Cocos gram +

Prueba de la Catalasa

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa

El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto
muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).

Prodecimiento:

Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo previamente

esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por
el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liíquida de peróxido de
hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

Resultados:

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Streptococcus spp.

 Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de
aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para
diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.

Procedimiento:

Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo
de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo
con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15
minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados:

Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:

1: pequeños coágulos no oganizados

2: pequeños coágulos oganizados

3: gran coágulo organizado

4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.

Se consideran positivos los niveles 3 y 4.

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Staphylococcus epidermis.

PRUEBAS BASADAS EN CARACTERES DE RESISTENCIA A CIERTAS

SUSTANCIAS
A) TEST DE LA OPTOQUINA
* Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la
optoquina.
* Medio de cultivo: agar sangre
* Reactivo: discos impregnados de optoquina.
* Técnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar
sobre una placa de agar sangre y colocar en la superficie de la placa los discos
de optoquina. Incubar a 37º durante 24 horas.
* Lectura e interpretación de los resultados: en caso de que el
microorganismo sea sensible a la optoquina, se observa un halo de inhibición
alrededor del disco.
* Interés: diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de
Streptococcus alfahemolíticos (resistentes).
B) TEST DE LA BACITRACINA
* Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la
bacitracina.
* Medio de cultivo: placas con agar sangre.
* Reactivo: discos impregnados con bacitracina.
* Técnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar
en una placa de agar sangre y colocar sobre la placa los discos de bacitracina.
Incubar a 37º durante 24 horas.
* Lectura e interpretación de los resultados: una zona de inhibición del
crecimiento alrededor del disco, aunque sea pequeña, indicará la sensibilidad.
* Interés: diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A de Lancefield), sensible
a la bacitracina, de otras especies de Streptococcus betahemolíticos (grupos B,
C, D, F, G) que son resistentes.
También podemos incluir en este apartado la prueba de SOLUBILIDAD EN
BILIS (para diferenciar Streptococcus Pneumoniae, que tiene esta propiedad, de
otras especies de Streptococcus alfahemolíticos.

Solubilidad en bilis. Se basa en la capacidad de determinadas especies bacterianas de lisarse

en presencia de sales biliares, las más utilizadas de las cuales son el taurocolato y el
desoxicolato de sodio. Ambas provocan un descenso de la tensión superficial, que, unido a la
actuación de enzimas autolíticos, destruyen la célula. El efecto de esta enzima autolítica se
pone de manifiesto sobre colonias de S. pneumoniae crecidas en medios sólidos, en las que se
aprecia una umbilicación central, y también en colonias mucoides.

Crecimiento en caldo hipersalino. Determina la capacidad de algunos microorganismos de

desarrollarse en medios de cultivo con una concentración de cloruro sódico del 6,5%.

termorresistentes. La prueba consiste básicamente en incubar a 70ºC y observar un cambio a color amarillo en
el medio que indica que la enzima ha resistido la alta temperatura.

Cocos gram –

• Prueba de O/F: para realizar esta prueba se usa el medio básico de Hugh y Leisfon
con un pH de 7.1. Es un medio semisólido de color verde que se inocula por picadura,
contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%. Como
 indicador de pH tiene Azul de bromotimol. Se usa en dos tubos, uno sin aceite y otro
con acetie o vaselina sellándolo. Se inoculan los dos tubos con la bacteria por
picadura y se mantiene a 37°C por 24 horas, obteniéndose:

TUBO INTEPRETACIÓ
TUBO ABIERTO
SELLADO N

Oxidación
Amarillo Verde
(aerobio)

Amarillo (anaerobio
Amarillo Fermentación
facultativo)

Verde (anaerobio
Amarillo Fermentación
estricto)

Verde Verde Negativo (NH3)

• Prueba de oxidasa: Básicamente es la detección de la enzima oxidasa, muy útil en la

identificación de bacterias Gram (-). La reacción de la oxidasa se debe a la presencia
del sistema de citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxígeno
molecular, por la transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de
transferencia de electrones.

El sistema de citocromos está generalmente presente en organismos aeróbicos. Un resultado

positivo a la oxidasa consiste en una serie de reacciones en las cuales un componente auto-
oxidable del sistema de citocromo es al final catalizado. Utilizando un tubo capilar con
tetrametil-p-phenylendiamina al 1%, se adiciona una pequeña cantidad a un cultivo
bacteriano colocado sobre un papel filtro y obtenemos las siguientes reacciones: una reacción
positiva (presencia de oxidasa) se indica por la apariencia de un color púrpura obscuro en el
papel, en menos de 10 segundos; al contrario una reacción negativa, que consiste en una
ausencia de color púrpura, indica según los ejemplos:

Oxidasa (+): Pasteurella multocida

Oxidasa (-): Escherichia coli

 Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a
partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de
SH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con
objetivo de diferenciar entre:

• bacterias fermentadoras de la glucosa

• bacterias fermentadoras de la lactosa

• bacterias fermentadoras de sacarosa

• bacterias aerogénicas

• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.

Prodedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del
tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35°
durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.

Resultados:

• Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no

fermentadoras como Pseudomonas sp.

• Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.

• Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de

ácido sulfhídrico. Salmonela spp.

• Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no.
Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

 Indol

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen
la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y
amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de
microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona
con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y
Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este
período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo
fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol
y una prueba positiva.

Resultados:

(+) Escherichia coli

( - ) Klebsiella pneumoniae

 Rojo Metilo

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias
lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la
glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la
fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y
CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales
productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para
visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

Procedimiento:

Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar
a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de
metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es
suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta.
Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

Resultados:

(+) Escherichia coli

( - ) Enterobacter aerogenes

 Vogues Proskauer

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de

rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol.
En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de
alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

Procedimiento:

Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a
35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo
limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para
exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color
rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo
tanto una prueba VP positiva.

Resultados:

(+) Enterobacter aerogenes

(-)Escherichia coli

 Agar Citrato

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias.
La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única
fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el
indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento:

Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y
cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del
medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa
crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Resultados:

(+)Klebsiella spp.

( - ) Escherichia Coli

PRODUCCIÓN DE UREASA
La urea es un compuesto orgánico nitrogenado que se transforma por algunos microorganismos
del suelo, los cuales producen la enzima ureasa. Como resultado de esta actividad microbiana el
nitrógeno es liberado al suelo en forma inorgánica. Cuando esta reacción ocurre en medio de
cultivo se alcaliniza y el indicador permite percibir visualmente el cambio en acidez del medio.

 Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la
descarboxilación de la ornitina.

Procedimiento:

Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación
Enturbiamiento del
Hay movilidad
Agar.
Agar transparente de-
No hay movilidad
sarrollo solo en picada
Azul (alcalino) Descarboxila ornitina
Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila
Rojo (anillos) Indol (+)
Amarillo (anillos) Indol ( - )