RELATRIO DE AULA PRTICA Determinao de glicose em amostras biolgicas por espectrofotometria no UV-Vis

1. INTRODUO

A luz uma forma de radiao eletromagntica, e pode ser uma mistura de diversas ondas com comprimentos de onda distintos, chamada de policromtica, ou apenas um comprimento de onda definido, chamada de monocromtica. O comprimento de onda representando pelo smbolo , medido em nanmetros (nm, 10 -9 m) e indica a distncia medida longitudinalmente entre dois picos ou vales da onda. O espectro eletromagntico representa as diferentes faixas de radiao em funo do comprimento de onda e freqncia da onda. A freqncia o movimento oscilatrio da onda, medida em oscilaes por segundo (s -1) ou Hertz (Hz). Em um espectro eletromagntico cujo comprimento de onda aumenta para a direita, as ondas mais enrgicas e de maior freqncia esto no extremo esquerdo (raios gama e raios-X), enquanto as radiae s mais fracas esto direita. Assim, a energia contida em uma onda to maior quanto menor o comprimento de onda e maior a freqncia.

A regio do espectro eletromagntico compreendida entre 400 -700 nm aquela em que esto as ondas que sensibilizam as clulas do olho humano responsveis por captar as cores. As cores so faixas de ondas dentro desse intervalo de 300 nm. Quando o olho humano v verde, por exemplo, porque os comprimentos de onda do vermelho e azul foram absorvidos pelo objeto refletindo a luz. A radiao absorvida est relacionada com a estrutura eletrnica espacial da molcula que constitui o material . O estudo da relao comprimento de onda absorvido, estrutura eletrnica e material ou molcula pode ser realizado pela espectrometria. A espectrofotometria bioqumica est preocupada com as faixas do ultravioleta (UV, 185-400 nm), visvel (400-700 nm) e infravermelho (700-15.000 nm). Os eltrons numa molcula podem estar compartilhados entre dois tomos (participando de uma ligao covalente) ou em pares isolados em tomos de oxignio, enxofre, nitrognio e halognios [4]. As ligaes covalentes podem ser simples (sigma), dupla (sigma e pi) ou tripla (sigma, pi e pi). As ligaes sigma so mais fortes porque os orbitais atmicos dos dois tomos interagem frontalmente, fundindo em um nico orbital molecular linear. As ligaes pi, no entanto, so fracas porque os orbitais atmicos "se curvam" no espao para interagir, formando uma nuvem el etrnica torcida.

Os orbitais moleculares ligantes esto preenchidos por eltrons quando a molcula est no estado fundamental. Cada orbital ligante possui um respectivo orbital antiligante, de energi a maior e geralmente desocupado . Para ocorrer a absoro de energia, os eltrons devem ser excitados do orbital inferior menos energtico (ligante) para um superior mais energtico (antiligante), de forma que, como nos orbitais moleculares, a energia necessria igual diferena energtica entre os d ois orbitais. Alm desse tipo de salto, h eltrons no ligantes que saltam para orbitais antiligantes. Em energia crescente, os orbitais podem ser classificados como: ligante sigma, ligante pi, eltrons de pares isolados, antiligante pi, antiligante sigma . Ligaes fortes precisam de mais energia para serem excitadas, assim molculas que possuam somente ligaes covalentes simples sem pares isolados absorvem energia ultravioleta apenas ( < 185 nm), porque estas ondas tem comprimento de onda menor e ener gia maior. A absoro no UV-Vis depende da presena de grupos funcionais com eltrons de valncia com energia de excitao menores - grupos cromforos [4]. Em suma, molculas que possuem ligaes pi e/ou pares isolados absorvem no UV -Vis. O espectro de absorbncia ou grfico de absorbncia obtido aumentando-se o comprimento de onda de um feixe monocromtico de luz e medindo a absorbncia. A absorbncia o inverso do logaritmo da transmitncia, que definida como a razo entre a intensidade de luz emitida para a amostra e a intensidade emitida da amostra. As intensidades emitidas e recebidas variam porque, passando pela amostra, a luz pode sofrer desvios, reflexes, refraes ou absoro. A transmitncia e a absorbn cia tm grandezas arbitrrias. Os mtodos espectrofotomtricos em bioqumica residem basicamente sobre duas leis, que combinadas so conhecidas como a Lei de BeerLambert[1]. Lambert afirma que a frao de luz absorvida por um meio independente da intensidade da luz incidente e que cada cam ada sucessiva do meio absorve a mesma proporo de luz passando por ela, gerando um decaimento exponencial atravs do caminho percorrido na amostra. Isso expressado matematicamente pela equao. Beer afirma que a quantidade de luz absorvida proporciona l quantidade de molculas presentes no meio percorrido pelo feixe, ou seja, a concentrao do substrato.

