Replicarea ADN

Reprezint procesul de copiere fidel a succesiunii de nucleotide din moleculele de ADN, deci a informaiei genetice, n scopul transmiterii acesteia de-a lungul generaiilor celulare. Procesul se desfoar n faza S a ciclului celular. Este o reacie de polimerizare, are loc cu o rat de 500 nucleotide/secund la bacterii i de 50 nucleotide/secund la celulele de mamifere. Durata fazei S este de aproximativ 8 ore rezultatul fiind 2 cromozomi perfect identici cu cel de origine, unii prin intermediul centromerului pn n metafaza mitozei. Duplicarea cromozomilor implic att replicarea moleculei lungi de ADN a fiecruia, ct i asamblarea la ADN-ul nou format a noi proteine cromozomiale, ceea ce duce la formarea cromatinei. Viteza i acurateea sunt asigurate de o "main replicativ" complex, reprezentat de un complex multienzimatic.

Fidelitatea replicaiei ADN

Secvena de nucleotide a ADN-ului (sau a unei secvene de ADN) este duplicat prin mperecherea complementar de baze (A cu T i G cu C), ntr-o secven nucleotidic complementar. Procesul presupune recunoaterea fiecrui nucleotid i implic n mod obligatoriu separarea tranzitorie a celor dou lanuri complementare ale dublului helix de ADN, astfel ca gruprile acceptoare i donoare ale fiecrei legturi de hidrogen ale bazelor azotate s apar expuse pentru mperechere. Procesul este catalizat de o enzim de polimerizare a nucleotidelor denumit ADN-polimeraza.

ADN-polimeraza catalizeaz adiia "treapt cu treapt" a dezoxiribonucleotidelor, la captul 3'-OH al unui lan polinucleotidic preexistent (lanul primer) care se afl mperecheat la lanul matri.

n timpul replicaiei, fiecare caten veche de ADN servete ca matri pentru sinteza unei catene noi. Astfel, secvena ADN de o lungime enorm este replicat "semiconservativ" de ctre ADN-polimeraz.

"Furca replicativ"
Denumit astfel deoarece regiunea aflat n replicare ce se mic de-a lungul helixului de ADN parental are o form de Y. La nivelul furcii replicative, helixul ambelor molecule noi de ADN este sintetizat de un complex enzimatic extrem de sofisticat care conine i ADN-polimeraza.

Iniierea replicrii

Shortcut to replication.lnk

Furca replicativ este iniiat la nivelul unor secvene speciale de ADN numite origini de replicare; replicare Viteza de deplasare a furcii replicative este de 50 nucleotide/secund; Pe cromozomii eucarioi exist mai multe origini de replicare care se mic simultan; Furcile replicative funcioneaz grupat fiind activate simultan cte 20-80 de origini ce constituie uniti replicative; replicative n interiorul unei uniti replicative, fiecare origine de replicare este separat de cealalt printr-un spaiu de 30.000-300.000 de nucleotide; La fiecare origine de replicare se formeaz cte dou furci de replicare care se mic n direcii opuse, pn ce se ntlnesc cu furca de replicare a originii de replicare nvecinate care vine din direcie opus;

Replicarea pe lanul "tardiv"

ADN-polimeraza are nevoie pe lanul tardiv, din timp n timp, pe msur ce furca se desface, de cte un capt 3'-OH nou; Sinteza se face n salturi, la fiecare salt fiind necesar un nou primer ARN sintetizat de o ARN-primaz; Primerii ARN sunt secvene lungi de 10 ribonucleotide sintetizate la intervale regulate pe lanul tardiv; n momentul n care ADN-polimeraza ntlnete captul 5' al primerului ARN din fragmentul anterior intervine o RN-az ce rupe fragmentele de ARN primer iar spaiile rmase goale sunt ocupate de nucleotidele corespunztoare; Ultima etap este realizat de o ADN-ligaz ce sudeaz capetele fragmentelor Okazaki;

Proteinele de la nivelul furcii replicative

Proteinele helix-destabilizatoare, numite i proteine SSB ("single-strand DNA-binding proteins"), se leag la catenele de ADN desfcute din helix, fr a acoperi bazele. Ele stabilizeaz forma desfurat a monocatenelor.

