Liceo Augusto D Halmar Asignatura: Biologa. Profesor Cristian Flores Yanina Poblete.

Conceptos Generales sobre Biotecnologa e Ingeniera Gentica. Desde hace miles de aos, el ser humano ha optado mayoritariamente por una vida sedentaria, se sentaron en localidades que le proveyeran de proteccin ante enemigos naturales e inclemencias climticas. Tambin se preocup de cultivar plantas y criar animales con el fin de obtener alimento. Tempranamente en la historia de la humanidad, comienza el proceso de seleccionar los mejores ejemplares, los que producan ms leche, mejores frutos o los granos de mayor tamao. Mezclas, jugos, tiempos de espera, exposicin a la luz del sol, este tipo de acciones permiti mejorar sabores, texturas y cualidades de los alimentos. Ciertamente, ese ser humano no conoca el fundamento de estos beneficios, pero estaba manipulando las clulas de plantas, animales y microbios para producir sustancias tiles a la humanidad. El trmino biotecnologa hace referencia a aquellos procesos mediante los cuales se manipulan organismos vivos para elaborar productos tiles. La diferencia con nuestros antepasados es que ya no constituye un misterio. La biotecnologa moderna utiliza como operarios a los microbios, es decir, organismos microscpicos, generalmente compuestos de una sola clula, entre los mas utilizados estn las bacterias y los hongos. Tambin son actores principales los virus, aunque no tienen estructura celular, son comparativamente pequesimos y requieren de una clula para multiplicarse, ellos tienen su informacin gentica codificada en cidos nucleicos, que dirigen la sntesis de protenas virales, con el mismo cdigo gentico de los organismos celulares. Los microbios son sorprendentemente verstiles, habitan prcticamente todos los ambientes, hielo, agua hirviente, rocas, plsticos, tierra, aire, petrleo, maderas. La causa de que la biotecnologa est en debate cotidiano en las ltimas dcadas, es la aplicacin prctica de los grandes avances en la gentica microbiana y en la tecnologa que se ha desarrollado a partir de ella, permitiendo la manipulacin directa del DNA. La modificacin deliberada de la informacin gentica de un organismo, cambiando el cido nucleico y con ello modificando directamente el genoma, se denomina ingeniera gentica. En trminos muy generales, la ingeniera gentica utiliza un conjunto de mtodos que permiten seleccionar una porcin de informacin gentica. El gen es transferido (transgen) al genoma de otro organismo (transgnico) que no la posea antes de este procedimiento, generndose as un organismo genticamente modificado (OGM). El beneficio est en el producto que la clula genera tras la modificacin. Emblemtica ha sido la transferencia de genes humanos a clulas bacterianas, permitiendo que bacterias produzcan protenas humanas, como por

ejemplo la insulina, evitando el riesgo de alergia ante la insulina obtenida de vacas y cerdos. El detalle de los procedimientos es complejo, sin embargo, se puede llegar a una aproximacin vlida, al considerar algunos de sus aspectos ms significativos. Pero As definida, la biotecnologa no es ninguna invencin reciente, sino que forma parte del repertorio de la civilizacin humana, desde hace ya muchos miles de aos. Por citar un ejemplo, en la produccin de alimentos para el ser humano y los animales intervienen procesos de fermentacin microbiana: El hongo de las levaduras (Saccharomyces) y las familias de lactobacilos hacen "subir" las masas en la produccin del pan Las levaduras convierten, por fermentacin, los cocimientos de cereales en cerveza, los jugos de manzana en chicha y el jugo de uvas, en vino Los estreptococos y algunas especies de lactobacilos convierten leche en yogurt o en queso Las acetobacterias y bacterias de la especie Erwinia dissolvens hacen fermentar a los granos de caf o a las hojas de t Los lactobacilos convierten durante el ensilado plantas verdes y frescas en forraje para animales As tambin, desde comienzos del siglo XX, se obtienen de las bacterias y levaduras (que son hongos unicelulares, no bacterias), un sinnmero de elementos orgnicos. Por ejemplo: Disolventes orgnicos, como el etanol o la acetona cidos orgnicos, como el cido ctrico o el cido lctico Polisacridos como el dextrano Aminocidos, como el cido L-glutmico o la L-lisina Vitaminas, como la B-12 o la vitamina C Antibiticos, como los betalactmicos o la tetraciclina Alcaloides de uso clnico Enzimas para la industria qumica, como las lipasas (usadas en detergentes) y para la industria alimenticia, como las amilasas Hormonas peptdicas y esteroides, como la 1-hidroxiprogesterona o como la insulina humana, producida mediante ingeniera gentica. Adems, se hace uso de varias especies de bacterias en lixiviacin de minerales, esto es, minerales de baja calidad se enriquecen tras ser procesados metablicamente por bacterias. Parte importante del trabajo realizado por biotecnlogos especialistas en gentica molecular, utiliza tcnicas relativamente recientes, entre las que destaca la recombinacin del ADN. ADN RECOMBINANTE: El primer paso consiste en identificar y aislar el DNA responsable de un determinado fenotipo (es decir, que codifique para la produccin de una cierta protena). Una vez obtenido, el gen (o genes) responsable del fenotipo se fusiona con otros fragmentos de DNA para formar molculas de DNA recombinante.

