ANALIZA CALITATIVĂ A UNOR SUBSTANŢE NATURALE

PROTEINE
Proteinele sunt substanţe naturale cu structură macromoleculară, fiind componente esenţiale ale
celulelor organismelor vii ce joacă un rol important în fenomenul vieţii.
Moleculele de bază ale substanţelor proteice sunt aminoacizii uniţi între ei prin legături amidice –
CO-NH-, care dau naştere la catene polipeptidice lungi. În urma hidrolizei totale a proteinelor se
formează aminoacizii care sunt componentele de bază ale moleculei.
Cele mai importante reacţii ale substanţelor proteice sunt:
- reacţiile de precipitare;
- reacţiile de culoare.

A. Reacţii de precipitare
Acest tip de reacţii au loc sub influenţa:
- agenţilor fizici: exemplu căldura, când are loc coagularea ireversibilă a proteinelor;
- agenţilor chimici: exemple – acizi, săruri, solvenţi organici.

A1. Precipitarea prin încălzire

Prin încălzire la fierbere, proteinele suferă o transformare ireversibilă şi se transformă în
tulbureală, flocoane sau cheaguri. Pentru ca această reacţie să aibă loc mai repede trebuie ca să se atingă
punctul izoelectric, punct care se află de obicei în domeniul de pH slab acid. În mediu bazic, precipitarea
nu se observă deloc, iar în mediu neutru, precipitarea decurge mai greu.
Dacă se adaugă săruri anorganice neutre are loc uşurarea şi accelerarea coagulării proteinelor prin
fierbere. Adăugarea de polioli, zaharuri, aldehide, cetone, amine conduce la împiedicarea coagulării.

Mod de lucru
În patru eprubete se introduc 2-3 mL soluţie de proteină. În eprubeta 1 se adaugă 1-2 picături de
CH3COOH concentrat, în eprubeta 2 se adaugă 1-2 picături (NH4)2SO4, în eprubeta 3 se adaugă 1 mL
NaOH 10%, iar în eprubeta 4 nu se mai adaugă nimic.
Se încălzesc eprubetele la fierbere timp de aproximativ 1 minut şi se observă diferenţa dintre
cantitatea de precipitat care se formează în cele patru eprubete.

A2. Precipitare cu acizi

La tratarea soluţiei unei proteine cu acizi minerali concentraţi se formează precipitate
caracteristice care sunt solubile în exces de acid mineral (excepţie face precipitatul care se depune sub
influenţa HNO3). Dacă se utilizează acizi organici mai tari (CH3COOH, CCl3COOH) se obţin precipitate.

Mod de lucru
În două eprubete se toarnă câte 1 mL HCl concentrat şi 1 mL HNO3 concentrat. Se înclină
eprubetele şi se prelinge pe pereţii lor aproximativ 1 mL soluție de proteină. Se observă formarea unui
precipitat la nivelul inelului de separare între cele două straturi. Dacă se agită aprubetele, precipitatul din
eprubeta cu HCl se solvă în excesul de HCl, iar cel din eprubeta cu HNO3 devine mai abundent, fără a se
solvi în excesul de acid.

A3. Precipitarea cu săruri anorganice

Sărurile metalelor alcaline și ale magneziului (NaCl, KCl, MgSO4) precipită proteinele fără a le
denatura, precipitarea fiind reversibilă. Astfel, precipitatele obținute pot fi solvite prin adăugarea unui
exces de apă. Sărurile metalelor grele (CuSO4, HgCl2, Pb(CH3COO)2 ) precipită proteinele în mod
ireversibil, precipitatele obținute nu mai pot fi solvite prin adăugare de apă. O parte din acestea pot să se
solve în exces de reactiv.
Precipitarea proteinelor sub acțiunea soluțiilor de electroliți se datorează:
- luării sarcinilor electrice ale particulelor coloidale de proteine de către ionii sării încărcați cu
sarcină contrară și adsorbția pe aceste particule și
- apei de hidratare a proteinelor care este atrasă și luată de ionii puternic hidratați ai electrolitului
adăugat în exces mare. Aceste fenomene micșorează stabilitatea soluției coloidale, deoarece
ușurează apropierea și coagularea particulelor de proteine, care precipită.

Mod de lucru
a. La 2-3 mL soluție de proteină se adaugă o cantitate de 2-3 mL soluție saturată de (NH4)2SO4. Are
loc apariția imediată a unui precipitat care se solvă prin adăugare de apă. Se mai pot utiliza și soluții
de NaCl, MgSO4, KCl.
b. În două eprubete se introduc 1-2 mL soluție de proteină și treptat, în picături, în eprubeta 1 soluție
apoasă saturată de CuSO4, iar în cealaltă soluție apoasă 20% de Pb(CH3COO)2. Se observă apariția
unui precipitat albastru în eprubeta 1 și alb în eprubeta 2. Această precipitare este ireversibilă, dar
excesul de reactiv solvă precipitatul datorită peptidizării precipitatului de către ionii ce sunt adsorbiți
de particulele acestuia.

