TESTUL DE HIDROLIZA AL UREEI

Tehnica de lucru: tulpina bacteriana de testat se cultiva pe medii a caror compozitie chimica
se include uree, iar ca indicator de pH rosu fenol (ex: mediul Christensen). Datorita unei
reactii slab acide, mediul are culoare galbuie.
Intrpretarea rezultatelor:
- Reactia pozitiva se manifesta prin virarea culorii mediului de la galben (pH usor acid)
la rosu, datorita alcalinizarii mediului, prin prezenta amoniacului rezultat in urma
desompunerii ureei.
- Reactia negativa: culoarea mediului ramane nemodificata.
TESTUL INDOLULUI
Indolul reprezinta un metabolit rezultat in urma degradarii triptofanului, prin actiunea
triptofanazei bgacteiene asupra lantului sau lateral.
Cea mai raspandita metoda de evidentiere a indolului utilizeaza soutia Erlich-Kovacs. In
prezenta indolului reactivul care are culoare galbena se coloreaza in rosu.
Tehnica de lucru: la 1-2 ml cultura proaspata (24 ore, la 37 grade C in bulion), se adauga
cateva picaturi de reactiv Erlich-Kovacs.
Rectia seiteste ex. tempore, in functie culoarea reactivului, care avand densitate mai mica, se
ridica la suprafata culturii sub forma unui inel.
Interpretarea rezultatelor:
- Reactie pozitiva se manifesta prin virarea in rosu a inelului d reactiv
- Reactie negativa, culoarea culoarea inelului de reactiv ramane nemodificata.
METODE DE EVIDENTIERE A HIDROGENULUI SULFURAT
Hidrogenul sulfrat rezulta in urma degradarii unor aminoacizi care contin sulf (cistina,
cisteina). Evidentierea hidrogenului sulfurat se bazeaza pe realizarea acetatului de plumb
inglobat in mediu sau impregnat in benzi de hartie de filtru.
TESTUL CATALAZEI
Tehnica de lucru: pentru efectuarea acestui test se pot utiliza culturi in mediu lichid sau solid.
In cazul culturii in mediu lichid, la 5 ml cultura proaspata, in bulion, de 24 de ore, se adauga 3
ml solutie 3% H2O2.
Interpretarea rezultatelor:
-reactia pozitiva se manifesta prin aparitia unei efervescente prin degajare de oxigen
-reactie negativa, nu se constata modificari.
TESTUL CAMP(CHRISTIE-ATKINS-MUNCH-PETERSON)
Tehnica de lucru: principiul acestui test consta in potențarea activitatii slab hemolitice a unei
specii bacteriene, in prezenta unei tulpini de stafilococ beta-hemolitic (ex. Streptococcus
agalactiae, Listeria monocytogenes).
Tulpina de stafilococ beta-hemolitic se insamanteaza de-a lungul diametrului placii Petri cu
agar cu sange, apoi perpendicular se însămânțează tulpina de testat. Dupa incubare la
termostat si dezvoltarea culturii se interpreteaza activtatea hemolitica.
Interpretarea rezultatelor:
-reactia pozitiva se manifesta prin aparitia unei zone de hemoliza clara, in zona de hemoliza
slaba proprie stafilococului.
- rectia negativa, nu se observa nici o modificare in zona de hemoliza proprie stafilococului.
SISTEMELE MULTITEST
Avantajul acestor sisteme consta in faptul ca printr-o singura insamantare pe un mediu de
cultura se examineaza mai multe proprietati biochimice. Dintre aceste sisteme, TSI, MIU,
MILF sunt utilizate in special pentru identificarea tulpinilor de Enterobacteriaceae.
1. MEDIUL TSI(TRIPLE SUGAR IRON)
Permite examinarea a 3 glucide: glucoza, zaharoza si lactoza, precum si producerea de
H2S. Mediul are o culoare rosie( contine rosu fenol ca indicator de pH) si reprezinta o
portiune dreapta si una inclinata.
Tehnica de lucru: tulpina de testat se insamanteaza prin intepare in porțiunea dreapta
si prin striere pe suprafata inclinata. Incubarea se realizeaza la 37 grade C.
Interpretarea reultatelor:
- Fermentarea glucozei se manifesta prin virarea in galben a culorii mediului in
portiunea dreapta
- Fementarea lactozei si/sau zaharozei se manifesta prin virarea in galben a culorii
mediului in portiunea inclinata
- Producerea de H2S se manifesta prin virarea in negru a culorii mediului, la limita
dintre zona dreapta si cea inclinata.
2. MEDIUL MIU (MOBILITATE INDOL UREE)
Pemite examinarea hidrolizei ureei, a mobilitatii si a producerii de indol. Mediul este
semisolid,galben transparent (contine rosu fenol ca indicatorde ph). Solidificarea in tuburi
sealizeaza in coloana.
Tehnica de lucru: tulpina de testat se insamanteaza prin intepare, se adauga banda de hartie
indicator de indol si se incubeaza la 37 grade C, 24 de ore, iar tuburile negative se mentin in
continuare pana la 48 de ore.
Interpretarea rezultatelor:
-Hidroliza ureei se manifesta prin virarea in rosu a culorii mediului, datorita
alcalinizarii prin acumulare de amoniac
- Producerea de indol se manifesta prin virarea culorii in rosu a benzii de hartie de filtru
impregnata cu reactiv Erlich-Kovacs
- Mobilitatea se apreciaza pe baza opacifieri mediului in toata masa, tulpinile imobile
dezvoltandu-se numai pe traiectul liniei de insamantare.
3. MEDIUL MILF (MOBILITATE-INDOL-LIZINDECARBOXILAZA-
FENILALANINDEZAMIAZA)
 Tehnica de lucru: dupa repartizarea in tuburi mediul solidifica in coloana.
Tulpina de testat se insamanteaza prin intepare, se adauga banda de hartie indicator de
indol si se incubeaza la 37 grade C, 24 de ore. Tuburile negative se mentin in continuare
pana la 48 ore.
Interpretarea rezultatelor:
- Mobilitatea se apreciaza pe baza opacifierii mediului in toata masa, tulpinile imobile
dezvoltandu-se numai pe traiectul liniei de insamantare.
- Producerea de indol se manifesta prin virarea culorii in rosu a benzii de hartie de filtru
impregnata cu reactiv Erlich-Kovacs
- Producerea fenilidezaminazei se evidentiaza prin adugarea a 2-3 picaturi de solutie
10% clorura ferica acidifiata 5% cu HCl, solutie 10%. Reactia pozitiva se manifesta
prin colorarea in verde a inelului de rezultat sub actiunea fenildezaminazei bateriene
- Testul lizindecarboxilazei este pozitiv daca se observa alcalinizarea mediului,
manifestata prin colorarea in violet datorita decarboxilarii lizinei in cadaverina
- Reactie negativa, nu se constata modificari, mediul are o culoare galbena.
Metoda filtrării prin membrană
Principiu: concentrarea microorganismelor din probe relativ mari pe suprafața unor filtre
membrană urmată de incubare a acestora pe medii de cultură.
Aplicatii: analiza microbiologică a apei potabile și a apelor naturale a diferitelor băuturi a
zahărului a produselor cosmetice etc.
Avantajele metodei: pot fi testate volume mai mari de probe efecte de concentrare
rezultate cantitative posibilități de arhivare.
Materiale si echipamente: membrană filtru (policarbonat/ amestec de esteri-celuloză
porozitate adecvată), medii de cultura (cartonașe impregnate cu mediul nutritiv cartonașe
absorbante de umezit cu mediul nutritiv lichid medii nutritive cu agar sau gelatină ca
agent solidificator) pâlnie, pompă vid, incubator numărător colonii, etc.

