Metode

analitice în
biochimie

Partea a-II-a

Introducere în
electroforeză

Gheorghe Stoian
În memoria lui Costas Drainas
 Cuprins
Introducere..............................................................................................................................................................10
Istoricul electroforezei ............................................................................................................................................11
1.Concepte de bază în electroforeză .......................................................................................................................12
1.1. Ecuații de migrare electroforetică ....................................................................................................................12
1.2. Mobilitatea electroforetică ...............................................................................................................................14
1.3. Rezoluția de separare .......................................................................................................................................15
1.4. Factorii care influențează rezoluția de separare și mobilitatea electroforetică .................................................16
1.4.1. Tăria ionică (forța ionică) .............................................................................................................................16
1.4.2. Efectul termic Joule ......................................................................................................................................17
1.4.3. Electro(endo)osmoza ....................................................................................................................................18
1.4.4. Aparatura utilizată la separările electroforetice.............................................................................................19
2.Electroforeza în mediu liber ................................................................................................................................20
2.1. Avantajele utilizării electroforezei frontale......................................................................................................21
2.2. Dezavantajele electroforezei frontale ...............................................................................................................22
2.3. Aplicații ale electroforezei frontale..................................................................................................................22
2.3.1 Electroforeza frontală în flux continuu ..........................................................................................................22
1.3.2. Focalizarea izoelectrică în flux continuu ......................................................................................................24
1.3.3. Izotacoforeza în flux continuu ......................................................................................................................26
1.3.4. Electroforeza frontală cu trepte de câmp electric ..........................................................................................26
1.3.5. Separarea populațiilor de celule prin electroforeză în flux continuu .............................................................27
1.3.6. Electroforeza frontală pe coloană..................................................................................................................28
3.Electroforeza zonală ............................................................................................................................................30
3.1.Electroforeza pe hârtie ......................................................................................................................................31
3.1.1. Electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă ......................................................................................................35
3.2.Electroforeza pe strat subțire ............................................................................................................................35
3.3.Electroforeza pe folii de acetat de celuloză .......................................................................................................37
3.3.1.Microelectroforeza pe acetat de celuloză .......................................................................................................38
3.3.2.Aplicații ale electroforezei pe membrane de celuloză ....................................................................................38
Bibliografie .............................................................................................................................................................39
3.4.Electroforeza pe gel din amidon .......................................................................................................................40
Bibliografie .............................................................................................................................................................43
3.5.Electroforeza pe gel de agaroză ........................................................................................................................44
3.1.1.Echipamente și sisteme tampon .....................................................................................................................46
3.1.2.Aplicațiile electroforetice ale agarozei ...........................................................................................................48
3.1.2.1.Interpretarea unei electroforegrame ............................................................................................................49
3.1.2.2. Profilul electroforetic al proteinelor fluidului cerebrospinal comparativ cu cele din plasmă .....................54
3.1.2.3. Profilul electroforetic al proteinelor din urină comparativ cu cele din plasmă ...........................................55
3.5.2.4. Proteinuria Bence Jones .............................................................................................................................56
3.5.3.5. Electroforeza proteinelor urinare pe gel de agaroză în prezență de dodecil sulfat de sodiu .......................56
3.5.2.7. Electroforeza proteinelor: acetat de celuloză vs gel de agaroză, inspecție vizuală vs densitometrie ..........59
3.5.2.8. Electroforeza hemoglobinelor ....................................................................................................................60
3.5.2.9. Electroforeza fragmentelor de ADN în gel de agaroză ..............................................................................60
3.5.2.8.1. Electroforeza în câmp electric pulsator a fragmentelor de ADN.............................................................63
3.5.2.10. Microelectroforeza proteinelor în gel de agaroză .....................................................................................65
3.1.3.Concluzii........................................................................................................................................................65
3.6.Electroforeza proteinelor pe geluri de poliacrilamidă .......................................................................................66
3.6.1. Agenți de reticulare.......................................................................................................................................67
3.6.2. Reacția de polimerizare ................................................................................................................................ 69
3.6.3. Factorii de care depinde viteza reacției de polimerizare .............................................................................. 71
3.6.4. Proprietățile gelului de poliacrilamidă. ........................................................................................................ 72
3.6.4.1. Efectul de cernere moleculară ................................................................................................................... 72
3.6.4.2. Dependența de concentrația de monomeri, T[%] și C[%] ......................................................................... 73
3.6.5. Strategia de separare a proteinelor pe geluri din poliacrilamidă................................................................... 74
3.6.5.1. Compoziția chimică, concentrația și structura gelului de poliacrilamidă .................................................. 74
3.6.5.2. Forma gelului ............................................................................................................................................ 76
3.6.6. Condiții de separare ..................................................................................................................................... 77
3.6.6.1. Electroforeza în condiții denaturante ........................................................................................................ 78
3.6.6.2. Electroforeza proteinelor în condiții nedenaturante .................................................................................. 81
3.6.6.3. Electroforeza proteinelor serice cu gel suplimentar de concentrare format din Blue Sepharose CL-6B ... 82
3.6.7. Sisteme tampon ............................................................................................................................................ 82
3.6.7.1. Sisteme de tampon discontinue ................................................................................................................. 83
3.6.7.1.1. Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în sistem Ornstein-Davis ...................................................... 84
3.6.7.1.2. Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în sistem Laemmli ................................................................ 86
3.6.7.2. Sisteme de tampon continue...................................................................................................................... 86
3.6.7.3. Alte sisteme tampon .................................................................................................................................. 87
3.6.7.4. Alegerea sistemului tampon ...................................................................................................................... 87
3.6.8. Estimarea masei moleculare prin SDS-PAGE ............................................................................................. 89
3.6.8.1. Markeri de masă moleculară utilizați în SDS-PAGE ................................................................................ 90
3.6.8.2. Premarcarea cu coloranți fluorescenți. ...................................................................................................... 93
3.6.9. Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în gradient de porozitate ............................................................. 94
3.6.9.1. Aplicații ale electroforezei pe geluri de poliacrilamidă în gradient de pori ............................................... 98
3.6.10. Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în prezența bromurii de cetil-trimetil-amoniu (CAT-PAGE).. 100
3.6.10.1. Determinarea masei moleculare a proteinelor, cu păstrarea activității lor biologice ............................. 102
3.6.10.1.1. Principiile de bază ale separării proteinelor prin CAT-PAGE............................................................ 103
3.6.11. Variante ale electroforezei pe gel de poliacrilamidă în condiții native ..................................................... 105
3.6.11.1. Electroforeza nativă pe gel de poliacrilamidă în prezență de Coomasie (BN-PAGE) ........................... 105
3.6.11.1.1. Avantajele și limitările BN-PAGE ..................................................................................................... 112
3.6.11.2. Electroforeza nativă pe geluri de poliacrilamidă incolore (CN-PAGE) ................................................ 113
3.6.11.2.1. Avantajele și limitările CN-PAGE ..................................................................................................... 115
3.6.11.3. Electroforeza proteinelor bazice pe geluri de poliacrilamidă în sistem acid acetic-uree ....................... 115
3.6.11.3.1. Electroforeza proteinelor pe geluri de poliacrilamidă în prezență de fenol-acid acetic-uree .............. 116
3.6.12. Separarea amestecurilor de oligonucleotide prin PAGE în condiții denaturante ...................................... 118
Bibliografie .......................................................................................................................................................... 118
3.7 Separarea proteinelor pe geluri de poliacrilamidă prin focalizare izoelectrică ............................................... 126
3.7.1. Focalizarea izoelectrică cu amfoliți transportori. ....................................................................................... 126
3.7.2. Focalizarea izoelectrică cu gradienți de pH imobilizați ............................................................................. 128
3.7.3. Strategia de separare a proteinelor pe geluri de poliacrilamidă prin focalizare izoelectrică ....................... 130
3.7.3.1. Forma gelurilor ....................................................................................................................................... 131
3.7.3.2. Compoziția chimică, concentrația și structura gelului ............................................................................. 131
3.7.3.3. Îndepărtarea amfoliților din gel ............................................................................................................... 133
3.7.4. Rezoluția de separare în focalizarea izoelectrică ........................................................................................ 133
3.7.5. Aparatura utilizată în focalizarea izoelectrică ............................................................................................ 134
3.7.6. Avanjele și dezavantalele focalizării izoelectrice ....................................................................................... 135
3.7.6.1. Instabilitatea gradientului de pH ............................................................................................................. 135
3.7.6.2. Concluzii ................................................................................................................................................. 136
Bibliografie ...........................................................................................................................................................136
3.8. Separarea proteinelor prin electroforeză bidimensională pe gel de poliacrilamidă ........................................138
3.8.1. Pregătirea probei în vederea 2-D PAGE .....................................................................................................138
3.8.2. Principiul separării proteinelor prin 2D-PAGE ...........................................................................................141
3.8.3. Avantajele și limitările electroforezei bidimensionale pe geluri de poliacrilamidă .....................................144
3.8.5. Variante ale electroforezei bidimensionale .................................................................................................145
3.8.5.1. Electroforeza bidimensională pe geluri de poliacrilamidă în sistem BN/SDS .........................................145
3.8.5.2. Electroforeza bidimensională pe geluri de poliacrilamidă în sistem BAC/SDS .......................................145
3.8.5.3. Gel-electroforeza bidimensională virtuală ...............................................................................................147
Bibliografie ...........................................................................................................................................................148
3.9. Electroforeza preparativă ...............................................................................................................................153
3.9.1. Metode de recuperare a proteinelor din geluri ............................................................................................156
3.9.1.1. Electroeluția proteinelor din gelul de poliacrilamidă ...............................................................................156
3.9.1.2. Factorii care afectează recuperarea proteinelor din gel. ...........................................................................156
3.9.1.3. Proceduri premergătoare electroeluției ....................................................................................................158
3.9.1.2.1. Localizarea proteinei de interes ............................................................................................................158
3.9.1.2.2. Pretratamentul gelului excizat ...............................................................................................................159
3.9.1.4. Metode de electroeluție ............................................................................................................................160
3.9.1.3.1. Capturarea proteinei eluate pe membrane semipermeabile ...................................................................160
3.9.1.3.2. Electroeluția în tuburi de dializă ...........................................................................................................160
3.9.1.3.3. Electroelutorul de tip vertical ................................................................................................................161
3.9.1.3.4. Electroeluterul de tip orizontal ..............................................................................................................162
3.9.1.3.5. Electroeluterul de tip pasaj ....................................................................................................................162
3.9.1.3.6. Capturarea proteinei printr-un sistem discontinuu de gradient de conductivitate..................................163
3.9.1.3.7. Capturarea proteinei eluate intr-un sistem de tampon de concentrare în stare de echilibru ...................164
3.9.1.3.8. Capturarea proteinei eluate prin stivuire în stare staționară, cu ionul frontal concentrat .......................165
3.9.1.3.9. Capturarea proteinei prin electroeluție în câmp electric inversat ..........................................................165
3.9.1.5. Monitorizarea procesului de electroelutie ................................................................................................166
3.9.1.6. Tratamente post-electroeluție a proteinelor recuperate ............................................................................166
3.9.1.7. Eluţia continuă a proteinelor după electroforeza pe gel de poliacrilamidă la scală preparativă ...............167
3.9.2. Metode de recuperare a acizilor nucleici din gelurile de agaroză ...............................................................168
3.9.2.1. Eluţia acizilor nucleici din geluri de agaroză ...........................................................................................168
3.9.3. Electroforeza preparativă a organitelor și particulelor celulare în geluri de agaroză ..................................170
3.9.4. Electrodializa preparativă a proteinelor din geluri de amidon.....................................................................171
3.9.5. Electroeluția proteinelor după SDS-PAGE, fără secționarea gelului ..........................................................173
3.9.6. Eluţia enzimelor din geluri..........................................................................................................................174
3.9.7. Concluzii.....................................................................................................................................................174
Bibliografie ...........................................................................................................................................................175
3.10. Geluri compozite de agaroză/poliacrilamidă ................................................................................................181
3.10.1. Geluri compozite în analiza proteinelor ....................................................................................................183
Bibliografie ...........................................................................................................................................................185
3.11. Izotacoforeza ...............................................................................................................................................187
3.11.1. Caracteristicile procesului de separare prin izotacoforeză ........................................................................188
3.11.1.1. Migrarea cu aceeași viteză .....................................................................................................................189
3.11.1.2. Separarea componentelor printr-un model de tren ionic ........................................................................189
3.11.1.3.Efectul de îngustare a zonei ....................................................................................................................190
3.11.1.4. Efectul de reglare a concentrației ...........................................................................................................190
3.11.2.Aplicații ale izotacoforezei ........................................................................................................................191
3.11.2.1.Izotacoforeza preparativă ....................................................................................................................... 193
3.11.2.2.Izotacoforeza analitică ........................................................................................................................... 193
3.11.3.Aparatura utilizată în tehnicile de izotacoforeză ....................................................................................... 195
3.11.4. Avantajele utilizîrii tehnicii izotacoforetice ............................................................................................. 198
Bibliografie .......................................................................................................................................................... 199
3.12. Electroforeza capilară ................................................................................................................................. 202
3.12.1. Principii de bază în electroforeza capilară ................................................................................................ 202
3.12.1.1. Parametrii de migrare în electroforeza capilară ..................................................................................... 202
3.12.2. Electroendosmoza în electroforeza capilară ............................................................................................. 203
3.12.3. Aparatura utilizată în electroforeza capilară ............................................................................................. 205
3.12.4. Variante ale electroforezei capilare .......................................................................................................... 205
3.12.4.1. Electroforeza zonală capilară ................................................................................................................ 205
3.12.4.2. Focalizarea izoelectrică capilară ........................................................................................................... 207
3.12.4.3. Cromatografia electrocinetică capilară micelară ................................................................................... 209
3.12.4.3. Separări chirale ..................................................................................................................................... 210
3.12.4.4. Gel electroforeza capilară...................................................................................................................... 210
3.12.4.5. Izotachoforeza capilară ......................................................................................................................... 211
3.12.5. Aplicații ale electroforezei capilare.......................................................................................................... 212
3.12.5.1. Analize genetice .................................................................................................................................... 213
3.12.5.2. Analize de produse farmaceutice care conţin în structura lor baze azotate ........................................... 213
3.12.5.3. Analize de enantiomeri (produse farmaceutice cu centrii chirali) ......................................................... 214
3.12.5.4. Analize de ioni ...................................................................................................................................... 214
3.12.5.5. Caracterizarea unor proteine ................................................................................................................. 214
3.12.5.6. Analize de greutăți moleculare prin electroforeză pe gel, în prezență de SDS. ..................................... 215
3.12.5.7. Analize de focalizare izoelectrică. ......................................................................................................... 215
3.12.5.8. Analize de carbohidraţi. ........................................................................................................................ 215
3.12.5.9. Cartografierea peptidelor ...................................................................................................................... 215
Bibliografie .......................................................................................................................................................... 217
3.13. Electroforeza de afinitate ............................................................................................................................ 219
3.13.1. Imobilizarea liganzilor în gel ................................................................................................................... 220
3.13.2. Condiții de electroforeză .......................................................................................................................... 223
3.13.3. Aplicații calitative şi cantitative ale electroforezei de afinitate ................................................................ 224
3.13.4. Electroforeza de afinitate cu metal imobilizat .......................................................................................... 226
Bibliografie .......................................................................................................................................................... 227
3.14. Imunoelectroforeza ..................................................................................................................................... 230
3.14.1. Electroimunoanaliza monodimensională.................................................................................................. 232
3.14.2. Electroimunoanaliza bidimensională ....................................................................................................... 234
3.14.3. Condiții de separare în imunoelectroforeză .............................................................................................. 235
3.14.3.1. Tampoane utilizate în imunoelectroforeză ............................................................................................ 235
3.14.3.2. Aditivi utilizați în imunoelectroforeză .................................................................................................. 236
3.14.3.3. Antiseruri și anticorpi............................................................................................................................ 239
3.14.3.4. Aplicații ale imunoelectroforezei calitative și cantitative ...................................................................... 242
3.14.4. Contraimunoelectroforeza ........................................................................................................................ 243
3.14.5. Concluzii .................................................................................................................................................. 244
Bibliografie .......................................................................................................................................................... 246
4. Metode de detecție postelectroforetică a proteinelor ........................................................................................ 250
4.1. Evidențierea nespecifică a proteinelor prin Colorații cu compuși organici sau cu săruri anorganice ............ 251
4.1.1. Colorația cu Coomassie Brilliant Blue ....................................................................................................... 252
 4.1.2. Alți coloranți organici utilizați în evidențierea postelectroforetică .............................................................257
4.1.3. Colorația “Stains-All” .................................................................................................................................257
4.2. Colorația cu argint .........................................................................................................................................258
4.3. Strategii de marcare postelectroforetică multiplă ...........................................................................................265
4.4. Colorații reversibile .......................................................................................................................................267
4.4.1. Colorația cu ioni de cupru ...........................................................................................................................268
4.4.2. Colorația negativă imidazol-SDS-zinc........................................................................................................269
4.4.2.1. Mecanismul general al colorației negative cu săruri imidazol-SDS-zinc. ................................................270
4.4.2.2. Aplicaţiile analitice şi micropreparative ale colorației cu imidazol-zinc..................................................270
4.5. Colorația fluorescentă ....................................................................................................................................272
4.5.1. Colorații fluorescente specifice pentru studiul modificărilor post-tranzlaționale ........................................276
4.5.2. Concluzii.....................................................................................................................................................276
4.6. Evidențierea postelectroforetică a proteinelor care conțin în structura lor, ioni de vanadiu ...........................277
4.7. Evidențierea postelectroforetică a proteinelor prin marcare cu izotopi ..........................................................277
4.7.1. Marcarea cu izotopi radioactivi ...................................................................................................................278
4.7.2. Fluorografia ................................................................................................................................................278
4.7.3. Marcarea cu izotopi stabili ..........................................................................................................................278
4.8. Metode de marcare postelectroforetică bazate pe procese de chemiluminescenţă .........................................278
Bibliografie ...........................................................................................................................................................279
4.9. Detecția postelectroforetică a unei activități enzimatice în gel ......................................................................287
4.9.1. Prepararea probei şi electroforeza ei ...........................................................................................................288
Direct tissue isoelectric focusing on ultrathin polyacrylamide gels. Applications in enzyme, lectin and
immunohistochemistry. ...............................................................................................................................................289
4.9.2. Detecția enzimelor în gel ............................................................................................................................289
4.9.2.1. Principiile localizării “in situ” a enzimelor în gel ....................................................................................290
4.9.2.1.1. Captura simultană a produsului reacţiei enzimatice ..............................................................................290
4.9.2.1.2. Postincubarea cuplată a substratului .....................................................................................................290
4.9.2.1.3. Metode autocromice .............................................................................................................................290
4.9.2.1.4. Analiza indicator-matrice......................................................................................................................290
4.9.2.1.5. Copolimerizarea substratului în gelul de separare.................................................................................290
4.9.3. Tehnici specifice de evidențiere postelectroforetică a enzimelor ................................................................291
4.9.3.1. Oxidoreductazele .....................................................................................................................................291
4.9.3.1.1. Detecţia enzimelor NAD- şi NADP-dependente prin conversia coloranţilor tetrazolici la formazani ..291
4.9.3.1.2. Detecţia enzimelor NAD- şi NADP-dependente prin iluminare UV ....................................................292
4.9.3.1.3. Oxidoreductazele piridin nucleotid-independente.................................................................................292
5.3.1.1.1. Colorații duble ......................................................................................................................................293
5.3.2. Transferazele ..............................................................................................................................................294
5.3.2.1.Tehnicile cu gel indicator şi de transfer pe membrane ..............................................................................294
5.3.2.1.1. Prepararea gelului indicator (de acoperire) ...........................................................................................294
5.3.2.1.2. Transferul (blotting) ..............................................................................................................................295
5.3.2.2.Detecţia enzimelor după electroforeza în prezenţa SDS pri renaturare .....................................................295
Detectarea hexokinazei .........................................................................................................................................296
Detectarea activităţii Glutamat-Piruvat Transaminazice [47] ...............................................................................296
Detecţia aspartat transcarbamilazei [48] ...............................................................................................................297
Tabelul 2. Transferazele .......................................................................................................................................297
5.3.3.Hidrolazele...................................................................................................................................................298
5.3.3.1 Detecţia hidrolazelor prin tehnici de tip sandwich ....................................................................................300
Detecţia lipazei [53]..............................................................................................................................................300
Detecţia proteazei [54]. ........................................................................................................................................ 300
Liazele ................................................................................................................................................................. 304
5.4.Izomerazele .................................................................................................................................................... 308
7.4.Ligazele.......................................................................................................................................................... 310
Bibliografie .......................................................................................................................................................... 310
5. Transferul proteinelor din geluri pe alte medii suport ...................................................................................... 317
5.1. Membrane utilizate în transferul proteinelor ................................................................................................. 320
5.2. Strategia generală a transferului biomoleculelor ........................................................................................... 322
5.1.1. Tehnici de transfer a biomoleculelor de pe gel, pe membrană ................................................................... 323
5.1.2. Aparatura utilizată în transferul proteinelor ............................................................................................... 326
5.1.3. Factorii care influențează transferul electroforetic pe membrană ............................................................... 328
5.1.4. Blocarea site-urilor nespecifice .................................................................................................................. 329
5.1.5. Compoziția tampoanelor de incubare ......................................................................................................... 329
5.1.6. Sisteme de detecție a biomoleculelor țintă după transferul lor pe membrană ............................................. 329
5.1.6.1. Colorații totale a proteinelor pe membrana de transfer ........................................................................... 331
5.1.6.1.1. Colorația cu Coomassie Brilliant Blue ................................................................................................. 332
5.1.6.1.2. Colorația cu Amido Black .................................................................................................................... 332
5.1.6.1.3. Colorația cu India Ink........................................................................................................................... 333
5.1.6.1.4. Colorația cu Ponceau S ........................................................................................................................ 333
5.1.7.1.5. Colorarea proteinelor pe membranele de transfer cu CPT ................................................................... 334
5.1.6.1.6. Colorarea cu arginta proteinelor pe membrane de transfer .................................................................. 335
5.1.6.1.7. Colorarea cu iodură de cupru și sensibilizare cu argint a proteinelor pe membrane ............................. 336
5.1.6.1.8. Detecția proteinelor pe membrane utilizând colorantul Direct Blue 71 ............................................... 337
5.1.7.1.1. Metode fluorescente de colorare totală a proteinelor transferate pe membrană ................................... 338
5.1.7.1.1.1. Colorarea proteinelor cu MDPF ........................................................................................................ 338
5.1.7.1.1.2. Colorarea proteinelor cu Deep Purple Total Protein Stain ................................................................ 339
5.1.7.1.6. Transiluminarea ................................................................................................................................... 341
5.1.7. Metode de detecție specifică a biomoleculelor după transfer ..................................................................... 341
5.1.7.3. Detecţia prin chemoluminiscenţă ............................................................................................................ 343
5.1.7.4. Detecţia prin bioluminescenţă ................................................................................................................. 344
5.1.7.5. Detecţia chemifluorescentă ..................................................................................................................... 344
5.1.7.6. Detecţia prin fluorescență ....................................................................................................................... 345
5.1.7.7. Autoradiografia ....................................................................................................................................... 345
5.1.7.8. Detecţia colorimetrică ............................................................................................................................. 345
5.1.7.2. Colorații speciale ale proteinelor transferate pe membrană ..................................................................... 346
5.1.8. Achiziția de imagine .................................................................................................................................. 346
5.1.8.1. Sisteme (camere) de preluare a imaginii ................................................................................................. 347
5.1.8.2. Scannere (densitometre) .......................................................................................................................... 347
5.1.9. Analize de imagini ..................................................................................................................................... 347
5.1.10. Aplicaţii ale transferului proteinelor pe membrane .................................................................................. 348
Bibliografie .......................................................................................................................................................... 348
Glosar de termeni ................................................................................................................................................. 354
Bibliografie generală ............................................................................................................................................ 358
Bibliografie finală ................................................................................................................................................ 358
 Prefață

Biochimia este o ramură a științei care are ca obiect de activitate studiul proceselor biochimice care se
produc în organismele vii. Altfel spus, este o ramură a chimiei compușilor și proceselor care se manifestă
în organisme, o “chimie a vietii”, o “chimie biologică“, în contextul în care are ca țintă științifică studiul
structurii şi proprietăţilor moleculelor în organisme vii ori a modului prin care aceste molecule sunt
obținute sau modificate. Având ca obiect de studiu substanțele care intră în alcătuirea organismelor vii
precum și fenomenele prin care aceste substanțe se transformă, biochimia permite atât cunoașterea lumii
care ne înconjoară cât și transformarea ei. Biochimia reprezintă modalitatea prin care se înțelege biologia
în context chimic iar în acest efort, biochimia analitică concură la acest țel prin oferirea mijolacelor de
analiză. Astfel, biochimia analitică reprezintă un domeniu al biochimiei care se adresează identificării unor
substanțe, determinării unor cantități precise dintr-o substanță ori a compoziției acesteia în contextul
implicării ei într-un process sau sistem biochimic.
Parte a biochimiei analitice, lucrarea “Metodele analitice în biochimie/Electroforeză” oferă cititorilor
posibilitatea de a aprecia critic tehnicile electroforetice utilizate frecvent în laboratorul de biochimie și are
ca finalitate acumularea de cunoştinţe necesare bunei desfășurări a activității într-un laborator de
specialitate. Ea prezintă elementele fundamentale și practice ale metodelor electroforetice, clasice și
moderne, întâlnite în laboratorul clinic de biochimie, din industria biofarmaceutică și biotehnologică sau
din cercetarea biomedicală. Sunt avute în vedere numeroase aplicaţii semnificative, cu mare impact în
reușita unui experiment prin care se pot evidenția o serie de proprietăți ale biomoleculelor.
Lucrarea de față a fost elaborată în ideea de a pune la dispoziția studenților o bază de cunoștiințe
teoretice referitoare la metodele uzuale de electroforeză, toate strâns legate de necesitățile practice ale
cunoașterii. Ea reprezintă selecția unui vast material pe care îl pune azi la dispoziție biochimia modernă,
cu noțiuni care, prezentate metodic, permit însușirea acestei discipline și înțelegerea altor discipline cu
rolul de a materializa premizele necesare viitorului specialist să posede toate cunoștiințe deosebite pentru a
putea satisface cerințele expertizei necesare ocupării unui post de biochimist în într-un laborator clinic,
industrial ori de cercetare.
Pe de altă parte, lucrarea a urmărit dezvoltarea, la studenți, a dorinței de a pune în practică cele
studiate, de a lucra în laborator, de a cerceta, de a fi pasionați în descoperirea noului, de a obține rezultate
originale. Astfel, această publicație îşi propune să prezinte abordarea metodologică ce poate fi adoptată de
către orice cercetător ori analist, atât din laboratorul clinic cât și cel de cercetare pentru întrebuințarea
profesională a aparaturii specifice, de definire a procedeelor experimentale în obținerea unor rezultate
reproductibile clare, valoroase şi de înaltă rezoluţie.
Cartea de faţă, acoperă un gol de aproximativ 25 de ani de la apariția, în limba română, a unor
monografii în domeniul tehnicilor electroforetice în laborator și poate fi considerată un curs universitar, cu
vocaţie de manual, cu finalitate de sistematizare şi sintetizare. Pe de altă parte, poate fi, considerată o
monografie ştiinţifică, cu potenţial de interpretare şi înţelegere, cu impact în cercetarea de profil. Ea este
adresată studenţilor facultăţilor cu profil biologic și se doreşte a fi un instrument de cunoaştere şi
înţelegere a metodologiei laboratorului clinic, farmaceutic sau industrial, fiind de altfel accesibilă și
studenților/absolvenților altor specializări precum chimie/biochimie, farmacie, medicină (umană și
veterinară), fizică/biofizică, biotehnologie, control analitic al produselor alimentare, ori agronomie,
specialiștilor care doresc să-și îmbogățească cunoștiințele de metodologie analitică din laboratoarele de
toxicologie, specialiştilor din laboratorul clinic sau din cercetare, al analiștilor din domeniul biomedical,
ea răspunzând realităţilor practice cu care aceștia se confruntă în orice moment, în activitatea de zi cu zi.
Bucureşti, 2013

Autorul
 Introducere
Electroforeza proteinelor şi acizilor nucleici reprezintă una dintre metodele cele mai utilizate pe scară
largă în laboratoarele clinice, industriale ori de cercetare. Ea a devenit atât de banală în laborator astăzi
încât puţini cercetători își amintesc de originile acestei omniprezente tehnici, cu toate că nici o altă metodă
de laborator nu furnizează mai multe informaţii referitoare la puritatea unei probe ori dimensiunile
componentelor sale atât de rapid și cu atât de mic efort și cheltuială materială ca electroforeza.
Electroforeza proteinelor a fost dezvoltată pentru laboratorul clinic în anii '30, când s-au folosit, pentru
prima dată, ca medii de separare zaharoza şi amidonul. La sfârşitul anilor '50, introducerea și dezvoltarea
gelurilor de poliacrilamidă au reprezentat îmbunătăţiri care au oferit capacitatea de a controla dimensiunea
porilor de gel într-o matrice stabilă, ceea ce a condus la o creștere a rezoluţiei. Totuși, analizele
electroforetice au devenit general acceptate ca și instrument în analiza proteinelor după dezvoltarea
sistemelor discontinue denaturante la mijlocul și spre sfârşitul anilor '60, alături de comercializarea
sistemelor electroforetice plate verticale, la începutul anilor 1970. În cele din urmă, tehnologia a fost
adaptată la separarea și analiza acizilor nucleici, care a condus, mai departe la dezvoltarea unor metode de
secvenţiere ADN-ului şi a sistemelor de electroforeză în gel de agaroză.
În timp ce fundamentele ştiinţifice şi tehnologia de bază în analiza electroforetică s-au schimbat puţin
în ultimii 40 de ani, dezvoltarea unor produse comerciale, cu cost scăzut, uşor de utilizat, a unor sisteme
fiabile au avut ca efect îmbunătăţirea semnificativă a rezoluţiei, preciziei, şi reproductibilității tehnicilor
electroforetice, atât în cazul analizei proteinelor cât și în cazul celei a acizilor nucleici. De exemplu, au
fost dezvoltate o serie de sisteme de minigeluri şi de geluri prefabricate, care pot rezolva proteine cu masă
cuprinsă între 5 și 250 kD. Analizele electroforetice ale acizilor nucleici au devenit, de asemenea, de
încredere, uşor de realizat şi reproductibile, datorită comodității și disponibilităţii comerciale a unor
sisteme de geluri de agaroză ori a unor geluri prefabricate.
Apariția tehnologiei microfluidice din ultimii ani, precum cea a tehnologiei LabChip, au permis
automatizarea analizei electroforetice, atât a celor proteice, cât şi a acizilor nucleici. Aceste noi sisteme
tehnologice care îşi au originile în electroforeza capilară oferă separări rapide, precise şi de înaltă
rezoluţie. Ele efectuează în mod automat mai multe etape gel-electroforetice de bază: separarea, colorarea,
decolorarea, detecția spoturilor, preluarea de imagini, şi analiza datelor, într-un interval de timp de cel
mult 30 de minute, dar care nu necesită acelaşi nivel de expertiză. În plus, din cauza volumului de probă
redus necesar pentru a încărca şi migra un cip microfluidic, există mai puţine reziduuri de probe ori
reactivi. Deși aceste sisteme automate costă mai mult decât sistemele manuale, raportul eficiență/cost este
în favoarea acestor noi tehnologii datorită nevoii unor efectuării unor analize electroforetice rapide și cu
mare reproductibilitate.
Una dintre cele mai adecvate aplicaţii ale electroforezei automatizate a proteinelor este de a accelera
procesul de dezvoltare prin monitorizarea fracţiile separate prin cromatografie pe coloană în timpul unui
proces de purificare. Electroforeza automatizată se poate astfel aplica pentru analiza purității un anticorp
monoclonal sau de stabilire a etapelor de purificare a unei proteine obținută prin inginerie genetică.
Capacitatea de analiză a dimensiunilor unei proteine pe care o posedă electroforeza, de cuantificare şi de
identificare a unor informaţii referitoare la puritatea sa într-un timp scurt permite punerea rapidă în
evidență a fracţiilor mai importante, ceea ce conduce la reglajul fin al metodei de purificare. În plus,
sistemele automatizate permit evaluarea precisă a calităţii şi integrității unei probe de RNA într-o singur
pas utilizând mai puţin de 25 ng (Brubacher, 2008).
Astăzi, domeniile generale de aplicații ale electroforezei sunt, în principal cele legate de separarea
proteinelor, peptidelor, zaharurilor, acizilor nucleici, de la celule integrale până la molecule, de tipul
medicamentelor, pesticidelor, a cationilor organici sau anorganici, pe scurt, a tuturor particolelor care pot
transporta o sarcină electrică. Metodele electroforetice sunt astăzi folosite pentru caracterizarea calitativă a
substanţelor sau a amestecurilor de substanţe, pentru controlul purității, pentru determinări cantitative, ori
în scopuri preparative. În ceea ce privește cele mai importante domenii de aplicare, se poate spune că
analizele proteomice, alături de cele genomice reprezintă domeniile cele mai moderne de aplicații ale
electroforezei.
 ISTORICUL ELECTROFOREZEI
Prin definiție, electroforeza este o metodă de separare analitică și preparativă bazată pe fenomene
electrice în sisteme coloidale, tehnică de segregare a particulelor încărcate electric sub acțiunea unui câmp
electric uniform, aplicat din exterior.
Privind din punct de vedere istoric, în jurul anului 600 î.Hr., Thales din Milet a observat că un
fragment de chihlimbar, frecat, atrage fărâme de paie, fenomen numit electron (chihlimbar) - phoresis
(deplasare).
Ca fenomen electrofizic, electroforeza este cunoscută din anul 1809,
când Ferdinand Friedrich Reuss (Reiss) a observat că sub acțiunea unui
câmp electric particulele de argilă suspendate în apă se deplasează spre
anod. Din păcate, raritatea lucrărilor publicate de Reuss (cea mai mare
parte dintre ele au fost distruse de un incendiu din 1812) legate de
cercetarea fenomenelor electrocinetice explică faptul că lucrările sale în
acest domeniu au rămas aproape necunoscute la nivelul comunității
ştiinţifice. Chiar şi în lucrările de istorie a chimiei fizice, numele acestui
cercetător nu este menţionat. După alți cincizeci de ani G. H.
Wiedemann şi G. Quincke au investigat principiile electroosmozei în
detaliu, iar douăzeci de ani mai târziu, pe baza acestor cercetări
Hermann von Helmholtz a pus la punct teoria acestor fenomene şi a
introdus conceptul de strat dublu electric, pe baza căruia se întemeiază,
în special, electrochimia teoretică contemporană. Astfel, descoperirea lui Reuss a condus la naşterea unor
noi direcţii ştiinţifice precum teoria strat dublu electric, electrochimie, teoria stabilităţii sistemelor de
dispersie, etc. (Pertsov și Zaitseva-Baum, 2008).
La începutul secolului al XX-lea, studiile efectuate de W. B. Hardy au arătat că multe molecule
biologic-importante, cum ar fi enzimele şi în general proteinele, afișează o caracteristică de mobilitate
electroforetică (Hardy, 1899, 1905). El a demonstrat că, într-un câmp
electric, biomoleculele migrează în moduri previzibile. Aceste
rezultate au atras interesul unui mare număr de biochimişti. De
exemplu, W. B. Michaelis (1909) a fost capabil să utilizeze tehnica
electroforetică pentru a determina punctele izoelectrice ale unor
enzime. În acest context, este important de menţionat că astfel
electroforeza a făcut posibilă purificarea unor proteine. De fapt, ca
metodă biochimică, electroforeza a îmbunătăţit tehnicile de analiză a
unor proteine. Așadar dacă unele proteine erau considerate anterior
pure, s-a constatat că prin electroforeză ele erau compuse din două sau
mai multe subunităţi. (Devor, 2005).
Primul aparat complex de separare electroforetică a proteinelor
serice a fost dezvoltat în 1937, de Arne Wilhelm Kaurin Tiselius. De
altfel el a fost distins, în anul 1948, cu premiul Nobel pentru chimie ca
urmare a studiilor sale de separare a unor coloizi prin electroforeză și de analiză a mișcării particulelor
încărcate electric printr-un lichid staționar sub influența unui câmp electric, procese pe care le-a descris
prin utilizarea unui aparat cunoscut drept tubul lui Tiselius. El a dezvoltat astfel tehnica de separare a
proteinelor serice prin electroforeză în mediu liber (Tiselius, 1937). În sfârșit, Martin și Synge (1947) au
definit ionoforeza drept o electromigrare a particulelor cu masă moleculară mică în medii stabilizate, de
fapt o separare pe baza diferențelor de sarcină atât a moleculelor mici cât și a macromoleculelor în aparate
similare. Din această cauză, majoritatea celor care lucrează o denumesc electroforeză precizează și mediul
stabilizant folosit (hârtie, amidon, agaroză, etc.).
Electroforeza s-a dezvoltat rapid la mijlocul secolului trecut, odată cu utilizarea ei la atât la separarea și
analiza moleculelor mari (este cazul unor proteine) cât și la analiza unor aminoacizi sau chiar a unor ioni
anorganici. În plus faţă de electroforeza zonală, au apărut alte două tipuri de electroforeză, focusarea
izoelectrică şi izotacoforeza, separările prin cele trei tipuri bazîndu-se pe proprietăţile fizice diferite ale
particolelor.
 1. CONCEPTE DE BAZĂ ÎN ELECTROFOREZĂ
În tratarea teoretică a fenomenelor de transport electrocinetice, se ține cont de (a) particula care
migrează-este cazul coloidului de dispersie și de (b) mediul de dispersie. Astfel, coloizii de dispersie sunt
purtători de sarcină electrică.
În 1898, Cohen a observat și a elaborat o regulă empirică care spune că la contactul dintre două faze,
faza cu constanta dielectrică mare se încarcă pozitiv. Graham
explică regula prin posibilitatea adsorbției specifice
(chemosorbției) a anionilor pe suprafața solidelor indiferent de
semnul inițial al acesteia, deoarece anionii pierd mai ușor stratul
de hidratare și datorită numărului mare de electroni per nucleu,
sunt mai ușor polarizabili. În acest caz forțele de atracție dintre
anioni și dipolii induși pe suprafața particulelor sunt mai
puternice decât în cazul cationilor. Saltul de potențial care apare
la contactul dintre cele două faze are drept cauză faptul că una
dintre faze cedează ioni celeilalte rămânând încărcată cu sarcini
de semn opus ori adsorbției ionilor sau moleculelor polare din
mediul de dispersie. Din această
cauză suprafața încărcată va
atrage din motive de neutralitate
electrică ioni de semn contrar
(contraioni) din mediul de
dispersie formând un strat dublu
electric.
Considerând o particulă
încărcată electric cu raza r iar raza
și stratul Stern egală cu r+δ în timp
ce d2 reprezintă distanța din centrul
particulei până la limita stratului
difuz, reprezentând potențialul în funcție de inversul distanței se
deduce un potențial electrocinetic ϛ (zeta) care apare la suprafața
particulei din mediu și care generează separarea electroforetică
după relația:

unde qs reprezintă densitatea electrică superficială, d2 este

grosimea stratului dublu, iar ε este constanta dielectrică a mediului.
Grosimea stratului dublu electric (sau lungimea Debye), k-1, din jurul unei particule coloidale este dată
de relația:

unde kB reprezintă constanta Boltzmann, T este temperatura, e reprezintă sarcina electrică, F este constanta
Faraday, iar I este tăria ionică, calculată după următoarea formulă:

și unde zi și ci sunt valența respectiv concentrația molară a ionilor din soluție (Overbeek, 1977).
La aplicarea unui câmp electric, ionii din stratul Stern migrează în sens opus particulei și tind să o
antreneze și pe aceasta întârziind astfel migrarea. Pe de altă parte, dacă electrolitul are concentrație mare
sau ionii componenți ai electrolitului au valențe și mase mari, are loc o scădere a potențialului ϛ (zeta).
1.1. ECUAȚII DE MIGRARE ELECTROFORETICĂ
O particulă încărcată electric, într-un mediu lichid tamponat, sub acțiunea unui câmp electric uniform,
se va deplasa cu o viteză constantă, determinată de acțiunea a patru forțe:
 1. Forța de atracție electroforetică (F1) egală cu produsul dintre sarcina electrică Q a particulei (
a entității electrocinetice) și intensitatea câmpului electric aplicat (E).

2. Forța de frecare Stokes (F2), egală cu o funcție a produsului dintre coeficientul de vâscozitate a
mediului (η), raza particulei (r) și viteza electroforetică, v după relația:
F2= 6πηrv
3. Forța de frânare electroforetică (F3) rezultată ca urmare a atracției exercitate de câmpul
electric asupra ionilor electrolitului (soluția tampon în care se deplasează particula) conform relației:
F3= (Q - ε• ξ•r)•E
unde Q reprezintă sarcina electrică a particulei;
ε este constanta dielectrică a mediului;
ξ reprezintă potențialul zeta;
r este raza particulei;
E reprezintă intensitatea câmpului electric aplicat.
4. Forța datorată efectului de frânare (F4), forță care apare din cauza redistribuirii ionilor
electrolitului în apropierea particulei, sub acțiunea unui câmp electric uniform.
Imediat după aplicarea unui câmp electric , suma vectorială a celor patru forțe devine egală cu zero, iar
viteza electroforetică devine constantă:

Pentru electroforeza în medii stabilizate (gel de amidon, poliacrilamidă, etc.) F3 și F4 sunt practic
neglijabile, astfel încât forței de atracție electroforetice (F1) se opune forța de frecare Stokes (F2):

ceea ce înseamnă că:

Din ultima relație se calculează viteza electroforetică:

Ecuația de mai sus conduce la relația Huckel:

unde ξ, reprezintă potențialul zeta;

ε, este constanta dielectrică a mediului;
H, este gradientul de potențial, egal cu raportul dintre tensiunea aplicată, E și distanța dintre
electrozi,
r, este raza particulei;
La baza fenomenelor electrocinetice importanță practică are relația Helmholtz-Smoluchovski:

Henry, plecând de la relațiile Huckel și Helmholtz-Smoluchovski, generalizează conform teoriei

stratului difuz:

unde re reprezintă raza efectivă a particulei hidratate, r+δ, iar χ (khi) este inversul grosimii stratului dublu
electric, a cărei valoare este dată de relația:
 în care: z reprezintă valența;
e este sarcina elementară;
n este numărul ionilor
De exemplu, la temperatura camerei, pentru un n=c (în moli/litru).

Se deduce că, pentru valori mari ale χ•re~1000, f(χ•re) = , valabilă în domeniul Smoluchovski,

indiferent de forma particulelor. Dacă χ•re~1, atunci f(χ•re) = și se aplică particulelor sferice mici în
comparație cu grosimea stratului dublu electric (domeniul Hükel). Într-un domeniu intermediar f(χ•re) este
dependent de forma și orientarea câmpului electric.
Se poate deci evalua potențialul zeta (ξ) după relația:

unde v reprezintă viteza electroforetică.

1.2. MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ

Mobilitatea electroforetică este într-o relație de proporționalitate directă cu viteza electroforetică, ea
fiind raportul dintre viteza electroforetică și intensitatea câmpului electric. Mobilitatea electroforetică se
determină prin măsurarea intervalului de timp, t, necesar unei particule sau unei interfețe solid-lichid să
parcurgă o anumită distanță, d, sub acțiunea unei diferențe de potențial provenit din exterior după relația:

Considerând că l, reprezintă distanța dintre electrozi măsurată în interiorul soluției, atunci mobilitatea
electroforetică se poate scrie:

Cum gradientul de potențial, H, este egal cu raportul dintre intensitatea câmpului electric aplicat
(tensiunea aplicată), E și distanța dintre electrozi, l, se poate scrie:

de unde se deduce mobilitatea efectivă (măsurată în sistemul internațional în m2•V-1•s-1), µ:

În practică se folosește mobilitatea relativă, µo care este proporțională cu distanța de migrare:

Aceasta se calculează prin compararea mobilității unor particule diferite, considerându-se că timpul de
migrare și intensitatea câmpului electric sunt constante (adică particulele care se compară au condiții
identice de migrare electroforetică).
Pentru electroforeza în medii stabilizate, când

adică,

Se calculează viteza de migrare drept:

 Coeficientul 6π•η•r este denumit coeficient de fricțiune (frecare) în medii stabilizate și este dependent
de o serie de alți factori.
Substituind viteza electroforetică din relația de mai sus în ecuația mobilității relative:

atunci,

Se deduce astfel faptul că mobilitatea relativă este în funcție de sarcina particulei, Q și de raza sa, r:

unde Q reprezintă sarcina particulelor, iar r este raza particulei.

Se poate spune că particulele cu un raport Q/r identic vor avea o mobilitate identică. Cum Q este
produsul dintre suprafață și densitatea de sarcină superficială, qs, pentru o particulă sferică cu raza r,
sarcina particulei este:
Q = 4 π•r2•qs
iar mobilitatea relativă este funcție de raportul atunci,

= 4 π•r•qs
ceea ce arată că dacă variațiile dimensiunilor particulelor sunt compensate de variațiile de sarcină electrică
superficială, particulele vor migra cu mobilități egale.
1.3. REZOLUȚIA DE SEPARARE
În electroforeza într-un mediu stabilizat, particulele cu
mobilități (µ) diferite se vor deplasa în zone discrete.
Teoretic separarea diferitelor particule sub formă de zone
discrete este realizată, dacă mobilitățile relative sunt
suficient de diferite și dacă distanța migrării este suficient de
mare.
Eficiența unei separări electroforetice este exprimată
printr-o mărime denumită rezoluție de separare, Rs.
Considerând două zone separate electroforetic, cu lățimea
benzii egală cu l1 și l2, iar distanța dintre ele fiind egală cu
Δd, rezoluția de separare este egală cu:

unde Δd reprezintă distanța dintre centrele zonelor 1 și 2, iar l1 și l2 sunt lățimile celor două zone formate
de cele două tipuri de particule.
Drumul parcurs (distanța) în procesul separării electroforetice este egală cu:
d = v•t
unde v reprezintă viteza electroforetică iar t este timpul de migrare.
Din relația mobilității, µ= , se deduce viteza electroforetică, v=µ•E, iar drumul parcurs de o particulă
în funcție de mobilitatea sa este dat de relația:
d = µ•E•t
Se poate spune că drumul parcurs de o particulă este egal cu produsul dintre mobilitatea sa, timpul de
migrare și câmpul electric aplicat.
Pentru particula 1, drumul parcurs de aceasta este egal cu d1 = µ1•E•t iar drumul parcurs de particula 2
este egal cu d2 = µ2•E•t.
Cum Δd reprezintă distanța dintre centrele zonelor 1 și 2 fiind egală cu diferența de migrare între cele
două particule (d1-d2) se deduce rezoluția de separare:
 Se consideră că: (1) pentru o separare electroforetică eficientă este necesară o rezoluție de separare
cuprinsă între 1 și 1,5; (2) lățimea zonelor de separare (l1 și l2 din figura de mai sus) are un rol hotărâtor.
Ea este asociată cu dispersia Gauss datorată procesului aleatoriu de deplasare a particulelor în câmp
electric și este rezultanta a însumării a cinci termeni care acționează independent, după cum urmează:
 Difuziunea termică;
 Microheterogenitatea;
 Difuziunea turbulentă;
 Electrodifuziunea;
 Electrosorbția.
Primii doi termeni acționează și sunt importanți în cazul electroforezei în mediu liber; difuziunea
termică și difuziunea turbulentă sunt importante în cazul electroforezei pe medii stabilizate.
Pe de altă parte, analiza relației rezoluției de separare în contextul proceselor de dispersie arată că
pentru creșterea rezoluției de separare este de preferat creșterea intensității câmpului electric și nu a
timpului de migrare.
1.4. FACTORII CARE INFLUENȚEAZĂ REZOLUȚIA DE SEPARARE ȘI
MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ
Mobilitatea particulelor care se deplasează într-un câmp electric uniform precum și rezoluția de
separare dintre particule cu mobilități diferite sunt influențate de următorii factori:
1. pH-ul soluției tampon. Acesta afectează mobilitatea deoarece sarcina electrică este funcție de
pH. Din această cauză, alegerea unei soluții cu pH optim conduce la rezoluții superiore;
2. Difuziunea postelectroforetică care depinde de metoda electroforetică utilizată.
3. Factori proprii particulelor: mărime, formă, sarcină electrică, concentrație, gradul de hidratare și
disociere.
4. Factori caracteristici mediului de separare: vâscozitate, pH, intensitatea câmpului electric, timpul
de migrare.
5. Factori dependenți de metoda electroforetică utilizată: difuziunea postelectroforetică.
6. Alți factori.
1.4.1. TĂRIA IONICĂ (FORȚA IONICĂ)
Câmpul ionic dezvoltat de un ion în soluție depinde de: (a) concentrația sa; (b) valența (sarcina) sa; (c)
prezența altor ioni în soluție. Astfel, în soluții diluate, tăria ionică este independentă de natura chimică a
ionului. Pentru a ține cont de toți acești parametrii, s-a introdus o mărime denumită tărie ionică (forță
ionică).
Prin definiție, tăria (forța) ionică (j) reprezintă semisuma termenilor obținuți prin înmulțirea
concentrațiilor molare (c) a fiecărui ion în soluție cu pătratul valenței sale (z):

unde i = 1,2,....n.
În calculul forței ionice a unei soluții tampon se consideră că acizii slabi sunt nedisociați, în schimb
sărurile lor sunt complet disociate. Astfel, pentru o soluție tampon conținând 8,8 g/l acid dietilbarbituric și
10,3 g/l dietilbarbiturat de sodiu, forța ionică este dată numai din disocierea sării de sodiu și ionul de
dietilbarbiturat. Cum dietilbarbituratul are masa moleculară de 206,18g, 10,3 grame reprezintă 0,05 moli/l,
de aici se trage concluzia că tăria ionică (j) este egală cu 0,05M.
Teoretic, mobilitatea electroforetică este invers proporțională cu rădăcina pătrată a forței ionice:
µ

Cum mobilitatea, µ, este egală cu raportul dintre viteza electroforetică și intensitatea câmpului electric
uniform aplicat, se deducă că:
µ=

de unde,
 Din această relație se poate observa că odată cu micșorarea tăriei ionice are loc o creștere a intensității
câmpului electric uniform aplicat. Astfel, datorită faptului că rezoluția de separare este direct proporțională
cu intensitatea câmpului electric uniform aplicat, scăderea tăriei ionice conduce la creșterea rezoluției de
separare.
În general se consideră că:
 soluții tampon cu forțe ionice mici permit viteze de migrare mari, deci mobilități mari;
 forțe ionice mai mari de 0,15M conduc la viteze de migrare mici la timpi de migrare mici dar cu
o rezoluție bună. Trebuie totuși avut în vedere că o forță ionică prea mică poate conduce la precipitarea
probelor.
1.4.2. EFECTUL TERMIC JOULE
În timpul unei separări electroforetice, la trecerea curentului electric prin soluție are loc o degajare de
căldură denumită căldură Joule sau efect Joule. Acest efect este deosebit de important în condițiile în care
poate afecta negativ separarea electroforetică prin favorizarea proceselor de difuziune, a apariției
curenților de convecție ori de denaturare a probei (mai ales în cazul enzimelor) Din acest motiv este
necesară menținerea între anumite limite a acestui efect.
Efectul termic Joule poate fi controlat (a) în sisteme tampon continue prin valoarea puterii electrice
intrate (dacă temperatura este constantă); (b) în sisteme tampon discontinue (multifazice) prin controlul
rezistenței electrice a mediului de separare.
Rezistența electrică crește odată cu avansarea frontului mobil datorită scăderii conductivității mediului.
Astfel, la o intensitate a curentului (I) constantă, creșterea tensiunii (U) și căldura degajată este în relație
directă cu timpul de migrare. Dacă tensiunea este constantă, scăderea intensității este funcție de timpul de
separare iar căldura degajată dezvoltată prin efect Joule va fi redusă în timp ce rezoluția de separare va fi
slabă.
Conform primei legi a lui Ohm, intensitatea curentului (I) este direct proporțională cu tensiunea
electrică (voltajul, V) și invers proporțională cu rezistența (R) sistemelor electroforetice este dată de tipul
tampoanelor utilizate, de tipul de configurații ale gelului și de volumul total al gelurilor care se rulează, în
timp ce tensiunea electrică este dată de produsul dintre intensitate și rezistență după relația:

Conform celei de-a doua legi a lui Ohm, puterea (P) este egală cu produsul dintre intensitatea
curentului aplicat și tensiunea curentului electric:

Cum U=I • R, această relație poate fi scrisă:

Substituind U, când I = și după înlocuirea lui I rezultă:

unde: U reprezintă tensiunea electrică (diferența de potențial) [V];

R este rezistența electrică, [Ω];
I este intensitatea curentului electric, [A];
P reprezintă puterea [W] = [J•s-1];

Se observă că practic, căldura degajată este egală cu puterea electrică care intră în sistemul
electroforetic. Considerând intensitatea câmpului electric aplicat (E, [V/m]), prin măsurarea tensiunii
electrice aplicate se poate deduce că intensitatea câmpului electric este egală cu raportul dintre tensiunea
electrică aplicată și drumul parcurs de o particulă cu sarcină Q într-un câmp electric uniform după relația:
E= =[ .
Astfel, se deduce că efectul termic Joule este funcție de tăria ionică, j. Efectul este mai pronunțat la
puteri mari, în timp ce efectul este estompat la forțe ionice mici.
 În concluzie se recomandă: (1) în cazul sistemelor cu rezistență constantă sau care se diminuează în
timpul separării electroforetice, folosirea unui curent electric constant; (2) în sisteme cu rezistență electrică
care crește (ca în cazul sistemelor multifazice) folosirea unor tensiuni electrice constante, deși uneori
aceasta conduce la scăderea rezoluției de separare datorită creșterii difuziunii, mai ales în medii de
separare omogene. Din acest motiv în experimentele de separare electroforetică se utilizează redresoare
care mențin automat tensiunea în funcție de intensitatea curentului aplicat.
1.4.3. ELECTRO(ENDO)OSMOZA
În medii poroase, saturate cu o soluție ionică, se manifestă o serie de sarcini electrice fixate pe
suprafața fazei solide, distribuția spațială a anionilor și cationilor din faza lichidă are la bază teoria
stratului dublu electric (Cherblanc și colab., 2008). Electro(endo)osmoza este un fenomen electrocinetic
care apare în urma deplasării fazei lichide de dispersie printr-un capilar, sisteme capilare sau medii
poroase la aplicarea unui câmp electric exterior. Ea se caracterizează prin deplasarea electrolitului în
câmpul electric aplicat (vezi și 3.12.3.2. Electroendosmoza în electroforeza capilară). Din aceeași
categorie de fenomene fac parte și potențialul de curgere (fenomen opus electroendoosmozei) ori
potențialul de sedimentare.
În principiu, un suport static, un mediu stabilizant (de exemplu, un gel) și/sau suprafața unui
echipament de separare de tipul plăcilor de sticlă, a tuburilor ori a capilarelor, poate conține grupări
încărcate electric precum grupări carboxilice (prezente în structura amidonului și a agarozei), grupări
sulfonice (în structura agarozei), grupări hidroxi (de pe suprafața sticlei de cuarț). Aceste grupări devin
ionizate în tampoane bazice și neutre și din acest motiv, în câmp electric ele vor fi atrase spre anod. Cum
astfel de sarcini sunt fixate de matrice, ele sunt imobile și nu pot migra. În aceste condiții rezultă o
compensare prin contracurgerea ionilor de H3O+ în direcția catodului, proces denumit electroendosmoză
(figura 1.1). Astfel, în medii suport stabilizate (hârtie de filtru, dar mai ales în cazul gelului de agaroză),
electroendoosmoza se corelează cu proporția de sarcini negative ale acestora, motiv pentru care are loc o
inducere a unui flux de lichid spre catod. Cum particulele care se separă sunt încărcate negativ, sunt
necesari cationi în exces din faza mobilă pentru a asigura electro-neutralitatea, în timp ce migrarea lor se
realizează spre anod, apar fenomene de convecții interne, deci se produc modificări ale mobilității
electroforetice și astfel alterări ale rezoluției de separare.
Figura 1.1. Electroendosmoza: grupările
încărcate negativ fixate la gelul matrice ori la
suprafață cauzează o curgere a ionilor de apă.
Acest proces conduce la transportul de apă în
direcție inversă migrării electroforetice a
ionilor din probă, ceea ce conduce la un
proces de difuziune care conduce la obținerea
unor benzi neclare.

În aceste condiții, la aplicarea unui câmp electric exterior, acești cationi în exces exercită un moment
adițional în fluidul din por care conduce faza lichidă spre catod. Această mișcare netă a fluidului față de
structura solidului într-un gradient electric impus este denumită electroosmoză (Casagrande, 1949). În
practică, viteza electroosmotică este descrisă la scală macroscopică de relația:

unde vL reprezintă media vitezelor, numită și viteza Darcy sau viteza de filtrare iar Φ desemnează
potențialul electric. Permeabilitatea electroosmotică, kE, caracterizează mediul poros în relație cu fluxul vL
și forța, Φ. Această relație poate fi de asemenea derivată teoretic din matematizările termodinamicii
liniare a proceselor ireversibile. Permeabilitatea electroosmotică are la bază fenomene electrocinetice
(Alshawabkeh și Acar, 1996; Virkutyte și colab., 2002).
Se poate spune că mărimea fizică dată prin raportarea vitezei de migrare a unei particule (a unei
proteine, în speță) per unitate de intensitate a câmpului electric este denumită "mobilitate electroforetică",
ale cărei unități de măsură sunt viteza (cm/sec) raportată la unitatea de câmp electric (V/cm), adică
cm2/V•sec. De altfel, separarea a două particule este rezultatul unei diferențe între mobilitățile lor
electroforetice.
 În concluzie, pentru ca un proces de separare electroforetic să fie reproductibil, este necesar a se
preciza riguros condițiile de lucru precum: calitatea mediului de separare, proprietățile sistemului tampon,
caracteristicile probei, stabilirea câmpului electric aplicat, temperatura și timpul de lucru, pentru a se evita,
pe cât posibil procesele care conduc la pierderea rezoluției de separare.
1.4.4. APARATURA UTILIZATĂ LA SEPARĂRILE ELECTROFORETICE
Pentru a realiza un experiment de separare și analiză electroforetică sunt necesare următoarele sisteme:
a. Sursă de putere care generează un curent electric continuu, stabilizat;
b. Aparatul propriu-zis alcătuit după metoda electroforetică utilizată, având o construcție variată
dar care trebuie să prezinte compartimente pentru electrozi (din platină, grafit, etc.) și uneori sisteme de
termostatare;
c. Dispozitive anexe care cuprind: (a) dispozitiv de turnat plăci (amidon, poliacrilamidă, etc.); (b)
cuve de fixare, colorare, spălare (decolorare); (c) sistem de uscare (uneori cu aer cald); (d) sisteme de
evaluare optică (spectrofotometru cu sistem de baleiere, densitometru cu lungime de undă fixa, cu sistem
de reflexie sau fluorescență, sisteme video de preluare a imaginii și de analiză a gelurilor; (e) dispozitive
specifice.
 2. ELECTROFOREZA ÎN MEDIU LIBER
Prin definiție, electroforeza în mediu liber (free-flow electrophoresis, FFE) se bazează pe deplasarea
liberă a unor componente cu mobilități diferite dintr-un amestec, sub acțiunea unui câmp electric exterior.
În acest context, între diferitele particule constituente ale amestecului se formează suprafețe de separare
(fronturi - de unde și denumirea de electroforeză frontală), care pot fi observate prin modificarea bruscă a
indicelui de refracție (ca și în cazul ultracentrifugării analitice). Prin măsurarea acestui parametru fizic de-
a lungul celulei electroforetice se obțin diagrame electroforetice (denumite diagrame Schlieren). Astfel,
din deplasarea fronturilor se calculează vitezele de migrare ale componentelor din amestec. În plus, de la
introducerea ei, în anii 1960, această metodă de separare și-a găsit o poziţie permanentă printre metodele
analitice şi preparative în biochimie precum şi în chimie pentru separarea, de exemplu, a celulelor,
organitelor celulare, a peptidelor, proteinelor, a compușilor anorganici și organici, etc.
Sistemele tehnice utilizate în electroforeza în mediu liber au la bază aparatul Tiselius, un dispozitiv în
forma literei U, în timp ce aparatele moderne au modificări la sistemul de electrozi (aceștia sunt de tip
reversibil), la modul de alimentare cu soluție tampon, la modul de încărcare a probei, ori la modul de
înregistrare a vitezei de deplasare.
Părțile principale ale aparatului sunt reprezentate din (a) compartimentul de electrozi; (b) celula
electroforetică; (c) sistemul de termostatare; (d) sistemul de înregistrare (figura 2.1).

Figura 2.1. Reprezentarea schematică a unui dispozitiv Tiselius (http://pauling

blog.files.wordpress.com/2008/11/apparatus.jpg?w= 468).

Celula electroforetică este alcătuită din trei sectoare care se pot deplasa lateral prin glisare. Modul de
încărcare cu probă este prezentat în figura 2.2. Separarea se realizează la temperaturi scăzute (2 - 4oC) la o
diferență de potențial de 4-10 V/cm timp de 6 ore.

Figura 2.2. Modul de încărcare a probei în aparatul Tiselius de electroforeză în mediu liber.
Pentru a înțelege modul de funcționare a unui aparat de tip Tiselius, să presupunem că avem un
amestec de două componente PA și PB (pot fi luate în discuție două proteine) cu mobilități diferite (µA ˃µB)
care se deplasează în aceeași direcție. Dacă în momentul inițial concentrația celor două proteine este
identică pe tot parcursul tubului electroforetic, după cum semnalul la sistemul optic este constant. După
instituirea unui câmp electric, proteina PA, cu mobilitate mai mare va migra mai rapid spre anod,
îmbogățind frontul de tampon, dar sărăcind coada tubului (figura 2.3).
 Figura 2.3. Principiul de separare a
două componente prin electroforeză în
mediu liber.

După trecerea unui timp suficient de mare, proteina PA se va concentra în frontul de electroforeză, iar
proteina PB , cu mobilitate mai mică, va migra după aceasta. Dacă se reprezintă grafic semnalul primit de
sistemul optic, se realizează o diagramă Schlieren (figura 2.4.).

Figura 2.4. O diagramă Schlieren pentru două componente (PA și PB) separate prin
electroforeză în mediu liber (c=concentrație, n=indice de refracție).

Prin derivatizarea intensității semnatului (a concentrației sau a indicelui de refracție) rezultă o

electroforegramă cu peak-uri electroforetice.
2.1. AVANTAJELE UTILIZĂRII ELECTROFOREZEI FRONTALE
După cum s-a arătat mai sus, în electroforeza frontală, substanţele de analizat sunt separate în mod
continuu într-un câmp electric aplicat perpendicular peste un strat subțire de tampon transportor în flux
continuu, după cum se observă și în figura 2.5. Astfel, un amestec de probă este injectat în fluxul continuu
de electrolit transportor, iar după un timp de migrare, componente, diferit încărcate, se împart pe culoarele
de migrare diferite care pot fi în continuare colectate la capătul aparatului.

Figura 2.5. O ilustrare a principiului electroforezei libere

frontale și principalele componente ale unui sistem de separare
electroforetică și microelectroforetică. Tamponul curge în flux
laminar într-un film continuu de 0,3 mm, de sus în jos sub
acțiunea forței gravitaționale. Proba se introduce lateral. Sub
acțiunea câmpului electric, componentele probei se deplasează
spre anod lateral și totodată de sus în jos, odată cu tamponul
(după Kohlheyer și colab., 2008).

Sistemele FFE disponibile la scală comercială au fost iniţial dezvoltate ca dispozitive de curățare a
unei probe, de exemplu, ca o treaptă de prefracționare, înainte de o separare prin electroforeză
bidimensională. În continuare au fost dezvoltate mini-aparate de FFE care se pot cupla la spectrometrul de
masă sau la cromatograful de lichide și care astfel permit, odată cu separarea continuă, opțiunea de
detectare on-line (Mazereeuw și colab., 2000; Chartogne și colab., 2000). Această combinaţie de FFE, ca
metodă pentru separarea continuă cu detectare în timp real, permite monitorizarea neîntreruptă a analitului,
în cazul probelor biologice ale unor pacienţi, produşi de reacţie, etc. Totuși, sistemele rămân în continuare
complicate și sunt încă lente în funcţionare, deși utilizarea lor pare a fi foarte promiţătoare. Astfel,
sistemele electroforetice care funcționează după principiul curgerii libere (frontale) în formă miniaturizată
(µ-FFE) și-ar putea găsi aplicații în construcția unor aparate miniaturizate portabile de monitorizare a unor
pacienți (Tudos și colab., 2001).
Odată cu tendinţa de miniaturizare și de dezvoltare a
sistemelor lab-on-a-chip, au fost de asemenea, dezvoltate
şi demonstrate sisteme de microelectroforeză în mediu
liber, FFE bazate pe chip-uri (Dittrich și colab., 2006).
Miniaturizarea implică mai multe avantaje mai ales având
în vedere volumul eşantionului şi viteza de separare. În
contrast cu volumele de ordinul mililitrilor de probă
consumate de tehnicile convenţionale, microsistemele FFE
au nevoie doar de câteva zeci de nanolitrii până la câteva
sute de microlitri de probă. Această reducere a volumului
este deosebit de utilă în cazul analizelor clinice, când de
multe ori sunt disponibile numai volume scăzute din
probele biologice. Mai mult, timpul de analiză scade de la
câteva ore/zeci de minute, la câteva secunde în cazul utilizării microdispozitivele FFE (Manz și Eijkel,
2001). Mai mult, camerele de separare de ordinul a câtorva micrometri permit o disipare mai bună a
căldurii și care admit tensiuni electrice mai mari și astfel separări mai rapide (Das și Fan, 2006).
2.2. DEZAVANTAJELE ELECTROFOREZEI FRONTALE
Dintre dezavantajele electroforezei frontale se pot enumera:
1. Aparatura necesară;
2. Amestecarea zonelor datorită difuziunii, curenților de convecție, motiv pentru care este strict
necesară existența unui sistem de termostatare;
3. Existența unor anomalii de interpretare. Astfel, suprafața peak-ului nu este identică cu
concentrația de proteină. Un alt tip de anomalii sunt legate de migrare. În acest context viteza de migrare
ascendentă nu este identică cu viteza de migrare descendentă. Acest fenomen, în mod obișnuit, se poate
neglija, dar pentru o electroforeză de mare acuratețe, această anomalie nu este de dorit.
2.3. APLICAȚII ALE ELECTROFOREZEI FRONTALE
Date recente (Kohlheyer și colab., 2008) arată că toate tipurile de electroforeză standard pot fi aplicate
cu succes electroforezei frontale, dintre care cele mai obișnuite aplicații sunt: electroforeza frontală în
flux continuu, focalizarea izoelectrică în flux continuu, izotacoforeza în flux continuu și electroforeza
frontală în trepte de câmp electric (Krivánková și Bocek, 1998; Roman și Brown, 1994).
2.3.1 ELECTROFOREZA FRONTALĂ ÎN FLUX CONTINUU
Electroforeza frontală în flux continuu implică utilizarea unui electrolit transportor care curge cu o
compoziție constantă, același pH și aceeași conductivitate în care componentele probei se separă după
mobilitatea lor (determinată de raportul sarcină/mărime; figura 2.6).
Există o corelație directă între electroforeza zonală clasică, utilizată în aplicații analitice și
electroforeza în flux continuu, folosită mai ales în scopuri preparative (Kasicka și colab., 1992; Kasicka și
colab., 1998). Astfel, în electroforeza în flux continuu analitul care trebuie separat se abate de la linearitate
sub un unghi constant, determinat de: (a) tăria câmpului electric, (b) mobilitatea analitului și (c) viteza de
curgere. Distanța de migrare, d, a unui analit care se mișcă într-un câmp electric este dat de relația:

unde µo reprezintă mobilitatea electroforetică aparentă, E este intensitatea câmpului electric aplicat, iar
t reprezintă timpul de rezidență a moleculelor de analit în camera de separare (Raymond și colab., 1994).
 Figura 2.6. Principiul electroforezei frontale în flux continuu (După Kohlheyer și colab., 2008).

Cu toate acestea, o serie de fenomene influenţează negativ calitatea separării. Sursele de lărgire a
benzii comune în electroforeza în flux liber sunt următoare: fluxul de probă injectată duce la o deviație
standard a lăţimii benzii, σINJ. Alte tipuri de fenomene care conduc la lărgirea benzii sunt: împrăștierea
difuzională (σD), amplificările hidrodinamice (σHD), lărgirea electrodinamică (σED), efectul termic Joule
(σJH), şi dispersia prin electromigrare (σEMD) (Weber și Bocek, 1998; Gebauer și Bocek, 2005).
Varianța totală, σ2, a benzii de analit separat este dată de suma varianțelor tuturor factorilor care
contribuie la împrăștierea benzii:

Varianța datorată injectării probei care conduce la lățirea frontului wi este exprimată de relația:

Reducerea lărgimii frontului prin injectare a probei, deseori mai semnificativă în sisteme microfluidice
decât în cele de mari dimensiuni, se realizează de exemplu, printr-un control hidrodinamic mai precis, care
provoacă fluxuri laminare (Raymond și colab., 1996).
Varianța datorată difuziei laterale este în relație directă cu timpul de rezidență, t, a analitului în camera
de separare și poate fi exprimată ca:

unde D reprezintă coeficientul de difuziune a analitului. Astfel, pentru a reduce acest efect în sistemele
microelectroforetice cu flux liber, se utilizează timpi de rezidență foarte scurți.
Profilul parabolic de debit, care este cauzat de presiune conduce la viteze inegale în regiunile din
interiorul camerei de separare (Fonslow și Bowser, 2006). Analiții care se deplasează aproape la partea de
sus ori cei care curg în partea de jos a plăcii petrec mai mult timp in câmpul electric, şi, prin urmare sunt
deviați mai mult decât analiții care se deplasează in apropiere de centrul camerei electroforetice. Acest
efect este numit lărgire hidrodinamică şi duce la o deformare în formă de semilună a probei. Varianţa
datorată lărgirii hidrodinamice a bandei este egală cu:

unde h reprezintă înălțimea camerei de separare. Ecuația de mai sus arată că în cazul camerelor de
separare mici cum sunt cele utilizate în microelectroforeză în mediu liber, nu are loc o reducere
semnificativă a procesului de împrăștiere datorat efectului hidrodinamic (Fonslow și Bowser, 2006).
În ceea ce privește încălzirea mediului datorată efectului Joule din interiorul aparatului de electroforeză
va avea drept cauză existența unui gradient de temperatură între plăcile care acoperă camera de separare,
efectul fiind maxim în centrul acesteia. Acest gradient de temperatură conduce la o scădere local a
vâscozității în centrul aparatului și care afectează mobilitatea analitului, ceea ce conduce la lărgirea benzii.
În plus, zonele cu conductivitate electrică diferită din probă şi din electrolitul de transport va avea ca efect
o dispersie datorată electromigrării. Acest tip de distorsiuni sunt datorate vitezelor diferite de migrare a
analiților în zone care au intensități inegale ale câmpului electric. Prin urmare, efectul poate fi minimizate
prin alegerea unor sistemele de tampon corespunzătoare, cu conductivități similare pentru probă şi pentru
electrolitul transportator.
În contrast cu sistemele convenţionale FFE aparatele miniaturizate sunt prevăzute cu sisteme active de
răcire care favorizează disiparea rapidă a căldurii ceea ce conduce la reducerea denaturării probei.
Experimentele au confirmat faptul că microseparările realizate prin electroforeză în flux liber pot fi
realizate fără o influenţă remarcabilă a căldurii degajate prin efect Joule la a aplicarea unei intensități a
câmpului electric de până la 60 V/mm (Fonslow și Bowser, 2006).
O abordare interesantă a fost demonstrată de către Fonslow şi Bowser (2006), care au obținut o ecuație
analogă celei descrise de către van Deemter în cazul separării cromatografice și care se aplică cu succes și
în cazul procesului de separare prin electroforeză în flux liber. Ei au arătat că viteza liniară, câmpul
electric, precum şi distanţa de migrare trebuie să fie luate toate în considerare, pentru a optimiza procesul
de dispersie soldat cu lăţirea bandei şi de creștere a rezoluţiei.
Rezoluţia de separare a două peak-uri adiacente este definită de relația:

Presupunând că împrăștierea bandei este dominată de difuziune, prin inserarea ecuaţiilor (1) şi (4), se
poate obţine (în condițiile în care coeficienţii de difuzie sunt egali):

Substituind timpul de rezidență, t, cu L/v (unde L este lungimea camerei de separare în direcţia fluxului
iar v este viteza liniară de curgere) şi înlocuind E cu Veff/W, în cazul în care Veff este tensiunea efectivă de
separare (tensiunea utilizată pentru separarea efectivă) iar W este lăţimea camerei de separare, se obţine:

Această ecuaţie arată că, în cazul miniaturizării aparatelor de electroforeză în flux continuu, rezoluţia
separare este independentă de dimensiunea dispozitivului (presupunând un raport constant L/W) şi depinde
numai de tensiunea aplicată la separare şi de viteza liniară de curgere.
1.3.2. FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ ÎN FLUX CONTINUU
În focalizarea izoelectrică în flux continuu, electrolitul de transport utilizat este compus dintr-un
amestec de amfoliți, care, în prezenţa unei tensiunii aplicate şi pe o pantă naturală de pH conduce, la
formarea unui gradient liniar de pH, perpendicular pe direcţia fluxului. Componente probei migrează în
cadrul acestui gradient de pH din cauza câmpului electric până când ajung la punctul în care valoarea pI a
lor devine egală cu valoarea pH-ului local al tamponului, devenind neutre din punct de vedere al sarcinii
electrice concentrându-se (figura 2.7.).

Figura 2.7. Principiul focusării izoelectrice frontale în flux continuu (După Kohlheyer și colab.,
2008).

Spre deosebire de tehnica de separare prin electroforeză în flux continuu liniară, unde deviația standard
a benzii unei fracții din probă crește continuu în cazul focalizării izoelectrice în flux continuu, deviația
standard a aceleași fracții din probă rămâne constantă, odată ce ajunge la echilibru. Lărgirea benzii, de
exemplu, din cauza difuziei, este continuu contracarată, deoarece speciile moleculare care au atins zona de
echilibru migrează înapoi la locul unde pI-ul este egal cu zero (Wang și colab., 2002). Prin urmare, lăţimea
benzii datorată injectării probei precum și cea datorată altor factori joacă un rol minor în focalizarea
izoelectrică în flux continuu. Totuși, o solubilitate scăzută a substanţei de analizat, la o valoare de pI şi
prin urmare, precipitarea ei conduce adesea la o focalizare neideală şi distorsionată. (Kohlheyer și colab.,
2008).
În condiţiile stării de echilibru, următoarea ecuaţie diferenţială, descrie elementele de legătură între
transportul electroforetic şi masa difuzională, în timpul focalizării izoelectrice:

unde C reprezintă concentraţia de analit, aflat în poziţia x într-o direcție de separare, µ este mobilitatea
acesteia la acel moment, E este intensitatea câmpului electric, iar D este coeficientul de difuzie (Righetti,
1983).
Un parametru util pentru a exprima calitatea unui sistem de echilibru de separare în gradient, de tipul
unui sistem de focalizare izoelectrică, include deviația standard a lățirii peak-ului, σ (ecuația 10), valoarea
minimă a pI care poate fi rezolvată D (pI)min (ecuația 12) și capacitatea peak-ului n (ecuația 14). Soluţia
pentru ecuaţia diferenţială (9) la starea de echilibru final oferă o distribuţie a concentrației în formă Gauss,
cu o deviație standard exprimată de către relația:

unde D reprezintă coeficientul de difuzie, E este intensitatea câmpului electric iar factorul p este dat de
relația:

în care d(pH)/dx reprezintă gradientul de pH iar dµ/d(pH) este panta mobilității analitului (Righetti,
1983).
O cale de deducere a puterii de separare prin focalizare izoelectrică este dată de relația 12 care arată că
diferența minimă de pI a două specii care pot fi separate, la distanțe dintre două peak-uri egală cu 2σ
(Righetti, 1983):

Prin înlocuirea Δ(pH)/dx cu ΔpH/L, unde L este lungimea gradientului de pH iar ΔpH este diferența
totală a gradientului de pH aplicat și prin înlocuirea intensității câmpului electric E cu Veff/L, unde Veff este
căderea de potențial utilizată la separare, se poate rescrie ecuația 12, astfel:

Se poate observa din ultima ecuație că numai ΔpH şi Veff sunt parametrii legați de dispozitiv (aparat) în
timp ce ceilalţi parametrii depind de analit. Astfel, devine clar faptul că rezoluţia Δ(pI)min este
independentă de dimensiunile dispozitivului, dar creşte odată cu tensiunea totală aplicată, un rezultat
similar fiinde obținut și în cazul electroforezei în flux continuu liniară. Prin urmare, presupunând condiţii
de separare ideale (inexistența degajării de căldură prin efect Joule), se poate trage concluzia că în
sistemele microfluidice de focalizare izoelectrică în flux continuu se pot realiza separări cu rezoluţie mare,
comparabile cu cele obținute în aparate de mari dimensiuni. În mod evident, o rezoluţie bună este
favorizată de o separare la o tensiune înaltă şi la o pantă de îngustă a pH-ului. Beneficiile date de
reducerea mărimii sunt legate de scăderea timpului de separare, după cum acesta scade liniar odată cu
lungimea camerei.
O metodă obișnuită pentru a exprima numărul de peak-uri care pot fi rezolvate este capacitatea peak-
urilor, n, definită prin relația:
unde L este lungimea totală a gradientului de pH (Wang și colab., 2002).
De asemenea, teoretic, capacitatea peak-ului este independentă de dimensiunile dispozitivului, după
cum relația 14 poate fi rescrisă astfel:

1.3.3. IZOTACOFOREZA ÎN FLUX CONTINUU

În procedeele de separare prin izotacoforeză în flux continuu, proba este introdusă între două
tampoane, unul frontal (LE) și unul posterior (TE), cu mobilități electroforetice mai mari respectiv mai
mici decât mobilitățile analiților din probă (figura 2.8.).

Figura 2.8. Principiul izotacoforezei frontale în flux continuu (După Kohlheyer și colab., 2008).

În timpul izotacoforezei în flux continuu analiţii se separă în regiuni adiacente în funcţie de mobilitatea
lor electroforetică descendentă (Gebauer și Bocek, 1995).
1.3.4. ELECTROFOREZA FRONTALĂ CU TREPTE DE CÂMP ELECTRIC
Un al patrulea mod de utilizare a electroforezei în flux continuu este tehnica cea frontală, în trepte de
câmp electric, proces în care se creează un gradient de câmp electric în trepte prin introducerea unui
tampon mai puţin conductiv în centrul camerei de separare, spațiu delimitat pe părţile laterale de mai
multe tampoane mai conductoare (figura 2.9).

Figura 2.9. Principiul electroforezei frontale în flux continuu cu trepte de câmp electric (După
Kohlheyer și colab., 2008).

