INTRODUCERE

Fertilizarea “in vitro” este o tehnologie bine stabilită cu o multitudine de aplicaţii în

practică. Tehnologia se bazează pe producţia de embrioni utilizaţi pentru cercetare,
pentru tratarea infertilităţii la oameni şi animale, pentru creşterea productivităţii la
animalele de fermă şi pentru protejarea speciilor de animale pe cale de dispariţie.
Pentru majoritatea speciilor, protocoalele de fertilizare “in vitro” (IVF) sunt disponibile şi
oferă cantităţi mari sau suficiente de ovule fertilizate, ducând la o producţie de embrioni
viabili care se pot dezvolta într-un produs de concepţie normal după transferul la
femelele receptoare.
Originile fertilizării “in vitro” se regăsesc încă din anul 1878, însă primele studii
care atesta succesul fertilizării “in vitro” la om s-au publicat în anul 1969 (Yanagimachi
şi Chang, 1963, 1964). Aceste studii au fost primele studii care s-au referit la IVF
mamiferelor utilizând spermatozoizi capacitaţi “in vitro”. Un studiu mai recent (Chang,
1976) a arătat ca ovulele de iepuroaica fertilizate “in vitro” se pot dezvolta în produşi
normali. Aceste lucrări de pionerat au fost cruciale pentru acceptarea, 20 de ani mai
târziu, a IVF la om ca şi un tratament clinic al infertilităţii. Anii 1960 şi 1970 au fost anii
de aur ai fertilizării “in vitro” când, după descoperirea capacitării spermei, s-au raportat
succese remarcabile la câteva specii importante ca iepure, şoarece, hamster, şobolan,
om.
În ciuda eforturilor intense de cercetare încă de la jumătatea secolului al 19 lea, în
1971, cunoştinţele de fiziologie, biochimie şi morfologie a fertilizării la mamifere erau
insuficiente. Progresul cercetării a fost greu realizat deoarece fertilizarea are loc în
organismul mamiferelor, ceea ce înseamnă că evenimentele implicate în fertilizarea
ovocitelor şi dezvoltarea embrionară nu au putut fi investigate în microclimatul lor
natural. Aşadar, informaţia privind relaţia dintre ovulă sau embrionul în dezvoltare şi
microclimatul matern a fost greu de obţinut. O tehnică folositoare este recoltarea
ovocitelor fertilizate sau a embrionilor timpurii din tractul genital femel şi studiul
dezvoltării lor ulterioare “in vitro”. Aceasta abordare a fost utilizată, dar oferă informaţii
puţine despre evenimentele din „in vivo”. Mai mult, momentul ovulaţiei şi a fertilizării „in
vivo” nu s-a putut stabili cu acurateţe, ceea ce restricţionează investigaţia rapidă a
evenimentelor care apar, ca de ex. penetrarea spermatozoizilor prin învelişul ovocitei şi
a modificărilor pe care le suferă gameţii pe parcursul stadiilor iniţiale ale fertilizării.
Astfel, informaţii utile pot fi obţinute din studiul ovocitelor care sunt fertilizate „“in vitro””
şi care apoi se dezvoltă “in vitro”. Nu numai că procesul fertilizării poate fi observat de
aproape, dar de asemenea se pot examina şi factorii care contribuie la o fertilizare
normală.
În prezent se încearcă punerea la punct a unui protocol de fertilizare “in vitro” a
ovocitelor bovine care să ducă la obţinerea de embrioni viabili ce vor putea fi transferaţi
la femelele receptoare. Succesul acestui protocol depinde de: tehnica de recoltare a
ovocitelor şi aprecierea morfologică a acestora, metodele de cultivare pentru
maturizarea ovocitei, capacitatea spermatozoizilor şi fertilizarea ovocitelor prin punerea
în contact a ovocitelor mature cu spermatozoizii capacitaţi.
Până nu de mult, pentru recoltarea ovocitelor bovine se utilizau metode
chirurgicale, ceea ce provocă suferinţă animalului. În ultimii ani s-a încercat
implementarea unor tehnici de recoltare nechirurgicale (de ex.: introducerea unui
endoscop prin fosa paralombară dreaptă, prin laparascopie sau prin aspirarea
transvaginală ecoghidată a foliculilor ovarieni (Gordon, 1991). Se mai pot obţine ovocite
din ovarele animalelor sacrificate în abatoare prin metoda aspirării foliculilor, prin
disecţia foliculior sau prin mărunţirea ovarelor (Duran, 2000).