El DNA recombinante se multiplica (clonacin de genes) para lo cual se inserta en una clula, generalmente bacterias. Este proceso permite sintetizar grandes cantidades, tanto de genes aislados como de los productos de ellos (protenas). La produccin de molculas de DNA recombinante se basa en la propiedad de las enzimas microbianas llamadas enzimas de restriccin (o endonucleasas) de escindir (separar, cortar) las dos cadenas del DNA en sitios especficos. En condiciones normales, protegen la clula husped destruyendo el DNA extrao tras su penetracin en la clula. Actualmente los cientficos disponen de mltiples variedades de enzimas de restriccin que reconocen muchas secuencias especficas diferentes, que se utilizan para preparar fragmentos de DNA que contienen genes o porciones de genes especficos. La enzima realiza cortes escalonados en las dos cadenas de DNA para formar extremos cohesivos o pegajosos. Los extremos cohesivos del DNA se asocian entre s mediante apareamiento de bases (anillamiento), la unin de los fragmentos se logra por accin de la enzima DNA ligasa. Los retrovirus, son virus cuya informacin gentica esta contenida en ARN, ellos no poseen DNA, pero para utilizar la maquinaria celular, deben generar algo as como un lenguaje tipo DNA. En 1970 se descubri que los retrovirus poseen un tipo especial de enzima, llamada transcriptasa reversa, que permite al virus producir una copia tipo DNA de su informacin gentica. Este especial DNA se denomina DNA complementario (cDNA). Este descubrimiento permiti sintetizar genes o porciones principales de genes tambin a partir del RNA mensajero (mRNA). Southern public un procedimiento para detectar fragmentos aislados especficos del DNA, de tal forma que se poda aislar un gen particular a partir de una mezcla compleja de DNA. La tcnica de la transferencia de Southern se basa en la especificidad de la complementariedad de las bases de los cidos nucleicos. En los aos 80 se desarrollaron tcnicas que permiten la sntesis de grandes cantidades de un fragmento de DNA (reaccin en cadena de la polimerasa o PCR). Actualmente es un proceso automatizado que realiza una mquina especialmente diseada para ello. As es posible estudiar muestras donde el material gentico est presente en muy pequeas cantidades, esto es de gran utilidad en virologa y en estudios de expresin gnica. Existen cuatro tipos principales de vectores: los plsmidos, los csmidos, los bacterifagos y otros virus, y los cromosomas artificiales. Todos los vectores comparten una serie de caractersticas. Se trata tpicamente de pequeas molculas de DNA bien caracterizadas. Contienen al menos un origen de replicacin y son capaces de replicarse en el interior del husped apropiado, incluso cuando contienen DNA "forneo". Los plsmidos fueron los primeros vectores de clonacin. Son fciles de aislar y purificar, y pueden ser reintroducidos en una bacteria. Los plsmidos recombinantes que contienen DNA forneo a menudo se denominan quimeras.