 importante notar que somente a absorbncia linearmente proporcional concentrao do meio, no a transmitncia. A relao entre as duas grandezas dada por A = log 10 (1/T) = - log10 T. Sendo assim, para determinaes de concentraes usando espectrofotometria, usada a absorbncia. Por exemplo, quando A = 2 apenas 1% da luz incidente transmitida e quando A = 3 apenas 0,1% transmitida . A glicose um carboidrato poliidroxialdedo de seis carbonos. Em sua forma aberta, a funo aldedo est no primeiro carbono, e os outros cinco possuem uma hidroxila lateral. Com exceo do primeiro e sexto carbono, os outros quatro so centros quirais. A D-glicose possui a hidroxila do lado direito do quinto carbono contando a partir do carbono com o grupo aldedo, enquanto a L-glicose a possui do lado esquerdo. Em soluo aquosa, a hidroxila do quinto carbono ataca o primeiro carbono, criando uma cadeia fechada. O anel se arranja no espao de forma a aumentar os ngulos entre as ligaes para estabilizar a estrutura. O primeiro carbono passa a ser mais um centro quiral chamado de carbono anomrico. Quando a hidroxila anomrica est abaixo do plano do anel, diz-se que a glicose do tipo alfa, caso contrrio beta. [referencia]. As enzimas so catalisadores biolgicos que aceleram reaes bioqumicas nos organismos vivos. As enzimas so especficas para um substrato e s reagem catalisando uma reao, de forma que outros compostos no meio reacional permanecem ilesos. Isso devido ao fato da enzima e o substrato terem um encaixe timo, seja do tipo chave -fechadura ou induzido, no qual a enzima torce ou aproxima partes do substrato para incitar a reao. A glicose oxidase (Beta-D-glicose:oxignio 1-oxiredutase; EC 1.1.3.4) uma enzima e cataliza a oxidao de Beta -D-glicose para Delta-D-glicolactona na presena de oxignio molecular. Ela foi descoberta em 1928 por Mller em Aspergilus niger e Penicillium glaucum, e posteriormente em outros fungos, mas no em plantas superiores e animais [5]. Dessa forma, a glicose oxidase um dmero com grupo prosttico FAD - Flavina Adenina Dinucleotdeo - em cada um. Enzimas em tecidos animais que oxidam glicose so fac ilmente diferenciveis da glicose oxidase porque no precisam de oxignio molecular e no geram perxido de hidrognio. Os produtos da catlise de oxidao de

glicose so perxido de hidrognio e um ster cclico, que depois hidrolisado em cido glucnico linear. Esses reagentes so incolores e a reao no pode ser acompanhada por observao a olho nu. Freqentemente o perxido de hidrognio gerado aproveitado em outra reao que possa ident ificar o andamento da primeira.
OBJETIVO

Determinar a concentrao de glicose em amostras biolgicas.

MATERIAIS y

Reagente padro - soluo de glicose de concentrao conhecida de 100mg/dL; Reagente trabalho - glicose oxidase, peroxidase, 4 -aminofenazona, fenol e tampo TRIS; Reativo de trabalho resfriado; Amostra de plasma de ovelha; Ponteira de 10-100L; Pipetador de 10-100L; Ponteira de 100-1000L; Pipetador de 100-1000L; 5 Tubos de ensaio; Gelo; Cubeta.

y y y y y y y y y

MTODOS

Os cinco tubos de ensaio foram marcados como branco, padro I e II e desconhecido I e II.
y y

No tubo branco (B) foram adicionados 2 mL do reativo de trabalho; Nos tubos padro I (P1) e padro II (P2) foram adicionados 20L do reativo padro e 2ml do reativo de trabalh o;

Nos tubos desconhecido I (D1) e desconhecido II (D2) foram adicionados 20L da amostra de plasma e 2ml do reativo de trabalho.