Corectarea erorilor de replicare

Fidelitatea copierii ADN n cursul replicrii nalt(max. 1 eroare/10 ); Formele tautomerice se pot mperechea greit; Ex: forma tautomeric a C se mperecheaz cu A n loc de G, ceea ce poate cauza o mutaie; ADN-polimeraza ncepe sinteza unui polinucleotid de la captul 3'-OH al unui primer ce este mperecheat cu o secven complementar de pe lanul matri ; Un nucleotid adugat greit (nemperecheat) nu poate reprezenta capt de continuare a sintezei fiind tiat de o subunitate a ADN-polimerazei ce are astfel o activitate 3'5' exonucleazic ;

Proteinele de la nivelul furcii replicative

ADN-helicaza, hidrolizeaz ATP helicaza pentru a se mica rapid de-a lungul unei monocatene de ADN; ADN-topoizomerazele funcioneaz ca "nucleaze reversibile ce determin iniial ruperea dublei catene de ADN "n amonte" de furca replicativ, slbind tensiunea care s-a creat n molecul i apoi legarea la loc a capetelor libere;

Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare

Etapele de la apariia unei leziuni n secvena ADN: recunoatere, evaluare (CP), rspuns (R, A); Cile mecanismelor celulare de reparare ADN: excizia bazelor (BER), excizia nucleotidelor (NER), excizarea mononucleotidic a bazelor mperecheate greit (MMR);

Rspunsurile la apariia unei leziuni n secvena ADN.

A. Post-recunoatere i evaluare are loc sinteza translezional a ADN. B. Repararea implic excizia bazelor i sinteza n condiiile prezenei ADN-ului dublucatenar. Bazele mperecheate greit - rezultate n urma erorilor din timpul replicrii ADN, sunt excizate ca mononucleotide. O baz degradat este excizat fie individual (reparare prin excizia bazelor) sau n cadrul unei secvene oligonucleotidice (reparare prin excizie oligonucleotidic). C. Celula dispune de o reea complex de semnalizare ce blocheaz ciclul celular, avnd n permanen la dispoziie opiunea morii celulare programate. Imagine preluat din articolul cu titlul: Defying death after DNA damage (Rich et al., 2000a).

Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare

Proteinele implicate n mecanismul MMR de reparare a erorilor (partea I). Proteine MSH2-MSH6 (MutS) MSH2-MSH3 (MutS) MLH1-PMS2 (MutL) MLH1-MLH3 (MutL) MSH4-MSH5 EXO1 ANKRD17 Funcii
Repararea erorilor de mperechere: eroare singular de tip baz-baz i IDL de 1-2 mperechere: singular baz baz 1baze Repararea unor IDL singulare i unor IDL-uri 2 baze. Aciune parial suprapus IDLbaze. Ac par suprapus heterodimerului Msh2-Msh6 Msh2Mediator al evenimentelor: de la ataarea la locusul mperecherii greite a evenimentelor: ata gre omologilor MutS pn la sinteza de reparare a ADN. pn Are funcii i n recombinarea n meioz; func meioz Repar: erorile singulare de tip baz-baz i IDL de 1-2 baze fiind un sistem de Repar baz baz 1rezerv pentru MutL. rezerv MutL Principala funcie este legat de recombinarea n meioz. func legat meioz Repararea rupturilor ADN-ului dublu-catenar n meioz i mitoz ADNdublumeioz mitoz Excizia ADN dublu-catenar dubluSupraexprimarea ANKRD17 promoveaz intrarea n faza S; promoveaz Depleia sa prin siRNA: Deple siRNA: - blocheaz progresia ciclului celular; blocheaz celular; - conduce la supra-expresia p53 i p21; supra- diminueaz nivelul de ncrcare al proteinelor Cdc6 i PCNA pe molecula ADN diminueaz nc sugernd implicarea sa direct n mecanismul replicrii. direct replic rii.

Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare

Proteinele implicate n mecanismul MMR de reparare a erorilor (partea II). II). Proteine MLH1-MLH2 (hPMS1) (MutL) Complexul RFC PCNA Funcii
La om nu se cunoate funcia heterodimerului. cunoa func heterodimerului. ncarc PCNA; ncarc Moduleaz polaritatea exciziei Moduleaz Interacioneaz cu omologii MutS and MutL; Interac ioneaz MutL; Recrutez proteinele MMR la MM; Recrutez Augumenteaz specificitatea de legare la MM a Msh2-Msh6; Augumenteaz Msh2Particip la excizie i probabil la semnalizare; Particip semnalizare; Particip la sinteza de reparare a ADN. Particip Excizia ADN mono-catenar monoMutator sinergic cu Exo1 mutant Sinteza de reparare exact a ADN exact Particip la excizie i la sinteza ADN Particip Sigileaz molecula ADN prin formarea post-sintetic a legturilor fosfoSigileaz post- sintetic leg fosfodiesterice

3_ exo a Pol 3_ exo a Pol ADN pol RPA ADN ligaz

Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare

Principalii heterodimeri implicai n mecanismul MMR. A. Compoziia heterodimerilor MutS i MutS. B. Compoziia heterodimerilor MutL i MutS.

CAP.2. GENETICA SOMATIC A PROCESELOR MALIGNE COLORECTALE 2.7 Genele i mecanismele de reparare a erorilor de replicare
Sistemul MMR uman reconstruit - etapele procesului de reparare.
MutS (sau MutS) legat la locusul unde s-a produs eroarea de tip MM (triunghiul rou) recruteaz MutL. Acest complex sufer o schimbare conformaional indus de ATP, rezultatul fiind deplasarea de la locusul MM. (a) Complexul ce se deplaseaz n direcia 5' ntlnete RFC legat la captul 5' al catenei ntrerupte. Ulterior desprinde RFC de pe ADN i ncarc EXO1. Exonucleaza activat ncepe degradarea catenei n direcia 5'3', monocatena rmas fiind stabilizat de RPA. Dup nlturarea MM, EXO1 nu mai este stimulat de MutS i este inhibat intens de MutL. ADN polimeraza este ncrcat la captul 5' al discontinuitii iniiale unde se afl PCNA. Acest complex particip la sinteza de reparare, fisura rmas ntre fragmente fiind reparat de ADN ligaz. (b) Complexul ce se deplaseaz n direcia 3' ntlnete molecula PCNA legat la captul 3' al catenei ntrerupte. Recrutarea EXO1 conduce la degradarea catenei dintre discontinuitatea original i MM, posibil prin cteva ncrcri repetate ale EXO1. RFC este legat la captul 5' al discontinuitii pervenind degradarea catenei (la distan de MM). Dup nlturarea MM activitatea EXO1 este inhibat prin legarea sa de RPA i MutL, secvena lips fiind sintetizat de ADN polimeraza i sigilat de ADN ligaza care finalizeaz procesul de reparare. Imagine preluat din: The multifaceted mismatch-repair system. Jiricny J. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 May;7(5):335-46.

Asamblarea histonelor pe parcursul procesului de replicare

La eucariote ADN-ul este replicat n starea sa structurat sub form de cromatin, deci complexat cu proteinele histonice. Majoritatea organismelor posed copii multiple ale fiecrei gene histonice(histonele fiind sintetizate aproape exclusiv n faza S a ciclului celular); Ipotez: n momentul cnd furca replicativ ajunge la nivelul nucleozomului, se presupune c acesta se desface n doi "seminucleozomi" permind astfel ADN-polimerazei s copieze lanul desfcut;

Ipotez: replicarea pe ADN-ul eucariot organizat n cromatina nuclear