En el esquema de la Figura 5 se pueden apreciar las etapas mediante las cuales es posible conseguir insulina humana haciendo uso de ADN recombinante en la bacteria E. coli . En la tabla se mencionan otros usos que tiene la tcnica del ADN recombinante en la medicina.

Figura 5. Obtencin de insulina mediante ADN recombinante

Productos

Ejemplos y usos Activador de plasmingenos de tejido (TPA), activa a la plasmina, una Anticoagulantes enzima involucrada en ..disolver cogulos, efectivo tratamiento en vctimas de ataques cardacos. Factor VIII promueve coagulaciones y es deficiente en hemoflicos. El uso Factores del factor VIII ..producido por tecnologa de DNA recombinante elimina sanguneos riesgos de infeccin asociados con ..transfusiones sanguineas. Factores Factores de crecimiento del Sistema Inmune que estimulan la produccin estimuladores de leucocitos, ..usados para tratar deficiencias inmunes y para combatir de colonias infecciones. Estimula la produccin de eritrocitos; usado para tratar anemia en Eritropoyetina pacientes con ..enfermedades al rin. Factores de Estimula la diferenciacin y crecimiento de varios tipos celulares. Se utiliza crecimiento para promover la cicatrizacin. Hormona de crecimiento Usada para el tratamiento del enanismo. humana Insulina humana Usada para el tratamiento de la diabetes. Interferones Interfieren con la produccin viral; usados para tratar algunos cnceres. Activan y estimulan diferentes clases de leucocitos; posibles usos en Interleuquinas cicatrizacin de ..heridas, infeccin con VIH, cncer, y deficiencias inmunes. Extraordinaria especificidad de unin que es usada en: test de Anticuerpos diagnsticos; transporte ..dirigido (drogas, toxinas, o compuestos monoclonales radiactivos para tumores como una terapia para ..cncer); muchas otras aplicaciones. Extraordinaria especificidad de unin que es usada en: test de Superoxido diagnsticos; transporte ..dirigido (drogas, toxinas, o compuestos dismutasa radiactivos para tumores como una terapia para ..cncer); muchas otras aplicaciones. .Las protenas derivadas de cubiertas virales son tan eficientes para iniciar Vacunas una respuesta inmune como los virus muertos, pero son ms seguros; la primera vacuna desarrollada fue ..para la hepatitis B. Expresin de genes forneos en bacterias. Una vez que se ha construido un vector de clonacin adecuado, el rDNA penetra en la clula husped, y se desarrolla una poblacin de microorganismos recombinantes. La clula hospedera carece de enzimas de restriccin y del gen que codifica la Aptaza necesaria para los procesos de recombinacin gentica, con objeto de reducir las posibilidades de que el rDNA sufra recombinacin con el cromosoma de la clula husped. Para detectar la presencia del DNA recombinante en las clulas hospederas, se inserta un gen que la hace resistente a un cierto antibitico, entonces aquellas clulas que mueren en presencia de ese antibitico, no haban adquirido el plasmado recombinante.