Analiții care trebuie să fie separați se mișcă relativ rapid prin zona centrală, caracterizată printr-un
câmp electric crescut până când ajung la limita zonei unde se află un tampon cu o tărie ionică crescută și
un câmp electric mai redus. Acest pasaj dintr-un câmp într-altul conduce la o scădere drastică a vitezei
electroforetice a analitului, timp în care componentele acestuia au tendința de a se concentra (Kuhn și
colab., 1990).
 1.3.5. SEPARAREA POPULAȚIILOR DE CELULE PRIN ELECTROFOREZĂ ÎN FLUX
CONTINUU
Există mai multe dificultăţi implicate în separarea electroforetică de celule sau alte bioparticule. În
primul rând, celulele care urmează a fi separate trebuie să fie prezente ca o suspensie monocelulară.
Agregatele de celule sau ansamblurile lor nu pot fi separate electroforetic, în timp ce multe proceduri de
izolare a celulelor conduc la o deteriorare a acestora prin disrupere și de eliberare a nucleilor ori a ADN-
ului, oferind astfel preparate care nu pot fi utilizate la separarea electroforetică. În general, orice nuclei
eliberați în timpul procedurii de izolare pot fi eliminați în urma filtrării suspensiei printr-un dop de vată de
sticlă introdusă într-o pipetă Pasteur. ADN-ul liber, care poate apărea în cazul în care nucleii sunt
dezintegrați, trebuie să fie de asemenea, eliminați, deoarece, în câmp electric, conduc la agregarea
celulară. Un tratament scurt cu DN-ază ultrapură (20-30µg/ml) la temperatura camerei timp de 5-10
minute este în general suficientă.În acest context, dacă celule sanguine, limfatice, sau cele prezente în alte
fluide ale corpului pot fi destul de uşor pregătite pentru electroforeză, celulele din ţesuturi trebuie să fie
mai întâi izolate prin dezintegrare mecanică, de exemplu. Distrugerea celulelor prin simpla dezintegrare
mecanică poate fi redusă prin tratarea țesuturilor cu diferite enzime combinată apoi cu metode mecanice
blânde, cum ar fi amestecare ușoară sau aspiraţie printr-o pipetă gură largă. Această procedură este
probabil, singura modalitate de a obţine o suspensie monocelulară din țesuturi precum țesutul tumoral.
Enzimele care s-au dovedit a fi adecvate pentru obţinerea de suspensii monocelulare din ţesuturi diferite
sunt tripsina, chimotripsina, colagenaza, hialuronidaza şi dispaza. Trebuie avut în vedere că astfel de
enzime au de multe ori, dezavantajul de a cliva o serie de grupări specifice de pe suprafaţa celulelor care
urmează să fie separate și care modifică sarcina superficială de pe suprafața acestora și care reprezintă o
condiţie prealabilă pentru separarea electroforetică. De altfel mărimea sarcinii superficiale de pe suprafața
celulei reprezintă una dintre principalele motive pentru care un număr relativ mic de exemple de succes de
separare electroforetică a celulelor din ţesuturi pot fi găsite în literatura de specialitate.
O abordare diferită, utilizată la pregătirea prealabilă a celulelor de tipul nefronilor, care sunt conectați
între ei prin intermediul unor complexe joncționale Ca2+-dependente, este cea de tratament a țesutului cu
complexanți slabi ai Ca2+, precum citratul, EDTA sau EGTA, în combinaţie cu o agitarea blândă.
O altă problemă este alegerea mediului de pregătire şi de separare. Compoziţia optimă a tamponului de
separare trebuie să fie identificată pentru fiecare tip de celule. Cele mai multe dintre instrumente de
electroforeză în flux continuu prezintă sisteme eficiente de răcire care permit a se crește tăria ionică a
mediului de separare la valori de 8-10•102 µohm/cm. Aceasta este o tărie apropiată condiţiilor fiziologice
în care se separă celule în stare viabilă. În scopul de a atenua pierderea viabilității celulelor acestea trebuie
să fie colectate în mai multe soluţii fiziologice, cum ar fi medii de cultură, după ce acestea au fost separate
prin camera electroforetică. Trietanolamina, împreună cu contraionul acetat, s-au dovedit a fi mai eficienți
decât fosfatul, Tris-ul, sau orice alt tampon testat. Ioni, precum Mg2+, Ca2+, sau Mn2+ pot fi adăugați la
mediu, împreună cu agenţi de reducere fiziologici, de tipul glutationului. pH-ul trebuie să fie în intervalul
fiziologic (7,0-7,5). Osmolaritatea trebuie să fie, de asemenea, aproape de valoarea fiziologică, în jur de
300 mOsm. Această osmolaritate poate fi realizată prin adăugarea unor zaharuri, precum zaharoza, riboza,
manoza, sau cu prin adăugare de glicerină, cea din urmă nefiind însă potrivită pentru celule de tipul celor
din tubii renali, care tind să preia activ molecule din mediu prin intermediul unor procese de pinocitoză.
Temperatura la care celulele sunt pregătite, izolate şi separate trebuie să fie, de asemenea, aleasă cu
grijă. Celulele crescute în cultură la 37 oC, de exemplu, nu pot fi ținute pe gheaţă, deoarece ele ar putea
suferi de şoc termic şi astfel există posibilitatea de a se altera. În acest caz, temperatura camerei ar trebui
să fie utilizată pentru pregătirea probei iar temperaturile de 10 o-15oC pentru migrarea electroforetică.
Teoretic, celule preparate la temperaturi sub 10 oC pot fi separate la 4oC. Cu toate acestea, din cauza fazei
de tranziție a lipidelor membranare, temperatura de lucru din aparatul de electroforeză trebuie să fie de
peste 6oC.
Concentraţia de celule în suspensie care urmează să fie separate este importantă. O concentraţie prea
mare de celule cauzează agregarea lor, ceea ce face imposibilă o bună separare. O concentrație prea mică
conduce la imposibilitatea de a identifica suficiente fracţiuni individuale de celule. Concentraţia optimă se
situează între 20 şi 60 x l06 celule/ml.
În final, condiţiile de funcţionare a aparatului de electroforeză în sine joacă un rol cheie în realizarea
unei bune separări. Aparatul trebuie să ruleze întotdeauna la putere maximă, condiție care este adesea
limitată de capacitatea de răcire. Proporţia de tampon aflat în flux și volumul de probă injectată trebuie să
fie de 100-200:1-2; cu alte cuvinte, atunci când se rulează între 100-200 ml de soluţie tampon de
separare/oră, pot fi injectați doar 1-2 ml de suspensie de celule. Este recomandabil să se depună pe pereţii
din sticlă ai dispozitivului de separare un strat alcătuit din albumină, înainte de fiecare separare pentru a
aduce potenţialul ξ (zeta) al peretelui cât mai aproape de potenţialul ξ al bioparticulelor (în intervalul de
intensitate cuprins între 27 și 45mA) şi astfel de a evita disturbanțele provocate prin electroosmoză.
Strategia utilizată în abordarea unei separări electroforetice complete poate fi rezumată după cum
urmează: o suspensie monocelulară este pregătită fără a avea agregate celulare, ori nuclei sau ADN
contaminant. Celulele sunt spălate treptat în medii de separare, cu pH-uri sau compoziţii ionice diferite şi
sunt apoi observate timp de aproximativ 2 ore pentru a verifica stabilitatea şi menținerea proprietăţilor lor.
În continuare se selectează cel mai bun tampon iar celulele sunt treptat transferate în acesta până la
obţinerea unei concentraţii corespunzătoare (Heidrich și Hannig, 1989). Condiţiile de separare sunt astfel
alese încât celulele cu mobilitatea ca mai mare sunt deviate masiv spre anod. În cazul în care celulele
agregă, procedura de pregătire nu este optimă şi trebuie să fie în cntinuare îmbunătăţită. Celulele sunt
colectate în mediul de cultură sau de un mediu cât mai aproape de cel fiziologic posibil. Numărarea
celulelor poate fi făcută în tuburi de colectare individuale în timpul procesului de separare, în scopul
evidențierii profilului de separare, pe baza căruia se analizează diferitele fracţiuni. Dacă nu se realizează o
separare clară a celulelor, trebuie să fie modificat pH-ul şi compoziţia tamponului. În cazul în care
diferenţele în sarcină superficială nu este suficient de mare nu este posibilă o separare optimă.
În general, şansele pentru o separare de succes sunt mari, atunci când există diferenţe clare
morfologice între diferitele tipuri de celule. Aceste diferenţe sunt evidente, de exemplu, în cazul celulelor
tubilor renali proximali şi distali. Primele tipuri de celule prezintă microvili lungi şi numeroși fiind mai
puţin încărcate negativ decât cele din urmă, care sunt mai scurte şi posedă mai puţini microvili. În acest
caz diferenţa de bază în mobilitatea electroforetică este dată de faptul că celulele proximale au o
membrană mai bogată în microvilozități și care este mai puţin încărcată negativ şi prin urmare au o
mobilitate electroforetică mai mică în timp ce celulele distale au o membrană bazală mai mare, fiind mai
încărcate electronegativ (Heidrich și colab., 1972; Hcidrich și Geiger, 1980).
O rezoluție mai bună s-a obținut în condiții de microgravitație, când viteza ”de cădere” a fost mai
mică. Tehnica s-a utilizat pentru separarea unor celule din rinichi embrionar aflate în cultură. În cazul
acestui experiment, celulele s-au deplasat timp de 12 minute la o temperatură cuprinsă între 5 și 9 oC.
Condițiile de lucru (tamponare, tărie ionică mică pentru a contracara efectul Joule, mărimea stratului de
tampon aflat în flux continuu, concentrația celulelor) au fost alese în așa fel încât să nu afecteze
integritatea celulelor, în condițiile unei rezoluții de separare cât mai bună (Hannig și colab.,1990).
1.3.6. ELECTROFOREZA FRONTALĂ PE COLOANĂ
O altă aplicație a electroforezei în flux continuu o reprezintă tehnica denumită electroforeză în flux
liber pe coloană, metoda fiind cunoscută ca procedeu electroforetic preparativ ascendent.
Aparatul este alcătuit dintr-o coloană cilindrică parțial umplută cu un tampon cu densitate specifică
mai mare decât cea a celulelor. Suprafața astfel realizată va reprezenta stratul de start pe
care celulele sunt depuse (starting cushion). În continuare coloana se umple cu o soluție
izotonă de tampon. Densitatea specifică crescută a stratului de start se realizează cu
”Ficoll-Hypaque”, sucroză ori apă grea iar electrozii se găsesc în compartimente separate
(figura alăturată).
În condițiile aplicării unui câmp electric, celulele vor migra ascendent spre anod, viteza
de migrare a acestora fiind în relație directă cu sarcina superficială de pe suprafața lor.
Separarea durează circa o oră, formându-se zone distincte care se pot colecta în fracțiuni.
Coloana este termostatată și prezintă o capacitate de circa 2•106-2•108 celule/ciclu de
separare.
O instalație semiautomată a fost concepută de către Hanning și Schindler pentru
misiunea Apollo-Soiuz. În acest caz, celulele au fost înghețate într-o soluție tampon fosfat
care conține NaCl (6,42mM), glucoză (222mM), EDTA (0,336mM) și glicerină (5%) sub forma unui disc
care s-a introdus în coloană. După dezghețare, s-a aplicat un câmp electric în condiții de microgravitație.
La terminarea electroforezei, coloana s-a înghețat complet și s-a păstrat în azot lichid până la revenirea pe
pământ. Acest procedeu a fost denumit electroforeză pe coloană statică în condiții de microgravitație
(Clifton și colab., 1996).
Utilizarea electroforezei în mediu liber la studiul analitic al macromoleculelor biologice este de
importanță deosebită. Dacă inițial Tiselius, folosind un tampon cu pH=7,6 a reușit să separe proteinele
serice în patru fracțiuni: albumina, cu mobilitatea cea mai mare și trei fracțiuni globulinice (α, β și γ, cu
mobilități descrescătoare de la α, la β și γ), ulterior s-a observat că la pH=8,6 (la care toate proteinele
serice sunt negative, ele migrând spre anod), globulinele α se rezolvă ca două subfracții α1 ți α2, iar la
introducerea unor ioni de calciu (care interacționează cu componentele serice modificând astfel
mobilitatea lor) într-un tampon veronal, fracția β se separă în două componente:β1 și β2.
Pe de altă parte, alte aplicații importante a electroforezei în mediu liber este cea de determinare a
potențialului zeta al unei particule ori cele de separare a: (a) celulelor intacte (de exemplu a celulelor
sanguine); (b) a organitelor celulare (lizozomi, mitocondrii, aparat Golgi); (c) a sistemelor de membrane
celulare. În plus, electroforeza în mediu liber este utilizată la studiul adezivității bacteriilor, la purificarea
plasminogenului tisular exprimat în drojdii, la separarea celulelor transformate și clonate, fiind utilizată în
tehnologia anticorpilor monoclonali.
Prin utilizarea unei celule electroforetice în flux liber orizontale
(figura alăturată) procedeul se utilizează la studiul eritrocitelor
umane din sânge periferic în cazuri normale și patologice (malarie),
în studiul celulelor imunocompetente T și B și a celulelor dendritice,
la diagnosticarea și clasificarea unor leucemii și monitorizarea
tratamentului aplicat precum și la urmărirea efectelor antitumorale
ale unor medicamente. S-a obținut astfel un medicament cu structură
de polizaharid extras din Coriolus versicolor (familia
Basidomicetae) denumit krestin cu efect antitumoral și reversor (care reinstaurează comportamentul
normal) asupra limfocitelor, readucându-le în limite normale funcțiile leucocitelor și macrofagelor (Dong
și colab., 1996).
Astăzi, cele mai bune aparate separă celule a căror diferență de mobilitate este de circa 5%. În cazul
separării celulelor cu mobilități electroforetice apropiate sau identice, se reduce selectiv și masiv sarcina
electrică superficială la unele populații celulare cu ajutorul unor anticorpi specifici (figura 2.10).

Figura 2.10. Prezentarea schematică a reducerii

selective și masive a sarcinii electrice
superficiale la unele populații celulare cu ajutorul
unor anticorpi specifici, în cazul separării
celulelor cu mobilități electroforetice apropiate
sau identice (După Hansen și colab., 1989).

Se pot utiliza unul sau două tipuri

de anticorpi. Metoda a fost denumită tehnica de separare electroforetică pe baza specificității antigenice
și s-a sugerat a fi utilizată la eliminarea celulelor Killer în cazul transplantului de măduvă roșie (Hansen și
colab., 1989).
 3. ELECTROFOREZA ZONALĂ
Din elementele mai sus arătate, este relativ ușor să se observe că în cazul electroforezeia în mediu liber
mobilitatea electroforetică a unei particule, este funcție de raportul dintre sarcina sa electrică și
coeficientul său de frecare, practic de forma sa (Andrews, 1986.; Garfin, 1995; Garfin, 2003). În cazul
proteinelor, ambii parametrii sunt stabiliți de compoziția și interacția lor cu mediul înconjurător, după cum
mobilitățile electroforetice sunt influențate de factori, precum pH-ul, cantitatea și tipul de contraioni care
sunt prezenți în mediu.
Mobilitățile electroforetice ale particulelor sunt foarte diferite în condițiile migrării pe un suport
precum gelul decât în separările prin electroforeză liberă. Gelurile, ca suporturi electroforetice pot acționa
ca o sită moleculară pentru molecule de dimensiunea particulelor care se separă. Ele constau din rețele
tridimensionale de material solid și poros, care acționează ca o barieră în calea mișcării particulelor în
câmp electric uniform în timpul electroforezei care se deplasează între porii încărcați în tampon.
În momentul în care Tiselius (1937) a publicat lucrarea sa referitoare la electroforeza în mediu liber, în
acelașii an, Konig (1937) a indicat posibilitatea de a utiliza hârtia de filtru pentru separarea electroforetică
a amestecurilor de proteine. În continuare, o serie de cercetători au descris diverse tehnici care au utilizat
hârtia drept agent anticonvectiv pentru separarea amestecurilor de aminoacizi, peptide, proteine și alte
substanțe. Astfel, hârtia de filtru a devenit general utilizată fiind cel mai practic mediu suport în
electroforeză. Neîndoios, dezvoltarea cromatografiei pe hârtie prin anii 1940 a condus la cercetări privind
obținerea unei hârtii de filtru care a fost utilizată simultan atât în separări cromatografice cât și pentru
separări prin electroforeză.
Utilizarea hârtiei de filtru sau a altor medii suport solide introduc de asemenea o serie de factori care
implică mobilitatea electroforetică a moleculelor încărcate electric, procesele de electroosmoză, de curgere
hidrodinamică a lichidului, de adsorbție, efecte cromatografice și de concentrare. Din acest punct de
vedere, electroforeza zonală nu poate fi utilizată pentru determinarea precisă a mobilității electroforetice, a
punctului izoelectric sau a altor proprietăți de migrare a substanțelor fără o procedură de standardizare
adecvată tehnicilor particulare. Astfel, a fost introdusă mărimea Rf drept raportul dintre mobilitatea unei
macromolecule oarecare și mobilitatea unei molecule standard sau a unui colorant trasor care migrează cu
frontul. În aceste condiții o macromoleculă cu sarcină electrică dată, în funcție de dimensiunile sale și de
dimensiunile porilor/capilarelor prin care este obligată să se deplaseze datorită aplicării unui câmp electric
uniform, va fi mai mult sau mai puțin frânată în deplasarea sa, fiind caracterizată, printre altele, prin
mobilitatea sa electroforetică.
În practică se folosește mobilitatea electroforetică relativă care este proporțională cu distanța de
migrare. Ea se calculează prin compararea mobilităților diferitelor macromolecule considerând timpul de
separare și intensitatea curentului electric, constante. Deoarece frontul de ioni este dificil de localizat, în
practică, mobilităţile sunt normalizate față de un colorant trasor, de obicei albastrul de brom fenol (ABF)
(figura 3.4) care este în mod obișnuit folosit ca marker (indicator) colorat de migrare și care se deplasează
aproximativ odată cu frontul de ioni. Mobilitatea relativă se notează cu Rf (retardation factor, factor de
întârziere) și poate fi practic definit ca raportul dintre mobilitățile unei macromolecule în mediu restrictiv,
µ și mobilitatea sa într-un mediu liber, nerestrictiv, µo după relația:

Prin urmare, Rf este o constantă fizică care caracterizează o macromoleculă dată într-un suport cu o
anumită compoziție, în condiții definite.
În mod obișnuit colorantul de monitorizare a migrării este amestecat cu proba, astfel, anionul ABF
poate fi utilizat în sisteme cu pH bazic, în timp ce pentru sistemele electroforetice acide, verdele de
metilen (un cation) este efectiv (Gabriel, 1971). De asemenea, în tabelul 3.1. sunt prezentați o serie de
coloranți utilizați ca markeri (trasori) de migrare electroforetică și utilizările lor în electroforeza zonală pe
diverse suporturi capilare sau poroase.
Un suport ideal este acela care nu prezintă impurități, este chimic inactiv în ceea ce privește
substanțele separate, care nu prezintă activitate adsorbtivă și care prezintă cel mai scăzut efect
electroosmotic. Din nefericire nici o hârtie de filtru nu îndeplinește în totalitate toate aceste condiții. În
plus, au fost introduse noi medii suport care posedă proprietăți mult mai favorabile, precum acetatul de
celuloză, gelurile de agaroză și de poliacrilamidă (Ostrowski, 1979).
 Se poate remarca că odată cu introducerea hârtiei de filtru ca mediu suport stabilizant s-a permis
ținerea sub control a difuziunii și a curenților de convecție, s-a simplificat tehnica și aparatura necesară
separării electroforetice. Astfel, electroforeza zonală asigură stabilitatea electroforetică.
Tabelul 3.1. Coloranții-markeri (trasori) de migrare electroforetică și utilizările lor (după Fisher)
Denumire Utilizări
Albastrul de brom fenol (Bromophenol Blue) Colorant trasor neutru și bazic, utilizat în special la electroforeza pe
hârtie, nitroceluloză, gel de amidon, agaroză sau poliacrilamidă
Verdele de bromocrezol (Bromocresol Green) Colorant trasor utilizat la electroforeza ADN pe agaroză
Pironină Y (Pyronin Y) Colorant trasor acid utilizat la electroforeza ARN
Verdele de metal (Methyl Green) Colorant trasor neutru și acid utilizat la analiza AND nativ
Roșul de metal (Methyl Red) Colorant trasor acid utilizat în special în focusarea izoelectrică
Xilenul cianol FF (Xylene Cyanole FF) Colorant trasor utilizat la secvențierea ADN
În prezent se folosesc o varietate de medii suport stabilizante care se pot împărți în:
(1) Medii suport cu structură capilară, care (a) prezintă proprietăți anticonvective - dacă
secțiunea capilară este suficient de mică (într-un canal cu secțiune circulară curgerea descrește cu puterea
a 4-a a razei); (b) sunt stabile fizico-chimic; (c) prezintă proprietăți mecanice bune; (d) sunt netoxice; (e)
sunt ieftine și astfel accesibile; (f) sunt relativ inerte-este cazul hârtiei de filtru, a acetatului de celuloză, a
mediilor specifice cromatografiei pe strat subțire (celuloza microcristalină, silicagelul, alumina,
silicagelul; (g) au proprietăți electroforetice specifice bune – nu interacționează decât foarte slab cu
compușii pe care îi separă (excepție face hârtia de filtru la care se observă o adsorbție nespecifică). În
cazul acestor medii suport, proteinele serice se separă în albumină și alte patru sau mai multe componente
globulinice dar cu o rezoluție inegală, cu o poziție relativă a fracțiunilor asemănătoare.
(2) Medii suport care, datorită structurii poroase caracteristice, participă activ în separare. În
acest caz separarea electroforetică are loc atât densității sarcinilor electrice cât și a efectului de cernere
moleculară. Astfel, două particule cu aceeași sarcină electrică dar cu dimensiuni diferite, vor fi separate ca
zone distincte, particulele mai mici migrând mai ușor. De exemplu, dacă prin electroforeză pe hârtie
proteinele serice se separă în fracțiile: albumină, α1-, α2-, β- și γ-globuline, după electroforeza pe gel de
amidon se identifică circa 15 zone proteice.
Din categoria acestor medii fac parte gelul de amidon, gelul de agaroză (unde efectul de sită
moleculară apare la concentrații mari de gel) și gelul de poliacrilamidă (care prezintă avantajul de a putea
alege dimensiunea porilor).
(3) Medii afine, pe care le vom examina în subcapitolele 3.13 și 3.14.
3.1. ELECTROFOREZA PE HÂRTIE
Descoperită la mijlocul secolului trecut, hârtia de filtru s-a răspândit în diverse domenii, reprezentând
pentru o perioadă lungă de timp mediul ideal pentru electroforeză. Totuși, importanța sa a scăzut odată cu
introducerea altor noi suporturi.
În acest tip de electroforeză, hârtia de filtru reprezintă mediul stabilizant care posedă următoarele
caracteristici:
(a) conține minimum 96% celuloză, insolubilă în NaOH concentrat;
(b) prezintă o capacitate mare de imbibiție (absorbție) care trebuie să fie de două ori mai mare decât
greutatea sa;
(c) este lipsită de metale grele (de exemplu Pb), care modifică conductibilitatea sa electrică; (are o
structură uniformă a fibrelor de celuloză, unidirecționate;
(d) prezintă o densitate caracteristică a fibrelor - o hârtie de filtru fină sau medie prezintă o textură
deasă care va conduce la separări în zone bine delimitate, dar într-un timp mai mare, în timp ce o hârtie de
filtru grosieră se îmbibă rapid cu cantități mari de tampon iar separările vor conduce la zone neclare, într-
un timp mai scurt;
(e) la un pH acid și la tării ionice scăzute apar fenomene de adsorbție a proteinelor pe suport care vor
conduce, în continuare, la formarea benzilor cu coadă.
Tamponul, reprezintă de asemenea o componentă importantă a sistemului electroforetic. În cazul
acetui tip de electroforeză, tamponul se află în compartimentul electrozilor, la un nivel egal și constant,
evitându-se astfel fenomenul de sifonare (de trecere a tamponului între compartrimente printr-un proces de
echilibrare a nivelului de lichid). Menținerea evaporării tamponului în limite rezonabile se realizează prin:
(a) scăderea forței ionice, legată de efectul Joule și de efectul de flux capilar; (b) saturarea
compartimentului de separare cu vapori; (c) adăugarea de propilenglicol sau glicerină (5-15%) în soluția
tampon ori (d) în cazul electroforezei de înaltă tensiune, prin plasarea hârtiei de filtru în solvenți hidrofobi.
 Calitatea probei utilizate în electroforeza pe hârtie este deosebit de importantă. În cazul unei proteine
pure se pune problema cunoașterii valorii pH-ului la care mobilitatea ei în câmp electric este egală cu zero.
Acest punct reprezintă punctul izoelectric al proteinei (figura 3.1). Nu trebuie să se confunde pI cu punctul
izotonic, definit ca valoarea pH-ului unei soluții apoase de proteină după îndepărtarea tuturor ionilor
necoloidali din soluție.
Valoarea pI este specifică unei proteine și depinde de natura solventului precum și de concentrația
electrolitului.

Figura 3.1. Dependența dintre pH-ul soluției și sarcina electrică a două

polipeptide, insulina umană și fragmentul polipeptidice des-B23-B30-
octapeptid-insulină (DOI). Se observă diferența dintre puncteele izoelectrice ale
celor două polipeptide. (După Kasicka, 2005).

În separarea electroforetică este necesar să se urmărească cu mare atenție pH-ul și tăria ionică a soluției
tampon. De obicei tăria ionică a acesteia este cuprinsă între 0,06-0,1M. Soluțiile tampon cu o tărie ionică
mai mică de 0,06M nu tamponează suficient în timp ce soluțiile cu o tărie ionică mai mare de 0,1M
conduc la un efect Joule marcant, care se manifestă cu o degajare semnificativă de căldură.
Echipamentul utilizat în electroforeza pe hârtie este alcătuit din două componente principale: o cameră
(tanc) electroforetic și o sursă de putere electrică.
Tancurile electroforetice sunt variate în construcție și depind de aranjamentul pe orizontală sau
verticală a benzii de hârtie electroforetică precum și de necesitățile caracteristice ale unor experimente
particulare (figura 3.2). Astfel, tancul electroforetic utilizat în mod obișnuit la electroforeza pe hârtie de
voltaj scăzut este de două tipuri, după cum hârtia de filtru este așezată. În tipul orizontal, hârtia de filtru
este fixată orizontal la capetele incintei în timp ce la tipul vertical, aceasta este așezată vertical, pe o
baghetă. La extremități, banda de hârtie este imersată în vasele de tampon la aceeași adâncime în timp ce
nivelul tamponului în cele două compartimente trebuie să fie egal. Unele aparate prezintă un sistem
labirint prin care comunică, în condiții speciale, cele două rezervoare, prevenindu-se astfel fenomenul de
sifonare prin banda de hârtie în timpul separării electroforetice. Aparatul este de asemenea prevăzut cu un
capac, realizat de obicei din plexiglas.
Electrozii utilizați la construcția aparatelor de electroforeză sunt executați din diverse materiale precum
grafitul, argint/clorura de argint, paladiu ori platina. Tipul de electrod trebuie să fie astfel selectat având în
vedere tipul de electrolit (tampon) utilizat la separare. Electrozii de grafit sunt ușor polarizabili și cu mică
rezistență mecanică, putându-se lesne dezintegra, conducând la o contaminare a soluțiilor. Pe de altă arte,
electrozii de argint/clorură de argint trebuie să fie reversați după fiecare utilizare. În plus ei nu pot fi
utilizați într-o serie de electroliți cu care pot reacționa.

Figura 3.2. Reprezentarea schematică a tipurilor

de tancuri utilizate la electroforeza pe hârtie: (a)
tip orizontal; (b) tip vertical; (c) tip cu banda de
hârtie imersată; (d) tip cu banda de hârtie închisă.
 Cele mai bune rezultate sunt obținute cu electrozi obținuți din paladiu și platină (în formă de fir sau
folie), care pot fi utilizați în diverși electroliți, la pH-uri variate. Pentru a se preveni contaminarea cu
produși de electroliză care se eliberează la nivelul electrodului, banda de hârtie de filtru nu trebuie să fie
introdusă direct în compartimentul electrozilor, ci într-un compartiment adiacent acestora, iar contactul
electric este realizat prin intermediul unor punți (bride) din hârtie de filtru sau bumbac, a unor punți din
agar sau printr-un sistem special de labirint. De ademenea, volumul de electrolit-tampon în vase trebuie să
fie suficient de mare pentru a preveni influența produșilor de electroliză asupra separării electroforetice.
Volumul V care transportă ionii de hidrogen în timpul unui experiment poate fi calculat astfel:

unde UH+ reprezintă mobilitatea H+, I este intensitatea curentului (Amperi), t este timpul (secunde) iar K
este conductivitatea soluției. Se poate deduce că, în cazul unor electroliți diluați și la timpi mari de
separare, tamponul trebuie să circule continuu între compartimentele cu electrozi.
Sursa de curent trebuie să fie capabilă să ofere un intensitate a curentului și un voltaj constant. Pentru
separările de rutină, sursa de curent adecvată trebuie să aibă capacitatea de a oferi 50 mA și 500V.
Intensitatea maximă a curentului care poate fi utilizată pe unitatea de arie a benzii de hârtie de filtru
supuse separării electroforetice poate fi calculată astfel:

unde I (mA) reprezintă intensitatea curentului, P (cm2) este aria benzii de hârtie de filtru măsurată între
suprafețele de electrolit și compartimentele electrozilor iar U (V) este potențialul electric. În general
tensiunea maximă de lucru este de 400 V, cu o cădere maximă de 15V/cm2 (în medie de 2-10V/cm2).
Determinările cantitative ale fracțiilor separate pe benzile din hârtie de filtru pot fi realizate atât
metode directe cât și indirecte. În cazul metodelor directe, fracția care trebuie să fie măsurată trebuie să
absoarbă radiație UV, să fie fluorescentă ori radioactivă. În metodele indirecte zonele separate trebuie să
fie mai întâi colorate iar absorbanța se măsoară cu ajutorul unui densitometru. Au fost construite o serie de
densitometre semi - sau total automatizate care trasează grafic intensitatea luminii transmise sau reflectate
de pe o electroforegramă colorată versus distanța de-a lungul benzii electroforetice în formă de curbe
electroforetice.
Aria din interiorul acestor curbe este determinată fie automat fie printr-o scanare integrată, fie cu
ajutorul unui planimetru ori prin tăierea ariilor reprezentate și cântărirea lor. Sunt descrise de asemenea
scannere computerizate care permit analiza cantitativă completă a unei electroferograme în câteva
secunde. Figura 3.3 prezintă profilul electroforetic al proteinelor serice separate prin electroforeză pe
hârtie, colorate cu amino black 10B și scanate cu un densitometru semiautomat.

Figura 3.3. Profilul electroforetic al proteinelor serice separate pe hârtie, colorate cu amino black
10B și scanate cu un densitometru semiautomat.

Aplicarea probei se realizează pe banda de hârtie de filtru îmbibată cu soluție tampon, fixată în aparat,
după crearea unui mediu saturat și stabilizat în vapori, cu ajutorul unei pipete capilare, seringi Hamilton
(1-5µl) ori micropipete. Se pot realiza două tipuri de spotări: în picătură sau în linie.
Pentru urmărirea separării electroforetice se apelează la un colorant ca substanță de referință. De obicei
se utilizează albastru de bromofenol (ABF), un colorant trifenilmetanic (figura 3.4) ale cărui proprietăți și
utilizări în electroforeză vor fi detaliate pe parcurs. După completa separare benzile de hârtie de filtru se
îndepărtează din camera de electroforeză și se usucă într-o etuvă (aproximativ 100°C).
 Figura 3.4. Structura chimică a colorantului trifenilmetanic, albastru de brom fenol
(bromophenol blue).

Componentele separate se localizează în mod uzual prin colorații histochimice folosind un colorant
adecvat. În acest sens cei mai utilizați coloranți frecvent folosiți în evidențierea componentelor proteice
separate prin electroforeză pe hârtie sunt Amino Black 10B (Grassmann și Hannig, 1952; Kawerau, 1954)
(figura 3.5), Albastrul de bromofenol (Durrum, 1950), Azocarmine B (Plückthum și Götting, 1951;
Korver, 1950), Light Green SF (Rideout și Prichard, 1955) și Ponceau Red 2R (Rottger, 1952) (figura
3.6).

Figura 3.5. Structura chimică a colorantului diazolic Amido

black 10B, utilizat în practica biochimică la colorarea totală a
proteinelor.

După colorare, excesul de colorant este îndepărtat de pe banda de hârtie prin spălare cu un solvent
convenabil. Pentru o decolorare mai eficientă se poate adăuga detergent la soluția de solvent ori procesul
de spălare se realizează la o temperatură de aproximativ 80°C (Pucar, 1953).
Componentele lipoproteice ale serului sanguin pot fi detectate pe banda de hârtie prin colorare cu
Sudan Black B (Swahn, 1952) (figura 3.7) ori cu Oil Red O (Weller, 1958) (figura 3.8).

Figura 3.6. Structura chimică a azo-colorantului Ponceau

2R. Alte denumiri: Xylidine ponceau, Ponceau G, Red R,
Acid Red 26, Food Red 5.

Figura 3.7. Structura chimică a Sudan Black (10)B, un

colorant diazo.

Figura 3.8. Structura chimică a Oil Red O un colorant diazo.

Alte denumiri; Solvent Red 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125,
C26H24N4O.

Prin utilizarea acestor ultime proceduri se pot separa și detecta patru fracții lipoproteice: chilomicroni,
α-lipoproteine, pre-β-lipoproteine și β-lipoproteine. Totuși, cea mai bună rezoluție a fracțiilor lipoproteice
din serul sanguin se obțin pe gelul de agaroză ori pe membrane de acetat de celuloză (Lees și Hatch,
1963).
Componentele glicoproteice sunt detectate pe hârtie cu ajutorul reactivului Schiff-acid periodic, în
cazul glicoproteinelor neutre (Matthieu și Quarles, 1973), difenilamină pentru mucoproteine și
glicozaminoglicani (Anderson și Maclagen, 1955), albastru de toluidină și Azure A pentru glicoproteine
acide (Takeuchi, 1961) și alcian blue pentru glicozaminoglicani acizi (Prout, 1969; Newton și colab.,
1974). Pentru un ser normal se regăsesc 5-6 fracții glicoproteice, ale căror concentrații se modifică pe
parcursul dezvoltării unor procese patologice la nivelul ficatului, rinichilor, sistemului nervos central ori în
timpul evoluției unor procese tumorale (Ostrowski, 1979).
Electroforeza la voltaj scăzut a fost deosebit de utilizată în analiza amestecurilor de proteine, în
particular a proteinelor serului sanguin și a lipo- ori glico-proteinelor. Din această cauză ea a jucat un rol
important în dezvoltarea unor tehnici de diagnostic în condițiile în care modificările albuminei și ale
fracțiilor globulinice în timpul proceselor patologice sunt de o semnificație clinică majoră (Owen, 1958)
după cum se observă în figura 3.9.

Figura 3.9. Exemple caracteristice de separare a proteinelor normale

și patologice serice sanguine: (a) normal; (b) inflamație acută; (c)
inflamație cronică subacută; (d) ciroză hepatică; (e) sindrom nefrotic;
(f) β-mielom; (g) γ-plasmocitom.

Sursele de eroare în electroforeza pe hârtie provin de la alegerea eronată a tăriei ionice a tamponului
(dacă aceasta este prea mare rezultă o fracționare slabă iar dacă aceasta este prea mică conduce la apariția
unor zone cu margini difuze), a tehnicii de lucru (dacă hârtia este zgâriată sau insuficient îmbibată, proba
rămâne în start) a modului de lucru (dacă timpul scurs între oprirea sursei de curent la sfârșitul separării și
momentul fixării este crescut, apar zone difuze).
În general se poate spune că două tipuri de hârtie vor conduce la rezultate diferite și că variațiile de
temperatură conduc la modificarea migrării proteinelor pe suportul solid.
3.1.1. ELECTROFOREZA PE HÂRTIE LA TENSIUNE ÎNALTĂ
În acest caz tensiunea aplicată este de circa 50-215V/cm, iar la bornele sursei de curent tensiunea
redresorului este de 10 kV. Se poate afirma că o creștere de la 5V la 100V/cm (adică o creștere de 20 de
ori) va conduce la o creștere de asemenea, de 20 de ori a vitezei de migrare, în schimb cantitatea de
căldură degajată va crește de 202, adică de 400 de ori, motiv pentru care este absolut necesară existența
unei termostatări uniforme (o termostatare neuniformă conduce la apariția zonelor de semilună, când
marginile hârtiei se usucă mai tare). În plus, la concentrații mari de probă rezoluția de separare este
scăzută, obținându-se zone cu trenă (Ostrowski, 1979).
Electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă se utilizează la separarea aminoacizilor (se realizează în
tampon acid formic-acetat de sodiu), a peptidelor (tampon piridină-acid acetic, la un pH cuprins între 3,0
și 5,0), a glucidelor sau a bazelor azotate purinice și pirimidinice.
Sub forma bidimensională, electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă se poate combina cu cromatografia
pe hârtie.
3.2. ELECTROFOREZA PE STRAT SUBȚIRE
Cromatografia și a electroforeza în strat subțire, au reprezentat metode promițătoare pentru analizele
compoziției proteinelor și a acizilor nucleici datorită comodității și sensibilității lor crescută (de la 10 la 50
de ori) în comparație cu tehnicile pe hârtie. În acest sens, electroforeza în strat subțire combinată cu
cromatografia pe acelașii suport a reprezentat o metodă de rutină pentru separarea a unor mici cantități de
aminoacizi, nucleotide, ioni anorganici și a altor substanțe cu masă moleculară mică.
Utilizarea mediilor suport de strat subțire oferă următoarele avantaje față de tehnicile care utilizează
hârtia (Deyl, 1984):
(1) necesită un echipament mult mai simplu pentru preparare;
(2) rezoluția este în general superioară;
(3) separările se pot realiza la potențiale înalte în perioade de timp foarte scurte;
 (4) sunt necesare mici cantități de probă, putându-se realiza mai ușor separări atât cantitative cât și
micro-preparative;
(5) probele nu trebuie desalinizate, ele aplicându-se direct, pe strat. În aceste condiții ureea și glucidele
rămân în start, în timp ce ionii migrează rapid;
(6) se pot utiliza reactivi agresivi de spray-ere și astfel limita de detecție este mai coborâtă.
Din punct de vedere al echipamentului utilizat, se folosesc aparate convenționale de tip orizontal,
similare acelora utilizate în electroforeza pe hârtie, pe acetat de celuloză ori pe gel de agar/agaroză.
Pentru separări la potențiale mai înalte ori pentru separări bidimensionale s-au descris diverse camere
prevăzute cu sisteme de răcire (Hrkal, 1979).

Figura 3.10. Cameră pentru electroforeză în strat subțire. (a) placă orizontală prevăzută cu sistem de răcire; (b) foițe de izolare; (c)
strat subțire pe placă de sticlă; (d) bride de hârtie (Whatman 3 MM); (e) placă de sticlă, 5 mm grosime; (f) compartimente pentru
tampon și electrozi; (w) sistem de răcire (după Hrkal, 1979).
Aparatul pentru electroforeză pe strat subțire este prezentat schematic în figura 3.10. El este alcătuit
dintr-un plan orizontal sub care se găsește un sistem de răcire cu apă, pe care se așează placa
electroforetică (cu dimensiuni de 10 x 10 sau 20 x 20 cm) prevăzută cu un strat subțire (de circa 250-300
µm, înălținme) și care este pusă în contact cu tamponul din tanc prin intermediul unor bride din hârtie de
filtru. Aparatul este acoperit cu o placă de sticlă. Mica distanță dintre placa cu strat subțire și placa care
acoperă aparatul acționează ca o cameră umedă și previne uscarea stratului subțire.
În cazul separărilor componentelor serului sanguin, volumul de probă este în funcție de cantitatea de
creatinină. În general proba spotată trebuie să conțină maximum 5 µg de creatinină. Timpul de separare
este de aproximativ 25-30 minute la o tensiune de 30 V/cm.
Proteinele sau alte substanțe macromoleculare pot fi separate prin utilizarea unui sistem bidimensional,
gel filtrare pe strat subțire/electroforeză pe strat subțire. În funcție de masele moleculare ale probei, se pot
utiliza suporturi cromatografice de tipul Sephadex Superfine (cu o mărime cuprinsă între G-25 - G-200).
Așadar, Sephadex-ul, echilibrat în tamponul adecvat, este depus într-un strat subțire pe placa de sticlă și
care apoi este plasată într-un aparat dedicat de tipul celui prezentat în figura 3.11. Stratul cromatografic,
conectat la un rezervor prin intermediul unei bride din hârtie de filtru Whatman No. 1 la capătul superior,
este echilibrat în tampon. În continuare placa se înclină într-un unghi de 15-20o față de orizontală.

Figura 3.11. Aparat pentru separări bidimensionale (gel-

filtrare și electroforeza pe strat subțire) pe gel de Sephadex.
(a) sistem suport; (b) fantă pentru conexiunea prin hârtie
de filtru; (c) sistem de răcire a platformei cu apă; (d) bazin
care conține tampon ori solvent utilizat la dezvoltarea
electroforegramei; (e) sistem de schimbare a poziției
suportului plăcii; (f) orificii și (g) șuruburi de prindere
(după Hanson și colab., 1966).

De asemenea, pentru a îndepărta fluidul filtrat, la capătul inferior se pasează o bucată de hârtie de
filtru. După finalizarea gel-filtrării, placa este aranjată orizontal iar electroforeza se realizează pe o direcție
perpendiculară față de prima dimensiune. Pentru a obține o imagine a spoturilor proteice, placa este apoi
acoperită cu grijă cu o bucată de hârtie de filtru și după 5 minute de contact, timp în care componentele
separate se transferă pe aceasta, hârtia este îndepărtată de pe strat, uscată la 100°C și colorată cu un
colorant specific.
 Tehnica bidimensională de separare electroforetică a fost utilizată la analiza componentelor serice
(Hanson și colab., 1966), a unor coloranți tetrazolici (Locke și colab., 1968), a unor aminoacizi urinari, a
unor peptide (Klein și colab., 1970) și a altor substanțe biologic active (Jaworek, 1971).
3.3. ELECTROFOREZA PE MEMBRANE DIN DERIVAȚI AI CELULOZEI
Dacă inițial membranele de acetat de celuloză au fost produse pentru a fi folosite în procese de filtrare,
utilizarea lor ca mediu suport în electroforeză a fost sugerată de Kohn (1957). Foliile de acetat de celuloză
se obțin prin tratamentul celulozei cu anhidridă acetică, iar produsul de reacție, triacetatul de celuloză, este
cel mai des utilizat în procedeele electroforetice.
Membrana din acetat de celuloză (cu o grosime de cca. 12 µm și cu un diametru al porilor de cca. 0,4
µm) este un material omogen care conține numai urme de impurități. Ea este de culoare alb-opacă, cu
suprafață netedă și uniformă. La microscop se observă o structură microporoasă care împiedică difuziunea
zonelor sau a spoturilor, din acest motiv se obține o bună separare a proteinelor plasmatice chiar la o
tensiune mică. Celuloza utilizată este de mare puritatea, lipsesc hemicelulozele și lignina, în timp ce
metalele grele sunt prezente numai în urme. Față de hârtia de filtru, adsorbția proteinelor și a altor
substanțe pe acest mediu suport este minimă, încât fenomenul de trenă sau de aspect de cometă este
practic eliminat. Timpul de separare este mai scurt decât în cazul utilizării suportului de hârtie,
membranele de acetat de celuloză fiind ideale pentru tehnicile de imunodifuzie și imunoelectroforeză.
Dintre dezavantajele utilizării membranelor de acetat de celuloză enumerăm: (1) prețul mai mare față
de hârtia de filtru, (2) necesitatea de a acorda mai multă atenție pentru obținerea unor rezultate
reproductibile. În prezent, s-au adus îmbunătățiri ale produsului inițial prin apariția și utilizarea curentă a
acetatului de celuloză gelatinizat (Cellogel).
Foliile (strip-urile) din acetat de celuloză sunt insolubile în apă, alcooli, eteri, acizi, baze diluate și în
majoritatea hidrocarburilor, dar sunt ușor solubile în fenol, acid acetic glacial, diclorometan și acetonă, iar
în mod particular, în amestec cloroform:etanol 90:10 (v/v) sau în amestec diclorometan:acetonă 50:50
(v/v) Strip-urile pot fi deveni translucide prin imersia lor în ulei din semințe de bumbac, în decalină, în
ulei de parafină ori în ulei Whitemore 120, ultimul fiind important în condițiile analizei prin scanare optică
a fracțiilor colorate prezente pe foliile de acetat de celuloză. În plus, ele pot fi impregnate și stocate
permanent în glicerol, compus care previne destrucția spoturilor colorate.
Pentru separări electroforetice de proteine și mai ales, acizi nucleici, Pristoupil (1966a; 1966b) a
introdus membranele de nitroceluloză. Aceste membrane, cu o mărime a porilor cuprinsă între 0,1-12 µm,
au fost utilizate în mod constant în analizele de acizi nucleici, în special a hibrizilor RNA-DNA și DNA-
DNA după cum aceștia prezintă o adsorbtivitate selectivă față de proteine și acizi nucleici, în condiții
adecvate.
Membranele de dimensiuni dorite sunt așezate într-o placă Petri cu tampon și lăsate să plutească până
la dispariția petelor alb-opace după care se scufundă complet. Membranele de Cellogel nu necesită aceste
precauții, ele putându-se scufunda timp de 10 minute. În schimb dacă se utilizează strip-uri din
nitroceluloză (5 x 1 cm), acestea trebuie mai întâi tratate timp de 5 minute cu o soluție de Tween 60, 2%
preparată într-un tampon compus din veronal, citrat și oxalat, pH=8,6 (Pristoupil și Fricova, 1967). Astfel
de membrane cu dimensiuni variate a mărimii porilor, impregnate cu detergenți ori soluții de albumină
serică, pot fi utilizate la separări de proteine, polinucleotide și nucleoproteine (Pristoupil, 1969; Pristoupil,
1970). În aceste condiții membranele nu prezintă fenomene de adsorbție și pot fi utilizate pentru separări
de proteine în gradienți înalți de potențial (15-20 V•cm-1 timp de 10-15 minute).
Strip-urile, imbibate în tampon prin metodele mai sus menționate, se plasează imediat în tancul
electroforetic prin intermediul unui sistem reglabil, iar probele se aplică cu ajutorul unei micropipete sau
unui dispozitiv de aplicare simultană a probelor (10-16 probe),
volumul aplicat fiind în funcție de grosimea membranei și de
concentrația ei.
În cazul membranelor din nitroceluloză, la un pH neutru ori
alcalin, RNA migrează rapid înspre anod, în timp ce DNA nativ
rămâne pe linia de start. DNA monocatenar denaturat migrează
spre anod (Pristoupil și colab., 1968).
Modelul de bază al tancurilor utilizate în separări
electroforetice pe membrane de celuloză seamănă cu cele utilizate
în electroforeza pe hârtie. De altfel, o serie dintre aceste dispozitive prezintă sisteme de răcire și pot fi
utilizate concomitent pentru electroforeză pe membrane ori pe strat subțire, ambele separări putându-se
realiza atât la voltaje scăzute cât și la cele înalte. Pentru a minimaliza procesul de evaporare, în soluția
tampon se poate adăuga glicerol. Controlul evaporării se poate realiza și prin folosirea unor soluții de
tampon cu tării ionice mici (o concentrație mică a soluției tampon favorizează creșterea vitezei de migrare
în paralel cu scăderea efectului Joule). Astfel, dacă tăria ionică este dată de relația:

iar mobilitatea este

Dacă ; rezultă că E
unde v reprezintă viteza electroforetică
iar E este intensitatea câmpului electric (măsurat în V/m).
Efectul termic Joule este dat de expresia:

iar
R•I = U
unde, H reprezintă căldura Joule, măsurată ca număr de calorii/secundă
R este rezistența mediului stabilizat și tamponat (R = Rmediu + Rtampon).
I reprezintă intensitatea curentului electric (amperi)
A este echivalentul mecanic de căldură (A = 4,8)
După electroforeză strip-ul de celuloză este uscat timp de aproximativ 10 minute la o temperatură de
100°C. Metodele de colorare și detecție utilizate sunt asemănătoare cu cele utilizate la hârtia de filtru.
Nigrozina (India ink) este cel mai bun colorant al proteinelor pe folii de acetat și nitroceluloză. Un alt
colorant des utilizat în colorarea proteinelor este Ponceau S. În general, sunt de preferat ca soluțiile
apoase de colorant față de cele alcoolice, concentrația acestora fiind de obicei mai scăzută față de cea
aplicată în cazul detecției pe hârtie de filtru.
Membranele din acetat și din nitroceluloză sunt ideale pentru examinările absorbțiometrice și fluoro-
densitometrice, precum și de detecție a substanțelor radioactive prin autoradiografie ori prin metode de
scanare directă.
3.3.1. MICROELECTROFOREZA PE ACETAT DE CELULOZĂ
Benzile de acetat sau nitroceluloză, de mici dimensiuni disponibile dau posibilitatea efectuării unor
analizei proteice complete dintr-o probă de 0,25 µl ser sanguin în 50 minute. Tehnica a fost denumită
electroforeză microzonală sau microelectroforeza pe acetat de celuloză (Pristoupil, 1970). Procedeul de
miniaturizare prin reducerea dimensiunilor membranei, a probelor și a timpului, se bazează pe faptul că
mobilitatea electroforetică este relație directă cu distanța de migrare și invers proporțională cu timpul și
intensitatea câmpului electric aplicat după relația:

unde, µ reprezintă mobilitatea electroforetică

d este distanța de migrare
t reprezintă timpul de migrare
E este intensitatea câmpului electric aplicat
astfel, dacă distanța este de 100 cm iar timpul este de 1000 minute, mobilitatea este:
µ=
Deci, în condițiile în care distanța de migrare este redusă, se reduce și timpul de migrare.
3.3.2. APLICAȚII ALE ELECTROFOREZEI PE MEMBRANE DE CELULOZĂ
În mod obișnuit, membranele de celuloză sunt utilizate pentru separarea proteinelor plasmatice, a
glico- și lipoproteinelor, a hemoglobinelor, a enzimelor ori a altor proteine. Ele pot fi utilizate atât în
tehnici analitice cât și în scopuri preparative. Metoda electroforetică pe membrane de acetat de celuloză
este încă cea mai des utilizată în diagnosticarea unor maladii. Tabelul 3.2. prezintă profilul electroforetic
obținut în urma separării pe suport Cellogel al unui ser sanguin normal.
Tabelul 3.2. Profilul electroforetic al unei probe serice proteice realizate pe folie de acetat de celuloză.
Fracția electroforetică analizată Procente % Deviație standard
Albumine 61% ± 1,5
Alfa 1-globuline 2,5% ± 1,5
Alfa 2-globuline 8% ± 2,0
Beta globuline 10% ± 2,0
Gama globuline 16% ± 3,5

Analiza acestei proteinograme este deosebit de importantă în identificarea unor maladii prin
determinarea procentelor fracțiilor serice din cantitatea totală a proteinelor. În figura 3.12 se prezintă
aspectul unei electroforegrame obținute după procesarea unei probe de ser sanguin normal.

Figura 3.12. Profilul electroforetic al unei probe serice. Fracțiile proteice s-au
evidențiat prin colorare cu Ponceau S.

Astfel prin interpretarea unei proteinograme realizate pe membrane de celuloză sau cellogel se pot
depista:
-hipergamaglobulinemiile (creșterea tuturor claselor de imunoglobuline);
-hipogamaglobulinemiile (diminuarea tuturor claselor de imunoglobuline);
-mielomul sau macroglobulinemia lui Waldenström (apariția unei benzi foarte omogene care semnifică
prezența unei proteine monoclonale);
-sindromul nefrotic (hiperexpresia globulinelor α2 și β, cu diminuarea albuminei și a γ globulinelor);
-ateroscleroza (creșterea β globulinelor);
-poliatrita reumatoidă (creșteri policlonale ale γ globulinelor și creșterea fracției α2 globulinei.
Tehnica electroforetică care implică astfel de membrane este de asemenea utilă în monitorizarea unui
tratament aplicat. Ea este superioară tehnicilor imunologice în determinarea izoenzimelor enolazei
(procedeul durează circa 10 minute iar necesarul de ser este de circa 10µl), activitatea enzimatică fiind
determinată în aproximativ 5 minute prin tehnică de bioluminiscență. Electroforeza pe membrane de
celuloză a fost și este utilizată la studiul comparativ al unor proteine serice la om și la alte animale. Ea a
fost utilizată la studiul histonelor (proteine bazice ale cromatinei la eucariote), la studiul hemoglobinelor
normale și patologice când s-au evidențiat la pH=8,4, hemoglobina A, Hb F, Hb S, Hb S și Hb C de Hb E
și Hb O.
Membranele de celuloză se utilizează și în tehnicile de imunoelectroforeză, colorarea efectuându-se în
acest caz cu ajutorul AgNO3, iar imunodetecția realizându-se direct, pe membrană, fără transfer pe o altă
membrană.
Blocurile de Cellogel (cu o grosime de circa 2,5-5 mm) se folosesc în scop preparativ; în acest caz ele
se utilizează la separarea componentelor proteice din 0,25-1 ml de ser sanguin. În plus, procedura de
utilizare a cellogel-ului în analiza proteinelor serice poate fi urmărită pe site-ul
http://wn.com/serum_protein_electrophoresis_procedure.
Bibliografie
Kohn, J. (1957) A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis. Clin. Chim. Acta. 2:297-303.
Pristoupil, T. I. (1966a) Microelectrophoresis of proteins on nitrocellulose membranes. Biochim. Biophys. Acta 117:475-476.
Pristoupil, T. I. (1966b) Rapid quantitative determination of very small amounts of proteins. Nature (London) 212:75-76.
Pristoupil, T. I. (1969) On the mechanism of adsorption of proteins to nitrocellulose in membrane chromatography. Chem. Listy
63:577-580.
Pristoupil, T. I. (1970) Microchromatography and microelectrophoresis on nitrocellulose membranes. Chromatogr. Rev. 12:109-
125.
Pristoupil, T. I., Fricova, V. (1967) Microelectrophoresis of serum proteins on nitrocellulose membranes. J. Chromatogr.
26:331-333.
Pristoupil, T. I., Fricova, V., Kramlova, M., Travnicek, M., Sterbikova, J. (1968) The behaviour of nucleic acids in membrane
chromatography and electrophoresis on nitrocellulose filters. J. Chromatogr. 36:91-98.
 3.4. ELECTROFOREZA PE GEL DIN AMIDON
Electroforeza pe gel din amidon este prima metodă de electroforeză zonală care a pus în valoare efectul
de sită moleculară a mediului suport a fost introdusă de Smithies (1955). Ea este în continuare recunoscută
drept o tehnică care furnizează mijloace elegante de rezolvare a particulelor similare încărcate electric și
cu mobilități libere identice. Astfel, o matrice de gel - nu și în cazul mediilor capilare de tipul hârtiei, a
silicagelului sau a acetatului de celuloză - prezintă o structură reticulată care poate impune o rezistență
fricțională apreciabilă la trecerea ionilor, accesul acestora în structura rețelată fiind dat de mărimea porilor
și dimensiunea ionilor care migrează în câmp electric. În cazul în care domeniul dimensiunii medii a
porilor gelului de amidon se apropie de domeniul dimensiunilor proteinelor, fracțiile proteice care
migrează vor fi întârziate diferențial, într-un grad proporțional cu dimensiunea lor. Prin urmare, datorită
reticulării fine și având un efect de sită moleculară, separarea amestecurilor este realizată în astfel de
matrice electroforetice atât în funcție de dimensiune și formă, cât și datorită diferențelor de sarcină
electrică.
Amidonul este un polizaharid natural insolubil în apă dar care în stare nativă, în prezența apei se umflă.
Matricea electroforetică se obține printr-o hidroliză parțială când amidonul se convertește într-o formă
coloidală la o temperatură de circa 70 oC și care apoi prin răcire la temperatura camerei se transformă într-
un gel ferm, a cărei mărimea a porilor este dată de concentrația acestuia și de gradul de hidroliză. În
general această mărime variază într-un domeniu redus prin faptul că nici concentrația, nici gradul de
hidroliză nu pot fi schimbate decât în anumite limite, bine definite, fără a afecta caracteristicile mecanice
ale gelului.
Față de alte medii stabilizante de separare (hârtia, gelatina, agarul ori silicagelul) a proteinelor,
peptidelor ori a acizilor ribonucleici, amidonul prezintă o serie de avantaje:
(1) Adsorbția celor mai multe proteine pe amidon este neglijabilă;
(2) Eluția fragmentelor de amidon după separarea electroforetică se realizează mai ușor decât în cazul
gelului de gelatină ori agar ceea ce reprezintă un factor important în experimentele preparative;
(3) Amidonul formează mai ușor o pastă omogenă cu diverse tampoane față de pudra de celuloză;
(4) Electroosmoza este mai mică decât în cazul multor altor medii suport deși acest fenomen poate
cauza o separare slabă, mai ales în cazul când tehnica este cea “de bloc de amidon” și se realizează în
modelul de aranjament orizontal.
Electroforeza pe gel de amidon este considerată după unii autori a fi o metodă blândă de separare și
purificare a proteinelor fără șanse de denaturare, putându-se pune alături de metoda salting-out ori de
precipitarea cu acizi, alcool ori acetonă. Pe de altă parte, alți autori consideră că din contră, în timpul
electroforezei au loc procese ireversibile de denaturare care conduc la o pierdere considerabilă de proteină.
Chestiunea în cauză se ridică dacă acest proces se manifestă din cauza dezvoltării de căldură cauzată
intensității curentului electric (17-20 mA) a curentului în soluții tampon cu tărie mare. De altfel, procesul
de denaturare nu se observă la tării ionice scăzute, rezultatele fiind satisfăcătoare.
Amidonul este utilizat ca mediu suport în trei tehnici electroforetice zonale:
I. Electroforeza clasică pe gel de amidon, descrisă pentru prima dată de Smithies (1955);
II. Electroforeza pe coloană, dezvoltată de către Carlson (1954) și independent de Flodin și Porath
(1954);
III. Electroforeza pe bloc de amidon, introdusă de Kunkel și Slater (1952).
Aparatura utilizată în electroforeza pe gel de amidon este de două tipuri: (a) pentru geluri orizontale
(figura 3.13); (b) aparate cu gel vertical (figura 3.14) Ambele aparate sunt alcătuite din 2 rezervoare cu
soluție tampon, compartimentate pentru a împiedica produșii de electroliză să intre în contact direct cu
gelul. Contactul dintre suportul electroforetic și gel se realizează prin intermediul unor bride din hârtie de
filtru sau tifon; în același mod se formează legăturile dintre compartimente.
Pregătirea amidonului. Amidonul din cartof este cel ușor de procurat și mai utilizat în electroforeză
deși s-a constatat că rezultate mai bune se obțin cu cel din orez. Astfel, amidonul este spălat de mai multe
ori cu apă distilată, prin amestecare viguroasă după care se lasă să sedimenteze. În continuare se
decantează supernatantul pentru a se îndepărta particulele insolubile și particulele foarte mici de amidon.
După spălări repetate amidonul este parțial uscat prin filtrare pe pâlnie Buchner după care este spălat cu
tampon fierbinte în care se va realiza separarea electroforetică.
 Figura 3.13. Cuvă pentru turnarea
gelului utilizată la electroforeza pe gel
de amidon în sistem orizontal.

După preparare, gelul de amidon este conectat la compartimentele externe ale electrozilor prin
intermediul unor bride de hârtie ori de agar împachetate în parafilm sau în folie de material plastic.
Conexiunea gel-tanc electroforetic trebuie să fie îmbibată în tampon de migrare.

Figura 3.14. Aparatură utilizată la electroforeza pe gel de amidon pe geluri verticale. I. Sistem clasic. II. Electroforeza pe bloc de
amidon. III. Imaginea unui sistem electroforetic pregătit pentru utilizare (După Bloemendal, 1959).

Aplicarea probei reprezintă un moment critic în electroforeza pe gel de amidon. În modelul orizontal
proba se poate aplica:
(a) Pe fragmente de hârtie de filtru de dimensiuni anumite. Dezavantajul acestei aplicări este dat de
adsorbția selectivă a unor componente din probă (de exemplu lipoproteinele β din serul uman) de către
hârtia de filtru;
(b) Direct în godeuri. În acest caz pot să apară fenomene de electrodecantare când proteinele cu cea
mai mare viteză de migrare se vor acumula la marginea godeului sub forma unei zone înguste, de densitate
mare și vor sedimenta în partea inferioară a acestuia, înainte de a intra în gel.
Modelul de aparat vertical elimină fenomenul de electrodecantare și asigură o răcire eficientă în timpul
separării electroforetice. La acest sistem, plăcile sunt de dimensiuni mari (15 x 18 cm sau 10 x 18 cm) iar
grosimea gelului este de 1-6 cm, în funcție de cantitatea de probă. Ultimile geluri cu o grosime de 6 cm se
folosesc la studiul polimorfismelor enzimatice, în genetică.
Godeurile (cu dimensiuni de 15-30 mm lungime, 1 mm lățime și 50 mm adâncime) se efectuează cu
ajutorul unui pieptene din plexiglace care se plasează peste stratul de amidon înainte de gelificarea
acestuia și care apoi se îndepărtează.
În general separări bune sau foarte bune se pot obține la temperatura camerei, la o tensiune de 6V/cm
timp de 6 ore sau la o temperatură de 5 oC și la o tensiune de 10V/cm, în sisteme de tampon continue sau
discontinue (vezi subcapitolul 3.6.6.).
După finalizarea separării gelul este extras cu grijă din cuva de electroforeză și este tăiat paralel cu
suprafața în două sau mai multe părți egale. În general sunt recomandate diverse proceduri de colorare a
gelurilor care se realizează prin turnarea colorantului peste suprafața secționată. O serie de lucrări prezintă
colorația cu soluție de Amido black 10B dizolvat în amestec metanol:apă:acid acetic glacial (50:50:10)
timp de l0-30 min. Excesul de colorant se îndepărtează prin spălări repetate cu solventul colorantului.
După ultima spălare gelul se introduce într-un amestec metanol:apă:acid acetic glacial timp de 1-2 ore.
Proteinele care nu dau complexe stabile cu Amido black pot fi colorate cu albastru de bromofenol, Light
green ori alți coloranți bine cunoscuți din tehnica de electroforeză pe hârtie.
O altă tehnică implică fixarea gelului în acid acetic 5% înainte de colorare. În acest caz amestecul de
colorare este format din Amido black l0B, acid acetic și ml acetat de sodiu. Fragmentele sunt apoi spălate
în soluție de acid acetic. Pentru o evidențiere mai pregnantă a proteinelor comparativ cu amido black,
Neelin și Connell (1959) utilizează colorația cu nigrozină (Buffalo black). Colorarea se realizează timp de
2 minute prin imersarea gelului într-o soluție saturată de reactiv preparată în metanol:apă:acid acetic
glacial (50:50:1). Solventul este utilizat ca lichid de decolorare. După îndepărtarea excesului de colorant
gelul este lăsat peste noapte în solvent.
Lipoproteinele pot fi colorate prin incubare timp de 16 ore într-o o soluție alcătuită din: Sudan black
10B (1,2g), apă distilată (40 ml), etanol (600 ml) și NaOH (2 ml). Decolorarea completă se realizează după
imersare într-o soluție de etanol 60%, după 6-8 zile. De asemenea, pentru a vizualiza lipoproteinele, se
poate utiliza o soluție saturată de Oil Red O pregătită într-un amestec metanol:apă:acid acetic glacial
(60:10:30).
Proteinele care conțin cupru precum hemocianina, sunt detectate prin plasarea secțiunii de gel, timp de
3-4 ore într-o soluție care conține 50 ml acetat de sodiu l0% și 3 ml de soluție ditio-oximidă (0,1%
preparată în alcool). Apariția unei colorații verde-închis este un rezultat pozitiv. Hemoglobinele sunt
detectate cu reactiv benzidină după metoda descrisă de Franklin și Quastel (1949) sau cea descrisă pentru
electroforeza pe gel de agar (Fine și colab., 1956) dar fără utilizarea acetatului de zinc. Pentru
identificarea unor proteine precum hemoglobina care prezintă o activitate peroxidază-like, o-dianisidina
pare a fi cel mai bun reactiv ea formând o colorație brună. Hem-proteinele pot fi de asemenea colorate cu
o-tolidină (O'Kelly și Kohn, 1955).
În cazul electroforezei pe blocuri de gel de amidon, se îndepărtează stratul de parafilm care acoperă
gelul și se presează o bucată de hârtie de filtru pe suprafața gelului de amidon. Aceasta este apoi uscată
timp de 5 minute la 80-l00oC. În caz că particulele de amidon aderă la folia de hârtie de filtru, acestea sunt
îndepărtate printr-o periere ușoară. Fragmentul de gel este apoi colorat cu amido black ori alt colorant
specific pentru proteine (de exemplu, nigrozina). În această manieră se pot identifica componentele
proteice, proces important în special în experimentele preparative când secționarea blocului nu este
necesară. Tabelul 3.3. arată o serie de aplicații ale electroforezei pe gel de amidon.
Pentru evidențierea specifică a enzimelor se utilizează tehnici speciale de colorare. Astfel,
dehidrogenazele se evidențiază cu ajutorul sărurilor de tetrazoliu, hidrolazele prin intermediul substratelor
cromogene colorate sau fluorescente, transferazele și izomerazele se evidențiază indirect prin intermediul
unor dehidrogenaze.
Tabelul 3.3. O serie de aplicații ale electroforezei pe gel de amidon.
Tamponul Tăria ionică
Sursa biologică pH V mA Timp (ore)
utilizat (Molaritatea)
Barbital 0,1 25-60
Lipoproteine serice normale/patologice 8,6 100-500
Fosfat 0,5 24
Proteine lenticulare bovine Barbital 0,1 8,6 400 - 24
Tuberculo-proteine Barbital 0,1 8,6 360 17-20 30
Fosfataza alcalină intestinală Barbital 0,02 8,6 200 7-9 12
Acetat
0,017 4,00 175 30 24
Hormonul de creștere (somatotropină)
0,1 11,2 175 30 72
Carbonat
β-Galactozidză Pirofosfat 0,025 8,5 370 1 16
Chimotripsinogen Cacodilat 0,1 6,6 3,2V/cm - 65
Tirozinază de mamifere Barbital 0,1 8,5 300 11 19
Tripsină Acetat 0.1 4,00 /300 - 10
0,02M borat +
Hemocianină Borat 8,0/3 92V/cm - 12
NaOH 0,008M
Hemoglobină Borat 0,05 M 8,5 6V/cm - 5
Plasmă umană Borat 0,025 - 450 - 18

Electroforeza pe gel de amidon este atât o metodă analitică cât și preparativă. Ea prezintă o rezoluție
superioară față de alte tehnici electroforetice, dar nu se aplică în mod curent în laboratorul clinic. Totuți,
ca tehnică de separare și evidențiere a proteinelor, se utilizează la studiul izoformelor lactat
dehidrogenazei sau a fosfatazei.
Prin electroforeză pe gel de amidon într-un gel acid care conține uree 4 M și lactat de aluminiu au fost
separate histonele. Tehnica a fost utilizată pentru prima dată la separarea proteinelor ribozomale la
Escherichia coli (efectuată în tampon acetat pH=5,1 în prezență de uree 6-8 M) cu rezoluție foarte bună,
evidențiindu-se astfel 24 de fracțiuni. De altfel, tehnica s-a dovedit de succes și în cazul separării acestor
proteine la eucariote.
 Electroforeza pe gel de amidon este încă utilizată la studii de genetică a populațiilor, când se separă și
se identifică variante alelice ale enzimelor, cu ajutorul său ilustrându-se polimorfismul enzimatic al
organismelor.
Bibliografie
Bloemendal, H. (1959) Starch electrophoresis. III. Starch gel electrophoresis. J. Chromatog. 2:121-135.
Carlson, L. A. (1954) Electrophoretic studies of serum lipoproteins I. Description of apparatus and technique for their separation
in starch medium. Acta Chem. Scand. 8:510-520.
Fine, J. M., Uriel, J., Faure, J. (1956) Etude électrophorétique en gélose de diverses hémoglobines animals. Bull. Soc. Chim.
Biol. 38:649–660.
Flodin, P., Porath, J. (1954) Zone electrophoresis in starch columns. Biochim. Biophys. Acta 13:175-182.
Franklin, A. E., Quastel, J. H. (1949) Paper Chromatography of Proteins and Enzymes. Science 110:447-451.
Granick, S., Mauzerall, D. (1958) Porphyrin biosynthesis in erythrocytes. II. Enzymes converting gamma-aminolevulinic acid to
coproporphyrinogen. J. Biol. Chem. 232:1119-1140.
http--www_advantecmfs_com-labo-img-ep_verticalslab_diagram_jpg.mht
Kunkel, H. G., Slater, R. J. (1952a) Lipoprotein patterns of serum obtained by zone electrophoresis. J. Clin. Invest. 31:677-684.
Kunkel, H. G., Slater, R. J. (1952b) Zone electrophoresis in a starch supporting medium. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 80:42-44.
Neelin, J. M., Connell, G. E. (1959) Zone electrophoresis of chicken-erythrocyte histone in starch gel. Biochim. Biophys. Acta
31:539-541.
O'Kelly, T., Kohn, J. (1955) An ortho-tolidine method for the detection of occult blood in faeces. J. Clin. Pathol. 8:249-251.
Owen, J. A., Silberman, H. J., Got, C. (1958) Detection of haemoglobin, haemoglobin-haptoglobin complexes and other
substances with peroxidase activity after zone electrophoresis. Nature 182:1373.
Smithies, O. (1955) Grouped variations in the occurrence of new protein components in normal human serum. Nature 175:307-
308.
Smithies, O. (1955) Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults.
Biochem. J. 61:629-641.
 3.5. ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZĂ
Încă din secolul al XVII-lea în Japonia, agarul și o mulți alți hidrocoloizi derivați dintr-o serie de alge
roșii de mare din clasa Rhodophyceae (speciile Gelidium și Gracilaria) au fost utilizați la prepararea
hranei. Ca mediu-suport utilizat în imunoelectroforeză agarul a fost introdus de către Grabar și Williams
în anul 1953; tehnica originală descrisă de acești cercetători este ocazional utilizată și astăzi. Pe de altă
parte, electroforeza pe agar modificat, este de altfel o metodă curentă de identificare a variantelor de
hemoglobină. În cromatografie, inițial agarul a fost aplicat de către Polson în anul 1961 la separări bazate
pe proprietatea sa de sitare moleculară, în condițiile în care, în paralel acesta a fost înlocuit cu agaroza
(Hjerten, 1961).
După raportarea separării și purificării sale, agaroza, singurul hidrocoloid neadeziv și-a găsit o
multitudine de utilizări în științele separatologice (Araki, 1937). Biopolimerul a fost separată ca un
component aparent fără grupări sulfat, de agaropectină, parte de altfel bogată în asemenea grupări și care,
la rândul ei, a fost izolată din agar. Cele două componente se separă prin acetilare și dizolvare în
cloroform când agaroza acetilată este solubilă. Conținutul în grupări sulfat al diferitelor agaroze este în
general sub 0,12% comparativ cu conținutul acestora (4%) în agaropectină (Armisén, 1991). Din această
cauză agaroza poate fi utilizată în prepararea gelurilor, fără a fi nevoie de aditivi sau de agenți de
reticulare, iar inerția sa chimică la interacțiuni cu proteinele și acizii nucleici reprezintă principala rațiune
în larga sa utilizare, ca mediu de separare. În plus față de simplicitatea pregătirii gelului de agaroză oferă
acesteia o multitudine de avantaje ca mediu de separare precum recuperarea simplă a probei și lipsa
toxicității. Tot ce este necesar în prepararea gelurilor este de a dizolva agaroza pulbere prin încălzire
controlată, după care să se lase la răcit. Procesul de gelificare se manifestă spontan și este complet în cazul
gelurilor reci, total solidificate.
În comparație cu gelul de poliacrilamidă, gelul de agaroză este un sol foarte poros, ceea ce îi limitează
oportunitatea folosirii sale în formă nemodificată, la separări pe baza efectulului de sită moleculară a
proteinelor cu masă moleculară mai mică de 60 kDa. Pe de altă parte, marea sa permeabilitate face din ea
un mediu superior poliacrilamidei în experimente imunochimice, când agaroza este de multe ori unică.
Proprietățile gelurilor de agaroză. Din punct de vedere chimic,
agaroza este un polizaharid liniar compus din unități alternative de
D- și L-galactozobioză (agarobioză) legate prin legături β 1-4
(figura alăturată) cu catene de o lungime dată de cele 400 de
unități de agarobioză, legate prin legături α 1-3 și cu o masă
moleculară de circa 120 kDa (figura 3.15). În plus, ea conține, în
cantități diferite, resturi substituite carboxilat, piruvat și/sau sulfat
(Hickson și Polson, 1968; Duckworth și Yaphe, 1971a; Duckworth
și Yaphe, 1971b; McDonell și colab., 1977; Roberts, 1976).

Figura 3.15. Structura agarozei. Gradul de

reticulare este reprezentat cu n. (După Armisen,
1991).

Gelificarea (ansamblul de fenomene implicate în trecerea agarozei din formă de sol, în formă de gel) se
manifestă ca un proces de inter-legare a protofibrilelor. Rees și Arnott (1974) au analizat evoluția
procesului de gelificare, transformare realizată prin împerecherea catenelor cu o masă de 120 kDa în
structuri dublu helicoidale, cu o grosime de 0,8-1,4 nm, urmată de legarea laterală a dimerilor helicați în
structuri denumite protofibrile, cu o grosime medie de ordinul a 24 nm și cu un număr de 5-5000 dimeri
helicați. În contrast, grosimea fibrelor din gelurile convenționale de poliacrilamidă este de numai 0,4 nm.
Astfel, în timpul acestui proces, lanțurile dublu catenate elicoidale se desfac iar legăturile 3,6 din
structura 3,6 anhidrogalactozei se desfac de asemenea, ceea ce conduce la fragmentarea lanțului inițial în
lanțuri dublu elicoidale mai scurte a căror capete se vor uni încrucișat, proces de numit schimbarea
partenerului. În continuare are loc asocierea în suprafibrile cu raza de 10-20 nm (figura 3.16),
supraînfășurate care explică rezistența mai mare și porii mai mari a gelului de agaroză comparativ cu alte
geluri care nu formează suprafibrile (ca de exemplu gelul de amidon, gelul de poliacrilamidă cu un grad de
reticulare, C% cuprins între 1 și 5).

Figura 3.16. Reprezentarea schematică a formării

și a structurii finale a unui gel de agaroză.

Abilitatea de a forma fibrile groase, puternice permit agarozei să formeze geluri chiar la concentrații
sub 0,2%. Încorporarea agarozei în suprafibre groase fac aceste geluri înalt poroase până la o concentrație
mai mare de 6%, limita la care agaroza poate fi dizolvată fără a apela la temperaturi de autoclavare.
Concentrații până la 16% se pot realiza numai prin autoclavare. La gelurile cu o concentrație egală cu 2%
efectul de sită moleculară nu este prezent, electroforeza fiind de tip capilar, în timp ce la gelurile cu o
concentrație cuprinsă între 3 și 10%, distanțele între și din interiorul suprafibrilelor devin egale și ia astfel
naștere un gel cu o singură dimensiune a fibrelor.
Lichefierea (trecerea din stare solidă/gel în stare lichidă) agarozei depinde în totalitate de legăturile de
hidrogen și este inhibată de o serie de agenți chaotropi precum glicerina concentrată (aprox. 20%),
guanidina•HCl sau KSCN, a căror concentrații mari se utilizează în mod obișnuit în procedurile
biochimice. Astfel, de compuși pot bloca procesul de gelatinizare, cu toate că nu au efect apreciabil asupra
solidificării gelurilor. Ca urmare, agenții chaotropi concentrați utilizați în solubilizarea proteinelor ori ca
agenți de denaturare trebuie îndepărtați, înainte de electroforeză ori înlocuiți cu alți compuși precum urea
ori SDS. În plus, cum agregarea agarozei este total reversibilă, gelurile se pot topi la intensități de curent
înalte. De asemenea, gelurile de agaroză sunt compresibile, și au tendința de a curge în afară din celulele
electroforetice verticale.
Gelurile de agaroză sunt translucide deoarece fibrele
înfășurate împrăștie lumina dar devin transparente prin uscare.
Porozitatea mare a agarozei o face superioară
poliacrilamidei pentru separarea proteinelor mari,
polipeptidelor, complexelor cu un domeniu de masă (Mr)
cuprins între 100 kDa și mai mulți megadaltoni. Prin urmare,
prin utilizarea agarozei se pot separa fragmente de ADN cu
dimensiuni cuprinse în domeniul 1000 la 23000 perechi de
baze (bp).
În cazul agarozei hidroxietilate numărul de lanțuri din
constituția suprafibrilelor este mai mic decât în cazul agarozei
nesubstituite și din această cauză porii gelului sunt mai mici fiind similari cu cei ai gelului de
poliacrilamidă, ceea ce îi conferă acesteia o mare capacitate de sitare moleculară, similară gelului de
poliacrilamidă, însă cu o rezistență mecanică mai mică decât cea a agarozei nemodificate. De altfel, au fost
obținuți noi derivați de agaroză care au proprietăți mecanice îmbunătățite.
În funcție de gradul de substituție cu grupări care posedă sarcini negative și de modificările chimice
survenite, se disting trei categorii de agaroză, toate caracterizate prin: a) conținutul în resturi sulfat
(exprimat în %); b) electroosmoză; c) temperatura de gelificare; d) temperatura de topire.
Electroendoosmoza (EEO) preparatelor de agaroză este dată de parțial de conținutul în resturi sulfat și
piruvat (vezi și subcapitolele 1.4.3. Electro(endo)osmoza; 3.12.2. Electroendosmoza în electroforeza
capitală). De altfel, grupările sulfat prezente în cele mai multe preparate induc o mică EEO în timpul
electroforezei comparativ cu cele piruvat. Ea se manifestă ca o curgere de tampon prin gel, efect datorat
faptului că sarcinile negative din matricea de gel nu se pot mișca spre anod, motiv pentru se produce o
pompare compensatoare de tampon, spre catod. EEO poate induce așadar, colapsarea gelurilor în sisteme
tampon discontinue datorită electroendoosmozei inegale ce se dezvoltă prin frontul de tampon. Astfel, o
serie de sisteme tampon descrise pentru gelurile de poliacrilamidă nu funcționează la fel de bine pentru
gelurile de agaroză. Efectul asupra mobilității proteinelor este în general mic, totuși devine pronunțat în
sisteme de tampon discontinue utilizate pentru îngustarea benzilor din proba aplicată.
 EEO poate fi măsurată convențional fie cu ajutorul ciancobalaminei (vitaminei B 12), colorată în roșu
(Ghosh și colab., 1972), fie cu ajutorul Dextran-500, care poate fi detectat în urma precipitării cu etanol,
or urmărind migrarea albuminei serice bovine (BSA). De obicei se utilizează deplasarea electroforetică a
BSA la un pH=8,6 iar în urma acestei analize se determină factorul –mr, în funcție de care se clasifică
agarozele în: agaroze cu electroosmoză mare, medie (standard) și mică. În consecință, agarozele cu EEO
diferită se utilizează în tehnici specifice după cum urmează:
a) Agarozele cu EEO mare (-mr=0,25) se utilizează în tehnicile de contraimunoelectroforeză;
b) Agarozele cu EEO standard și mică (-mr =0,13-0,07) se utilizează pentru electroforeză și
imunoelectroforeză. Ele sunt folosite la separarea acizilor nucleici (agarozele standard), nededetectând
DN-azele, RNA-azele, proteazele, inhibitorii endonucleazelor, enzimele de restricție și modificare,
ligazele, polimerazele.
c) Agarozele cu EEO egală cu zero sunt utilizate în tehnicile de focusare izoelectrică (vezi
subcapitolul 3.7). Ele se obțin prin adăugarea unor aditivi sau în urma unei reacții de substituție, în scopul
blocării (contrabalansării) sarcinilor electrice negative cu grupări electropozitive. Totuși, prezența
aditivilor dintr-o serie de zero-EEO agaroze contribuie la formarea unui background în timpul colorării.
d) Agarozele hidroxietilate (cu un număr de grupări hidroxietil de circa 15%) formează geluri cu
concentrație de 2-10% cu dimensiunile porilor aproximativ egale cu cea a proteinelor. Ele au o
temperatură de gelificare în jurul a 25oC iar temperatura de solidificare de aproximativ 45 oC (25/45).
Astfel, o agaroză hidroxietilată 15/45 formează geluri de concentrație 2-10%, asemănătoare gelurilor de
poliacrilamidă. Agarozele cu un procent de 5% hidroxietil formează geluri cu o temperatură de topire de
60-65oC.
Au fost descriși numeroși derivați de agaroză, utilizați în cromatografia de afinitate la care adăugarea
unor grupări încărcate electric nu este critică. Toți acești compuși, preparați însă în scop electroforetic,
implică modificarea sarcinilor electrice ale agarozei. După cum s-a mai amintit, agaroza hidroxietilată
precum și cea hidroximetilată sunt derivați cu punct de topire scăzut care formează geluri cu fibre subțiri și
care astfel măresc procesul de sitare moleculară. Aceste agaroze, cu punct de topire scăzut, sunt utilizate în
acord cu proprietatea lor de sitare moleculară, în electroforeza capilară (vezi subcapitolul 3.12).
e) Alilglicidil-agarozele, sunt derivați ai agarozei cu punct de topire foarte scăzut și care sunt
uneori utilizați în locul bisacrilamidei, în reacția de reticulare cu acrilamida, în cazul gelurilor foarte
dense. Acești derivați disponibili comercial produc geluri cu puncte de topire scăzute. Studiile de alchilare
a agarozei atât cu glicidolul ct și cu alil-glicidil eterul pentru prepararea glioxil-agarozei și a analogilor săi,
arată că grupările hidroxil implicate în funcționarea legăturilor de hidrogen în timpul gelificării sunt
protejate în timpul derivatizării agarozei în stare de gel, gelul de agaroză derivatizată reținând mai mult din
caracteristicile sale originale de topire și de gelificare. Trebuie avut în vedere că glioxil-agaroza (gliceril
agaroză oxidată) posedă grupări acetaldehidice substituite care pot reacționa ca baze Schiff cu grupările
amino ale proteinelor. Ca urmare, la un pH mai mic de 8,5, aceste legături prin baze Schiff sunt atât de
disociate încât rețin proteinele în procesul de migrare în câmp electric. În consecință, odată separate pe
gelul de glioxil-agaroză, proteinele pot fi antrenate fie spre legare la gel, fie la disocierea lor, reversibil
prin imersia într-un tampon cu pH=10,0 pentru a supresa legăturilor de tip bază Schiff, fie prin imersia lui
într-un tampon care conține cianoborohidrură de sodiu care conduce rapid și specific la alchilarea
grupărilor amino ale proteinelor cu grupări aldehidice în matricea gelului. Această funcționalizare permite
gelului să fie utilizat secvențial și repetitiv ca mediu de separare și imobilizare, astfel el poate să fixeze
mici peptide care conțin cel puțin o singură grupare amino, dar nu poate lega nucleotide (Shainoff, 2007).
3.1.1. ECHIPAMENTE ȘI SISTEME TAMPON
Gelurile de agaroză sunt în cel mai adesea utilizate în tehnicile electroforetice orizontale, când ele sunt
plasate, conectate prin punți umede cu incintele umplute cu tampon, între electrodul anodic și catodic. Se
are în vedere că utilizarea punților din hârtie sau bumbac conduce la o pierdere de voltaj ceea ce conduce
la o creșterea a efectului de încălzire și apariția fenomenului de condensare în camera de separare
electroforetică. Pierderea de voltaj de-a lungul gelului trebuie să fie controlată direct, de la nivelul gelului
și nu din sursa de curent. În plus hârtia de filtru nu este totdeauna recomandată deoarece prin utilizarea sa
drept bridă de contact, datorită procesului de electroosmoză, puntea dinspre anod se poate usca împreună
cu extremitatea respectivă a gelului în timp ce la extremitatea catodică se adună lichid în exces, după cum
hârtia de filtru nu poate prelua și transfera cantități mari de lichid. Cu excepția unor cerințe uzuale,
platformei pe care se așează gelul se poate adapta ușor un sistem de răcire, realizat prin recircularea apei.
Gelurile sunt turnate ori în casete deschise ori în sisteme prevăzute cu două spațiatoare. Condensarea
vaporilor pe gel este ușor de prevenit printr-o simplă barieră de vapori care se așează pe gel. Pentru
electroforeza acizilor nucleici utilizarea punților (bridelor) de legătură a fost eliminată prin aplicarea
tehnicii cunoscute drept „submersă” în care gelul este așezat pe o platformă, sub nivelul de tampon,
conectat la camerele electrozilor. Modelul de electroforeză submarin nu este însă curent aplicabil în cazul
electroforezei proteinelor deoarece acestea au tendința de a difuza în tamponul înconjurător, în comparație
cu acizii nucleici care posedă constante de difuziune foarte mici iar odată aplicat un câmp electric
migrează aproape în întregime prin gel.
Gelurile în format vertical sunt rareori utilizate, deoarece agaroza are tendința de a se dilata și astfel de
a părăsi caseta în care a fost turnată. Totuși, acest proces poate fi prevenit prin imersarea prealabilă a
casetei într-un gel diluat de agaroză 0,5%, lăsând apoi să se usuce la 60 oC timp de 1-2 ore înainte de a fi
turnat. În schimb, dacă se dorește ca aderența gelului să fie scăzută, suportul pe care se toarnă gelul este
pretratat cu o soluție de diclordimetilsilan, 5% preparată în cloroform.
Inițial, aplicarea probei în gelul de agaroză s-a realizat prin formarea unei fante în gel. Această tehnică
este în continuare utilizată la electroforeza acizilor
nucleici, macromolecule care formează benzi înguste, în
condițiile în care migrează nerestinctiv din soluția de
probă în gelul de migrare care se comportă restrictiv. În
cazul separării proteinelor, godeurile induc distorsiuni ale
benzilor proteice datorită: (i) procesului de permeație
parțială în marginile godeului înainte de începerea „de
facto” a separării electroforetice; și (ii) datorită tensiunii
electrice inegale care se manifestă le-a lungul godeului în
momentul aplicării unui câmp electric. Astfel, în cazul
analizei proteinelor, metoda optimă de transfer a probei
este de transfer prin absorbție, datorită ușurinței cu care
soluțiile pot fi îmbibate în agaroză, urmată de compresia temporară a hârtiei de transfer, unde amestecul de
proteine se află absorbite. O altă tehnică de transfer este cea prin care probele se depun pe gel cu ajutorul
unor benzi de demarcație, tehnică așa-numită de aplicare a probei prin intermediul „foliei de aplicare”, un
șablon din material plastic întins peste gel care are prevăzute niște fante prin care probele sunt depuse pe
gel. Acest sistem de aplicare a probei a fost sugerat de Cawley (1969) și a simplificat procedura de analiză
a proteinelor pe gel de agaoză (Johansson, 1972). astfel, folia de aplicare se spală cu soluție salină
izotonică putând fi utilizată de circa 100-200 de ori.
În separări analitice de proteine, răcirea efectivă printr-un bun contact între gel și suprafața de răcire
este foarte importantă. Temperatura de răcire trebuie să fie ajustată astfel încât să se excludă supra-
generarea de căldură, detectată prin apariția apei de condensare pe partea interioară a capacului transparent
care acoperă camera electroforetică. O suprarăcire, totuși, conduce la formarea de picături de fluid pe
suprafața gelului, ceea ce conduce la obținera unei electroforegrame cu un profil pătat al benzilor proteice.
De altfel cele mai multe echipamente disponibile comercial posedă o un sistem optim de transfer a
căldurii, ceea ce conduce la obținerea unor rezultate bune la voltaje mari, recomandate de producător.
Tamponul poate fi reutilizat de mai multe ori având grijă ca polaritatea curentului trebuie schimbată la
fiecare folosință pentru a preîntâmpina schimbările de pH din vasul de tampon.
Din punct de vedere electric, în cele mai multe aparate se utilizează un gradient de potențial de 15-
20V/cm. Acesta corespunde unei puteri totale a câmpului electric de 250-300V și o intensitate de curent de
100-140mA, care depinde de mărimea electrozilor. În cazul gelurilor subțiri de 3 mm grosime, tensiunea
aplicată este de 6V/cm, iar rezoluția poate fi ușor îmbunătățită dacă grosimea gelului este scăzută la 0,5
mm, iar gradientul de potențial este crescut la 30-35V/cm.
Albumina se concentrează într-o bandă relativ îngustă și într-o concentrație proteică locală mare ceea
ce o fac importantă în condițiile utilizării acidului picric drept agent de precipitare preîntâmpinând
formarea unui fond neclar.
Fixarea fracțiilor proteice se realizează: a) fie prin imersarea gelului în soluție de acid acetic 20% timp
de o oră, după care gelul se usucă timp de 16 ore la 37 oC; b) fie prin imersarea sa într-un amestec de acid
picric (soluție saturată):acid acetic (20%) într-un raport 3/1 timp de 15 minute, după care gelul se usucă.
Cu excepția colorației cu argint, toate metodele comune utilizate, bazate pe reacția cu Coomassie
Brillant Blue (figura 3.17), fluorescență, chimiluminescență, și de tip coloidal funcționează bine cu
agaroza, ultima fiind cea mai rapidă. Totuși, colorația cu Amido Black 10B (soluție 1% preparată într-o
soluție de acid acetic 7% sau preparată într-un amestec metanol:acid acetic:apă, în raport de 5:1:5) este
utilizată deoarece produce zone distincte și facilitează vizualizarea α- și β-lipoproteinelor. Pe de altă parte,
colorația cu Coomassie Brilliant Blue coloidal (soluție 0,07% preparată într-un amestec metanol:acid
acetic:apă, 4,5:1:4.5) este de două-trei ori mai sensibil și este de mare valoare când se analizează o soluție
proteică mai diluată, însă trebuie avut în considerație că prin tratament cu acid gelul de agaroză este expus
la procese de hidroliză. În plus față de gelurile de poliacrilamidă, cele de agaroză pot fi și imunocolorate.