Standard plate count SPC

Numărarea coloniilor prin însămânțare pe mediu de cultură este cea mai folosită metodă
pentru determinarea numărului total de germeni viabili din alimente și apă.
Procedura:
1. Din proba de analizat se fac diluție decimale succesive
2. Însămânțarea inoculului:
 - Prin inglobare: din fiecare diluție se pretează câte un mililitru în cutii Petri peste care
se toarnă 14-15 ML mediu de cultură 45 de grade Celsius; se amestecă prin mișcări
circulare, fara a ridica cutiile de pe masă, metoda preferată pentru bacterii anaerobe
sau microaerofile;
- La suprafață inoculând 0,1-0,5 ml se distribuie uniform pe suprafața mediului solid;
metodă preferată pentru: determinarea bacteriilor psihotrofe, care nu suportă
temperatura crescută a agarului topit; identificarea bacteriilor pe baza caracterelor de
cultură (coloniile cresc la suprafața mediului, iar aspectul lor poate fi urmărit)
cultivarea bacteriilor aerobe ;
3. Incubare 48 ore-5 zile la diferite temperaturi în funcție de cerințele microorganismelor
țintă
4. Numărarea coloniilor rezultate (se iau în calcul plăcile în care sau dezvoltată între 25
și 250 colonii)
5. Rezultatul se exprimă în unități formatoare de colonii (CFU/ml) si se calculează
conform formulei:

CFU/ml =numar colonii x factor de dilutie

———————————————
Volumul insamntat (ml)

Most probable number (MPN)

Se realizează dilicii succesive 1 pe 10 din produsul de testat
Pentru a mări acuratețea statistică (deoarece bacteriile pot să nu fie uniform distribuite
în mediu) 1 ml din fiecare din fiecare dilutie se inoculează în 3 tuburi cu medii de
cultură lichide (9 ML bulion sau TSB) care se incubează
Se notează numărul de probe pozitive (tulburare, prezența de gaz pentru coliformi) din
cele trei inoculate pentru fiecare din dilutie. Rezultatele se exprimă conform tabelului
Mac Crady (Tabel standard MPN)
Se propune următorul exemplu: Dacă sau confirmat bacterii coliforme în trei eprubete
cu diluția 10 la minus 1, În două eprubete cu diluția 10 la -2 și intr-o eprubetă cu
diluția 10 la minus 3, se obține combinația de trei cifre 321, în dreptul căreia se va
citi, din tabelul Mac Crady, numărul cel mai probabil de bacterii coliforme.