Insercin de genes en clulas eucariotas. El material gentico, inyectado directamente en clulas animales como huevos fertilizados, se incorpora de forma estable al genoma para producir un animal transgnico. Otra tcnica es la electroporacin. Si se mezcla un conjunto de clulas con una preparacin de DNA y a continuacin se las expone brevemente a pulsos. Las clulas captan el DNA a travs de poros temporales creados en su membrana plasmtica. La biobalstica es una de las tcnicas ms eficaces, consiste en disparar micro proyectiles con DNA al interior de clulas vegetales y animales. Algunas pistolas utilizan descargas elctricas o gas a alta presin para propulsar el DNA. Tambin es posible transferir el rDNA (transfectar) con vectores biolgicos como Agrobacterium y virus. 3. Organismos transgnicos Los organismos superiores que han incorporado genes extraos se denominan transgnicos; este trmino suele reservarse para plantas y animales. Se estn utilizando diversos mtodos para insertar genes extraos o ajenos en clulas vegetales o animales. Con frecuencia se utilizan virus como vectores, aunque tambin se han empleado otros mtodos, como inyeccin directa de ADN en las clulas Una manera de reconstruir genticamente las protenas animales consiste en utilizar animales vivos que han incorporado un gen extrao para producir la protena recombinante. Estos animales transgnicos suelen obtenerse por microinyeccin del ADN de un gen especfico en el ncleo de un vulo fecundado. Los vulos se implantan despus en el tero de una hembra y se permite que se desarrollen. En un estudio de este tipo, el gen para la hormona del crecimiento se aisl de una biblioteca de ADN genmico de rata y se combin con la regin promotora de un gen de ratn que en general produce metalotionena, una protena cuya sntesis es estimulada por la presencia de metales pesados como zinc. Se utilizaron las secuencias reguladoras para la metalotionena, como un interruptor que permitiera activar y desactivar a voluntad la hormona del crecimiento de la rata. Despus de que se inyect el gen manipulado en vulos de ratn fecundados, stos se implantaron en el tero de una hembra de ratn y se permiti que se desarrollaran hasta embriones. Los embriones en los cuales el trasplante de genes fue exitoso crecieron con rapidez cuando se expusieron a pequeas cantidades de zinc. Un ratn que se desarroll a partir de un vulo que haba recibido dos copias del gen para la hormona del crecimiento alcanz una talla de ms del doble de la normal. Como podra esperarse, tales ratones a menudo son capaces de transmitir a la descendencia su mayor capacidad de crecimiento. Ya se ha demostrado que la descendencia transgnica tiene valiosas aplicaciones de investigacin en una amplia gama de estudios. Entre stos se incluyen regulacin de la expresin gnica, funcionamiento del sistema inmunitario, enfermedades genticas y virales, y genes causantes del desarrollo de cncer. Se han utilizado animales transgnicos para desarrollar cepas que secreten protenas importantes en la leche. Por ejemplo, se ha introducido en ratones transgnicos el gen para el activador del plasmingeno tisular, una protena que

disuelve los cogulos que causan los ataques cardiacos, y en forma semejante el gen para un factor de la coagulacin sangunea humana, en ovejas. Estos genes recombinantes se han fusionado en las secuencias reguladores de los genes para las protenas lcteas y, por lo tanto, slo se activan en tejidos mamarios que tienen relacin con la produccin de leche. La ventaja de producir la protena en la leche es que se obtiene en grandes cantidades y puede obtenerse sirnplemente al ordear al animal. La protena se purifica despus de la leche. Los animales no son daados por la introduccin del gen y, dado que la progenie del animal transgnico suele producir tambin la protena recombinante, es posible establecer cepas transgnicas simplemente criando a los animales. Recordemos que tambin se utilizan virus como vectores para ADN recombinante. Los virus de ARN, llamados retrovirus, hacen copias en ADN de s mismos por transcripcin inversa (Figura 6). Algunas veces tales copias en ADN se integran a los cromosomas del husped, donde se duplican junto con el ADN de ste. Por ejemplo, los virus de la leucemia murina genticamente alterados son retrovirus que pueden utilizarse como vectores para incorporar genes recombinantes en clulas cultivadas. En determinadas condiciones, genes portados por los virus modificados por ingeniera gentica pueden expresarse en las clulas animales para producir protenas reconstruidas en forma gentica. Una desventaja importante de introducir genes en clulas animales cultivadas es que el rendimiento de las protenas codificadas por el ADN ajeno portado por los virus suele ser bajo. Figura 6. Estructura de un Sin embargo, estos tipos de vectores son retrovirus como medios de terapia gnica de algunos trastornos hereditarios del promisorios ser humano. 4. Plantas transgnicas en la agricultura Las plantas han sido cruzadas en forma selectiva durante miles de aos. El xito de tales trabajos depende de la presencia de rasgos deseables en la variedad de planta que se selecciona o en plantas silvestres o domsticas estrechamente relacionadas cuyos rasgos pueden ser transferidos por cruzamiento. Las variedades primitivas, o especies estrechamente relacionadas, de plantas cultivadas a menudo tienen rasgos, como la resistencia a enfermedades, que pueden introducirse de manera ventajosa en variedades ms adecuadas para las necesidades modernas. Si en una planta se introducen genes de cepas o especies con las que ordinariamente no se cruza, las posibilidades de mejoramiento se elevan en gran medida. Los genetistas de vegetales ahora disponen de fondos de investigacin debido al potencial econmico de los rendimientos mejorados. Adems, es posible que estos especialistas tengan mayor libertad de experimentar con nuevas tcnicas que quienes trabajan con animales, debido a que la manipulacin de genes vegetales no suele implicar el mismo tipo de consideraciones ticas. Por desgracia, ha sido muy difcil encontrar un vector adecuado para introducir genes recombinantes en muchos tipos de clulas vegetales. En el sistema vector ms utilizado se recurre a la bacteria formadora de agallas