Cultivarea “in vitro” pentru maturare afectează atât numărul ovocitelor care ajung
în metafaza II şi care devin apte pentru fertilizarea “in vitro”, cât şi dezvoltarea
embrionară ulterioară (Bavister, 1982). Mediile de maturare “in vitro” care se folosesc
sunt medii simple (de obicei sunt sisteme tamponate carbonate care conţin ser fiziologic
cu piruvat, lactat si glucoza) şi medii complexe ce conţin suplimentar la componentele
de baza şi aminoacizi şi vitamine. Cele mai multe laboratoare de IVF utilizează mediul
TCM 199 ca şi mediu de maturare a ovocitelor bovine „“in vitro”” (Bavister, 1992). Hawk
şi Wall în 1993 fac o comparaţie a mediilor pentru maturarea “in vitro” (IVM),
concluzionând că mediul F-10 este superior mediilor TCM 199 şi B2. Mai recent, Gliedt
şi col., 1996, în urma cercetărilor, demonstrează că mediul RPMJ-1940 este inferior
mediului TCM 1999. În 1997, Wang şi col., demonstrează că nu exista nici o diferenţă
între rata dezvoltării embrionare a ovocitelor maturate în mediul TCM 199 şi cele
maturate în mediul RPMJ-1940 şi în mediul B2. Ovocitele maturate “in vitro” au o slabă
competenţă de dezvoltare, au nivele scăzute ale glicolizei, care este necesară pentru
finalizarea maturării. O reducere a nivelului glicolizei poate reflecta o activitate scăzută
a căilor pentozo-fosfat care joacă un rol important în maturarea meiotică a ovocitelor
bovine, de aceea este obligatorie utilizarea unui mediu de maturare care conţine
glucoză (Krisher şi Bavister, 1998).
Succesul IVF la bovine necesită pregătirea corespunzătoare a spermei si a
ovocitei, ca şi condiţii de cultivare care să favorizeze activitatea metabolică a gameţilor
(Xu şi King, 1990). Primul studiu asupra succesului maturării şi fertilizării “in vitro” la
bovine a fost realizat de Iritani şi Niwa (1977) în Japonia, dar naşterea de viţei nu a fost
raportată până în 1986 de către Hanada şi col.
Fertilizarea ovocitelor bovine include o serie de evenimente succesive în care
sperma:
• trebuie sa fie mobilă pentru a ajunge la ovocita şi pentru a penetra învelişul
acesteia;
• să aibă abilitatea de a începe capacitarea şi de a manifesta reacţie acrozomială;
• să aibă capacitatea de a se ataşa de zona pelucida (ZP) şi de membrana vitelină
a ovocitei prin dobândirea proteinelor de legătură în timpul maturării şi expunerea
acestor locusuri de ataşare ovocitei într-un timp corespunzător;
• să aibă abilitatea de a fuziona cu oolema şi de a se incorpora în ovocită;
“In vitro”, pentru inducerea capacităţii şi reacţiei acrozomiale se utilizează mai
multe medii. Unul dintre acestea este mediul de fertilizare cu concentraţie mare ionică
(Mediul BO) cu osmolaritate de 360-390 mOsM pentru capacitarea spermei proaspete
de taur (Bousquet si Brackett, 1982). Însă Sirard şi col., 1986 au demonstrat că
utilizarea acestui mediu este limitată la câţiva tauri şi ei nu consideră că are o aplicare
generală. Mai recent (Ibrahim, 1993) s-a început utilizarea mediului TALP pentru
capacitarea “in vitro” spermatozoizilor de taur. În acest sens, Jaakma şi col., 1997 au
observat un procent semnificativ mai mare a ovocitelor bovine care s-au dezvoltat în
stadiul de blastocist după inseminarea cu spermatozoizi capacitaţi cu acest mediu
suplimentat cu heparină. Alte studii susţin ideea că capacitarea spermei de taur cu
heparina reflectă mecanismul capacitării din vivo (Parrish şi col., 1989). Doza de
heparină şi perioada de incubaţie pentru capacitare sunt factori importanţi care
afectează fertilizarea “in vitro” la bovine şi dezvoltarea embrionară ulterioară
(Vlaenderen şi col., 1991). Heparina induce schimbări în proprietăţile de legare a
proteinelor spermatice şi determină reducerea concentraţie de ioni de calciu în timpul
capacitării (Leclerc şi col., 1992). Unii autori (Shamsuddin şi col., 1992) sugerează că
rata fertilizării poate fi rapid îmbunătăţită prin adăugarea heparinei la mediul de
fertilizare, doza variind între 0,5 – 50 microlitri/ml. Sugawarea şi col., 1984, utilizând
sperma de taur congelată/decongelată preincubata într-un mediu ce conţinea lichid
folicular bovin (bFF), au raportat o rată de penetrare de 56%. Se pare că bFF-ul conţine
componente (ca de ex. glucozo-amino-glicanzii) capabile să capaciteze sperma de taur.