Metoda petrifilmelor
Principiu: mediul de cultură specific ( in general, in mediu selectiv), deshidratat este fixat pe
un suport adeziv și acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de cercetat,
lichidul hidratează mediul și prin termostatare este posibilă dezvoltarea microorganismelor.
Se recomandă pentru evaluarea calității microbiologice a numeroase categorii de produse
alimentare: lapte și produse lactate, carne și preparate din carne, ouă legume și fructe, cereale
și produse cerealiere, condimente.
Avantaje: metodă simplă evaluare eficientă tip de analiză redis cost redus al analizelor/probe
o productivitate ridicată în ceea ce privește numărul de probe analizate/oră.
 Etape: se diluează proba prin tehnica diluțiilor decimale până la o concentrație potrivită se
ridică filmul superior se pipetează un mililitru suspensie în centrul Petrifilmului se eliberează
filtrul superior care se lasă să cadă liber cu ajutorul dispozitivului de răspândire se presează
ușor deasupra zonei inoculate pentru distribuția uniformă a celulelor din suspensie pe toată
suprafața circulară a mediului de Cultură se îndepărtează dispozitivul de răspândire și se
așteaptă un minut pentru solidificarea mediului incubare interpretare se numără coloniile
formate se poate observa și producerea de gaz
Proba reductazei
Principiu gradul de contaminare al unui produs se corelează cu durata în care se produce
modificarea culorii unor indicatori redox ( albastru de metilen, resazurina) sub acțiunea
reductazei sintetizate de celulele vi prezente în produs
Indicatii: evaluarea calității microbiologice a laptelui
Determinări cantitative ale bacteriilor în forma sporulata
Bacterii producătoare de spori cu implicați în industria alimentară: Bacillus spp. (Bacterii
aerobe), Clostridium spp. (Bacterii anaerobe).
Exemplu: numararea sporilor din piper.
Se cântărește un g piper se adaugă în 99 ML ser fiziologic steril amestecul se încălzește la 80
de grade Celsius 30 de minute pentru distrugerea formelor vegetative se așteaptă 10 minute
pentru sedimentarea particulelor mari opțional se fac diluții succesive din fiecare diluție se
fac însămânțări pe medii de cultură în triplicat se incubează în condiții optime 37 grade
Celsius în aerobioză sau anaerobioză se numără coloniile pe fiecare placă și se face media
între valorile de pe cele trei plăci pentru fiecare dilutie se precizează numărul de CFU/gram
produs prin ajustări de volum și de diluție.

Identificarea biochimică semiautomată

Identificarea biochimică semiautomată Evaluează aproximativ 20 de caractere biochimice
simultan pe test de tip API
Etape (exemplu pentru identificare pe teste API-bioMérieux)
- triburile api se deschid din folie și se inserează în tăvița corespunzătoare
- seprepara suspensie standard Mcfarland, conform cerintelor testului
- se pipeteaza inoculul in fiecare godeu al stripului
-pentru conditii de microaerofile, se astupa godeul cu ulei natural
- se acopera tavitacu capacul corespunzator
- se incubeaza
-se citesc modificarile de culoare din fieca godeu si se marcheaza pe fisa de interpretare cu +
sau-
-se contureaza un cod specific pe baza +sau-, care se compara cu baza de date
- Identificarea speciei seraporteaza ca % de similaritate
BOALA EXPERIMENTALA
In microbiologie se folosesc animale de laborator in diferite scopuri prepararea vaccinurilor,
cercetare stiintifica, in cadrul identificarilor pentru cultivarea microorganismelor si studierea
patogenitatii acestora.
Cel mai frecvent se folosesc: soarei, cobai, sobolani, hamsteri, iepuri, pisici, maimute, ovine,
etc.
Animalele se aleg in functie de receptivitatea fata de agentul patogen inoculat. Se pot utiliza
animale „germ free” – nu contin flora microbiana , sunt crescute in conditii de asepie;
animale”gnotobiotice”-specii ”germ free” inoculate cu tulpini microbiene cunoscute
Cresterea si intretinerea animalelor de laborator presupune existenta a trei
incaperi(crescatorie, camera pentru inoculari si interventii chirurgicale aseptice) si o camera
pentru intretinerea animalelor inoculate, precum si asgurarea unor conditii optime de
temperatura, aeratie, caldura si hrana.
Inocularea animalelor:
- Se realizeaza doar cu acordul Comisiilor de Etica a Cercetarii sau a structurilor
organizatorice specifice
- Cunoasterea regulilor de manipulare a animalelor
- Operatiile dureroase petnru animale necesita anestezie
- Cai de inoculare: intradermic, subcutanat, intramuscular, intraperitoneal, intravenos,
intrazanal, etc., functie de agentul patogen
- Dupa inoculare animalele se supravegheaza zilnic: se noteaza toate modificarile
aparute; daca animalul moare spontan se vor recolta probe biologice, fragmente de
organe care se pot analiza prin metoda descrisa anterior.