A4. Precipitarea cu solvenți organici

La tratarea unei soluții proteice cu alcool sau acetonă se formează imediat un precipitat
caracteristic.

A5. Precipitarea cu fenol și cu formaldehidă

Cu fenolul și cu formaldehida, proteinele formează produși de condensare puțin solubili, prin
intermediul grupelor aminice libere existente în moleculele proteinelor.

Mod de lucru
În două eprubete se introduc aproximativ 1 mL soluție de proteină și în eprubeta 1 se adaugă
soluție apoasă saturată de fenol, iar în eprubeta 2 o soluție apoasă de formaldehidă în volume egale.
Soluția fenolică precipită imediat proteinele și apare o tulbureală, flocoane sau cheaguri. În soluția
de formaldehidă coagularea are loc în timp.

B. Reacţii de culoare
Cu anumiți reactivi specifici, proteinele dau naștere la reacții de culoare caracteristice, datorită
diferiților aminoacizi care stau la baza substanțelor proteice.

B1. Reacția biuretului

Sub acțiunea CuSO4 în mediu alcalin, substanțele proteice formează o colorație caracteristică vie
violetă datorită grupării peptidice –CO-NH-. Această reacție este numită reacția biuretului.

Mod de lucru
Într-o eprubetă se introduc 2-3 mL soluție de proteină și un volum egal de soluție de NaOH 20-
30% și apoi 1-2 picături CuSO4 1%. Are loc apariția unei colorații roz-violetă caracteristică.
Observație: Nu se adaugă multă soluție de CuSO4 pentru că aceasta poate masca colorația specifică care
trebuie să apară!
 B2. Reacția xantoproteică
Prin tratarea proteinelor cu HNO3 concentrat apare o colorație galbenă, datorită nitrării nucleelor
aromatice ale unor aminoacizi (triptofanul, fenilalanina, tirosina) care intră în componența proteinelor:

CH2 CH COOH CH2 CH COOH

NH2 NH2
N
H fenilalanina
triptofan

HO CH2 CH COOH

NH2
tirosina

Mod de lucru
La 1 mL soluție de proteine se adaugă câteva picături de HNO3 concentrat și se observă apariția
unui precipitat sau tulbureală galbenă.
La fierberea soluției, precipitatul se solvă, iar soluția rămâne colorată în galben.
După răcirea soluției, i se adaugă puțin NH4OH, cînd soluția se colorează în portocaliu. Dacă se
adaugă NaOH, soluția se colorează în brun.

B3. Reacția cu Hg(NO3)2 – reactivul MILLON

Sub acțiunea Hg(NO3)2, proteinele formează un precipitat alb, datorită formării unei combinații
mercurice, precipitat care se colorează apoi în roșu mai intens (când proteina inițială conține în moleculă
grupări –OH în poziție orto) sau mai puțin intens (când proteina inițială conține în moleculă grupări –OH
în poziția para).

Mod de lucru
Într-o eprubetă se introduc 2-3 mL soluție de proteină și 1 mL reactiv Millon, se fierbe și se
observă formarea unui precipitat alb floconos care se aglomerează și se colorează în roșu-cărămiziu.
Chiar și soluția se poate colora uneori în roșu.

B4. Reacția LIEBERMAN

La tratarea proteinelor coagulate cu HCl concentrat se obțin colorații violete, datorită condensării
nucleelor furfurolice obținute prin încălzirea cu HCl a zaharurilor existente în molecula substanțelor
proteice cu fenolii existenți în molecula proteinelor.

Mod de lucru
Într-o eprubetă se introduc 5 mL soluție proteică și se coagulează prin fierbere. Se decantează apoi
lichidul și coagulul rămas se introduce în 5 mL HCl concentrat. Se fierbe până până la dizolvarea
coagulului și se observă apariția unei colorații violete cu tendință spre brun.

Prepararea soluțiilor de proteine

1. Proteine din făină de grâu
 Se cântăresc 50 g făină de grâu și se amestecă cu 200 mL apă și se agită cât de des este posibil
timp de 30-40 minute. Se filtrează și se obține o soluție clară de proteine.

2. Proteine din albușul de ou

Se separă de gălbenuș albușul unui ou de găină și peste el se toarnă 100-150 mL apă distilată,
agitându-se bine. Soluția opalescentă obținută se filtrează printr-o pânză umezită cu apă. Soluția obținută
se utilizează pentru efectuarea reacțiilor de culoare și de precipitare.

3. Proteine din lapte

a) Peste 100 mL lapte se adaugă un volum egal de apă și apoi, sub agitare, câteva picături de CH 3COOH
glacial. Se observă apariția unui precipitat floconos. Se filtrează apoi printr-o pânză umedă și se obține o
soluție limpede.
b) Peste 50 mL lapte proaspăt se adaugă un volum egal de soluție saturată de (NH4)2SO4, când precipită
cazeina și globulina, conținând și grăsimea. Suspensia se filtrează și se obține o soluție clară de proteine.