Pentru acest motiv, lichidul folicular bovin a fost utilizat ca şi mediu de capacitare a
spermatozoizilor de taur în 1992 de către Iqbal şi Hunter. În 1989, Fukuda şi col. au
demonstrat importanţa fluxului de ioni de calciu extracelular în procesul capacitării
spermei. Ei au arătat că tratamentul spermei cu calciu ionofor are ca rezultat
hiperactivarea şi funcţionarea reacţiei acrozomiale la sperma de taur, oferindu-i
capacitatea să penetreze ovocita. Jiang şi col., 1992 comparând tratamentele cu calciu
ionofor cu cel cu heparina, susţin simplitatea utilizării ionoforului şi obţinerea unei
producţii mai mari de embrioni. Madison şi col., 1991 utilizează pentru pregătirea
spermei mediul TALP cu heparina şi cafeina, ei adaugând în mediul de fertilizare o
concentraţie de 1x1,5x106 spermatozoizi/ml. Fukui şi col., 1990 stabilesc condiţiile
standard pentru co-cultivarea spermatozoizilor cu ovocitele care sunt 16 – 22 de ore la
39OC în atmosfera cu 5% CO2.
În aceste condiţii de co-cultivare a spermatozoizilor cu ovocita are loc fertilizarea
care constă în (Wassarman, 1999 şi Wrigh , 1999):
1. Penetrarea spermatozoizilor a complexului cumulus:
• ovocita ovulată este închisă în celulele cumulus. Celulele cumulus sunt celule
somatice care înconjoară ovocita şi au rădăcini în matricea extracelulară care
conţine acid hialuronic; numai spermatozoizii capacitaţi şi cu acrozom intact pot
penetra cumulusul pentru a ajunge la ovocita;
• hialuronidaza, parte componentă a spermatozoidului participă la progresia
acestui prin cumulus.
2. Interacţiunea spermatozoidului cu zona pelucida:
• zona pelucida este un înveliş glicoproteic care înconjoară ovocita şi care conţine
trei glicoproteine (ZP1, ZP2, ZP3). Ea este locul de iniţiere a legării
spermatozoidului la ovocita şi se constituie ca o barieră pentru polispermie.
3. Penetrarea zonei pelucida:
• este necesară o mobilitate mai mare a spermatozoidului (mobilitate
hiperactivată);
• are loc digestia enzimatică a zonei pelucida de către acrozin.
4. Fuziunea spermatozoidului cu oolema:
• după fuzionarea cu oolema, întregul spermatozoid este încorporat total în
oolema şi suferă decondesarea cromatinei;
5. Reluarea meiozei de către ovocita:
• în timpul decondensării cromatinei spermatozoidului, meioza care era oprită în
stadiul de metafaza II este reiniţializată spre stadiul de telofaza II;
• ovocita în metafaza II este caracterizată prin prezenţa primului globul polar în
spaţiul perivitelin. La finalul meiozei, al doilea globul polar este eliberat în spaţiul
perivitelin şi ovocita devine haploidă şi este caracterizată prin prezenţa a doi
globuli polari.
6. Formarea pronucleilor:
• cromatina spermatozoidului, ulterior decondensării/recondensării ei în ovocită şi
cromatina ovocitei în telofază II se vor transforma în pronuclei patern şi matern.