Aps as adies, todos foram homogeinizados e incubados em banho maria a 37C por 10 minutos. Retirados do banho, foram dei xados na bancada para esfriar. Em seguida, foi analisado a absorbncia da amostra e do padro a 505 nm no espectrofotmetro, que foi zerado com a substncia do tudo branco.
RESULTADOS E DISCUSSES

Observou-se que com a adio do reativo padro as

amostras

apresentaram mudana na colo rao, nos primeiros minutos antes do aquecimento, de incolor para rosa, tanto para a soluo padro como para a desconhecida. Sups-se que essa mudana era causada pela quantidade de glicose que cada amostra apresentava, pois houve diferena de tom entre mais forte e mais clara (Figura 1).

Figura 1. Solues aps aquecimento.

Com a anlise no espectrofotmetro, obtivemos os seguintes dados; TUBO B P1 P2 D1 D2 ABSORBNCIA 0,001 0,330 0,366 0,292 0,292

Pela Lei de Lambert -Beer, A = e.b.C, onde A a absorbncia, e a absortividade da soluo analisada, b a espessura da cubeta que contm a amostra e C a concentrao molar do analito, podemos determinar as concentraes de duas amostras do mesmo anali to por comparao. Uma amostra de concentrao conhecida posta no espectrofotmetro e sua absorbncia anotada. A amostra de concentrao desconhecida e a absorbncia anotada tambm. Isolando e.b na frmula, obtemos A/C. Essa razo a mesma para amostras da mesma soluo analisadas na mesma cubeta. Ento temos A p/Cp = Ad/Cd. Com esses, determinamos a concentrao de glicose que era desconhecida, na amostra D1, obtivemos 84,195 e na D2 83,905 mg/dL.

CONCLUSES

A suposio foi confirmada pelo Espectrofotmetro que acusou a presena de glicose nas amostras que continham plasma sanguneo. Usando a metodologia, foi possvel atingir o objetivo proposto : determinar o nvel de glicose em amostras atravs de mtodo enzimtico.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. GORE, M. G. Spectrophotometry and spectrofluorimetry. 2. ed. Oxford, Reino Unido: Oxford University Press, 2000. Disponvel em <http://books. google.com.br/books?id=dCjsBlnQhc4C>. Acesso em 14 out. 2009. 2. SILVA, V. L. da; CERQUEIRA, M. R. F.; MATOS, R. C. Determinao amperomtrica de glicose em mel usando as enzimas peroxidase e glucose oxidase imobilizadas em reator tubular. Sociedade Brasileira de Qumica SBQ, 31 Reunio Anual da SBQ. NUPIS, Dept Quim, Inst Ci enc Exat, UFJF, Juiz de Fora- MG. Disponvel em <http://sec.sbq.org.br/cdrom/31ra/resumos/T0079 1.pdf>. Acesso em 15 out. 2009. 3. K. A. Johnson, J. Chem. Ed., 79, 74 -76 (2002) 4. SOUZA, B. L. C. Espectrofotometria UV-visvel. Departamento de Engenharia Qumica DEQUI - Escola de Engenharia de Lorena EEL/USP. (Slides em PDF). Disponvel em <http://bcortez.files.wordpress.com/2008/08/ espectrofotometria-uv-visivel-seg-sem.pdf>. Acesso em 15 out. 2009. 5. WHITAKER, J. R. Principles of enzymoloy for the food sciences. 2. ed. CRC Press, 1994. 533p. Disponvel em <http://books. google.com.br/books?id=ySi_ pbehlOoC>. Acesso em 10 out. 2009. 6. EVERSE, J.; EVERSE, K. E.; GRISHAM, M. B. Peroxidases in chemistry and biology. vol 2. CRC Press, 1991. 2p. Disponvel em <http://books.google. com. br/books?id=A8gQmQD39UgC>. Acesso em 10 out. 2009. 7. WANG, N. M. Glucose assay by dinitrosalicylic colorimetric method. Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland. Disponvel em<http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab4a.htm>. Acesso em 14 out. 2009. 8. LOPES, F. M. Biosensor espectrofotomtrico para determinao de glicose . Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Gois. Rev. Bio. Neotrop. 4(1): 74-75. 2007. Disponvel em <http://www.revistas.ufg.br/index.php/RBN/article/viewFile/4850/4060>. Acesso em 14 out. 2009.