Figura 3.17. Structura chimică a colorantului trifenilmetanic Coomassie

Brillant Blue G-250 (sinonime: Serva blue G, C.I. acid blue 90).

O adaptare a electroforezei pe agaroză o reprezintă procedeul denumit “de înaltă rezoluție”, utilizat în
laboratorul de analize medicale. Prin această metodă se evidențiază schimbări calitative și cantitative ale
proteinelor serice, semnificative din punct de vedere clinic, care nu pot fi decelate printr-o electroforeză
convențională, pe membrană de acetat de celuloză. Practic se lucrează cu un gel de agaroză de 1 mm
grosime, turnat pe folii de film flexibil de poliester, denumite Gelbond™ care sunt păstrate în soluție
tampon și în ambalaje ermetice. Această prezentare facilitează mânuirea și stocarea gelului prelucrat.
Volumul de probă este de 2-4 µL, putându-se aplica simultan 6 ori 12 probe iar timpul de separare este de
aproximativ 45 de minute la o tensiune de 20V/cm.
3.1.2. APLICAȚIILE ELECTROFORETICE ALE AGAROZEI
Inițial, electroforeza pe gel de agaroză s-au utilizat la separări, în contextul diagnosticului proteinelor
plasmatice, în particular a lipoproteinelor, cu o mare îmbunătățire față de rezultatele obținute pe alte
suporturi de tipul hârtiei ori a amidonului, tehnici anterior utilizate. Separările analitice directe au fost
urmate de identificarea metodei imunoelectroforetice a proteinelor. Aceste separări au fost în mod curent
aplicate proteinelor native, cu toate că electroforeza proteinelor pe gel de agaroză în prezență de
dodecilsulfat de sodiu este de asemenea utilizată (vezi subcapitolul 3.5.6.5.).
Separarea proteinelor în funcție de punctele lor izoelectrice, independent de mărimea moleculară prin
stabilirea unui gradient de pH de-a lungul gelului, demonstrată de către Vesterberg (1968), a devenit
operațională odată cu dezvoltarea agarozei zero-EEO, capabile să suporte această metodă de separare prin
utilizarea agarozei ca suport electroforetic.
Electroforeza pe gel de agaroză este, de asemenea, utilizată pentru a se evalua legarea afină a unor
glicosaminoglicani sulfatați la proteine (Takahashi și colab., 1981). Evident, acest proces depinde de
posibilitatea de a evidenţia polizaharidele pe plăci de agaroză. Din nefericire, tehnica este limitată la
identificarea polianionilor sulfatați care pot fi colorați cu albastru de toluidină (Dietrich și Dietrich, 1976;
Nader și colab., 1981; Volpi, 1994). Volpi și Maccari (2002) au dezvoltat o metodă postelectroforetică
sensibilă pentru vizualizarea glicozaminoglicanilor nemarcați radioactiv, rezolvați pe un gel de agaroză,
prin colorare cu albastru de toluidină, urmată de procedura “Stains-All”. Prin această metodă, se pot
detecta mai puţin de 10 ng dintr-o singură specie, tehnica putând fi folosită pentru colorarea a câtorva
micrograme dintr-un amestec complex de polizaharide. Combinația electroforeză pe gel de
agaroză/colorare secvenţială cu albastru de toluidină/”Stains-All” poate fi aplicată la analiza tuturor
complexelor glicozaminoglicanilor (heparina, sulfat de heparan, condroitin/dermatan sulfat) şi a
polianionilor nesulfatați (hialuronat, polizaharidul capsular defructozilat-K4), precum şi compararea
specificităților enzimelor glicozaminoglican-degradante şi de identificare ori de cuantificare, cu o mare
sensibilitate (de aproximativ 0,1%) a contaminării cu polizaharide a unor preparate de glicozaminoglicani.
Procedura de colorare poate fi utilizată la evaluarea posibilelelor afinităţi dintre proteine și polizaharide.
 3.1.2.1. Interpretarea unei electroforegrame
Abilitatea gelului de agaroză de a revela proteine diferite variază în funcție de (1) concentrația de
proteină, (2) capacitatea de legare a colorantului și de (3) gradul de omogenitate electroforetică. În
general, capacitatea de legare a colorantului scade odată cu creșterea conținutului în oligozaharide și
lipide. Figura 3.18 oferă o imagine schematică a concentrației relative și a heterogenității electroforetice a
proteinelor plasmatice, în cazul unui subiect sănătos, având cel mai frecvent fenotip.

Figura 3.18. Distribuția electroforetică și concentrațiile relative ale proteinelor

majore plasmatice comparativ cu fracțiile obținute prin electroforeză clasică.
Abreviații: Alb, Albumină; Lp, Lipoproteine; Om, Orosomucoid; α1-At, α1-
antitripsină; α2-M, α2-macroglobulină; GC, componente specifice de grup; Hp,
haptoglobine; CIG, globulină insolubilă la rece; Hz, hemopexină, Tf, transferină; C3,
complement C3; Fg, fibrinogen; Ig, imunoglobulină; și CRP, proteină C-reactivă.

După cum se observă, pentru a se pune în evidență gradul de heterogenitate electroforetică și pentru a
se arăta discrepanța dintre fracțiile electroforetice și domeniul de concentrație a proteinelor individuale au
fost reprezentate profilurile concentrațiilor individuale/mobilității electroforetice. De asemenea, în tabelul
3.4 sunt prezentate proteinele individuale care pot fi identificate în diverse concentrații și care pot
influența profilul electroforetic. Proteinele și valorile acestora din paranteze indică nivelul concentrațiilor
care nu pot influența semnificativ profilul electroforetic.
Tabelul 3.4. Domeniul normal de variație, al proteinelor unui subiect adult normal (După Jeppson și colab., 1979).
Proteina țintă Domeniul normal Proteina țintă Domeniul
(g/L) normal (g/L)
Prealbumină 0,15-0,36 Globuline insolubile la rece 0,1-0,3
Albumină 39-51 Transferină 1,7-2,7
α-Lipoproteine (3-7) β-Lipoproteine 2,2-7,4
(α-Fetoproteină)a <1-1 -5 Component 3 al sistemului 0,6-2,2
complement
(Orosomucoid) 0,40-1,05 IgA 1,0-3,0
α1-Antitripsină 0,8-1,9 Fibrinogen 2,2-4,4
Globuline specifice de 0,2-0,55 (IgM) 0,6-2,2
grup
(Inhibitori inter-α1- 0,2-0,7 IgG 6,5-15,5
tripsină)
(Ceruloplasmină) 0,22-0,46 (Catene ușoare de imunoglobulină) <0,001
α2-Macroglobuline 1,2-2,4 (Proteină C-reactivă) <0,02
Haptoglobine (1-1, 2-2, 0,40-2,9
2-1)
a
Componentele din paranteze pot influența vizibil profilul electroforetic când concentrația lor crește în stări patologice.
În continuare vom analiza semnificația fiecărei benzi proteice din punct de vedere al compziției,
migrării specfice și a patologiei aferente fracțiilor proteice identificate pe un gel de agaroză (tabelul 3.5.)
 Zona de prealbumine. Proteinele prezente în această zonă sunt puțin discernute, difuz
demarcate, cu o mobilitate care variază puțin. De altfel este dificil a se detecta oricare dintre proteine
aflate în zona de prealbumine, dacă profilul electroforetic nu este inspectat față de un background alb sau
sub o lumină reflectată.
În mod normal prealbumina, o proteină care leagă tiroxina, este singura componentă care se discerne în
această zonă, unde prezintă variații de migrare și o bandă întinsă, care depinde de gradul de formare a
complexului și probabil, este într-o relație directă cu polimorfismul genetic.
Din punct de vedere al diagnosticului clinic, numai concentrația relativă totală a prealbuminei este de
interes clinic. Astfel, în maladii legate de metabolismul intermediar al trigliceridelor sau în lipoliza
secundară, α-lipoproteinele pot migra în zona prealbuminei. De asemenea, în această zonă pot să apară
conjugate ale albuminei și substanțele acide circulante (de exemplu, o serie de metaboliți ai
medicamentelor).
Tabelul 3.5. Analiza profilului electroforetic în patologie (După Jeppsson și colab., 1979).
Zona electroforetică Observație Cauze posibile
Masă celulară hepatică scăzută,
Zona prealbuminei Scăzută Răspuns inflamator
Malnutriție
Răspuns inflamator,
Malnutriție,
Scăzută Pierderi în greutate,
Zona albuminei Maladii maligne,
Un volum extracelular crescut.
Medicamente (penicilină)
Front anodal rapid
Icter
Intensitate scăzută Leziuni ale celulei hepatice
Interzona albumină-α1 Malnutriție
α1- Lipoproteine Intensitate crescută Abuz de alcool
Nivel estrogenic crescut postmenstrual
Polimorfism Variante genetice.
Răspuns inflamator,
Zona α1 Crescută
Alterarea celulei hepatice
α1-Antitripsina
Deficiență genetică,
Relativ scăzută
Scăderi în greutate.
Dependentă de vârstă la copii,
Zona α2
Crescută Persoane în vârstă (>70),
α2-Macroglobulina
Proteinurie selectivă
Crescută Răspuns inflamator,
Haptoglobina
Relativ scăzută Hemoliză in vivo
Variante genetice (proteina Bence Jones, componenta M,
Polimorfism
Zona β1 hemoglobină)
Transferina Crește Deficiență de fier, estrogeni
Scade Malnutriție, scăderi în greutate răspuns inflamator
Hipercolesterolemie
β-Lipoproteine Poziție crescută O mobilitate scăzută cu creșterea intensității sugerează o
obstrucție biliară
Zona β2
Creștere selectivă Malignitate, infecții ale mucoasei, artrită, abuz de alcool
IgA
Polimorfism Variante genetice,
Poziție Conversia in vivo/in vitro a C3 la C3c
C3 Răspuns cronic inflamator,
Crește
Obstrucție biliară
Scade Activarea complementului
Zona γ Crește Răspuns inflamator
Fibrinogen Scădere relativă Fibrinoliză, procedură inadecvată de prelevare a probei
Benzi înguste Componenta M
Imunoglobuline Difuzie crescută Creștere policlonală
Apariție în benzi Creștere oligoclonală, infecție virală, malignitate
Patologie. O fracție crescută de prealbumină poate fi observată la alcooliciîn timp ce o scădere
remarcabilă a concentrației în timpul unei zile este în mod clar cauza unui răspuns acut inflamator (cu
cauze necunoscute). Concentrația prealbuminei rămâne scăzută în inflamația cronică activă. Totodată, o
prealbumină scăzută este o caracteristică constatată în fazele timpurii ale cirozei hepatice. Principala
utilizare clinică a estimării prealbuminei este detecția timpurie a masei celulare funcționale hepatice.
 Zona de albumine. Această bandă prezintă cea mai mare lățime deoarece dintre toate celelalte
proteine, concentrația de albumină este cea mai mare, precum și din cauza eterogenității sale
electroforetice, ambele, cu origine genetică. La subiecți sănătoși fracția albuminică are aceeași lățime cu
excepție în cazul unor heterozigoți neobișnuiți (o prevalență mai mică de 1:100) care prezintă diferențe
dee migrare la nivelul albuminelor rapide și lente. Cea mai obișnuită variantă genetică este cea
caracterizată prin împrăștierea catodală a fracției de albumină, deși au fost observate o serie de variante de
albumină cu extindere anodală ori catodală a fracției. În cazul unor heterozigoți apare o separare clară a
albuminei în două benzi fenomen denumit „bisalbuminemie” (cu o prevalență mai mică de 1:10.000).
Patologie. O concentrație scăzută a albuminei este o trăsătură cauzată de modificări în distribuția ei
intra- și extra-vasculară, retenție de apă, ori datorită unei sinteze scăzute, care caracterizează răspunsul
inflamator acut sau cronic, insuficiență cardiacă ori renală, pierderile anormale intestinale ori alte pierderi
externe, ciroză avansată și stadii avansate ale maladiei maligne. Hipoalbuminemia poate fi de asemenea, o
sechelă a infuziei de dextran ori o producție supracrescută de imunoglobuline, care contribuie la presiunea
osmotică coloidală. Hiperalbuminemia este un semn al deshidratării. O mobilitate electroforetică alterată
și o albumină dispersă poate fi rezultatul legării de albumină a unor substanțe organice, exogene și
endogene, încărcate electric. Albastrul de bromfenol, indicatorul de migrare cel mai adesea utilizat în
monitorizarea migrării electroforetice este regăsit în frontul de albumină.
Cele mai obișnuite cauze endogene care induc o creștere a albuminei sunt hiperbilirubinemia, prezența
unor acizi grași neesterificați, ori administrarea unor doze mari de aspirină. După un tratament parenteral
cu doze mari de penicilină se poate observa o fracție albuminică rapidă cu timp de înjumătățire normal
biologic, datorată conjugării acizilor penicilici la albumină, în timp ce o mobilitate scăzută a unei părți a
fracției de albumină este de obicei ereditară. De asemenea, ingestie și deci o contaminare cu metale grele,
precum cuprul, poate conduce la același profil electroforetic.
 Interzona albumine-α1. Datorită prezenței α-lipoproteinelor, această arie este de obicei în mod
egal colorată. În mod normal, intensitatea culorii zonei dintre banda de albumină și cea de α1 reflectă în
principal concentrația de α-lipoproteine. Această intensitate este crescută la femei în timpul pubertății,
după ingestie de estrogeni și în perioada de graviditate. α1-Lipoproteinele cuprind una dintre cele mai
heterogene grupe de proteine plasmatice din punct de vedere electroforetic și chimic. Poziția obișnuită este
cea dinspre zona albuminei spre banda α1, media mobilității lor crescând odată cu creșterea concentrației
de acizi grași neesterificați. În cazuri excepționale, α-fetoproteina poate apărea ca o bandă slabă în
mijlocul acestei zonei. În plus, pot să apară la mijlocul limitei catodale a zonei, variantele de α1-
antitripsină care migrează rapid iar culoarea poate fi anormal de intensă din cauza α-lipoproteinelor atipice
ori a concentrației foarte mari de orosomucoid.
Patologie. α-Lipoproteinele de pe partea anodală a zonei de albumine indică o lipoliză anormală.
Astfel, o fracțiune crescută a α-lipoproteinelor cu o mobilitate normală ori lentă este considerată ca
trăsătură obișnuită, strâns legată de alcoolemia cronică. O creștere moderată în concentrația fracției de α-
lipoproteine este parte a răspunsului inflamator în timp ce o scădere marcantă a α-lipoproteinelor cu o
creștere medie a mobilității lor și o imunoreactivitate alterată este constatată în mod uzual în hepatite acute
și precede hiperbilirubinemia. În cazurile de ciroză hepatică, zona α-lipoproteinei este “pală”. De
asemenea, zona α-lipoproteinei este mai puțin intensă în timpul ocluziei biliare, când concentrația benzii
de β-lipoproteine este crescută și se poate demonstra prezența lipoproteinei X (Lipoproteina X, LP-X, este
o lipoproteină anormală care apare în serul pacienţilor cu icter obstructiv şi este aşadar, este un marker
pentru colestază, un ansamblu sferic care se agregă puternic). Prezenţa LP-X în ser nu permite o
discriminare între colestaza intra-şi extra-hepatică. Pe de altă parte, LP-X este prezentă în plasma
pacienţilor cu deficiență în lecitin:colesterol acil transferază (LCAT) plasmatică familială. O mobilitate
scăzută a fracției de α-lipoproteine anodale conduce la o bandă α1 neclară. Aceasta poate fi observată în
malnutriția severă, ori la alcoolici, în particular după un consum recent de alcool. O fracție mare de α-
lipoproteine cu mobilitate normală sau mică este în mod obișnuit descrisă la alcoolici cronici iar o scădere
moderată a fracției α-lipoproteice este dată de un răspuns inflamator. Scăderea α-lipoproteinelor însoțește
mai multe maladii lipoproteice moștenite, precum deficiența în lecitin:colesterol aciltransferază (EC
2.3.1.43) ori maladia Tangier (de asemenea cunoscută ca “deficiența α-lipoproteică familială” ori
hipoalfalipoproteinemia).
α-Fetoproteina este o componentă serică identificată „în urme”, care migrează în zona dintre albumină
și banda α1. În stări patologice, în serurile pacienților care prezintă cancer primar al ficatului ori tumori
embrionare, α-fetoproteina poate cauza o bandă slabă, când este prezentă în exces de 100 de ori față de
normal.
Orosomucoidul (ORM, sau α-1- glicoproteina acidă, este o componentă plasmatică se fază acută fiind
modulată de două gene polimorfe. Ea este sintetizată în hepatocite, este puțin heterogen și se întinde pe
partea anodală a benzii α1-antitripsină. Deoarece are o capacitate mică de colorare (datorită marelui
conținut în acid sialic) ORM nu este în mod obișnuit decelat.
În cazuri patologice, banda α1 poate să apară extinsă și ușor pufoasă, pe partea anodală (dacă
concentrația de ORM este mai mare de 2g/L). Pe de altă parte, este imposibil să se interpreteze prin
aparență, dacă o bandă α1 anodală pufoasă este rezultatul unei creșteri a α1-lipoproteinelor ori a creșterii
ORM. O creștere a fracției de ORM este în mod obișnuit constatată cu una sau două zile, în faza timpurie
a unei inflamații; valori crescute sunt de asemenea observate în timpul insuficienței în filtrarea
glomerulară și deseori, în timpul tratamentului cu prednisolonă sau cu alți analogi de corticosteroizi cu
masă moleculară relativ mică când, una din căile catabolice ale acestora implică eliminarea lor prin filtrare
glomerulară. Benzi α1 anodale scuamoase (pufoase) sunt comune și în cazul unei uremii.
 Zona α1. α1-Antitripsina (A1AT, este un inhibitor proteazic care aparține superfamilei de
serpine fiind un inhibitor seric de tripsină și de alte multe proteaze, cu rol de protecție a țesuturilor de
acțiunea hidrolitică a enzimelor, în special ale elastazei din neutrofile. Ea este responsabilă pentru banda
α1 normală și care prezintă ca satelit, o bandă adiacentă minoră catodală, aceasta fiind o expresie a
microheterogenității sale. Sunt frecvente variante genetic moștenite sau căpătate și care pot provoca
lărgirea, deplasarea uşoară, sau dublarea benzii α 1. Aproximativ 15% dintre caucazieni au variante
genetice A1AT detectabile prin electroforeză pe gel de agaroză. Cele mai multe dintre aceste persoane
sunt heterozigote: la jumătate dintre ei A1AT apare ca bandă normală, în timp ce cealaltă jumătate se
observă o bandă secundară pe partea sa catodală sau anodală, aceste variante neavând o semnificație
clinică. A1AT posedă o grupare SH-reactivă şi din acest motiv, compuşii tiol se găsesc legaţi şi uneori,
modifica mobilitatea electroforetică.
Patologie. A1AT aparţine reactanţilor de fază acută, crescând la una-două zile după apariția unor
leziuni tisulare; creşterea selectivă a A1AT este un semn extrem de valabil de afectare hepatică şi un
semnal sensibil al creșterii estrogenilor; dublarea benzii apare, de exemplu, în timpul sarcinii, iar o scădere
a benzii α1 este un indicator pentru măsurarea specifică a A1AT şi de tipizare genetică (Pi-typing) (Pierce
și colab., 1976).
 Interzona α1-α2. Acest sector a unei electroforegrame este situată de obicei pe partea anodală,
bine demarcată a benzii α2 fiind recunoscută după prezența a una-trei benzi slabe, adiacente. Acestea
reprezintă componentul specific de grup, inhibitorul inter-α1 antichimiotripsină, și proteina care leagă
vitamina D. Când sunt prezente, haptoglobinele de tip 1:1 se suprapun acestor benzi minore pe partea
anodală a α2-macroglobulinelor și astfel, partea catodală din zona α2 apare goală.
Patologie. Analiza electroforegramei prin inspecție vizuală nu este suficientă pentru a stabili care
dintre proteinele prezintă valori crescute. Totuși, prin simpla analiză se observă că în timpul unui răspuns
inflamator acut, poate să apară o noua bandă, pe partea catodală a α 1-antitripsinei. În plus, în timpul unui
răspuns inflamator acut ori în timpul unei sarcini, benzile din această zonă sunt mai intens colorate
identificându-se pacienţii suferinzi de mielom cu proteinurie Bence Jones cu catene k, complexe formate
între catenele k şi α1-antitripsină sau albumină. Acestea sunt legate printr-o punte S-S şi sunt clivate printr-
o uşoară reducere. În această zonă pot apărea de altfel și catene libere ușoare de tip λ.
 Banda α2. Compoziţia proteică complexă a zonei α2, nu poate fi soluţionată printr-o simplă
inspecţie vizuală, deşi două familii de proteine domină compoziția acesteia: α 2-macroglobulinele şi
haptoglobinele. Ambele tipuri de proteine prezintă variaţii individuale şi diferă prin zona de împrăștiere în
bandă ceea ce conduce, pentru o interpretare corectă a compoziţiei fracţiei, necesitatea unei analize
densitometrice cantitative. O formă distinctă de ascuţire a benzii α2, indica existența unei fracţiuni α2
majore de macroglobuline, fenomen observat de obicei la copii, unde α 2-macroglobulina este atât de
dominantă în zona α2 in timpul primilor ani de viață încât variaţia altor α2-globuline nu poate fi observată.
Un fenomen similar este sedeori observat la persoanele în vârstă.
Patologie. Creşterea fracţiunii α2-macroglobulinei valoare de diagnostic scăzută, procesul
manifestndu-se în mod regulat în cazuri de pierdere glomerulară selectivă de proteine, dar nu şi în cazul
pierderilor de proteine intestinale. O uşoară creştere este observată în mod obișnuit în ciroză hepatică, în
diabet, în afecţiuni maligne, precum şi la persoanele în vârstă. Valorile scăzute ale α2-macroglobulinei, de
asemenea, au o importanţă redusă de diagnostic, în ciuda poziţiei cheie a proteinei ca acceptor major de
proteaze eliberate în spaţiul intercelular şi timpul scurt de înjumătățire a acestor complexe. Nu se observă
nici un declin aparent în concentraţia plasmatică în pancreatită acută, în ciuda unui catabolism crescut
intra-abdominal a α2 macroglobulinei, cu toate că, valori scăzute sunt în mod constant obținute în timpul
ultimilor zile ale vieţii. Pe de altă parte, α 2-antiplasmina (denumită și inhibitorul plasminei, un inhibitor
serin-proteazic (serpin) responsabil de inactivarea plasminei, o enzimă importantă care participă în
fibrinoliză și în degradarea unui număr variat de alte proteine) scade semnificativ mai devreme şi mai mult
decât se observă în cazul α2-macroglobulinei la pacienții suferinzi de pancreatită.
Creşterea drastică a haptoglobinei din plasmă, în timpul unei reacţii inflamatorii şi reducerea ei în
timpul eliberării crescute de hemoglobină intravasculară (în condițiile unei hemolize uşoare, în deficiență
de vitamină B12, în cazul unui deficit de acid folic, în metastaze hepatice şi de măduvă osoasă, în sepsis, în
hepatită ori în ciroză hepatică și în splenomegalie) conduce la o mare variabilitate a acestei componente
din zona α2 și care poate fi decelată numai printr-o analiză cantitativă atentă. Intensitatea benzii α2 poate fi
crescută şi extinsă catodal atunci când s-au format complexe hemoglobină-haptoglobină, în acest caz,
proba fiind, de obicei de culoare roşie. De altfel, tratamentul cu androgeni 17-hidroxilați amplifică
creşterea inflamatorie a haptoglobinei plasmatice în timp ce proliferarea celulelor maligne în sânge poate
conduce la migrarea componentei M (o imunoglobulină anormală care apare în cantitate crescută la
pacienții suferinzi de macroglobulinemie, boala catenei grele sau mielom multiplu) în zona α 2. De altfel
multe alte α2-globuline prezintă o variaţie legată de existența unei boli, dar concentraţia lor este prea mică
pentru a influenţa apreciabil aspectul zonei.
 Interzona α2-β1. Background-ul colorației din această zonă are o intensitate scăzută, deși,
uneori, fibronectininele plasmatice solubile (acele globuline insolubile la rece, fibrinolignine, produse în
ficat de către hepatocite și care reprezintă componenta proteică majoră a plasmei sanguine fiind
identificate la o concentrație de 300 μg/ml) cu origine fibroblastică cauzează o bandă îngustă și slabă, în
mijlocul zonei, a cărei concentraţie scade în momentul formării cheagurilor din plasmă, din cauza legării
la fibrină. Fibronectininele constituie cea mai mare parte a crio-precipitatului în preparatele plasmatice
tratate cu heparină, la 4oC. În același timp se pot identifica benzi cu aspect scuamos și cu mobilitate
anormal de mare când concentraţiile pre β- şi β-lipoproteinelor sunt mici, proces întâlnit mai ales la
depozitarea probelor. Pe de altă parte, în timpul electroforezei serurilor contaminate cu hemoglobină
(>1g/l), ultima ăn formă liberă migrează în interzona catodală α2-β1 și care astfel se suprapune peste o
parte din banda anodală β1.
Patologie. Concentrația fibronectinelor este puțin influenţată de o stare patologică, deși tinde să scadă
în timpul unui răspuns inflamator, în tmp ce o concentraţie crescută este regăsită în timpul colestazei de
sarcină. În plus, componentul M ale tuturor claselor de imunoglobuline și catenele ușoare ale acestora pot
să apară în această zonă.
 Zona β1. Intensitatea culorii a acestei benzi variază relativ proporţional cu concentraţia de
transferine (glicoproteine din plasma sanguină cu funcței de transport al fierului și rol de control al
acestuia în fluidele biologice). Divizarea fracţiunii într-o bandă cu mobilitate mai lentă și o bandă mai
rapidă este expresia heterozigotismului variantelor de transferină. În astfel de cazuri, cele două benzi au
intensitate normală sau una redusă la jumătate, iar ambele variante nu sunt semnificative clinic. După
scindarea C3 a complementului (fenomen care are loc în mod regulat în condițiile depozitării serului),
fragmentul C3c migrează și se suprapune, apărând astfel pe partea anodală a benzii β1. Rata de clivaj este
mai rapidă în serurile de la subiecţi cu răspuns inflamator.
Patologie. Benzile cu intensități mai accentuate sau mai pale indică concentraţii crescute, respectiv
scăzute ale transferinei. De asemenea, în timpul sarcinii, după un tratament cu estrogeni ori în cazul unui
deficit de fier, creşterea transferinei se poate observa chiar cu ochiul liber, în timp ce o scădere a
concentrației este evidențiată în timpul unui răspuns inflamator ori în cazul persoanelor alcoolice. În
această zonă se pot evidenția și componente M, în principal a celor din clasa IgA, a căror heterogenitate
moleculară, mărime şi capacitate de formare a unor complexe reprezintă cauza extinderii lor în direcţii
anodală ori catodală. În schimb, alte componente M au, de obicei, o delimitare clară.
 Interzona βl-β2. Este alcătuită din 3 benzi de lipoproteine uşor vălurite, care domină această
zonă, cu partea catodală mai clară decât cea anodică, în timp ce background-ul colorat, se datorează, în
principal prezenței IgA. În această parte a electroforegramei, mobilitatea β-lipoproteinelor este dependentă
de existența acizilor graşi neesterificați legați şi uneori scade odată cu creșterea concentrației acestora ca
rezultat al apariției unor interacţiuni nedorite cu o agaroză bogată în grupări ionizabile, prin urmare,
aspectul electroforegramei variază în funcție de calitatea suportului electroforetic, care alterează
mobilitatea componentelor. În plus, mobilitatea β- lipoproteinelor scade odată cu creșterea concentrației de
Ca2+ din tampon. Din această cauză, electroforeza comparativă a serurilor proaspete face posibilă
decelarea unor diferențe de concentraţii ale β-lipoproteinelor. Astfel, apariția unei bande deplasate catodal,
de intensitate mare, indică o concentrație anormal de mare a β-lipoproteinelor, în timp ce o cantitate
scăzută a acestora are ca efect o mobilitate accentuată. O intensitate crescută a culorii din această zonă
extinsă în partea γ-anodală, este o caracteristică a creșterii IgA după cum în această zonă pot fi identificate
toate componentele M ale claselor de Ig.
 Zona β2. Aceasta zona este datorată în principal existenței celui de-al treilea factor complement
(C3), după cum o serie de variante genetice se decelează datorită diferențelor ușoare de mobilitate. În mod
normal, banda C3 are o mică intensificare a culorii pe partea anodală.
 Banda C3 este despărțită în două în timpul depozitării serului iar produsul predominant de conversie
este C3c, care are o mobilitate mai mare decât β1. De altfel, în faza de început a conversiei apare o mică
bandă slabă în partea catodală a C3, acest compus intermediar fiind foarte labil.
Patologie. C3 este unul dintre reactanţii de fază acută și crește în concentrație după o fază de lag de
aproximativ cinci-şapte zile. Concentrația crește de asemenea în timpul unei obstrucții biliare. Pe de altă
parte, valori normale sau scăzute, după prima săptămână de răspuns inflamator sugerează o activare
anormală a C3, produșii de conversie a complementului, in vivo, sunt rareori găsiți în probele de sânge, din
cauza timpului lor mic de înjumătățire. Astfel, o banda de slabă a C3, în combinaţie cu apariţia unor
produși de conversie sugerează o activare „in vitro” a procesului, în timp ce valori mici datorate creșterii
activării complementului „in vivo”, pot fi observate la începutul unei faze nefritice acute, a
glomerulonefritei membrano-proliferative, în lupusul eritematos sistemic, precum şi datorită existenței
unor complexe imune intravasculare. Pe de altă parte, o activare prin calea clasică (de exemplu în reacţii
antigen-anticorp, în anemia hemolitică) a complementului C3 nu este, de multe ori, urmată de o scădere a
fracției C3, în ciuda unei scăderi marcate a C4.
 Zona γ. Pe partea catodală a benzii C3 urmează o zona extinsă, banda banda γ, a cărei
intensitate şi distribuţie de culoare, depinde de concentrația diferitelor subclase de IgG și unde pot fi
observate chiar cu ochiul liber o serie de anomalii deosebite. Astfel, în condițiile în care este analizată
electroforetic plasma sanguină, concentrațiile crescute ale IgM prezente în probă influențează în mică
măsură intensitatea culorii în partea de anodală a zonei γ, zonă unde migrează de asemenea și fibrinogenul
ca și bandă îngustă a cărei intensitate este corelată cu concentrația acestuia.
Patologie. Datorită dimensiunilor mari şi a mobilității lente a fibrinogenului este împiedicată detecția
unor variante genetice care posedă substituţii la un singur aminoacid. În schimb, este uneori identificată o
demarcare scuamoasă a benzii de fibrinogen, fără existența unei trene, în pancreatita subacută, iar
evidențierea în zona γ a unor benzi slabe, individuale, pot fi decelate ca urmare a proliferării unor clone
celulare producătoare de Ig. Apariția ocazională a unor splitări la concentrații de ordinul 2g/l, este datorată
unei proliferări celulare oligoclonale. Uneori, în zona γ anodală, se poate observa, un produs labil de
conversie a C3. De altfel, acest fenomen este observat după infecţii virale ori în cazul prezenței unor
tumori maligne. În ultimul caz, existența unei patologii maligne poate conduce la apariție unor benzi
înguste și intens colorate de componentă M, a cărei concentraţie indică cu aproximație dimensiunea clonei
de imunocite proliferante, după cum creşterea concentraţiei acesteia M indică o creştere a masei celulare.
De altfel, la persoane în vârstă, existența componentelor M, într-o concentrație de aproximativ 10 g/L,
reprezintă de obicei, semnal al unei proliferări imunocitare, în timp dacă sunt semne concomitente de
răspuns inflamator fără cauze aparente, aceste componente provenite din IgM conduc la suspiciunea unui
limfom malign sau a unei reticuloze. De altfel, în cazul răspunsului inflamator acut şi cronic, proteina C-
reactivă migrează pe partea catodală a conglomeratului de IgG şi care adesea atinge concentrații care au
ca efect apariția unei benzi. În același timp, interacţiunea dintre proteina C reactivă și contaminanţii
existenți în gelul de agaroză (în funcție de lotul de agaroză utilizat) cauzează variaţii ale intensității benzii.
O stimulare a producerii de Ig de către celulele policlonale se identifică printr-o creștere a intensității
culorii zonei γ și care indică de obicei, o creștere a sintezei IgG, după cum existența unor concentrații
crescute (>25 g/L) sugerează stări hiperimune a căror origine poate fi lupusul eritematos sistemic,
hepatitele cronice active, formarea de abcese cu origine microbiană sau procese maligne, ultimile
implicând măduva osoasă. În cazuri rare astfel de efecte apar accidental și la indivizii sănătoși. Un profil al
al zonei γ al unei electroforegrame proteinelor serice pe gel de agaroză prezentată în figura 3.19.
Dacă o hipergamaglobulinemie moderată, dezvoltată ca răspuns la stimuli antigenici variați nu atinge
concentrații anormale mai devreme de trei săptămâni, o hipogamaglobulinemie este ușor de recunoscut
prin electroforeza comparativă și care indică, de obicei, maladii serioase (de exemplu diabet,
mieloscleroză, proliferare celulară plasmatică sau reticulară malignă, metastaze generalizate).
Hipogamaglobulinemia la adulți fără o cauză aparentă este o indicație a unei proteinurii Bence Jones.
În cazuri rare, pe partea catodală ale zonei γ normale, pot apărea componente M provenite din clasele
de Ig M ori G. Pe de altă parte, lizozimul, care migrează în această zonă în mod normal rareori atinge
concentrații care să-l facă vizibil, cu excepția maladiilor mieloproliferative (Laurell, 1972).
3.1.2.2. Profilul electroforetic al proteinelor fluidului cerebrospinal comparativ cu cele din plasmă
În mod normal, aproximativ 80% dintre proteinele fluidului cerebrospinal fluid (CSF) au originea
plasmatică iar restul sunt sintetizate local, în condițiile în care timpul de înjumătățire al proteinelelor
plasmatice care intră în spațiul subarahnoid este de aproximativ o săptămână și din acest motiv compoziția
CSF urmează, cu o oarecare întârziere, pe cea a plasmei. Pe de altă parte, transferul proteinelor plasmatice
scade rapid odată cu creșterea masei lor moleculare și din acest motiv raportul dintre proteinele mari (IgM,
β-lipoproteine și α2-macroglobuline) și albumină, este în mod normal mai scăzut în CSF decât în plasmă.
Totuși, discriminarea pe baza masei moleculare se micșorează atunci când concentrația proteică a CSF
este crescută iar procentul de proteine sintetizate local se diminuează în mod normal odată cu creșterea
concentrației de proteine totale.

Figura 3.19. Un profil policlonal semnificativ al electroforezei proteinelor serice pe gel

de agaroză (anodul fiind în stânga). Banda γ prevăzută cu asterisc este lărgită și se întinde
pe toată aria de mobilitate gama (Panelul B). Analiza densitometrică relevă un peak difuz
de mobilitate gama. Acest profil este cel mai adesea dat de prezența unui proces
inflamator ori reactiv, în bolile cronice ale ficatului, în bolile țesutului conectiv, în infecții
cronice, ori într-o maladie limfoproliferativă (Panel A). (După Kyle și Rajkumar, 2004).

Interesul clinic în analiza electroforetică a CSF este limitat la profilul imunoglobulinic, în cercetarea
semnelor locale de producere a imunoglobulinelor în sau în jurul sistemului nervos central. Profilurile
mono- și policlonale din zona γ a CSF în momentul în care profilul plasmatic este de tip policlonal,
reprezintă un indicator ferm al unui răspuns imunocitar local față de microorganisme, virusuri, ori
complexe antigen-anticorp.
Din punct de vedere analitic, o probă de CSF supusă separării trebuie să fie de cel puțin 150 de ori mai
concentrată, profilul electroforetic al acesteia fiind caracterizat printr-o puternică fracție prealbuminică,
care migrează puțin mai rapid decât cea identificată în plasma sanguină. Zona albuminei și α1 sunt similare
celor plasmatice și se observă o fracție α-lipoproteică mai redusă, alături de o bandă α1 mai difuză.
Datorită unui conținut foarte scăzut în α2macroglobuline, zona α2 apare mai estompată și mai
scuamoasă, iar zona α2-β1 conține mai multe proteine, în timp ce banda β1 este similară cu cea găsită în
plasmă, după cum banda β2 este dublată datorită prezenței C3 și a transferinei, ultima produsă local și
prezentând un conținut deosebit în carbohidrați. Pe de altă parte, se observă o tendință de îngustare a
mijlocului zonei γ în timp ce la capătul catodal al ei se evidențiază o bandă slabă, cauzată de fracția ”urme
de γ”, labilă și cu masă moleculară mică (10.000 daltoni).
Analizele electroforetice comparative ale proteinelor din CSF și plasmă nu prezintă interes în condițiile
în care concentrația de proteină din CSF depășește 2g/l, deoarece producția locală de Ig nu poate fi
distinsă din profilul electroforetic exprimat datorită prezenței masive a proteinelor plasmatice.
3.1.2.3. Profilul electroforetic al proteinelor din urină comparativ cu cele din plasmă
Un determinant de bază în analiza profilului proteinelor urinare este reprezentat de compoziția și
cantitatea de proteine care permează prin filtrare glomerulară, în relație directă cu capacitatea resorbtivă
tubulară. În mod normal, acest proces este limitat la aproximativ 200 mg proteine/zi, pierderea redusă a
acestora neprezentând un efect tip feedback asupra profilului proteic plasmatic. Astfel, în cazul pierderii
urinare masive a unor de cantități de proteine, analizele comparative electroforetice disting trei posibilități
majore: (a) proteinuria glomerulară neselectivă, (b) proteinuria glomerulară selectivă și (c) proteinuria
Bence Jones.
În proteinuria glomerulară neselectivă, leziunile membranelor glomerulare sunt atât de severe încât nu
mai există o discriminare în filtrarea moleculelor cu o dimensiune medie cuprinsă între albumină și IgG
(70.000 la 150.000 daltoni). Astfel, cantitatea de proteină (albumină) din urină dă indicații asupra
existenței unei leziuni decât profilul proteic urinar care urmărește profilul seric. De altfel, în mod normal
albumina trece prin filtrul glomerular de 5-10 ori mai ușor decât IgG, gradul de selectivitate glomerulară
fiind mai bine reflectat de raportul albumină/IgG decât de rezultatul analizelor electroforetice. În plus, în
proteinuria glomerulară neselectivă profilurile electroforetice urinare deviază mult de profilul plasmatic.
 În proteinuria glomerulară selectivă plasma este epuizată de proteinele cu masă moleculară relativ
mică, care în schimb se regăsesc și îmbogățesc urina; profilul urinar este dominat de banda albuminică,
banda α1 (α1-antitripsină) și banda β1 (transferină), în timp ce partea catodală este lipsită de fracțiuni. În
acelașii timp, profilul plasmatic prezintă un aspect caracteristic pierderii glomerulare de proteină afișând o
fracție albumină scăzută și o creștere a concentrației tuturor proteinelor mari (α2-macroglobuline,
fibronectine, β-lipoproteine, IgM și fibrinogen). Proteinuria glomerulară selectivă blândă (<1g/L) este o
trăsătură comună care caracterizează condițiile inflamatorii și insuficiența circulatorie fiind de interes
clinic marginal. Pe de altă parte, răspunsul inflamator conduce la o excreție crescută de orosomucoid, ceea
ce cauzează o bandă α1 ștearsă în direcția anodală, în timp ce interzona α este parțial ocupată de o α2-
glicoproteină Zn-dependentă și de alte proteine mici.
În concluzie, rațiunile pentru efectuarea analizelor electroforetice a urinei în cazuri care prezintă o
pierdere de proteine sunt limitate la suspiciuni legate de maladia Bence Jones ori de proteinuria tubulară
proximală.
3.5.2.4. Proteinuria Bence Jones
Excreția urinară a catenelor ușoare de imunoglobuline κ ori λ, cu origine monoclonală (proteinuria
Bence Jones) conduce la apariția unei singure (uneori duble) bande, mai mult ori mai puțin închisă la
culoare, undeva în zona α1 spre zona cu mobilitate γ. Natura ei poate fi demonstrată prin
imunoelectroforeză, deși este de preferat o evidențiere prin imunofixare după o electroforeză pe gel de
agaroză în prezența antiserurilor anti κ și anti λ, deoarece rezultatul unor analize imunoelectroforetice
convenționale este mai dificil de interpretat comparativ cu rezultatul obținut prin imunofixare, în condițiile
în care concentrația de catenă ușoară monoclonală este scăzută, din cauza faptului că acele catene
policlonale ușoare se dislocă și se regăsesc în urină.
Excreția unei cantități crescute de catene ușoare prin glomeruli cauzează competiția cu alte proteine cu
masă moleculară relativ mică pentru capacitatea limitată de reabsorbție în secțiunea tubulară proximală a
nefronului. De aceea, profilul proteic în proteinuria Bence Jones prezintă deseori o serie de benzi care
sugerează o reabsorbție tubulară insuficientă.
Proteinuria tubulară pură este o proteinurie moderată mai mică de 0,5g/zi, caracterizată prin excreția
proteinelor mici (<50.000 Da) care în condiții normale permează filtrul glomerular și sunt apoi, în mod
normal reabsorbite de către celulele tubulare proximale.
Proteinele predominante cu masă moleculară mică care dau o creștere a benzilor electroforetice din
urină sunt α2-microglobulina (proteina de legare a retinolului), β microglobulina (parte constantă a
antigenului HLA) și “urmele γ”. În mod egal abundente, dar heterogene electroforetic, sunt proteina HC
(Tejler și Grubb, 1976) și catenele ușoare policlonale, proporția acestora variind în funcție de maladie.
Leziunile tubulare pure sunt rare, deși un profil proteic similar de “proteinurie tubulară” este în mod
curent depistat într-o insuficiență de filtrare glomerulară avansată. Acest fapt este explicat prin creșterea
concentrației proteice plasmatice, în condițiile în care filtrarea glomerulară a tuturor moleculelor, care în
condiții normale sunt eliminate este insuficientă. Încărcarea cu proteine mici crește în puținele funcții
rămase a nefronilor și astfel se depășește capacitatea reabsorbtivă a celulelor tubulare proximale.
Insuficiența tubulară proximală primară este combinată cu o filtrare glomerulară normală (o creatinină
plasmatică normală) în opoziție cu insuficiența tubulară proximală secundară care este însoțită de o
insuficiență de filtrare glomerulară (uremie).
În concluzie, electroforeza proteinelor urinare are o valoare clinică deosebită dacă se suspectează o
proteinurie Bence Jones, deși în alte scopuri de diagnostic ea prezintă un interes marginal.
3.5.3.5. Electroforeza proteinelor urinare pe gel de agaroză în prezență de dodecil sulfat de sodiu
După introducerea în 1967 a dodecil sulfatului de sodiu (SDS) de către Shapiro, Viñuela și Miazel
(1967) drept transportor al proteinelor, care are ca efect separarea proteinelor pe gel de poliacrilamidă în
funcție de masa lor moleculară prin impunerea sarcinii negative peste sarcina lor originală și eliminarea
diferențelor conformaționale dintre ele, procedeul a fost rapid adoptat ca mijloc rapid de separare a
proteinelor cu masă moleculară mare și pe gel de agaroză. În acest sens, investigaţiile pacienţilor cu
mielom multiplu (MM) includ screening-ul electroforetic al proteinelor urinare (pentru evaluarea funcţiei
renale ori de detectare a unei fracţiuni de proteine anormale), urmat de un procedeu de imunofixare pentru
identificarea unei componente monoclonale (imunoglobuline intacte sau catene ușoare libere ale unor
anticorpi monoclonali), care apar în mod obișnuit în cazul proteinuriei Bence Jones (BJP) (Levinson și
Keren, 1994). Astfel, BJP este detectată prin analize de laborator în urina a 75% dintre pacienţi cu MM şi
este una din caracteristicile majore ale acestei boli (Kyle, 1994). În plus, cuantificarea periodică a BJP prin
electroforeză este de asemenea utilizată în monitoriza complicaţiilor renale ale bolii şi a răspunsului
pacientului la tratamentul aplicat deoarece cantitatea de proteine Bence Jones excretate în urină se
corelează cu masa tumorală (McLaughlin și Alexanian, 1982).
Metodele electroforetice care utilizează agaroza sau acetatul de celuloză ca mediu stabilizant sunt
utilizate în mod curent pentru analiza de proteinelor urinare, separare ce se realizează pe baza sarcinii
electrice și a dimensiunii lor. Aceste metode necesită o treaptă anterioară de concentrare a urinei, proces
realizat de obicei prin ultrafiltrare, tehnică consumatoare de timp şi costisitoare care, în plus poate conduce
la pierderea necontrolată de proteine (Pesce și colab., 1972; Laurell, 1972). Pe de altă parte, unele
rezultate sunt deosebit de dificil de interpretat din cauza faptului că proteinele Bence Jones, comigrează cu
imunoglobulinele intacte ori cu alte proteine, precum transferina (McNamara și colab., 1991). De altfel,
electroforeza pe gel de agaroză (AGE), ca metodă de rutină, prezintă o sensibilitate scăzută în detectarea
concentraţiilor mici de proteine Bence Jones (Levinson și Keren, 1994). Din această cauză, Bianchi-
Bosisio și colab. (1991) au introdus, pentru analiza calitativă a proteinelor urinare, electroforeza pe gel de
poliacrilamidă în prezență de dodecil sulfat de sodiu. SDS-PAGE separă proteinele în funcţie de mărimea
lor moleculară, iar monomerii catenelor ușoare libere (policlonale sau monoclonale) sunt vizualizate ca o
bandă cu masă moleculară (Mr) de 25.000 Da, care sunt deosebite cu uşurinţă de imunoglobulinele intacte
(cu masă moleculară de 150.000 Da). Astfel, SDS-PAGE diferenţiază, proteinuria cu origine glomerulară
(proteine, cu masă moleculară mai mare de 66.000 Da), de cea cu origine tubulară (proteine cu masă
moleculară mai mică de 66.000 Da), sau cu origine mixtă. Această metodă este, aşadar, un instrument
clinic de mare valoare pentru evaluarea funcţiei renale, un important factor de prognostic în MM (Burton
și Harris, 1996; Durie și Salmon, 1975). Cu toate acestea SDS-PAGE, nu este utilizată pe scară largă în
laboratoarele clinice, pentru că este mai laborioasă şi este mai costisitoare (Marshall și Williams, 1993;
Siba și colab., 1988; Lubega, 1983; Marshall și Williams, 1987).
În acest context, Le Bricon și colab. (1998; 2000) au realizat tehnica de analiză a proteinelor urinare
prin electroforeză pe gel de agaroză în prezență de dodecil sulfat de sodiu (SDS-AGE) asemănător SDS-
PAGE, la pacienți suferinzi de MM. În acest protocol, urina, fără o concentrare prealabilă, se analizează pe
suport Hydragel®, mediu electroforetic utilizat în mod obișnuit la analiza concentrației proteice, având în
vedere ca urina a cărei concentrație de proteine este mai mare de 2g/l, să se dilueze înainte de analiză,
până la o concentrație de 1g/l. În continuare, douăzeci de microlitri de soluţie de SDS, 10g/l (care conține
albastru bromfenol ca indicator de migrare) se adaugă la 80 µl de urină şi se amestecă la temperatura
camerei. Cinci microlitri din probele astfel tratate se adăugă în fiecare godeu și se lasă să difuzeze timp de
10 minute. Separarea electroforetică se realizează prin aplicarea unei tensiuni constante de 60V (10 mA)
timp de 60 de minute într-un tampon SDS-imidazol (1,0 g/l SDS şi 3,4 g/l imidazol). După finalizarea
electroforezei, gelul se usucă complet la 80oC timp de 20 minute, după care se cufundă pentru 30 minute
într-o soluţie apoasă de colorare alcătuită din: 1,33g/l Coomassie blue, 250ml/l metanol şi 200ml/l acid
acetic. Gelul este decolorat prin cufundare în două băi succesive apoase prima alcătuită din acid acetic,
150ml/l, în timp ce a doua este o soluţie apoasă de glicerol 150ml/l şi se usucă la 80 oC (15 min). Timpul
total de analiză este circa 3,5 ore.
Pe un astfel de gel prelucrat se detectează imunoglobulinele (Mr=850.000-150.000), haptoglobinele
(Mr=86.000), transferina (Mr=76.000), albumina (Mr=66.000), α1-microglobulina (Mr=30.000),
monomeri de catene ușoare (Mr=25.000), proteina de legare a retinolului (Mr=21.000) şi β2-
microglobulina (Mr=12.000). Catenele ușoare policlonale nu pot fi diferenţiate de catenele monoclonale
ușoare, în schimb SDS-AGE diferenţiază proteinuria fiziologică (150 mg/24 h, în principal albumină) şi
proteinuriile renale (glomerulare, tubulare, sau mixte) ori cele de origine prerenală. În figura 3.20. sunt
prezentate profilurile electroforetice a cinci probe.
Catenele monoclonale ușoare (BJP), apar ca o bandă largă și intensă la o masă moleculară de 25.000 D
şi pot fi identificate în absenţa (BJP pură, prerenală) sau în prezenţa proteinuriei renale.
Pe de altă parte, în cazul apariției unor forme polimerice a catenelor ușoare, proba se tratează cu β-
mercaptoetanol, înainte de electroforeză iar după finalizarea electroforezei și a procesării
postelectroforetice, geluri se scanează, iar rezultatele se exprimă ca procent din proteinele totale în g/l.
Limita de detecție pentru o bandă proteică este de 15 mg/l (Le Bricon și colab., 1998).
 Figura 3.20. Profilul electroforetic a cinci probe după SDS-
AGE. De la stânga spre dreapta: 1, proteinurie glomerulară
selectivă: transferină și albumină; 2, BJP prerenală pură:
dimeri ai catenelor ușoare și monomer, înainte de
tratamentul cu β mercaptoetanol; 3, proteinurie mixtă:
imunoglobuline, transferină, albumină, α1- microglobulină
(Alfa-1 µ), monomeri ai catenelor ușoare (policlonali),
proteina de legare a retinolului (RBP) și β2-microglobulină
(Beta-2 µ); 4, BJP prerenală pură: monomeri ai catenelor
ușoare; 5, proteinurie tubulară: mici cantități de albumină,
monomeri ai catenelor ușoare (policlonale) și RBP.
Caracterul monoclonal al catenelor ușoare detectate sunt
confirmate prin imunofixare. După Le Bricon și colab.,
1998.

Se poate spune astfel că SDS-AGE separă proteinele în acord cu masa lor moleculară (figura 3.21.) și
nu necesită o concentrare anterioară a urinei, o îmbunătățire substanțială față de electroforeza de rutină.

Figura 3.21. Migrarea proteinelor urinare în SDS-AGE. Se prezintă profilul markerilor moleculari migrați prin SDS-AGE (A) și
a unui specimen de urină la care s-a evidențiat proteinurie mixtă cu BJP (B). Rf-urile zonelor s-au comparat cu cel al lactalbuminei
(Mr 14.400) și s-a calculat pentru fiecare proteină marker (fosforilază b, Mr=94.000; albumină, Mr=67.000; ovalbumină, Mr=43.000;
anhidrază carbonică, Mr=30.000; inhibitorul tripsinei, Mr=20.000). Pacientul cu mielom multiplu (bărbat; vârstă, 64 de ani; IgG λ
monoclonală) excretă 3,0 g proteină/24h (1,0 g/l), care conține un amestec de albumină (0,3 g/l), IgG (0,1 g/l), L λ (0,48 g/l) și alte
proteine. Banda electroforetică corespunzătoare catenelor ușoare de monomeri reprezintă 20% din proteinuria totală. IgG
monoclonală intactă și BJP λ se identifică prin imunofixare. (După Le Bricon și colab., 1998).
Trebuie însă accentuat că există o serie de limitări ale acestei tehnici: cea mai importantă fiind faptul
că prin utilizarea ei, nu poate să realiza o distincție definitivă între proteinele monoclonale şi cele
policlonale. În absenţa unor leziuni tubulare (în cazul BJP pură sau în proteinuria glomerulară), se
evidențiază întotdeauna banda electroforetică corespunzătoare Mr=25.000 Da, caracteristică BJP, după
cum pe parcursul unei proteinurii tubulare ori mixte, catenele policlonale ușoare se excretă în urină, din
cauza unei insuficiente reabsorbţie tubulare. Cum mielomul multiplu se caracterizează prin leziuni
tubulare, acestea pot conduce la eliminarea unui amestec complex de catene ușoare monoclonale şi
policlonale.
Utilizând SDS-AGE, s-a constatat că o bandă electroforetică cu Mr=25.000 și cu o intensitate mai
mare decât a altor proteine mici (α1-microglobulina, proteina de legare a retinolului şi β2-microglobulina)
sugerează BJP. Pe de altă parte, prezenţa unor concentrații semnificative de catene policlonale ușoare în
specimene de urină pot conduce la o supraestimare a cantității de proteine Bence Jones (Norden și colab.,
1987).
O altă serie de dificultăţi întâmpinate în SDS-AGE sunt asociate cu cuantificarea BJP. Formele
polimerice de catene uşoare prezente în specimenul de urină prezintă benzi electroforetice pale,
caracteristice unei mase moleculare mari (dimeri, tetrameri ori polimeri mri cu o Mr=300.000), în timp ce
în 50% din probele de urină, se observă numai forme dimerice cu Mr=50.000 (Le Bricon și colab., 1998).
Pentru a minimaliza acest fenomen în cazul pacienţilor cu MM se recomandă reducerea specimenelor
urinare cu β mercaptoetanol, înainte de SDS-AGE, în paralel cu de rularea unui marker de depolimerizare,
după cum datele experimentale arată că nu există nici un impact asupra Rf în condițiile tratamentului cu
agent reducător.
SDS-AGE este un instrument eficient în monitorizarea funcţiei renale (Bianchi-Bosisio și colab.,
1991). De exemplu, profilurile proteinelor separate prin această tehnică pot ajuta la identificarea unor
leziuni predominant renale la copii sau vârstnici, fenomen care nu este posibil printr-o simplă biopsie
(Lubega, 1983). S-a arătat că în cazul MM, SDS-AGE diferenţiază uşor proteinuria glomerulară (selectivă
sau neselectivă), de proteinuria tubulară sau mixtă, după cum circa 25% dintre pacienţii diagnosticați cu
mielom prezintă semne de alterare a funcției renale. De altfel, insuficienţa renală (acută sau cronică) este
una dintre complicaţiile majore ale MM (Alexanian și colab., 1990), proces care se observă la aproximativ
50% dintre pacienţii diagnosticați, în cursul evoluției maladiei şi care este asociată cu un prognostic sever.
Fenomenul este însoțit de secreția lanțurilor ușoare care reprezintă un factor esenţial contribuie la
insuficienţă renală a persoanelor suferinde de MM (Alexanian și colab., 1990), deși nu s-a dovedit o
corelație clară între secreția de albumină (identificată prin SDS-AGE) și starea patologică implicată.
În concluzie, SDS-AGE este o tehnică din laboratorul clinic utilizată la urmărirea pacienţilor
diagnosticați cu MM. Ea este caracterizată printr-o înaltă rezoluţie, sensibilitate şi reproductibilitate.
Comparativ cu electroforeza clasică pe gel de agaroză, SDS-AGE combină simplitatea (nu este nevoie de
o concentrare prealabilă a urinei) cu sensibilitatea crescută în detecția BJP. Astfel, prin intermediul
determinării semicantitative ale BJP, metoda este utilă în monitorizarea progresiei maladiei la pacienți. În
plus, profilurile electroforetice glomerulare, tubulare ori mixte se identifică ușor pe gelul de agaroză, după
SDS-AGE, deși interpretarea lor electroforegramelor cere o experiență în domeniu, mai ales în cazul
evitării unor capcane, în special în ceea ce priveşte existența catenelor ușoare polimerizate ori prezenţei
unor catene ușoare mono-şi/sau policlonale în specimenele de urină, la pacienţii diagnosticați cu MM. În
unele cazuri detecția unor concentrații scăzute ale proteinelor Bence Jones prin SDS-AGE poate fi ușor
mai sensibilă decât imunofixarea.
3.5.2.7. Electroforeza proteinelor: acetat de celuloză vs gel de agaroză, inspecție vizuală vs
densitometrie
În laboratoarele de specialitate, o mare parte dintre separările electroforetice de proteine plasmatice se
realizează pe acetat de celuloză. După unii autori, se consideră că utilizarea agarozei ca mediu suport
combinată cu o inspecţie vizuală a electroferogramelor pare să aibă o eficacitate mare şi astfel să
dovedească utilitatea sa clinică (Jeppson și colab., 1979). Astfel, electroforeza pe acetat de celuloză, dacă
este procesată corect (50 mmol/l tampon barbiturat, pH=8,6, cu sau fără lactat de calciu (2 mmol/l) şi
colorată cu Amido Black, ori cu Coomassie Brilliant Blue R 250, cu o migrare a albuminei pe o lungime
de 5 cm şi o analiză vizuală a benzilor conferă rezultate credibile (Aguzzi, 1980; Tarantino și colab.,
1980). Mai mult, prin intermediul tehnicii de imunosubtracție (Aguzzi și Poggi, 1977) ori imunofixare,
este posibil să se evalueze semicantitativ prealbumina, albumina, α1-antitripsina, α2-macroglobulina,
haptoglobina, transferina, C3, şi imunoglobulinele (Aguzzi și colab. 1978).
Ojala şi Weber (1980) au introdus scanarea densitometrică după electroforeza pe acetat de celuloză.
Această procedură de evaluare oferă avantaje de cost, simplitate, şi de viteză, în comparaţie cu
electroforeza pe gel de agaroză, datele numerice furnizate fiind mai fiabile decât interpretarea vizuală
realizată de clinician.
Pe de altă parte, Jeppsson şi Laurell (1980) consideră că separarea pe gel de agaroză este superioară
celei realizate pe folie de acetat de celuloză în termeni de rezoluţie şi de utilitate clinică. Studiul cu privire
la identificarea componentelor monoclonale (Merlini și colab., 1981) realizat în probe complexe (100 de
eşantioane, 39 din care conţineau două sau mai multe componente monoclonale) prin analiza numărului de
benzi monoclonale pe gel de agaroză (Jeppsson și colab., 1978) comparativ cu identificarea pe acetat de
celuloză, arată că rezoluția obținută pe folii de acetat, dacă procedura este realizată corect, nu este
semnificativ mai mică decât cea obținută prin electroforeză pe gel de agaroză. Mai mult, inspecţia vizuală
a electroforegramelor pe folie de acetat de celuloză a profilului proteic asupra unui lot heterogen de 1003
persoane (Aguzzi și colab., 1980) care au inclus persoane sănătoase (inclusiv femei gravide şi copii) ori
persoane suferinde de diverse maladii clasificate, a confirmat diagnosticul, ceeaq ce a arătat utilitatea sa
clinică.
 3.5.2.8. Electroforeza hemoglobinelor
Hemoglobina este o proteină tetramerică compusă din două perechi de lanţuri de globină identice şi
patru grupări de hem. Hemoglobina fetală (Hbf), formată din catene α și γ, este în mod normal, prezentă la
naştere, fiind înlocuită de hemoglobina A0 (HbA0), hemoglobina dominantă la adulţi, compusă din catene
C α și γ.
În unele segmente ale populaţiei, există variante transmise genetic ale hemoglobinelor care conduc la
probleme grave de sănătate. De exemplu, înlocuirea restului de valină din poziția a șasea a catenei β, cu
unul de glutamină conduce la formarea de hemoglobină S (HbS), care este responsabilă pentru forma de
seceră a hematiilor. În alte cazuri, sinteza fie a lanțului α ori β a globinei este redusă sau absentă.
Talasemia (α și β) este o boala genetica care se transmite ereditar autozomal dominant. Leziunea genetică
realizează o anomalie de reglare cantitativă a sintezei diverselor catene polipeptidice ale globinei denumite
generic “hemoglobinopatii cantitative”, la care starea homozigotă sau combinaţiile de oricare două
anomalii poate duce la manifestări clinice, in special in timpul sarcinii, în diverse situații chirurgicale, sau
în alte situaţii critice (Regnier, 1987).
Depistarea și stabilirea diagnosticului de certitudine al sindroamelor talasemice se realizează pe baza
unei metode de laborator – a electroforezei hemoglobinei, deoarece o modificare în structura chimică față
de cea normală, are drept consecință modificarea sarcinii electrice, care va conduce la o migrare diferită
într-un câmp electric a fracțiunilor respective, alături de alte analize hematologice (analiza frotiului de
sânge periferic, care prezintă în majoritatea cazurilor semnele clasice citologice ale unui sindrom
talasemic) și în asociere cu hemoleucograma precum și alți parametrii biochimici.

Figura 3.22. Gel de agaroză preturnat pentru electroforeza

hemoglobinei. În poziția 2 se observă prezența unei benzi in zona de
migrare a hemoglobinei fetale, evidențiată în panelul din dreapta, după
scanare. (După Dima, 2009).

În practica de laborator, se utilizează gel preformate de agaroză, cu ajutorul cărora se determină

hemoglobinele normale HbA1α2β2, HbA2α2δ2, HbFα2γ2 și hemoglobinele majore-variantele S sau D ori
C sau E. Scăderea sintezei unuia dintre lanțurile α sau β evidențiate pe gel pune diagnosticul de talasemie.
Figura 3.22. exemplifică modul de diagnostic a unei talasemii minore la un pacient în vârstă de un an și
5 luni și unde se evidențiază prezența unei benzi de hemoglobină fetală (HbA1 + F = 96,8% și HbA2 =
3,2%).
3.5.2.9. Electroforeza fragmentelor de ADN în gel de agaroză
Încă de la începutul tehnicilor electroforetice s-a axiomat faptul că moleculele care transportă o sarcină
electrică vor migra într-un câmp electric într-un mod previzibil. Atunci când este supusă unui câmp
electric, o moleculă care transportă o sarcină netă negativă va migra spre polul pozitiv, în timp ce o
moleculă încărcată cu o sarcină netă negativă va migra spre polul negativ. Într-o matrice semisolidă
precum cea a gelului de agaroză, ecuaţia care descrie mobilitate pot fi reinterpretată, cel puţin euristic, prin
definirea densității gelului (sau a concentrației sale) și de mărime a moleculei care se separă.
Acizii nucleici sunt polimeri alcătuiți din unităţi nucleotidice, conectate prin intermediul legăturilor
diester-fosfat la scheletul zaharidic, cu efect net în a oferi macromoleculelor o sarcină netă negativă.
Astfel, atunci când astfel de macromolecule sunt plasate în matricea semi-solidă a unui gel, ele vor
migra spre polul pozitiv într-un mod previzibil şi reproductibil, procesul putând fi descris ca o funcţie
exponenţială negativă a lungimii acestora. Altfel spus, moleculele mai scurte vor migra mai repede în timp
ce moleculele mai mari (mai lungi) vor migra mai lent. Într-adevăr, în cazul unui acid nucleic, aflat într-un
câmp electric uniform, orice alt element al expresiei migrării sale este o constantă, iar mobilitatea sa este
complet determinată de mărimea moleculei (a cărui masă moleculară se exprimă în daltoni sau în perechi
de baze-base pair, bp; de fapt nucleotide, unde o pereche de baze este aproximativ egală cu 660 daltoni).
Metoda de separare este deosebit de simplă, rapidă și sensibilă fiind utilizată în mod curent la separarea,
identificarea și purificarea fragmentelor de acizi nucleici.

Figura 3.23. Mobilitatea electroforetică a fragmentelor de restricție a ADN într-

un gel de agaroză. DNA provine din bacteriofagul lambda în urma digestiei cu
enzima de restricție Hind III. Graficul arată că distanța de migrare în centimetri
în funcție de mărimea în perechi de baze a fragmentului separat (după Devor,
2005).

Din punct de vedere practic, intr-un gel de agaroză, este dificil să se rezolve cu precizie acizi nucleici
dubli catenari mai mici de aproximativ 100 de baze, deoarece proprietatea de cernere moleculară a
agarozei nu este suficient de pregnantă. Pe de altă parte, macromoleculele cu masă moleculară
aproximativă cuprinsă între 25.000 bp și 2.000.000 bp vor migra în gel cu viteze diferite, datorită limitării
mobilității lor. Macromoleculele de acizi nucleici mai mari de 2.000.000 bp nu vor putea penetra un gel
convențional de agaroză. Se poate spune astfel că domeniul efectiv de mărime pentru electroforeza
fragmentelor de acizi nucleici dublu catenari pe un gel convențional de agaroză este între 100 bp și 25.000
de bp. În acest interval comportamentul macromoleculei este precis şi previzibil (figura 3.23).

Figura 3.24. Separarea fragmentelor de ADN de dimensiuni diferite prin

electroforeză pe gel vertical. Gelul este preparat prin turnarea agarozei topite sau a
acrilamidei nepolimerizate între două geamuri de sticlă aflate la o distanță de
câțiva milimetrii. După solidificarea agarozei ori polimerizarea acrilamidei se
formează o matrice de gel, a cărei pori depinde de concentrația de gel sau de
acrilamidă utilizată. Deoarece porii sunt mai mari în gelurile de agaroză decât în
cele de poliacrilamidă, cel din înainte este utilizat la separarea fragmentelor mari
de ADN (între 500 și 20 kb) în timp ce al doilea se utilizează la separarea
fragmentelor mici (de la o nucleotidă, până la 2 kb). Amestecul de fragmente de
ADN care urmează a fi separat este depus într-un godeu din partea superioară
după care se aplică un câmp electric prin gel. Fragmentele de ADN se mișcă spre
polul pozitiv cu o viteză invers proporțională cu logaritmul lungimii lor formând
benzi care pot fi vizualizate prin autoradiografie (dacă fragmentele sunt
radiomarcate) ori prin adăugare de colorant fluorescent de tipul bromurii de etidiu;
în acest ultim caz, agaroza lichefiată este lăsată să se solidifice pe un suport de
sticlă sau plastic orizontal (după Lodish și colab., 2000).

În anii ‘80, a fost elaborată o ipoteză prin care se considera că acizi nucleici migrează prin gel
asemănător mișcării ondulatorii a unui şarpe. Astfel macromolecula se mișcă în față și trage restul de de
catenă după ea.
În acest model, cu cât molecula este mai mare, cu atât ea interacționează mai puternic cu matricea de
gel și astfel întâmpină o rezistenţă mai mare din partea acestuia (creşterea rezistenţei gelului fiind
neliniară) ceea ce are ca efect o mărire a timpului său de staționare într-o zonă anumită. Acest model,
numit „mișcare șerpuitoare”, este suficient pentru a explica tot comportamentul unui acid nucleic într-o
matrice de semi-solidă (Lerman et al., 1982; Lumpkin et al., 1985). De altfel, în anul 1989 un grup de
cercetători de la Universitatea din Washington, au testat această teorie, filmând macromoleculele de ADN
care se deplasează printr-un gel de agaroză. Înregistrarea a arătat atât mișcarea ondulatorie, sigmoidală, cât
și interacțiunile dintre un acid nucleic și matricea gelului de agaroză (Smith și colab., 1989; de Gennes,
1979). În figura 3.24. este prezentată separarea unor fragmente de ADN de dimensiuni diferite prin
electroforeză pe un gel vertical.
Cum matricea de gel restricționează difuzia întâmplătoare a moleculelor, moleculele cu lungimi
diferite se separă în zone discrete („benzi”) a căror lățime este egală cu lățimea godeului unde s-a plasat
amestecul original de acid nucleic (figura 3.25).

Figura 3.25. Analiza unor fragmente de ADN după separare electroforetică pe gel de
agaroză. Prima linie conține fragmente cu masă moleculară cunoscută de ADN obținute
în urma digestiei cu o enzimă de restricție a unui ADN cunoscut. Celelalte patru linii
arată diverse fragmente cu mărimi diferite prezente în probe.

Se poate spune astfel că mobilitatea unui fragment de acid nucleic (în speță de ADN) este funcție de
(1) masa moleculară, (2) câmpul electric aplicat, (3) compoziția nucleotidică, (4) temperatura de lucru și
(5) soluția de tampon utilizată la separare. De altfel, deplasarea moleculelor liniare de ADN se realizează
cu o viteză invers proporțională cu logaritmul masei lor moleculare.
Pe de altă parte, conformația ADN explică mobilitățile diferite la mase moleculare egale. Astfel, ADN
posedă o serie de conformații: (1) circular închisă (covalentry closed circle), (2) supraînfășurată
(supercoiled), (3) circular deschisă (open circular), (4) liniară (figura 3.26), mobilitățile electroforetice a
acestor forme find date de condițiile de separare.

Figura 3.26. Diverse conformații ale ADN.

Pentru vizualizarea postelectroforetică a fragmentelor de acizi nucleici se utilizează tehnici

autoradiografice (dacă fragmentele sunt radiomarcate) ori prin adăugare
de colorant fluorescent de tipul bromurii de etidiu (figura alăturată).
Bromura de etidiu, este o moleculă planară care se intercalează în
structura ADN, între bazele azotate iar buclele supraînfășurate încărcate
cu sarcină negativă ale conformației circular închise se desfac. În aceste
condiții mobilitatea electroforetică se
reduce semnificativ iar la concentrații
de 0,1-0,5 µg/ml colorant, toate
buclele înfășurate sau supraînfășurate
sunt desfăcute. Din același motiv bromura de etidiu reduce mobilitatea
conformațiilor circular închise și liniare. De asemenea, legarea
bromurii de etidiu la macromoleculă conduce la amplificarea
fluorescenței intrinseci și are ca rezultat, în condițiile iluminării gelului
cu lumină ultravioletă, evidențierea regiunilor de gel care conțin ADN,
printr-o strălucire mai crescută comparativ cu regiunile de gel care nu conțin macromoleculele separate.
ADN marcat radioactiv poate fi vizualizat prin autoradiografia gelului, când fragmentele de acid
nucleic radiomarcat pot fi detectate, prin analiza particulelor β eliberate. În acest caz, gelul este depus în
contact cu un film fotografic, la întuneric; astfel expus, filmul va indica pozițiile fragmentelor de ADN
marcat. După developarea filmului se obține imaginea fotografică a fragmentelor de acid nucleic iar datele
astfel achiziționate se pot stoca în computer și pot fi convertite într-o imagine asemănătoare unei
autoradiograme.
Dacă compoziția nucleotidică nu influențează în mod semnificativ mobilitatea electroforetică, în
schimb concentrația de agaroză este esențială: cu cât concentrația de gel este mai mare, cu atât mobilitatea
fragmentelor de ADN este mai mică. Astfel, prin folosirea gelurilor în gradient de concentrație este
posibilă separarea ADN de diferite mărimi, în afara intervalului de mase moleculra mai sus menționate.
Aparatura utilizată este de obicei orizontală, asemănătoare celei utilizate la electroforeza proteinelor.
Este de asemenea necesar un redresor de curent cu o intensitate de 100 mA și o tensiune de 100V, iar
pentru evidențiere postelectroforetică a fragmentelor de ADN după colorare cu bromură de etidiu, de o
lampă UV prevăzută cu un filtru de 300 nm. Pentru a obține o rezoluție bună, căderea de tensiune între
bornele aparatului de electroforeză trebuie să fie de circa 5V/cm. În general, la diferențe mici de potențial,
mobilitatea fragmentelor lineare de ADN este proporțională cu intensitatea câmpului electric. De obicei se
lucrează la temperatura camerei, cu toate că pentru geluri cu o conentrație de agaroză mai mică de 0,5%,
se recomandă migrarea la o rece (4oC).
Majoritatea protocoalelor de lucru recomandă tamponul Tris, 50mM, pH=7,5-7,8 drept optim în ceea
ce privește tăria ionică și capacitatea de tamponare.
Tehnica de lucru pentru electroforeza submersă (figura 3.27) a fragmentelor de acizi nucleici, de obicei
utilizează o agaroză cu o electroosmoză standard (-mr = 0,13) sau mică (-mr = 0,07), care se prepară
asemănător celor de amidon, iar după solidificare se plasează pe platforma cuvei unde se acoperă cu
tampon, cu un strat acoperitor de circa 1 mm. La trecerea unui curent electric, rezistența electrică a
stratului de soluție tampon este aproape egală cu cea a gelului și astfel, cea mai importantă parte a
curentului aplicat va trece prin gel.

Figura 3.27. Tehnica de separare a acizilor nucleici în

sistem submersă.