Figura 7 Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria por lo general produce tumores o "agallas" en los vegetales al introducir un plsmido especial, llamado plsmido inductor de tumores o Ti (por su nombre en ingls: tumor-inducing), en las clulas de su husped. El plsmido induce crecimiento anormal forzando a las clulas de la planta a producir grandes concentraciones de una hormona de crecimiento vegetal, la citocinina; tambin desva el metabolismo de las clulas del husped a producir sustancias conocidas como opinas, derivados sencillos de aminocidos y cetocidos que son nutrimentos preferidos por la bacteria. Es posible "desarmar" al plsmido Ti de manera que no induzca la formacin de tumores y utilizarlo como vector para insertar genes en clulas vegetales (Figura 7). Las clulas en las que se introduce el plsmido alterado de hecho son normales, excepto por los genes que se han insertado. Los genes colocados en el genoma de la planta de esta manera pueden transmitiese en forma sexual por semillas a la siguiente generacin, pero tambin pueden propagarse asexualmente si se desea. Un problema importante con el vector Ti es que, con pocas excepciones, slo plantas dicotiledneas pueden ser infectadas por A. tumefaciens. Por desgracia, las gramneas, que constituyen la principal fuente de alimento para el ser humano, son monocotiledneas y por ello salen de la gama de huspedes de la bacteria. Se est realizando intensa investigacin encaminada a desarrollar sistemas vectores para monocotiledneas. Un mtodo ha sido el desarrollo de una "escopeta" gentica. Fragmentos microscpicos de metal se cubren de ADN y se disparan contra clulas vegetales para que atraviesen las paredes celulares. Algunas de las clulas retienen el ADN y son transformadas por ste. Tales clulas pueden cultivarse y utilizarse para regenerar una planta completa Una complicacin ms de la ingeniera gentica de plantas es que varios genes vegetales importantes se localizan en el ADN de los cloroplastos; estos ltimos son esenciales en la fotosntesis, que es la base de la productividad de las plantas. Es obvio que sera til desarrollar mtodos para modificar la porcin del ADN vegetal que reside dentro del cloroplasto. En la actualidad, los mtodos de ingeniera del cloroplasto son el centro de intensa investigacin.

Problemas: 1. Por qu la tcnica se llama se "ADN recombinante"? 2. Por qu se llaman "extremos pegajosos" si la unin que permite reconstituir al plasmidio se basa en los mismos puentes de hidrgeno que forman el resto de la doble hebra de ADN? 3. Las clulas de E. coli que se usan en ingeniera gentica son "deficientes". Es decir, no pueden sintetizar componentes escenciales de su pared celular, por ejemplo o cierta base nuclear como la timina. Por lo tanto, slo pueden sobrevivir en medios enriquecidos con estas sustancias. Por qu crees que los bilogos moleculares han tomado estas precauciones? 4. Completa el siguiente cuadro acerca de enzimas utilizadas en recombinacin del ADN: Origen Enzimas de restriccin Ligasas Transcriptasa inversa 5. Si fueses agricultor, qu genes te interesara insertar en un plsmido Ti? 6. Qu situaciones estara limitando el uso de recombinacin gnica en especies vegetales? Funcin original Uso en gentica ingeniera