Această tehnică este numită electroforeză cu gel scufundat (submers) și este cea mai utilizată procedeu
de analiză electroforetică a fragmentelor de ADN (Grierson, 1990; Sealey și Southern, 1990). Calculul
voltajului se realizează prin asumarea faptului că în sistemele electroforetice submarine, numai
aproximativ 80% din curent trece prin gel, căderea de tensiune (V/cm) poate fi estimată prin relația:

3.5.2.8.1. Electroforeza în câmp electric pulsator a fragmentelor de ADN

Principiul metodei este reprezentat de faptul că fragmentele de ADN sunt obligate să-și schimbe
periodic direcția de deplasare ca urmare a schimbării direcției câmpului electric. Intervalul de timp pentru
migrare într-o direcție sau alta determină limita superioară a dimensiunii fragmentelor de ADN care se vor
separa distinct. Dependența de timp este aproape liniară: la frecvențe de timp de 0,1 secunde, se separă
fragmente mai mari de 10 Kbp, în timp ce la intervale de timp de o oră, se vor separa fragmente de circa 1
Mbp. Timpul necesar separării prin electroforeză în câmp pulsator este cuprins între 20 și 80 de ore, în
condițiile în care gelul de agaroză are o concentrație de 0,5-1% (de Lencastre și colab., 1994).
Tehnica a fost dezvoltată la mijlocul anilor `80 ca tip de metodă de analiză electroforetică a
moleculelor de acizi nucleici în domeniul de mărime care nu limitează mobilitatea. Soluția a implicat
introducerea unei mobilități dependente de mărimea macromoleculelor prin alterarea câmpului electric.
Primul tip de modificare implică simpla schimbare de polaritate a câmpului
electric într-o manieră regulată. Carle și colab. (1986) au arătat că o
schimbare periodică a polarității va induce moleculelor (chiar pentru cele
mai mari) din matricea de gel, o mișcare de întoarcere în forma literei U,
această întoarcere permițând separarea lor. Dacă lungimea timpului de
schimbarea polarității și de reversare a direcției de migrare electroforetică a
moleculelor este de aproximativ o treime din timpul de mișcare spre înainte,
ele se vor putea separa în câteva ore, pe agaroză standard. Prima
demonstrație practică a acestei metode, denumită ”electroforeză în câmp
inversat” (Field Inversion Gel Electrophoresis-FIGE), a rezolvat complet,
printr-o migrare de o secundă înainte urmată de o secundă înapoi,
macromolecule cu o masă molecurară de 2.000.000 bp precum cromozomii intacți din drojdia de bere
(Carle și Olson, 1984). Din acel moment s-au dezvoltat o varietate de metode, în mod obișnuit denumite
”electroforeză în câmp pulsator” (Lai și colab., 1989; Devor, 2005). Prin aceste tehnici cele mai mari
macromolecule de acizi nucleici cu o lungime cuprinsă între 2•104 la 107 bp (20 kb la 10 megabp, Mb), se
pot separa, în funcție de masa lor moleculară. Dacă prin metoda clasică, convențională se pot separa
fragmente de ADN de până la 20 kbp cu rezoluție bună, cele până la 40 kbp cu rezoluție satisfăcătoare,
pentru separarea fragmentelor până la 500 kbp se rezolvă cu rezoluție slabă, într-un gel de agaroză foarte
fragil cu o concentrație de 0,1% (Fangman, 1978).
Separarea prin electroforeză în câmp pulsator depinde de comportamentul singular al moleculelor mari
de DNA într-un câmp electric care este pornit și inversat (pulsat) la intervale mici de timp. În condițiile în
care se aplică un câmp electric unor macromolecule de acid nucleic mare aflate într-un gel, acestea vor
migra în direcția câmpului electric și de asemenea se vor întinde pe toată lungimea lor. Dacă curentul este
stopat, moleculele încep să se “relaxeze” prin înfășurări întâmplătoare. Timpul necesar pentru relaxare este
direct proporțional cu lungimea moleculei. Câmpul electric este apoi reaplicat într-un unghi de 90° ori
180° față de prima direcție. Moleculele mai mari se relaxează mai puțin decât moleculele mai scurte în
momentul în care curentul este oprit. Cum moleculele se rearanjează prin înfășurări întâmplătoare înaintea
mișcării lor într-o nouă direcție, moleculele mai mari încep să se miște în direcția nouă impusă mai lent
decât cele mai scurte. Această alternare repetată a direcției câmpului electric forțează macromoleculele de
diferite mărimi să se îndepărteze mai mult și mai multe între ele.
Electroforeza în câmp pulsator este foarte importantă în purificarea moleculelor mari de ADN, până la
≈107 bp în lungime. Tehnica este necesară pentru analiza cromozomilor celulari de la 5•10 5 bp (cel mai
mic fiind cromozomul de la drojdie) până la aproximativ 2-3•108 bp (cromozomii animali și de plante).
Din această cauză, cromozomii cei mai mari trebuie în prealabil digerați în fragmente de 10 7 bp, ori mai
mici, înainte de analiză, proces realizat cu ajutorul enzimelor de restricție care taie la situsuri bine-
specificate (Lodish și colab., 2000). Temperatura de lucru este de 14-15oC, la o cădere de tensiune de 2,5-
10V/cm, în sistem submers.
Dintre aparatele descrise (figura 3.28), cele mai bune rezultate se obțin la aparatele la care unghiul
format de cele două direcții ale câmpului electric este de 90 o. Astfel, placa electroforetică este de obicei
pătrată, cu dimensiuni de 140 x 140 mm, iar cuva electroforetică este de obicei rectangulară, fiind
prevăzută cu un sistem de răcire și recirculare a tamponului (de obicei se utilizează tamponul TBE:Tris
(65 mM Tris-HCl), borat (22,5 mM acid boric), EDTA (1,25 mM), pH=9,0 (El-Osta și colab., 2002).
Sursa de curent continuu este un redresor de 400-500mA, cu un sistem automat de schimbare a
polarității, etalonat între 0,1 secunde și 1000 secunde. La unele aparate există dispozitive automate de
schimbare a poziției plăcii cu gel. Câmpul electric aplicat poate fi uniform pe o direcție, neuniform pe
cealaltă direcție, neuniformă pe ambele direcții, uniformă pe ambele direcții, iar deplasarea netă este dată
de diferența dintre două cicluri.
Mobilitatea moleculelor de ADN este în funcție de (1) tensiunea (diferența de potențial) aplicată, (2)
temperatura de lucru, (3) frecvența schimbării direcției câmpului electric și (3) de soluția de tampon
folosită, din care cauză trebuie identificată combinația optimă tensiune/temperatură (rezoluția de separare
scade odată cu creșterea temperaturii și a tensiunii, deși viteza de migrare electroforetică crește). Din
această cauză, se recomandă schimbarea frecvenței ciclurilor de cel puțin două ori în timpul separării.

Figura 3.28. Reprezentarea schematică a unor tipuri diverse de aparate utilizate

în electroforeza acizilor nucleici în câmp pulsator.
 Asemănător vizualizării fragmentelor mici de ADN și în acest caz gelul poate fi colorat cu bromură de
etidiu (1 µg/ml), când fluorescența intens-orange a colorantului intercalat în molecula de ADN dublu
helicală conduce la cuantificarea a minimum 50ng de compus. Pe de altă parte, prin această tehnică, este
oarecum dificil a se determina masă moleculară cu toate că se pot utiliza markeri de masă.
Dintre aplicațiile electroforezei în câmp pulsator se pot enumera obținerea hărților genetice, (a
librăriilor metagenomice), a cariotipului electroforetic la drojdii (Sacharomices cerevisiae, Candida
albicans) ori la protozoare (Giardia intestinalis). Tehnica s-a utilizat în studiul genomului uman, la analiza
unor regiuni implicate în maladii cunoscute precum complexul major de histocompatibilitate, de analiză a
genei distrofiei musculare Duchenne (unde s-a pus la punct un test molecular de diagnostic în cazul
femeilor ”vector” purtătoare a genei defecte și astfel de diagnostic prenatal în familii cu risc crescut).
Se poate spune că apariția electroforezei în câmp pulsator a contribuit semnificativ la dezvoltarea
biologiei moleculare.
Dintre dezavantaje se pot enumera (1) timpul mare de izolare a ADN și de tratament cu enzime de
restricție, procese care preced electroforeza, dezavantaj major al analizelor de macrorestricție prin
intermediul electroforezei în câmp pulsator. Astfel, un protocol standard durează cinci-șase zile până la
evaluarea rezultatelor (Stolle și colab., 2001).
Pe de altă parte, metodele de comparare a întregului genom, precum electroforeza în câmp pulsator ori
de analiză a polimorfismelor lungimii fragmentelor de restricție nu sunt în general desemnate detectării
alterărilor genetice de mici dimensiuni, ele fiind capabile să detecteze inserțiile și delețiile de mari
dimensiuni. În schimb, electroforeza bidimensională a ADN este o tehnică care are potențialul de a detecta
chiar și în câteva minute mutații punctiforme în absența unor date de secvențiere pre-existente. Această
tehnică a fost descrisă pentru prima dată de către Fisher și Lerman (1979), care au utilizat două
dimensiuni pentru a expune genomul unui lisogen lambda la E. coli și de a identifica inserția fagului de 48
kbp. Pe scurt, genomul ADN este digerat cu o enzimă care taie frecvent iar fragmentele sunt rezolvate pe
baza masei lor moleculare pe gel de agaroză sau acrilamidă. Fragmentele sunt apoi separate, în a doua
dimensiune pe baza compoziției lor utilizând electroforeza în gradient de denaturare, tehnică utilizată în
mod extins la identificarea mutațiilor punctiforme (Fodde și Losekoot, 1994; Muyzer și Smalla, 1998;
Malloff și colab., 2003).
3.5.2.10. Microelectroforeza proteinelor în gel de agaroză
Această metodă se aplică la separarea proteinelor. Gelurile se prepară pe lame de microscop (25 x 75
mm) din agaroză cu o concentrație de 0,5-2%, formându-se un strat de circa 1,7 mm; proba care se aplică
are un volum de 1 µl, iar migrarea se realizează la o diferență de potențial electric de 25V/cm. Datorită
gradientului mare de tensiune și pentru a se obține o rezoluție foarte bună, camera de separare
electroforetică este prevăzută cu un sistem de răcire.
Microelectroforeza în gel de agaroză se poate utiliza și la separarea acizilor nucleici, microgelurile
recomandîndu-se în special când este necesar un răspuns rapid, înaintea pasului următor, într-un
experiment de clonare.
3.1.3. CONCLUZII
Deși utilizarea poliacrilamidei ca mediu-suport electroforetic în analiza celor mai multe proteine și
glicoproteine în locul celui de agaroză a condus la eclipsarea ultimului, deși acesta rămâne de neînlocuit în
aplicații de tipul procedurilor imunoelectroforetice, în special în cele care necesită trepte de imunodifuzie
(imunotipare și imunofixare), în separarea moleculelor foarte mari cu o rază hidrodinamică mare de
aproximativ 5–10 nm, de tipul anticorpilor, lipoproteinelor, o serie de proteine de membrană, acizi
nucleici și virusuri, unde este nevoie de geluri cu pori mari, practic nerestrictive.
Gelurile de agaroză cu toate că sunt relative rigide sunt mai puțin elastice decât cele din poliacrilamidă
și din această cauză nu sunt ușor de manipulat, necesitând o grijă în manipulare. Electroforeza proteinelor
plasmatice nu necesită o agaroză înalt purificată, mai importantă fiind calitatea de reproductibilitate de la
un lot de producție, la altul.
Gelurile de agaroză sunt astăzi indispensabile în laboratoarele de biologie moleculară și genetică.
 3.6. ELECTROFOREZA PROTEINELOR PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ
Electroforeza zonală a devenit extrem de populară la începutul anilor ‘60, odată cu introducerea
matricelor de poliacrilamidă și cu descoperirea conceptului de tampoane discontinue. Astăzi, aplicațiile
unor astfel de matrice electroforetice nu se limitează numai la disc-electroforeză, electroforeză pe geluri
plane verticale, în gradient de pori și electroforeză în prezență de dodecilsulfat sau în electroforeza zonală
capilară, ci și la cel puțin două tehnici importante în analiza acizilor nucleici: secvențierea ADN ori
electroforeza în gradient de temperatură.
Poliacrilamida (în marea majoritate a aplicațiilor electroforetice este vorba de copolimerul acrilamidei
cu bisacrilamida) a fost inițial utilizată în industria materialelor plastice și a firelor și fibrelor sintetice, în
procesele de obținere a hârtiei, la tratarea apelor potabile sau la epurarea celor uzate precum și la
imobilizarea enzimelor ori a microorganismelor. Ca mediu suport electroforetic ea a fost introdusă în
laboratorul de biochimie de către Raymond și Weintraub (1959).
Popularitatea gelurilor de poliacrilamidă provine dintr-o serie de proprietăți fundamentale ale acestora:
 clarite optică, inclusiv transparență în lumină ultravioletă (UV=280 nm), cu toate că ele absorb
puternic la 210 nm, o regiune la care răspund legăturii peptidice; astfel, utilizarea sa nu este recomandată
ca polimer de separare și în continuare de analiză a proteinelor ori a polipeptidelor la această lungime de
undă, în electroforeza capilară. De altfel, pentru astfel de scopuri sunt disponibili comercial alți polimeri
transparenți la această regiune de UV precum celuloza (care astfel este preferată) ori alți copolimeri
sintetici care permit formarea gelurilor transparente la lungimi de undă cuprinse în domeniul ultraviolet
(260 și 280 nm), permițând scanarea directă în scopul identificării acizilor nucleici ori a proteinelor.
 neutralitate electrică, dată de absența grupărilor încărcate electric;
 disponibilitate într-o mare varietate a mărimii porilor.
Alte avantaje ale utilizării gelurilor de poliacrilamidă sunt:
 puterea mare de rezoluție;
 reproductibilitatea crescută;
 posibilitatea controlului dimensiunilor porilor pe un domeniu larg;
 inerția și stabilitatea chimică la variații mari de pH, temperatură, forță ionică;
 marea rezistență și flexibilitate, proprietăți mecanice bune, ceea ce creează un avantaj față de gelurile
din agar, agaroză ori amidon.
Sursele comerciale furnizează acrilamidă și N,N'-metilen bisacrilamidă cu o puritate suficientă care
permite utilizarea lor fără a fi nevoie de o etapă de purificare. În plus, o serie de firme furnizează
copolimerii (acrilamidă și bis acrilamidă) în formă premixată (în amestec), gata pentru reacția de
polimerizare.
Dintre dezavantajele utilizării acrilamidei se pot enumera: neurotoxicitatea, cancerogenitatea, la
contactul cu pielea, componentele amestecului de polimerizare pot cauza iritații. În plus,
reproductibilitatea depinde de puritatea reactivilor și a condițiilor de lucru. Ca regulă, componentele
trebuie să fie stocate în vase închise la culoare, la frigider. Odată ce monomerii au fost dizolvați durata de
viață a soluției este de aproximativ trei luni. Este recomandat ca pH-ul soluției să fie măsurat periodic
deoarece odată cu îmbătrânirea soluției, pH-ul va crește. Altfel spus, o soluție veche va necesita un timp
mai crescut de polimerizare, fenomen care indică deterioararea monomerilor.
Acrilamida (amida acidului acrilic, 2-propen amida) este o pulbere albă, ușor solubilă în apă, solubilă
în solvenți polari (etanol, acetonă, cloroform) și insolubilă în solvenți nepolari
(tetraclorură de carbon, n-heptan). Ea își păstrează proprietățile chimice timp
îndelungat dacă este păstrată corespunzător. Dacă este expusă la lumină, are loc o slabă
polimerizare, formându-se mici cantități de poliacrilamidă. Amida acidului acrilic se
prepară fie prin sinteză chimică, prin hidroliza acrilonitrilului, fie prin biosinteză (se
utilizează tulpini din genurile Cornynebacterium ori Nocardia, care posedă o activitate
nitrilazică și în consecință produc acrilamidă cu un randament de foarte mare odată
cultivate pe mediu care conține acrilonitril, la o temperatură de 15 oC.
Acrilamida se purifică prin recristalizare din cloroform sau soluții alcoolice la o temperatură de 60oC.
Astfel obținută produsul este apt pentru a fi utilizat în tehnici de tipul focalizării izoelectrice ori în alte
proceduri unde sunt necesare geluri foarte subțiri.
Structurile chimice ale unor monomeri acrilamido N-substituiți utilizați la prepararea gelurilor de
poliacrilamidă sunt prezentați în tabelul 3.6.
Tabelul 3.6. Structura chimică a unor monomeri acrilamido N-substituiți utilizați la prepararea gelurilor de poliacrilamidă utilizate în
electroforeză (după Righetti și colab., 1981; Righetti și Gelfi, 1996).
Denumire Formula chimică Masă moleculară

N,N-Dimetilacrilamidă (DMA) 99

N-Acriloil-2-amino-2-hidroxi metil-l,3-propan
175
(Trisacryl)

N-Acriloil morfolină 141

235
N-Acriloil- 1-amino- 1-deoxi D-glucitol

159
N-Acriloil amino etoxi etanol

N-Acriloil amino propanol 129

Prin modele structurale geometrice, statistice şi termodinamice uu fost descrise proprietățile probabile
ale gelurilore. Astfel, geluri hidrofile sunt considerate acele structuri tridimensionale care prezintă o reţea
de lanţuri polimerice flexibile, în interstiţiile cărora macromolecule sunt forţate să migreze datorită
diferenţei de potenţial aplicată, în conformitate cu o partiţie guvernată de factori sterici. Molecule mari pot
penetra numai în regiunile în care ochiurile rețelei sunt mari, în timp ce molecule mici îşi găseasc drumul
în regiuni înguste ale structurii tridimensionale, chiar în apropierea legăturilor reticulate. Probabil că cel
mai bun mod de a imagina o matrice hidrofilă este de a considera ca aceasta este compusă din două
compartimente interconectate lichide care au coeficienţi de frecare diferiți. Indiferent cum am descrie
structura de gel, trebuie amintit că, în general, agarozele sunt mai poroase decât poliacrilamidele şi că
aceste două matrice folosite în separări electroforetice se completeze reciproc.

3.6.1. AGENȚI DE RETICULARE

Cel mai folosit agent de reticulare, utilizat la obținerea gelurilor de poliacrilamidă
este N,N’metilen bisacrilamida (bis). Această substanță, din punct de vedere fizico-
chimic, aceasta are o culoare albă, nu are miros și posedă o masă moleculară de
154,17g. Ea se purifică asemănător acrilamidei.
Din punct de vedere structural, bisacrilamida este produsul de condensare rezultat
din două molecule de acrilamidă și o moleculă de formaldehidă, după următoarea
reacție:
 Tabelul 3.7. Structura chimică a unor agenți de reticulare utilizați la prepararea gelurilor de poliacrilamidă utilizați în electroforeză
(după Righetti și colab., 1981; Righetti și Gelfi, 1996).
Denumire Structura chimică Masa moleculară Lungimea catenei

N,N'-Metilen bisacrilamidă
154 9
(Bis)

Etilen diacrilat (EDA) 170 10

N,N'-(1,2-Dihidroxietilen)
200 10
bisacrilamidă (DHEBA)

N,N'-Dialiltartardiamidă
228 12
(DATD)

N,N',N"-Trialil citric triamidă

309 12-13
(TACT)

Polietilen glicol diacrilat 200

214 13
(PEGDA20o)

N,N'-Bisacrililcistamină (BAC) 260 14

Polietilen glicol diacrilat 400

400 25
(PEGDA400)

N-Bis-acrililpiperazină (BAP) 194 10

 De pe daltă parte, versatilitatea poliacrilamidei este demonstrată de numărul mare de agenți de
reticulare care, alături de bisacrilamidă pot fi folosiți la pregătirea unor geluri cu proprietăţi specifice,
utilizate în scopul unor separări electroforetice specifice (tabelul 3.7). Dintre aceștia amintim:
 N,N’Cistaminbisacrilamida - utilizată la prepararea gelurile de acrilamidă solubilizabile; înlocuiește
echimolecular bisacrilamida, trecerea gelurile în stare de sol realizându-se cu ajutorul unor agenți
reducători ai legăturii disulfurice (-S-S-) precum 2 mercaptoetanolul, ditiotreitolul sau ditioeritriolul.
 Diacrilpiperazina (N-Bis-acrilil-piperazină, BAP)-se sintetizează relativ ușor și este foarte solubilă în
apă. Ea formează geluri cu conductibilitate mai mare decât cele obținute prin copolimerizarea acrilamidei
cu bisacrilamidă, ultima neumflându-se prea puternic în apă, iar în prezența dodecilsulfatului de sodiu
dimensiunile porilor se reduc aparent. Prin utilizarea gelurilor care conțin acest agent de reticulare,
separarea și detecția proteinelor este îmbunătățită, iar transferul proteinelor pe membrane de nitroceluloză
este mai eficient.
 N,N’ Dialiltartratdiamina -formează geluri care își măresc volumul cu aproximativ 30% în apă. Ele
sunt solubile în acid periodic sau periodat de potasiu. Gelurile formate cu acest agent de reticulare au o
stabilitate mecanică mai bună, sunt mai aderente pe sticlă și sunt perfect transparente, fiind comparabile cu
gelurile de acrilamidă-bisacrilamidă.
 N,N'-(1,2-Dihidroxietilen) bisacrilamida (DHEBA)-poate fi folosită pentru turnarea gelurilor
reversibile, deoarece structura de 1,2-diol face din DHEBA un compus sensibil la clivaj prin oxidare cu
acid periodic.
 Polimerii pe bază de etilen diacrilat (EDA) pot fi utilizați ca geluri clivabile, proces realizat prin
hidroliză, deoarece acest agent de reticulare conține legături ester. În plus, agenții de reticulare poli(etilen
glicol diacrilat) fac parte din aceeaşi serie de derivaţi esterici, cu proprietăți asemănătoare.
Gelurile trisacrilice sunt obținute prin copolimerizarea monomerului N-acriloil-2-amino-2-
hidroximetil-1,3-diol propanului cu bis acrilamida. Acest monomer trisacril creează un micromediul care
favorizează abordarea componentelor dizolvate, hidrofile (a proteinelor, în speță) de suprafaţa gelului,
deoarece scheletul de polietilenă este îngropat sub un strat de grupări hidrofile (hidroximetil). Astfel, acest
tip de matrice are un avantaj evident comparativ cu suporturile de poliacrilamidă la care, stratul protector
hidrofil este absent și care au un caracter mai pronunţat hidrofob (trisacrilul, are un coeficient de partiţie P,
de 0,01). De altfel, la cealaltă extremă a scalei de hidrofilicitate este situată N, N’-dimetilacrilamida
(DMA) care posedă. o foarte mare hidrofobicitate (P = 0,5), fiind în același timp este extrem de rezistentă
la hidroliza alcalină (cu aproximativ trei ordine de mărime mai stabilă decât acrilamida).
Totuși acest polimer se degradează cu o cinetică de ordinul zero iar motivul aceastei instabilități îl
constituie modul în care legăturile de hidrogen dintre grupările -OH şi carbonil (amido) din structura
trisacril activează un mecanism de "transfer acil N-O", ceea ce conduce la o hidroliză rapidă a legăturilor
amido, chiar în condiţii uşor alcaline. Același dezavantaj este întâlnit și în cazul unui alt monomer, foarte
hidrofil, N-acriloil-1-amino-1-dezoxi-D-glucitol, care suferă o reacție de hidroliză autocatalitică, la valori
alcaline ale pH-ului, fiind astfel la fel de instabil ca și trisacril-ul. Din aceste motive utilizarea lor ca mediu
suport în electroforeză este destul de limitată. (Righetti, 2005).
Gelurile ACM-BAP. În cursul anului 1984 a fost raportat un nou cuplu de polimeri cu proprietăți
specifice și utilități practice în electroforeză: acriloil morfolina (ACM) şi piperazin bisacrilil (BAP,
ultimul fiind agentul de reticulare). Aceste geluri manifestă anumite caracteristici interesante datorate
prezenţei atomulului de azot din inelul morfolino, implicat în legătura amido; acesta din urmă conduce la o
stabilitate pronunţată faţă de hidroliza alcalină, asemănătoare matricelor convenţionale de poliacrilamidă.
În plus, astfel de matrice sunt pe deplin compatibile cu o serie de solvenţi hidro-organici, permiţând astfel
o separare electroforetică în fază mixtă.
N-Acriloilaminoetoxietanolul (AAEE) este un alt monomer care combină hidrofilicititatea ridicată cu o
extremă stabilitate la hidroliză. Ca monomer liber, el are o rezistenţă la hidroliză de 10 ori mai mare decât
a acrilamidei în timp ce ca polimer stabilitatea acestuia (în NaOH 0,1 M și la 70oC) este de 500 de ori mai
mare.
3.6.2. REACȚIA DE POLIMERIZARE
Cea mai importantă proprietate chimică a acrilamidei o reprezintă capacitatea de a fi implicată într-o
reacție de polimerizare vinilică. Procesul de polimerizare este inițiat de:
 radiații γ, X, UV (în prezența unui fotosensibilizator de tipul peroxidului de hidrogen, eozinei (un
derivat dibromo-dinitro al fluoresceinei), riboflavinei ori acridin orange-ului (3-N,3-N,6-N,6-N-
tetrametilacridin-3,6-diamină). Structurile chimice ale fotosensibilizatorilor eozină B, acridin orange și
riboflavină sunt prezentate în figura 3.29;
Figura 3.29. Structurile chimice ale
unor fotosensibilizatori utilizați la
polimerizarea acrilamidei. (A) eozină
B; (B) acridin orange; (C) riboflavină.

 ultrasunete;
 inițiatori termic-labili, solubili în apă (persulfat de amoniu, persulfat de potasiu, azoderivați, etc.)
 alți agenți fizici sau chimici care generează radicali liberi.
În general sistemele catalitice se pot împărți în:
a. Sisteme catalitice în care radicalii liberi sunt generați prin reacții redox;
b. Sisteme catalitice în care radicalii liberi sunt generați prin fotocataliză.
Alături de cele două mari categorii există, de asemenea sisteme combinate.
Sisteme catalitice redox constau de obicei din:
I. Inițiatorul al reacției de polimerizare vinilică (acesta este o substanță care introdusă în sistemul
chimic în concentrație mică poate declanșa procesul respectiv. Inițiatorul se descompune cu ușurință în
radicali liberi). Cel mai utilizat inițiator al reacției de polimerizare este ionul persulfat, S2O82-. Schema
reacției de descompunere a persulfatului și de generare a radicalilor liberi este prezentată în figura 3.30.

Figura 3.30. Schema reacției de descompunere a persulfatului și de generare a

radicalilor liberi care catalizează polimerizarea vinilică.

II. Catalizatorul (acceleratorul) al reacției de polimerizare (acesta este o substanță care modifică
viteza de reacție, catalizând formarea de radicali liberi, în acest caz). O condiție
necesară pentru ca o substanță să funcționeze drept catalizator este de a poseda
două grupări amino separate prin doi atomi de carbon sau o grupare amino
terțiară. Astfel, cel mai utilizat accelerator în polimerizarea acrilamidei este
tetrametiletilen diamina, TEMED (Chrambach și Rodbard, 1971). În acest
sistem catalitic, TEMED accelerează descompunerea moleculelor de persulfat în
doi radicali sulfat iar aceștia inițiază reacția de polimerizare.
Trebuie însă avut în vedere necesitatea prezenței TEMED în această reacție. În figura 3.31 este
prezentată reacția de polimerizare dintre acrilamidă și bisacrilamidă, în prezența persulfatului de amoniu și
a TEMED.

Figura 3.31. Reprezentarea reacției de polimerizare

dintre acrilamidă și N,N’metilen bisacrilamidă în sistem
catalitic persulfat/TEMED.
 De remarcat că eficiența polimerizării în acest sistem scade rapid la valori ale pH-
ului mai mici de 6,0 (Caglio și Righetti, 1993).
Un alt catalizator utilizat în reacția de polimerizare vinilică (acesta fiind însă un
catalizator mai slab decât TEMED, dar mai fiabil în colorarea gelurilor cu argint
amoniacal-în acest caz se adaugă la sistemul catalitic tiosulfat de sodiu alături de
persulfat) este 1.4. piperazin dimetil (1.4, dimetilpiperazina, DMPIP).
Pe de altă parte, un alt sistem catalitic utilizat la prepararea gelurilor de poliacrilamidă este format din
riboflavină (figura 3.29, C) și TEMED. Astfel, riboflavina, sub acțiunea radiației UV generează radicali
liberi, care inițiază reacția de polimerizare. Sistemul conține și TEMED pentru a mări viteza de reacție;
polimerizarea durează circa o oră, deși în absența TEMED ea decurge în aproximativ 8 ore; după circa o
oră, doar 60% din monomeri fiind polimerizați, utilizarea unor astfel de geluri nepolimerizate total
conducând la rezultate nereproductibile; monomerii neintrați în reacție pot interacționa cu resturile
aminoacizilor din constituția proteinelor supuse separării electroforetice ori cu diversele componente ale
sistemului tampon. De obicei fotopolimerizarea cu riboflavină drept accelerator, este utilizată pentru
gelurile cu pH scăzut (Garfin, 1995).
Un alt sistem de fotopolimerizare (figura 3.32) cuprinde un colorant cationic (albastru de metilen) și
un cuplu redox alcătuit dintr-un reducător (toluen sulfinat de sodiu) și un oxidant mediu (clorură de
difeniliodoniu).

Figura 3.32. Catalizatori ai reacției de fotopolimerizare: A. clorură de difeniliodoniu (DPIC); B. toluen sulfinat de sodiu (STS), C.
albastru de metilen (MB). Ultimul, poate fi utilizat și în combinație cu riboflavin-5'-fosfatul (prezentat în figura 3.29c).
Rabilloud și colab. (1996) au descris următorul amestec de polimerizare: 37µM albastru de metilen,
500µM toluen disulfinat și 25µM clorură de difeniliodoniu. Acest sistem catalitic conduce la obținerea
unor geluri deosebit de ferme, chiar la valori reduse ale pH, reproductibile, cu proprietăți vâsco-dinamice
mai bune decât cele obținute prin sistemul standard de cuplaj redox, persulfat și TEMED (Lyubimova și
colab., 1993).
Un alt sistem de cataliză a fost descris de MacFarlane (1983) și se bazează pe un cuplu Fenton de
polimerizare a amestecului de acrilamidă/bisacrilamidă. Amestecul de reacție conține: FeSO4 (8 µM), acid
ascorbic (4 mM) și H2O2 (0,001%). Gelurile astfel obținute sunt puțin mai fragile față de cele produse prin
metoda anterioară (Rabilloud) dar dau rezultate similare în separarea proteinelor.
Toate sistemele de polimerizare a acrilamidei sunt sensibile față de oxigen și din această cauză este
necesară degazarea prealabilă a amestecului de polimerizare.
3.6.3. FACTORII DE CARE DEPINDE VITEZA REACȚIEI DE POLIMERIZARE
Viteza reacției de polimerizare depinde de:
(1) Concentraţia netă de monomeri şi de radicalilor liberi (în cele mai multe cazuri se utilizează
TEMED în concentrație de 10 mM și persulfat);
(2) Temperatura la care are loc reacția de polimerizare. În acest context se cunoaște că reacția de
polimerizare este exotermă și din această cauză, temperatura trebuie să fie controlată cu atenție. Ea se
desfășoară mai ușor la temperatura camerei, cu toate că există și siteme de termostatare. În general la
gelurile plate, disiparea căldurii este mai eficientă cu cât grosimea gelului este mai mică;
(3) Puritatea reactivilor;
(4) Concentrația de inhibitori. Prin inhibitor trebui înțeles orice compus care distruge radicalii liberi.
Astfel, orice compus care poate acţiona ca o trapă pentru radicalii liberi va acţiona ca un inhibitor de
polimerizare. Oxigenul atmosferic este cel mai important inhibitor și din acest motiv este necesară o
degazare corespunzătoare a amestecului de polimerizare pentru a elimina oxigenul dizolvat în soluţiile de
acrilamidă. Prezența oxigenului este critică pentru o reproductibilitate absolută a electroforezei
(Chrambach, 1985). Cu toate acestea, în multe cazuri, pot fi acceptabile și geluri obținute fără o degazare
completă.
Alți inhibitori ai reacției de polimerizare sunt (a) aminele alifatice, (b) compușii aromatici precum
piridina, (c) protonii (existenți în mediul acid).
Pentru ca gelurile să fie reproductibile, toți acești parametrii trebuie să fie controlați cu atenție. Mai
trebuie avut în vedere că utilizarea unor reactivi de înaltă calitate este o condiţie prealabilă pentru
obținerea unor geluri reproductibile și de înaltă rezoluţie. Acest lucru este valabil mai ales pentru
acrilamidă, care constituie componenta cea mai abundentă în amestecul de monomeri. În plus, reziduurile
de acid acrilic, poliacrilamidă liniară şi a impurităţilor ionice sunt contaminanţi majori care scad calitatea
preparatelor de acrilamidă. Astfel, contaminanții chimici care afectează îm plus calitatea gelurilor sunt:
 Acid acrilic-va copolimeriza cu acrilamida şi bisacrilamida, ceea ce pentru gelul rezultant conferă
proprietăţi de schimbător de ioni.
 Poliacrilamida lineară-prin furnizarea unui nucleu de polimerizare necontrolat, poate conduce la
geluri nereproductibile.
 Contaminanţii ionici-pot să includă atât inhibitori cât și acceleratori ai reacției de polimerizare. În
special, metale precum cuprul pot inhiba copolimerizarea merilor.
 Componentele tampon trebuie să fie de grad de reactiv şi numai apa deionizată trebuie să fie utilizată
pentru toate fazele electroforezei pe gel de poliacrilamidă.
3.6.4. PROPRIETĂȚILE GELULUI DE POLIACRILAMIDĂ.
Prin polimerizarea acrilamidei cu bisacrilamida, se formează o rețea
tridimensională în condițiile în care agentul de reticulare bifuncțional se
leagă de lanţurile liniare de poliacrilamidă adiacente formând un mediu
poros în care dimensiunile porilor sunt în relație cu concentrațiile inițiale
ale monomerilor (acrilamidă și bisacrilamidă) și de condițiile de realizare a
reacției de polimerizare (sistem catalitic, temperatură, etc.).
Prin convenţie, gelurile de poliacrilamidă sunt caracterizate printr-o
pereche de valori, T[%] şi C[%]. Astfel, T[%] reprezintă procentul de
greutate al cantității totale de monomeri, inclusiv a agentului de reticulare
(în g/100 ml),

adică:

unde a reprezintă cantitatea de acrilamidă iar b este cantitatea de bisacrilamidă în timp ce V este volumul
total de soluție.
C[%] reprezintă procentul (proporția) de agent de reticulare din totalul de monomeri, adică din
cantitatea totală a acestora și se calculează după relația:

După cum se observă, C[%] este practic gradul de reticulare.

S-au observat o serie de anomalii în condițiile în care se utilizează doi agenți de reticulare cu mase
moleculare diferite și care nu vor prezenta aceeași frecvență în structura polimerului, agentul de reticulare
mai mic fiind mai des întâlnit (va avea o frecvență mai mare). Din acerastă cauză, uneori se utilizează
fracția molară, X care poate fi definită ca:

3.6.4.1. Efectul de cernere moleculară

Termenul de por nu definește un element geometric decât în sens orientativ și comparativ, mărimea lui
semnificând rezistența opusă de rețeaua tridimensională a gelului la deplasarea macromoleculelor care
migrează în câmp electric. Cu ajutorul gelului de poliacrilamidă se pot separa molecule de la câteva sute la
câteva milioane de daltoni. Mărimea efectivă a porilor este în funcție de concentrația totală a monomerilor,
T[%] și de gradul de reticulare, C[%].
 3.6.4.2. Dependența de concentrația de monomeri, T[%] și C[%]
O macromoleculă cu sarcină electrică dată, în funcție de dimensiunile sale și de dimensiunile porilor va
fi, mai mult sau mai puțin frânată, în deplasarea sa în câmp electric, fiind caracterizată, printre altele, prin
mobilitatea sa electroforetică. În practică se folosește mobilitatea electroforetică relativă care este
proporțională cu distanța de migrare. Ea se calculează prin compararea mobilităților diferitelor
macromolecule considerând timpul de separare și intensitatea curentului electric, constante. Mobilitatea
relativă se notează cu Rf . Altfel spus, Rf poate fi definit ca raportul între mobilitățile unei macromolecule
în mediu restrictiv µ și mobilitatea sa într-un mediu liber, nerestrictiv, µo după relația:

Prin urmare, Rf este o constantă fizică care caracterizează o macromoleculă dată într-un gel cu o
anumită compoziție, în condiții definite.
Pentru a obține date despre: (a) dimensiunile și sarcina netă a unei macromolecule, (b) omogenitatea,
(c) concentrația optimă a unui gel care poate rezolva (diferenția) două specii moleculare, se folosesc
reprezentările Ferguson, respectiv funcția log (mobilitate, Rf) vs concentrația gelului (figura 3.33).

Figura 3.33. Reprezentarea Ferguson. Din panta dreptei (α) se desemnează

coeficientul de retardare, KR iar din intersecția cu axa oy se obține yo valoare dată
pentru T[%]=0. Se observă că KR este legată de raza moleculară, R a particulei.

Reprezentarea Ferguson, pornind de la măsurarea distanței de migrare la o intensitate dată a câmpului

electric, dezvăluie dimensiunea, forma și sarcina electrică netă a particulelor care migrează ca o bandă în
gelul electroforetic (Rodbard și Chrambach, 1971) după cum inspecția distanțelor de migrare pe un gel cu
o singur concentrație nu poate furniza aceste informații decât în cazul în care în care particulele posedă o
sarcină electrică egală, caz reprezentat de separarea lor în prezență de detergent (dodecilsulfat de sodiu, de
cele mai multe ori).
Fenomenul de frânare a deplasării macromoleculei în gel (măsurat prin KR) este în relație cu
mobilitatea macromoleculei în mediu liber, nerestrictiv la T[%]=0 (a cărei valoare este dată de y0,
parametru caracteristic al macromoleculei luate în studiu). Astfel, y0 poate fi corelat cu sarcina electrică
netă.

Figura 3.34. Tipuri structurale de geluri de poliacrilamidă. A. Poliacrilamidă nereticulată cu C[%]=0%. Este un gel unidimensional
iar consistența polimerului este lichid-vâscoasă. B. Un gel de poliacrilamidă cu C[%] de valoare medie. C. Un gel de poliacrilamidă
cu C[%] de valoare mare. D. Un gel de poliacrilamidă reticulat pur, zerodimensional (C[%]=T[%]).
În lumina acestor reprezentări Ferguson gelurile pot fi clasificate în:
a. Zerodimensionale, când fibrele de polimer au o lungime aproximativ egală cu 0, polimerul fiind liniar
și supraînfășurat formând suprafibre cu pori mari cu raza de 20-40 nm.
b. Unidimensionale, când fibrele de polimer au o lungime ”infinită” iar numărul de capete este
neglijabil. Este cazul poliacrilamidei convențional reticulate cu C[%]=2-5% care pare a avea predominant
caracter de gel unidimensional cu fibre cu rază de 1-2 nm. Configurațiile geometrice probabile ale
diferitelor tipuri structurale de geluri de poliacrilamidă sunt prezentate în figura 3.34.
Ca urmare a reprezentărilor de mai sus se desprinde dependența gelurilor față de parametrul C[%].
Astfel, la C[%] cuprins între 0-5%, fibrele de poliacrilamidă sunt liniare, gelurile fiind unidirecționale; la
valori ale C[%] situate în domeniul 5-50%, fibrele de poliacrilamidă sunt zerodimensionale,
supraînfășurate, diametrul porilor crește, iar practic moleculele nu mai sunt frânate în migrarea lor în câmp
electric. Figura 3.35 prezintă dependența factorului de frânare în funcție de concentrația totală de polimeri,
T[%].

Figura 3.35. Dependența mărimii porilor de gradul de reticulare, C[%].

În ceea ce privește dependența mărimii porilor de parametrul T[%], se poate spune că la o valoare
constantă a gradului de reticulare (C[%]=2-5%), mărimea porilor scade pe măsură ce valoarea
parametrului T% crește după relația:

Astfel, mărimea efectivă a porilor unui gel de poliacrilamidă este o funcţie inversă a concentrației
totale de monomeri, T[%]. În plus, pentru orice concentrație totală de monomer dat, dimensiunea efectivă
a porilor, variază în funcţie de proporţia de agent de reticulare din amestecul de reacţie (C[%]). Odată cu
creșterea T[%], la o concentrație scăzută de agent de reticulare, numărul de catene liniare crește, iar
mărimea porilor scade. Când T[%] este crescut la o concentrația fixă, dar cantitatea de agent de reticulare
este redusă, numărul de catene crește iar dimensiunea porilor se reduce. Pe de altă parte, dimensiunea
porilor este o funcţie bifazică dependentă de C[%]. În condițiile în care se variază C[%], la un T[%]
constant, se produce o diminuare a dimensiunii porilor, nivelul minim fiind atins la aproximativ C[%]=5%
(figura 3.35). Creşterea ulterioară a lui C[%] cauzează formarea de legături mai scurte şi mai groase de
lanţuri polimerice (Chrambach, 1985; Richards și Lecanidou, 1971, 1974).
3.6.5. STRATEGIA DE SEPARARE A PROTEINELOR PE GELURI DIN POLIACRILAMIDĂ
În funcție de proprietățile proteinei (proteinelor) luate în studiu și de scopul urmărit, trebuie avut în
vedere:
- compoziția chimică, concentrația și structura gelului de poliacrilamidă (gel omogen, gel în gradient,
etc.);
- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);
- condițiile de separare (denaturante, nedenaturante, disociative, nedisociative);
- sistemul tampon (continuu sau discontinuu)
- forța ionică și pH-ul sistemului tampon.
3.6.5.1. Compoziția chimică, concentrația și structura gelului de poliacrilamidă
Din punct de vedere al compoziției chimice, acrilamida poate fi polimerizată cu bisacrilamida
(procedeul cel mai adesea folosit), bisacrilcistamina (BAC), dialiltartatdiamina (DATD),
dihidroxietilenbisacrilamida (DHEBA), etc (tabelul 3.6). Ultimii trei agenți de reticulare se utilizează la
prepararea gelurilor solubilizabile, în tehnici la scală micropreparativă, deoarece, în cele mai multe cazuri
ei permit trecerea gelului în stare de sol, în condiții avantajoase pentru conservarea integrității structurale
și funcționale ale proteinelor luate în analiză.
Dacă gelul este discontinuu (alcătuit din zone cu proprietăți diferite), gelul de concentrare (T[%]=4%)
este plasat deasupra gelului restrictiv, de rezolvare, ultimul având o concentrație a monomerilor cuprinsă
între 5 și 30% (Bollag și Edelstein, 1991). Gelul de concentrare (de stivuire) conține, de exemplu, tampon
Tris-HCl 0,125 M, pH=6,8, iar gelul de separare poate fi realizat în tampon Tris-HCl 0,375 M, pH=8,8.
Discontinuitatea de pH dintre cele două geluri suprapuse este desemnată pentru a regla mobilitatea
efectivă ale ionilor de glicinat din compartimentul catodic în timp ce diferențele dintre concentrațiile de
tampon din cele două geluri sunt realizate din considerații electrochimice.
Porozitatea gelului de concentrare este atât de mare (T[%]=4%) pentru a nu împiedica mișcarea
proteinelor în cursul migrării lor în câmp electric și funcționează în general ca un mediu suport cu
proprietăți anticonvective, în timpul formării zonei înguste de start. În aceste condiții, separarea
proteinelor se realizează în continuare, în gelul de rezolvare, a cărui porozitate este determinată empiric, în
funcție de mobilitatea proteinelor din probă. Astfel, nu există o regulă clară pentru a predicționa
concentrația corectă a unui gel pentru rezolvarea electroforetică a unui amestec de proteine necunoscute.
Alegerea este făcută în așa fel încât proteinele de interes să se separe în gel; în mod obișnuit se începe cu
un gel de separare cu T[%]=7,5% pentru o separare electroforetică inițială a probei care conține
componente cu mobilități necunoscute (Hames, 1990).
În afara domeniului de pH cuprins între 4 și 6, gelurile de poliacrilamidă sunt inerent instabile. După o
stocare de aproape 4 luni la o temperatură de 4oC, în tampoanele uzual utilizate în electroforeză, uneori are
loc o scădere notabilă a profilului benzilor separate electroforetic. Alterarea structurii poliacrilamidei este
un proces lent de hidroliză a grupărilor carboxamididice (-CO-NH2) ale monomerilor de acrilamidă și care
se manifestă în tampoane bazice (Boschetti, 1989). Hidroliza conduce la formarea unor grupări carboxil (-
COO-), ionizabile. Gelurile vechi, umflate, au o structură a porilor schimbată ele luând caracteristici de
schimbători de ioni datorită procesului de clivare hidrolitică. Îmbătrânirea gelurilor de poliacrilamidă are o
semnificație comercială deoarece limitează perioada de utilizare a gelurilor preturnate (Garfin, 1995). Din
această cauză, pentru a obține o rezoluție de separare maximă, este necesar să se utilizeze numai geluri
proaspăt preparate.
Concentrația gelului se referă la concentrația totală a monomerilor (parametrul T[%]) și a gradului de
reticulare (parametrul C[%]). Așadar, pentru proteine bine caracterizate, alegerea concentrației gelului nu
reprezintă o problemă. Astfel, pentru proteine cu masă moleculară cuprinsă între 20.000 și 150.000
daltoni, se recomandă geluri cu T[%]=5-12%. În cazul proteinelor cu masă moleculară cuprinsă între
10.000 și 80.000 daltoni se recomandă geluri cu T[%]<10-12% iar în cazul proteinelor masă moleculară
mai mică de 15.000 daltoni se utilizează geluri cu T[%]>15%.
În figura 3.36. este arătat un exemplu al efectului dimensiunii porilor asupra separării unor proteine
native. Astfel, la T[%]=4% și C[%]=2,67%, fenomenul de migrare este, în esență de necernere, proteinele
migrând în gel mai mult sau mai puțin în funcție de mobilitatea lor, liberă. În condițiile utilizării unui gel
(T[%]=8%; C[%]=2,67%) care acționează ca o sită pentru proteinele prezente în probă, apar efecte
combinate ale sarcinii electrice superficiale și ale mărimii lor asupra separării electroforetice. Se observă
că pozițiile relative ale unor proteine sunt deplasate în gelul al doilea (T[%]=8%; C[%]=2,67%),
comparativ cu primul, unde nu se produce fenomenul de cercere moleculară (T[%]=4%; C[%]=2,67%).

Figura 3.36. Efectul dimensiunii porilor asupra profilului electroforetic al unui amestec de proteine în condiții native și sistem
Ornstein-Davis, discontinuu. Diagrama din stânga a fost obținută utilizând un gel cu T[%]=4%; C[%]=2,67%, în timp ce figura din
dreapta arată comporamentul efectroforetic al aceluiași amestec de proteine dar într-un gel cu T[%]=8% și C[%]=2,67%. Liniile
oblice leagă benzile care reprezintă aceeași proteină pe cele două geluri. Se observă schimbările relativ mari de mobilitate ale BSA în
formă dimeră și ale α-lactalbuminei în cele două tipuri de geluri (După Garfin, 2003).
Soluțiile de monomeri se prepară uzual ca soluții stoc, concentrate. Pentru gelurile utilizate în
separarea de proteine este preferată o soluție stoc de monomeri cu T%=30% și C%=2,7% care se
realizează prin dizolvarea a 29,2g de acrilamidă și 0,8g de bisacrilamidă în 72,5 ml de apă complet
deionizată (volumul final fiind de 100 ml iar densitatea specifică de 1,025). Soluția de monomeri trebuie
filtrată și stocată la rece, preferabil într-un vas de sticlă brună.
Pentru gelurile utilizate în separarea de acizi nucleici se folosește un amestec alcătuit din
acrilamidă:bisacrilamidă cu T%=30% și C%=3,3% preparată din 29g de acrilamidă și 1g de bisacrilamidă.
Concentrațiile de inițiator sunt determinate empiric, prin urmărirea polimerizării în timp de 15-20
minute, după adăugare. În aceste condiții, gelificarea se realizează complet în 90 de minute. Dacă se
utilizează geluri de concentrare, este necesar ca acestea să aibă structuri poroase mari. În general, pentru o
polimerizare rapidă (în circa 8-10 minute) se adaugă persulfat de amoniu, la o concentrație finală de
0,05% respectiv TEMED, la o concentrație de 0,1%.
De obicei, soluțiile stoc de monomeri și de tampon se combină până la concentrația dorită și apoi se
deaerează sub un vid modest timp de aproximativ 15 minute. Inițiatorul și catalizatorul sunt apoi adăugate
iar amestecul se toarnă în aparatul gata-pregătit. Dacă se utilizează un gel de concentrare, se prepară și se
toarnă mai întâi gelul se rezolvare (separare). El este apoi acoperit cu o soluție de butanol saturat în apă,
pentru a exclude aerul din vecinătatea superioară a gelului și pentru a forma o legătură puternică între cele
două geluri. După aproximativ o oră, stratul de alcool este îndepărtat și gelul format în partea superioară se
spală cu apă până la dispariția mirosului caracteristic de butanol, după care se toarnă amestecul de gel de
concentrare peste gelul de separare și se introduce un ”pieptene” formator de godeuri pentru a forma spații
în care se aplică proba. După finalizarea polimerizării și îndepărtarea pieptenului, gelul este gata de
utilizare.
Structura gelurilor este strâns legată de parametrii T[%] și C[%] Astfel, un gel omogen se
caracterizează printr-o singură valoare a concentrației totale de monomeri, T[%], în timp ce un gel cu
gradient este caracterizat printr-un gradient de concentrație de obicei cuprins între 5 și 20%. Gelurile în
gradient sunt mai avantajoase deoarece oferă mai multe date despre proteinele supuse electroforezei.
Gradientul poate fi liniar sau exponențial, putând astfel vorbi despre gradient de pori. Gelurile omogene au
pori de aceeași mărime.
Pentru obținerea unei rezoluții de separare optime a două proteine, deseori se folosește un gel omogen,
de concentrație potrivită, în funcție de mărimea și sarcina electrică a proteinei luate în studiu. Aceasta
poate să fie stabilită prin măsurarea mobilității fiecărei proteine într-o serie de geluri de concentrații cu
(T[%]) diferite.
În urma unui astfel de studiu se disting patru categorii de probleme (situații) de separare:
I. Cele două proteine au densități de sarcină electrică identice, deci mobilități identice într-un mediu
nerestrictiv (figura 3.36, panelul A).
II. Proteina cu mobilitate mai mare (densitate de sarcină electrică mai mare) este mai mică în
dimensiuni. În acest caz separarea se realizează pe baza mobilității și a masei moleculare; se consideră că
cele două proteine sunt sinergice iar prin creșterea concentrației de gel crește și rezoluția de separare
(figura 3.36, panelul B).

Figura 3.36. Reprezentări Ferguson a unor situații întâlnite la separarea prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă a două proteine.
III. Una dintre proteine are dimensiuni mai mari și mobilitate electroforetică mai mare. În acest caz
separarea se realizează în funcție de dimensiune și sarcină electrică, cele două proteine fiind antagoniste.
Cazul este caracteristic sistemelor nedisociative (figura 3.36, panelul C).
IV. Două proteine au aceleași dimensiuni dar au mobilități electroforetice diferite (este cazul
izoenzimelor, hemoglobinelor, etc.). În acest caz concentrația monomerilor nu are efect asupra separării
relative a celor două proteine. Situația corespunde separărilor prin focusare izoelectrică sau prin
izotacoforeză (figura 3.36, panelul D).
3.6.5.2. Forma gelului
Primele electroforeze care au folosit poliacrilamida drept mediu suport s-au efectuat pe geluri plate,
orizontale și apoi pe geluri cilindrice (unde amestecul de polimerizare se toarnă în tuburi de sticlă sau
plexiglace). În prezent însă, în majoritatea cazurilor se apelează la separarea pe verticală în geluri plate
(geluri placă), cu o grosime a gelului cuprinsă între 50 µm și 3 mm.
Gelurile placă orizontală (sau verticală) sunt simplu de preparat , într-un timp scurt; pe un astfel de
gel se aplică mai multe probe, inclusiv proteine standard cu masă moleculară cunoscută, separându-se în
condiții de migrare electroforetică identice. Numărul de probe aplicate este în funcție de necesități, iar
analiza calitativă și estimările cantitative se efectuează cu mai multă ușurință și precizie în cazul gelurilor
cilindrice. Prin utilizarea poliacrilamidei se elimină artefactele optice, ceea ce face posibilă fotografierea
corectă. În plus, în cazul gelurilor placă, căldura produsă prin efect Joule este mai repede disipată
comparativ cu gelurile cilindrice iar uscarea gelurilor este relativ simplă.
Gelurile cilindrice sunt de neînlocuit la separarea proteinelor marcate cu radioizotopi când se
urmărește determinarea cantitativă a radioactivității. Ele sunt de preferat atunci când trebuie determinată
activitatea enzimatică a fracțiunilor separate deoarece cantitatea aplicată este mult mai mare (fără a afecta
calitatea separării). Gelurile cilindrice sunt preferate la testarea pH-ului optim de lucru și a concentrației
optime a gelului de poliacrilamidă.
Pe lângă aplicațiile evidente de analiză a purității unor probe proteice, electroforeza este utilizată la
determinarea unor parametrii fizico-chimici ai proteinelor. Dacă proteina supusă analizei într-o serie de
geluri cu concentrații (T[%]) diferite, dar cunoscute și se măsoară mobilitatea ei electroforetică relativă, Rf
în fiecare gel, se poate construi o diagramă liniară, log Rf versus T% (diagrama Ferguson). Această
reprezentare poate da o importantă informație: panta acestei drepte este o măsură a mărimii moleculare și
este denumită coeficient de retardare (retardation coefficient, KR) a cărei prelungire care intersectează axa
0y (Y=Rf când T[%]=0) este o măsură a mobilității electroforetice în condiții libere (când gelul nu este
prezent) și așadar este o măsură a sarcinii electrice nete. Astfel, s-a demonstrat că în cazul proteinelor
globulare există o relație liniară între √KR și raza moleculară (R), ultima putând fi calculată prin măsurători
ale KR. Cum mobilitatea în condiții libere (m0, calculată din Y0) și Rf (calculat din KR) sunt cunoscute, se
poate calcula sarcina netă a moleculei prin utilizarea teoriei clasice a electroforezei. În plus, dacă se
reprezintă diagramele Ferguson pentru toate proteinele dintr-un amestec, pantele diferitelor linii vor da
imediat informații referitoare la componenții diferiți cu masă moleculară similară dar cu sarcină electrică
netă diferită existenți, componenți proteici cu aceeași sarcină electrică dar masă moleculară diferită sau
dacă componenții proteici diferă atât prin sarcină cât și prin masă. Un exemplu de diagramă Ferguson este
prezentat în figura 3.37 unde albumina serică bovină (BSA) este migrată într-o serie de geluri cu T%
cuprins între 4% și 10%, obținându-se o familie de curbe cu pante diferite care reprezintă oligomerii (de la
monomer la heptamer) ai BSA.

Figura 3.37. Reprezentarea grafică a logaritmului mobilității electroforetice a BSA

versus concentrația (densitatea) gelului (diagrama Ferguson) la un grad de
reticulare de 2%, constant (După Thorun, 1971).

În cazul electroforezei bidimensionale, prima dimensiune se realizează în cele mai bune condiții în
geluri cilindrice. În plus, dacă gelurile placă pot fi în egală măsură omogene sau în gradient, gelurile
cilindrice sunt de obicei omogene.
3.6.6. CONDIȚII DE SEPARARE
Condițiile de separare trebuie să asigure o solubilizare completă a
probelor proteice. În acest scop, alegerea condițiilor de separare se
realizează sistematic în funcție de proprietățile hidrofile/hidrofobe ale
probei proteice. Astfel, pentru testarea solubilității, numai prin disocierea
legăturilor hidrofile, proba este incubată în soluții tampon alcaline,
neutre și acide, în prezența/absența clorurii de potasiu (0,1-0,5 M), la o
temperatură de 4oC, pentru a nu afecta activitatea biologică. Dacă proba
nu se solubilizează, se repetă testarea în prezență de EDTA (etilendiaminotetraacetat), 0,1 M. EDTA
complexează ionii metalici divalenți și astfel se desfac legăturile în care aceștia sunt implicați.
 Urea este deseori utilizată ca agent de disociere în electroforeza pe gel (Grierson, 1990). Urea, disrupe
legăturile de hidrogen și pe cele hidrofobe putând cauza agregări nedorite ori formarea unor structuri
secundare, care afectează mobilitățile proteinelor. Disocierea legăturilor de hidrogen necesită uree în
concentrații mari (7-8 M). De asemenea, ea este de multe ori utilizată în denaturarea acizilor nucleici, când
urea reprezintă un component esențial al gelurilor la care este necesară menținerea configurațiilor
unicatenare a fragmentelor de ADN sau ARN, pentru a se determina cu acuratețe masele moleculare ale
acestora.

O N C H2 C H3 O N C H2 C H2 OH

A B
Figura 3.38. Structurile chimice ale N-etilmorfolinei (A) și hidroxietilmorfolinei (B)
Poliolii (ce de exempu, glicerina) sunt folosiți frecvent pentru solubilizarea proteinelor în condițiile
menținerii activității lor biologice. Dacă proba continuă să rămână insolubilă se recurge la detergenți,
compuși care modifică hidrofobicitatea relativă a proteinelor și care astfel îmbunătățesc separarea
electroforetică. Într-o mică măsură același efect se obține prin folosirea tampoanelor relativ hidrofobe pe
bază de N-etilmorfolină sau hidroxietilmorfolină (figura 3.38).
3.6.6.1. Electroforeza în condiții denaturante
Cea mai mare parte a studiilor de electroforeză în gel de poliacrilamidă recurge la condiții denaturante,
disociative. Ca atare, proteinele oligomere disociază în lanțurile polipeptidice, componente. Astfel,
proteinele își pierd activitatea biologică. Detergenții se utilizează în electroforeză când este necesară
disruperea interacțiilor proteină-compus lipidic ori proteină-proteină. În acest scop au fost utilizați o serie
de detergenți, dintre care cel mai cunoscut agent de disociere este dodecilul sulfat de sodiu (lauril sulfatul
de sodiu, SDS).
SDS este un detergent ionic care are formula chimică: CH3-(CH2)10-CH2-SO3-Na+, (figura 3.39).

Figura 3.39. Structura chimică a dodecilsulfatului de sodiu, SDS.

Se observă brațul nepolar și regiunea polară care posedă o sarcină
negativă.

Conceptele de bază ale interacției proteină-detergent au fost prezentate atât în termeni generali
(Helenius și Simons, 1975; Neugebauer, 1990) cât și în cazul strict al electroforezei (Hjelmeland și
Chrambach, 1981). Astfel, cele mai multe proteine sunt ușor solubile în SDS, făcând electroforeza în
prezența acestui detergent anionic (SDS-PAGE) o metodă general aplicabilă.
Dintre proprietățile fizice ale SDS se pot aminti:
 solubilitate în apă: 3% (masă/volum);
 precipită la temperaturi cuprinse între 0-10oC.
Calitatea (puritatea) detergentului este o condiție importantă
în SDS-PAGE. (Brown, 1988; Margulies și Tiffany, 1984),
efectele impurităților prezente în preparatele de SDS fiind
impredictibile. Dintre contaminanți cei mai des întâlniți, cele mai
nedorite efecte le au probabil alchil sulfații, alții decât dodecil
sulfatul (C12), în special decil sulfatul (C10), tetradecil sulfatul
(C14) și hexadecil sulfatul (C16), care se leagă la proteine similar
SDS dar prezintă afinități diferite și în consecință afectează
mobilitățile acestora. În plus, contaminanții lipofilici prezenți în preparatele de SDS, printre care și
dodecanolul, pot fi incluși în complexele micelare SDS-proteină ceea ce conduce la scăderea rezoluției de
separare. Numai SDS purificat (proces realizat prin recristalizare în n heptan) trebuie utilizat pentru
electroforeză, dar chiar cu SDS pur, diferite glicoproteine, lipoproteine și nucleoproteine au tendința de a
se lega la detergent neregulat, ceea ce conduce la o migrare anormală a complexelor SDS-polipeptide, în
ceea ce privește masele lor moleculare. În plus, prezența unor săruri anorganice în preparatul de SDS
conduce la modificarea proprietăților tensioactive ale acestuia.
 Dodecil sulfatul de litiu (lithium dodecyl sulfate, LDS) a fost uneori substituit SDS în analizele
efectuate pe geluri de poliacrilamidă (Kubo și Takagi, 1986) după cum bromura de cetiltrimetilamoniu
(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) a fost, de asemenea, utilizată în electroforeza proteinelor
(Akins și colab., 1992). LDS este mult mai solubil ca SDS și nu precipită la temperaturi scăzute (la 4oC se
leagă afin la poliacrilamidă, deși la 25oC nu prezintă o astfel de proprietate), ceea ce permite migrarea
gelurilor la temperaturi scăzute.
CTAB este un denaturant mai slab decât SDS, prin urmare prezervă anumite activități biologice care
sunt în mod obișnuit distruse de către detergenul anionic. S-a constatat că dacă într-un sistem tampon
continuu, SDS este înlocuit cu LDS, separarea moleculelor cu masă moleculară mică este accelerată
datorită deficitului de LDS în regiunea frontală a gelului. Astfel, dacă gelul este saturat în LDS, rezoluția
separării la 4oC pe acest gel este mai bună decât cea obținută după electroforeză un gel de poliacrilamidă
în prezență de SDS efectuată la 25oC.
Majoritatea proteinelor leagă SDS într-un raport constant de 1,4g SDS/gram proteină. În aceste
condiții, sarcinile intrinseci (proprii) ale polipeptidelor sunt nesemnificative comparativ cu sarcinile
electrice negative rezultate după legarea SDS. Densitățile de sarcină electrică superficială ale complexelor
SDS-polipeptide sunt în principiu identice, ceea ce permite separarea (într-un gel cu porozitate controlată)
strict în funcție de dimensiunile polipeptidelor. În acest fel, pe lângă compoziția (conținutul) polipeptidelor
din probă, se determină și masele moleculare ale polipeptidelor, dacă sunt separate în același timp cu un
set de proteine cu masă moleculară cunoscută, prin raportare la acestea. Tehnica de lucru este simplă iar
cantitatea de probă este de ordinul a micro sau a nanogramelor.
Astfel, pregătirea probei pentru SDS-PAGE se realizează astfel încât să se realizeze un raport optim
(1,4g de SDS/1g de proteină denaturată) pentru multe tipuri de proteine, acest raport permițând separarea
electroforetică pe baza Mr. Interesant, la concentraţii mai mici de SDS, există un alt raport stabil de legare
a proteinelor de SDS (0,4g/1g de proteină), care se pare că nu produce o masivă denaturare a proteinei
(Reynolds și Tanford, 1970). De fapt, Tyagi și colab. (1993) au arătat că uneori, mici concentrații de SDS
(0,02%), combinate cu tehnica electroforetică de separare pe baza limitei de pori ar putea fi folosită pentru
determinarea simultană a Mr și a activității native. Existenţa unor complexe detergent-proteină, care
prezintă un raport crescut de detergent fără denaturarea proteinei, reprezintă o perspectivă interesantă
pentru dezvoltarea de noi tehnici electroforetice de determinare a greutății moleculare cu păstrarea
activității, cu aplicabilitate la un sistem specific.
Cea mai mare parte dintre proteine se solubilizează în SDS, indiferent de sursă, existând însă și
excepții. Astfel, glicoproteinele și lipoproteinele nu pot fi saturate în SDS, deoarece, în primul caz, partea
neproteică a unităților hidrofile oligozaharidice previn legarea micelară a SDS, partea proteică numai
interacționând cu acesta. Proteinele puternic bazice (de exemplu, histonele) interacționează prin legare
electrostatică a micelelor de SDS prin intermediul grupărilor sulfat. În cazul glicoproteinelor,
impedimentul poate fi relativ îndepărtat prin utilizarea tampoanelor Tris-borat în condiții alcaline,
crescându-se astfel sarcina netă negativă a glicoproteinelor și care astfel produce viteze de migrare bine
corelate cu masa moleculară. Migrarea histonelor poate fi îmbunătățită prin utilizarea gelurilor în gradient
de pori care permit catenelor polipeptidice să acceadă la limita lor de pori.
O serie de tipuri de proteine nu se comportă predictiv în timpul SDS-PAGE (Andrews, 1986; Hames,
1990). Incompleta reducere a proteinelor, care rămân cu unele legături intra sau intermeolculare intacte, nu
sunt saturate complet cu SDS, deoarece unele dintre situsurile de legare ale SDS nu devin disponibile
pentru detergent. Glicoproteinele și lipoproteinele nu sunt, de asemenea, saturate cu SDS, deoarece
componentele lor neproteice nu interacționează cu detergentul anionic. Proteinele care conțin secvențe de
aminoacizi neobișnuite, în special cele cu un conținut ridicat de lizină sau prolină, proteinele foarte bazice
ori proteine foarte acide se comporte anormal în SDS-PAGE, probabil datorită existenței unui raport
sarcină electrică/masă diferit fașă de cel așteptat. În mod similar, complexele SDS-proteine foarte mari, cu
mase moleculare de sute de kilodaltoni, pot avea conformații anormale (Garfin, 1995).
Pe de altă parte, proteinele pure, au tendința ca la temperaturi ridicate să formeze agregate și să
precipite. Este cazul hemaglutininei bacteriene care disociază complet după 30 de minute de fierbere la
100oC în prezență de SDS. Competiția agregare/dezagregare se poate rezolva, de exemplu, prin scăderea
concentrației proteinei din probă. Practic, testarea celui mai bun amestec de disociere se face prin păstrarea
constantă a concentrației proteice, a concentrației de agent reducător (de obicei β-mercaptoetanol) și a
concentrației de detergent, cu variația timpului de incubare. Dacă rezultatul este nesatisfăcător, se trece la
alterarea unui alt parametru dintre cei arătați mai sus.
 Pentru a se stabili mecanismul de legare a SDA la albumina serică bovină (BSA) s-a studiat
interacțiunea dintre aceste componente. Astfel, în stare nativă, BSA conține 10-11 situsuri cu constante
mari de legare a ionilor de detergent. Legarea ionilor de detergent de proteina nativă nedenaturată se
realizează secvențial (unul după altul), în timp ce legarea detergentului la proteina denaturată este puternic
cooperativă. Existența complexelor discrete proteină-detergent sugerează că asocierea ionilor de detergent
este, de asemenea importantă, atunci când afinitatea detergentului pentru proteină este mai mică. Un raport
de legare mai mare decât cel normal pentru un singur situs de legare se explică numai prin formarea de
micele de detergent în acel loc, adică ionii de detergent se leagă atât la proteină cât și la ionii de detergent
deja legați. acest fenomen este numit amplificarea legării, iar acest tip de legare poartă numele legare
micelară și s-a demonstrat că este reversibil. La atingerea concentrației micelare critice acest mecanism
încetează.
Saturarea cu SDS a unei proteine depinde de asemenea de punctul izoelectric al acesteia, ceea ce
influențează indirect comportamentul electroforetic. De asemenea, saturarea cu SDS este posibilă la
temperatura camerei și se aplică în cazul electroforezei bidimensionale; gelurile folosite la separarea
proteinelor prin focusare izoelectrică sunt pregătite pentru a doua dimensiune, cea de separare pe gel de
poliacrilamidă în prezență de SDS (SDS-PAGE). În acest caz, incubarea la fierbere este înlocuită printr-o
incubare la temperatura camerei, într-un amestec format din uree, 9M și Triton X-100, 20% (O'Connor și
colab., 1998).
Un alt agent de disociere foarte aplicat în disocierea probelor pregătite pentru
electroforeză este ureea. Denaturarea produsă de uree este dependentă de
temperatură, pH și tărie ionică. Pentru o denaturare completă, se utilizează uree cu
o concentrație mai mare sau egală cu 8M, alături de clasicii agenți reducători ai
punților disulfurice, deși există totuși proteine care nu se pot denatura.
Avantajul utilizării ureei drept agent de denaturare constă în proprietatea ei de a nu afecta sarcina
electrică intrinsecă a proteinei, ceea ce permite astfel o separare atât în funcție de masa moleculară a ei cât
și în funcție de sarcina electrică, după cum efectul denaturant al acesteia datorat ruperii legăturilor de
hidrogen inter și intramoleculare poate fi reversat prin îndepărtarea ei prin dializă. Dezavantajele utilizării
ureei constau în faptul că prin utilizarea ei nu se poate determina cu precizie masa moleculară, nefiind, în
plus la fel de eficientă ca SDS în disocierea proteinelor. De exemplu, ureea disociază în proporție de 50%
un lizat celular brut (la electroforeză, 50% din lizat este agregat nefiind apt să penetreze gelul) în timp ce
SDS disociază același preparat în proporție de 90%. Unele proteine, pentru a fi disociate complet necesită
prezența simultană a SDS și a ureei.
Clorura de guanidină (guanidina hidroclorică) este, de asemenea, un agent de disociere utilizat în
disocierea probelor pregătite pentru electroforeză. Datorită capacității superioare de
a participa la stabilirea legăturilor de hidrogen, în concentrații de 4-6M, guanidina
hidroclorică conduce la ruperea legăturilor necovalente, ceea ce provoacă
desfacerea structurii cuaternare, distrugerea structurilor secundare și terțiare.
Majoritatea proteinelor în acest agent de solubilizare au o conformație total dezordonată, motiv pentru care
este rareori folosită în separările electroforetice.
Disocierea completă reductivă a celor mai multe proteine se realizează prin incubarea probei diluate în
tamponul de migrare la o temperatură de 95-100oC (pe baie de apă) timp de 2-5 minute, în prezența atât a
SDS, în exces, cât și a unor tiocompuși (β-mercaptoetanolului, ditioeritrolului sau ditiotreitolului, agenți
utilizați la reducerea punților disulfurice), după cum se observă
în figura 3.40.

Figura 3.40. Mecanismul reducerii punților disulfurice proteice de către

tiocompuși. Coloana din stânga: reducerea cu ajutorul monotiolilor (de tipul β-
mercaptoetanolului). Coloana din dreapta: reducerea cu ajutorul ditiolilor
ciclizabili (precum ditiotreitolul, DTT). Sferele întunecate reprezintă suprafața
proteinei. (După Rabilloud, 1996).
 În procedura Laemmli (1970), probele pregătite pentru electroforeză pe gel de poliacrilamidă în
prezență de SDS se prepară în tampon Tris-HCl, 0,0625 M, pH 6.8, SDS, 2%, β-mercaptoetanol, 5%,
glicerol, 10%, și aproximativ 0,025% albastru de bromfenol (Bollag și Edelstein, 1991; Garfin, 1990a;
Hames, 1990). Este de preferat să se realizeze un tampon stoc pentru probă, care să conțină toate
componentele cu excepția β-mercaptoetanolului, acesta din urmă adăugându-se chiar înainte de utilizare.
Glicerolul oferă probei o densitate care îi permite depunerea sa în godeul gelului de separare aflat sub
tamponul de migrare în timp ce colorantul de migrare permite atât aplicarea probei cât și monitorizarea
migrării electroforetice (el migrează odată cu ionul frontal, adică odată cu frontul).
Cantitatea de detergent prezentă în tamponul probei este suficientă pentru a asigura saturarea
amestecului de proteine. În cazuri rare, când proba are o tărie ionică foarte crescută (>0,2 M), ea poate fi
dizolvată în tamponul stoc al probei (tamponul de încărcare) într-un raport de 1:1 (v/v), fiind totuși, mai
indicată o diluție într-un raport de cel puțin 1:4 (v/v).
Cantitatea de proteină din proba care se încarcă pe un gel depinde de metoda de detectare utilizată.
Astfel, proteinele de interes trebuie să fie într-o cantitate suficientă pentru a fi ulterior localizate.
Detectarea unei componente din probă în geluri impune o cantitate de proteină/bandă de circa 1µg
pentru a avea o vizibilitate uşoară a benzilor proteice colorate cu coloranţii anionici, de tipul Coomassie
Brilliant Blue R-250 sau de 0,1µg de proteine/bandă în cazul colorării cu argint.
3.6.6.2. Electroforeza proteinelor în condiții nedenaturante
În acest tip de electroforeză separarea se realizează pe baza dimensiunii și sarcinii nete a proteinelor,
păstrându-se conformația nativă a acestora, interacțiile dintre subunități și activitatea biologică. În multe
cazuri, se utilizează detergenți neionici, în general nedenaturanți, cu rol de a solubiliza proteinele, când se
urmărește păstrarea activității biologice.
Cel mai cunoscut detergent neionic utilizat în separările
electroforetice este Triton X-100, compus care, din punct de
vedere chimic este o polioxietilenă, a cărei structură este
prezentată alăturat (n=10).
În scopul determinării mecanismului molecular de legare,
s-a studiat interacția detergent-proteină. Astfel, Triton X-100
interacționează hidrofob cu unele proteine precum BSA,
albumina serică umană, β-lactoglobulina, în timp ce alte proteine nu leagă acest detergent (mioglobina,
imunoglobulina G umană, etc.). Astfel, s-a constatat că BSA are 4 situsuri de legare a Triton X-100, însă
legarea nefiind cooperativă (prezentă în cazul legării SDS), probabil, datorită concentrației micelare critice
relativ mici. Avantajul utilizării Triton X-100 derivă din capacitatea de solubilizare a proteinelor de
membrană când, în general, sunt preferați detergenți cu o concentrație micelară critică mai mică de 1 mM.
Pentru geluri native, discontinue, la aplicarea probei, este deobicei utilizat tamponul gelului superior,
diluat de 3-5 ori. De asemenea, colorantul trasor (de urmărire a migrării) și glicerolul (ori sucroza) sunt
adăugate, concentrația proteică fiind redusă în aceleași limite ca și cele utilizate în cazul SDS-PAGE. În
sisteme discontinue, volumul de probă nu este deosebit de important, după cum lungimea gelului de
concentrare este cel puțin dublă față de înălțimea volumului de probă, încărcată în godeu (Jovin, 1973).
În condițiile utilizării unor metode sensibile de detecție, este necesară o manipulare cu grijă a probei.
Gelurile colorate cu argint după SDS-PAGE uneori prezintă benzi artificiale în regiunea de masă
moleculară cuprinsă între 50-70 kDa precum și o linie neregulată verticală și distinctă, paralelă cu direcția
de migrare. Apariția acestor anomalii au fost atribuite unor contaminări (Ochs, 1983).
Pe de altă parte, soluțiile de monomeri, tamponul stoc al probei, tampoanele gelului și tamponul de
migrare trebuie să fie filtrate printr-o membrană de nitroceluloză și stocate în containere curate. De
asemenea este important a se curăța aparatul de electroforeză cu detergent și a se utiliza mănuși la
asambarea acestui echipament.
 3.6.6.3. Electroforeza nativă a proteinelor serice cu gel suplimentar de concentrare
Serul este un amestec foarte complex de proteine. Examinarea iniţială a proprietăţilor fizico-chimice
native şi funcţiile biologice ale proteinelor individuale din ser fiind frecvent realizată prin utilizarea
electroforezei pe gel de poliacrilamidă, în condiții native. Deseori se constată că folosind această metodă,
este dificil de izolat o proteină pură, datorită contaminării cu albumină, proteina serică prezentă în cea mai
mare concentraţie în probă.

Figura 3.41. (1) Reprezentarea schematică a preparării gelurilor de poliacrilamidă utilizate în separarea proteinelor pe gel de
poliacrilamidă în condiții native, cu includerea unui pat de gel de concentrare care conține și Blue Sepharose CL-6B. (2) Separarea
proteinelor serice prin native PAGE cu (A) ori fără (B) Blue Sepharose CL-6B, prezent în gelul de concentrare. Linia 1: 4µl de ser.
Linia 2:5µg de α1-antitripsină. Linia 3: 20µg de albumină. Linia 4, 5 µg de α1-antitripsină și 20µg de albumină. Linia 5: 4µl de ser
și 5µg de α1-antitripsină. HG, haptoglobină; TF, transferină; CP, ceruloplasmină; AT, α1-antitripsină. (După Muratsubaki, și colab.
2002).
Mai mult, albumina poate să interfere în detecția calitativă a altor proteine serice, precum α1-
antitripsina. Pentru eliminarea acestor dezavantaje pentru eliminarea albuminei din probă, este adesea
utilizat, în PAGE, un pasaj prealabil printr-o coloană de Blue Sepharose CL-6B (Tracy și colab., 1982;
Corthals și colab., 1997; Travis și Pannell, 1973). Procesul de separare se bazează pe afinitatea albuminei,
a unor lipoproteine, a unor kinazele şi oxidoreductazele piridinenucleotid-dependente pentru Cibacron
Blue F3G-A, un ligand atașat în structura Sepharose CL-6B, obținându-se astfel Blue Sepharose CL-6B
(Fisher și Whitt, 1979; Wille, 1976; Travis și colab., 1976; Bohme și colab., 1972; Wilson, 1976). Mai
mult, Muratsubaki, și colab. (2002) au descris o metodă simplă pentru detectarea proteinelor serice prin
PAGE în condiții native, în care Blue Sepharose CL-6B este încorporat în gelul de concentrare, pentru a
elimina proteinele cu afinitate pentru Cibacron Blue F3G-A. În figura 3.41. este prezentată o reprezentare
schematică a unui gel de poliacrilamidă utilizat în condiții native, cu includerea unui pat de gel de
concentrare care conține Blue Sepharose CL-6B (1) și o separare a proteinelor serice cu ori fără Blue
Sepharose CL-6B prezent în gelul de concentrare (2).
3.6.7. SISTEME TAMPON
Deşi cunoştinţele cu privire la proprietăţile geluri sunt relativ modeste, comportamentul ionilor din
soluțiile tampon, în condițiile aplicării unui câmp electric sunt bine-cunoscute, fiind astfel concepute o
serie de sisteme interesante și utile, astfel încât să existe o mai mare flexibilitate în alegerea protocolului
de separare (Chrambach şi Jovin, 1983; Hames, 1990; Laas, 1989; Mosher și colab., 1992).
Evident, tamponul de electrolit, are un efect profund asupra migrării electroforetice, caracteristicile
acestuia conducând la stabilirea condiţiilor electrice (intensitatea câmpului electric aplicat) care afectează
separarea şi de aici, rezoluţia. În acest context, proteinele diferă foarte mult în sensibilitatea lor, la tării
ionice diferite, interacțiile cu speciile ionice, pH-ul mediului şi necesitățile lor în diverși factori. Astfel,
sistemul de tampon utilizat este în funcție de proba care urmează să fie separată electroforetic. De altfel,
tamponul ales pentru separarea proteinelor prin electroforeză nativă (nedenaturantă) depinde, de multe ori,
mai mult de tipul proteinelor luate în studiu decât de cerințele electroforetice.
Sistemele electroforetice în care ionii unei singure soluții tampon sunt prezenți în probă, gel și
compartimentul electrozilor (concentrația lor putând fi diferită), la un pH constant se numesc sisteme
tampon continue. Un sistem continuu se poate utiliza atât pentru separarea acizilor nucleici cât și a
proteinelor, în tancul electroforetic folosindu-se acelaşi tampon, la un pH constant, ca și la prepararea
gelului. De asemenea, proba este încărcată direct pe gelul unde se va produce separarea electroforetică.
După cum moleculele vor migra prin porii de gel, acestea sunt fracţionate în funcţie de mobilitatea lor,
lățimea benzilor fiind determinată, în principal, de înălţimea volumului probei aplicate, parametru care
astfel limitează rezoluția în sistemele continue de electroforeză. Pe de altă parte, probele diluate necesită
volume mari pentru a furniza cantităţi detectabile de material, obţinându-se, în final, benzi relativ largi și
astfel utilizarea gelurilor cu o dimensiune a porilor constantă, limitează sistemele continue la probe care au
o concentrație mare de proteine și care conduc la cele mai bune rezultate. În astfel de proces de separare,
gelul are porii suficient de mici pentru a permite o separare în funcție de dimensiunile și sarcina
macromoleculelor din probă.
Unele proteine plasmatice și celulare se pot separa mai bine în geluri de poliacrilamidă cu gradient de
concentrație, în sistem continuu, când viteza de deplasare a proteinelor descrește în timp și ajunge la zero,
odată cu atingerea limitei lor de por. În acest fel, are loc o creștere a rezoluției de separare, electroforeza
cu limită de pori fiind foarte valoroasă pentru separări de proteine pe baza masei lor moleculare. Se poate
spune că într-un gel omogen separarea macromoleculelor se realizează în funcție de sarcină electrică și
masă moleculară, în timp ce într-un gel cu gradient de concentrație, separarea macromoleculelor se
realizează în funcție de masă moleculară. De exemplu, într-un gel omogen cu T%=7,5 α1-antitripsina are o
mobilitate mai mică decât albumina, migrând după aceasta, într-un gel în gradient de concentrație, α1-
antitripsina (MM=54.000 Da) va migra în fața albuminei (MM=68.000Da).
Folosind geluri de poliacrilamidă cu gradient liniar de concentrație (T[%]=3-30; C[%]=3,8), în sistem
de tampon continuu, se constată că distanța de migrare (D) este proporțională cu logaritmul timpului de
migrare după relația:

unde a reprezintă panta dreptei iar b este intersecția cu abcisa (figura 3.42).

Figura 3.42. Dreapta de regresie utilizată la calculul masei moleculare a unei macromolecule,
după electroforeză pe geluri cu gradient de concentrație a porilor.

Există o relație liniară între logaritmul masei moleculare și logaritmul pantei dreptei de regresie, dată
de relația:

care este utilizată la calculul masei moleculare a unei proteine studiate.

Odată cu introducerea sistemelor de tampon discontinue (multifazice) s-a îmbunătățit puterea de
rezoluție a procesului electroforetic. Astfel, sistemele de tampon discontinue utilizează ioni de tamponare
diferiți în gel şi în soluţiile de electrozi, fiind concepute pentru a intensifica zonele probei în separări de
înaltă rezoluţie. Studiile privind separarea macromoleculelor de ARN au pus sub semnul întrebării
necesitatea procesului de stivuire în cazul separării acizilor nucleici prin electroforeză pe geluri de
poliacrilamidă. Drept consecinţă, aproape toate electroforezele acizilor nucleici se realizează în sisteme
tampon continue (Richards și Lecanidou, 1971).
3.6.7.1. Sisteme de tampon discontinue
În esență, în cazul electroforezei zonale multifazice, discontinue, probele sunt aplicate pe un gel cu
porozitate mare, gelul de concentrare (stivuire), care serveşte ca și un mediu anticonvectiv. Toate speciile
ionice, inclusiv macromoleculele din probă, formează fronturi în mişcare în timp ce ionii din tamponul de
gel, formează un front care se mişcă înaintea componentelor din probă. Ionii din tamponul de electrozi
formează, de asemenea, un front care se mișcă în spatele ultimilor componente din proba supusă separării,
cu mobiliatea cea mai mică astfel încât ionii din probă (macromoleculele cu sarcină electrică) dintre
fronturile de tampon se concentrează (”se stivuiesc”) în zone extrem de înguste, aranjate în ordinea
descreșterii mobilităţii lor, nu mai mari de câteva sute de microni, cu conţinut proteic ridicat, de circa 100
mg/ml proteină (Chen și colab., 1978). Astfel, macromoleculele stivuite se vor deplasa prin pori mari ai
gelului de stivuire ca zone individuale foarte înguste, indiferent de volumul de probă iniţial intrând în gelul
restrictiv, de rezolvare (sau de separare), gel cu o pori de dimensiuni mici, în serii foarte înguste, aflate la
distanțe mici, unele de celelalte. Odată ajunse în gelul de rezolvare, cernerea devine predominantă şi
macromoleculele de probă "se destivuiesc" şi se separă, în funcţie de mărimea şi sarcina lor electrică.
Ornstein (1964) şi Davis (1964) au dezvoltat pentru prima dată sisteme electroforetice de înaltă
rezoluţie pe gel de poliacrilamidă (PAGE) pentru separarea proteinelor native. Sistemul propus de ei a
rămas popular fiind utilizat în continuare, pe scară largă. Acesta a fost conceput pentru analiza de proteine
serice, dar funcţionează bine pentru o gamă largă de tipuri de proteine. În esență, sistemul de tampon
Ornstein-Davis este prima tehnică de încercat atunci când se lucrează cu o probă nouă de proteine native.
Ornstein a recunoscut că o înaltă rezoluţie este atinsă atunci când zona de start a proteinelor din probă este
cât mai îngustă posibil. Astfel, el a conceput o metodă electroforetică care comprimă zonele de proteină cu
mult dincolo de limitele atinse prin alte procedee fizico-chimice. Formularea lui se bazează pe ecuaţiile
care descriu fluxul de curent în soluţii ionice şi proprietăţile tampoanelor.
O discuţie matematică a proceselor de electromigrare a fost realizată de Foret şi Bocek (1989) şi
Kleparnik şi Bocek (1991). Ideea lui Ornstein a fost cea de includere a proteinele din probă într-un tip de
sandwich intim, mărginit de două fronturi de ioni de electroliţi care se deplasează în câmp electric. Sub
influenţa câmpului electric, proteinele din probă devin comprimate între frontul de ioni conducător şi cel
de extremitate finală și segregă în zone învecinate, în ordinea de mobilităţi lor relative. Acest proces are
loc în regiune gelului cu pori mari, de concentrare. Proteinele din probă ajung la gelul de rezolvare într-o
bandă de start foarte subţire. Odată ce proteine trec în gelul de rezolvare, predomină efectul de separare
prin cernere moleculară. Astfel, sistemul Ornstein-Davis, folosește ioni de clorură ca ioni conducători,
după cum ionii glicinat sunt ioni finali, după cum ionii Tris sunt ioni comuni. În timp, prin analize
electrochimice s-au descris o serie mare de sisteme tampon care se pretează separării electroforetice. În
acest sens, Jovin (1973b), a propus 4269 de sisteme de tampon, care teoretic, acoperă gama de pH cuprinsă
între 2,5 și 11 din 0,5 în 0,5 unităţi de pH. Totuși, foarte puţine dintre aceste sisteme au fost efectiv
încercate, probabil ca o consecinţă a nomenclaturii greoie şi confuze precum şi a lipsei unei direcţii clare
cu privire la modul de a alege un sistem corect, pentru o aplicaţie dată (Chrambach şi Rodbard, 1981). De
altfel, Chrambach şi Jovin (1983) au simplificat nomenclatura şi au redus numărul de sisteme tampon la
19 variante.
Tratarea electroforezei discontinue de către Jovin (1973b, c, d), alături de studiile efectuate de Everaerts
și colab. (1976) şi Schafer-Nielsen şi Svendsen (1981) sunt mult mai cuprinzătoare şi corecte decât
abordarea lui Ornstein. Allen (1974) a elaborat o serie de sisteme alternative de tampon discontinuu, la
care se utilizează diferenţele de conductivitate, pentru a atinge îngustarea zonei electroforetice, la un pH
constant (Allen și colab., 1984; Allen şi Budowle, 1994).
De departe însă, cel mai popular sistem de electroforeză pe gel de poliarilamidă în prezență de
dodecilsulfat de sodiu (SDS-PAGE), este cel conceput de Laemmli (1970), care a încorporat SDS în
tampoanele descrise anterior de Ornstein și Davis.
3.6.7.1.1. Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în sistem Ornstein-Davis
Este instructiv de a considera evenimentele ionice care au loc în timpul electroforezei discontinue, mai
ales având în vedere că alte sisteme discontinue funcţionează prin mecanisme similare. Sistemul Ornstein-
Davis, foloseşte la separarea proteinelor, două tampoane diferite care conţin anioni diferiți şi un cation
comun. În momentul stabilirii unui câmp electric omogen, ionul clorură, prezent în gelul de poliacrilamidă
din momentul pregătirii soluției de polimerizare devine ion frontal în timp ce ionii glicinat care provin din
tamponul de migrare (tamponul de electrozi) devine ion terminal. Ionul Tris, comun, susţine
electroneutralitatea. Astfel, cele mai multe proteine serice care transportă sarcini negative nete migrează
spre anod.
Sistemul Ornstein-Davis constă din patru părţi interdependente: (1) un gel de stivuire (concentrare), (2)
un gel de separare, (3) un tampon de electrod (de migrare) şi (4) proba care urmează a fi fracționată.
Etapele succesive dintr-o separare electroforetică în sistemul de tampon descris de Ornstein-Davis sunt
prezentate în figura 3.43. După cum se observă, gelul este format din două secțiuni (figura 3.43, panel A),
o porțiune cu porozitate mare (gelul de concentrare) cu T%=4 este turnată peste gelul restricitiv de
rezolvare (T%=5-30). Gelul de concentrare conține tampon Tris-Cl, 0,125 M, pH=6,8, în timp ce gelul de
separare conține tampon Tris-Cl, 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele două zone de gel
este desemnată pentru a regla mobilitatea efectivă a ionului glicinat.
Stivuirea. Când este aplicată o tensiune de curent, ionii clorură din secţiunile de gel, proteinele
anionice din probă, precum şi ionii de glicinat din zona tamponului de electrod încep să se deplaseze spre
anod (figura 3.43, panel B). Tris-ul (o bază), precum şi orice altă proteină în formă cationică prezentă în
probă, migrează spre catod. Aşa cum ioni de clorură părăsesc proba, în spatele lor se crează o regiune
localizată, de conductivitate scăzută și câmp înalt. Câmpul crescut din spatele frontului de ion clorură
accelerează proteinele din probă şi ionii de glicinat din tamponul electrodului la aceeaşi viteză ca şi a
ionilor clorură (E•µ=constant). Gradul de ionizare a glicinei, la pH-ul tamponului de electrozi (pH=8,3)
este de aşa natură că mobilitatea efectivă a ionilor glicinat este mai mică decât ca a ionului clorură şi a
proteinelor din probă. De altfel, mobilitatea efectivă a unei electrolit slab reprezintă mobilitatea medie a
formei ionizate:
µef=µx,
unde x reprezintă fracţiunea de molecule ionizate la un pH specific iar µ este mobilitatea acestora. În acest
fel, fiecare moleculă poate fi gândită ca fiind ionizată x% din timpul de deplasare în câmp electric şi
neionizată restul timpului.

Figura 3.43. Etapele separării unui amestec de proteine în sistem discontinuu tampon Ornstein-Davis. (A) Gelul este format din
două secţiuni: un gel de concentrare, cu pori mari situat în parte superioară, peste un gel restrictiv de rezolvare (separare). Fiecare
secțiune de gel conţine tampon Tris-HCl, dar concentraţiile şi pH-urile celor două tampoane corespunzătoare celor două secţiuni sunt
diferite. Gelul de concentrație este indicat printr-o nuanță de gri deschis în timp ce gelul de separare este de culoare gri-închis. Proba
proteică dizolvată în tamponul gelului de concentrare diluat este plasată în godeurile gelului de concentrare (linii orizontale
întunecate). Tamponul de migrare Tris- glicină (de culoarea fondului figurii) este în contact cu partea de sus a gelului, partea de sus a
probei, precum şi partea inferioară a lui. Anodul este situat în partea inferioară a gelului iar catodul se află în zona superioară. În
acest sistem proteinele serice de exemplu, au sarcini nete negative şi se mișcă în jos spre anod. Ionii de Tris sunt distribuiți în întregul
sistem şi serveasc la menţinerea electroneutralității. Intensitatea câmpului electric (E), la scurt timp după aplicarea unei tensiuni
electrice, este reprezentată în graficul din partea dreaptă a imaginii. Câmpul electric existent în gel este relativ scăzut, ca o consecinţă
a conductivității relativ ridicate datorată ionilor de clorură, foarte mobili. (B) În momentul aplicării unei tensiuni electrice,
constituenții anionici ai sistemului se vor alinia în ordinea mobilităţilor electroforetice, ioni clorură (Cl-) având cea mai mare
magnitudine a mobilității, în zona tamponului de gel, mai mare decât mobilitatea ionului glicinat (Gly), provenit din zona tamponului
de electrozi. Proteinele din probă, cu mobilităţi intermediare, sunt introduse într-un sandwich (în ordinea de mobilitatea lor) între
frontul clorură şi frontul de ioni glicinat. Astfel, proteinele din probă devin "stivuite" în regiunea foarte îngustă dintre cele cele două
fronturi de ioni de tampon în mişcare şi formează, spațial, o zonă foarte îngustă de start. Intensitatea câmpului electric este
influenţată de distribuţie locală a purtătorilor de sarcină, care sunt proteinele din zona de probă. Intensitatea, E, a câmpului în zone
diferite care conțin ioni este ajustată, astfel încât toate fronturile ionice migrează cu aceeaşi viteză. (C). La scurt timp după ce
procesul de concentrare este finalizat, proteinele din probă trec în gelul de rezolvare care posedă pori mai mici și unde mișcarea este
încetinită datorită procesului de cernere moleculară. În gelul de rezolvare, ionii de glicinat depașesc proteinele din probă şi astfel vor
migra chiar în spatele ionilor clorură. (După Garfin, 1995).
Cum pKa a glicinei este pH=9,8 la pH=8,3, moleculele de glicină sunt disociate în proporție de 1/30 în
ioni glicinat. Ca urmare, o regiune a frontului mobil se formează rapid cu ioni de clorură, frontali și ioni de
glicinat în spatele lor, în timp ce proteinele din probă sunt comprimate între cele două fronturi. Astfel,
proteinele formează, zone individuale subțiri, așezate precum fișicul de monede, în ordinea descrescătoare
a mobilităţii lor, între ionul conducător, clorură şi ionul terminal, glicinat. În acest timp, pH-ul gelului de
concentrare devine 8,3 deoarece ionii de glicină se deplasează prin acest gel. În stiva creată, fiecare zonă
proteică se află într-un câmp electric scăzut care se mișcă în față și un câmp electric ridicat aflat în spatele
ei. Orice moleculă de proteină avansează în zona din fața sa unde întâlnește un câmp electric cu intensitate
scăzută, fiind încetinită până când zona sa îl va prelua. Invers, o moleculă proteică care provine spatele
acestei zone este accelerată de câmpul electric crescut de acolo. Ca atare, în starea de echilibru, fiecare
dintre proteinele prezente în probă este concentrată într-o zona îngustă, de înaltă densitate, determinată
exclusiv de mobilitatea sa, în condiţiile electroforetice date.
Separarea. După cum regiunile mobile aflate în deplasare ajung la interfaţa dintre gelul de concentrare
(stivuire) şi gelul de rezolvare, proteinele vor fi încetinite accentuat datorită existenței porilor restrictivi ai
ultimului gel. Concomitent, pH-ul este brusc crescut la valoarea de 8,8 şi creşte rapid, la un pH=9,5
deoarece Tris-Cl se înlocuieşte cu Tris-Glicinat. Mobilitatea efectivă a ionilor de glicinat la pH 9,5 este
destul de mare și ca atare depășec proteinele din probă care migrează chiar în spatele frontului de ionului
clorură, care sunt încetinite în mișcare de către porii reduși ai gelului de rezolvare și în aceste condiții,
zonele de proteine devin necomprimate, ele începând să se separe în benzi macroscopice datorită efectului
de cernere moleculară (figura 3.43, panel C).

Figura 3.44. Principiul electroforezei pe gel de

poliacrilamidă în sistem disconutinuu. (După
Westermeier, 1997).

In gelul de rezolvare, proteine se deplasează la un pH=9,5 (pH-ul de operare al gelului), introdus în

sistemul Ornstein-Davis pentru a asigura o mobilitate eficientă a glicinatului, mai mare decât cea a celei
mai rapide proteine serice (prealbumina) în cazul gelurilor cu T[%]=7,5 (Jovin, 1973d; Ornstein, 1964). În
plus, odată cu ridicarea valorii pH-ului, sarcina netă a proteinelor va creşte consecutiv (Westermaier,
2005). După cum are loc progresul migrării, benzile proteice, inițial foarte subțiri se dispersează de ordinul
milimetrilor, drept consecință a proceselor de difuzie și de diluție a fracției proteice. Figura 3.44 prezintă
schematic principiul electroforezei pe gel de poliacrilamidă în sistem disconutinuu, pe geluri cilindrice,
verticale.
3.6.7.1.2. Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în sistem Laemmli
Pentru a permite determinări ale greutate moleculară, Laemmli (1970) a modificat sistemul Ornstein-
Davis. Astfel, sistemul imaginat conține SDS în concentrație de 0,1% în tampoanele Ornstein-Davis şi
utilizează o etapă de denaturare, prin tratament termic al probei proteice (Bollag şi Edelstein, 1991;
Garfin, 1990a; Hames, 1990). Procedeul este astfel conceput pentru a denatura complet proteinele de
probă în componentele lor polipeptidice constitutive, înainte de electroforeză.
În momentul în care un amestec de proteine se incubează într-un tampon care conţine SDS şi un agent
tiol-reducător, cum ar fi 2-mercaptoetanolul la o temperatură crescută, proteinele sunt complet denaturate,
în timp ce polipeptidele rezultate, datorită prezenței SDS, se încarcă cu o sarcină negativă, uniform
repartizată pe sprafața lor, în raport cu masa lor moleculară. Astfel, agentul de reducere rupe legăturile
disulfurice între segmentele proteinelor native, în timp ce SDS, un denaturant bine-cunoscut, îmbracă
polipeptidele uniform, într-un raport bine-sabilit (Reynolds şi
Tanford, 1970). Ca atare, proprietăţile detergentui ecranează
proprietățile polipeptidelor, toate complexele SDS-polipeptide
iau o formă similară prelungită, asemănătoare unei vergea, cu
dimensiuni proporţionale cu greutatea lor moleculară. În plus,
densitatea de sarcină a complexelor SDS-polipeptidă este
independentă de pH în intervalul 7-10 și astfel fracţionarea în gel este guvernată strict de procesul de
cernere moleculară; în asemenea condiții, prin utilizarea acestui sistem se poate la estima greutățile
moleculare ale polipeptidelor separate.
Sistemele electroforetice descrise de Laemmli și Ornstein-Davis pot fi utilizate la separarea atât a
proteinelor cât și a acizilor nucleici (Tas, 1990). În cazul separării acizilor nucleici, este totuși preferat
sistemul Laemmli deoarece în cazul acestei tehnici, prezența SDS conduce la denaturarea nucleazelor,
enzime de multe ori contaminante.
3.6.7.2. Sisteme de tampon continue
Aproape orice tampon cu pH-ul cuprins între 3 şi 10 poate fi folosit în electroforeză. Astfel, McLellan
(1982) a compilat o listă deosebit de utilă de tampoane utilizate în electroforeză. Cele mai potrivite soluții
pentru separări electroforetice sunt cele care au o rezistenţă ionică relativ scăzută, deoarece această
proprietate menţine efectul Joule la un nivel minim. Pe de altă parte, în cazul în care puterea ionică este
prea scăzută, se pot înregistra procese de agregare a proteinelor. Astfel, alegerea tamponului va depinde de
proteina luată în studiu, deși în general, limitele concentraţiei ionilor tampon utilizați în electroforeză sunt
cuprinse între 0,01-0,1 M. Sistemele tampon continue caracteristice care au fost cel mai des utilizate sunt:
 Tris-glicină (intervalul de pH cuprins în domeniul 8,3-9,5) (Chen și colab., 1978b);
 Tris-borat (intervalul de pH cuprins în domeniul 8,3-9,3) (Margolis şi Kenrick, 1968);
 Tris-acetat (intervalul de pH cuprins în domeniul 7,2-8,5) (Fairbanks și colab., 1972).
Ionii borat pot forma complexe cu unele clase de structuri glucide şi prin urmare, pot influenţa
rezolvarea unor glicoproteine. Proteinele foarte bazice, cum ar fi histonele, sunt separate pe geluri în
tampon acid acetic-uree (Spiker, 1980).
Sistemul SDS-PAGE continuu descris de Weber şi Osborn (1969) folosește tamponul fosfat de sodiu
(pH=7,0), dar pentru a obține cea mai bună rezoluţie, după cum inexistența unui gel de stivuire limitează
acest procedeu la utilizarea sa doar în cazul probelor cu o concentrație proteică mare.
3.6.7.3. Alte sisteme tampon
Cel puţin teoretic, au fost descrise o multitudine de sisteme de tampon discontinue (Jovin, 1973a). ca
atare, în cazul separării unor proteine bazice, sistemul alanină-acetat cu un pH scăzut dezvoltat de Reisfeld
și colaboratorii (1962) este de multe ori excelent (Hames, 1990). Allen (1974; Allen și colab., 1984, 1989,
1993) pledează pentru utilizarea sistemelor Tris-sulfat/Tris-borat, Tris-formiat/Tris-borat, şi Tris-
citrat/Tris-borat pentru electroforeza atât a proteinelor cât și a acizilor nucleici (procesul de stivuire
îmbunătăţind rezoluţia de separare a acizilor nucleici).
Neville (1971) a elaborat o procedură deosebit de utilă pentru SDS-PAGE folosind un sistem tampon
Tris-sulfat/Tris-borat. (Acest sistem a fost de fapt, unul calculat după tratarea teoretică a lui Jovin și în
care ionii de clorură incluși în tamponul gelului inferior alături de schimbarea bruscă a pH-ului nejucând
un rol operațional în electrochimia acestei tehnici și astfel nefiind necesare). Mai exact, sistemul Neville a
fost dezvoltat pentru a concentra și fracționa proteine saturate în SDS în domeniul de masă moleculară 2-
300 kDa, el necâştigând o mare popularitate.
Un alt sistem SDS-PAGE este similar cu cel descris de Laemmli, dar în care Tris este înlocuit cu un
analog al său, amediol (2-amino-2-metil-1,3-propandiol) a fost descris de Wyckoff și colab., 1977. Acest
sistem pare să ofere o rezoluţie mai bună decât sistemele Laemmli sau Neville, în special în domeniul de
mase moleculare cuprinse între 1 și 10 kDa (Bury, 1981).
Înlocuirea glicinei cu Tricină în tamponul de de migrare, descris de Laemmli conduce la o separare
excelentă a polipeptidelor mici (Schagger şi van Jagow, 1987). La valorile de
pH utilizate, Tricina migrează mai rapid decât glicina în gelul de stivuire.
Acest fenomen este benefic în cazul complexelor SDS-polipeptide mici care
se separă astfel de banda largă de micelii formate de SDS, care se formează în
spatele frontului de ioni conducători.
În acest procedeu se utilizează în special geluri cu T[%]=16,5 și C[%]=3
pentru separarea proteinelor din domeniul de mase moleculare cuprins între 1
și 70 kDa. Rezoluţia este uneori îmbunătăţită prin includerea unui gel de spațiere cu T%=10 și C%=3 între
gelul de rezolvare și cel de stivuire (T[%]=4 și C[%]=3).
Tamponul de migrare este alcătuit din Tricină, 0,1M/SDS, 0,1%, pH=8,25 în timp ce tamponul probei
este alcătuit din Tricină-HCl, 0,1M, pH=6,8 care conține 2-mercaptoetanol, 2% (volum/volum), glicerol,
20% (greutate/volum), albastru bromfenol, 0,025% și SDS (nu mai mult de 1% pentru a obține o mai bună
rezoluţie a proteinelor mici de 1-5 kDa) după cum proteinele cu masă moleculară foarte mică nu sunt
complet fixate în gel şi astfel ele pot difuza în timpul colorării.
De remarcat că acest ultim sistem a devenit foarte popular în analizele de polipeptide.
3.6.7.4. Alegerea sistemului tampon
1. Proteine native. Alegerea sistemului de electroforeză pentru proteine depinde în special de
caracteristicile proteinelor de interes, după cum nu există un sistem de tampon universal, ideal, pentru
electroforeza tuturor proteinelor native. Din această cauză, atât stabilitatea proteinelor cât şi rezoluţia de
separare a acestora sunt consideraţii importante în selectarea tamponului.
Tampoanele Ornstein-Davis, reprezintă o primă alegere, recomandată de Ornstein (1964) și Davis
(1964). De asemenea, se recomandă utilizarea celor 19 tampoane discontinue selectate de către
Chrambach şi Jovin (1983), precum şi a tampoanelor continue elaborate de McLellan (1982). Compoziția
acestor tampoane continue este prezentată în tabelul 3.8.
Unele proteine native pot agrega şi în continuare precipita, la concentraţii foarte mari, fenomen care se
apare în timpul procesului de stivuire în condițiile unei separări în sisteme de tampon discontinue. Prin
urmare, se poate întâmpla ca astfel de proteine să nu poată intra în gelul de rezolvare ori ca gelul să
elibereze lent proteinele concentrate prin resolubilizarea acestora în timpul electroforezei. În cazul în care
proteinele de interes se comportă în acest mod, soluția probabil cel mai bună este cea de a utiliza un
procedeu de electroforeză în tampon continuu.
pH-ul ales trebuie astfel încât să fie în intervalul peste care proteinele de interes sunt stabile. Acesta
trebuie să fie, de asemenea, destul de departe de punctele izoelectrice ale proteinelor de interes care poartă
o sarcină electrică netă suficient de mare pentru a migra prin gel într-un timp rezonabil. Pe de altă parte,
separarea a două proteine la o concentraţie de gel dată este cea mai bună în apropierea punctelor lor
izoelectrice, deoarece în aceste condiții, proteinele se vor mișca lent în acel interval de pH. Astfel,
alegerea pH-ului este de obicei un compromis între considerente de rezoluţie de separare şi de stabilitate a
proteinei de interes.
Tabelul 3.8. Tampoane continue utilizate în electroforeza proteinelor native (După McLellan, 1982).
pH Componenta Cantitate/volu Componenta acidă (în Cantitate/volu
Tampona bazică m pentru o soluție paranteze sunt prescurtările m pentru o soluție
de 5X concentrată utilizate) de 5X concentrată
3,8 β Alanină 13,36g/l Acid lacticb 7,45 ml/l
1X = 30 mM 1X = 20 mM
4,4 β Alanină 35,64g/l Acid acetic 11,5ml/l
1X = 80 mM 1X = 40mM
4,8 acid γ- 41,24 Acid acetic 5,75ml/l
aminobutiric (GABA) 1X = 20mM
1X = 80 mM
6,1 Histidină 23,28g/l acid 2-(N-morfolino)-etan 29,28
1X =30 mM sulfonic (MES)
1X = 30 mM
6,6 Histidină 19,4g/l acid 3-[N-morfolino] 31,4g/l
1X =25 mM propan sulfonic (MOPS)
1X =30 mM
7,4 Imidazol 14,64g/l acid N-2- 41,71g/l
1X = 43 mM Hidroxietilpipera-zin-N'-
etansulfonic (HEPES)
1X = 35 mM
8,1 Tris[hidroximetil] 19,38g/l acid 4-(2-hidroxietil)-1- 37,85g/l
aminometan (Tris) piperazinpropanesulfonic
1X = 32 mM (EPPS, HEPPS)
1X = 30 mM
8,7 Tris 30,29g/l Acid boric 7,73g/l
1X = 50 mM 1X = 25 mM
10,2 Amoniac 12,5 ml/l acid N-Ciclohexil-3-amino 22,13g/l
1X = 37 mM propan-sulfonic (CAPS)
1X = 20 mM
Obs. aTampoanele descrise au o abatere a pH-ului de ±0,1 unități. Nu se ajustează pH-ul.
b
Acid lactic, soluție 85%
Pentru a obține cele mai bune rezultate în sisteme continue, concentraţiile proteinelor de interes trebuie
să fie de cel puţin 1mg/ml, pentru a menţine volumul probei la un nivel minim. În plus, proba trebuie să fie
încărcată într-un tampon cu o tărie ionică de aproximativ 1/2-1/5 din forța ionică a tampoanelor de gel şi
de migrare (deși în unele cazuri poate fi necesară o etapă de dializă), astfel că la căderea de tensiune care
se dezvoltă între electrozi, proteinele din probă să poată penetra gelul.
Alegerea concentrației corespunzătoare de gel este, desigur, critică în succesul unei separări, procesul
fiind puternic influenţat de concentraţia (T[%]) a gelului de poliacrilamidă. O valoare ridicată a T[%]
poate conduce la excluderea unor proteine din gel în timp ce la o valoare scăzută are ca efect o diminuare
a procesului de cernere moleculară. O abordare, utilă în cazul utilizării tampoanelor continue McLellan,
este cea de folosire a unor geluri cu pori relativi mari (T[%] cuprins între 5 și 7%) ori de a modifica
mobilităţile prin alterarea pH-ului. O abordare practică pentru sistemele discontinue este de a iniția
experimentele utilizând un gel cu T[%]=7,5; în cazul în care rezultatele nu sunt satisfăcătoare, se pot
încerca o serie de concentraţii de gel cu T[%] cuprins între 5% şi 15%. Gelurile cu gradient de pori pot fi,
de asemenea, încercate (Hames, 1990).
2. Proteine denaturate și acizi nucleici. În separările prin SDS-PAGE, este mai simplu de a se
identifica concentrațiile optime de separare a ADN comparativ cu necesitățile gelurilor utilizate în
separările proteinelor native, deoarece separarea complexelor SDS-polipeptide și a polinucleotidelor este
dependentă în principal de lungimea catenei. Gelurile Laemmli cu un T[%]=7,5 rezolvă proteine din
domeniul de mase moleculare de 40-200 kDa, cele cu T[%]=10% separă optim proteine din domeniul de
mase moleculare de 20-200 kDa, cele cu T[%]=12% rezolvă proteine din domeniul de mase moleculare de
15-100 kDa, în timp ce gelurile cu T[%]=15% rezolvă optim macromoleculele proteice din domeniul de
mase moleculare de 6-90 kDa.
Electroforeza fragmentelor de acizi nucleici este realizată cel mai adesea exclusiv în sisteme de tampon
continue. Tampoanele Tris/Borat/EDTA (TBE) și Tris/Acetat/EDTA (TAE) sunt cel mai des utilizate la
separarea ADN sau ARN atât pe geluri de poliacrilamidă cât și pe cele de agaroză. În plus, tampoanele
discontinue descrise de Allen pot mări rezoluția de separare (Allen și colab., 1989; 1993). Astfel, se
utilizează sistemul tampon discontinuu care utilizează anionul sulfat drept ion frontal și ionul borat ca și
ion terminal, ceea ce conduce la creșterea rezoluției cu 1,4 ori, ascuțirea benzilor și scăderea timpului de
migrare. Pentru a pregăti 1 litru de tampon stoc 5 x, utilizat la pregătirea gelurilor se utilizează 9,8 ml de
H2SO4 concentrat (96%) și 378g Trizma bază (pH=9,0), în timp ce pentru a prepara 1 litru tampon de
migrare (5 ori concentrat) se folosesc 43,5 g acid boric și 435 g Trizma bază (pH=9,0).
Carninci și colab. (1990) recomandă utilizarea unor geluri cu o grosime de 0,2 mm, 40 cm lungime și
20 cm lățime (Ansorge și Garoff, 1981). Ca urmare, în scopul preparării a 30 ml amestec de polimerizare
se adaugă 15 g de uree (pentru o concentrație finală de 8 M), 6 ml de tampon de gel de migrare (5 x),
Acrilamidă/Bis(T[%]=30%), apă dublu distilată (până la 30 ml), 30 µl de TEMED și 60 µl de persulfat de
amoniu (25%).
Gelurile de poliacrilamidă cu T%=5% și T%=10% sunt utilizate la separarea moleculelor lineare de
ADN din domeniul de mase moleculare de 200-2000 respectiv 50-1500 bp (Garfin, 1995).
3.6.8. ESTIMAREA MASEI MOLECULARE PRIN SDS-PAGE
În procedura descrisă de Laemmli, tratamentul probei anterior SDS-PAGE conduce la desfacerea
proteinelor în subunităţile lor componente care sunt în continuare acoperite de către detergentul anionic.
Mobilităţile electroforetice ale tuturor complexelor polipeptidă-SDS rezultate își asumă aceeaşi relaţie
funcţională din punct de vedere al masei lor moleculare. De altfel, într-o primă aproximare, vitezele de
migrare ale complexelor polipeptide-SDS sunt invers proporţionale cu logaritmul maselor lor moleculare.
Astfel, agregatele SDS-polipeptide, se vor deplasa prin geluri într-un mod previzibil: complexele cu masă
moleculară mică vor migra mai repede comparativ cu cele mari. Aceasta înseamnă că masa moleculară a
unei proteine poate fi estimată din analiza mobilităţilor relative ale subunităţilor sale, în condițiile SDS-
PAGE și în prezența unui calibrator (standarde), ceea ce conduce la una dintre cele mai importante
aplicaţii, cel mai des folosită în separările electroforetice, care reprezintă o parte semnificativă a
popularității SDS-PAGE.
În SDS-PAGE, masele moleculare sunt determinate prin compararea mobilităţii proteinei analizate,
față de mobilităţile unor proteine marker, cu masă moluculară cunoscută. Prin această procedură se pot
normaliza mobilităţile electroforetice, determinându-se valori măsurabile semnificative şi caracteristice. În
plus, prin determinarea mobilităţilor relative, este suficient să se calculeze factorul de întârziere, Rf, un
parametru relevant al mobilității relative.
În condițiile în care este bine-cunoscut faptul că la mulți coloranţi de origine sintetică de genul
albastrului de bromofenol (ABF) nu au fost complet investigate proprietăţile chimice, fizice şi
toxicologice, ei pot fi toxici (mai ales ca alergeni ori cancerigeni). De exemplu, s-a constatat că ABF poate
provoca reacții alergice și iritaţii însoțite de durere. Din acest motiv fişa tehnică de securitate a datelor
tuturor laboratoarelor care utilizează un standard de calitate prevăd ca fiind necesar ca persoanele care
lucrează cu ABF să acorde o atenție cuvenită manipulării acestei substanțe.
Siva și colab. (2008) propune utilizarea alternativă a unui pigment vegetal roșu-oranj (figura 3.45)
extras din semințele fructului de annatto (arborele Bixa orellana L.). Acest colorant posedă proprietăți
similare ABF și în plus nu interferă cu proteinele testate. Procedura de lucru este simplă, practică și
reproductibilă.

Figura 3.45. Structura chimică a izomerilor cis-bixină și nor bixină. Bixină: R

= CH3; Norbixină, R = H.

În scopul determinării masei moleculare, frontul de colorant poate fi marcat printr-o gradaţie la
marginea gelului sau prin introducerea unui ac îmbibat cu cerneală de India (India ink) înainte ca gelul să
fie colorat (când frontul de colorant nu mai este vizibil, după colorarea proteinelor). De asemenea, este
acceptabil să se normalizeze mobilităţile cu cea a uneia dintre benzile de proteine din gel. Reprezentarea
grafică a logaritmului masei moleculare a proteinei (log M) în funcție de mobilitatea relativă, Rf, conduce
la obținerea unei sigmoide (Hames, 1990) ușor asimilată unei drepte rezonabile (figura 3.46) când în
fiecare gel supus electroforezei se rulează o linie cu proteine standard cu mase moleculare cunoscute, în
paralel cu proteinele de testat.

Figura 3.46. O curbă de calibrare, logMr vs. Rf realizată pentru o serie

de markeri de masă moleculară cuprins în domeniul 10-20 kDa, separați
pe un gel omogen (T%=10% și C%=2,75%) de poliacrilamidă în
prezență de SDS. Se poate observa deviația de la linearitate. Proteinele
marker sunt: miozină (194 kDa); RNA polimerază (subunitatea β) (160
kDa); β galactozidază (116 kDa); fosforilază B (94 kDa); RNA
polimerază (subunitea β) (95 kDa); albumină serică bovină (68 kDa);
ovalbumină (43 kDa); RNA polimerază (subunitea σ) (38,4 kDa);
anhidrază carbonică (30 kDa); tripsinogen (24,5 kDa); β-1actoglobulină
(17,5 kDa); lizozim (14,5 kDa).

Astfel, graficul log M vs Rf construit din distanţele de migrare a standardelor conduc la calibrarea
curbei gelului. Valorile Rf ale proteinelor de testat sunt apoi comparate cu cele ale standardelor.
Interpolarea valorilor Rf ale proteinei de analizat pe curba standard oferă indicii aproximative asupra masei
moleculare.
Liniaritatea aparentă a curbei standard nu poate acoperi însă, întreaga gamă de mase moleculare pentru
un amestec de proteine separate într-un gel particular. Cu toate acestea, log M este suficient de aplatizat,
într-un sens matematic, pentru a permite estimări în masă moleculară destul de exacte care urmează să fie
făcute prin interpolare, şi chiar şi prin extrapolare, peste domenii relativ mari. Intervalele aproximative
utile a gelurilor după SDS-PAGE pentru estimări de masă moleculară sunt după cum urmează: pentru
mase moleculare din domeniul 40.000 la 200.000 Da, geluri cu T%=7,5%; pentru mase moleculare din
domeniul 30.000 la 100.000, geluri cu T%=10%; pentru mase moleculare din domeniul 15000 la 90000
Da, geluri cu T%=12%; pentru mase moleculare din domeniul 10.000 la 70.000 Da, geluri cu T%=15%.
Amestecuri de proteine standard cu masă moleculară cunoscută sunt disponibile în comerţ pentru
calibrarea geluri în vederea electroforezei proteinelor.
Este important să se aibă în vedere faptul că masele moleculare obţinute prin SDS-PAGE după
protocolul descris de Laemmli sunt cele ale subunităţilor polipeptidelor şi nu cele ale proteinei
oligometrice, native. Mai mult decât atât, proteinele care sunt incomplet saturate cu SDS, unele
polipeptide foarte mici, proteinele foarte mari şi cele conjugate cu glucide sau lipide se comportă anomal.
Cu toate acestea, SDS-PAGE oferă estimări rezonabile în masă moleculară pentru cele mai multe proteine.
În plus, curbe standard similare pot fi construite și pentru acizi nucleici. Pentru estimări de dimensiuni
moleculare, macromoleculele de ADN şi ARN trebuie să fie în configuraţii în care mobilităţile lor depind
numai de lungimea lanţului. Probele de ARN trebuie să fie libere de agregate şi de structuri legate prin
punți de hidrogen. Din această cauză, ureea este de obicei inclusă în gelurile destinate determinării masei
moleculare ale acizilor nucleici monocatenari în timp ce standarde de acizi nucleici cu dimensiuni
cunoscute sunt disponibile comercial.
3.6.8.1. Markeri de masă moleculară utilizați în SDS-PAGE
Este important a avea la îndemână o gama largă de markeri, astfel încât să se exploreze orice
dimensiune de masă moleculară a oricărui polipeptid. Astfel, în tabelul 3.9, sunt enumerați o serie de
marker care ar trebui să suficienți pentru cele mai multe scopuri, deoarece aceștia se întind pe un interval
de aproximativ 1000 de ori al masei moleculare (deşi markeri cu masă mai mică de 10 kDa sunt mai rar
folosiți).
Tabelul 3.9. Proteine-marker de masă moleculară, utilizate în SDS-PAGE
Masă Masă
Proteină Proteină
moleculară moleculară
Bacitracină 1480 Enolază (mușchi) 41000
Avidină 1600 Ovalbumină 43000
Glucagon 3500 Fumarază (mușchi) 49000
Insulină (formă redusă) 6600 Catene grele IgG 50000
 Inhibitor al tripsinei (Lima bean) 9000 Glutamat dehidrogenază (ficat) 53000
Citocrom C (mușchi) 11700 Piruvat kinază (mușchi) 57000
α-lactalbumină 14176 Catalază (ficat) 57500
Lizozim 14314 Bovin serum albumină 66290
Ribonuclează B 14700 Transferină 76000
Hemoglobină (catene β) 15500 Plasminogen 81000
Mioglobină 17200 Lactoperoxidază 93000
β-lactoglobulină B 18363 Fosforilază a (mușchi) 100000
Inhibitor al tripsinei (Soybean) 20095 Ceruloplasmină 124000
Tripsină 23300 β-lactosidază (E . coli) 130000
Chimotripsinogen 25666 Albumin serică (dimer) 132580
Anhidrază carbonică B 28739 Imunoglobulină G (neredusă) 150000
Carboxipeptidază A 34409 Imunoglobulină A (neredusă) 160000
Pepsină 34700 α2-macroglobulin (redus) 190000
Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenază (mușchi) 35700 Miozină (catenă grea) 220000
Lactat dehidrogenază (mușchi) 36180 Tiroglobulină 335000
Aldolază (mușchi) 38994 α2-macroglobulină (neredusă) 380000
Alcool dehidrogenază (ficat) 39805 Imunoglobulină M (neredusă) 950000
Amestecurile de proteine cu masă moleculară cunoscută (kiturile de masă moleculară) acoperă
intervale ale masei moleculare pe domenii limitate. De exemplu, sunt comercializate trei seturi de markeri:
(a) pentru un domeniu scăzut, (b) mare și (c) pentru o arie largă, care pot fi utilizați ca standarde în
intervale cuprinse între 14.000-90.000 Da, 45.000-200.000 Da, respectiv 6.500-200.000 Da. Dacă aceștia
nu sunt de ajuns, se pot pregăti o serie proprie prin reticularea catenelor polipeptidice ale unor proteine
mici (de exemplu, lizozim, hemoglobină, albumină serică bovină). În acest scop, Payne (1973) a propus
un protocol de reticulare care utilizează glutaraldehida pentru pregătirea unor polimeri solubili, cu valori
de masă moleculară cuprinse între 3•104 până la 2•107. Pe de altă parte, Wolf și colab. (1970) au obţinut o
serie de familii de polimeri similari prin reticulare cu ajutorul dietilpirocarbonatului. Cu toate acestea,
acești oligomeri formați prin reticulare au fost supuși unor critici (Steele și colab., 1978), deoarece ei au
tendinţa de a migra mai rapid decât proteinele, ducând astfel la supraestimarea aparentă a valorii masei
moleculare cu 5-15%, atunci când sunt utilizați ca markeri.
O varietate de standarde de masă moleculară modificate chimic sunt astfel disponibile, după cum se
observă mai jos:
a. Standarde de proteine precolorate pregătite prin legare covalentă la cromofori. Cu toate acestea, un
dezavantaj posibil a acestui tip de standarde este faptul că valorile lor de masă moleculară sunt previzibile,
după modificarea chimică și astfel, fiecare lot produs al aceleași proteine poate avea dimensiuni aparent
diferite după cum se observă prin SDS-PAGE.
b. Standarde marcate cu biotină sau cu 14C pentru SDS-PAGE care permit evaluări corecte de masă
moleculară direct pe membrane, după Western blotting.
c. Proteine ladder care constau din proteine spațiate egal (în termeni de masă) preparate printr-o
oligomerizare controlată cu agenți de reticulare adecvați.
Figura 3.47. O hartă de migrare a proteinelor pe gel. Poziția relativă a proteinelor standard sunt prezentate pentru o serie de geluri,
după separare în SDS-PAGE, procedura Laemmli (în geluri omogense și în gradient de pori). (După Garfin, 2003).
Este ușor să se aleagă concentrațiile optime ale gelului (%T) necesar separării proteinelor mai ales în
sistem SDS-PAGE decât pentru cele separate prin electroforeză în condții native deoarece în primul caz
are loc rezolvarea complexelor proteină-SDS, proces care este în principal dependent de lungimea catenei
polipeptidice a componentelor probei. În acest sens gelurile Laemmli (T[%]=7,5%) rezolvă proteine din
domeniul de mase moleculare cuprinsă între 40 și 200 kDa, în timp ce gelurile T[%]=10% rezolvă
proteinele cu greutate moleculară cuprinsă între 20 și 200 kDa, gelurile cu T[%]=12% rezolvă proteinele
cu greutate moleculară cuprinsă între 15 și 100 kDa, iar gelurile cu T[%]=15% rezolvă proteinele cu
greutate moleculară cuprinsă între 6 și 90 kDa (figura 3.47).

Researchers have settled on C values of 5.0% (19:1 acrylamide/bis) for most forms of denaturing DNA
and RNA electrophoresis and 3.3% (29:1) for most native DNA and RNA gels. For SDS-PAGE
electrophoresis of proteins, the standard C value that has been adopted is 2.6% (37.5:1). The table below
gives recommended acrylamide/bis ratios and gel percentages for different molecular size ranges.

Polyacrylamide Gel Solutions

Recommended appplications for each for each formulations shown in bold
Dupa https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/polyacrylamide-matrix

Acrylamide:MBA Denatured
Native
Gel % DNA/RNA Protein (kD)
Ratio DNA/RNA (bp)
(bp)

19:1 4 100-1500 70-500 100-200

" 6 60-600 40-400 40-150

" 8 40-500 20-200 20-100

" 10 30-300 15-150 15-70

" 12 20-150 10-100 8-60

29:1 5 200-2000 70-800 >150

" 6 80-800 50-500 50-200

 " 8 60-400 30-300 30-125

" 10 50-300 20-200 20-100

" 12 40-200 15-125 10-70

" 20 <40 <40 <30

37.5:1 6 -- -- 60-200

" 8 -- -- 50-150

" 10 -- -- 25-100

" 12 -- -- 15-80

Matrix formulations for various applications.

3.6.8.2. Premarcarea cu coloranți fluorescenți.

În SDS-PAGE proteinele premarcate cu un marker colorat sau fluorescent și-au găsit o aplicaţie
majoră. În același timp, trebuie avut în vedere că în general, introducerea acestor grupări modifică sarcina
netă a moleculei prin reacţii care implică grupările terminale α-NH2 şi cele ε-NH2 ale resturilor de lizină.
Dacă în tehnici precum disc-electroforeza, izotacoforeza ori în focusarea izoelectrică această
modificare produce alterări ale mobilității electroforetice și prin urmare conduce la generarea unei serii de
benzi proteice de mobilitate uşor schimbată, în SDS-PAGE, sarcina intrinsecă a catenei polipeptidice nu
este importantă (într-o anumită măsură); astfel moleculele marcate ori nemarcate migrează împreună în
funcţie numai de mărimea lor. Creşterile de mici dimensiuni cauzate de introducerea grupării chimice nu
poate fi, de obicei detectată prin SDS-PAGE (dat fiind faptul că, în scopul de a rezolva benzile adiacente,
ar fi nevoie de o creştere a masei cu minimum 2000 Da, dar care este uşor de detectat prin tehnici moderne
precum spectrometria de masă) şi care conduce, de obicei, la formarea unei zone mai difuze de analit
(Burlingame și colab., 1998; Ogorzalek și colab., 1996; Jeannot și colab., 1999; Liang și colab., 1996;
Strupat și colab., 1994).
Griffith (1972) a propus premarcarea proteinelor cu un colorant precum Remazol (care reacţionează cu
grupările -SH, amino- primare şi secundare precum şi cu grupările –OH, alcoolice), în timp ce Bosshard şi
Datyner (1977) au utilizat Drimarene Brilliant Blue și Uniblue A.
Inouye (1971) a încorporat în proteine marker-ul fluorescent, 1-dimetilaminonaftalen-5-clorură de
sulfonil (clorură de dansil), la care nivelul limitei de detecţie este mai mică de 8 ng proteină/bandă.
Alți markeri fluorescenți utilizați la evidențierea proteinelor sunt:
4-fenilspiro [furan-2 (3H), 1'-ftalan-3,3'-diona, fluorescamina (Ragland și colab., 1974) (figura 3.48);
 2-metoxi-2,4-difenil-3 (2H) furanona, MPDF (Barger și colab., 1976);
 o-ftaldialdehida, OPA, (Weidekamm și colab., 1973).
MPDF a fost raportată a fi de aproximativ 2,5 ori mai sensibilă decât fluorescamina în timp ce OPA
este cu un ordin de mărime sau mai mult mai sensibilă decât fluorescamina.
 Figura 3.48. Reprezentarea reacției fluorescaminei cu
proteinele și structura fluoroforului format (R-NH2 reprezintă
un rest amino al proteinei). (După Pace și colab., 1974).

Un alt agent de marcare este N-iodoacetil-N'-(5-sulfo-1-naftil) etilendiamina (IAEDANS), un reactiv

modificat al acidului iodoacetic, format prin legarea sa la un fluorofor, acidul amino-naftolsulfonic (figura
3.49).

Figura 3.49. Structura chimică a acidului 5-({2-[(iodoacetil) amino]etil}amino)

naftalen-1-sulfonic (IAEDANS), un fluorofor organic, solubil în dimetilformamidă
(DMF) ori în soluții tampon cu un pH în jur de 6 și care reacționează cu grupările tiol
primare ale proteinelor.

Compusul reacționează și modifică în mod specific resturile Cys, manifestând un maxim al excitaţiei la
λ=340 nm şi un maxim de emisie la λ=418 nm (Ursitti și colab., 1995).
3.6.9. ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ ÎN GRADIENT DE
POROZITATE
Migrarea macromoleculelor într-o matrice de gel cu o concentraţie graduală și continuă (ceea ce
semnifică un gradient de porozitate), are ca efect compactarea zonelor de proteine de-a lungul direcției de
migrare, astfel că banda proteică, traversează concentrații din ce în ce mai mari de gel, iar viteza sa de
migrare scade continuu. Acest proces conduce la o îngustare progresivă a benzii proteice.
Există o serie de motive pentru a recurge la geluri de porozitate graduală. Electroforeza pe geluri de
poliacrilamidă separă macromolecule pe baza atât a dimensiunilor lor cât şi pe baza diferenței de sarcină
superficială netă. În acest caz, influenţa sarcinii electrice a moleculei poate fi eliminată, metoda putând fi
utilizată, cu o calibrare corespunzătoare, pentru măsurarea dimensiunii moleculare (Mr). Acest proces a
fost realizat prin două căi principale de depăşire a efectelor sarcinii electrice. Într-una, o cantitate relativ
mare de ligand încărcat electric, cum ar fi dodecil sulfatul de sodiu (SDS), este legat de proteine, ecranând
în mod eficient sarcina electrică iniţială (intrinsecă) prezentă pe moleculele de proteine şi conducând la o
sarcină cvasi-constantă al raportului sarcină electrică/masă moleculară. În plus, în SDS-PAGE proteinele
sunt, în general, disociate în subunităţile polipeptidice constitutive, proces asimilat, de cele mai multe ori
cu pierderea concomitentă a integrităţii funcţionale al acestora. Prin urmare, păstrarea dimensiunilor
iniţiale a moleculei native trebuie să fie evaluată în absenţa unor substanţe denaturante.
O a doua metodă de măsurare a Mr, poate fi realizată pe baza măsurătorile matematice prin care se
anulează efectele date de sarcina electrică, asupra mobilității proteinelor native, în geluri de concentraţii
(T[%]) diferite. Acest primncipiu a condus la ”reprezentarea Ferguson” descrisă mai sus. Cu toate acestea,
această abordare de determinare a masei moleculare nu a găsit aplicații pe scară largă, deoarece este
laborioasă şi costisitoare în termen de timp şi material biologic (probă).
Din această cauză s-a introdus o a treia metodă de determinare a dimensiunilor moleculare: cea de
utilizare a gelurilor în gradient de porozitate. Principiul tehnicii este prezentat în figura 3.50, când, după o
separare electroforetică în timp suficient (de cel puţin 10 kV•h) pentru ca mobilitatea proteinelor să fie
constantă şi în cele din urmă să înceteze pentru că fiecare element constitutiv al probei să ajungă într-o
regiune a gelului cu o densitate la care dimensiunea medie a porilor se apropie de diametrul proteinelor
(limita de pori). Astfel, raportul dintre distanţele de migrare ale unei proteine cu cea a oricărui alteia
devine o constantă, după ce au intrat toate într-o regiune a gelului în care acestea sunt supuse unor condiţii
de cernere drastică. Din această cauză, profilul electroforetic devine constant după o migrare prelungită
într-un gel cu gradient de concentrație.
Concentraţia de gel, la care rata de migrare pentru o proteină dată devine constantă se numeşte limită
de pori: dacă această porozitateeste marcată în mod corespunzător cu ajutorul unui set adecvat de
proteine marker, atunci este posibil să se coreleze distanţa de migrare a oricărui element constitutiv dintr-
un amestec de proteine cu masa sa moleculară.

Figura 3.50. Reprezentare grafică a logaritmului mobilității electroforetice a

proteinelor serice în funcție de timpul de separare, în condițiile utilizării unui gel
în gradient de pori la un grad de reticulare, constant de C%=5%. (După
Margolis și Wrigley, 1975).

După ce migrarea electroforetică a fost efectuată, datele experimentale colectate, există două modalităţi
de bază pentru calculul matematic: una dintre metode presupune două etape iar cealaltă necesită o singură
etapă.
(a) În primul caz, distanţa de migrare a proteinelor este reprezentată grafic în funcție de rădăcina
pătrată a timpului de electroforeză. Dacă se reprezintă astfel de pante de regresie obţinute în funcție de
masele lor moleculare, se obține o corelație liniară, care permite măsurători ale masei moleculare a
proteinelor necunoscute în domeniul 2•105 şi 106 Da. Forma proteinelor (globulare sau fibrilare),
conţinutul lor de carbohidraţi (până la 45%), precum şi mobilitățile lor electroforetice în mediu liber (între
2,1 și 5,9•10-5 cm2•V-1•s-1) nu par a fi esenţiale pentru o bună măsurare a masei moleculare prin această
procedură.
(b) În metodele cu o singură etapă se reprezintă grafic logaritmul masei moleculare în funcție de %T
și se obține o dreaptă de regresie, care permite estimarea exactă a masei moleculare a proteinei
necunoscute.
Următoarele ecuaţii empirice, leagă parametrii de mai sus:

unde -e’ și –e” reprezintă pantele diverselor drepte de regresie, în timp ce y’ și y” sunt punctele de
intercepție cu axa 0y, care conduc la identificarea concentraţiei gradientului de gel, în timp ce T și D’
reprezintă distanța de migrare (mm).
Logaritmul (Mrmax) sau log (Rsmax) corespunzătoare acestei concentrații este de ordinul a 1,3•106 Da
(Rs=9,3 mm). Corelaţiile Mr–%T ori log Mr–D’ nu sunt semnificativ modificate pe durata electroforezei.
Prin urmare, indiferent de cât timp de separare este efectuat trebuie să fie obţinută o valoare constantă a
Mr pentru o proteină stabilă. De asemenea, s-a demonstrat că aceeaşi relaţie matematică de mai sus (log
Mr versus D’) este, de asemenea, aplicabilă în cazul electroforezei pe poliacrilamidă în gradient liniar de
gel, în prezență de SDS.
Gelurile în gradient, la care dimensiunile porilor de schimbă continuu în direcția migrării, sunt
populare în analizele amestecurilor complexe de proteine, în intervale de mase moleculare mari (Allen și
colab., 1984; Allen și Budowle, 1994; Andrews, 1986; Hames, 1990). Astfel, într-un astfel de gel la care
porii devin din ce în ce mai mici, se observă o îngustare aparentă a benzii proteice după cum moleculele
migrează spre limita lor de pori, unde sunt stopate în mișcare (Margolis și Kenrick, 1968; Rodbard și
colab., 1971). Această proprietate poate fi avantajoasă într-un număr de cazuri. De exemplu,
comportamentul anormal a glicoproteinelor în SDS-PAGE, datorită legării variabile a SDS, poate fi
înlăturat în geluri în gradient în care efectele de cernere moleculară predomină față de cele de sarcină
electrică.
Marele avantaj al gelurilor cu gradient de pori este reprezentat din faptul că se pot rezolva atât
macromolecule mari cât și mici pe același gel. Cu toate acestea, ele nu pot atinge o rezoluție mare între
două molecule ca în cazul separării pe geluri de poliacrilamidă cu o singură concentrație a porilor. O
abordare optimă este cea de a utiliza gelurile în gradient de pori la estimarea complexității unor
amestecuri, ceea ce de multe ori poate fi suficientă în unele scopuri, deși o mai bună rezoluție necesită
geluri cu pori uniformi.
Pentru producerea gradienților de poliacrilamidă cu aproape orice formă sunt disponibile diverse
dispozitive, unele posedând pompe programabile, complexe care formează gradienți hidrostatic. Sunt de
asemenea comercializate geluri preturnate cu gradient de pori.
Sistemele de tampon discontinue conduc la cea mai bună rezoluție în gelurile cu gradient: minigelurile
cu un gradient de T%=4-15%, bazate pe tampoanele Laemmli, rezolvă complexe SDS-polipeptide în
domeniul de masă moleculară 40-200 kDa în timp ce minigelurile cu un gradient de T%=4-20% și 10-20%
separă complexe SDS-proteine cu o masă moleculară cuprinsă între 10 și 100 kDa.
O abordare alternativă pentru determinarea masei moleculare folosind geluri de poliacrilamidă în
prezență de SDS și în gradient liniar de pori a fost dezvoltată de Rothe şi Maurer (1986). ]n acest caz, un
grafic liniar este realizat după relația:

unde D este distanţa de migrare (mm) şi a şi b sunt panta,respectiv intercepția dreptei (vezi figura 3.51).

Figura 3.51. Reprezentarea Rothe şi Maurer (1986) de determinare

a masei moleculare după SDS-PAGE, folosind un gradient linear de
pori. Curba arată o relaţie liniară între logaritmul masei moleculare
și √D (D1/2) pentru o serie de 34 de proteine standard care acoperă
domeniul de masele moleculare cuprinse între 13.000 și 95.000 Da,
separate pe un gel în gradient T[%]=3-30% (la un C[%] constant de
8,4%).

Liniaritatea este independentă de sistemul de tampon, de concentraţia de agent de reticulare, în

intervalul C[%]=1-8% ori în intervalul de gradient de concentraţie T[%] din domeniul 3-30%, la o
lungime a gelului cuprinsă între 8 şi 15 cm, cu toate că valorile a şi b sunt modificate odată cu schimbarea
acestor parametrii.
Relaţia liniară dintre log10Mr și √D este, în practică, independentă de timp, astfel încât estimările de
masă moleculară pot fi realizate în condițiile unei rezoluții optime a probei proteice particulare care
urmează a fi analizate. Astfel, gelurile pot fi preparate în orice formă de gradient de concentrație care se
potrivesc cerinţelor specifice de separare. Cu toate acestea, cea mai mare parte a lucrărilor publicate se
referă la utilizarea de gradienți simpli, liniari sau concavi. Având în vedere că dimensiunea porilor este o
funcţie de 1/√(T[%]), într-un gradient liniar modificările dimensiunii porilor sunt mai line, mai treptate, de
la pori mari spre pori mici în funcție de valoarea T[%]. Astfel, moleculele mici, trebuie să migreze pe o
lungime considerabilă de gel, până la o porozitate apropiată de limita porilor. Gradienții convecși de
concentrație ar agrava în mod natural această situaţie, dar în geluri cu gradient concav limita porilor este
atinsă mai rapid decât în gelurile cu gradienți liniari. Practic, orice dispozitiv pentru pregătirea soluţiilor de
gradienți poate fi aplicată pentru formarea de geluri în gradient. Cel mai simplu aparat pentru prepararea
gradientului liniar necesită două vase identice, un agitator şi tubulatură, după cum se prezintă în figura
3.52. Dacă forma vaselor este identică, când un volum de soluţie părăsește incinta C, pentru a se menţine
echilibrul hidrostatic, jumătate de volum va trece din rezervorul de B în C. Dacă camera de amestecare C,
este umplută cu soluţie de concentrație T% mare iar rezervorul B cu o soluţie diluată, în timp ce conținutul
camerei C este agitat continuu, apoi concentrația T% de monomeri din camera de amestecare, va scădea,
proces regăsit și la nivelul casetei de turnare a gelului, J. Astfel, caseta J, de polimerizare, va conţine un
gradient liniar descrescător de porozitate.

Figura 3.52. Schema unui sistem pentru turnarea gelurilor de poliacrilamidă în gradient linear: A, dispozitiv bicameral de formare a
gradientului; B, rezervor; C, cameră de amestecare; D, supapă; E, bară magnetică de agitare; F, agitator magnetic; G, robinet; H,
pompă peristaltică; I, tubulatură; J, casetă de turnare a gelului placă vertical. (După Dunn, 1993).

Au fost publicate o serie de metode de preparare a gelurilor în gradient, însă toate sunt practic doar
variante ale acestui concept simplu (Caton și Goldstein, 1971; Arcus, 1967; Pratt și colab., 1969;
Gianazza și colab., 1979). Micile corecturi se referă la volumele soluţiilor din rezervorul B şi camera de
amestecare, C sunt făcute pentru a permite densităţi diferite ale celor două soluţii, la volumul dislocuit de
bara magnetică de agitare şi la diferenţele de nivel de produse de forţele dinamice care rezultă prin
acţiunea de agitare. De exemplu, alături de dispozitivul de formare a gradientului se atașează o tijă
compensatoare, ori un con de compensare proiectat de Svensson (1967) și utilizat la prepararea pantelor de
densitate de zaharoză în focalizarea izoelectrică. Calitatea gradientului generat poate fi verificată prin
adăugarea unui colorant, cum ar fi p-nitrofenolul (Lorentz, 1976) sau albastru de bromofenol (Gorg și
colab., 1980) într-unul dintre rezervoare şi apoi de scanarea gelului cu un densitometru.
În cazul în care se are în vedere turnarea simultană a unui număr de geluri placă verticale, procedura
utilizată pe scară largă pentru pregătirea gradientul de gel este aceea descrisă de Margolis şi Kenrick
(1968), aşa cum este ilustrată în figura 3.53, în care componentele cu concentrații de monomeri diferite
sunt introduse prin partea de jos printr-un sistem dreptunghiulare, în care plăcile de gel sunt așezate pe o
platformă din material plastic.
Aparatul are avantajul că poate pregăti în acelaşi timp un număr de geluri placă, astfel încât
reproductibilitatea gradientul într-un lot de geluri preparate va fi foarte mare. Evident, că soluţia de
gradient este introdusă prin partea de jos a sistemului de plăci, de la o concentrație mică spre o
concentrație mare a T[%]. Trebuie totuși să se evite apariția unor curenți de convecție, inclusiv cei
generați de căldura produsă in timpul reacţiei de polimerizare. Acest lucru este evitat atât prin includerea
zaharozei (sau a glicerolului) în amestecul de polimerizare alături de creerea unui gradient paralel de
concentrație a catalizatorului și inițiatorului reacției de polimerizare (TEMED şi persulfat de amoniu),
astfel încât reacția de polimerizare să se manifeste mai întâi în partea superioară a gelului în gradient (cel
mai diluat), după care să se realizeze în josul gelului. Totuși, folosirea gradientului de catalizatori este prea
greoaie şi rareori, a fost adoptată în laborator după ce Righetti și colab. (1994) au demonstrat că, în
prezenţa gradienţilor densitate şi în geluri subţiri (cele mai populare astăzi) astfel de fluxuri convective (pe
care le-ar face un gel foarte neomogen) sunt, în esenţă, eliminate.
Limitele concentrației aleasă pentru gradient depinde de compoziția probei ce urmează a fi separată.
Gradienți de tipul 4-24, 4-26, 4-30, 2-30% etc., sunt considerați în general mai potriviți să fie utilizați
pentru cele mai multe probe proteice (de exemplu proteine serice, proteine urinare, etc.), deși dacă timpul
de electroforeză este prelungit, este posibil ca proteinele cu Mr în jur de 30,000 Da să migreze în afara
gelului. Felgenhauer (1979) a utilizat gradienți de 20-50% pentru proteine cu masă moleculară în jurul
valorii 30.000 Da. Gradienții de 2,5-12% ori 2-16% (Caton și Goldstein, 1971) dau rezultate bune pentru
amestecuri de proteine cu masă moleculară cuprinsă în domeniul 100.000-5.000.000 Da.
 Figura 3.53. Reprezentarea schematică a unui aparat
pentru prepararea unui număr de geluri de
poliacrilamidă cu gradient liniar de pori: A, sistem de
producere a gradientului; B, rezervor (concentrație
mare de monomeri, T% mare); C, cameră de
amestecare (concentrație mică mare de monomeri, T%
mică); D, valvă; E, bară magnetică; F, agitator
magnetic; G, robinet de închidere; H, pompă
peristaltică; I, casetă de turnare a mai multor copii de
geluri verticale. (După Dunn, 1993).

De obicei, soluțiile utilizate la obținerea gradienților au C[%]=5% pentru orice valoarea a lui T[%].
Campbell și colab. (1983) au arătat că, după cum mărimea porilor este minimă la aproximativ C = 5%
pentru geluri cu o valoare a lui T% în jur de 20%, proporția de agent de reticulare necesară pentru
obținerea unor pori minimi, crește odat[ cu T[%]. Astfel, este indicat să se maximizeze domeniul mărimii
porilor pentru oricare domeniu de concentrație particulară a gelului realizându-se astfel geluri cu un grad
de reticulare egal cu 5% când efectul maxim de cernere moleculară se obține la gelurile cu T[%]=40% și
C[%]=12,5 și s-a sugerat că acestea trebuie să fie condițiile de limitare a gelurilor în gradient.
Utilizând geluri în gradient cu T[%]= 3% și C[%]=4% în partea superioară și T[%]= 40%,
C[%]=12.5% la extremitatea inferioară, s-a obținut o rezoluție excelentă a proteinelor în domeniul de masă
moleculară cuprins între 670.000 și 14.000 Da, putându-se astfel chiar separa peptide produse prin digestia
cu tripsină a albuminei serice bovine (Rodbard și colab., 1971).
Pe de altă parte, toate treptele toate etapele mai sus prezentate pot fi realizate cu o mare versatilitate și
cu un control înalt asupra reproductibilității gradientului dacă se utilizează în crearea acestui gradient a
unui microcomputer, după cum se observă în figura 3.54. În acest caz, se activează o valvă
electromagnetică cu două canale pentru a trage cantitățile optime de lichid din vasele D ori E, care apoi
sunt amestecate într-o cameră de amestecare de volum mic (G) plasată între valvă și pompa peristaltică.

Figura 3.54. Schema unui dispozitiv microcomputerizat

de control a pregătirii gradienților de geluri din
poliacrilamidă în format vertical: A, microcomputer; B,
forma gradientului care urmează a fi generat; C, sistem
controlat de schimbare a volumelor; D, rezervor pentru
soluția de acrilamidă cu T% crescut; E, rezervor pentru
soluția de acrilamidă cu T% mică; F, valvă
electromagnetică cu două canale; H, pompă peristaltică;
I, turn care conține casetele de turnare a gelului. (După
Dunn, 1993).

3.6.9.1. Aplicații ale electroforezei pe geluri de poliacrilamidă în gradient de pori

Pentru a analiza simultan un număr mare de proteine dintr-un anumit tip de ţesut sau din celule, se
utilizează pe scară largă electroforeza 2-D care prersupune o separare în primă dimensiune prin focalizare
izoelectrică (O'Farrell, 1975; O'Farrell și alții, 1977). De exemplu, în focalizarea izoelectrică cu
imobilineTM (derivați ai acrilamidei cu o acţiune de tamponare), gradientul de pH este fix şi stabil în gel,
fără o pierdere a sa în timpul electroforezei, putând fi astfel separate cu o rezoluţie mare, amestecuri
complexe de proteine, într-o gamă largă de pH.
 Pe de altă parte, electroforeza în gradient de pori în prezența SDS poate rezolva, o gamă largă de
proteine într-un domeniu mare de masă moleculară. Prin urmare, asocierea dintre focalizare izoelectrică şi
electroforeza în gradient de pori în prezență de SDS maximizează numărul de proteine identificate într-un
gel, după o singură separare bidimensională.
Pentru a se determina pI și masa unor proteine native, se utilizează în prima dimensiune focalizarea
izoelectrică în absență de uree urmată de electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante
(Righetti, 1983; Emes și alții, 1975; Manabe și Okuyama, 1981; Kadofuku și Sato, 1984). În acest caz
suprapunerea benzilor proteice din electroforeza în gradient de pori nu are relevanță deoarece în prima
dimensiune proteinele se separă în acord cu pI-ul fiecăreia dintre ele.
În cazul unei proteine multimerice, parţial purificate, numărul de subunități şi masa moleculară a
subunităţilor sunt analizate simultan prin electroforeză 2-D, electroforeza în gradient de pori reprezentând
prima dimensiune iar SDS-PAGE, a doua (Yamaoka și alții, 1993; Santambrogio și Massover, 1987;
Curdel și Petek, 1980). Astfel, după o primă electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante,
poziţia proteinelor multimerice în gel este determinată prin teste specifice acesteia pentru estimarea masei
sale moleculare native, după care proteina multimerică este disociată în subunităţile sale prin tratament cu
SDS. Masa moleculară a fiecărei subunități este determinată prin electoforeză pe gel de poliacrilamidă în
prezență de SDS iar numărul de subunități dintr-o proteină nativă, complexă, se calculează din aceste
valori. În cazul în care proteina multimerică este înalt purificată, masa proteinei native multimerice şi
masa subunităţile sale denaturate pot fi determinate simultan printr-o separare unică prin electroforeză în
gradient de pori cu un tampon de migrare care conține 0,02% de SDS (Tyagi și alții, 1993).
Pentru analiza punților disulfurice, se efectuează o separare electroforetică în gradient de pori în
absența unui agent reducător după care, legăturile -S-S- se reduc și se repetă electroforeza în gradient de
pori, într-o a doua dimensiune (Steiner și Luscher, 1986).
De altfel, au fost descrise o serie de aplicații ale electroforezei în analiza lipoproteinelor, inclusiv a
lipoproteinelor cu densitate mare (HDL) ori a celor cu densitate mică (LDL) (Lefevre și colab., 1987;
Atger și colab., 1991; Slyper și colab., 1997; Wakatsuki și colab., 1997; Florentin și colab., 1994; Li și
colab., 1994; Dormans și colab., 1991). Astfel, în cele mai multe laboratoare de analiză specializată,
metodele uzuale de separare și de cuantificare a lipoproteinelor din ser sunt, în mare parte, cele de
ultracentrifugare în gradient de densitate. Un dezavantaj al acestei metode constă din necesitatea unui
echipament scump alături de un personal cu o experienţă mare. În schimb, prin utilizarea tehnicii
electroforetice în gradient de pori în separarea și analiza acestora se obțin rezultate valoroase după cum
metoda este relativ simplă, necostisitoare şi sensibilă în detectarea subfracțiilor lipoproteice dintr-un
volum mic de ser. Mai mult, electroforeza în gradient de pori, în condiții nedenaturante separă
lipoproteinele, pe baza diferenţelor de dimensiune a particulelor şi astfel ea poate oferi în mod direct
dimensiunea particulelor, în timp ce separarea prin ultracentrifugare în gradient de densitate se bazează
doar pe diferenţa de densitate, parametru indirect, dependent de dimensiunea particulelor.
Dacă, înainte de separare, lipoproteinele din proba de ser sunt precolorate printr-o tehnică specifică
lipidelor (cu negru de Sudan B, de exemplu) migrarea lor poate fi monitorizată în timp real în timp ce
capacitatea de rezoluţie în fracţionarea lipoproteinelor prin electroforeză în gradient de pori nu este deloc
inferioră tehnicii de analiză prin ultracentrifugare în gradient de densitate (Blom și colab., 2003). Astfel,
HDL poate fi fracţionată în 14 subclase prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante (Li
şi colab., 1994). Prin urmare, electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante este considerată o
metodă extrem de utilă în studiul lipoproteinelor. Pe de altă parte, în cazul analizelor lipoproteinelor, se
utilizeză atât gradient în trepte cât şi gradient liniar , alături de zone-platou de concentrație de pori (Atger
şi colab., 1991).
În plus faţă de examinarea interacţiunii funcţionale a unor proteine sau a subunităţilor acestora,
electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante poate fi utilizată la analiza reacțiilor antigen-
anticorp, după cum mobilitatea unui astfel de complex este mai lentă decât cea a unei molecule singulare
de antigen. Mai mult, un complex al unei molecule de antigen şi doi anticorpi monoclonali care recunosc
doi epitopi distincți migrează mai lent decât un complex format dintr-un antigen şi un anticorp
monoclonal. Prin urmare, prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante se poate
determina dacă două anticorpi monoclonali împotriva acelaşi antigen recunosc epitopi diferiți sau identici
și astfel este posibil să se realizeze studii de cartografiere a epitopilor printr-o astfel de tehnică (Wilson și
Smith, 1984).
 Prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante se studiază de asemenea complexe
ADN-proteine (Strick și Knopf, 1992). Tehnica este cunosctă drept “analiza modificării mobilității
electroforetice” (electrophoretic mobility shift assay, EMSA). EMSA în sistem de gradient de pori în
condiții nedenaturante are o capacitate de rezoluţie înaltă şi este utilă nu numai pentru examinarea
complexele ADN-proteină care conțin proteine diferite ci și la detecția unor proteine care se leagă la un
ADN mutant (Yamaoka, 1998).
Zaharurile (Nishimura și Janado, 1975) și catenele hidrocarbonate, (Rice și colab., 1987; Turnbull și
colab., 1988) pot fi analizate prin electroforeză în gradient de pori, din moment ce această tehnică de
separare poate discrimina chiar o diferenţă de masă moleculară a unor dizacharide, pot fi urmărite procese
de fracţionare şi cartografierea a unor lanţuri hidrocarbonate, după scindarea enzimatică sau chimică
(Greber și colab., 1997; Michikawa și colab., 1997; Fawcett și colab., 1992; Wheeler și colab., 1992).
3.6.10. ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ ÎN PREZENȚA
BROMURII DE CETIL-TRIMETIL-AMONIU (CAT-PAGE)
Separarea electroforetică a proteinelor este, probabil, una dintre tehnicile cele mai utilizate pe scară
largă în laboratoarele de biochimie atât în cazul electroforezei în condiții native cât și SDS-PAGE (Laemli,
1970; Reynolds și Tanford, 1970; Shirahama și colab., 1974).
În SDS-PAGE interacţiunea dintre fracțiile proteice cu matricea de poliacrilamidă creşte odată cu
creșterea greutății moleculare după cum complexele proteină/SDS au toate o formă similară de bastonaș
(Reynolds și Tanford., 1970). Astfel, proteinele mici se deplasează mai repede decât cele mari. Ca rezultat,
mobilitatea electroforetică a unei proteine în SDS-PAGE este (în primă aproximare) o funcție liniară a
logaritmului greutatății sale moleculare.
Din nefericire, acest fenomen întâlnit în SDS-PAGE nu este valabil pentru toate proteinele. De
exemplu, proteinele transmembranare hidrofobe pot lega până la 3 grame de SDS per gram de proteină şi
astfel, în câmp electric se mișcă mai rapid decât ar fi de aşteptat. De exemplu, subunitatea α a Na+/K+-
ATPazei (cu o greutate moleculară de 112 kDa) are o mobilitate electroforetică practică corespunzătoare
unei proteine de 86 kDa.
Un fenomen anormal, asemănător, apare și în cazul proteinelor înalt încărcate electric, foarte bazice, de
tipul histonelor (Buxbaum, 2003) ori a proteinelor foarte acide care nu leagă SDS, ceea ce conduce, la un
comportament electroforetic deviat (Westermeier, 2005). De asemenea, glicoproteinele, prin partea lor
glucidică, conţin în structura lor un număr variabil de resturi carbohidrat încărcate negativ. Această
heterogenitate a sarcinii conduce la benzi largi și difuze în SDS-PAGE și care pot reduce în mod serios
puterea de rezolvare şi sensibilitatea acestei tehnici.
În cazul în care, în loc de încărcarea negativă cu SDS, se utilizează o încărcare pozitivă a proteinelor
prin intermediul unor detergenți de tipul bromurii de cetiltrimetilamoniu (CTAB), sarcina electrică a
glucidelor se neutralizează prin legarea suplimentară a unor molecule de detergent. Acest fenomen
conduce la obținerea unor benzi mai clare.
Metoda a fost denumită CAT gel electroforeză după inițialele componentelor care participă la procesul
de separare a proteinelor în câmp electric: CTAB- un detergent cationic, arginină și Tricină (Akins și
colab. 1992; Akins și Tuan, 1994). În acest context, CTAB reprezintă un detergent cationic cunoscut ca
solubilizant foarte eficient a proteinelor şi care a fost folosit pentru izolarea unor astfel de macromolecule
„dificile” (Fairbanks și Avruch, 1972; Mocz și Balint, 1984; Freedman și colab., 1988; Maki și colab.,
1991; Pritchard și colab., 1985). Utilizarea CTAB ca detergent de transport a macromoleculelor proteice a
condus la elaborarea unei tehnici de separare alternative la utilizarea detergenților anionici, în condiții de
mediu acid (pH cuprins între 3,0 și 5,0) și permite separarea proteinelor în funcție de greutatea lor
moleculară, dar într-o direcție catodală, opusă (Eley și colab., 1979).
Alături de CTAB, o serie de autori au prezentat protocoale electroforetice care conțin alţi detergenţi
încărcați pozitiv, precum bromura de tetradeciltrimetilamoniu (Amory și colab., 1980), clorura de
cetilpiridiniu (Mocz și Balint, 1984) ori clorura de benzildimetil-n-hexadecilamoniu (“16-BAC”) şi au
concluzionat că proteinele separate prin electroforeză în prezență de detergent cationic își pot menţine
activitatea biologică (MacFarlane, 1983; Akins și colab., 1992). De asemenea, s-a sugerat un sistem
bidimensional de separare bazat pe electroforeză secvenţială, într-un detergent cationic urmată de
utilizarea unui detergent anionic precum SDS (Hartinger și colab., 1996). De altfel, din cauza sarcinilor
electrice opuse, fiecare detergent poate fi utilizat în cazul în care celălalt nu reușește să separe proteinele
(Akin și colab., 1985; Panyim și colab., 1977).
 Trebuie subliniat însă că nici unul dintre sisteme de separare electroforetică în prezență de detergent
cationic nu separă proteinele neglicozilate la fel de bine ca SDS-PAGE, în parte datorită faptului că aceşti
surfactanți nu reuşesc să conducă la o bună stivuire a proteinelor, ceea ce are ca urmări obținerea unor
benzi largi alături de necesitatea unor volume mari de probă. De altfel, într-un sistem tampon continuu,
proteinele se deplasează cu o lăţime de bandă echivalentă cu înălţimea probei încărcate în gel, procesul de
difuzie extinzând în continuare banda în timpul migrării electroforetice. În practică normală, înălţimea
stratului de probă din godeul de gel este de mai mulți milimetri, ceea ce conduce la o rezoluţie relativ
scăzută. Ornstein (1964), a propus o soluţie la această problemă: electroforeza începe într-un gel cu pori
mari, de stivuire, în prezenţa unui ion complet încărcat, care se deplasează rapid (γ) şi un ion parţial
încărcat, care se deplasează încet (α), care formează zone separate, ambii cu un contraion comun (β). pH-
ul (şi, prin urmare, ionizarea lui α) se alege astfel încât mobilitatea lui α este mai mică decât cea a
proteinelor. În aceste condiţii, toate moleculele proteice vor avea un suficient timp, pentru a trece de ionii
α și apoi să se așeze în spatele zonei ionilor γ ca o bandă îngustă, cu o concentrație mare de proteine (10-
100 mg/ml). Când acestă zonă îngustă alcătuită din benzile proteice ajunge în gelul de separare, întâmpină
o micșorare dramatică a dimensiunii porilor (care încetinește în mișcare proteinele mari, dar nu și ionii de
mici) și un pH diferit, la care ionii posteriori devin pe deplin încărcați electric iar ca rezultat creştere
mobilitatea lor și astfel, acești ioni depășesc stiva de proteine. În continuare, proteinele întâlnesc un
gradient liniar de tensiune şi se separă, dacă SDS este prezent, în funcţie de greutatea lor moleculară.
În CAT-PAGE proteinele se deplasează spre polul negativ și ca atare trebuie utilizat un sistem diferit
de tamponare. Jovin şi colab. (1973) au definit o mare varietate de sisteme de tampon care se pot utiliza în
CAT-PAGE și care îndeplinesc criteriile teoretice ale separării, după cum au fost descrise o serie de alte
sisteme tampon care au dat rezoluții bune (Amory și alții, 1980; Fairbanks și Avruch, 1972; Mocz și
Balint, 1984; Akins și alții, 1992; MacFarlane, 1983; Akin și alții, 1985; Panyim și alții, 1977). Pe de altă
parte, dispersia benzii datorate difuziei poate fi minimizată prin utilizarea gelurilor de poliacrilamidă cu
gradient de pori în gelul de separare (Buxbaum, 2003).
În ceea ce privește sistemele de polimerizare a amestecului acrilamidă-bisacrilamidă, în experimentele
de electroforeză cationică a glicoproteinelor de membrană utilizând CTAB, Buxbaum (2003)
polimerizează gelurile după metoda de fotopolimerizare descrisă de Rabilloud și colab. (1996). Astfel,
sistemul electrochimic de polimerizare este alcătuit din: albastru de metilen, 37 µM; toluen disulfinat, 500
µM și clorură de difeniliodoniu, 25 µM și are ca rezultat obținerea unor geluri elastice, cu bune proprietăți
mecanice, chiar la un pH redus.
Alternativ, gelurile pot fi polimerizate printr-un sistem Fenton descris de MacFarlane (1983) alcătuit
din: FeSO4, 8 µM; acid ascorbic, 4 mM; H2O2, 0,001%. Aceste geluri sunt mai uşor fiabile decât cele
produse prin metoda Rabilloud, dar conduc la separări similare a proteinelor. Trebuie avut în vedere că
ambele sisteme sunt sensibile la prezența oxigenului, motiv pentru care este necesară o degazare a
amestecului de fotopolimerizare.
Buxbaum (2003) a utilizat geluri în gradient de pori în trepte care conțin glicerol 10%, în soluţia de
polimerizare cu densitate mare. Aceste geluri sunt produse ca și gradiente cu 12 trepte de concentraţii, la
distanţe egale. De asemenea, ele conțin uree, 6M şi CTAB 0,1 %. Tamponul de migrare din tancul
superior este alcătuit din β alanină 40 mM, acid acetic, 70 mM și CTAB, 0,1%, pH=4,0. Tamponul probei,
(de două ori concentrat) este alcătuit din KOH (127 mM) și acid acetic (187 mM) și conține CTAB, 1,2%,
uree, 6M, β-mercaptoetanol, 1%, glicerol, 10%, fucsină bazică, 0,005%, pH=5,0.
Gelul de concentrare (stivuire) conține tampon KOH/acid acetic, 64 mM/94 mM, pH=5,1 și
acrilamidă/bisacrilamidă (19:1), 4%. Opţional, poate fi adăugat verde de malahit 0,002% astfel încât
godeurile să se poată încărca mai uşor. Gelul de separare este preparat într-un gradient de concentrație de
5-15% (acrilamidă/bisacrilamidă, 37:1) în tampon KOH/acid acetic, 43 mM/280 mM, pH=4,0. Tamponul
de migrare din tancul inferior este alcătuit din KOH/acid acetic, 50 mM/56 mM, pH=5,7 care conține
0,1% CTAB.
Proba este alcătuită dintr-o suspensie de membrane supusă separării electroforetice se diluează în
raport 1:2 cu tamponul probei şi se incubează la 37 oC timp de 30 de minute înainte de electroforeză.
Separarea electroforetică se realizează la o intensitate de 20 mA/gel și la o tensiune maximă de 200V,
în cazul minigelurilor de 7x8 cm. Trebuie însă să se aibă în vedere că ansamblurile CTAB-proteine se
deplasează spre anod, motiv pentru care este necesară inversarea polarității sursei de alimentare.
Prin metoda descrisă, este posibil să se separe proteine cu rezoluție mai mare și benzi mai clare decât
în cazul SDS-PAGE a glicoproteinelor. Este cazul, de exemplu, a glicoproteinei Mdr1, care posedă
activitate ATP-azică, având o mare semnificație medicală în rezistența multiplă la medicamente (multiple
drug resistance).
În plus, comparativ cu SDS, CTAB provoacă alterări minore la nivelul structurii proteinelor; astfel
electroforeza în prezență de CTAB poate fi utilizată drept tip de electroforeză nativă (Akin et al. 1985).
Deşi metoda a fost dezvoltată în primul rând pentru analiza glicoproteinelor de membrană, ea este utilă
în separarea altor proteine (ca de exemplu a proteinei p53, un factor transcripțional important atât în
reglarea progresiei ciclului celular cât și în inducerea procesului de apoptoză într-o varietate de celule)
care, prin utilizarea acestui detergent este complet solubilizată, comparativ cu tratamentul cu SDS, la care
procesul de trecere în soluție este nesatisfăcător. Datorită acestei proprietăți metoda poate deveni deosebit
de utilă în cercetarea proteomică deși, ca şi în cazul SDS, CTAB prezintă o legare anormală la proteinele
înalt încărcate electric.
3.6.10.1. Determinarea masei moleculare a proteinelor, cu păstrarea activității lor biologice
După cum am mai spus, tehnica electroforetică elaborată de Laemmli (1970) este printre cele mai
comune proceduri de laborator. Ea se bazează pe observaţiile făcute de către Shapiro și colab. (1967) și
Weber şi Osborn (1969), care au arătat că SDS ar putea fi utilizat pentru separarea proteinelor pe baza
dimensiunii lor moleculare. În metoda lui Laemmli, solubilizarea în SDS se combină cu un sistem de gel
discontinuu care folosește tamponul glicină/Tris, după cum a fost detaliat de Ornstein (1964) și Davis
(1964). De obicei, gel-electroforeza discontinuă în prezență de SDS conduce la disocierea complexelor
proteice în subunităţi denaturate şi la separarea acestora în benzi discrete. Deoarece mobilitatea proteinelor
pe geluri în prezență de SDS este legată de dimensiunea moleculară, mulți cercetători utilizează această
tehnică în determinarea masei moleculare a subunităților acestora.
Din păcate, este dificil de a evalua activitatea biologică a proteinelor tratate cu SDS: acestea, pregătite
pentru SDS-PAGE sunt disociate din complexele lor naturale, fiind denaturate în mod semnificativ. S-a
dovedit că după după îndepărtarea SDS și renaturare, de cele mai multe ori, proteinele ajung la o formă
activă (Manrow și Dottin, 1980; Scheele, 1982); cu toate acestea, această metodă este incomodă şi
potenţial nesigură (Akins și Tuan, 2002).
O metodă preferată pentru determinarea activităţii proteinei native după electroforeză implică
utilizarea de detergenţi neionici, cum ar fi Triton X 100 (TX-100) (Hearing și colab., 1976); din păcate,
proteinele nu se separă în funcţie de dimensiunea lor moleculară. Identificarea masei moleculare într-un
sistem electroforetic care conține un detergent neionic precum TX-100 necesită determinarea mobilităţilor
în mai multe concentrații de gel și o analiză „Ferguson” (Ferguson, 1964; Hedrick și Smith, 1968; Tuan și
Knowles, 1984).
O serie de studii anterioare au descris utilizarea CTAB şi a unui alt detergent înrudit cu acesta
(bromura de tetradeciltrimetilamoniu, tetradecyltrimethylammonium bromide-TTAB) în procedurile
electroforetice pentru determinarea greutății moleculare (Akin și colab., 1985; Eley și colab., 1979;
Marjanen și Ryrie, 1974; Panyim și colab., 1977; Schick, 1975). În plus, încă din anii ‘60, s-a constatat că
anumite proteine își păstrează niveluri semnificative de activitate enzimatică după solubilizarea lor în
CTAB (Spencer și Poole, 1965) chiar şi după separarea lor electroforetică în prezența acestui detergent
cationic (Akin și colab., 1985).
Bazându-se pe caracteristicile observate a CTAB şi ale sistemelor de gel, în prezența acestui detergent,
a fost dezvoltat un sistem, care spre deosebire de metodele anterioare de separare electroforetică pe gel în
prezență de CTAB, este discontinuu şi permite proteinelor să fie concentrate înainte de separarea lor
efectivă (Ornstein, 1964; Davis, 1964). Astfel, dterminarea masei moleculare prin electroforeză
discontinuă în prezență de CTAB reprezintă o abordare electroforetică relativ nouă și care permite o
separare fină a proteinelor cu menținerea activității lor native. Sistemul de separare combină gel-
electroforeza discontinuă într-un tampon arginină/N-Tris(hidroximetil)metilglicină-tricină) în timp ce
proba este solubilizată în CTAB. Drept urmare, pe gelurile CAT, proteinele separate apar ca benzi
discrete, mobilitatea lor fiind într-o funcție logaritmică a masei lor moleculare pentru un domeniu larg a
acestora. De altfel, după CAT-PAGE, multe dintre proteine rețin un nivel înalt din activitatea lor nativă,
care poate fi în continuare detectată; astfel benzile de proteine separate pot fi utilizate atât la determinarea
maselor moleculare cât și la identificarea unor actitivăți specifice. Metoda CAT-PAGE, combină aspectele
cele mai utile ale sistemelor SDS și TX-100 prin care se permite separarea proteinelor pe baza masei lor
moleculare cu reșinerea activității lor native (Akins și Tuan, 2002).
 În concluzie, CAT-PAGE este o metodă utilă, pentru separarea de proteine, cu păstrarea activității
native. Ea este, de asemenea, o alternativa excelenta la sistemele bazate pe SDS utilizate la separarea și
determinarea greutății moleculare a proteinelor (Akins și Tuan, 2002).
3.6.10.1.1. Principiile de bază ale separării proteinelor prin CAT-PAGE
Sistemul CAT-PAGE este format din două matrice de gel şi mai multe componente tampon într-o
secvență bine-stabilită. Elementele care compun sistemul CAT-PAGE sunt prezentate în tabelul 3.9.
Tabelul 3.9. Compoziția unui sistem CAT-electroforetic (După Akins și Tuan, 2002).
Tricină, 15 mM, pH=8,2
Tamponul din tanc Anod CTAB, 0,1%
Arginină, bază liberă, 14 mM
Tricină-NaOH, 10 mM, pH=8,8
Tamponul probei CTAB, 1%
Glicerol, 10%
Agaroză, 0,7%
Gel de concentrare CTAB, 1%
Tricină-NaOH, 125 mM, pH=9,96
Poliacrilamidă, 6%
Gel de separare
Tricină-NaOH, 375 mM, pH=7,96
Tricină, 25 mM, pH=8,2
Tamponul din tanc Catod CTAB, 0,1%
Arginină, bază liberă, 14 mM
Observații: Gelurile sunt inițiate în partea superioară, cu anodul cufundat în rezervorul de tampon şi se termină în partea de jos, cu
catodul cufundat într-un rezervor suplimentar de tampon. Soluţia tampon din rezervor conţine CTAB, arginină sodică, şi Tricină, sare
de sodiu. Între tampoanele rezervorului se află gelul de concentrare şi gelul de separare. Gelurile sunt realizate din polimeri de
acrilamidă într-o soluţie de tampon Tricină/NaOH. Înainte de electroforeză, probele de proteine sunt solubilizate într-un tampon al
probei care conţine CTAB (cu rol în solubilizarea proteinelor), Tricină/NaOH, cu rol în menținerea pH-ului, şi glicerol, pentru a
creşte greutatea specifică. Proteinele solubilizate în tamponul probei se încarcă direct pe gelul de concentrare.
Într-un câmp electric aplicat, sarcina pozitivă a complexelor CTAB-proteină cauzează o migrare a
acestora spre catod, electrodul încărcat negativ, situat la partea de jos a sistemului electroforetic, alături de
ionii de sodiu prezenți în sistem. Componenta arginină din tampon aflat in rezervor, migrează de asemenea
spre catod; pe de altă parte, arginina este un compus amfoter (un zwitterion), iar sarcina sa netă este în
funcţie de pH. Astfel, la valorile de pH existent în tamponul din rezervor, arginina este încărcată pozitiv în
timp ce valorile de pH din gelul de concentrare şi ale tamponului probei sunt mai apropiate de pI-ul său,
motiv pentru care ea va conține o sarcină netă pozitivă, corespunzător mai mică, deoarece migrează din
tamponul din rezervor în această zonă. Prin urmare, zona de interfaţă dintre tamponul din rezervorul
superior şi gelul de concentrare/tamponul probei conţine o regiune de rezistenţă înaltă a câmpului electric
în cazul în care ionii de sodiu din gelul de concentrare/tamponul probei (Tricină-NaOH), trec în faţa a
ionilor de arginină, cu mobilitate redusă (Tricină-arginină). În scopul de a transporta curentul electric,
proteinele acoperite cu CTAB migrează mai rapid în această zonă de interfaţă decât în zona care conţine
doar sodiu, inferioară. După cum interfaţa avansează, proteinele “stivuite” deoarece frontul posterior al
probei aplicate se distribuie spre capul conducător. Când zona de interfață catodică care migrează atinge
gelul de separare, arginina devine din nou înalt încărcată din cauza scăderii pH-ului din acest gel. Datorită
acţiunii de cernere moleculare a matricei de gel, benzile comprimate ale proteinelor migrează stivuite
(compactate) diferenţiat prin gelul de separare în funcţie de dimensiunea lor.
Două caracteristici ale gelurilor pe bază de CTAB se deosebesc de metodele electroforetice standard pe
bază de SDS. În primul rând, proteinele separate in geluri în prezență de CTAB migrează în funcţie de
logaritmul maselor lor moleculare domnului într-o gamă mult mai largă de greutăţi moleculare decat în
cazul proteinelor separate în geluri în prezență de SDS. După cum se observă în figura 3.55. reprezentarea
grafică a distanţei relative de migrare în funcţie de logaritmul maselor moleculare, cunoscute, a proteinelor
standard arată ca o dreaptă.
Datorită relaţiei semilogaritmice dintre masa moleculară (Mr) și distanța migrată, se pot
determina greutățile relative ale proteinelor necunoscute. Astfel, CAT-PAGE poate fi utilă mai
ales pentru determinarea maselor moleculare a proteinelor mici ori pentru compararea unor
proteine cu greutăţi moleculare foarte diferite. În al doilea rând, menţinerea într-o proporție
semnificativă a activității native permite evaluarea profilurilor electroforetice ale activităţii
biologice a proteinelor, fără măsuri suplimentare de renaturare a lor. Ca urmare, după cum multe
proteine separate prin CAT-PAGE pot fi, ulterior, identificate pe baza activității b iologice, în
condiţiile mai sus prezentate, CTAB poate fi considerat drept un detergent nedenaturant, în
condițiile în care detergenții denaturanţi modifică, în general, conformaţia nativă a proteinelor în
atare măsură, încât această activitate este eliminată, mai ales atunci când se utilizează o
concentrație ridicată a acestora.

Figura 3.55. Mobilitatea unor proteine în CAT-PAGE este funcţie de greutatea lor moleculară. Un amestec de proteine a fost
fracționat într-un gel de separare de acrilamidă, T=6% şi un gel de concentrare de agaroză, 0,7% a fost vizualizat prin colorare cu
CBB R-250. Mobilităţile relative (Rf) au fost calculate ca distanta de migrare raportată la distanţa totală a frontului de sare/colorant și
care s-au reprezentat grafic față de logaritmul valorilor greutăților moleculare pentru fiecare bandă proteică. Curba este liniară pe
întreaga gamă de log Mr (R2>0,99). Benzile de proteine includ tripsinogenul (24kDa), anhidraza carbonică (29kDa), gliceraldehid-3-
fosfat dehidrogenază (36kDa), ovalbumină (monomer, 45kDa şi dimer, 90kDa), albumină serică bovină (monomer, 66kDa şi
multimeri, 132, 198 şi 264 kDa), fosforilază-B (97,4kDa) şi β-galactozidază (116 kDa). (După Akins și Tuan, 2002).
Proteinele separate pe geluri în prezență de CTAB pot fi colorate cu argint, Ponceau S, sau CBB-R250
(în ordinea descrescătoare a sensibilității). Colorarea cu Ponceau este la fel de simplă ca şi în cazul
CBBlue-R250, dar oferă o sensibilitate mai mare.
Eliminarea fondului colorat se poate face electroforetic, în cazul în care sunt necesare rezultate rapide.
Este de asemenea posibil transferul electroforetic al proteinelor separate prin această tehnică pe membrane
PVDF în vederea imunodetecției. Comparativ cu tehnica Western blotting, realizată după SDS-PAGE,
care utilizează un tampon Tris-glicină foarte concentrat, această metodă utilizează un tampon diluat KOH-
acid acetic, fiind astfel mai economică, chiar şi pentru proteine, pentru care alte avantaje create de CTAB
față de SDS nu sunt relevante.
Seși un număr considerabil de detergenţi cationici sunt disponibili în comerţ, CTAB este deseori
selectat pentru că:
 este ieftin, bine caracterizat şi disponibil la o puritate înaltă;
 are mare putere de solubilizare a proteinelor;
 în acelaşi timp, prin utilizarea CTAB este destul de uşor a se păstra activităţile enzimatice ale
multor proteine; proteinele solubilizate cu acest detergent pot fi analizate prin PAGE fără complicaţiile
inerente, care pot apărea din cauza prezenţei unui al doilea detergent. Aceasta nu înseamnă, totuşi, că
CTAB este cel mai bun detergent cationic, care poate fi utilizat pentru toate scopurile posibile, după cum
au fost sugerați și alți detergenţi cationici, inclusiv bromura de tetradeciltrimetlamoniu (Amory și alții,
1980), clorura de cetilpiridiniu (Mocz și Balint, 1984) ori 16 -BAC (MacFarlane, 1983), la fel de valoroși.
Luate în ansamblu, caracteristicile mai sus prezentate fac din CAT-PAGE o alternativă atractivă la
sistemele standard electroforetice de determinare consecutivă a masei moleculare și a activității native a
proteinelor (Akins și Tuan, 2002) și în concluzie, electroforeza în prezența CTAB, alături de posibilitatea
de a transfera proteinele pe membrane sintetice, reprezintă un instrument valoros pentru cercetătorii care
activează în domeniul chimiei proteinelor.
 3.6.11. VARIANTE ALE ELECTROFOREZEI PE GEL DE POLIACRILAMIDĂ ÎN
CONDIȚII NATIVE
Multe probe biologice pot fi separate în paralel, într-o singură migrare electroforetică și printr-o
comparaţie directă a complexelor proteice prezente, se permite identificarea uşoară a unor tulburări și mai
departe la direcționarea pacientului spre analize funcţionale suplimentare. În proteomică, separarea de
înaltă rezoluţie a proteinelor este în general realizată prin procedee bidimensionale (2-D), în funcție de
punctul izoelectric al acestora (IEF-PAGE) şi masa de lor moleculară (SDS-PAGE). Aceasta ultimă
tehnică de denaturare separă sute de mii de proteine din probe complexe (Righetti, 2005). Cu toate acestea,
proteinele hidrofobe de membrană sunt greu detectabile, după 2-D IEF/SDS-PAGE (Zahedi și colab.,
2006). Prin urmare, analiza globală a proteomicii membranare nu este încă clar inițiată, în ciuda
importanţei membranei pentru celula vie.
Electroforeza nativă pe gel de poliacrilamidă (native PAGE) este o metodă de separare în câmp electric
uniform general utilizată în proteomică şi metabolomică. În această procedură, separările sunt realizate în
condiții nedenaturante, detergenţii fiind utilizați numai în măsura în care aceștia sunt necesari pentru a liza
membranele lipidice din celule, dacă este cazul. Astfel, complexele proteice rămân, în cea mai mare parte,
asociate în structuri asemănătoare celor existente în angrenajul celular. Din această cauză, unul dintre
aspectele negative ale native PAGE este reprezentat de faptul că aceste structuri nu pot fi separate în stare
pură sau predictibilă, după după cum ele nu pot migra prin gelul de poliacrilamidă sub forma unor proteine
individuale, ca în cazul proteinelor denaturate, unde detergentul dezagregă și oferă sarcină electrică
negativă acestora ceea ce permite astfel separarea lor, native PAGE nu beneficiază de efectul detergentului
anionic.
Există o serie de metode populare ale native PAGE: (a) electroforeza pe gel de poliacrilamidă nativă în
prezență de Coomasie Brillant Blue (blue native PAGE, BN-PAGE), (b) electroforeza nativă pe geluri de
poliacrilamidă incolore (clear native PAGE, CN-PAGE), (c) electroforeza cantitativă preparativă în
condiții native și continue (quantitative preparative native continuous PAGE, QPNC-PAGE) și (d)
electroforeza nativă pe geluri de poliacrilamidă incolore de mare rezoluție (high resolution CNE, hrCNE)
(Wittig și colab., 2007a; Wittig și colab., 2007b) care vor fi prezentate în continuare.
3.6.11.1. Electroforeza nativă pe gel de poliacrilamidă în prezență de Coomasie (BN-
PAGE)
În ultimii ani, separarea de complexe proteice prin electroforeză nativă pe gel de poliacrilamidă în
prezență de CBB (blue native PAGE, BN-PAGE) s-a dovedit a fi o metodă dominantă în identificarea unor
tulburări funcţionale, prin analiza unor omogenate totale, ţesuturi, celule ori fracţiuni celulare (Zapata și
colab., 2004; Vahsen și colab., 2004; Pfeiffer și colab., 2003; Claeys și colab., 2005). Metoda a fost
utilizată la determinarea greutății moleculare a complexelor proteice din intervalul cuprins între 10 şi
10.000 kDa (Schägger, 2003), fiind analizate cu succes mai ales complexele membranare intrinseci de
transfer ale electronilor/protonilor din mitocondrii şi cloroplastele (Wittig și colab., 2006; Carrozzo și
colab., 2006). Tehnica a fost combinată cu alte tehnici pentru a determina starea oligomerică,
stochiometria, activitatea enzimatică şi structura moleculară a complexelor multiproteice (Dudkina, și
colab., 2005); Poetsch și colab., 2000; Sunderhaus și colab., 2006).
BN-PAGE reprezintă o strategie alternativă de separarea cu rezoluţie înaltă a proteinelor de membrană
şi de menţinere a funcţiei lor biologice (Jung și colab., 2000). Metoda se numește nativă, deoarece cele
mai complexe de proteine separate își păstrează funcţiile enzimatice şi blue native, pentru că separarea
electroforetică se bazează pe proprietatea colorantului Coomassie blue G250 de a se lega la proteine. Deși
procedeul a fost descris pentru prima data în 1991 în cazul separării complexelor de proteine membranare
din lanţul respirator al mitocondriei umane (Schagger și von Jagow, 1991), astăzi, BN-PAGE reprezintă o
alegere excelentă în cazul în care este necesară o analiză a proteinelor native de membrană și a
interacţiunilor dintre ele la o rezoluţie înaltă şi cu randament sporit (Schägger, 2003; Eubel și colab.,
2005).
Deşi în general în multe domenii ale biochimiei, au fost elaborate protocoale pentru inițierea analizei
proteomice, o abordare sistematică a proteomului conduce la dezvoltarea unor tehnologii adecvate. În
acest sens, BN-PAGE reprezintă într-o primă etapă, unul dintre candidaţii la standardizare în timpul
fracţionării analitice secvenţiale de înaltă rezoluţie a proteomului (Aivaliotis, și colab., 2005). În
particular, organizarea naturală a sistemelor vii a oferit această ocazie de urmărire a funcţiei complexelor
de proteine native după separare electroforetică prin BN-PAGE. Totuși, datorită asocierii unui număr mare
de proteine unice în mai multe complexe de proteine enzimatice, nivelul de complexitate este menţinut la
un nivel scăzut (Reisinger și Eichacker, 2006). Aceasta este baza pentru oricare analiză de succes
tehnologic a stărilor dinamice de dezvoltare, a stărilor metabolice şi a nivelurilor de organizare celulară.
Importanţa biologică a interacţiunilor dintre proteine este dată de faptul că proteinele se exprimă în
funcţie de gene în toate organismele vii. Proteinele sunt molecule funcţionale care operează pe căi
metabolice, de dezvoltare şi de reglare, dintr-o celulă, ţesut sau dintr-un organism. Proteinele multiple sunt
complexe integrate, în scopul organizării lor în mai multe funcţii enzimatice. Complexe de proteine, prin
urmare, reflectă organizarea macromoleculară a stării celulare, care reprezintă fundamentul în înţelegerea
funcţiilor lor. În practica proteomică, obiectivul central îl reprezintă identificarea tuturor proteinelor
prezente într-o stare definită de dezvoltare a unui organism, ţesut, celuleă sau subfracție celulară şi de a
caracteriza modificările lor calitative şi cantitative, ca răspuns la schimbările de mediu (Tsirogianni și
colab., 2006; Singh și colab., 2005; Brouillard și colab., 2005).
În ultimii ani, cu ajutorul BN-PAGE, o tehnologie simplă pentru separarea şi identificarea unor
complexe proteice (şi mai ales a complexelor de proteine membrane), au fost elucidate un număr mare de
mecanisme celulare. Figura 3.56 prezintă principiul BN-PAGE.

Figura 3.56. Evoluția unui proces de migrare prin BN-PAGE. Imaginile reprezintă trei puncte caracteristice din perioada de timp de
electroforeză prin BN-PAGE. Aparatul electroforetic constă din anod (partea de jos) şi tancul rezervor de tampon catodic (sus,
umplute cu tampon catodic, care conține CBB, de culoare albastră), gelul se află situat între două plăci de sticlă (ca un sandwich) iar
menținerea temperaturii se realizează prin intermediul unei mantale și prin agitarea tamponului din compartimentul anodal în tot
timpul electroforezei. Înainte de începerea electroforezei, tamponul catodal care conține CBB este completat în rezervorul cu tampon
şi probele sunt depuse în godeuri (săgeata de culoare albă, godeul probei, panelul 1, înainte de începerea migrării). În timpul
electroforezei, probele încărcate electric intră în gelul de concentrare (stivuire) şi după un timp, colorantul Coomassie care se
deplasează cu frontul ajunge la jumătatea gelului de separare. În acest moment, complexele proteice încep să devină vizibile în gelul
de separare. În acest moment, tamponul cu Coomassie catodic se schimbă cu un tampon catodal incolor (săgeţile de culoare albă,
panelul 2, în timpul migrării). BN-PAGE poate fi oprită atunci când tampon colorat cu CBB pătată a ajuns la sfârşitul gelului de
separare şi separarea de complexe este finalizată (săgeţile de culoare albă, panelul 3, sfârșitul migrării). (După Reisinger și
Eichacker, 2006).
Pregătirea probei în vederea BN-PAGE. Blue native PAGE separă complexe ale proteinelor de
membrană în stare nativă. Pentru a obţine rezultate optime, pregătirea probelor reprezintă pasul cel mai
critic, din acest motiv toate treptele de prelucare se efectuează pe gheaţă. Pentru a mări șansele de
solubilizare a complexelor proteice și de creștere a stabilității lor, se are în vedere că solubilitatea
proteinelor depinde atât de natura probei, precum şi pe tipul de detergent şi de concentrația acestuia, aceste
variabile trebuind testate pentru oricare probă de interes.
Solubilizarea complexelor proteice. Membranele biologice, cele mai utilizate probe supuse analizei
eletroforetice prin BN-PAGE, sunt ansambluri complexe de lipide şi proteine. Un compus lipidic este de
obicei compus din două cozi hidrofobe de hidrocarbură conectate la un cap polar. Lipidele sunt cel mai
adesea aranjate într-o structură bistratificată cu cozile hidrofobe alăturate iar capetele hidrofile ale acestora
fiind îndreptate spre exterior, în timp ce proteinele de membrană sunt încorporate în zonele hidrofobe ale
bistratului membranar prin interacţiunea lor cu faza hidrofobă lipidică. Proteine se adună în complexe
multisubunitare pentru a îndeplini funcţiile celulare în cadrul fazei de membrană.
În scopul investigării compoziției în subunități a complexelor de proteine specifice, ansamblurile
proteice trebuie, în primul rând, extrase din faza lipidică şi separate unele de altele. Pentru BN-PAGE,
scopul este de a menţine structura şi compoziţia nativă în subunități a tuturor componentelor membranei
necesare prezenței activității enzimatice specifice din complex în timpul separării electroforetice.
 Figura 3.57. Doi detergenți nonionici, digitonina (A) și
ß-dodecil-n-maltozid (B), utilizați la solubilizarea și
separarea complexelor proteice prin BN-PAGE.
Membranele tilacoide au fost solubilizate în acești
detergenți la concentrații cuprinse între 1,1–72 mmol/l.
După îndepărtarea materialului nesolubilizat prin
centrifugare, complexele proteice s-au supus separării
prin BN-PAGE. La finalul electroforezei gelurile s-au
colorat cu CBB coloidal iar masele moleculare ale
complexelor proteice s-au determinat utilizând un kit
de mase moleculare pentru proteine native.

Pentru a pregăti proba în vederea BN-PAGE sunt necesare două etape. În primul rând, pentru
extragerea de complexe native din faza lipidică, sunt utilizați de obicei detergenţi amfifilici care dezagregă
bistratul lipidic și solubilizează atât lipidele cât și proteinele membranare în micele. De altfel, detergenţii
sunt molecule amfipatice compuse dintr-un cap cu o grupare polară, ionică sau neionică și o coadă de
hidrocarburi. Ca rezultat al caracterului amfifilic, detergentul formează micele termodinamic stabile cu
nucleele hidrofobe în mediul apos. Aceste nuclee hidrofobe oferă un mediu care permite dizolvarea
moleculelor hidrofobe sau a unor domenii ale proteinelor. Peste concentrația critică, care reprezintă
concentraţia micelară maximă (CMC), detergenţii se autoagregă în micele, prin intermediul cozile
hidrocarbonate, în timp ce sub CMC, micele sunt mai stabile iar moleculele mai lente sunt ori încorporate
în interiorul lor ori sunt îndepărtate din acestea. CMC este puternic dependentă de o serie de factori
precum: temperatura, pH-ul, puterea ionică, omogenitatea detergentului şi puritatea sa. În prezenţa
membranelor celulare, micele furnizează rezervorul necesar acumulării de detergent în faza membranară,
de perturbare a bistratului membranar și de liză a acestuia. Cum procesul de partiţie a moleculelor de
detergent în faza lipidică are la bază o relație de dependență în funcție de concentraţie, are loc formarea
unor micele între lipidele componente și detergent, între lipide, proteine și detergent, ori între proteine și
detergent. În scopul de a menţine interacţiile proteină-proteină şi de a se asigura faptul că ansamblul
proteic este solubilizat în/pe micele, tipul corect de detergent şi concentrația sa sunt determinate
experimental (figura 3.57).
În continuare, membranele nesolubilizate și agregatele proteice sunt separate prin centrifugare iar
complexele proteice extrase și solubilizate în micelele de detergent vor rămâne în supernatant. Din acest
moment, separarea complexelor de proteine prin BN-PAGE poate începe. O primă considerație în
momentul selectării unui detergent utilizat în BN-PAGE, este forma neionică a grupării hidrofile, în
condițiile în care detergenţii anionici, cationici, şi zwitterionici modifică de obicei într-o măsură mai mare
structura proteinelor, gradul de modificarea variind în funcţie de proteinele individuale studiate şi de
detergentul particular utilizat. Pe de altă parte, detergenţii ionici sunt mai sensibili la pH, la puterea ionică
şi la natura contraionului, ei putând interfera în metodele de analiză care implică sarcina electrică. Tabelul
3.10 prezintă o trecere în revistă a detergenților utilizați pentru solubilizarea complexelor proteice
integrale de membrană pentru o analiză ulterioară prin BN-PAGE (Krause, 2006).
Cei mai mulți detergenţi neionici sunt nedenaturanți, dar în același timp mai puţin eficienți în
disruperea agregatelor proteice. Dintre aceștia, ß-dodecil-n-maltozidul şi digitonina (figura 3.58) s-au
dovedit a fi cei mai utili în BN-PAGE (Eubel și colab., 2003).
Încărcarea probei și separarea electroforetică. Prin definiție, termenul de „electroforeză” se referă la
transportul unor particule încărcate electric cum ar fi proteinele singulare ori complexe de proteine într-un
gradient de câmp electric. Într-un câmp electric omogen, proteine vor migra cu o viteză constantă, atunci
când forţa electromotoare a câmpului electric de accelerare este echilibrată de rezistenţă constricțională de
frecare şi în continuare de forţele ionice din mediul de separare. Empiric, viteza de migrare a proteinelor şi
prin urmare distanţa de separare a lor, la un moment dat, într-un interval de timp, sunt direct proporţionale
cu starea încărcării electrice precum şi cu intensitatea câmpului eletric aplicat şi sunt invers proporţionale
cu mărimea şi/sau masa proteinelor hidratate precum şi vâscozitatea mediului de separare. Două materiale,
agaroza şi poliacrilamida, s-au dovedit a forma geluri-matrice stabile şi ușor controlabile.

A B
Figura 3.58. Structurile chimice ale digitoninei (A) și a ß-dodecil-n-maltozidului (sinonime: n-dodecil-beta-D-maltozid, s,n-dodecil-
beta-D-maltopiranozid, DDM), (B).
În ceea ce privește gelul de poliacrilamidă, dimensiunile porilor obţinuţi prin polimerizarea acrilamidei
s-au dovedit a fi esențiali în separarea proteinelor şi a complexelor proteice ceea ce a condus la
introducerea ei în procesele de separare electroforetică.
Tabelul 3.10. Detergenți utilizați la solubilizarea complexelor proteice integrale de membrană pentru analiză prin BN-PAGE. (După
Krause, 2006).
Tipul de detergent Proba biologică Tipul de detergent Proba biologică
Detergenți nenionici Triton X-100 Mitocondrie la mamifere
β-D-dodecilmaltozid Mitocondrie la mamifere Mitocondrie la drojdii
Mitocondrie la drojdii Mitocondrie la plante
Mitocondrie la fungi Membrane plasmatice umane
filamentoși
Mitocondrie la plante Microzomi la mamifere
Mitocondrie la alge Cloroplaste la plante (tilacoide)
Mitocondrie la protiste Membrane externe ale anvelopei
cloroplastelor la plante
Cloroplaste la plante (tilacoide) Membrane la cianobacterii
Microzomi la mamifere Membrane la bacterii
Microzomi la drojdii Nonidet P-40 Mitocondrie la drojdii
Microzomi la plante Octaetilen-glicol Microzomi la drojdii
mono-n-dodecil eter
Membrane la cianobacterii Lubrol Mitocondrie la drojdii
Membrane externe la Digitonină Mitocondrie la mamifere
cianobacterii
Membrane la bacterii Mitocondrie la drojdii
β-D-decilmaltozid Mitocondrie la mamifere Mitocondrie la fungi filamentoși
Cloroplaste la plante (tilacoide) Mitocondrie la plante (sau
membrane externe și interne)
Cloroplaste la alge (tilacoide) Cloroplaste la plante (tilacoide)
Membrane interne ale Cloroplaste la alge (tilacoide)
anvelopei cloroplastelor la
plante
Membrane la cianobacterii Membrane externe ale anvelopei
cloroplastelor la plante
β-D-octilglucozid Mitocondrie la drojdii Microzomi la mamifere
Microzomi la plante Microzomi la drojdii
Membrane la cianobacterii Peroxizomi la mamifere
Membrane exerne la Membrane la bacterii
cianobacterii
6-O-(N-Heptil- Detergenți
carbamoil) metil-α-D- Mitocondrie la drojdii zwitterionici
glucopiranozid (amfoteri)
Dodecanoil-sucroză Cloroplaste la plante CHAPS Membrane plasmatice umane
CHAPSO Membrane postnucleare umane
FOS-colină Membrane externe la cianobacterii
Pentru o rezoluţie crescută realizată prin PAGE, densitatea şi dimensiunea porilor matricei de gel este
de asemenea importantă. În BN-PAGE, o separare de înaltă rezoluţie, este în principal realizată prin
dimensiunea porilor de gel, care scade odată cu distanţa de separare (geluri în gradient de pori). Prin
urmare, atunci când complexe de proteine ating limita lor de pori, viteza lor scade treptat la zero și astfel
este realizată o separare de înaltă rezoluţie (figura 3.59).
Rezoluţia de separare este contracarată prin două forţe. În câmp electric, norul ionic al sarcinilor
superficiale de pe suprafața proteinelor induce o contra-mişcare în cadrul moleculelei de solut din mediul
de separare (întârziere) în timp ce pentru a contracara acest efect la nivelul proteinelor apare un efect de
relaxare. În plus, suprafața hidrată a proteinelor va diminua starea electrică și va conduce la creşterea
volumului efectiv al acesteia. Aceşti factori pot conduce la un aspect scuamos al proteinei în matricea de
gel şi sunt responsabili pentru mică cantitate de informaţii structurale care pot fi obținute de pe urma
migraţiei a unei proteine în timpul PAGE.

Figura 3.59. BN-PAGE a complexelor de proteine membranare tilacoide. Markerul de masă

moleculară (MP) conține următoarele proteine standard separate: tireoglobulină 696, feritină 440,
catalază 232, lactat dehidrogenază 140, şi albumină 67, kDa. Din 1×10 8 cloroplastele de orz
corespunzând la 400 µg de proteină, au fost izolate plastide care au fost în continuare lizate, iar
membranele tilacoide au fost colectate prin centrifugare. Proteinele membranare au fost
solubilizate cu dodecilmaltozid şi separate pe un gel de poliacrilamidă cu gradient liniar de pori
(6-12%), prin BN-PAGE (TM). Linia a doua de gel a fost colorată cu CBB (CS). Pentru a se
determina activitatea diaforazei-NAD(P)H:plastoquinon:oxidoreductazei (asterisc pe partea
dreaptă a gelului), gelul din prima dimensiune, a fost incubat în 50 mM tampon fosfat
pH=8,0/EDTA, 1mM. Reacția de culoare a fost iniţiată prin adăugarea a 0,2 mM NADH şi 0,5
mg/ml nitro blue tetrazoliu. Gelul s-a incubat în continuare timp de 12 ore. Se evidențiază (prin
săgeţi) două complexe proteice care conţin clorofilă (AS) la o masă moleculară de 550 kDa
(semnalul de sus, echivalent complexului PS I, LHC I) şi un altul, la o masă moleculară de 120
kDa (semnalul mai mic, echivalent complexului LHC II).

Luate împreună, după direcția câmpului electric ale unui aparat de electroforeză, mişcarea particulelor
poate fi anticipată în cazul în care raportul sarcină electrică la masa moleculară şi/sau dimensiunea
proteinei este menţinut constant pe tot parcursul de separării. Astfel, mobilitatea (μ) a tuturor particulelor
va fi constantă iar separarea va decurge ca o distanţă parcursă în intervalul de timp, datorită forțelor de
decelerare și care este reflectă în masa moleculară şi/sau mărimea particulei. Acest fenomen înseamnă că,
în BN-PAGE, starea electrică a complexelor proteice este proporţională cu masa şi/sau dimensiunea
complexelor proteice. Fenomenul este bine demonstrat după o a doua separare electroforetică prin SDS-
PAGE unde tipul de detergent utilizat la solubilizare şi legarea Coomassie influenţează separarea
complexelor de proteine şi a subunităţilor corespunzătoare acestora.
Cel mai eficient sistem de control a distanţei de separare este reprezentat de gelul de separare. El este
montat între cele două tancuri care conțin tampon, astfel încât singura conexiune electrică între cele două
camere re realizează prin intermediul lui. Ca urmare, cea mai mare parte a sistemelor electroforetice
folosite în BN-PAGE sunt cu cele cu poziționare verticală a plăcilor de gel care prezintă conexiuni directe
lichid-tampon şi care fac mai eficientă utilizarea câmpului electric. Datorită rezistenței ridicate a gelului,
aparatul trebuie să posede un sistem de răcire.
Schimbarea tamponului catodic. Pentru a obține un background scăzut al gelului şi o vizualizare a
benzilor albastre după prima dimensiune, tampon catodal care conține CBB se schimbă la jumătatea
timpului de separare electroforetică. Acest procedeu este recomandat în mod deosebit în cazul în care este
planificată o detecție prin immunoblotting, după prima dimensiune (Darie și colab., 2006). Gelul odată
migrat poate fi folosit pentru diferite aplicaţii. Complexe singulare pot fi vizualizate atât prin colorare cu
CBB cât și prin colorare cu argint. În plus, gelul poate fi folosit pentru identificarea unor activități
enzimatice, precum complexele enzimatice/respiratorii mitocondriale (Sunderhaus și colab., 2006), în
timp ce subunităţile complexelor proteice pot fi revelate printr-o etapă electroforetică, ulterioară. În
această abordare 2-D, complexele proteice din prima dimensiune sunt denaturate cu SDS/β-
mercaptoetanol în gel şi sunt transferate direct într-un sistem standard SDS-PAGE (Laemmli, 1970),
pentru separarea subunităţilor proteice în funcţie de greutatea lor moleculară. Dupa finalizarea SDS-
PAGE, subunităţile pot fi vizualizate prin colorare cu CBB şi identificate prin spectrometrie de masă
(Granvogl și colab., 2006).
Colorarea preelectroforetică cu coloranți CyDyes a complexelor de proteine. De obicei, proteinele
separate sunt evidențiate prin colorare sau sunt marcate cu coloranți fluorescenți pentru vizualizarea lor
postelectroforetică. Coloranții chimici au o afinitate mai mare pentru moleculelor de proteine decât pentru
matricea de gel și astfel se detectează proteinele pe baza colorării necovalente diferenţiale. Rezultatul este
o creştere locală în concentraţia de colorant la nivelul benzilor de proteine.
Caracteristicile importante care conduc la selecția și utilizarea unei astfel de colorații sunt:
background-ul scăzut al matricei, sensibilitate ridicată de legare la proteine și un domeniu larg de
liniaritate de legare la proteine la concentraţii diferite. În BN-PAGE, marcarea proteinelor pentru o
detecție cu sensibilitate ridicată, poate fi de asemenea, realizată înainte de solubilzarea complexelor
proteice şi prin urmare, înaintea separării complexelor în componente.
Prin legare covalentă a coloranţilor fluorescenți la proteinele native, subunităţile singulare de
proteine ale complexului nativ sunt marcate cu un colorant prin intermediul grupărilor de lizină
şi apoi fluorescenţa este detectată după separarea complexelor prin BN-PAGE ori a subunităţilor
de proteine corespunzătoare prin electroforeză bidimensională, BN-PAGE/SDS-PAGE
(Granvogl și colab., 2006).
Versatilitatea BN-PAGE provine din două caracteristici particulare, critice pentru complexele proteice
separate, cu diferite proprietăți fizico-chimice care apar la diferite probe biologice cum ar fi mitocondriile,
cloroplastele, la alte organite celulare, fracţii citosolice şi la membrane bacteriene. În primul rând, pH-ul
de migrare în BN-PAGE este stabilit la 7,5, o valoare cuprinsă în intervalul fiziologic pentru cele mai
multe compartimente intracelulare. La această valoare se permite migraţia ansamblurilor de proteine,
sensibile la condiţiile acide şi/sau bazice care conduc la disocierea lor în subunităţi şi/sau pierderea
activităţii enzimatice.
În al doilea rând, CBB G-250 (figura 3.17) este dizolvat în tamponul catodal în timp ce proba este
introdusă, cu puţin timp înainte de migrare ceea ce conduce, în mod semnificativ, la legarea colorantulului,
în esenţă la toate proteinele membranei într-un mod în care se păstrează cele mai multe dintre interacţiile
proteină-proteină. Legarea colorantului conferă o sarcină negativă netă complexelor de proteine şi care în
mare măsură diminuează orice agregare artificială a proteinelor hidrofobe ale membranei solubilizate cu
detergent în timpul migrării electroforetice, printr-un proces de repulsie electrostatică, fără a fi nevoie de
prezența detergentului în gel. Legarea colorantui anionic se produce oarecum uniform într-un raport
CBB/proteine de regulă egal cu 1g colorant/1g proteină (Heuberger și colab., 2002). În consecinţă,
complexele de proteine şi proteinele individuale migrează spre anod datorită sarcinii negative nete şi sunt
separate printr-un efect de cernere a gelului de poliacrilamidă, în esenţă, în funcţie de dimensiunea (masa)
proteinelor (Schägger și von Jagow, 1991; Schägger și colab., 1994; Schägger, 1995; Schägger, 2001;
Schägger, 2003).
Desigur, comportamentul electroforetic al speciilor de proteine este mai mult sau mai puţin influenţat
de starea lor nativă (nedenaturată), de forma şi sarcina lor intrinsecă, cu atât mai mult, cu cât colorantul
CBB nu se poate lega decât marginal (Schägger și von Jagow, 1991; Schägger, 2001; Schägger, 2003;
Heuberger, 2002). Cu toate acestea, determinarea cu acuratețe a masei moleculare ale complexelor de
proteine solubile și membranare se realizează prin compararea maselor lor cu masa moleculară a altor
proteine cunoscute (Schägger și colab., 1994; Schägger, 2001; Schägger, 2003) precum și prin coroborare
cu o serie de tehnici precum centrifugarea în gradient de sucroză, gel-filtrarea și centrifugarea analitică,
metode mai laborioase și mai puțin precise (Heuberger și colab., 2002; Huang și colab., 1994; Heermann
și colab., 1998; John și colab., 2005; Marbois și colab., 2005).
În general, masele moleculare aparente a tuturor speciilor de proteine legate la CBB la un pI=8,6 şi
cele care nu se leagă la colorantul CBB G-250 la un pI=5,4 se potrivesc foarte bine pe curbele de calibrare
și care dezvăluie o dependenţă liniară a logaritmului masei aparente în funcție de distanţa de migrare
(Schägger și colab., 1994; Schägger, 1995; Schägger, 2001; Schägger, 2003). Limita superioară de
mărime a complexelor de proteine separate prin BN-PAGE este, de aproximativ 10.000 kDa (Nijtmans și
colab., 2002; Farhoud și colab., 2006), deoarece cele mai mari complexe multiproteice din mitocondrie
(precum complexul piruvat dehidrogenazei) pot intra în gelurile de separare în gradient cu o concentraţie a
poliacrilamidei de 3% în partea superioară a lor (Schägger, 2001; Schägger, 2003; Hunzinger și colab.,
2005). În principiu, alte matrici de gel precum cea de agaroză care posedă dimensiuni mai mari ai porilor
decât cei obținuți prin polimerizarea poliacrilamidei pot fi adoptate și care pot permite un potenţial de
separare a ansamblurilor de proteine cu mase moleculare semnificativ mai mari mari de 10.000 kDa. Un
gel de agaroză utilizat în condiții BN a fost demonstrat că separă complexul piruvat dehidrogenazic, dar
capacitatea sa de a rezolva amestecuri de proteine cu mase moleculare într-o gamă mai mare, a fost
inferioară (Henderson și colab., 2000) față de cea a unui gel de poliacrilamidă în gradient (Schägger,
2001; Schägger, 2003; Hunzinger și colab., 2005; Aseeva și colab., 2004). Pare mai plauzibil ca gelurile
compozite, îmbunătăţite, de agaroză-poliacrilamidă (Suh și colab., 2005) să poată oferi o matrice adecvată
pentru tehnica de electroforeză în condiții BN pentru a separa complexele de proteine gigant. De
asemenea, prin creşterea concentraţiei de poliacrilamidă în partea inferioară a gelului în gradient, la 18-
20%, BN-PAGE poate fi utilizată la separarea proteinelor mici şi a complexelor de proteine, cu masă
moleculară în jur de 10-50 kDa, care astfel permite performanțe de separare pe game înguste de mase
moleculare (Schägger, 2001; Schägger, 2003).
Se poate nota că disocierea interacţiunilor proteină-proteină, destul de slabe, induse de colorantul
anionic CBB în timpul BN-PAGE trebuie să fie luată în considerare, în special atunci când separarea se
aplică complexelor de proteine din membrană delipidate, prepurificate. În mod surprinzator, CF0-F1-ATP
sintaza din spanac solubilizată cu detergent rămâne intactă în timpul BN-PAGE, dacă se utilizează un
tampon catodic cu concentraţie scăzută colorant (0,002%) în timp ce prin utilizarea unei concentrații de
zece ori mai mare de colorant (0,02%-concentrația de detergent de obicei utilizată pentru analiza unor
extracte complexul se desface cantitativ în două subcomplexe, CF0 şi CF1 (Schägger și von Jagow, 1991;
Schägger și colab., 1994; Neff și colab., 1999). Prin urmare, prin combinarea unor detergenţi neutri cu
colorantul anionic CBB G-250 se pot mima proprietăţile unor detergenţi anionici, uşori (Neff și colab.,
1999).
Protocolul original al BN-PAGE a fost introdus inițial pentru analiza celor cinci complexe individuale
OXPHOS din mitocondriile izolate din inimă de bovină şi drojdie, într-o singură etapă, după solubilizare
cu detergenţi neionici într-o soluţie de acid 6-aminocaproic tamponată cu 2-[bis(2-hidroxietil)-amino]-2-
(hidroximetil)propan-1,3-diol (Bis/tris) (Schägger și von Jagow, 1991). Față de protocolul inițial, tehnica a
fost îmbunătăţită şi extinsă considerabil (Wittig și Schagger, 2007). Astfel, complexele OXPHOS separate
își păstrează integral activitatea lor enzimatică sau într-o măsură semnificativă, după electroeluția lor din
gel, demonstrând condiţiile native care justifică termenul electroforeză nativă (Schägger și von Jagow,
1991; Schägger și colab., 1994; Schägger, 1995). În anii care au urmat descoperirii ei până în prezent,
protocolul original a fost folosit fără modificari majore în scopul examinării compoziţiei subunităților
individuale ale complexelor mitocondriale OXPHOS de la o mare varietate de eucariote precum drojdii
(Schägger și von Jagow, 1991; Bullis și colab., 1994), plante (Jänsch și colab., 1995; Jänsch și colab.,
1996; Brumme și colab., 1998; Werhahn și Braun, 2002; Heazlewood și colab., 2003; Sabar și colab.,
2003; Heazlewood și colab., 2003; Heazlewood și colab., 2003; Millar și colab., 2003; Taylor și colab.,
2005; Navet și colab., 2004), alge (Duby și colab., 2001; Cardol și colab., 2002; Cardol și colab., 2004;
van Lis și colab., 2003; Atteia și colab., 2003; van Lis și colab., 2005), protiste (Navet și colab., 2004;
Speijer și colab., 1997; Maslov și colab., 1999; Horváth și colab., 2000; Horváth și colab., 2000; Fang și
colab., 2001; Horváth și colab., 2002; Nebohácová și colab., 2004; Horváth și colab., 2005; Marx și
colab., 2003), nematoda Caenorhabditis elegans (Artal-Sanz și colab., 2003), culturi de celule umane
(Nijtmans și colab., 1995; Klement și colab., 1995; Schägger și colab., 1996) şi ţesuturi umane (Schägger
și Ohm, 1995; Schägger, 1995; Devreese și colab., 2002).
BN-PAGE a apărut ca un instrument superior de analiză în diagnosticul clinic al defectelor
mitocondriene la nivelul OXPHOS (Schägger și colab., 1996; Schägger și Ohm, 1995; Schägger, 1995;
Bentlage și colab., 1995; Houštek și colab., 1999; Van Coster și colab., 2001; Santorelli și colab., 2002;
De Meirleir și colab., 2004; Carrozzo și colab., 2006), cu atât mai mult, cu cât sunt suficiente cantități de
ordinul miligramelor de țesut obținut din biopsii, ori mitoplaste sau mitocondrii izolate din culturi celulare
ale pacientului, pentru a obţine rezultate semnificative, care permit monitorizarea combinată a status-ului
de asamblare a complexelor OXPHOS şi a activităţile enzimatice după o evidențiere postelectroforetică.
Mai mult, BN-PAGE s-a dovedit a fi o metodă robustă, uşor de gestionat, precum şi eficientă din punct de
vedere al costurilor şi al timpului de lucru care furnizează rezultate deosebite de analiză a complexelor de
proteine din membrană precum și proteinele solubile din aproape toate tipurile de material biologic . De
asemenea, procedeul este adesea folosit ca o treaptă de purificare finală şi/sau ca instrument pentru
determinarea masei moleculare, a stării oligomerice și a compoziţiei în subunități a ansamblurilor
prepurificate de proteine (Schägger și von Jagow, 1991; Schägger și colab., 1994; Schägger, 1995;
Schägger, 2001; Schägger, 2003; Heuberger și colab., 2002; Huang și colab., 1994).
 3.6.11.1.1. Avantajele și limitările BN-PAGE
BN-PAGE reprezintă cea mai veche tehnică de electroforeză pe gel de poliacrilamidă în condiții
nedenaturante, unde colorantul furnizează sarcinile electrice necesare separării ansamblurilor de proteine
complexe prin electroforeză. Ea a fost descrisă pentru prima dată de către Schagger și von Jagow (1991) și
a cărei utilizare în detectarea şi analizarea complexelor de proteine solubile și de membrană de la toate
tipurile de material biologic, ca instrument de separare, a reprezentat un enorm succes.
O valoare specială o reprezintă BN-PAGE în proteomica funcţională, tehnica având o deosebită
robustețe putând fi astfel realizată în oricare laborator, fără a avea nevoie de echipament foarte scump și
foarte sofisticat. Pe lângă acestea, versatilitatea metodei, fiabilitatea şi precizia în identificare a
interacţiunilor proteină-proteină fac din BN-PAGE o metodă care răspunde cerinţelor esenţiale în
proteomică.
Totuși, uneori detecția fals pozitivă (a unor complexe artificiale, a unor proteine nefiziologice)
reprezintă o capcană, care apare în rarele momente când interacțiile dintre proteine sunt alterate din cauza
proastei solubilizări a ansamblului proteic de către detergent ori din cauza condițiilor precarfe asigurate de
BN-PAGE, când colorantul anionic CBB induce o perturbare în interacţiile slabe, existente între
subunități. Din acest punct de vedere, nu există decât un singur raport (Kouril și colab., 2005) care
dovedește prin abordări alternative, că uneori BN-PAGE ar produce rezultate fals pozitive şi anume în
cazul unor mici cantităţi de oligomeri PSI provenite de la plantele superioare, obţinute după solubilizarea
cu digitonină a cloroplastelor (Krause și colab., 2004; Heinemeyer și colab., 2004). Din această cauză,
posibilitatea de a detecta în mod artificial complexe ale unor agregate de proteine trebuie să fie luate în
considerare.
Pe de altă parte, detecția unor interacţiuni foarte slabe precum cele ale complexelor de proteine
tranzitorii prin BN-PAGE nu este posibilă, probabil, din mai multe cauze. Astfel, aplicarea corectă a BN-
PAGE ca o metodă mai degrabă probabilă în termeni de interacții dintre proteine poate oferi rezultate
superioare, în asociere cu abordări paralele, bazate pe alte principii, care pot confirma detectarea unor
interacţiuni proteine-proteine (Krause, 2006).
Pregatirea probei şi anume realizarea condiţiilor corespunzătoare solubilizării şi chiar originea
materialului biologic de start precum şi procedura de izolare a acestuia, reprezintă, fără îndoială condiții
esenţiale pentru a obţine rezultate optime în timpul analizei biochimice ulterioare. Foarte important, după
cum se observă în tabelul 3.11, în esenţă, toți detergenţii blânzi par a fi compatibili cu BN-PAGE. Acest
lucru permite o examinare aprofundată a acestora pentru a testa eficienţa de extragere a proteinelor de
membrană şi de prezervare a anumitor complexe proteice și implicit a funcțiilor lor. De fapt, studiul
interacţiilor proteină-proteină în condiţii diferite (de exemplu, prin utilizarea unor detergenţi diverși şi
analiza paralelă prin electroforeză nativă pe geluri de poliacrilamidă în condiții blânde) oferă o mai bună
evaluare a relevanţei lor fiziologice. În plus, o astfel de pregătire a probei şi o diversificare a condiţiilor de
electroforeză pot oferi date importante referitoare la complexele formate de multe proteine precum şi
informnații asupra unei proteine individuale printr-un singur protocol (Krause, 2006). De exemplu,
extractabilitatea diferenţială/stabilitatea complexelor de proteine membranare prin solubilizare cu
detergenţi diferiți (Krause și colab., 2004; Moslavac și colab., 2005), precum şi mobilităţile diferite ale
unor specii de proteine în cazul separări lor prin BN-PAGE pot conduce la identificarea unor complexe de
proteine care comigrează cu alte specii de proteine sau care, în alte condiţii nu penetrează în gel. Această
strategie creşte, de asemenea, şansa de a detecta complexe mai puţin abundente de proteine. Luate
împreună, în conformitate cu cele prezentate în acest capitol, extractele proteice solubilizate, extractele
probelor de membrană în prezență de detergent precum și cele ale organitelor celulare, trebuie întotdeauna
să fie analizate atât prin BN-PAGE cât și prin alte tehnici nedistructive (precum tehnica de electroforeză
pe gel de poliacrilamidă fără coloranți-CN-PAGE) în paralel. Schägger (2001; 2003) recomandă testarea
permanentă în termen de electroforeză a extractelor proteice în detergent fără adaosuri mari/suplimentare
de colorant CBB înainte de BN-PAGE. În mod similar, amestecurile de proteine solubile, precum şi
proteinele de membrană prepurificate care conţin numai cantităţi mici de micele lipid-detergent trebuie să
fie analizate, în primul rând, cu tampon catodic diluat (care să conțină de exemplu, 0,002% CBB). În plus,
se are în vedere creșterea în mod semnificativ a analizelor modificarilor post-translaționale precum
fosforilarea speciilor de proteine prin separare în sistem BN-PAGE (Tichy și colab., 2003; Taylor și
colab., 2003; Focke și colab., 2003; Bykova și colab., 2003a; Bykova și colab., 2003b; Augereau și
colab., 2005; Krause-Buchholz și colab., 2006; Di Pancrazio și colab., 2006; Guerrieri și colab., 1999;
Bautista și colab., 2000; Choksi și colab., 2004; Wen și Garg, 2004; Burwell și colab., 2006; Franco și
colab., 2006).
Dezavantajul utilizării CBB este acela că odată legat la proteine colorantul poate să acționeze ca
detergent ceea ce cauzează disocierea complexelor proteice. Un alt dezavantaj îl reprezintă capacitatea
CBB de a stinge chemoluminescența (proces care îl face inadecvat în detectarea ulterioară prin Western
blotting sau în cazul realizării unor studii de activitate) sau fluorescenţa unor proteine care conțin grupări
prostetice fluorescente (de exemplu, hemul sau clorofila), ori marcate cu coloranţi fluorescenți.
În concluzie, BN-PAGE s-a dezvoltat ca metodă de separare a proteinelor de membrană și a
complexelor multiproteice cu mase moleculare cuprinse între 10kDa și 10.000 kDa (Schagger and von
Jagow, 1991; Schagger et al, 1994; Schagger, 2000).
 Protocoalele originale și tehnicile înrudite au fost încontinuu imbunătățite și dezvoltate. Se poate nota
că au fost introduse noi tampoane pentru separările prin BN-PAGE, bistris fiind acum general înlocuit cu
imidazol, care nu disturbă determinările de proteine iar în același timp proteinele sunt solubilizate la o
tărie ionică scăzută (NaCl, 50 mM) comparativ cu tehnicile care utilizsează acid aminocaproic în
concentrație de 500mM.
 Principiile de bază ale BN-PAGE, au rămas totuși neschimbate, detergenți neutrii și blânzi, utilizați la
solubilizarea proteinelor de membrană și CBB fiind adăugați la supernatant după centrifugare.
 CBB se leagă la suprafața tuturor proteinelor de membrană dar nu și de proteinele solubile în apă. Se
poate spune că legarea unui mare număr de molecule de colorant anionic reprezintă baza utilizării CBB în
BN-PAGE.
3.6.11.2. Electroforeza nativă pe geluri de poliacrilamidă incolore (CN-PAGE)
Acest tip de electroforeză (Clear Native PAGE, CN-PAGE) separă proteine acide solubile sau de
membrană, de exemplu, prin migrare pe gel de poliacrilamidă în gradient de pori. Procedeul nu utilizează
un colorant încărcat electric, astfel mobilitatea electroforetică a proteinelor în CN-PAGE (în contrast cu
schimbarea sarcinii electrice care survine în tehnica BN-PAGE) depinde numai de sarcinile electrice
intrinseci ale proteinelor, distanța de migrare depinzând deci numai de sarcina intrinsecă a acestora și de
mărimea porilor gelului în gradient. În multe cazuri această metodă are o rezoluție mai scăzută decât cea
obținută prin BN-PAGE, deși CN-PAGE oferă avantajele pe care prezența colorantului CBB nu le poate
oferi: lipsa unei interferențe în tehnicile analitice ulterioare, de exemplu în cea de separare la microscală
pentru analize FRET (fluorescence resonance energy transfer). De asemena CN-PAGE este o tehnică mai
blândă decât BN-PAGE și deci cu ajutorul ei se pot prezerva ansamblurile supramoleculare labile ale
complexelor proteice de membrană care altfel ar disocia în condițiile oferite de BN-PAGE.
CN-PAGE a fost introdusă în anii ‘90, la scurt timp după dezvoltarea BN-PAGE şi nu este nimic
altceva, decât un sistem electroforetic folosit în BN-PAGE, care nu utilizează însă colorantul în procesul
de separare (Schägger și colab., 1994). În atare de condiții, complexele de proteine vor migra numai sub
incidența sarcinii lor intrinseci spre anod şi numai speciile acide de proteine (pI<7,0) intră în gel
(Schägger și colab., 1994). Acest fenomen limitează versatilitatea CN-PAGE şi astfel, în comparaţie cu
BN-PAGE, amestecul de proteine sunt rezolvate cu o putere mai redusă. Astfel, mobilitatea electroforetică
a speciilor de proteine este determinată nu numai de mărimea lor, ci şi de punctul lor izoelectric, în
contrast cu condiţiile existente în BN-PAGE. În general, proteinele solubile acide sau complexele
proteină-lipid-detergent solubilizate de membrană, cu un pI=5,4 au o sarcină destul de negativă în termen
de mobilitate, asemănător BN-PAGE (Schägger și colab., 1994). CN-PAGE a fost utilizată pentru prima
dată ca o treaptă de preseparare a complexelor OXPHOS (complexe mitocondriale de fosforilare
oxidativă) din inima bovină, solubilizate cu ß-dodecil-n-maltozid (DDM), urmată de BN-PAGE
bidimensională și care conduce la separări cu mare rezoluție deși mobilitatea electroforetică a complexelor
OXPHOS de la mamifere şi ciuperci filamentoase este redusă în mod semnificativ în comparaţie cu BN-
PAGE (Schägger și colab., 1994; Krause și colab., 2004; Krause și colab., 2005; Wittig și, Schägger
2005), în timp ce omologii complexelelor OXPHOS de la drojdii (Grandier-Vazeille și Guerin, 1996;
Pfeiffer și colab., 2003; Zhang și colab., 2005; Gavin și colab., 2002; Prescott și colab., 2003; Stephens și
colab., 2003; Gavin și colab., 2003; Stephens și colab., 2003; Gavin și colab., 2004; Gavin și colab.,
2005; Everard-Gigot și colab., 2005; Saddar și colab., 2005) şi de la plante (Krause și colab., 2004)
prezintă mobilități sunt foarte asemănătoare în timpul electroforezei în ambele sisteme. De interes deosebit
este observaţia că ansamblurile proteice de fotofosforilare de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii
(Rexroth și colab., 2004), precum și alte complexe proteice tilacoide (Krause și colab., 2004; Darie și
colab., 2005) ori complexele solubile ale stromei (Peltier și colab., 2004, Krause și colab., 2004; Schroda
și colab., 2001; Peltier și colab., 2006; Majeran și colab., 2005) au un comportament electroforetic
aparent comparabil atât în BN- cât și în CN-PAGE, ceea ce sugerează mai degrabă pI-urile acide ale
proteinelor respective. Într-adevăr, complexele Clp proteazice din stroma plantelor superioare, care au
aceeaşi masă moleculară aparentă de 325 kDa obţinută atât prin BN cât și prin CN-PAGE, analizate prin
focalizare izoelectrică în condiții native, au condus la determinarea unui pI acid, aproximativ egală cu 5,0
(Peltier și colab., 2004).
Dacă în BN-PAGE cel mai important aspect detrimental îl reprezintă faptul că unele interacţii proteină-
proteină sunt afectate într-o oarecare măsură de prezența colorantulului anionic CBB, care conduce, de
exemplu, la disocierea complexelor de proteine în unităţile componente (Neff și colab., 1999), prin
aplicarea CN-PAGE s-a raportat o separare cu o rezoluție semnificativ mai mare a supercomplexelor
OXPHOS conservate (Krause, 2006) din extractele de fungi (Pfeiffer și colab., 2003; Krause și colab.,
2004; Everard-Gigot și colab., 2005) ori din mitocondriile de mamifere (Krause și colab., 2005; Wittig și
Schägger, 2005). În mod similar, complexele de proteine solubile ale stromei înalt purificate din
cloroplastele de Arabidopsis s-au dovedit a fi mai puţin stabile în timpul BN-PAGE (Peltier și colab.,
2004; Peltier și colab., 2006) mai ales atunci când se adaugă înainte de electroforeză concentraţii ridicate
de colorant CBB, în timp ce prin CN-PAGE s-a reușit separarea mai multor proteine, dintre care 241 au
putut fi identificate, multe dintre ele fiind parte a unor complexe (Peltier și colab., 2006). De altfel, pentru
a se evita o potenţială agregare a proteinelor de membrană din extractele în timpul migrării electroforetice,
se adaugă detergenţi blânzi la gelurile native incolore, de exemplu, DDM, 0,01% (Schägger și colab.,
1994), Triton X-100, 0,01% (Krause și colab., 2004a; Krause și colab., 2004b; Krause și colab., 2005) ori
digitonină, 0,003-0,025 % (Krause și colab., 2004a; Krause și colab., 2004b; Krause și colab., 2005;
Zhang și colab., 2005; Wittig și Schägger, 2005; Rexroth și colab., 2004), detergenți prezentați în tabelul
3.11.
Tabelul 3.11. Detergenți utilizați pentru solubilizarea complexelor proteice integrale de membrană pentru analiză prin CN-PAGE.
(După Krause, 2006).
Detergentul utilizat Proba biologică
Mitocondrie la mamifere
β-D-dodecilmaltozid Mitocondria la drojdii
Cloroplaste la plante (tilacoide)
β-D-decilmaltozid Mitocondrie la mamifere
β-D-octilglucozid Mitocondrie la drojdii
Triton X-100 Mitocondrie la drojdii
Nonidet P-40 Mitocondrie la drojdii
Lubrol Mitocondrie la drojdii
Digitonină Mitocondria la drojdii
În condițiile analizei proteinelor de membrană este necesar să se cunoască efectul diferitelor
concentraţii de detergenţi corespunzători prezenţi în gel; din această cauză detergenții trebuie să fie
întotdeauna testați pentru a se evalua pe de o parte potenţialul artificial de agregare a complexelor proteice
în timpul migrării electroforetice şi pe de altă parte, menținerea stabilității complexelor de proteine în
extractul de detergent (Krause și colab., 2004a; Krause și colab., 2004b; Krause și colab., 2005; Zhang și
colab., 2005). Figura 3.60 prezintă o analiză a sensibilității la detergent în cazul unei activități enzimatice.

Figura 3.60. Analiza sensibilității ATP-azei la detergent. S-au analizat trei geluri după CN-PAGE unidimensională la care raportul
digitonină/proteină este (A) 2g/g, (B) 4g/g şi (C) 8g/g. Cele 4 probe (1-4) au fost studiate astfel: benzile 1 au fost utilizate la
determinarea directă a activității ATPazice (zimografie în tampon tris/glicină suplimentat cu ATP, Mg2SO4, şi Pb (NO3)2). Benzile
nr. 2 au fost preincubate în tampon tris/glicină, după care tamponul s-a înlocuit cu tamponul de analiză, fără detergent și reprezintă
referinţa pentru benzile 3 şi 4 care au fost tratate cu diverși detergenți blânzi. (A) Triton X-100 (0,025% și 0,05%) a fost adaugat in
tamponul de incubare, după care s-a analizat activitatea enzimatică (A 3 şi A 4), după care s-a comparat cu activităţile de pe benzile
de referinţă, 2. În mod similar, au fost utilizați (B) digitonina şi (C) DDM pentru benzile de gel 3 şi 4 (0,025% şi 0,05% detergent).
(După Wittig şi Schägger, 2005).
3.6.11.2.1. Avantajele și limitările CN-PAGE
CN-PAGE în prezență de DDM şi digitonină, a fost descrisă ca fiind o tehnică foarte eficientă în
separarea la microscală necesare analizelor FRET (Gavin și colab., 2003; Prescott și colab., 2003;
Stephens și colab., 2003; Gavin și colab., 2004). CN-PAGE acționează în condiţii mult mai blande decât
BN-PAGE, după cum CBB, colorant anionic, poate să mimeze unele proprietăţi ale unui detergent anionic
şi poate cauza disocierea proteinelor din complexele lor de membrană. Este cazul disocierii parţiale a
domeniului catalitic F1 şi în subunităţile individuale a şi b ale holo-complexului V respirator unde
condiţiile blânde, datorate în special utilizării digitoninei conduce la păstrarea ansamblurilor
supramoleculare ale complexelor ale lanţului respiratorii, care sunt disociate în condiţiile mai dure ale BN-
PAGE (Pfeiffer și colab., 2003).
Un alt exemplu este cel al identificării în sistem digitonină/CN-PAGE a stărilor oligomerice ale ATP
sintetazei mitocondriene, care anterior nu au putut fi detectă cu ajutorul BN-PAGE.
De obicei, pentru analize standard, se utilizează mai degrabă BN-PAGE, decât CN-PAGE, deoarece
rezoluţia ansamblurilor de proteine este mai mare, iar estimările maselor moleculare/stării oligomerice
sunt mai ușor de obținut. Cu toate acestea, CN-PAGE oferă avantaje ori de câte ori colorantul CBB
interferă cu alte tehnici de analiză, de exemplu, în determinarea activităţilor enzimatice.
Un alt avantaj al CN-PAGE este cel de îmbunătăţire a activităţii de decolorare a gelului, după cum nu
există nici o interferenţă de culoare a fundalului, iar accesibilitatea substratului nu este afectată de prezența
colorantului legat la proteine (Grandier-Vazeille și Guerin, 1996; Pfeiffer și colab., 2003; Krause și
colab., 2005; Wittig și Schägger, 2005).
Ca și în cazul BN-PAGE, CN-PAGE utilizează aceleași tampoane (Schägger, 2003) şi aceleaşi condiţii
de migrare, cu excepţia că, pentru CN-PAGE probele aplicate şi tamponul catodal nu conţin nicio cantitate
de detergent, în timp ce digitonina, în concentrație de 0,025% este inclusă în gelul de poliacrilamidă cu
gradientul linear pori, T%=3-13%. Trebuie notat că în cele mai multe cazuri, condiţiile de solubilizare a
proteinelor de membrană includ suspendarea sedimentului de membrane într-un tampon de solubilizare, de
tipul NaCl 50mM, imidazol 50mM, acid 6-aminohexanoic 2mM, EDTA 1mM, pH=7, după care se adaugă
digitonină, 20% (Wittig și Schägger, 2005).
Având în vedere caracteristicile de mai sus-menţionate, CN-PAGE este utilizată mult mai rar decât
BN-PAGE (Peltier și colab., 2004; Schägger și colab., 1994; Grandier-Vazeille și Guerin, 1996;
Grandier-Vazeille și colab., 2001; Pfeiffer și colab., 2003; Krause și colab., 2004; Krause și colab., 2004;
Krause și colab., 2005; Zhang și colab., 2005; Wittig și Schägger, 2005; Gavin și colab., 2002; Prescott și
colab., 2003; Stephens și colab., 2003; Gavin și colab., 2003; Stephens și colab., 2003; Gavin și colab.,
2004; Gavin și colab., 2005; Everard-Gigot și colab., 2005; Saddar și Stuart, 2005; Schroda și colab.,
2001; Peltier și colab., 2006; Rexroth și colab., 2004; Darie și colab., 2005; Majeran și colab., 2005;
Malave și colab., 2003; Nováková și colab., 2006). Se poate concluziona astfel că CN-PAGE este un
instrument interesant în abordările funcţionale din proteomică.
3.6.11.3. Electroforeza proteinelor bazice pe geluri de poliacrilamidă în sistem acid acetic-uree
În anul 1969, Panyim şi Chalkley au descris un sistem continuu (acid acetic-uree, AU) de separare a
proteinelor bazice foarte asemănătoare, pe baza diferențelor de mărime și sarcină electrică pe un gel de
poliacrilamidă. Un exemplu al acestui protocol, îl reprezintă separarea histonei H4 nemodificate de
formele sale monoacetilate sau monofosforilate (Ruiz-Carrillo și colab., 1975). Astfel, la un pH acid egal
cu 3,0 proteinele bazice cu o valoare crescută a punctului izoelectric vor avea în mod clar o sarcină netă
pozitivă, care va reprezenta un determinant important a mobilității lor. În cazul în care o singură sarcină
superficială pozitivă este eliminată, de exemplu, prin acetilarea “in vivo” a unuia dintre resturile ε pozitive
de lizină a catenei mici de histonă H4 (102 reziduuri), se observă o scădere semnificativă a mobilității
efective pe gel. În mod similar, adăugarea unei grupări fosfat scade sarcina netă pozitivă a proteinei care
se va materializa cu o modificare drastică a mobilității electroforetice în timpul migrării. Separarea
proteinelor cu mărimi și sarcini similare, de exemplu, histonele parţial acetilate H2A, H2B și H3 din cele mai
multe organisme, se poate realiza, de obicei, numai prin includerea unui detergent neionic, de tipul Triton
X-100 (Waterborg, 2000). Totuși, pentru a obține rezultate optime, gelurile AU trebuie să fie supuse
preelectroforezei pentru a încărca gelul cu un strat de ioni înaintea depunerii probei. În cursul
acestui proces preelectroforetic, forma godeurilor se deformează, făcând gelurile neutilizable.
Paulson și Higley (1999) au eliminat acest inconvenient prin încărcarea godeurilor de gel cu
polietilen glicol înainte de preelectroforeză. Pe de altă parte, Bonner și colab. (1980) au descris
tehnica de electroforeză în sistem discontinuu în prezența acidului acetic, ureei și a detergentului Triton, o
variantă a metodei care evită necesitatea unei preelectroforeze exhaustive, previne deformarea godeurilor
probei (Paulson și Higley, 1999) şi în general, produce benzi mult mai clare și mai înguste. Astfel, dacă în
condiții native, datorită absenței fenomenului de concentrare (stivuire) benzile proteice caracteristice au
forme de obicei curbate și oarecum difuze, sistemul discontinuu de separare prin electroforeză în prezența
acidului acetic și a ureei este superior, fiind utilizat nu numai pentru separarea histonelor, dar și pentru alte
proteine și care conduce la obținerea unor benzi clare, într-o perioadă mai scurtă de timp decât în cazul
modului de electroforeză continuă (Panyim și Chalkley, 1969; Ruiz-Carrillo și colab., 1975). S-a descris
astfel o metodă de separare a unor histone din drojdii care prezervă toate modificările postsintetice. De
altfel, separarea în funcție de numai o sarcină electrică este dovedită a avea la bază acetilarea resurilor de
lizină și a fost demonstrată în mod clar, pentru fiecare specie de histone. De altfel, fără o fracţionare,
profilurile histonelor H2B, H2A şi H3 s-ar suprapune, făcând imposibilă cuantificarea fiecărei proteine și a
acetilărilor survenite, în timp ce forma benzilor proteice este în general îngustă și dreaptă. În plus,
compresia formei benzii, vizibilă pentru o serie de proteine nehistone foarte abundente cu mobilități
scăzute în gel, poate fi minimizată prin scăderea concentraţiei de proteine în gelul de concentrare ori prin
creşterea grosimii gelului (Waterborg, 2000).
Gelurile AU sunt utilizate în prezent în analiza unor proteine foarte diferite, cu puncte izoelectrice mai
mici decât cele ale histonelor, care la un pH=3,0 pot fi încărcate electric pozitiv în cursul electroforezei.
Exemplele includ defensinele din neutrofile (Wang și colab., 1997), proteinele din secreţiile nazale cu
activitate antimicrobiană (Cole și colab., 1999), enzime, precum tirozinaza (Burzio și colab., 2000),
izoenzimele serice (Hansen și colab., 2000), chemokinele (Krijgsveld și colab., 2000) ori protaminele
bazice (Evenson și colab., 2000).
3.6.11.3.1. Electroforeza proteinelor pe geluri de poliacrilamidă în prezență de fenol-acid acetic-uree
O alternativă la separarea prin SDS-PAGE sau prin AU-PAGE o reprezintă electroforeza pe gel de
poliacrilamidă în prezență de fenol-acid acetic-uree (PAU-PAGE), tehnică introdusă de Work (1964)
care, datorită capacității excelente de solubilizare a proteinelor de către amestecul fenol-acid acetic-uree s-
au putut utiliza la fracționarea, prin electroforeză, a proteinelor hidrofobe din membrană, insolubile în apă
(Pusztai și Wait, 1973; Zahler și Niglli, 1977). Procesul fizico-chimic presupune că fenolul şi acidul acetic
sunt capabile într-o anumită măsură să disrupă legăturile de hidrogen care stabilizează proteinele prin
donarea de protoni grupărilor carbonil ale legăturii peptidice (Zahler și Niglli, 1977). De asemenea, ambii
componenți (fenolul şi acidul acetic) perturbă interacţiile hidrofobe, ceea ce face din ei buni solvenţi
pentru extracția și solubilizarea unor astfel de proteine de membrană. În plus, după cum urea care este bine
cunoscută a disrupe legăturile de hidrogen amestecul PAU destabilizează atât strucutra terţiară cât și pe
cea cuarternară a proteinelor, manifestând un puternic efect de monomerizare.
Chiar și odată cu dezvoltarea SDS-PAGE, tehnica electroforetică PAU-PAGE a continuat să fie
folosită pentru fracţionarea de înaltă rezoluţie a unor proteine, precum subunitatea catalitică a Ca-
ATPazei. În aceste condiții acide, caracteristice PAU-PAGE, se menţin caracteristicile acido-stabile ale
intermediarilor fosforilați ai ATP-azelor vanadat-sensibile şi se permite astfel identificarea lor cu rezoluţie
înaltă (MacLennan, 1970; Meissner și Fleischer, 1971; Zahler, 1974; Gallagher și Leonard, 1987).
Geluri plate verticale se realizează prin polimerizarea în prezența directă a amestecului de fenol, uree și
acid acetic, direct în matricea de gel (Simon, 1980). Din păcate, la concentraţii mai mari de l0% de fenol,
acesta interferă la reacția de polimerizare şi provoacă un background excesiv la colorare făcând astfel
dificilă evidențierea profilului electroforetic al proteinelor din amestec. Polimerizarea gelurilor în prezență
de fenol conduce la o serie de probleme care nu sunt în mod obișnuit întâlnite în cazul polimerizării
clasice a acrilamidei. Astfel, sunt necesare cantități semnificativ mai mari de agenți chimici de
polimerizare și din această cauză, timpul de polimerizare este mai lung. Gelurile au o tentă de culoare ușor
brună, și conduc la un fond înalt care impietează la evidențierea benzilor proteice prin utilizarea condițiilor
standard ale procedurii de colorare a proteinelor cu CBB și s-a evidențiat o relație liniară între concentrația
de fenol prezent în sistemul de polimerizare și background-ul obținut după colorare.
Interferența la colorarea și apariția background-ului este de asemenea în funcție de raportul
acrilamidă/bisacrilamidă pe de o parte și de cantitatea de agenți de polimerizare utilizați, pe de altă parte.
În plus, gelurile se contractă în timpul polimerizării, iar mărimea acestei contracții este în funcție de
aceeași doi parametrii, contracția fiind mai accentuată la cantități scăzute de agenți chimici de
polimerizare ori la un raport acrilamidă/bisacrilamidă ușor crescut (Simon, 1980). Pe de altă parte, în cazul
sistemelor cu geluri subțiri, verticale cu o grosime de 1,5 mm, procesul mai sus prezentat este redus. În
schimb, gelurile cu o grosime mai mare de 1,5 mm devin mult prea fragile pentru a fi utilizate în studiile
de rutină. În rezolvarea electroforetică a subunității catalitice a Ca-ATPazei de transport prin membrană s-
a dovedit că sistemul de separare în prezență de PAU este mai eficient în condițiile în care concentrația de
fenol este introdusă în gel chiar înainte de utilizare (Zahler, 1974), gelul polimerizându-se înainte de
introducerea amestecului celor trei componente (PAU), deși odată cu adăugarea acestora se constată o
mare distorsiune a godeurilor gelului, fenomen înlăturat fie prin izolarea camerei de polimerizare și
creerea unor condiții speciale procesului de transfer (Gallagher și Leonard 1987), fie prin utilizarea
polietilen glicolului în amestecul de polimerizare (Paulson și Higley 1999). De altfel, la alegerea finală a
sistemului de gel trebuie avut în vedere factorii enumarați mai sus.
Condiţiile acide în care funcționează PAU-PAGE asigură, celor mai multe proteine, o încărcare cu
sarcini pozitive în timp ce în condițiile utilizării unui matrix de gel cu o înaltă densitate, variaţia în
mobilitate datorată diferenţelor de sarcini native este, de obicei compensată de efectul de cernere
moleculară a gelului și care conduce la o corelație ridicată între mobilitatea şi greutatea moleculară a
proteinelor (Gallagher și Leonard 1987; Meissner și Fleischer, 1971; Conrad și Penniston, 1976). Un
sistem similar (Takayama și colab., 1966), în care se realizează un transfer prin schimb între matricea de
gel și componentele PAU, arată de asemenea o relaţie bună între masa moleculară şi de mobilitatea
relativă a proteinelor (Senior și Brooks, 1970; Senior și MacLennan, 1970). Cu toate acestea, o serie de
proteine precum pepsina, prezintă excepţii, ele nefracţionând în funcţie de masa ei moleculară, datorită
probabil faptului că aceste proteine, printre care și pepsina, au puncte izoelectrice egale cu 2,0, apropiate
de pH-ul de operare al sistemului ceea ce are ca efect încărcarea lor cu o sarcină electrică netă prea mică şi
ca urmare fără posibilitatea de a migra în gel pe tot parcursul procesului de separare (Malamud și
Drysdale, 1978).
Pe de altă parte, prin utilizarea acestei tehnici, schimbările în mobilitate datorate unor condiții
reducătoare, permit identificarea punților disulfurice atât inter cât și intramoleculare. Astfel, modificarea
mobilității albuminei serice bovine (de la rapid la lent), precum şi a altor proteine monomerice în condiții
reducătoare după reducerea punților –S-S- a fost raportată chiar în condițiile utilizării SDS-PAGE la un
pH redus, într-un sistem în care este prezent acidul formic (Heukeshoven și Demick, 1981; Allore și
Barber, 1984). În mod similar, albumina serică bovină neredusă are o mobilitate neaşteptat de mare într-
un sistem PAU-PAGE în care se utilizează concentraţii scăzute de fenol (Simon, 1980). Heukeshoven şi
Dernick (1981) motivează acest comportament prin faptul că albumina serică bovină neredusă este mult
mai compactă ca urmare a stabilizării punților disulfurice în timp ce după reducere, structura ei se
deschide şi din această cauză, în timpul migrării electroforetice, procesele de fricțiune între proteină și
matricea de gel cresc, ceea ce conduce la reducerea mobilității acesteia. De altfel, PAU-PAGE conduce la
o rezoluţie excepţională atât a proteinelor reduse cât și a celor nereduse, ultimile fiind extrase din
membrana plasmatică cu ajutorul unui detergent neionic, de tipul Triton X-114 (Gallagher și Leonard,
1987). Ca urmare, în condițiile în care se analizează preparate proteice obținute din membrane plasmatice
a celulelor provenie din rădăcină de porumb, tratate Triton X-114 se observă o bandă de proteină majoră
cu o masă de 65 kDa. Această proteină de 65 kDa a fost convertită prin reducere în trei benzi noi la
aproximativ jumătate din masa moleculară. Acest proces sugerează faptul că proteina 65 kDa majoră
neredusă, extrasă cu Triton 114 din membrana plasmatică este o proteină complexă, formată din două sau
trei subunităţi legate prin punți disulfurice (Gallagher și Leonard, 1987). În opoziție, preparate proteice
obținute din același material biologic analizate prin SDS-PAGE conduc la electroforegrame dificil de
interpretat (Gallagher și Leonard, 1987; Briskin și Leonard, 1982; Dupont și Leonard, 1980). Astfel,
PAU-PAGE rezolvată proteine pe care SDS-PAGE nu le poate identifica şi care indică faptul că principala
problemă nu o reprezintă proba, ci sistemul SDS-PAGE în sine.
Sistemul descris de Simon (1993) de evidențiere prin electroforeză într-un sistem fenol-acid acetic-uree
a proteinelor veziculare la archea Halobacterium conduce la obținerea unor geluri care pot fi uscate în
mod satisfăcător, fiind compatibil cu tehnicile fluorografice utilizate la identificarea benzilor proteice și de
cuantificare a radioactiviății. Cum background-ul colorației gelurilor este minimă, gelurile pot fi scanate
pentru a se estima cantitatea de proteină din fiecare bandă proteică (Simon, 1980). Este de asemenea
posibil să se realizeze analize de Western blotting a proteinelor separate pe geluri PAU (Halladay și
colab., 1993).
În concluzie, PAU-PAGE fracționează proteine în funcţie de greutate lor moleculară, având un efect
puternic de monomerizare a proteinelor, de solubilizare a proteinlor insolubile hidrofobe. Condițiile create
de amestecul PAU conduce la distrugerea activitatății endogene a proteazelor din probă, fără a fi nevoie de
o prelucrare termică. Prin PAU-PAGE este uşor de observat diferențele de conformaţie datorate punților
disulfurice ale proteinelor mono- şi multimerice prin reducerea mobilității aparente, această proprietate
fiind utilă în cazul studiilor de conformaţie a proteinelor extrem de hidrofobe, cu o solubilitate scăzută în
soluții apoase. PAU-PAGE oferă astfel, un punct de vedere tehnic și eficient, fiind o alternativă la
exigențele SDS-PAGE.
3.6.12. SEPARAREA AMESTECURILOR DE OLIGONUCLEOTIDE PRIN PAGE ÎN CONDIȚII
DENATURANTE
Electroforeza pe gel de poliacrilamidă în condiții denaturante este una dintre cele mai
utilizate metode de separare a oligonucleotidelor, fiind folosită atât la analiza amestecurilor de
nucleotide cât și la purificarea acestora, la scală micropreparativă.
După cum s-a menționat anterior, DNA într-un gel poate fi descris ca având o configurație
închisă, spre cea liniară existentă într-o soluție este înfățișat sub o formă deschisă, prins într-o
rețea tridimensională de gel. Relația cantitativă dintre mobilitatea electroforetică a DNA în geluri
și lungimea sa poate fi exprimată prin următoarea formulă (Lerman și Frish, 1982).

unde µ reprezintă mobilitatea electroforetică, l, lungimea DNA, α este o constantă care depinde
în principal de tamponul utilizat în electroforeză, c este o constantă multiplicativă dependentă de
gradul de reticulare al gelului precum și de alți factori.
O formulă similară a fost descrisă și de Lumpkin și Zimm (1982). În acest caz, exponentul α
este unitar în cazul ideal, fiind subunitar în tampoanele obișnuite. Această formulă care descrie
mobilitatea electroforetică implică faptul că logµ este o funcție liniară a logl și astfel logaritmul
distanței migrate, plotate față de logaritmul lungimii fragmentului de DNA este o linie dreaptă,
iar α este dat de panta ei. Panta α este o măsură a modului prin care fragmentele de DNA se
separă pe gel.
În mod tradițional, tamponul comun utilizat, Tris-borat, 89mM, EDTA, 2 mM, pH=8,3
(Peacock și Dingman, 1968) este adecvat dar, de asemenea, prezintă o serie de dezavantaje.
Relativa mare conductivitate face din separare o procedură mai degrabă de lungă durată. De
asemenea, nu este clar dacă separarea dintre benzile de DNA utilizând tamponul Tris-borat este
cel mai atractiv sau maxim teoretic posibil.
Mandecki și Hayden (1988) au arătat că utilizarea unui tampon care conține L-histidină 50
mM (pH=7,6) îmbunătățește profund rezoluția oligonucleotidelor care conțin mai puțin de 70 de
resturi nucleotidice în condițiile separării prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă și în condiții
denaturante. În plus, mica conductivitate a tamponului de histidină conduce la o scădere de trei
ori a timpului de separare, după cum o serie de compuși policationici (spermidina și etilen-
diamina) îmbunătățesc rezoluția de separare a oligonucleotidelor.
Bibliografie
Aivaliotis, M., Karas, M., Tsiotis, G. (2006) High throughput two-dimensional blue native electrophoresis: a tool for functional
proteomics of cytoplasmatic protein complexes from Chlorobium tepidum. Photosynth. Res. 88:143-157.
Akin, D. T., Shapira, R., Kinkade, Jr. J. M. (1985) The determination of molecular weights of biologically active proteins by
cetyltrimethylammonium bromide–polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 145:170-176.
Akins, R. E., Levin, P. M., Tuan, R. S. (1992) Cetyltrim ethylammonium bromide discontinuous electrophoresis: MR-based
separation of proteins with retention of enzymatic activity. Anal. Biochem. 202:172-178.
Akins, R. E., Tuan, R. S. (1994) Separation of proteins using cetyltrimethylammonium bromide discontinuous gel
electrophoresis. Mol. Biotech. 1:211–228.
Akins, R. E., Tuan, R. S. The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition, Edited by: J. M. Walker © Humana Press Inc., Totowa,
NJ, 2002.
Allore, R. J., Barber, B. H. (1984) A recommendation for visualizing disulfide bonding by one-dimensional sodium dodecyl
sulfate--polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 137:523-527.
Amory, A., Foury, F., Goffeau, A. (1980) The purified plasma membrane ATPase of the yeast Schizosaccharomyces pombe
forms a phosphorylated intermediate. J. Biol. Chem. 255:9353-9357.
Ansorge,W., Garoff, H. (1981) Improvements of DNA sequencing gels. Anal. Biochem. 115:450-457.
 Artal-Sanz, M., Tsang, W. Y., Willems, E. M., Grivell, L. A., Lemire, B. D., van der Spek, H., Nijtmans, L. G. (2003) The
mitochondrial prohibitin complex is essential for embryonic viability and germline function in Caenorhabditis elegans. J. Biol.
Chem. 278:32091–32099.
Aseeva, E., Ossenbühl, F., Eichacker, L. A.,Wanner, G., Soll, J., Vothknecht, U. C. (2004) Complex formation of Vipp1
depends on its alpha-helical PspA-like domain. J. Biol. Chem. 279:35535–35541.
Atteia, A., van Lis, R., Mendoza-Hernández, G., Henze, K., Martin, W., Riveros-Rosas, H., González-Halphen, D. (2003)
Bifunctional aldehyde/alcohol dehydrogenase (ADHE) in chlorophyte algal mitochondria. Plant Mol. Biol. 53:175–188.
Augereau, O., Claverol, S., Boudes, N., Basurko, M. J., Bonneu, M., Rossignol, R., Mazat, J. P., Letellier, T., Dachary-Prigent,
J. (2005) Identification of tyrosine-phosphorylated proteins of the mitochondrial oxidative phosphorylation machinery. Cell Mol. Life
Sci. 62:1478–1488.
Bautista, J., Corpas, R., Ramos, R., Cremades, O., Gutiérrez, J. F., Alegre, S. (2000) Brain mitochondrial complex I inactivation
by oxidative modification. Biochem. Biophys. Res. Commun. 275:890–894.
Bohme, H. J., Kopperschlager, G., Schulz, J., Hofmann, E. (1972) Affinity chromatography of phosphofructokinase using
Cibacron blue F3G-A, J. Chromatogr. 69:209–214.
Bonner, W. M., West, M. H. P., Stedman, J. D. (1980) Two-dimensional gel analysis of histones in acid extracts of nuclei, cells,
and tissues. Eur. J. Biochem. 109:17–23.
Briskin, D. P., Leonard, R. T. (1982) Phosphorylation of the Adenosine Triphosphatase in a Deoxycholate-Treated Plasma
Membrane Fraction from Corn Roots. Plant Physiol. 70:1459-1464.
Brouillard, F., Bensalem, N., Hinzpeter, A., Tondelier, D., Trudel, S., Gruberm A. D., Ollero, M., Edelman, A. (2005) Blue
native/SDS-PAGE analysis reveals reduced expression of the mClCA3 protein in cystic fi brosis knockout mice. Mol. Cell.
Proteomics 4:1762–1775.
Brumme, S., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. P. (1998) New insights into the co-evolution of cytochrome c reductase and
the mitochondrial processing peptidase. J. Biol. Chem. 273:13143–13149.
Bullis, B. L., Lemire, B. D. (1994) Isolation and characterization of the Saccharomyces cerevisiae SDH4 gene encoding a
membrane anchor subunit of succinate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 269:6543–6549.
Burwell, L. S., Nadtochiy, S. M., Tompkins, A. J., Young, S., Brookes, P. S. (2006) Direct evidence for S-nitrosation of
mitochondrial complex I. Biochem. J. 394:627–634.
Burzio, L. A., Burzio, V. A., Pardo, J., Burzio, L. O. (2000) In vitro polymerization of mussel polyphenolic proteins catalyzed
by mushroom tyrosinase. Comp. Biochem. Physiol. B 126:383–389.
Buxbaum, E. (2003) Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins. Anal. Biochem. 314:70–76.
Bykova, N. V., Egsgaard, H., Møller, I. M. (2003) Identification of 14 new phosphoproteins involved in important plant
mitochondrial processes. FEBS Lett. 540:141–146.
Bykova, N. V., Stensballe, A., Egsgaard, H., Jensen, O. N., Møller, I. M. (2003) Phosphorylation of formate dehydrogenase in
potato tuber mitochondria. J. Biol. Chem. 278:26021–26030.
Cardol, P., Matagne, R. F., Remacle, C. (2002) Impact of mutations affecting ND mitochondria-encoded subunits on the activity
and assembly of complex I in Chlamydomonas. Implication for the structural organization of the enzyme. J. Mol. Biol. 319:1211–
1221.
Cardol, P., Vanrobaeys, F., Devreese, B., Van Beeumen, J., Matagne, R. F., Remacle, C. (2004) Higher plant-like subunit
composition of mitochondrial complex I from Chlamydomonas reinhardtii: 31 conserved components among eukaryotes. Biochim.
Biophys. Acta 1658:212–224.
Carninci, P., Gustincich, S., Bottega, S., Patrosso, C., Del Sal, G., Manfioletti, G., Schneider, C. (1990) A simple discontinuous
buffer system for increased resolution and speed in gel electrophoretic analysis of DNAsequence. Nucleic Acids Res.18:204.
Carrozzo, R., Wittig, I., Santorelli, F. M., Bertini, E., Hofmann, S., Brandt, U., Schägger, H. (2006) Subcomplexes of human
ATP synthase mark mitochondrial biosynthesis disorders. Ann. Neurol. 59:265–275.
Choksi, K. B., Boylston, W. H., Rabek, J. P., Widger, W. R., Papaconstantinou, J. (2004) Oxidatively damaged proteins of heart
mitochondrial electron transport complexes. Biochim. Biophys. Acta 1688:95–101.
Claeys, D., Geering, K., Meyer, B. J. (2005) Two dimensional blue native/sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis for
analysis of multimeric proteins in platelets. Electrophoresis 26:1189–1199.
Cole, A. M., Dewan, P., Ganz, T. (1999) Innate antimicrobial activity of nasal secretions. Infect. Immun. 67:3267–3275.
Conrad, M. J., Penniston, J. T. (1976) Resolution of erythrocyte membrane proteins by two-dimensional electrophoresis. J. Biol.
Chem. 251:253-255.
Corthals, G. L., Molloy, M. P., Herbert, B. R., Williams, K. L., Gooley, A. A. (1997) Prefractionation of protein samples prior to
two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 18:17–323.
Darie, C. C., Biniossek, M. L., Winter, V., Mutschler, B., Haehnel, W. (2005) Isolation and structural characterization of the
Ndh complex from mesophyll and bundle sheath chloroplasts of Zea mays. FEBS J. 272:2705–2716.
Darie, C.C., De Pascalis, L., Mutschler, B., Haehnel, W. (2006) Studies of the Ndh complex and photosystem II from mesophyll
and bundle sheath chloroplasts of the C(4)-type plant, Zea mays. J. Plant Physiol. 163:800–808.
Davis, B. J. (1964) Disc electrophoresis II: Method and application to human serum proteins. Ann. NY Acad. Sci. 121:404–427.
de Gennes, P.-G. Scaling Concepts in Polymer Physics. Cornell University Press, Ithaca, NY., 1979.
Devreese, B., Vanrobaeys, F., Smet, J., Van Beeumen, J., Van Coster, R. (2002) Mass spectrometric identification of
mitochondrial oxidative phosphorylation subunits separated by two-dimensional blue-native polyacrylamide gel electrophoresis.
Electrophoresis 23:2525–2533.
Di Pancrazio, F., Bisetto, E., Alverdi, V., Mavelli, I., Esposito, G., Lippe, G. (2006) Differential steady-state tyrosine
phosphorylation of two oligomeric forms of mitochondrial F0F1ATPsynthase: a structural proteomic analysis. Proteomics 6:921–926.
Duby, F., Cardol, P., Matagne, R. F., Remacle, C. (2001) Structure of the telomeric ends of mt DNA, transcriptional analysis and
complex I assembly in the dum24 mitochondrial mutant of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Genet. Genomics 266:109–114.
Dudkina, N. V., Heinemeyer, J., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. (2005) Structure of dimeric ATP synthase from
mitochondria: an angular association of monomers induces the strong curvature of the inner membrane. FEBS Lett. 579:5769–5772.
 Dupont, F. M., Leonard, R. T. (1980) Solubilization and Partial Purification of the Adenosine Triphosphatase from a Corn Root
Plasma Membrane Fraction. Plant Physiol. 65:93 l-938
Eley, M. H., Burns, P. C., Kannapell, C. C., Campbell, P. S. (1979) Cetyltrimethylammonium bromide polyacrylamide gel
electrophoresis: Estimation of protein subunit molecular weights using cationic detergents. Analyt. Biochem. 92:411–419.
Eubel, H., Braun, H.P., Millar, A. H. (2005) Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions. Plant
Methods 1:11.
Eubel, H., Jansch, L., Braun, H. P. (2003) New insights into the respiratory chain of plant mitochondria: supercomplexes and a
unique composition of complex II. Plant Physiol. 133:274–286.
Evenson, D. P., Jost, L. K., Corzett, M., and Balhorn, R. (2000) Characteristics of human sperm chromatin structure following
an episode of influenza and high fever: a case study. J. Androl. 21:739–746.
Everard-Gigot, V., Dunn, C. D., Dolan, B. M., Brunner, S. Jensen RE, Stuart RA. (2005) Functional analysis of subunit e of the
F1F0-ATP synthase of the yeast Saccharomyces cerevisiae: importance of the N-terminal membrane anchor region. Eukaryot. Cell
4:346–355.
Fairbanks, G. Avruch, J. (1972) Four gel systems for electrophoretic fractionation of membrane proteins using ionic detergents.
J. Supramolec. Struc. 1:66-75.
Fang, J., Wang, Y., Beattie, D. S. (2001) Isolation and characterization of complex I, rotenone-sensitive NADH: ubiquinone
oxidoreductase, from the procyclic forms of Trypanosoma brucei. Eur. J. Biochem. 268:3075–3082.
Farhoud, M. H., Wessels, H. J., Steenbakkers, P. J., Mattijssen, S. Wevers, R. A., van Engelen, B. G., Jetten, M. S., Smeitink, J.
A., van den Heuvel, L. P., Keltjens, J. T. (2006) Protein complexes in the archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus
analyzed by blue native/SDS-PAGE and mass spectrometry. J. Proteome Res. 5:625–633.
Ferguson, K. (1964) Starch gel electrophoresis-Application to the classification of pituitary proteins and polypeptides.
Metabolism 13:985–1002.
Fisher, S.E. Whitt, G.S. (1979) Purification of the creatine kinase isozymes of the green sunfish (Lepomis cyanellus) with Blue
Sepharose CL-6B. Anal. Biochem. 94:89–95.
Focke, M., Gieringer, E., Schwan, S., Jänsch, L., Binder, S., Braun, H. P. (2003) Fatty acid biosynthesis in mitochondria of
grasses:malonyl-coenzyme A is generated by a mitochondrial-localized acetyl-coenzyme A carboxylase. Plant Physiol. 133:875–
884.
Franco, M. C., Arciuch, V. G., Peralta, J. G., Galli, S., Levisman, D., López, L. M., Romorini, L., Poderoso, J. J., Carreras, M.
C. (2006) Hypothyroid phenotype is contributed by mitochondrial complex I inactivation due to translocated neuronal nitric-oxide
synthase. J. Biol. Chem. 281:4779–4786.
Freedman, D. O., Nutman, T. B. C., Ottesen, E. A. (1988) Enhanced solubilization of immunoreactive proteins from Brugia
malayi adult parasites using cetyltrimethylammonium bromide. Experim. Parasitol. 65:244-250.
Gallagher, S. R. Leonard, R. T. (1987 a) Phenol-Acetic Acid-Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Membrane Proteins’.
Anal. Biochem. 162:350-357.
Gallagher, S. R., Leonard, R. T. (1987 b) Electrophoretic Characterization of a Detergent-Treated Plasma Membrane Fraction
from Corn Roots. Plant Physiol. 83:265-271.
Gavin, P. D., Devenish, R. J., Prescott, M. (2002) An approach for reducing unwanted oligomerisation of DsRed fusion proteins.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 298:707–713.
Gavin, P. D., Devenish, R. J., Prescott, M. (2003) FRET reveals changes in the F1-stator stalk interaction during activity of F1F0-
ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta 1607:167–179.
Gavin, P. D., Prescott, M., Devenish, R. J. (2005) F1F0-ATP synthase complex interactions in vivo can occur in the absence of
the dimer specific subunit. J. Bioenerg. Biomembr. 37:55–66.
Gavin, P. D., Prescott, M., Luff, S. E., Devenish, R. J. (2004) Cross-linking ATP synthase complexes in vivo eliminates
mitochondrial cristae. J. Cell Sci. 117:2333–2343.
Grandier-Vazeille, X., Bathany, K., Chaignepain, S., Camougrand, N., Manon, S., Schmitter, J. M. (2001) Yeast mitochondrial
dehydrogenases are associated in a supramolecular complex. Biochemistry 40:9758–9769.
Grandier-Vazeille, X., Guerin, M. (1996) Separation by blue native and colorless native polyacrylamide gel electrophoresis of
the oxidative phosphorylation complexes of yeast mitochondria solubilized by different detergents: specific staining of the different
complexes. Anal. Biochem. 242:248–254.
Granvogl, B., Reisinger, V., Eichacker, L. A. (2006) Mapping the proteome of thylakoid membranes by de novo sequencing of
intermembrane peptide domains. Proteomics 6:3681–3695
Guerrieri, F., Vendemiale, G., Grattagliano, I., Cocco, T., Pellecchia, G., Altomare, E. (1999) Mitochondrial oxidative
alterations following partial hepatectomy. Free Radic. Biol. Med. 26:34–41.
Halladay, I.T., Jones, J.G., Lin, F., MacDonald, A. B., DasSarma, S. (1993) The rightward gas vesicle operon in Halobacterium
plasmid pNRC100: identification of the gvpA and gvpC gene products by use of antibody probes and genetic analysis of the region
downstream of gvpC. J. Bacteriol. 175:684-692.
Hansen, S., Thiel, S., Willis, A., Holmskov, U., Jensenius, J. C. (2000) Purification and characterization of two mannan-binding
lectins from mouse serum. J. Immunol. 164:2610–2618.
Hartinger, J., Stenius, K., Hogemann, D., Jahn, R. (1996) 16-BAC/ SDSPAGE: a two-dimensional gel electrophoresis system
suitable for the separation of integral membrane proteins. Anal. Biochem. 240:126-133.
Hearing, V. J., Klingler, W. G., Ekel, T. M., and Montague, P. M. (1976) Molecular weight estimation of Triton X-100
solubilized proteins by polyacrylamide gel electrophoresis. Analyt. Biochem. 126:154–164.
Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Millar, A. H. (2003a) Mitochondrial complex I from Arabidopsis and rice: orthologs of
mammalian and fungal components coupled with plant-specific subunits. Biochim. Biophys. Acta 1604:159–169.
Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. (2003 b) Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome.
Plant Physiol. 132:230–242.
Heazlewood, J. L., Whelan, J., Millar, A. H. (2003 c) The products of the mitochondrial orf25 and orfB genes are FO components
in the plant F1F0 ATP synthase. FEBS Lett. 540:201–205.
 Hedrick, J. L., Smith A. J. (1968) Size and charge isomer separation and estimation of molecular weights of proteins by disc gel
electrophoresis. Arch. Biochem. Biophys. 126:154–164.;
Heermann, R., Altendorf, K., Jung, K. (1998) The turgor sensor KdpD of Escherichia coli is a homodimer. Biochim. Biophys.
Acta 1415:114–124.
Heinemeyer, J., Eubel, H., Wehmhöner, D., Jänsch, L., Braun, H. P. (2004) Proteomic approach to characterize the
supramolecular organization of photosystems in higher plants. Phytochemistry 65:1683–1692.
Heuberger, E. H., Veenhoff, L. M., Duurkens, R. H., Friesen, R. H., Poolman, B. (2002) Oligomeric state of membrane transport
proteins analyzed with blue native electrophoresis and analytical ultracentrifugation. J. Mol. Biol. 317:591–600.
Heukeshoven, J., Demick, R. (1981) Electrophoresis of viral proteins in formic acid 1. General aspects. Electrophoresis 2:91-98.
Horváth, A., Berry, E. A., Huang, L. S., Maslov, D. A. (2000) Leishmania tarentolae: a parallel isolation of cytochrome bc(1)
and cytochrome c oxidase. Exp. Parasitol. 96:160–167.
Horváth, A., Horáková, E., Dunajcíková, P., Verner, Z., Pravdová, E., Slapetová, I., Cuninková, L., Lukes, J. (2005)
Downregulation of the nuclear-encoded subunits of the complexes III and IV disrupts their respective complexes but not complex I
in procyclic Trypanosoma brucei. Mol. Microbiol. 58:116–130.
Horváth, A., Kingan, T. G., Maslov, D. A. (2000) Detection of the mitochondrially encoded cytochrome c oxidase subunit I in
the trypanosomatid protozoan Leishmania tarentolae. Evidence for translation of unedited mRNA in the kinetoplast. J. Biol. Chem.
275:17160–17165.
Horváth, A., Nebohácová, M., Lukes, J., Maslov, D. A. (2002) Unusual polypeptide synthesis in the kinetoplast-mitochondria
from Leishmania tarentolae. Identification of individual de novo translation products. J. Biol. Chem. 277:7222–7230.
Huang, D., Everly, R. M., Cheng, R. H., Heymann, J. B., Schägger, H., Sled, V., Ohnishi, T., Baker, T. S., Cramer, W. A. (1994)
Characterization of the chloroplast cytochrome b6f complex as a structural and functional dimer. Biochemistry 33:4401–4409.
Hunzinger, C., Wozny, W., Schwall, G.P., Poznanovi, S., Stegmann, W., Zengerling, H., Schoepf, R., Groebe, K., Cahill, M. A.,
Osiewacz, H. D., Jägemann, N., Bloch, M., Dencher, N. A., Krause, F., Schrattenholz, A. (2006) Comparative profiling of the
mammalian mitochondrial proteome: Multiple aconitase-2 isoforms including N-formylkynurenine modifications as part of a protein
biomarker signature for reactive oxidative species. J. Proteome Res. 5:625-633.
Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. P. (1995) Cytochrome c reductase from potato does not comprise three core
proteins but contains an additional low-molecular-mass subunit. Eur. J. Biochem. 228:878–885.
Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. P. (1996) New insights into the composition, molecular mass and stoichiometry
of the protein complexes of plant mitochondria. Plant J. 9:357–368.
John, G. B., Shang, Y., Li, L., Renken, C., Mannella, C. A., Selker, J. M., Rangell, L., Bennett, M. J., Zha, J. (2005) The
mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Mol. Biol. Cell 16:1543–1554.
Jovin, TM (1973) Multiphasic zone electrophoresis. IV. design and analysis of discontinous buffer systems with a digital
computer. Ann. NY Acad. Sci 209:477-496.
Jung, C., Higgins, C. M., Xu, Z. (2000) Measuring the quantity and activity of mitochondrial electron transport chain complexes
in tissues of central nervous system using blue native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 286:214–223.
Klement, P., Nijtmans, L. G., Van den Bogert, C., Houstek, J. (1995) Analysis of oxidative phosphorylation complexes in
cultured human fibroblasts and amniocytes by blue-native-electrophoresis using mitoplasts isolated with the help of digitonin. Anal.
Biochem. 231:218–224.
Kouril, R., van Oosterwijk, N., Yakushevska, A. E., Boekema, E. J. (2005) Photosystem I: a search for green plant trimers.
Photochem. Photobiol. Sci. 4: 1091–1094.
Krause, F. (2006) Detection and analysis of protein–protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel
electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis 27:2759–2781.
Krause, F., Reifschneider, N. H., Goto, S., Dencher, N. A. (2005) Active oligomeric ATP synthases in mammalian
mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 329:583–590.
Krause, F., Reifschneider, N. H., Vocke, D., Seelert, H. Rexroth, S., Dencher, N. A. (2004a) "Respirasome"-like supercomplexes
in green leaf mitochondria of spinach. J. Biol. Chem. 279:48369–48375.
Krause, F., Scheckhuber, C. Q., Werner, A., Rexroth, S., Reifschneider, N. H., Dencher, N. A., Osiewacz, H. D. (2004 b)
Supramolecular organization of cytochrome c oxidase- and alternative oxidase-dependent respiratory chains in the filamentous
fungus Podospora anserina. J. Biol. Chem. 279:26453–26461.
Krause-Buchholz, U., Becker, J. S., Zoriy, M., Pickhardt, C., Przybylski, M., Rödel, G., Becker, J. S. (2006) Detection of
phosphorylated subunits by LA-ICP-MS and MALDI-FTICR-MS in yeast mitochondrial membrane complexes separated by blue
native SDS-PAGE. Int. J. Mass Spectrom. 248:56–60.
Krijgsveld, J., Zaat, S. A., Meeldijk, J., van Veelen, P. A., Fang, G., Poolman, B., Brandt, E., Ehlert, J. E., Kuijpers, A. J.,
Engbers, G. H., Feijen, J., Dankert, J. (2000) Thrombocidins, microbial proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion
products of CXC chemokines. J. Biol. Chem. 275:20:374–20,381.
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680–
685.
Lerman, L. S., Frisch, H. L. (1982) Why does the electrophoretic mobility of DNA in gels vary with the length of the molecule?
Biopolymers 21:995-997.
Lumpkin, O. J., Zimm, B. H. (1982) Mobility of DNA in gel electrophoresis. Biopolymers 21:2315-2316.
MacFarlane, D. E. (1983) Use of benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride (“16-BAC”), a cationic detergent, in an acidic
polyacrylamide gel electrophoresis system to detect base labile protein methylation in intact cells. Anal. Biochem. 132:231-235.
MacLennan, D. H. (1970) Purification and properties of an adenosine triphosphatase from sarcoplasmic reticulum. J. Biol.
Chem. 245:4508-4518.
Majeran, W., Friso, G., van Wijk, K. J., Vallon, O. (2005) The chloroplast ClpP complex in Chlamydomonas reinhardtii
contains an unusual high molecular mass subunit with a large apical domain. FEBS J. 272:5558–5571.
Maki, K., Sagara, J., Kawai, A. (1991) A cationic detergent, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), selectively dissociates
the intermediate filament of the fibroblast. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175:768-774.
Malamud, D., Drysdale, J. W. (1978) Isoelectric points of proteins: a table. Anal. Biochem. 86:620-647.
 Malave, C., Villegas, G. M., Hernandez, M., Martinez, J. C., Castillo, C., Suárez de Mata, Z., Villegas, R. (2003) Role of
glypican-1 in the trophic activity on PC12 cells induced by cultured sciatic nerve conditioned medium: identification of a glypican-1-
neuregulin complex. Brain Res. 983:74–83.
Mandecki, W., Hayden, M. (1988) High-Resolution Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Oligonucleotides Using L-Histidine
Buffer. DNA 7:57-62.
Manrow, R. E. Dottin, R. P. (1980) Renaturation and localization of enzymes in polyacrylamide gels: Studies with UDP-glucose
pyrophosphorylase of Dictyostelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:730-734.
Marbois, B., Gin, P., Faull, K. F., Poon, W. W., Lee, P. T., Strahan, J., Shepherd, J. N., Clarke, C. F. (2005) Coq3 and Coq4
define a polypeptide complex in yeast mitochondria for the biosynthesis of coenzyme Q. J. Biol. Chem. 280:20231–20238.
Marjanen, L. A. Ryrie, I. J. (1974) Molecular weight determinations of hydrophilic proteins by cationic detergent
electrophoresis: Application to membrane proteins. Biochem. Biophys. Acta 37:442–450.
Marx, S., Baumgärtner, M., Kannan, S., Braun, H. P., Lang, B. F., Burger, G. (2003) Structure of the bc1 complex from
Seculamonas ecuadoriensis, a jakobid flagellate with an ancestral mitochondrial genome. Mol. Biol. Evol. 20:145–153.
Maslov, D. A., Nawathean, P., Scheel, J. (1999) Partial kinetoplast-mitochondrial gene organization and expression in the
respiratory deficient plant trypanosomatid Phytomonas serpens. Mol. Biochem. Parasitol. 99:207–221.
Meissner, G., Fleischer, S. (1971) The role of phospholipid in Ca2+-stimulated ATPase activity of sarcoplasmic reticulum.
Biochim. Biophys. Acta 241:356-378.
Millar, A. H., Mittova, V., Kiddle, G., Heazlewood, J. L., Bartoli, C. G., Theodoulou, F. L., Foyer, C. H. (2003) Control of
ascorbate synthesis by respiration and its implications for stress responses. Plant Physiol. 133:443–447.
Mocz, G., Balint, M. (1984) Use of cationic detergents for polyacrylamide gel electrophoresis in multiphasic buffer systems.
Anal. Biochem. 143:283–292.
Muratsubaki, H., Satake, K., Yamamoto, Y., Enomoto, K. (2002) Detection of serum proteins by native polyacrylamide gel
electrophoresis using Blue Sepharose CL-6B-containing stacking gels. Anal Biochem. 307:337-340.
Navet, R., Jarmuszkiewicz,W., Douette, P., Sluse-Goffart, C. M., Sluse, F. E. (2004) Mitochondrial respiratory chain complex
patterns from Acanthamoeba castellanii and Lycopersicon esculentum: comparative analysis by BN-PAGE and evidence of protein-
protein interaction between alternative oxidase and complex III. J. Bioenerg. Biomembr. 36:471–479.
Nebohácová, M., Maslov, D. A., Falick, A. M., Simpson, L. (2004) The effect of RNA interference Down-regulation of RNA
editing 3'-terminal uridylyl transferase (TUTase) 1 on mitochondrial de novo protein synthesis and stability of respiratory complexes
in Trypanosoma brucei. J. Biol. Chem. 279:7819–7825.
Neff, D., Dencher, N. A. (1999) Purification of multisubunit membrane protein complexes: isolation of chloroplast F0F1-ATP
synthase, CF0 and CF1 by blue native electrophoresis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 259:569–575.
Nijtmans, L. G., Henderson, N. S., Holt, I. J. (2002) Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein
complexes. Methods 26:327–334.
Nijtmans, L. G., Spelbrink, J. N., Van Galen, M. J., Zwaan, M., Klement, P., Van den Bogert, C. (1995) Expression and fate of
the nuclearly encoded subunits of cytochrome-c oxidase in cultured human cells depleted of mitochondrial gene products. Biochim.
Biophys. Acta 1265:117–126.
Nováková, Z., Man, P., Novák, P., Hozák, P., Hodny, Z. (2006) Separation of nuclear protein complexes by blue native
polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis 27:1277–1287.
O'Connor, C. D., Farris, M., Hunt, L. G., Wright, J.N. 6.2 The Proteome Approach Williams, P., Salmond, G., Ketley, J. M. eds.
Methods in Microbiology: Bacterial Pathogenesis. Academic Press, Meth. Microbiol. 27:191-204, 1998
http://books.google.ro/books?id=v5bpO0TT4o8C&pg=PA194&dq=urea+9M+Triton+X-100+electrophoresis&hl=ro&sa=X&e
i=jAClUMm4MI_FtAaw9oDoAg&ved=0CDUQ6AEwAA#v=onepage&q=urea%209M%20Triton%20X-100%20electrophoresis&
f=false
Ornstein, L. (1964) Disc electrophoresis-1: background and theory. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121:321–351.
Panyim, S. Chalkley, R. (1969) High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones. Arch. Biochem. Biophys. 130:337–
346.
Panyim, S., Thitipongpanich, R., Supatimusro, D. (1977) A simplified gel electrophoretic system and its validity for molecular
weight determinations of protein-cetyltrimethylammonium complexes. Anal. Biochem. 81:320-327.
Paulson, J. R., Higley, L. L. (1999) Acid-urea polyacrylamide slab gel electrophoresis of proteins: preventing distortion of gel
wells during preelectrophoresis. Anal. Biochem. 268:157–159.
Peacock, A. C., Dlngman, C. W. (1968) Molecular weight estimation and separation of ribonucleic acid by electrophoresis in
agarose-acrylamide composite gels. Biochemistry USA 7:668-674.
Peltier, J. B., Cai, Y., Sun, Q., Zabrouskov, V. Giacomelli, L., Rudella, A., Ytterberg, A. J., Rutschow, H., van Wijk, K. J.
(2006) The oligomeric stromal proteome of Arabidopsis thaliana chloroplasts. Mol. Cell. Proteomics 5:114–133.
Peltier, J. B., Ripoll, D. R., Friso, G., Rudella, A., Giacomelli, L., Rudella, A., Ytterberg, A. J., Rutschow, H., van Wijk, K. J.
(2004) Clp protease complexes from photosynthetic and non-photosynthetic plastids and mitochondria of plants, their predicted
three-dimensional structures, and functional implications. J. Biol. Chem. 279:4768–4781.
Pfeiffer, K., Gohil, V., Stuart, R. A., Hunte, C., Brandt, U., Greenberg, M. L., Schägger, H. (2003) Cardiolipin stabilizes
respiratory chain supercomplexes. J. Biol. Chem. 278:52873–52880.
Poetsch, A., Neff, D., Seelert, H., Schagger, H., Dencher, N. A. (2000) Dye removal, catalytic activity and 2-D crystallization of
chloroplast H(+)-ATP synthase purified by blue native electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta 1466:339–349.
Prescott, M., Nowakowski, S., Gavin, P., Nagley, P., Whisstock, J. C., Devenish, R. J. (2003) Subunit gamma-green fluorescent
protein fusions are functionally incorporated into mitochondrial F1F0-ATP synthase, arguing against a rigid cap structure at the top of
F1. J. Biol. Chem. 278:251–256.
Pritchard, D. I., Crawford, C. R., Duce, I. R., Behnke, J. M. (1985) Antigen stripping from the nematode epicuticle using the
cationic detergent cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). Parasite Immunol. 7:575-585.
Pusztai, A., Watt, W. B. (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis of proteins in phenol-ethanediol-water (3:2:3, w-v-v) buffers
at various pH values. Anal. Biochem. 54:58-65.
 Rabilloud, T., Girardot, V., Lawrence, J.-J. (1996) One-and twodimensional histone separations in acidic gels: usefulness of
methylene blue-driven photopolymerisation. Electrophoresis 17:67–73.
Raymond, S., Weintraub, L. (1959) Acrylamide Gel as a Supporting Medium for Zone Electrophoresis Science 130:711–711.
Reisinger, V., Eichacker, L. A. (2006) Analysis of Membrane Protein Complexes by Blue Native PAGE. Practical Proteomics
1-2:6-15.
Rexroth, S., Meyer zu Tittingdorf, J. M. W., Schwaßmann, H. J., Krause, F., Seelert, H., Dencher, N. A. (2004) Dimeric H+-ATP
synthase in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta 1658:202–211.
Reynolds, J. A., Tanford, C. (1970) The gross conformation of protein-sodium dodedcyl sulfate complexes. J. Biol. Chem.
245:5161-5165.
Reynolds, J. A., Tanford, C. (1970) The gross conformation of protein-sodium dodecyl sulfate complexes. J. Biol. Chem. 245:
5161–5165.
Righetti, P.G. (2005) Electrophoresis: the march of pennies, the march of dimes. J. Chromatogr. A. 1079:24–40.
Rodbard, D., Chrambach, A. (1971) Estimation of Molecular Radius, Free Mobility, and Valence Using Polyacrylamide Gel
Electrophoresis. Anal. Biochem. 40:95-134.
Ruiz-Carrillo, A., Wangh, L. J., Allfrey, V. G. (1975) Processing of newly synthesized histone molecules. Nascent histone H4
chains are reversibly phosphorylated and acetylated. Science 190:117–128.
Sabar, M., Gagliardi, D., Balk, J., Leaver, C. J. (2003) ORFB is a subunit of F1F(0)-ATP synthase: insight into the basis of
cytoplasmic male sterility in sunflower. EMBO Rep. 4:381–386.
Saddar, S., Stuart, R. A. (2005) The yeast F(1)F(0)-ATP synthase: analysis of the molecular organization of subunit g and the
importance of a conserved GXXXG motif. J. Biol. Chem. 280:24435–24442.
Schägger, H. (1995a) Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.
Methods Enzymol. 260:190–202.
Schägger, H. (1995b) Quantification of oxidative phosphorylation enzymes after blue native electrophoresis and two-dimensional
resolution: normal complex I protein amounts in Parkinson's disease conflict with reduced catalytic activities. Electrophoresis
16:763–770.
Schägger, H. (2001) Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65:231–244.
Schägger, H., Bentlage, H., Ruitenbeek, W., Pfeiffer, K., Rotter, S., Rother, C., Böttcher-Purkl, A., Lodemann, E. (1996)
Electrophoretic separation of multiprotein complexes from blood platelets and cell lines: technique for the analysis of diseases with
defects in oxidative phosphorylation. Electrophoresis 17:709–714.
Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. (1994) Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by
blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem.
217:220–230.
Schägger, H., in: Hunte, C., von Jagow, G., Schägger, H. (Eds.), Membrane Protein Purification and Crystallization: A Practical
Guide, Academic Press, San Diego, CA, 2003.
Schägger, H., Ohm, T. G. (1995) Human diseases with defects in oxidative phosphorylation. 2. F1F0 ATP-synthase defects in
Alzheimer disease revealed by blue native polyacrylamide gel electrophoresis. Eur. J. Biochem. 227:916–921.
Schägger, H., Pfeiffer, K. (2000) Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J.
19:1777–1783.
Schägger, H., von Jagow, G. (1991) Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically
active form. Anal. Biochem. 199:223–231.
Scheele, G. A. (1982) Two-dimensional electrophoresis in basic and clinical research, as exemplified by studies on the exocrine
pancreas. Clin. Chem. 28:1056–1061.
Schick, M. (1975) Influence of cationic detergent on electrophoresis in polyacrylamide gel. Analyt. Biochem. 63:345–349.
Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. (2001) The chloroplastic GrpE homolog of
Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing. Plant Cell 13:2823–2839.
Senior, A. E., Brooks, J. C. (1970) Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitivt ATPase. I. An improved method of
purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Arch. Biochem. Biophys. 140:257-266.
Senior, A. E., MacLennan, D. H. (1970) Mitochondrial "structural protein". A reassessment. J. Biol. Chem. 245:5086-5095.
Shapiro, A. L., Vinuela, E., and Maizel, J. V. (1967) Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in
SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28:815–820.
Shirahama, K. Tsujii, K. Takagi, T. (1974) Free-boundary electrophoresis of sodium dodecyl sulfate–protein polypeptide
complexes with special reference to SDS–polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biochem. 75:309–319.
Simon, R. D. (1980) Acrilamyde gel electrophoresis of hydrophobic proteins: Gas vaculoe protein. Electrophoresis 1:172-176.
Simon, R. D. Electrophoresis of Halobacterium Gas Vesicle Protein in Phenol-Acetic Acid-Urea (PAU) Gels. În Archaea: a
laboratory manual, Vol. 2. (F.T. Robb Ed), 1993.
Singh, R., Chenier, D., Beriault, R., Mailloux, R., Hamel, R. D., Appanna, V. D. (2005) Blue native polyacrylamide gel
electrophoresis and the monitoring of malate- and oxaloacetate-producing enzymes. J. Biochem. Biophys. Methods 64:189–199.
Siva R., Mathew, G. J., Venkat, A., Dhawan, C. (2008) An alternative tracking dye for gel electrophoresis. Curr. Sci. 94:765-
767.
Speijer, D., Breek, C. K., Muijsers, A. O., Hartog, A. F., Berden, J. A., Albracht, S. P., Samyn, B., Van Beeumen, J., Benne, R.
(1997) Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Mol. Biochem. Parasitol. 85:171–186.
Spencer, M., Poole, F. (1965) On the origin of crystallizable RNA from yeast. J. Mol.Biol. 11:314–326.
Stephens, A. N., Khan, M. A., Roucou, X., Nagley, P., Devenish, R. J. (2003) The molecular neighborhood of subunit 8 of yeast
mitochondrial F1F0-ATP synthase probed by cysteine scanning mutagenesis and chemical modification. J. Biol. Chem. 278:17867–
17875.
Stephens, A. N., Nagley, P., Devenish, R. J. (2003) Each yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase complex contains a single copy
of subunit 8. Biochim. Biophys. Acta 1607:181–189.
Suh, M. H., Ye, P., Datta, A. B., Zhang, M., Fu, J. (2005) An agarose-acrylamide composite native gel system suitable for
separating ultra-large protein complexes. Anal. Biochem. 343:166–175.
 Sunderhaus, S., Dudkina, N.V., Jansch, L., Klodmann, J., Heinemeyer, J., Perales, M., Zabaleta, E., Boekema, E. J., Braun, H. P.
(2006) Carbonic anhydrase subunits form a matrix-exposed domain attached to the membrane arm of mitochondrial complex I in
plants. J. Biol. Chem. 281:6482–6488.
Takayama, K., MacLennan, D. H., Tzagoloff, A., Stoner, C. D. (1966) Studies on the electron transfer system. LXVII.
Polyacrylamide gel electrophoresis of the mitochondrial electron transfer complexes. Arch. Biochem. Biophys. 114:223-230.
Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. K., Hirst, J., Murphy, M. P. (2003) Reversible glutathionylation of complex I
increases mitochondrial superoxide formation. J. Biol. Chem. 278:19603–19610.
Taylor, N. L., Heazlewood, J. L., Day, D. A., Millar, A. H. (2005) Differential impact of environmental stresses on the pea
mitochondrial proteome. Mol. Cell. Proteomics 4:1122–1133.
Tichy, M., Lupínková, L., Sicora, C., Vass, I. Kuviková, S., Prásil, O., Komenda, J.(2003) Synechocystis 6803 mutants
expressing distinct forms of the Photosystem II D1 protein from Synechococcus 7942: relationship between the psbA coding region
and sensitivity to visible and UV-B radiation. Biochim. Biophys. Acta 1605:55–66.
Tracy, R. P., Currie, R. M., Young, D. S. (1982) Reproducibility and quality assurance of two-dimensional gel electrophoresis of
serum specimens. Clin. Chem. 28:908–914.
Travis, J. Bowen, J. Tewksbury, D. Johnson, D. Pannell, R. (1976) Isolation of albumin from whole human plasma and
fractionation of albumin-depleted plasma. Biochem. J. 157:301–306.
Travis, J., Pannell, R. (1973) Selective removal of albumin from plasma by affinity chromatography. Clin. Chim. Acta 49:49–52.
Tsirogianni, E., Aivaliotis, M., Papasotiriou, D.G., Karas, M., Tsiotis, G. (2006) Identification of inducible protein complexes in
the phenol degrader Pseudomonas sp. strain phDV1 by blue native gel electrophoresis and mass spectrometry. Amino Acids 30:63–
72.
Tuan, R. S., Knowles, K. (1984) Calcium activated ATPase in the chick embryonic chorioaliantoic membrane: Identification and
topographic relationship with the calciumbiding protein. J. Biol. Chem. 259:2754-2763.
Tyagi, R. K., Babu, B. R., Datta, K. (1993) Simultaneous determination of native and subunit molecular weights of proteins by
pore limit electrophoresis and restricted use of sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis. 14:826-828.
Vahsen, N., Cande, C., Briere, J. J., Benit, P., Joza, N., Larochette, N., Mastroberardino, P. G., Pequignot, M. O., Casares, N.,
Lazar, V., Feraud, O., Debili, N., Wissing, S., Engelhardt, S., Madeo, F., Piacentini, M., Penninger, J. M., Schägger, H., Rustin, P.,
Kroemer, G. (2004) AIF deficiency compromises oxidative phosphorylation. EMBO J. 23:4679–4689.
van Lis, R., Atteia, A., Mendoza-Hernández, G., González-Halphen, D. (2003) Identification of novel mitochondrial protein
components of Chlamydomonas reinhardtii. A proteomic approach. Plant Physiol. 132:318–330.
van Lis, R., González-Halphen, D., Atteia, A. (2005) Divergence of the mitochondrial electron transport chains from the green
alga Chlamydomonas reinhardtii and its colorless close relative Polytomella sp. Biochim. Biophys. Acta 1708:23–34.
Wang, M. S., Pang, J. S., Selsted, M. E. (1997) Semidry electroblotting of peptides and proteins from acid-urea polyacrylamide
gels. Anal. Biochem. 253:225–230.
Waterborg, J. H. (2000) Steady-state levels of histone acetylation in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 275:13,007–
13,011.
Waterborg, J.H., “Acetic Acid-Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Basic Proteins,” in The Protein Protocols Handbook
2nd Edition, Ed. J.M. Walker, Humana Press, NJ, pp103-111, 2002.
Weber, K. and Osborn, M. (1969) The reliability of molecular weight determination by dodecyl sulfate-polyacrylamide
electrophoresis. J. Biol. Chem. 244:4406–4412
Wen, J. J., Garg, N. (2004) Oxidative modification of mitochondrial respiratory complexes in response to the stress of
Trypanosoma cruzi infection. Free Radic. Biol. Med. 37:2072–2081.
Werhahn, W., Braun, H. P. (2002) Biochemical dissection of the mitochondrial proteome from Arabidopsis thaliana by three-
dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 23:640–646.
Wille, L.E. (1976) A simple and rapid method for isolation of serum lipoproteins from the other serum protein constituents. Clin.
Chim. Acta. 71:355–357.
Wilson, J.E. (1976) Applications of blue dextran and Cibacron Blue F3GA in purification and structural studies of nucleotide-
requiring enzymes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 72:816-823.
Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. (2006) Supercomplexes and subcomplexes of mitochondrial oxidative
phosphorylation. Biochim. Biophys. Acta 1757:1066-1072.
Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schägger, H. (2007 a) Functional assays in high resolution clear native gels to quantify
mitochondrial complexes in human biopsies and cell-lines. Electrophoresis 28:3811–3820.
Wittig, I., Karas, M., Schägger, H. (2007 b) High resolution clearnative electrophoresis for in-gel functional assays and
fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol. Cell. Proteomics 6:1215–1225.
Wittig, I., Schägger, H. (2005) Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics 5:4338–4346.
Wittig, I., Schägger, H. (2007c) Electrophoretic Methods to Isolate Protein Complexes from Mitochondria. Methods Cell Biol.
80:723-741.
Work, T. S. (1964) Electrophoretic separation of the proteins of ribosome subunits and of encephalomyocarditis virus. J. Mol.
Biol. 10:544-554.
Zahedi, R. P., Sickmann, A., Boehm, A. M., Winkler, C., Zufall, N., Schönfisch, B., Guiard, B., Pfanner, N., Meisinger, C.
(2006) Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Mol. Biol.
Cell 17:1436–1450.
Zahler, P., Niglli, V. The use of organic solvents in membrane research. In Methods in Membrane Biology (Kom, E. D., Ed.),
Vol. 8, pp. l-50, Plenum Press, New York, 1977.
Zahler, W. L. (1974) Analytical polyacrylamide gel electrophoresis and molecular weight determination. Methods Enzymol.
32:70-81.
Zapata, D. A., Schamel, W. W., Torres, P. S., Alarcon, B., Rossi, N. E., Navarro, M. N., Toribio, M. L., Regueiro, J. R. (2004)
Biochemical differences in the αβ T cell receptor: CD3 surface complex between CD8+ and CD4+ human mature T lymphocytes. J.
Biol. Chem. 279:24485–24492.
 Zhang, M., Mileykovskaya, E., Dowhan, W. (2005) Cardiolipin is essential for organization of complexes III and IV into a
supercomplex in intact yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 280:29403–29408.
 3.7 SEPARAREA PROTEINELOR PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ PRIN
FOCALIZARE IZOELECTRICĂ
Deceniul al șaselea a condus la evidențierea a trei evenimente majore în metodologia electrocinetică,
care au reprezentat o impresionantă dezvoltare în modelarea tehnologiilor electroforetice moderne:
(a) descrierea disc electroforezei de către Ornstein (1964) şi Davis (1964), o metodă electroforetică
care creşte în mod exponențial rezoluţia electroforetică prin introducerea în matricea de gel şi în
tampoanele de lucru o serie de discontinuităţi care îngustează benzile şi formează zone de start incredibil
de subţiri;
(b) descoperirea electroforezei în prezență de dodecil sulfat de sodiu (Shapiro și colab., 1967), care
separă proteine saturate în detergent într-un gel poliacrilamidă, în funcţie de masa lor, și nu în acord cu
efectul combinat al masei moleculare și sarcinii electrice, după cum se întâmplă în cazul electroforezei
convenţionale;
(c) inventarea focalizării (concentrării, focusării) izoelectrice (Svensson, 1961; Svensson, 1962;
Svensson, 1962), care separă proteinele, esenţial în funcţie de sarcina lor electrică netă (la o anumită
valoare dată, egală cu punctul izoelectric a lor). Figura 3.61 prezintă principiul focalizării izoelectrice.

Figura 3.61. Principiul separării proteinelor prin

focalizare izoelectrică. Înainte de încărcarea probei,
se stabilește un gradient de pH. (A) Se încarcă proba
și se aplică pe gel. În acest moment, proteinele vor
migra în funcție de pH-ul lor izoelectric, localizare la
care sarcina lor netă este nulă; (B) Proteinele
formează benzi electroforetice care pot fi excizate sau
utilizate în experimente ulterioare.

Într-adevăr, un progres major, a fost reprezentat de descoperirea focalizării izoelectrice (IEF)

convenţionale în prezența unor amfoliți transportori (carrier ampholytes, CA), solubili, a unor tampoane
amfoterice, raportate de Svensson-Rilbe într-o serie de articole acum clasice (Svensson, 1961; Svensson,
1962; Svensson, 1962).
În cam aceeași perioadă, Meselson și colab. (1957) au descris centrifugarea isopicnică (IPC), o tehnică
de înaltă rezoluție și înrudită, care a fost apoi denumită focalizare izopericorică (Kolin, 1977).
Spre deosebire de tehnicile cromatografice şi electroforetice convenţionale disponibile până la acea
dată, care nu aveau capacitatea de a preveni împrăștierea peak-ului în timpul procesului de separare, IEF şi
IPC au avut în vedere mecanisme care se opun forţelor entropice și care tind să disperseze zona
electroforetică/centrifugală. Astfel, după cum analitul ajunge într-un mediu (perichoron, în greacă), în care
parametrii săi fizico-chimici sunt egali (iso) cu cei din mediul exterior, el este focusat (concentrat,
focalizat) într-o zonă ultra subţire și este menținut stabil şi compactat de două câmpuri de forțe
antagoniste: difuzia (tendinţa de a disipa zona) şi câmpurile externe (gradienţi de tensiune, în cazul IEF,
ori câmpurile centrifugale, în cazul IPC) care forţează analitul să "nu evadeze", din zona lui de
"concentrare" (Giddings, 1991).
3.7.1. FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ CU AMFOLIȚI TRANSPORTORI.
IEF este o tehnică electroforetică pentru fracționarea compuşilor amfoterici în funcţie de pI de-a lungul
unui gradient continuu de pH (Rilbe, 1973; Rilbe, 1996) și care, contrar electroforezei zonale, unde mediul
de separare posedă un pH constant (tamponat) care stabilește o sarcină electrică constantă pe suprafața
moleculei și astfel conduce, în absența procesului de stivuire (cernere moleculară) la o mobilitate
constantă, sarcina electrică de suprafaţă a unui compus amfoter, în IEF este într-o continuă schimbare
(scădere) în funcţie de curba sa de titrare, în timp ce se deplasează de-a lungul unui gradient de pH, până
când ajunge la o poziţie de echilibru, adică în regiunea în care pH-ul se potriveşte cu pI-ul său. Acolo,
mobilitatea acestei molecule este egală cu zero iar molecula se oprește. În tot acest proces, gradientul este
creat şi menţinut, prin trecerea unui curent electric printr-o soluţie de compuşi amfoterici, care posedă
valori ale pI-urilor apropiate, pe o distanță care cuprinde un domeniu dat de pH. Transportul electroforetic
cauzează acestor CA stivuirea în funcţie de pI-lor, astfel încât se realizează un gradient de pH care crește
de la anod la catod și care este stabilizat.
 La începutul unei migrării, mediul de separare are un pH uniform și este egal cu pI-ul mediului
amfoliților transportori după cum cei mai mulți amfoliți au o sarcină netă şi o mobilitate netă. În câmp
electric, amfolitul cel mai acid migrează în apropierea anodului și se concentrează într-o zonă la care
valoarea pH-ului său este egală cu pI, în timp ce cel mai bazic amfolit se deplasează adiacent și în
apropierea catodului. Un amfolit mai puţin acid migrează adiacent şi ușor catodal într-o zonă stablită de
pH-ul său și astfel toți componenții sistemului ating o stare de echilibru. După finalizarea acestui proces de
aranjare (stivuire), unii amfoliți transportori tind să se deplaseze în zone cu pH mai mare sau mai mic prin
procese de difuziune în cazul în care sistemul nu se află într-un echilibru izoelectric. Dar, aşa cum imediat
ce aceștia intră în aceste zone, amfoliții transportori devin încărcați electric iar tensiunea electrică aplicată
îi forțează să se întoarcă în poziţia lor de echilibru. Această mişcare de pendul, difuzie versus
electroforeză, este cauza principală a curentului rezidual observat în condiţiile stării de echilibru
izoelectric. La un interval de timp după adăugare, moleculele probei de proteine, ajung de asemenea, la
punctul lor izoelectric.
Din punct de vedere chimic, CA sunt acizi oligo-amino, acizi oligo-carboxilici, disponibili comercial
sub denumiri diferite, existând trei abordări de bază în sinteza lor:
I. abordarea Vesterberg (1973), care implică o reacţie dintre oligo-amine diferite (tetra-, penta-şi
hexa-amine) cu acid acrilic;
II. procesul de sinteză chimică propus de Soderberg și colab. (1980), care implică co-polimerizarea
de amine, aminoacizii şi dipeptide cu epiclorhidrină;
III. abordarea Pogacar-Grubhofer, care a utilizează etilenimina şi propilendiamina pentru reacţii
ulterioare cu propansulfona, vinil sulfonatul de sodiu şi clormetil fosfonatul de sodiu (Pogacar și Jarecki,
1977; Grubhofer și Borja, 1974).
În consecinţă, există 3 tipuri de produse comerciale: Ampholines şi Biolytes, care fac parte din clasa I;
Pharmalytes, care sunt produși prin cea de a doua metodă; şi Novex-Ampholytes Servalyt ori Genomic
Solutions (pH=3-10), amfoliți, din clasa a III-a de sinteză.
Există de asemenea o gamă largă de amestecuri sintetice (în domeniul de pH=3-10) care conţin sute,
poate mii, din diferite substanţe chimice amfoterice având pI-uri distribuite uniform de-a lungul scalei de
pH. Din moment ce aceștia sunt obţinuți prin diferite abordări în sinteză, CA proveniți de la diverși
producători posedă caracteristici din punct de vedere al pI oarecum diferite. Astfel, în cazul în care este
necesară o rezoluţie mai mare, în special în cazul cartării bidimensionale a unor probe complexe, se
sugerează utilizarea unor amestecuri de CA proveniți de la firme diferite, disponibili comercial. Un
amestec util este reprezentat de 50% Pharmalyte, 30% Ampholine şi 20% Biolyte (în volum). CA din
orice sursă trebuie să aibă o masă moleculară medie de aproximativ 750 (un interval al mărimii de 600-
900, masa moleculară mai mare referindu-se la speciile mai acide de amfoliți) (Bianchi-Bosisio și colab.,
1981). Astfel, CA trebuie să fie uşor separabili (cu excepţia cazului în care sunt complexați hidrofobic de
proteine) de macromolecule prin cromatografie de excludere moleculară. Însemnul de pe ambalajul de CA
este valoarea absolută a pI-pKaprox (sau ½ΔpKa): cu cât valoarea este mai mică, cu atât conductivitatea şi
capacitatea de tamponare a lui este mai mare (la un pH=pI). Un ΔpKa=log 4 (adică, de exemplu pl-
pK=0,3) oferă o putere molară de tamponare (β) incredibil de mare la pI=2,0 (din păcate, astfel de
compuşi nu există în natură), în timp ce un ΔpK=log 16 (adică pI-pK=0,6) oferă o valoare β de 1,35 la un
pH=pI (Rilbe, 1996). În figura 3.62. este prezentată o schemă a formării unui gradient de pH prin
intermediul CA.
Figura 3.62. O reprezentare grafică formării unui gradient de pH, într-un
câmp electric, cu ajutorul amfoliților transportori. În momentul aplicării
unui câmp electric, amfoliții încărcați negativ migrează spre anod, în
timp ce aceia încărcați pozitiv migrează spre catod iar viteza lor de
migrare depinde de mărimea sarcinii lor nete. Moleculele de amfoliți
transportori cu cele mai mici valori ale pI migrează spre anod în timp ce
moleculele de amfoliți cu valoarea pI cea mai mare va migra spre catod.
Ceilalți amfoliți se vor alinia în funcţie de pI şi vor determina pH-ul
mediului, creându-se astfel un gradient stabil, unde pH-ul creşte treptat
de la 3 la 10, de exemplu. Cum amfoliții purtători au o greutate
moleculară mică, ei posedă o viteză mare de difuziune în gel. Acest fapt
presupune că în momentul în care difuzează mai departe de valoarea lor
de pI, ei sunt obligați din considerente electroforetice de pH să migreze
înapoi, în mod constant şi rapid. Procesul este deosebit de important
atunci când se realizează gradienți de pH foarte plați (cuprins între 4,0 şi
5,0, de exemplu) folosiți pentru obținerea unor rezoluţii crescute (După
Westermeier, 2005).
 3.7.2. FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ CU GRADIENȚI DE PH IMOBILIZAȚI
O serie de probleme majore asociate cu CA au fost deja recunoscute încă din anii ‘70, dar nu s-a putut
găsi remediile adecvate. Unele probleme sunt destul de severe. De exemplu, puterea ionică scăzută a
mediului IEF induce adesea iminența unor precipitări izoelectrice şi dispersia benzilor de proteine, chiar şi
în condițiile în care focalizarea este analitică iar proba are o încărcare redusă de proteine. Problema este
datorată unei conductivități neegale (şi de asemenea, a unei capacităţi de tamponare reduse) este
amplificată de condițiile unui amestec sărac în amfoliți. Fenomenul este descris în cazul sistemului de
focalizare izoelectrică Poly Sep 47, reprezentat de un amestec de 47 de tampoane amfotere și neamfotere,
considerat de unii cercetători a fi superior sistemului cu amfoliți transportori (Cuono și Chapo, 1982).
Datorită compoziţiei sale sărace, marea conductivitate crează de-a lungul căii de migrare lacune de pH, în
raport cu care proteinele cu pI-uri diferite sunt stivuite și care are ca efect rezultate slabe în procesul de
separare (Righetti și colab., 1988).
Abaterea catodică este de asemenea, o problemă majoră nerezolvată în focalizarea izoelectrică cu CA,
ea conducând la pierderea masivă de proteine în extremitatea catodică a gelului, dacă separarea este
prelungită. Pentru toate aceste motive, Bjellqvist și colab. (1982), au realizat tehnica de focalizare
izoelectrică cu gradienţi imobilizați de pH (IPG).
IPG reprezintă, probabil, dezvoltarea finală, între toate tehnicile de focalizare, o revoluţie în domeniu,
de fapt. Datorită posibilităţii de inginerie a gradientului de pH, în domenii dintre cele mai înguste (care, în
scopuri practice, a fost stabilit la 0,1 unităţi de pH pe o distanţă de 10 cm), la cel mai mare gradient posibil
(pH cuprins între 2,5 și 12,0), IPG permite o puterea cea mai mare posibilă de rezolvare, pe de o parte, şi
cea mai largă posibilitate de colectare a spoturi proteice (în cartarea prin electroforeză bidimensională), pe
de altă parte. Chimia este precisă şi amplu dezvoltată, aşa că sunt stabiliți toți algoritmii pentru punerea în
aplicare a oricărei lăţimi şi forme posibile de gradient de pH.
Tabelul 3.12. Ioni de tamponare acrilamido acizi (După Righetti, 2004).

pK Formulă Denumire Masă moleculară

acid 2-acrilamido-2-
1,2 207
metilpropansulfonic

3,1 acid 2-acrilamido-glicolic 145

3,6 N-acriloilglicină 129

4,6 acid 4-acrilamido-butiric 157

Datorită performanţei sale unice, IPG a condus la o mai bună alegere a primei dimensiuni în cazul
cartărilor bidimensionale (2-D) devenind cea mai adoptată tehnică în acest scop. IPG se bazează pe faptul
că gradientul de pH, care înainte, în cazul IEF cu CA migrează el însuși, este copolimerizat, şi astfel,
insolubilizat, în rețeaua matricei poliacrilamidice. Acest proces se realizează prin utilizarea, a unui set de
şase acizi slabi şi baze neamfotere, având o compoziţie chimică generală, CH2=CH-CO-NH-R (unde R
reprezintă fie două grupării carboxil diferite, slab acide, cu pK-uri de 3,6
respectiv 4,6, sau patru grupări terţiare amino, cu pK-uri de 6,2, 7,0, 8,5, şi
9,3, disponibile sub denumirea comercială de Immobiline, figura alăturată)
și a căror sinteză lor a fost descrisă de Chiari și colab. (1989a; 1989b).
Un set mai extins, care cuprinde 10 compuși chimici (unul cu pK=3,1,
unul bazic cu pK=10,3 şi doi titranți puternici, unul acid, cu pK=1 şi unul, o bază cuaternară, cu pK>12)
este disponibil cu denumirea comercială "pI select" (Righetti și colab., 1996). Tabelele 3.12 şi 3.13
prezintă caracteristicile chimice ale acestor compuși chimici, toți compușii sintetizați fiind fost raportați de
către Righetti și colab. (1988).
În plus, sisteme cu pK=3,1 au fost sintetizate pentru a fi utilizate la separarea unor izoforme ale unei
proteine foarte acide (pepsina) în timp ce specii cu pK=10,3 au fost adoptate pentru prima dată de către
Sinha şi Righetti (1987) pentru crearea unor gradienți alcalini necesari la separarea izoformelor elastazei.
 Tabelul 3.13. Ioni de tamponare acrilamido bazici. (După Righetti, 2004).

pK Formulă Denumire Masă moleculară

6,2 2-morfolino-etilacrilamidă 184

7,0 3-morfolino-propilacrilamidă 199

N,N-dimetil-aminoetil-
8,5 142
acrilamidă

N,N-dimetil-aminopropil-
9,3 156
acrilamidă

N,N-dietil-aminopropil-
10,3 184
acrylamidă

N,N,N-trietil-aminoetil-
>12 198
acrilamidă

De-a lungul anilor, s-a raportat sinteza a unui număr de ioni de tamponare, produși cu scopul de a
închide o serie de lacune de pH între imobilinele disponibile, în special în intervalul pH-ul 7,0-8,5.
Acestea sunt:
 pentru pK=6,6, 2-tiomorfolinoetilacrilamidă (Chiari și colab., 1990a);
 pentru pK=7,4, 3-tiomorfolinopropilacrilamidă (Chiari și colab., 1990a);
 pentru pK=6,85, 1-acriloil-4-metilpiperazină (Chiari și colab., 1991a);
 o alternativă pentru pK=7,0, 2-(4-imidazolil) etilamino-2-acrilamidă (Chiari și colab., 1991b);
 pentru pK=8,05, N,N-bis (2-hidroxietil) N’-acriloil-1,3-diaminopropan (Chiari și colab., 1990b).
 Alte specii ionice au fost descrise de Bellini şi Manchester (1998).
În practică, gradienţii imobilizaţi de pH sunt preparaţi prin amestecarea a două soluţii de polimerizare
diferite, într-un sistem generator de gradient asemănător celui utilizat la obținerea gradienților de pori
(figurile 3.52-3.54). În principiu, se utilizează două soluţii care conţin monomer de acrilamidă şi
catalizatori de polimerizare ai matricei de gel. Imobilinele se utilizează în soluţii stoc, cu concentraţii de
0,2 moli/L, soluția mai densă conținând glicerol. Astfel, în timpul reacției de polimerizare, grupările
carboxilat și amino se leagă covalent la matricea liniară de gel (Figura 3.63).
Figura 3.63. Reprezentarea grafică a unei rețele de
poliacrilamidă copolimerizată cu imobiline. (După Westermeier,
2005).

Deşi cele mai multe formulări iniţiale ale focalizării izoelectrice cu gradienți de pH imobilizați au fost
prezentate în termen de gradient liniar de pH, în unele cazuri, această soluție nu pare a fi optimă după cum
panta de pH poate necesita o alterare într-un interval în care proteinele se suprapun. Acest lucru este
deosebit de important în cazul general, care implică separarea de proteine dintr-un amestec complex, cum
ar fi lizatele celulare şi este, deci absolut necesară atunci când se efectuează experimente de electroforeză
bidimensională (2-D).
Având în vedere abundenţa relativă a diferitelor specii care arată că 70% dintre proteine au valori acide
ale pI (figura 3.64), este clar că un gradient de pH pentru rezolvarea optimă a unui amestec complex de
proteine trebuie să aibă o pantă mai blandă în porţiunea acidă şi un profil mai accelerat în regiunea
alcalină (Gianazza și Righetti, 1980). Un astfel de curs a fost calculat prin analiza profilului proteic pe
domeniul de pH cuprins între 3,5 - 10,0 din 0,5 în 0,5 unități de pH.

Figura 3.64. Abundenţa relativă a diferitelor specii de proteine în funcție de valoarea

pI. (După Righetti, 2004).

De altfel, prin reprezentare grafică se obține o pantă invers proporţională cu abundenţa relativă de
proteine în acest interval. Acest profil de lucru generează o curbă ideală (linie punctată în figura 3.65)
(Gianazza și colab., 1985).

Figura 3.65. Reprezentarea grafică a unui gradient performant realizat

pe domeniul pH=4-10: forma "ideală" (linie continuă) și reală (linie
punctată). Forma profilului "ideal" s-a obținut prin analiza statistic a
distribuției proteinelor în funcție de valoarea pI (figura 3.64). (După
Righetti, 2004).

Deşi gradienții neliniari de diverse forme sunt mult mai în utilizați în cromatografie, trebuie subliniat
faptul că, cei utilizați în focusarea izoelectrică sunt oarecum unici în modul în care sunt creați și sunt
optimizați pur și simplu prn intermediul unui sistem de generare de gradient (asemănător celui prezentat în
figurile 3.52-3.54) prin manipularea compoziţiei (în imobiline) din cele două soluţii aflate în vasele de
distribuție.
3.7.3. STRATEGIA DE SEPARARE A PROTEINELOR PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ PRIN
FOCALIZARE IZOELECTRICĂ
Proteinele, ca molecule amfotere, posedă sarcini nete pozitive, negative, sau neutre în funcţie de pH-ul
mediului în care se află dizolvate, sarcina per ansamblu a unei proteine particulare fiind determinată de
resturile de aminoacizi acizi sau bazici ionizabili de pe catenele polipeptidice și de grupările protetice.
Grupările carboxilice acide (-COOH), din proteine sunt neionizate în soluţii acide şi disociază în formă
anionică (-COO-) la valori ale pH-ului mai mari, de pH=3,0, în timp ce grupările amino (-NH2) şi alți
compuși de bază din proteine, cum ar fi guanidinele, sunt neîncărcate electric la un pH alcalin, dar devin
cationi la un pH mai în jur de 10,0 (de exemplu-NH3+), pH-ul la care o catenă polipeptidică disociază fiind
afectat de compoziția totală a proteinei și de proprietățile mediului în care se află dizolvată. Ca urmare,
fiecare grupare individuală ionizabilă dintr-o proteină are un punct aproape unic de disociere.
Sarcina netă pe de o proteină reprezintă suma algebrică a tuturor sarcinilor sale, pozitive şi negative.
După cum s-a mai amintit în acest capitol, există un pH specific pentru fiecare proteină la care sarcina netă
care o posedă este egală cu zero. Această valoare, denumită pH izoelectric (pI) este o proprietate
caracteristică fizico-chimică specifică fiecărei proteine. În cazul în care numărul de grupări acide dintr-o
proteină depăşeşte numărul de grupări bazice, pI-ul proteinei va avea o valoare scăzută a pH-ului. Pe de
altă parte, în cazul în care numărul grupărilor bazice sunt mai numeroase decât cele acide, pI-ul acesteia va
fi ridicat. De altfel, proteinele arată variaţii considerabile ale punctelor izoelectrice, dar valorile pI-urilor
se încadrează, de obicei, în intervalul de pH cuprins între 3 și 10.
În soluţii la care valorile pH-ului unei proteine este mai coborât decât valoarea pI-ului ei, aceasta este
încărcată pozitiv, în timp ce este identificată cu încărcătură negativă la valori mai mari peste punctul ei
izoelectric.
În electroforeză, sarcina netă a unei proteine determină direcţia migrării sale (mobilitatea
electroforetică). Astfel, la un nivel al pH-ului de mai mic decât pI-ul unei proteine, aceasta va migra spre
catod, în timp ce la valori ale pH-ului mai mari decât pI-ul său, ea se va deplasa spre anod. Pe de altă
parte, o proteină aflată la punctul său izoelectric nu vor migra în nicio direcţie.
În concordanță cu aceste concepte, focalizarea izoelectrică (IEF) este astfel o tehnică care a fost
dezvoltată pe baza acestor concepte, de separare a unor proteine pe baza diferenţelor dintre valorile lor de
pI, fiind utilizată atât pentru analiza cât și pentru izolarea unor proteine din diverse preparate.
În general, IEF se efectuează în condiţii nedenaturante, fiind o tehnică de înaltă rezoluţie, după cum în
multe cazuri rezoluţia a două proteine diferite se realizează la valori ale pI-ului lor de doar 0,02 unităţi de
pH, sau mai puţin și din această cauză, probe de proteine care par a fi omogene atunci când sunt testate
prin alte mijloace, poate fi adesea separate în mai multe componente prin acdeastă procedură. De altfel,
microheterogenitatea poate fi un indiciu dat de diferenţe în structura primară, existența unor izomeri
conformaționali, a unor diferenţele de tipuri şi de număr de grupări prostetice, sau de denaturare a
proteinei.
În funcție de proprietățile proteinei/proteinelor luate în studiu și în funcție de scopul urmărit, trebuie
avut în vedere:
 forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);
 compoziția chimică, concentrația și structura gelului (de poliacrilamidă ori agaroză);
 condițiile de separare (IEF, CA-IEF).
3.7.3.1. Forma gelurilor
Majoritatea experimentelor de IEF au fost efectuate în sisteme verticale și care utilizează gradienţi de
densitate realizați prin intermediul zaharozei sau a glicerolului (cu rol de a stabiliza gradientul de pH
împotriva curenților de convecție și pentru a reprezenta un suport al zonelor separate), gelurile de
focalizare au fost considerate greoaie și dificil de exploatat, după cum zonele concentrate sunt în mod
inerent instabile (deoarece sunt mai dense decât mediul abiental) şi nu sunt în mod corespunzător suportate
de gradienții de densitate. În plus, rezoluţia obţinută prin concentrarea în geluri cilindrice verticale este de
obicei pierdută în momentul extracției (recuperării) benzilor proteice concentrate. Ca o consecinţă,
gradienții de densitate au fost înlocuiți, în cea mai mare măsură, cu alte suporturi de stabilizare.
În prezent, cele mai multe IEF analitice sunt efectuate în geluri de poliacrilamidă cu concentrație și
grad de reticulare (T%, C%) continuă, după cum un astfel de polimer oferă matrici suport neîncărcate
electric. Gelurile sunt concepute cu pori mari, care permit mişcarea relativ liberă a proteinelor.
Cele mai obișnuite configurări în IEF analitică sunt gelurile plate orizontale deoarece această
configuraţie asigură o eficientă racire iar aplicarea probei se realizează relativ ușor, în timp ce IEF
realizată pe geluri cilindrice constituie în mod obișnuit prima dimensiune în metoda de electroforeză
bidimensională.
Spre deosebire de alte forme de electroforeză, mecanismul IEF se pretează la separări preparative și
din acastă cauză preocedeul electroforetic este o realitate practică.
3.7.3.2. Compoziția chimică, concentrația și structura gelului
Gelurile de poliacrilamidă sunt utilizate pentru focalizarea proteinelor cu masă moleculară de până la
aproximativ 500.000 Da. Ele sunt formate prin copolimerizarea monomerului acrilamidă, CH 2=CH-CO-
NH2 cu N, N'-metilenbisacrilamidă, CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 (bisacrilamidă), reacția de
polimerizare fiind realizată printr-un mecanism vinilic și este catalizată de un sistem generator de radicali
liberi.
Specific IEF, polimerizarea este realizată prin utilizarea combinată a persulfatului de amoniu,
tetrametil-etilen diaminei (TEMED) și riboflavinei, consecutiv cu iluminarea amestecului de reacție.
Riboflavina, iniţiator fotochimic, este inclusă, deoarece sistemul de APS/TEMED este ineficient la un pH
scăzut. În unele protocoale de lucru, riboflavina este înlocuită cu riboflavin-5’-monofosfat în concentrație
de 0,1% (Garfin, 2003). Matricea de gel utilizată în IEF trebuie să nu posede proprietăți de stivuire
moleculară a proteinelor și să fie mecanic stabilă. O compoziţie a gelului potrivit pentru electrofocusarea
orizontală este T=5%, C=3%.
Pe de altă parte, gelurile de agaroză au pori mult mai mari decât gelurile de poliacrilamidă și de aceea
sunt utilizate pentru separarea de proteine mari, care posedă structuri ce nu pot fi uşor caracterizate în
gelurile de poliacrilamidă. Astfel, macromoleculele mai mari de 200.000 Da pot fi separate pe geluri de
agaroză cu o concentrație de 1%, ele fiind realizate prin “topirea” unui amestec de agar şi care este în
continuare turnat pe o placă de sticlă, într-o manieră similară metodelor utilizate în pregătirea gelurilor de
agaroză în cazul imunodozărilor ori în cazul electroforezei ADN. De asemenea, pentru a reduce fluxurile
electroendoosmotice de solvent, se utilizează numai agaroze pregătite special pentru IEF (-Mr=0) iar
vâscozitatea mediului trebuie să fie crescută prin încorporarea în geluri a glicerolului ori a sorbitolului.
Pretratamentul probelor supuse IEF implică solubilizarea, denaturarea şi reducerea lor, pentru a rupe
complet interacţiunile dintre proteine şi pentru a elimina componentele neproteice din probă, precum acizii
nucleici.
În mod ideal, pentru a evita pierderile de proteine, solubilizarea completă a probei se realizează într-un
singur pas, eliminându-se astfel manipulările inutile, prevenindu-se pierderea unor componente solubile
care pot fi uşor îndepărtate din soluţie. Cel mai frecvent sistem de agenți de solubilizare utilizați este cel
compus din uree 8 M, CHAPS (3-[(3-colamidopropil) dimetilamoniu]-1-propan sulfonat, un detergent
zwitterionic), 4%, ditiotreitol (DTT, 50-100mM) şi Tris 40 mM. Cu toate acestea, nu există o soluție
„standard” pentru solubilizarea probei înainte de IEF, mai ales în cazul în care este necesar studiul unor
proteine insolubile, asociate de membrană, sau a unor proteine tisulare prezente in țesuturi foarte rezistente
precum firul de păr ori piele.
Alți detergenți recomandați în focusarea izoelectrică sunt CHAPSO (3-[(3-colamidopropol) dimetil-
amoniu]-2-hidroxi-1-propan sulfat) (figura 3.66), sau detergentul neionic octilglucozid (figura 3.67), la
concentraţii de 1-2% în gel.

Figura 3.66. Structura chimică a detergenților

zwitterionici CHAPS (R=H) și CHAPSO (R=OH).

Chiar şi în prezenţa de detergenţi, unele probe proteice pot avea cerinţe stricte de sare, aceasta fiind
introdusă în sistem doar dacă este o cerinţă absolută, deoarece prezența ei în amestecul de separare
prezintă riscul apariției unor procese substanţiale de distorsiune a benzilor. Pe de altă parte, trebuie avut în
vedere că amfoliții transportatori contribuie la tăria ionică a soluţiei ceea ce poate contracara lipsa unor alți
ioni în probă.

Figura 3.67. Structura chimică a octilglucozidului (octil-beta-D-glucopiranozid).

De altfel, prin introducerea unor reactivi precum tiourea, a agenților tensioactivi din clasa sulfobetainei
(figura 3.68) ori a tributil fosfinei (figura 3.69) în soluţia probei proteice de analizat a fost raportată o
anumită creștere a solubilității proteinelor.
 Figura 3.68. Structura chimică a detergentului zwitterionic
(amfoteric) sulfobetaina 3-12 (N-dodecil-N,N-dimetil-3-
amoniu-1-propan sulfonat).

Ureea este un agent comun de solubilizare, în special pentru acele proteine care precipită la punctele
lor izoelectrice, chiar dacă le denaturează.

Figura 3.69. Structura chimică a tributil fosfinei (tributilfosfan).

O concentrație de 3M uree este adesea găsită satisfăcătoare pentru menţinerea solubilității, cu toate că
au fost raportate concentraţii de lucru de până la 8 M. Pe de altă parte, în scopul de a preveni
carbamoilarea grupărilor amino și sulfhidril ale proteinelor, trebuie avut în vedere a se utiliza numai soluţii
proaspete (care sunt deseori tratate cu un amestec de răşină schimbătoare de ioni).
3.7.3.3. Îndepărtarea amfoliților din gel
Există un număr de moduri de separare a amfoliților de proteine. Astfel, eliminarea lor se poate realiza
electroforetic, prin precipitare cu sulfat de amoniu, gelfiltrare, cromatografie de schimb ionic sau pe gel de
hidroxilapatită. De asemenea, dializa este o metodă simplă şi eficientă pentru îndepărtarea amfoliților din
soluţiile de proteine. Practic, fracţiunile separate sunt tratate prima dată cu o souție de NaCl (1 M) cu
scopul de a perturba complexele electrostatice slabe existente între amfoliți și proteine, după care acestea
se dializează extensiv în tampoane adecvate.
De altfel, după cum este necesară pentru eliminarea completă a amfoliților din preparatul proteic, nu
există nici o modalitate specială de a demonstra absenţa completă a acestora dintr-o soluţie de proteine, cu
toate că, pentru cele mai multe aplicaţii, prezența amfoliților nu influențează mersul unei analize, nefiind
astfel nevoie ca ei să fie în întregime îndepărtați.
3.7.4. REZOLUȚIA DE SEPARARE ÎN FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ
Un obiectiv atât în analiza electroforetică cât și în electroforeza preparativă îl reprezintă realizarea în
cel mai mare grad posibil a unei rezoluţii crescute între benzile de proteine adiacente. În acest context,
rezoluţia se referă la separarea benzilor de proteine în raport cu lăţimea benzilor și este marcată de
diferenţa de pI dintre benzile care în mod clar se distind.
Doi dintre factorii care conduc la o rezoluţie crescută într-o IEF de succes se află sub direct control
experimental. Aceștia sunt (1) câmpul electric şi (2) panta gradientului de pH, parametrii determinați de
tensiunea aplicată respectiv de domeniul de pH cuprins între amfoliții transporori/imobilizați.
Conform teoriei focalizării izoelectrice şi rezultatelor experimentale, diferenţa de pI (ΔpI) între două
benzi de proteine adiacente rezolvate prin această tehnică este direct proporţională cu rădăcina pătrată a
gradientului de pH şi invers proporţională cu rădăcina pătrată a gradientului de tensiune (intensitatea
câmpului electric aplicat) conform relației:
ΔpI = (gradient de pH / gradient de voltaj)1/2
Astfel, în IEF, un domeniu îngust de pH şi o tensiune înaltă, aplicată, conduce la o rezoluţie înaltă (un
ΔpI mic). În plus faţă de aceşti doi factori, o rezoluţie bună este favorizată de existența unor substanţe cu
coeficienţi de difuzie scăzuți. De asemenea, vitezele ridicate de schimbare a mobilităţii, cu un pH apropiat
de punctele lor izoelectrice conduc la o rezoluție înaltă. De altfel, cele mai multe dintre proteine
îndeplinesc ultimile două criterii, dar aceşti factori nu sunt, desigur, sub controlul experimentatorului,
după cum schimbarea distanței dintre electrozi pentru o tensiune dată şi alegerea unui domeniu de pH, va
schimba în aceeaşi măsură atât pH-ul cât şi gradienţii de tensiune, astfel încât, cu excepţia cazului în care
intervalul amfoliților transportori sau tensiunea electrică aplicată sunt de asemenea modificați, nu au drept
consecinţă o modificare a rezoluţiei.
Rezoluţia, în IEF este exprimată în ΔpI, fiind definită ca diferenţa de sarcină de suprafață, în unităţi de
pI, între două specii de proteine rezolvate. În IEF se poate ajunge la un ΔpI, egal cu 0,001 unităţi de pH,
după cum limita corespunzătoare din IEF cu gradienți imobilizați fiind de doar de 0,01 unități. De
exemplu, Cossu şi Righeti (1987) au investigat posibilitatea de a rezolva proteine care conțin o mutație
punctiformă care implică resturi de aminoacizi neionizabili din catene laterale, considerate “tăcute
electroforetic” deoarece ele nu pot fi decelate printr-o tehnică convențională de separare în câmp electric.
Astfel, hemoglobina fetală (Hb F), alcătuită din două componente, denumite Aγ şi Gγ, care posedă o
mutație Gly→Ala la γ-136, poate fi rezolvată în două benzi principale prin utilizarea unui gradient foarte
lin de pH, de 0,1 unități pe o lungime a distanței de migrare de 10 cm (Cossu şi Righeti, 1987). Astffel,
rezoluţia de separare este aproape de limita practică, de ΔpI=0,001 (figura 3.70).

Figura 3.70. Focusarea izoelectrică a unui lizat ombilical pentru analiza hemoglobinei
fetale heterozigote (HbF) Sardinia. Sunt prezentate numai benzile HbF după cum
celelalte două componente majore sanguine HbA and HbFac, sunt pierdute prin
difuziune în gradientul de pH. Gradientul de focalizare izoelectrică este de 0,1 pH
unități și acoperă lungimea de 10 cm a gelului. Se observă cele două benzi rezolvate,
identificate ca produși normali și mutanți (Glyγ vs. Alaγ) ai genei. Benzile rezolvate
Aγ/Gγ sunt într-un raport de 20:80, identic cu cel predicționat teoretic prin expresia
genei (După Cossu şi Righeti, 1987).

În plus faţă de efectul asupra rezoluţiei, câmpurile electrice înalte, au ca rezultat o scădere a timpului
de migrare. Pe de altă parte, în oricare proces electroforetic, tensiunile ridicate sunt însoţite de eliberarea
unor cantităţi mari de energie termică (încălzire prin efect Joule) existând astfel limitări privind
magnitudinea acestor câmpuri electrice care pot fi aplicate. Cum coeficienții de difuziune cresc odată cu
creșterea temperaturii, în aceste condiții are loc o scădere a rezoluției de separare, alături de posibilitatea
degradării termice a gelurilor. Din această cauză sunt necesare geluri la care raportul suprafaţă/volum este
suficient de mare, mai precis se utilizează geluri subțiri care sunt mai capabile de a disipa căldura față de
gelurile groase și sunt, prin urmare, capabile să conducă la o rezoluţie mai mare.
Câmpurile electrice utilizate în focalizarea izoelectrică sunt, în general, de ordinul a 100V/cm.
3.7.5. APARATURA UTILIZATĂ ÎN FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ
Geluri plate orizontale utilizate în focalizarea izoelectrică deţin o serie de avantaje şi au devenit foarte
populare pentru scopurile analitice. Ele sunt realizate pe plăci de sticlă sau pe folii de plastic, tratate
special și care permit lucrul cu probe care urmează să fie aplicate oriunde pe suprafaţa lui, permițând
măsurarea pH-ului şi a tensiunii direct, pe suprafaţa lor. Datorită migrării în condiţii identice, pe astfel de
geluri-placă configurate, se pot rula un număr de probe care apoi se pot compara.
Celulele electroforetice cele mai bune, prezintă platforme pentru disiparea căldurii, de control al
condensului şi electrozi mobili care fac un contact direct şi uniform cu suprafaţa de gel iar cele mai multe
sisteme includ, de asemenea, dispozitive pentru turnarea geluri (figura 3.71).
Un sistem alternativ utilizat în IEF analitică la care rezoluţia este ceva mai mică decât cea care poate fi
obţinută în celule standard orizontale, este cel realizat cu un gel ”inversat” unde gelul este orientat în jos și
se migrează suspendat între doi electrozi de carbon, în formă de tijă. Astfel de celule inversate sunt mai
puţin costisitoare şi mai simplu de folosit, dar mai puţin versatile decât celulele standard. Pe de altă parte,
un alt avantaj al acestui sistem îl reprezintă faptul că în aceste celule se rulează tensiuni mai mici decât cel
standard şi nu necesită astfel o răcire activă.
Gelurile verticale utilizate în IEF prezintă avantajul că echipamentul electroforetic de rulare este
disponibil în cele mai multe laboratoare și pot fi utilizate la procesarea unui volum relativ mare a probei
deși celulele verticale nu tolerează volataje foarte înalte, această orientare nefiind capabilă să conducă la
rezoluții ultra-înalte ca cele obținute în cazul gelurilor migrate pe sisteme orizontale.
Figura 3.71. Reprezentarea schematică a unei celule de IEF (A) și o cameră de focalizare izoelectrică ”Multiphor II IEF”, Amersham
Bioscience (B). (După Garfin și Ahuja, 2005).
Pentru a proteja proteinele din probe și materialele celulelor electroforetice (în special garniturile) de
electroliții caustici (soluție de NaOH), s-au descris soluții alternative catodice și anodice pentru migrarea
gelurilor vericale în IEF. Drept soluție catodică se poate utiliza arginina (20 mM) și lizina (20 mM) în
timp ce soluția anodică recomandată (H3PO4, 70 mM) poate fi înlocuită cu un amestec de acid aspartic, 20
mM și acid glutamic, 20 mM (Rodríguez-Díaz și colab., 2005), deși aceste componente sunt mai scumpe.
Sursa de curent electric utilizată în IEF în celule standard trebuie să fie capabilă să dezvolte până la
3000 V şi o putere de operare de 30 W. Celule inversate au nevoie doar de circa 500 V şi 5 W, putere
maximă. În mod ideal, sursa de alimentare va avea un modul de putere constantă de operare. Celulele
standard necesită o circulaţie de lichidul de răcire, pentru a obține performanțe optime.
3.7.6. AVANJELE ȘI DEZAVANTALELE FOCALIZĂRII IZOELECTRICE
Principiul focalizării izoelectrice este foarte simplu de înţeles şi de pus în aplicare. Astfel, proba care
conține un amestec de proteine este adăugată unui amestec de amfoliți transportori ori unui tampon
transportor (alcătuit din compuși sintetici care conțin legături duble reactive, denumiți generic tampoane
acrilamido, încorporabile în matricea gelului de poliacrilamidă și care, utilizate într-o proporție corectă,
generează gradienți de pH imobilizați sub acțiunea unui câmp electric) pe un domeniu de pH bine-definit,
în celula de focalizare. Prin urmare, în condițiile aplicării unui potențial electric asupra celulei de
focalizare, proteinele vor migra în gradientul de pH într-o poziție echivalentă punctul lor izoelectric (pI).
În cazul în care o proteină difuzează din această regiune de pH, sarcina sa netă se va schimba, moment în
care intervine forţa electroforetică și care va influenţa migrarea sa înapoi în poziția sa de pI. Rezultatul net
este „concentrarea” de proteine în benzi înguste caracteristice valorile lor de pI.
În cazul IEF în mediu liber, un avantaj îl reprezintă abilitatea tehnicii de a fracţiona un amestec
complex de proteine în funcţie de pI-ul lor într-un mediu liber, fracţiunile putând să fie colectate şi
analizate în flux continuu, iar dacă este necesar, analiza lor se poate realiza prin electroforeză sau
cromatografie (vezi subcapitolul 1.3.2.- Focalizarea izoelectrică în flux continuu).
Dezavantajele IEF constau dui faptul că proteinele „neutre”, (dacă ne referim la pI-ul lor), de multe ori,
precipită din soluţie, fenomen care cauzează suprapunerea unor facţiuni din probă. În plus, în condițiile
utilizării, mai departe a unor tehnici precum cele de spectrometrie de masă cu ionizare prin electrospray
(ESI-MS) amfoliții utilizați pentru stabilizarea gradientului de pH pot interfera în analiză. De asemenea,
proteinele foarte hidrofobe pot fi pierdute în timpul pregătiririi probei sau în timpul focalizării, în
momentul în care acestea ajung la pH-ul lor izoelectric.
3.7.6.1. Instabilitatea gradientului de pH
Pentru cele mai multe scopuri practice, odată ce starea de echilibru a fost atinsă, gradienţii de pH sunt
stabili, deși în timpul unei focalizări prelungite (mai mare de 3 ore, în condiţii standard de analiză pe gel
plat), aceștia încep să se deterioreze, lent. Această pierdere este caracterizată printr-o deviere catodică a
gradienţilor şi este însoţită de o acidifiere la anod, aplatizarea gradientului în regiunea neutră a pH şi o
pierdere a benzilor în zona alcalină. Mecanismul de instabilitate, care a fost numit "derivă catodică," nu
este complet elucidat, fiind probabil cauzată de o combinaţie de factori, inclusiv electroendoosmoza,
absorbţia de CO2 ori fluxurile electroforetice pI-dependente. Consecinţa practică a derivei catodice este
faptul că trebuie evitați timpi de IEF excesiv de lungi.
 3.7.6.2. Concluzii
 Electroforeza pe gel de poliacrilamidă în două dimensiuni (2-D PAGE) prin care proteinele sunt
separate în funcţie de sarcină (pI) prin IEF, într-o primă dimensiune şi în funcţie de masa lor moleculară
prin SDS- PAGE în a doua dimensiune, prezintă o capacitate unică pentru rezolvarea unor amestecuri
complexe de proteine, care astfel permite analiza simultană a sute sau chiar mii de proteine ca produse ale
genei. Cu toate aceste avantaje, schimbul de date 2-D între laboratoare reprezintă o problemă majoră din
cauza nereproducibilății spaţiale între geluri 2-D generate prin metoda convenţională cu ajutorul
amfoliților transportatori (CA). Echilibrul dintre amfoliții transportatori în IEF nu poate fi realizat din
cauza instabilităţii gradientului de pH odată cu timpul prelungit de migrare acesta deplasându-se și
concentrându-se spre catod („deriva catodică”) şi se aplatizează în centru („fenomenul de platou”). Prin
urmare, sunt obţinute diferite pattern-uri de separare a proteinelor, dependente de timp. În plus,
reproductibilitatea profilului gradientului de pH-ului este limitată de variabilitatea în funcție de lotul de
fabricație a preparatelor de amfoliți transportatori.
 În cele din urmă, problemele legate de instabilitatea gradientului de pH şi nereproductibilitatea
rezultatelor au fost depăşite prin introducerea gradienților imobilizați de pH în IEF (Bjellqvist și colab.,
1982). Gradienții imobilizați de pH se bazează pe realizarea unui gradient de pH, generat de un număr
limitat (6-8) de compuși chimici bine definiți, care sunt co-polimerizați pe matricea acrilamidică. Astfel,
driftul catodic este eliminat, reproductibilitate este îmbunătăţită şi modelul poate fi supus unor comparări
interlaboratoare. Gradienții imobilizați de pH permit generarea de pante de pH pe orice interval de dorit
(larg, îngust sau ultra-îngust) cu pH-ul cuprins între 3 şi 12.
 Deoarece capacitatea de încărcare a probei pe geluri de IEF cu gradienți imobilizați de pH este,
de asemenea, mai mare decât cele cu amfoliți transportori, în special în domenii înguste de pH (o unitate
de pH) sau ultra-înguste (0,1 unităţi de pH), electroforeza bidimensională cu primă treaptă de IEF este
metoda optimă aleasă în separările micropreparative şi de identificare a unor noi proteine.
Bibliografie
Bellini, M. P., Manchester, K. L. (1998) Synthesis of zwitterionic acrylic acid buffers for isoelectric focusing in immobilized pH
gradients. Electrophoresis 19:1590-1595.
Bianchi-Bosisio, A. Snyder R.S. and Righetti, P.G. (1981) Molecular weight distribution of carrier ampholytes for isoelectric
focusing J. Chromatogr. 209:265-272.
Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P. G., Gianazza, E., Gorg, A., Postel, W., Westermeier, R. (1982) Isoelectric focusing in
immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. J. Biochem. Biophys. Methods 6:317-339.
Chiari, M., Casale, E., Santaniello, E., Righetti, P. G. (1989 a) Synthesis of buffers for generating immobilized pH gradients. I:
Acidic acrylamido buffers. Theor. Appl. Electr. 1:99-102.
Chiari, M., Ettori, C., Manzocchi, A., Righetti, P. G. (1991a) Structure-stability relationship of Immobiline chemicals for
isoelectric focusing as monitored by capillary zone electrophoresis. J. Chromatogr. 548:381-392.
Chiari, M., Giacomini, M., Micheletti, C., Righetti, P.G. (1991 b) Synthesis of a new acrylamido buffer (acryloylhistamine) for
isoelectric focusing in immobilized pH gradients and its analysis by capillary zone electrophoresis. J. Chromatogr. 558:285-295.
Chiari, M., Pagani, L., Righetti, P. G., Jain, T., Shor, R., Rabilloud, T. J. (1990 a) Synthesis of an hydrophilic, pK 8.05 buffer for
isoelectric focusing in immobilized pH gradients. Biochem. Biophys. Methods 21:165-172.
Chiari, M., Righetti, P. G., Ferraboschi, P., Jain, T., Shorr, R. (1990 b) Synthesis of thiomorpholino buffers for isoelectric
focusing in immobilized pH gradients. Electrophoresis 11:617-620.
Cossu, G., Righetti, P. G. (1987) Resolution of G gamma and A gamma foetal haemoglobin tetramers in immobilized pH
gradients. J. Chromatogr. 398:211-216.
Cuono, C. B., Chapo, G. A. (1982) Gel electrofocusing in a natural pH gradient of pH 3-10 generated by a 47-component buffer
mixture. Electrophoresis 3:65 -75.
Davis, B. J. (1964) Disc electrophoresis. ii. method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121:404-427.
Gabriel, O. (1971) [39] Analytical disc gel electrophoresis. Methods Enzymol. 22:565-578.
Garfin, D. E., Ahuja, S. Handbook of isoelectric focusing and proteomics. Separation Science and Technology, Volume 7.
Ahuja, S. Series Ed., Elsevier B.V. 2005. http://books.google.ro/books?id=zNuJTYRuTPsC&pg =PA95&lpg= PA95&dq=
IEF+inverted&source=bl&ots= GA-954cYxZ&sig=ah1kRN bemklQHNl1n2sXttSpow0&hl=ro&ei=hpnBS96cC8ulOPS5iZc
E&sa=X&oi= book_result&ct=result&resnum=6&ved=0CCIQ6AEwBQ#v=on epage& q=IEF%20inverted&f=false
Garfin, D.E. Essential Cell Biology, Volume 1. Cell Structure, A Practical Approach, Davey, J. D. Lord, M. Eds. Oxford
University Press, Oxford UK pag. 197-268, 2003. http://www.aesociety.org/areas/pdfs/Garfin _IEF_WebArticle9-07.pdf
Gianazza, E., Giacon, P., Sahlin, B., Righetti, P. G. (1985) Non-linear pH courses with immobilized pH gradients.
Electrophoresis 6:53-56.
Gianazza, E., Righetti, P. G. (1980) Size and charge distribution of macromolecules in living systems. J. Chromatogr. 193:1-8.
Giddings, J.C. Unified Separation Science, Wiley/Interscience, New York, pp. 86-109, 1991.
Grubhofer N., Borja, C. in B.J. Radola and D. Graesslin (Eds.), Electrofocusing and Isotachophoresis, de Gruyter, Berlin, pp.
111-120, 1974.
Kolin, A., in B.J. Radola and D. Graesslin (Eds.), Electrofocusing and Isotachophoresis, de Gruyter, Berlin, pp. 3-33, 1977.
Meselson, M., Stahl F.W., Vinogradov, J. (1957) Equilibrium sedimentation of macromolecules in density gradients. Proc. Natl
Acad. Sci. USA 43:581-588.
 Ornstein, L. (1964) Disc electrophoresis-1: background and theory. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121:321–351.
Pogacar P., Jarecki, R. in R. Allen and H. Maurer (Eds.), Electrophoresis and Isoelectric Focusing in Polyacrylamide Gels, de
Gruyter, Berlin, pp. 153-158, 1977.
Righetti, P. G., Mahmoud, H., Antonucci, F., Verzola, B., Bossi, A. Chapter 15. Electrophoresis of proteins and peptides. În
Chromatography, 6th ed. Erich Heftmann (Ed) Journal of Chromatography Library, Vol. 69B, pp. 633- 668, Elsevier B.V., 2004.
Righetti, P.G., Gelfi, C., Chiari, M. (1996) [10] Isoelectric focusing in immobilized pH gradients. Methods Enzymol. 270: 235-
255.
Rilbe, H. (1973) Rapid isoelectric focusing in density gradient columns. Ann. N. Y. Acad. Sci. 209:80-93.
Rilbe, H. (1978) Steady-state rheoelectrolysis J. Chromatogr. 159:193-205.
Rilbe, H. pH and Buffer Theory. A New Approach, Wiley, Chichester, pp. 1-192, 1996.
Rodríguez-Díaz, R., Wehr, T., Tuck, S. F. Analytical techniques for biopharmaceutical development. Rodríguez-Díaz, R., Wehr,
T., Tuck, S. F. Eds. Marcel Dekker, pag. 175, 2005. http://books.google.ro/books?id=jn0eO1PqC-MC&pg=PA145&dq=electrical
+power+supply+IEF&cd=3#v =onepage&q=electrical%20power%20supply%20IEF&f=false
Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Jr. (1967) Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in
SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285:815-820.
Sinha, P. K., Righetti, P. G. (1987) Isoelectric focusing of basic proteases in immobilized pH gradients. J. Biochem. Biophys.
Methods 15:199-206.
Soderberg, L. Buckley, D. Hagstrom G. Bergstrom, J. (1980) The chemical properties of Pharmalyte. Prot. Biol. Fluids 27 687-
691.
Svensson, H. (1961) Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. I. The
differential equation of solute concentrations at a steady state and its solution for simple cases. Acta Chem. Scand. 15:325-341.
Svensson, H. (1962a) Isoelectric fractionation, analysis and characterization of ampholytes in natural pH gradients. II. Buffering
capacity and conductance. Acta Chem. Scand. 16:456-466.
Svensson, H. (1962b) Isoelectric fractionation, analysis and characterization of ampholytes in natural pH gradients. 3.
Description of apparatus for electrolysis in columns stabilized by density gradients and determination of isoelectric points. Arch.
Biochem. Biophys. 1:132-138.
Vesterberg, O. (1973) Physicochemical properties of the carrier ampholytes and some biochemical applications. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 209:23-33.
3.8. SEPARAREA PROTEINELOR PRIN ELECTROFOREZĂ BIDIMENSIONALĂ PE
GEL DE POLIACRILAMIDĂ
În ultimii 25 de ani, am asistat la un efort sporit de dezvoltare a unor tehnologii capabile în a identifica
şi cuantifica un număr mare de proteine, exprimate în cadrul unui sistem celular (proteom), în speranţa
identificării unor noi biomarkeri, caracteristici unor stări patologice, de cartare a unor noi proteine
circulante, sau de identificare a unor noi mecanisme de semnalizare celulară.
Pentru a separa proteomul, oamenii de știință au folosit tehnologii electroforetice şi cromatografice,
separat ori în asociere atât în sisteme offline cât și în sisteme online. Astfel, complexitatea acestuia a
condus la dezvoltarea unor metode de separare eficiente şi a unor tehnici sensibile de detectare a
proteinelor, procese considerate critice în acest efort. În plus, progrese continue s-au realizat și în
spectrometria de masă (MS), tehnologie care a permis detectarea unor proteine cu o viteză şi o sensibilitate
mult mai mare decât cea anterior posibilă. Cu toate acestea, chiar şi cu ajutorul tehnicilor de ultimă oră,
este încă imposibil să se caracterizeze toate componentele unui proteom complex.
Deși aceste eforturi pot conduce la separarea şi identificarea a mii de proteine, în prezent nu există nici
o metodă unică, care să poată rezolva toate proteinele dintr-un proteom, datorită numărului lor mare şi a
gamei dinamice a concentraţiei lor. Separările într-o singură dimensiune sunt inadecvate pentru rezolvarea
în mod eficient a amestecurilor complexe de proteine și din această cauză Smithies şi Poulik (1956) au
predicționat că o combinaţie de două procese electroforetice pe un același gel, pe direcții perpendiculare ar
trebui să ofere un grad mult mai mare de rezoluţie decât este care este posibilă cu două separări
electroforetice, luate în mod separat. Cele două procese prezentate de cei doi autori sunt electroforeza în
funcție de mărimea moleculară şi electroforeza în funcție de mobilitatea proteinelor pe un gel de amidon.
Aserțiunea lor continuă să fie adevărată şi a constituit baza elaborării de metodologii ortogonale
multidimensionale de separare a amestecurilor complexe nu numai prin electroforeză pe gel, dar și prin
cromatografie ori electroforeză capilară (Issaq și Veenstra, 2008).
Un pas înainte în practica 2D-PAGE este atribuit lui Wright (1972), care a folosit un gel cilindric cu
T=4,75% și C=2%, în prima dimensiune, care a fost apoi depus pe marginea superioară a unui gel plat, cu
un gradient de pori. După electroforeză, gelul vertical a fost plasat într-o soluţie de colorare, ceea ce a
condus la vizualizarea și astfel rezolvarea a 112 proteine serice umane. Astfel, prin această nouă abordare
s-a rezolvat doar un număr mic de proteine, în principal cele mai abundente proteine ale unei celule sau
proteomul seric.
Introducerea SDS de către O'Farrell (1975) în tehnologia bidimensională de separarea a proteinelor
celulare în condiţii denaturante a permis rezolvarea a sute de proteine. Astfel, principiul aplicat este foarte
simplu: proteinele sunt rezolvate pe un gel, prin focalizare izoelectrică, care le separă în prima dimensiune
în funcţie de punctul lor izoelectric, urmată de electroforeză într-o a doua dimensiune, în prezenţă de
dodecil sulfat de sodiu, proces care le separă în funcţie de masa lor moleculară. Metoda lui O'Farrell a pus
cu adevărat bazele moderne ale 2D-PAGE, care a fost rapid adaptată şi acceptată pe scară largă de către
alţi cercetători. Anderson si Anderson (1977) au utilizat 2D-PAGE pentru analiza proteinelor plasmatice
umane. Ei au reuşit să separe şi să detecteze aproximativ 300 de spoturi distincte proteice. Spre deosebire
de Anderson și Anderson, Manabe și colab. (1979) au separat proteinele din plasmă umană folosind 2D-
PAGE fără agenţi de denaturare care a condus la rezolvarea a numai aproximativ 230 de spoturi proteice;
cu toate acestea, spoturile sunt pale și nu sunt bine rezolvate.
Diversitatea probelor analizate prin electroforeză bidimensională pe gel de poliacrilamidă (2D-
PAGE) a condus la recomandarea unei metode universale de pregătire a lor, după cum metoda este
considerată a fi în măsură să rezolve proteine diferite, cu o diferență de pI mai mică de 0,1 unități de pH şi
cu mase moleculare de 1 kDa. De asemenea, este esenţial să se reducă modificările din structura
proteinelor în timpul pregătirii probei altfel acestea vor conduce în mod inevitabil, la prezenţa unor spoturi
artifactuale pe harta 2D finală.
3.8.1. PREGĂTIREA PROBEI ÎN VEDEREA 2-D PAGE
Pretratarea probelor în vederea 2-D PAGE implică solubilizarea, denaturarea şi eliminarea completă a
interacţiuniilor dintre proteine (Rabilloud, 1996). Deşi este de dorit, nu există o metodă unică de pregătire
a specimenelor supuse analizei care poate fi universal aplicată din cauza diversității acestora și care sunt
analizate prin electroforeză bidimensională.
O procedură ideală de solubilizare a probei în vederea 2D-PAGE trebuie să conducă la perturbarea
tuturor complexelor proteice realizate prin legături necovalente şi a agregatelor polipeptidice din soluţii,
cu obținerea unor componente individuale (Herbert și colab., 1998). De altfel, indiferent de metoda de
preparare a probei aleasă, cel mai important aspect este de reducere la minimum a modificărilor structurale
ale proteinelor și care ar putea conduce, în final la apariția unor spoturi artefactuale pe hărţile 2D. În cazul
în care probele conţin uree, se are în vedere că, datorită izocianatului format prin descompunerea ei, nu
trebuie să fie încălzite deoarece tratamentul termic poate conduce la procese de carbamoilare a proteinelor,
proces care generează o mare heterogenitate a spoturilor proteice, după cum, probele trebuie să fie supuse
unei minime manipulări și se păstrează pe tot parcursul, la rece (Görg, 1998).
Un alt considerent care trebuie avut în vedere este tipul de proteine care se analizează (extract celular
total, fracții subcelulare ca de exemplu mitocondrii, ribozomi), sau anumite fracţiuni proteice cu o anumită
solubilitate (Görg și colab., 1997; Corthals și colab., 1997), ca de exemplu, fracțiuni proteice solubile în
apă sau proteine extrase într-o soluție hidroalcoolică (Weiss și colab., 1992; Weiss și colab., 1993).
Probele care conțin proteine solubile pot fi adesea analizate prin 2D-PAGE cu sau fără pretratamente
minime. Aceste tipuri de probe sunt exemplificate de fluidele corpului, precum serul, plasma, urina,
lichidul cefalorahidian, materialul seminal și lichidul amniotic. De altfel, probele serice ori plasmatice au o
concentraţie de proteine inerent ridicată şi pot fi analizate direct prin 2D-PAGE după diluare într-un
tampon de solubilizare cu toate că, în cazul probelor de ser o problemă majoră o reprezintă abundenţa
ridicată a unui număr mic de proteine (imunoglobulinele şi albumina), care pot ecrana o serie de
componente minore. Aceste proteine cu o abundență înaltă pot fi eliminate din probă, înainte de separarea
2D prin cromatografie de afinitate, cu toate că există un risc semnificativ ca în timpul acestui tratament să
se producă o eliminare nespecifică a unor componente proteice (Dunn și Corbett, 1996).
Alte tipuri de fluide corporale au un conţinut scăzut de proteine, dar conţin o concentraţie relativ mare
de săruri, care pot interfera în prima dimensiune, cea de focalizare izoelectrică. Aceste probe trebuie să fie,
de obicei, desalinizate înainte de 2D-PAGE prin tehnici precum dializa sau gel-cromatografia. Probele
trebuie să fie concentrate apoi prin metode de tipul liofilizării, precipitării cu acid tricloracetic (TCA) sau
precipitării cu acetonă rece. Ultima abordare s-a dovedit a fi deosebit de utilă la concentrarea unei mari
varietăți de probe pentru analize efectuate prin această tehnică (Pipkin și colab., 1985) după cum
dezvoltarea unor metode de detecţie sensibile, cum ar fi colorația cu argint, a făcut posibilă analiza unor
probe din fluidele corpului fără a recurge la o desalinizare extinsă şi la proceduri complexe de
concentrare(Dunn și Corbett, 1996).
Probele din țesuturi solide trebuie să fie disrupte în prezența unui tamponului de solubilizare. Liza
diferitelor tipuri de celule şi ţesuturi se poate realiza prin omogenizare (de exemplu omogenizatorul
Potter), disrupere prin mojarare cu pistil sau prin imersie în azot lichid, dezintegrare cu ultrasunete, liză
enzimatică (cu lizozim, de exemplu), tratament cu detergenţi precum Nonidet P-40 (figura 3.72), Triton X-
100, CHAPS, SDS, şoc osmotic, congelare urmată de decongelare repetată sau printr-o combinaţie a
acestor metode (tabelul 3.13). De exemplu, micile fragmente de ţesut trebuie să fie învelite în folie de
aluminiu, congelate în azot lichid, şi strivite până la o pulbere fină între două blocuri de metal răcit ori
într-un mojar. Probele mari de ţesut pot fi procesate prin omogenizare în tamponul solubilizare folosind un
omogenizator având în vedere reducerea la minim a spumării și a încălzirii, procese care conduc la
modificarea proteinelor.
Tabelul 3.13. Metode de disrupție a celulelor (după Görg, 1998)
Metoda de liză Procedura Aplicații
Liză osmotică Soluție hipoosmotică Culturi de celule tisulare
Liză prin îngheț-dezgheț Mai multe cicluri de înghețare-încălzire Culturi de celule tisulare; multe procariote
(de exemplu, înghețare cu azot lichid)
Liză cu detergenți Detergenți cationici/anionici Culturi de celule și celule fungice
Liză enzimatică Digestie enzimatică a peretelui celular Țesuturi de plante, celule fungice și
(cu celulaze, de exemplu) bacteriene
Sonicare Dezintegrare prin ultrasonicare Țesuturi animale, celule bacteriene
Măcinare Mojar cu pistil (măcinare cu nisip de Semințe de plante și rădăcini, țesuturi
cuarț sau cu azot lichid) animale, microorganisme
Celule de presiune Presiune înaltă (French Press) Microorganisme
Omogenizare Moară de dezintegrare cu bile de sticlă Microorganisme, șesuturi vegetale sau
(BeadBeater); dispozitiv de potterizare animale
În general, o cantitate adecvată de probă (de exemplu, celule de drojdii, celule animale sau seminţe de
plante) este suspendată în tamponul de liză, urmată de o sonicare într-o baie de gheaţă (3x10 secunde) şi în
continuare centrifugată (60 min, 42000 g, 15 oC); celulele de drojdie (120 mg), mieloblaste (5x10 8 celule)
sau de ţesuturi umane sau animale, cum ar fi ficatul sau inima (50-100 mg) ori seminţele (20 mg în cazul
legumelor, sau 50-100 mg, în cazul cerealelor) sunt omogenizate în azot lichid într-un mojar. Pulberea este
apoi suspendată într-un tampon de liză (1 ml), astfel încât concentraţia finală de proteine să se situează în
domeniul 5-10 mg/ml. Proteinele din ţesutul de natură vegetală (de exemplu, proteine din frunză) sunt
tratate la rece cu TCA/acetonă (-20oC) pentru a îndepărta compuşii fenolici: Frunzele sunt zdrobite într-un
mojar cu azot lichid, şi pulberea este concentrată prin resuspendare într-o soluţie pre-răcită (-20oC), de
acid tricloracetic, 10% sau de acetonă care conține 2-mercaptoetanol, 0,07%. Proteinele sunt lăsate să
precipite peste noapte la -20oC. După centrifugare, extractul se spală cu acetonă pre-răcită care conţine 2-
mercaptoetanol, 0,07%, iar în continuare supernatantul este îndepărtat, iar sedimentul se usucă în vid. De
asemenea, este posibil a se extrage în mod specific numai anumite fracţiuni de proteine, de exemplu,
proteine solubile în apă (albumine) sau solubile în alcool (gliadine) din cereale; înainte de focalizare aceste
extracte se diluează cu tampon de liză (Weiss et al 1992, 1993).
În majoritatea cazurilor, după liza celulelor, este necesar să se inactiveze o serie de compuși
interferenți (fenolii, în preparatele vegetale sau acizii nucleici în cele animale) şi să se elimine
componentele insolubile prin centrifugare. Fenolii din plante care au tendinţa de a adsorbi proteine şi
astfel pot să cauzeze profiluri proteice distorsionate pot fi eliminați fie prin precipitarea proteinelor cu acid
tricloracetic, 20%, prin solubilizare în acetonă rece/TCA, sau prin adsorbție specifică pe un pat de
polivinilpolipirolidonă.
Figura 3.72. Structura chimică a detergentului Nonidet P 40 (4-Nonil fenil-polietilen
glicol). Alte denumiri ale acestui compus: Imbentin-N/52 sau NP 40.

Dacă celulele conţin cantităţi mari de acizi nucleici, probele pot fi tratate cu un amestec de DNA-
ază/RNA-ază care nu conține proteaze. Aceste hidrolaze, dacă sunt prezente în probe, pot produce spoturi
artifactuale pe hărţile bidimensionale (2D) și din această cauză este adesea recomandat să se adăuge
inhibitori ale lor în tamponul de solubilizare, deși au fost elaborate și alte procedee de inactivare prin
precipitare a proteinelor cu acid tricloroacdetic (TCA) rece sau încubarea la fierbere în prezență de SDS a
probei. Astfel de inhibitori utilizați în 2D-PAGE sunt PMSF (figura 3.73A), Pefablocul (figura 3.73B),
EDTA, pepstatina (figura 3.73C), sau coctailurile de inhibitori de proteaze, având în vedere faptul că
astfel de reactivi pot modifica, de asemenea, proteinele şi astfel pot introduce artefacte de sarcină electrică.
Trebuie însă amintit că proteazele, de mai multe ori pot fi inactivate doar cu mare dificultate (Görg, 1998).
A B

Figura 3.73. Structurile chimice ale A, fenilmetilsulfonilfluorurii (PMSF); B, Pefabloc SC (4-(2-Aminoetil) benzen sulfonilfluorură
hidroclorică, sinonim AEBSF hidroclorură); C, pepstatinei (X-Val-Val-Statil-Ala-Statină).
După liza celulară şi inactivarea compușilor de interferenţă, proteinele trebuie să fie mai întâi,
solubilizate. Procedura de solubilizare utilizată pe scară largă este cea raportată de O'Farrell (1975) și
folosește un amestec de Nonidet-P40 (2%), uree (9 M), ditiotreitol (1%) şi 0,8% amfoliți transportori
(„tampon de liză”). Uneori, în locul detergentului neionic Nonidet-P40, se preferă detergentul neionic
Triton X-100 ori detergentul zwitterionic CHAPS. Deşi aceste metode în multe cazuri, dau rezultate
exelente nu toate complexele de proteine sunt complet disrupte de acest amestec.
Pe de altă parte, SDS, detergent anionic care perturbă cele mai multe dintre interacţiunile necovalente
ale proteinelor, nu poate fi aplicat gelurilor pregătite pentru focusare izoelectrică, deși s-a raportat
utilizarea sa într-o procedură de pre-solubilizare a probei înainte de migrarea electroforetică. În acest caz
proba proteică a fost tratată iniţial cu SDS (1%) şi apoi diluată cu cinci volume de tampon de liză pentru a-
l înlătura din amestecul de proteine, iar în continuare el fiind înlocuit cu un detergent neionic sau
zwitterionic; în aceste condiții proteinele se menţin într-o stare solubilă (Görg, 1998).
Pentru solubilizarea proteinelor hidrofobe, Rabilloud și colab. (1997) recomandă amestecuri de uree,
tiouree de tipul sulfobetainelor. În plus, extractele proteice nu trebuie să fie prea diluate pentru a se evita
pierderea de proteine din cauza adsorbţiei pe peretele vasului (de sticlă sau plastic), concentraţia minimă
nefiind mai mică de 0,1 mg/ml, cu un domeniu optim cuprins între 1 și 5 mg/ml. Dacă probele sunt diluate
şi conţin concentraţii relativ ridicate de săruri, care pot interfera în separarea proteinelor prin IEF, acestea
pot fi desalifiate. Alternativ, proteine pot fi precipitate cu TCA/acetonă pe gheaţă, pentru a se elimina
sărurile, solubile. În cazul în care se utilizează stripuri uscate de geluri de IEF care sunt reumflate în
soluţia de probă, se pot aplica direct probe diluate cu o concentraţie scăzută de săruri, fără un tratament
suplimentar. În acest ultim caz, se adaugă uree solidă, CHAPS şi DTT până la concentația dorită
(Rabilloud și alții, 1994).
Extractele proteice pot fi utilizate fie imediat, fie pot fi depozitate la -80oC, pentru un timp mai
îndelungat. Prin păstrare în frigider, la 4°C, depozitarea de scurtă durată de timp a extractelor proteice
(câteva ore până la o noapte). De asemenea, trebuie avut însă în vedere că îngheţarea şi dezgheţarea
repetată a probei poate conduce la denaturarea sa.
Pentru separări analitice, pe un strip de gel de IEF se aplică, de obicei, 20 µl soluţie de probă, în timp
ce pentru separări micropreparative se pot aplica până la câteva sute de microlitri de probă, cantitatea de
proteine încărcate pe un singur gel (cu o distanţă de separare de 180 mm) variind între 50-100 de µg
pentru o analiză cantitativă, respectiv 0,5-10 mg pentru separări micropreparative. Alternativ, proba poate
fi aplicată direct pe un gel rehidratat.
Probele care conţin uree nu trebuiesc încălzite deoarece prin acest proces termic se poate introduce o
heterogenitate considerabilă a sarcinii electrice datorită carbamoilării proteinelor de către izocianatul
format din descompunere la cald a compusului inițial. În plus, activitatea proteazelor aflate în probă poate
conduce uşor la degradarea proteinelor având ca rezultat apariția unor spoturi artifactuale cu greutate
moleculară mică. Astfel, probele trebuie să fie supuse la manipulări minime şi trebuie păstrate la rece, în
orice moment. Pe de altă parte, este posibil să se adăuge inhibitori de proteaze, cum ar fi fluorura de
fenilmetilsulfonil (PMSF), dar astfel de reactivi, pot induce de asemenea modificări structurale la nivelul
proteinelor şi care pot conduce la apariția unor rezultate artifactuale.
Se pot identifica patru categorii mari de probe. În cazul celulelor circulante (eritrocitele, leucocitele,
trombocitele) ori a celulelor crescute ”in vitro„ în suspensie de cultură, probele pot fi pur şi simplu
recoltate prin centrifugare; în continuare, se spală în soluţie de tampon fosfat salin (phosphate-buffered
saline - PBS) şi se tratează cu tamponul de solubilizare.
Celulele cultivate ca monostraturi pe substrat de sticlă sau plastic necesită, de asemenea, o mică
prelucrare. Astfel, în primă etapă mediul de cultură trebuie să fie aspirat, iar stratul de celule se spală cu
PBS pentru a minimiza contaminarea probei cu componentele din mediu, în special cu proteinele serice.
Stratul de celule este apoi fragmentat, după care se spală din nou cu PBS, iar celulele se recoltează prin
centrifugare. Utilizarea de enzime proteolitice pentru a elibera celulele ar trebui să fie evitată deoarece
acest proces conduce la degradarea proteinelor din probă. Alternativ, celulele din cultură pot fi lizate în
timp ce sunt încă ataşate la substrat prin adăugarea unui volum mic de tampon de solubilizare.
Probele care conţin niveluri ridicate de acizi nucleici trebuie să fie tratate prin adăugarea a unei zecimi
de volum de amestec DN-ază/RN-ază, fără proteaze (amestecul conţine DN-ază I (1mg/ml), RN-ază A
(500µg/ml), tampon Tris-HCl, 0,5 M care are în componență MgCl2, 50 mM, pH=7,00, după care se
incubează, la rece până când proba nu mai este vâscoasă (Garrels, 1979).
Majoritatea proteinelor vegetale pot fi tratate ca ţesuturile animale, după cu proteinele din frunze
trebuie să fie în primul rând extrase cu acetonă pentru a elimina pigmenţii fenolici.
3.8.2. PRINCIPIUL SEPARĂRII PROTEINELOR PRIN 2D-PAGE
Prima dimensiune a 2D PAGE implică separarea proteinelor prin IEF după tehnica descrisă de către
O'Farrell (1975) și care se realizează pe geluri cilindrice (T=3-5%), turnate în tuburi de sticlă capilare (cu
diametrul intern de 1-1,5 mm) sau pe stripuri. În mod uzual, gelurile conţin uree 8 M şi un detergent
neionic sau unul amfionic. Detergentul are de obicei o concentrație de 2% (masă/volum), aceasta putând fi
adesea redusă până la 0,5%, fără a se afecta modul de separare. Gelurile conțin de asemenea amfoliți
sintetici transportori care generează gradientul de pH-ul necesar procesului de separare într-o concentrație
de 2% (masă/volum). Din acest punct de vedere, sunt disponibili o varietate de amfoliți sintetici,
majoritatea acestora fiind potriviți în 2D PAGE.
 Ar trebui remarcat faptul că poate să apară o variabilitate considerabilă între loturile de amfoliți de la
acelaşi producător, iar acest lucru poate conduce la probleme în reproductibilitatea pe termen lung a
modelelor 2D; adesea este folosită o gamă amplă de amfoliți (pH 3-10), cu toate că, un amestec de
amfoliți dintr-un domeniu de pH=4-8 poate oferi, de multe ori, rezultate excelente după cum în gelurile
cilindrice utilizate în IEF, gradientul final de pH rareori se poate extinde peste 7,5.
A doua dimensiune poate fi realizată fie pe sisteme orizontale, fie pe sisteme verticale (Görg și colab.,
1988; 1995). Pentru set-up-urile orizontale, de laborator se pot utiliza geluri gata preparate ori geluri de
poliacrilamidă cu SDS (cu o grosime de 0,5 mm așezate pe un film GelBond PAG) care sunt plasate pe
placa de separare cu sistem de răcire a unităţii de electroforeză orizontală.
Gelurile de poliacrilamidă supuse anterior separării prin IEF echilibrate (figura 3.74), sunt plasate de-a
lungul gelului care va fi utilizat în a doua dimensiune. Scopul echilibrării gelurilor separate în primă
dimensiune prin focusare izoelectrică este cel de a pregăti proteinele focalizate pentru transferul lor în a
doua dimensiune a gelului de SDS-PAGE. Această operațiune implică incubarea timp de aproximativ 30
minute a gelului folosit la focusare într-o soluție tamponată care conține SDS, uree și glicerol, operațiune
necesară deoarece proteinele care au fost inițial separate pe baza sarcinii lor electrice intrinsece trebuie să
fie echilibrate cu un detergent anionic care oferă o sarcină electrică, obligatorie în cazul separării în cea de
a doua dimensiune (proteinele focalizate aflându-se la valorile lor de pI când sunt neîncărcate electric) și
pentru a se asigura că masa polipeptidică reprezintă caracteristica primară a separării în cea de a doua
dimensiune.

Figura 3.74. Echilibrarea gelurilor supuse focalizării izoelectrice în detergent

(SDS) (După Görg, 1998).

După cum s-a mai arătat, surfactantul anionic SDS este ales în acest scop, după cum el formează
complexe cu proteinele într-un raport de aproximativ 1,4 g SDS/g proteină, care supra-acoperă sarcina
intrinsecă a acestora, acordând o sarcină electrică net negativă complexelor SDS-proteină și dând astfel
polipeptidelor aproximativ aceeași formă hidrodinamică (Reynolds și Tanford, 1970). Prin urmare, prin
acest proces se asigură că toate polipeptidele posedă o mobilitate aproximativ egală atunci când se aplică
un câmp electric și în aceste condiţii, ele migrează ca anioni, efectul de cernere moleculară al
poliacrilamidei dând siguranța că vor fi rezolvate în primul rând pe baza greutății lor moleculare
(Laemmli, 1970; Crambach și Rodbard, 1971).
În timp ce greutatea moleculară a celor mai multe proteine poate fi aproximată în urma SDS-PAGE (cu
o abatere de ± 10%), în realitate, după cu am mai amintit, nu toate proteinele se leagă de SDS cu o
eficienţă egală (Segrest și Jackson, 1972; Kaufmann și colab., 1984). Din această cauză nu întotdeauna
masa moleculară detectată este în acord cu masa moleculară predicționată, motiv pentru care, greutățile
moleculare ale proteinelor determinate prin SDS-PAGE sunt menţionate sub formă aparentă (Mr).
Glicoproteinele care posedă în mod caracteristic o rază Stokes mare şi care sunt considerate heterogene
din cauza existenței unor substituții cu unităţi zaharidice sunt exemple clasice ale unor proteine care, de
multe ori, nu migrează în acord cu greutatea lor moleculară prezisă în geluri SDS-PAGE, ci au mai
degrabă tendinţa de a forma spoturi alungite vertical în gelurile 2D (Molloy și colab., 1997). În plus,
proteinele care sunt puternic modificate structural prin glicozilare, fosforilare, sau sulfatare pot avea o
eficiență scăzută în legarea SDS din cauza fenomenelor de respingere a sacinii electrice iar mobilităţile lor
sunt adesea mai mici decât cea aşteptate, ceea ce conduce la o greutate moleculară aparentă mai mare,
comparativ cu valoarea lor teoretică determinată teoretic (Herbert și colab., 1997).
Un al doilea scop important al treptei de echilibrare este cel de a pregăti proteinele pentru un transfer
eficient din gelul din dimensiunea de focusare izoelectrică și cel de SDS-PAGE. Acest proces se
realizează prin resolubilizarea proteinelor aflate la valoarea lor de pI din gelul de focalizare și prin
minimizarea fluxului endoosmotic din timpul transferului proteinelor între cele două dimensiuni gel.
(Görg și colab., 1985; Görg și colab., 2000). În general, soluţia standard de echilibrare constă în SDS
(2%), uree (6 M), glicerol (20%), şi Tris-HCl, 0,375 M (pH=8,8). În final, este o practică comună în a
realizarea unor reduceri sau alchilări a proteinelor înaintea transferului lor în gelul din a doua dimensiune.
 Reducerea este de obicei realizată cu ditiotreitol (DTT, 1%) care se adaugă la soluţia de echilibrare
timp de 15 minute iar alchilarea se produce prin înlocuirea DTT cu iodoacetamidă, în concentrație de 2,5-
3% (timp de 15 minute). Acest proces oferă o îmbunătăţite a solubilității proteinelor prin minimizarea
agregării polipeptidelor care s-ar putea produce în mod normal, prin formarea de legături disulfurice. În
plus, s-a dovedit că treapta de alchilare a proteinelor conduce la reducerea, până la eliminare a unor puncte
artifactuale, rezultate la colorația cu argint și cauzate de excesul de DTT (utilizat în etapa de echilibrare
pentru resolubilizarea proteinelor). S-a demonstrat de asemenea că agenţi de tipul tributil fosfinei,
îmbunătăţesc solubilizarea şi transferul unor proteine hidrofobe filamentoase de tipul keratinelor din lână
(Herbert și colab., 1998), după cum compusul nu reacţionează cu reactivii frecvent utilizați (cum ar fi
iodoacetamida şi acrilamida). Astfel, faza de echilibrare poate fi efectuată într-o singură etapă, în cazul în
care agentul reducător şi agentul alchilant sunt combinați, deși uneori, timpii de incubare suplimentari în
soluţia de echilibrare din etapa de alchilare ajută la o resolubilizare eficientă a proteinelor din gelul de
focalizare izoelectrică.
Într-adevăr, un timp de echilibrare prelungit (până la 45 minute) îmbunătăţește eficienţa transferului
unor proteine transmembranare, hidrofobe, deși este important de remarcat, că odată cu prelungirea
timpului de echilibrare există un risc crescut ca proteinele să difuzeze în gel (Molloy și McDowell, 2005).
Figura 3.75. Transferul gelurilor de poliacrilamidă supuse anterior
separării prin focalizare izoelectrică pe suprafaţa gelurilor încărcate
cu SDS în sistem orizontal (după Görg, 1998).

De altfel, la începutul deceniului întâi, au fost publicate o serie de articole care au evidenţiat posibilele
avantaje ale alchilării probei înainte de efectuarea separării prin focalizare izoelectrică (Herbert și colab.,
2001; Galvani și colab., 2001a; Galvani și colab., 2001b; Herbert și colab., 2003). Avantajele se centrează
pe diminuarea reactivităţii resturilor de cisteină, în scopul reducerii numărul de izoforme proteice false
care ar putea conduce la formarea unor legături disulfurice și la reasamblări alterate (Gehanne și colab.,
2002; Sebastiano și colab., 2003). Aceste observații au condus la introducerea unor noi agenți alchilanţi
reactivi în cercetarea proteomică care furnizează date suplimentare și care permit cuantificarea proteinelor
în geluri 2-D, prin utilizarea unor markeri de izotopi stabili şi a metodelor de spectrometrie de masă
(Sebastiano și colab., 2003; Olsson și colab., 2002).
În 2-D PAGE, set-up-rile orizontale sunt perfect adaptate pentru utilizarea de geluri gata de utilizare
realizate pe suporturi de film GelBond PAG (figura 3.75), după cum în configurarea verticală (figura
3.76), gelurile supuse anterior separării prin focalizare izoelectrică, după echilibrare, sunt plasate pe partea
de sus a gelurilor SDS verticale şi integrate intim cu ajutorul unui gel de agaroză.

Figura 3.76. Transferul gelurilor de poliacrilamidă supuse anterior

separării prin focalizare izoelectrică pe suprafaţa gelurilor care conțin
SDS în sistem vertical (după Görg, 1998).
 3.8.3. AVANTAJELE ȘI LIMITĂRILE ELECTROFOREZEI BIDIMENSIONALE
Aşa cum s-a mai menţionat, 2D-PAGE cuprinde focalizarea izoelectrică în prima dimensiune, urmată
de SDS-PAGE în cea de a doua dimensiune. De la introducerea sa de către Kolin (1954), focusarea
izoelectrică a suferit mai multe îmbunătățiri. La început, prima dimensiune se realiza în geluri de
poliacrilamidă formate în tuburi de sticlă sau material plastic şi care conţineau amfoliți care formau un
gradient de pH într-un câmp electric. Aceste sisteme au fost considerate istoric ireproductibile, instabile, şi
greu de manipulat. Introducerea gradienţilor de pH imobilizat de către Bjellqvist și colab. (1982a) a avut
un impact semnificativ asupra utilizării IEF pentru separarea amestecurilor complexe într-o gamă largă de
pH. Gradienţii de pH imobilizat au permis formarea unor pante stabile şi reproductibile de pH, capabile de
a concentra proteine acide ori bazice pe un gel unic pregătit cu gradient larg de pH. În izofocusare cu
gradienţi de pH imobilizați, amfoliții transportori sunt ataşați la moleculele de acrilamidă și înglobați în
geluri formând un gradient fix de pH. Fixarea gradientului împiedică deriva gelului şi de asemenea asigură
o exprimare eficientă şi reproductibilă (Pedersen și colab., 2003).
Utilizarea unui domeniu îngust de gradient de pH a permis separarea unui număr mult mai mare de
proteine comparativ cu cele obținute în cazul 2D-PAGE standard, deoarece o gamă mai restrânsă a pH-
ului conduce la o răspândire pe o distanţă fizică mai mare a proteinelor separate.
Avantajele electroforezei 2D în studiile de proteomică care nu sunt uşor furnizate prin abordări
alternative includ (Molloy și McDowell, 2005):
(1) maturitatea metodologiei;
(2) accesibilitatea;
(3) înaltul transfer de probă;
(4) detectarea unor proteine post-translațional modificate, inclusiv proteine fosforilate sau glicozilate;
(5) detectarea unor fragmente de proteine.
Pe de altă parte, cu toate dezvoltările tehnice ulterioare, este important să se recunoască limitele
electroforezei 2D în proteomică, abordare crucială pentru ca experimentele să poată fi proiectate într-un
mod corespunzător (Molloy și McDowell, 2005). Aceste limitări includ:
(1) dificultăţile în separarea proteinelor prin focusare izoelectrică la valori extreme ale pH-ului (<3,
>10), mai ales în cazul proteinelor bazice, care reprezintă o proporție semnificativă din proteomul
predicționat total la cele mai multe organisme eucariote. Astfel, din cauza efectelor electroendosmotice, a
migrării agenţilor reducători, precum ditiothreitolul şi datorită potenţialei hidrolize a acrilamidei la valori
bazice de pH, proteinele bazice au tendinţa de a forma dungi pronunţate, mai degrabă decât pete discrete
(Bae și colab., 2003). Aceste efecte pot fi parţial depăşite prin alimentarea continuă cu DTT în timpul
focalizării izoelectrice, combinat cu includerea de glicerol sau izopropanol pentru a suprima
electroendosmoza (Gorg și colab., 1995; Hoving și colab., 2002), ori prin folosirea unor alți agenți care
impiedica reformarea punților disulfitice (Olsson și colab., 2002).
(2) dificultăţi cu separarea prin focusare izoelectrică a proteinelor membranare, hidrofobe (Wilkins și
colab., 1998; Molloy, 2000; Santoni și colab., 2000);
(3) dificultăţi la separarea proteinelor foarte mici (<10 kDa) sau extrem de mari, cu mase moleculare
mai mari de 200 kDa;
(4) o insuficientă sensibilitate a detecției proteinelor. O provocare majoră pentru toate tehnicile de
proteomică este cea de dezvoltare a unor abordări analitice pentru a face faţă gamei dinamice mare a
proteinelor de expresie. Gama dinamică liniară de exprimare pentru proteinele din țesutul viu, este în
intervalul a şase ordine de mărime (Corthals și colab., 2000), în timp ce în serul sanguin acest interval este
chiar mai mare, apropiindu-se de un ordin de mărime cu o magnitudine egală cu nouă (Anderson și
Anderson, 2002). În aceste condiții, cu o gamă dinamică de 103-104, gelurile 2D se confruntă cu limitări în
capacitatea lor de a construi un inventar complet al proteomulului (Rabilloud, 2002). A fost sugerată de
exemplu, o prefracţionare celulară/subcelulară a probei ulitizând metode precum imunoizolarea,
electromigrarea (de exemplu, prin electroforeză în flux liber), citometria de flux, izolarea organitelor sau a
mitocondriilor (Fountoulakis și colab., 2002; Kernec și colab., 2001), izolarea unor membrane prin
gradient de densitate (Görg și colab., 2000) ori extracţia diferenţial-secvenţială, folosind o serie de reactivi
cu rol în creşterea solubilității (Molloy și colab., 1998). Amestecurile de proteine pot fi de asemenea
subfracționate prin tehnici tradiționale de cromatografie, cel mai adesea de fază inversă, de schimb ionic,
gelfiltrare, cromatografie de afinitate ori cromatofocusare (McGregor și Dunn, 2003).
 3.8.4. VARIANTE ALE ELECTROFOREZEI BIDIMENSIONALE
S-a constatat că prin aplicarea electroforezei bidimensionale clasice, o serie de informații referitoare la
interacțiile funcționale proteină-proteină sunt pierdute, mai ales în prima dimensiune datorită utilizării
unor denaturanți puternici, caracteristici IEF. O altă limitare este dată de faptul că proteinele membranare
hidrofobe tind să se agrege sau să precipite în timpul procesării în prima dimensiune și astfel vor fi sub-
reprezentate în al doilea gel. Din acerată cauză s-au elaborat o serie de tehnici bidimensonale dintre care o
serie o vom aminti în continuare.
3.8.4.1. Electroforeza bidimensională pe geluri de poliacrilamidă în sistem BN/SDS
Claeys și colaboratorii (2005) au dezvoltat o metodă BN-PAGE bidimensională (2-D Blue-
Native PAGE) în analiza subproteomului elementelor plachetare. Plachetele joacă un rol esențial
în hemostază iar adeziunea lor la matrix-ul extracelular subendotelial urmată de activarea rapidă
a acestora induce reacții procoagulante la suprafață și la formarea cheagului hemostatic. În plus,
plachetele activate secretă factori de coagulare și proteine de adeziune, alături de chemokine și
factori de creștere din granulele de stocare care sunt implicați în condițiile proliferative ori
inflamatorii precum remodelarea tisulară și cicatrizarea rănilor ori în evoluția proceselor
aterogenice (Ruggeri, 2002; Savage și colab., 2001). De altfel, ocluzii trombotice ale arterelor
plachetar-mediate se dezvoltă ca și complicații ale aterosclerozei și reprezintă cauza curentă a
anginei pectorale instabile, a infarctului miocardic, a accidentelor vasculare și a complicațiilor
după angioplastia percutanoasă (Ruggeri, 2002).
După cum s-a discutat în subcapitolul 3.6.11.1, electroforeza în prezență de CBB s-a
dezvoltat în studiul complexelor membranare proteice mitocondriene (Schägger și colab., 1994;
Schägger și colab., 1996). Utilizând această tehnică, proteinele de membrană sunt solubilizate
într-un detergent nonionic iar complexele proteină-proteină native sunt rezolvate într-o primă
dimensiune prin PAGE în condiții nedenaturante în acord cu masele lor moleculare aparente, în
prezență de CBB. Separarea prin SDS-PAGE în a doua dimensiune denaturează complexele și le
separă în subunitățile lor componente. Astfel, prin utilizarea acestei proceduri, s-au identificat 63
de proteine plachetare după digestia triptică în-gel a 58 de spoturi proteice selectate, urmată de
cromatografie lichidă cuplată în tandem cu spectrometria de masă. Nouă proteine s-au detectat
pentru prima dată prin abordarea proteomică a plachetelor sanguine. De asemenea s-a arătat că
această tehnologie rezolvă eficient o serie de complexe multiproteice de membrană ori citosolice
cunoscute (Claeys și colab., 2005).
Aplicarea acestei metode la analiza elementelor plachetare conduce la un sistem de analiză
convenabilă în cercetarea proteinelor de membrană la fel și a celor citosolice precum și la
identificarea unor complexe probabile.
Electroforeza BN/SDS pe geluri de poliacrilamidă este astfel o procedură valabilă în analiza
specifică a subproteomului plachetar precum și a fracției de proteine membranare (sau legate de
membrană) prin spectrometrie de masă și imunoblotting fiind relevantă în studiul interacțiilor
proteină-proteină generate de activarea plachetară. În plus, 2-D BN-PAGE poate fi utilizată în
continuare la studiul expresiei și dinamicilor asamblării subunităților intrinseci ale complexelor
de proteine membrane în sisteme de expresie ”in vitro”.
3.8.5.2. Electroforeza bidimensională pe geluri de poliacrilamidă în sistem BAC/SDS
Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în prezență de clorură de benzildimetil-n-
hexadecilamoniu (BAC-PAGE) a fost dezvoltată de Macfarlane (1983; 1989) pentru separarea
proteinelor alcalino-labile şi introdusă către Hartinger și colab. (1996), pentru separarea
proteinelor membranare integrale. În ceea ce priveşte separarea proteinelor hidrofobe această
metodă reprezintă o alternativă potrivită la 2D-PAGE convenţională (Klose, 1975; O'Farell,
1975; Zahedi și colab., 2005). Detergentul cationic clorură de benzildimetil-n-hexadecilamoniu
(figura 3.77.) este utilizat într-un sistem acid de PAGE discontinuă (pH=4,0-1,5). Combinația
16-BAC și SDS a fost inițial utilizată în studiul proteomului integral a membranelor veziculare și
la studiul clathrin-ei veziculare (Hartinger și colab., 1996). Proteinele au proprietăţi de migrare
uşor diferite în sistemele BAC-PAGE şi în SDS-PAGE, motiv pentru care încă nu a fost în mod
clar verificate, dar se pare că în cazul unor proteine extrem de încărcate acestea au tendinţa de a
lega mai mult BAC decât SDS (Macfarlane, 1989). Cum cei doi detergenți au proprietăți
intrinseci de legare la proteină, s-a obținut o separare îmbunătățită a tehnicii dublu-SDS (Braun
și colab., 2007).

Figura 3.77. Structura chimică a detergentului cationic clorură de

benzildimetil-n-hexadecilamoniu (BAC, 16-BAC) utilizat în BAC/SDS
PAGE.
 Original, tehnica 16-BAC-PAGE s-a bazat pe un sistem de tampoane fosfat de potasiu
(Macfarlane, 1983). În continuare, puterea de rezolvare a sistemului s-a îmbunătățit prin
optimizarea concentrației de BAC și prin introducerea sistemului de tamponare acid
metoxiacetic/acid acetic (Kramer, 2006). Mai târziu o altă îmbunătățire care a condus la
creșterea rezoluției BAC/SDS-PAGE a implicat utilizarea gelurilor BAC subțiri (Wenge și
colab., 2008; Ivanov și Lazarev, 2011). Complexele detergent-proteină încărcate pozitiv vor
migra spre catod şi sunt separate în funcţie de greutatea lor moleculară. Acest efect poate fi
exploatat prin aplicarea unei tehnici bidimensionale combinate BAC/SDS-PAGE. Astfel, o
rezoluţie superioară poate fi realizată evitând focalizarea izoelectrică din abordarea 2D-PAGE,
convenţională, principalul inconvenient fiind subreprezentarea proteinelor hidrofobe în geluri 2D
(http://biotech.szbk.u-szeged.hu).
Proteinele hidrofobe, precum proteinele legate de membrană, se separă într-o primă
dimensiune pe un gel acid la un pH=2,1 în prezenţa detergentului cationic 16-BAC, când
pironina Y (figura 3.78) este utilizată drept marker de migrare electroforetică și de finalizare a
separării. Urmează apoi o electroforeză în prezență de SDS (Langen și colab., 2000). O rezoluţie
decentă se va obține dacă profilul de separare în 16-BAC diferă diferă în mod substanţial față de
cel obținut în prezențșă de SDS (Westermeier, 2005).

Figura 3.78. Structura chimică a compusului Pironină Y,

utilizat ca marker de migrare și finalizare a separării în BAC-
PAGE.

Sistemul 16-BAC/SDS-PAGE a fost utilizat la separarea fracțiilor de proteine membranare

din frunze de orz (Kramer, 2006). Analizele de spetrometrie de masă MALDI-TOF-TOF
utilizate în analiza spoturilor au identificat o abundență de proteine și de proteine asociate cu
membrana în timp ce analizele LC-MS/MS a spoturilor obținute în urma BAC/SDS-PAGE a
condus la identificarea a 42 de proteine integral membranare din mitocondrie de drojdie (Zahedi
și colab., 2005) ori a 12 proteine integrale de membrană din sinapsele de șobolan (Coughenour
și colab., 2004).
Se mai poate reaminti că un alt detergent cationic, CTAB, a fost combinat cu SDS-PAGE
pentru analiza proteinelor din membrane celulelor T (Helling și colab., 2006).
3.8.5.3. Gel-electroforeza bidimensională virtuală
Gel-electroforeza bidimensională (2-D) virtuală (Ogorzalek Loo și colab., 1996; Ogorzalek
Loo și colab., 1997; Loo și colab., 1999; Ogorzalek Loo și colab., 2001; Walker și colab., 2001;
Iyer și Olivares, 2003) se bazează pe combinarea separării prin focalizare izoelectrică ca primă
dimensiune pe geluri de poliacrilamidă (figura 3.79) combinată cu spectrometria de
desorbție/ionizare de masă, matrix-asistată de (MALDI-MS) prin scanarea gelului uscat şi s-a
dezvoltat ca o provocare a analizei modificărilor post-translaționale a proteinelor (Ogorzalek Loo
și colab., 2004).
În acest proces, se poate crea un gel bidimensional prin generarea unei imagini asemănătoare
celei obținute după electroforeză bidimensională pe gel de poliacrilamidă dar unde separarea în
cea de a doua dimensiune (bazată pe masa moleculară) este înlocuită de spectrometria de masă.
Dimensiunea de spectrometrie de masă furnizează o acuratețe îmbunătățită a masei și o rezoluție
crescută într-un format direct legat de analizele clasice 2-D PAGE. Această legătură directă este
realizată prin metoda virtuală 2-D care utilizează geluri cu gradient de pH imobilizat înalt
reproductibile folosite în 2-D PAGE clasică, după cum scale de pI identice sunt livrate prin cele
două metode, facilitând compararea.
 Figura 3.79. Gel de poliacrilamidă după focalizare izoelectrică (pH 4–7) a
lipoproteinelor de densitate mare umane (HDL) colorate cu argint. (După Ogorzalek Loo
și colab., 2004).

Gel-electroforeza virtuală bidimensională are aplicații în immunoblottare, chimia în gel,

degradarea Edman, cartarea spectrometrică de masă a peptidelor și în analizele/procesările de
imagini. De exemplu, particulele de lipoproteine înaltă densitate (HDL) oferă un sistem excelent
de testare, deoarece procesele de glicozilare, fosforilare, de trunchiere, clivajele peptidelor
semnal, scindările pro-peptidice, reacţiile de sulfatare, de acilare cu acizi graşi precum şi cele de
splitări alternative sunt stabilite pentru toate apolipoproteinele (Duchateau și colab., 2001;
Schindler și colab., 1995; Lemieux și colab., 1995; Vukmirica și colab., 2003; Zhao și colab.,
2000). Acilarea cu palmitat sau palmitoleat (Lemieux și colab., 1995; Vukmirica și colab., 2003;
Zhao și colab., 2000; Fisher şi Gurin, 1964; Hoeg și colab., 1986; Hoeg și colab., 1988) sunt, în
principiu, detectabile pe aceste geluri, pe baza observaţiilor obţinute pe gelurile virtuale 2-D ale
proteolipidelor mulI şi osmE separate din extracte de Escherichia coli, (Ogorzalek Loo și colab.,
2001; Ogorzalek Loo și colab., 2004). În acest context, apolipoproteinele, particulele care
furnizează schelul pe care lipoproteinele sunt asamblate, și care participă în metabolismul lipidic
fizic ori enzimatic sunt în relație cu bolile cardiovasculare. De exemplu, în cazul HDL plasmatic
nivelurile acestora sunt invers corelate cu maladia coronariană prematură, fiind astfel studiat cu
un interes continuu (Abelson și Simon, 1996). În ciuda acestui interes, mecanismele prin care
HDLs protejează împotriva aterosclerozei nu sunt pe deplin înţelese. Din această cauză, gel-
electroforeza bidimensională virtuală reprezintă o direcție nouă în cercetarea biomedicală.
Sinergia cu alte tehnologii, atât analitice cât și preparative oferă acestei noi tehnici multe
facilități în cercetarea biochimică. Aceste studii extind metodele virtuale 2-D la proteinele
umane, cu scopul de a acoperi utilizarea lor în sisteme cu o serie de modificări (Loo Ogorzalek și
colab., 2004).
Bibliografie
Abelson, J. N., Simon, M. I. Plasma lipoproteins. Part C. Quantification. In: Bradley WA, Gianturco SH, Segrest
JP, eds. Methods Enzymol. San Diego: Academic Press, Vol. 263, pag. 1–364, 1996.
Anderson, L., Anderson, N.G. (1977) High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5421-5425.
Anderson, N. L., Anderson, N. G. (2002) The Human Plasma Proteome. Mol. Cell. Proteomics 1:845-867.
Bae, S. H., Harris, A. G., Hains, P. G., Chen, H., Garfin, D. E., Hazell, S. L., Paik, Y. K., Walsh, B. J., Cordwell,
S. J. (2003) Strategies for the enrichment and identification of basic proteins in proteome projects. Proteomics 3:569–
579.
Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P. G., Gianazza, E., Gorg, A., Postel, W., Westermeier, R. (1982) Isoelectric
focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. J. Biochem. Biophys. Methods
6:317-339.
Braun, R. J., Kinkl, N., Beer, M., Ueffing, M. (2007) Two-dimensional electrophoresis of membrane proteins.
Anal Bioanal Chem. 389:1033-1045
Claeys, D., Geering, K., Meyer, B. J. (2005) Two-dimensional Blue Native/sodium dodecyl sulfate gel
electrophoresis for analysis of multimeric proteins in platelets. Electrophoresis 26:1189–1199.
Corthals, G. L., Molloy, M. P., Herbert, B. R., Williams, K. L., Gooley, A. A. (1997) Prefractionation of protein
samples prior to two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 18:317-323.
 Corthals, G. L., Wasinger, V. C., Hochstrasser, D. F., Sanchez, J.C. (2000) The dynamic range of protein
expression: a challenge for proteomic research. Electrophoresis 21:1104–1115.
Coughenour, H. D., Spaulding, R. S., Thompson, C. M. (2004) The synaptic vesicle proteome: a comparative
study in membrane protein identification. Proteomics. 4:3141-3155
Crambach, A., Rodbard, D. (1971) Polyacrylamide gel electrophoresis. Science 172:440-451.
Duchateau, P. N., Pullinger, C. R., Cho, M. H., Eng, C., Kane, J. P. (2001) Apolipoprotein L gene family: tissue-
specific expression, splicing, promoter regions; discovery of a new gene. J. Lipid Res. 42:620–630.
Dunn, M. J., Corbett, J. M. (1996) Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Methods Enzymol.
271:177- 203.
Fisher, W. R., Gurin, S. (1964) Structure of lipoproteins: covalently bound fatty acids. Science 143:362–363.
Fountoulakis, M., Berndt, P., Langen, H., Suter, L. (2002) The rat liver mitochondrial proteins. Electrophoresis
23:311–328.
Galvani, M., Hamdan, M., Herbert, B., Righetti, P. G. (2001 a) Alkylation kinetics of proteins in preparation for
two-dimensional maps: a matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry investigation. Electropboresis
22:2058-2065.
Galvani, M., Rovatti, L., Hamdan, M., Herbert, B., Righetti, P. G. (2001 b) Protein alkylation in the
presence/absence of thiourea in proteome analysis: a matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass
spectrometry investigation. Electrophoresis 22:2066-2074.
Garrels, J. I. (1979) Two dimensional gel electrophoresis and computer analysis of proteins synthesized by clonal
cell lines. J. Biol. Chem. 254:7961-7977.
Gehanne, S., Cecconi, D., Carboni, L., Righetti, P. R., Domenici, E., Hamdan, M. (2002) Quantitative analysis of
two-dimensional gel-separated proteins using isotopically marked alkylating agents and matrix-assisted laser
desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spec. 16:1692-1698.
Görg, A. Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins using Immobilized pH Gradients. A Laboratory Manual,
1998, http://www.weihenstephan.de/blm/deg
Görg, A., Boguth, G., Obermaier, C., Posch, A., Weiss, W. (1995) Two-dimensional polyacrylamide gel
electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension (IPG-Dalt): The state of the art and the
controversy of vertical versus horizontal systems. Electrophoresis 16:1079-1086.
Görg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Csordas, A., Diaz, J. J., Madjar, J. J. (1997) Very alkaline immobilized pH
gradients for two-dimensional electrophoresis of ribosomal and nuclear proteins. Electrophoresis 18:328-337.
Görg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Harder, A., Scheibe, B., Wildgruber, R., Weiss, W. (2000) The current state
of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 21:1037-1053.
Görg, A., Postel, W., Günther, S. (1988) The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized
pH gradients. Electrophoresis 9:531-546.
Görg, A., Postel, W., Gunther, S., Weser, J. (1985) Improved horizontal two-dimensional electrophoresis with
hybrid isoelectric focusing in immobilized pH gradients in the first dimension and laying-on transfer to the second
dimension. Electrophoresis 6:599-604.
Görg, A., Postel, W., Weser, J., Günther, S., Strahler, S. R., Hanash, S. M., Somerlot, L. (1987) Elimination of
point streaking on silver stained two-dimensional gels by addition of iodoacetamide to the equilibration buffer.
Electrophoresis 8:122-124.
Hartinger, J., Stenius, K., Hogemann, D., Jahn, R. (1996). 16-BAC/SDS PAGE: a two-dimensional gel
electrophoresis system suitable for the separation of integral membrane proteins. Anal Biochem 240:126-133.
Helling, S., Schmitt, E., Joppich, C., Schulenborg, T., Müllner, S., Felske-Müller, S., Wiebringhaus, T., Becker,
G., Linsenmann, G., Sitek, B., Lutter, P., Meyer, H. E., Marcus, K. (2006) 2-D differential membrane proteome
analysis of scarce protein samples. Proteomics. 6:4506-4513.
Herbert, B. R., Molloy, M. P., Gooley, A. A., Walsh, B. R., Bryson, W. G., Williams, K. L. (1998) Improved
protein solubility in two-dimensional electrophoresis using tributyl phosphine as reducing agent. Electrophoresis
19:845-851.
Herbert, B. R., Molloy, M. P., Yan, J. X., Gooley, A. A., Bryson, W. G., Williams, K. L. (1997) Characterisation
of wool intermediate filament proteins separated by micropreparative two-dimensional electrophoresis.
Electrophoresis 18:568-572.
Herbert, B., Galvani, M., Hamdan, M., Olivieri, E., MacCarthy, J., Pedersen, S., Righetti, P. G. (2001) Reduction
and alkylation of proteins in preparation of two-dimensional map analysis: why, when, and how? Electrophoresis
22:2046-2057.
Herbert, B., Hopwood, F., Oxley, D., McCarthy, J., Laver, M., Gringer, L., Goodall, A., Williams, K., Castagna,
A., Righetti, P. R. (2003) Beta-elimination: an unexpected artifact in proteome analysis. Proteomics 3:826-831.
Hoeg, J. M., Meng, M. S., Ronan, R., Demonsky Jr., S. J., Fairwell, T., Brewer Jr., H. B. (1988) Apolipoprotein B
synthesized by Hep G2 cells undergoes fatty acid acylation. J. Lipid. Res. 29:1215–1220.
Hoeg, J. M., Meng, M. S., Ronan, R., Fairwell, T., Brewer Jr., H. B. (1986) Human preproapolipoprotein C-II.
Analysis of major plasma isoforms. J. Biol. Chem. 261:3911–3914.
Hoving, S., Gerrits, B., Voshol, H., Muller, D., Roberts, R.C. and van Oostrum, J. (2002) Preparative two-
dimensional gel electrophoresis at alkaline pH using narrow range immobilized pH gradients. Proteomics 2:127–134.
 Hoving, S., Voshol, H., van Ostrum, J. (2000) Towards high performance two-dimensional gel electrophoresis
using ultrazoom gels. Electrophoresis 21:2617-2621.
http://biotech.szbk.u-szeged.hu/bioinf/proteom_kieg/BACPAGE.htm
http://www.biochemistry.ucla.edu/biochem/Faculty/268/PDFS/JL.4063.pdf
Issaq, H. J., Veenstra, T. D. (2008) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE): advances
and perspectives. BioTechniques 44:697-700.
Ivanov, A. R., Lazarev, A. V. Sample Preparation in Biological Mass Spectrometry. Springer Dordrecht
Heidelberg London New York, Springer Science +Business Media B.V., 2011. http://books.google.ro/books?id=
MyzL73QPFLIC&pg=PA419&lpg=PA419&dq=Scheme+of+a+2D+BAC-SDS-PAGE&source=bl&ots=n6kaohh
VJp&sig=B3QQDhzKWwUp9-8OEgPnkWlHfTA&hl=ro&sa=X&ei=g3-eT_vrHoag-wa6xsH6Dg&ved=0CFIQ6A
EwBA#v=onepage&q=Scheme%20of%20a%202D%20BAC-SDS-PAGE&f=false
Iyer, S., Olivares, J. (2003) Trypsin digestion of proteins on intact immobilized pH gradient strips for surface
matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis. Rapid Comm. Mass Spectrom.
17:2323–2326.
Kaufmann, E., Geisler, N., Weber, K. (1984) SDS-PAGE strongly overestimates the molecular masses of the
neurofilament proteins. FEBS Lett. 170:81-84.
Kernec, F., Unlu, M., Labeikovsky, W., Minden, J. S., Koretsky, A. P. (2001) Changes in the mitochondrial
proteome from mouse hearts deficient in creatine kinase. Physiol. Genom. 6:117–128.
Klose, J. (1975). Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel
approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26:231-243.
Kolin, A. (1954) Separation and concentration of proteins in a pH field combined with an electric field. J. Chem.
Phys. 22:1628-1629.
Kramer, M. L. (2006) A new multiphasic buffer system for benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride
polyacrylamide gel electrophoresis of proteins providing efficient stacking. Electrophoresis. 27:347-356.
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature (London) 227:680-685.
Langen, H., Takács, B., Evers, S., Berndt, P., Lahm, H.-W., Wipf, B., Gray, C., Fountoulakis, M. (2000) Two-
dimensional map of the proteome of Haemophilus influenzae. Electrophoresis 21:411-429.
Lemieux, J., Giannoulis, S., Breckenridge, W. C., Mezei, C. (1995) Post-translational modifications of
apolipoprotein A-I and Po proteins in the avian peripheral nerve. Neurochem. Res. 20:269–278.
Loo, J. A., Brown, J., Critchley, G., Mitchell, C., Andrews, P. C., Ogorzalek Loo, R. R. (1999) High sensitivity
mass spectrometric methods for obtaining intact molecular weights from gel-separated proteins. Electrophoresis
20:743–748.
Macfarlane, D. E. (1983). Use of benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride ("16-BAC"), a cationic
detergent, in an acidic polyacrylamide gel electrophoresis system to detect base labile protein methylation in intact
cells. Anal Biochem 132:231-235.
Macfarlane, D. E. (1989). Two dimensional benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride-sodium dodecyl
sulfate preparative polyacrylamide gel electrophoresis: a high capacity high resolution technique for the purification of
proteins from complex mixtures. Anal Biochem 176:457-463.
Manabe, T., Tachi, K., Kojima, K., Okuyama, T. (1979) Two-dimensional electrophoresis of plasma proteins
without denaturing agents. J. Biochem. (Tokyo) 85:649-659.
McGregor, E., Dunn, M. J. (2003) Proteomics of heart disease. Hum. Mol. Gen. 12:R135–R144.
Molloy, M. P. (2000) Two-dimensional electrophoresis of membrane proteins using immobilized pH gradients.
Anal. Biochem. 280:1-10.
Molloy, M. P., Bolis, S., Herbert, B. R., Ou, K., Tyler, M. I., van Dyk, D. D., Willcox, M. D., Gooley, A. A.,
Williams, K. L., Morris, C. A., Walsh, B. J. (1997) Establishment of the human reflex tear two-dimensional
polyacrylamide gel electrophoresis reference map: new proteins of potential diagnostic value. Electrophoresis
18:2811-2815.
Molloy, M. P., Herbert, B. R., Walsh, B. J., Tyler, M. I., Sanchez, J.-C., Hochstrasser, D. F., Williams, K. L.,
Gooley, A. A. (1998) Extraction of membrane proteins for two-dimensional electrophoresis by differential solubility.
Electrophoresis 19:837-844.
Molloy, M. P., McDowell, M. T. Handbook of Isoelectric Focusing and Proteomics. 6. Two-dimensional gel
electrophoresis. D. Garfin and S. Ahuja, editors. Elsevier Inc. pag. 123-145, 2005.
O’Farrell, P. H. (1975) High-resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250:4007-
4021.
Ogorzalek Loo, R. R., Cavalcoli, J. D., VanBogelen, R. A., Mitchell, C., Loo, J. A., Moldover, B., Andrews, P. C.
(2001) Virtual 2-D gel electrophoresis: visualization and analysis of the E. coli proteome by mass spectrometry. Anal.
Chem. 73:4063–4070.
Ogorzalek Loo, R. R., Mitchell, C., Stevenson, T. I., Martin, S. A., Hines,W., Juhasz, P., Patterson, D., Peltier, J.,
Loo, J. A., Andrews, P. C. (1997) Sensitivity and mass accuracy for proteins analyzed directly from polyacrylamide
gels: implications for proteome mapping. Electrophoresis 18:382–390.
 Ogorzalek Loo, R. R., Mitchell, C., Stevenson, T., Loo, J. A., Andrews, P. C. in: Marshak, D.R. (Ed.), Techniques
in Protein Chemistry VII, Academic Press, San Diego, CA 1996, pp. 305–313.
Ogorzalek Loo, R. R., Yam, L., Loo, J. A., Schumaker, V. N. (2004) Virtual two-dimensional gel electrophoresis
of high-density lipoproteins. Electrophoresis 25:2384-2391.
Olsson, I., Larsson, K., Palmgren, R., Bjellqvist, B. (2002) Organic disulfides as a means to generate streak-free
two-dimensional maps with narrow range basic immobilized pH gradient strips as first dimension. Proteomics
2:1630–1632.
Pedersen, S. K., Harry, J. L., Sebastian, L., Baker, J., Traini, M. D., McCarthy, J. T., Manoharan, A., Wilkins, M.
R., Gooley, A. A., Righetti, P. G., Packer, N. H., Williams, K. L., Herbert, B. R. (2003) Unseen proteome: mining
below the tip of the iceberg to fiind low abundance and membrane proteins. J. Proteome Res. 2:303-311.
Pipkin, J., Anson, J. F., Hinson, W. G., Burns, E. R., Wolff, G. L. (1985) Alterations in synthesis of the acid
soluble proteins from nuclei of specific phases of the in vivo liver cell cycle after isoproterenol and sodium
phenobarbital administration: An electrophoretic study. Electrophoresis 6:306-313.
Rabilloud, T. (1996) Solubilization of proteins for electrophoretic analysis. Electrophoresis 17:813-829.
Rabilloud, T. (2002) Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up
the mountains. Proteomics 2:3–10.
Rabilloud, T., Valette, C., Lawrence, J. J. (1994) Sample application by in-gel rehydration improves the resolution
of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH-gradients in the first dimension. Electrophoresis 15:1552-
1558.
Reynolds, J. A., Tanford, C. (1970) Binding of dodecyl sulfate to proteins at high binding ratios. Possible
implications for the state of proteins in biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:1002-1007.
Ruggeri, Z. M. (2002) Platelets in atherothrombosis. Nat. Med. 8:1227-1234.
Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. (2000) Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?
Electrophoresis 21:1054-1070.
Savage, B., Cattaneo, M., Ruggeri, Z. M. (2001) Mechanisms of platelet aggregation. Curr. Opin. Hematol.
8:270–276.
Schägger, H., Bentlage, H., Ruitenbeek, W., Pfeiffer, K., Rotter, S., Rother, C., Böttcher-Purkl, A., Lodemann, E.
(1996) Electrophoretic separation of multiprotein complexes from blood platelets and cell lines: technique for the
analysis of diseases with defects in oxidative phosphorylation. Electrophoresis 17:709–714.
Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. (1994) Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein
complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native
electrophoresis. Anal. Biochem. 217:220–230.
Schindler, P. A, Settineri, C. A., Collet, X., Fielding, C. J., Burlingame, A. L. (1995) Site-specific detection and
structural characterization of the glycosylation of human plasma proteins lecithin:cholesterol acyltransferase and
apolipoprotein D using HPLC/electrospray mass spectrometry and sequential glycosidase digestion. Protein Science
4:791–803.
Sebastiano, R., Citterio, A., Lapadula, M., Righetti, P. R. (2003) A new deuterated alkylating agent for
quantitative proteomics. Rapid Commun. Mass Spec. 17:2380-2386.
Segrest, J. P., Jackson, R. L. (1972) Molecular weight determination of glycoproteins by polyacrylamide gel
electrophoresis in sodium dodecyl sulfate. Methods Enzymol. 28B:54-63.
Smithies, O., Poulik, M.D. (1956) Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature 177:1033.
Vukmirica, J., Tran, K., Liang, X., Shan, J., Yuan, J., Miskie, B. A., Hegele, R. A., Resh, M. D., Yao, Z. (2003)
Assembly and secretion of very low density lipoproteins containing apolipoprotein B48 in transfected McA-RH7777
cells. Lack of evidence that palmitoylation of apolipoprotein B48 is required for lipoprotein secretion. J. Biol. Chem.
278:14153–14161.
Walker, A. K., Rymar, G., Andrews, P. C. (2001) Mass spectrometric imaging of immobilized pH gradient gels
and creation of "virtual" two-dimensional gels. Electrophoresis 22:933–945.
Weiss, W., Postel, W., Görg, A. (1992) Application of sequential extraction procedures and glycoprotein blotting
for the characterization of the 2-D polypeptide patterns of barley seed proteins. Electrophoresis 13:770-773.
Weiss, W., Vogelmeier, C., Görg, A. (1993) Electrophoretic characterization of wheat grain allergens from
different cultivars involved in bakers’s asthma. Electrophoresis 14:805-816.
Wenge, B., Bönisch, H., Grabitzki, J., Lochnit, G., Schmitz, B., Ahrend, M. H. (2008) Separation of membrane
proteins by two-dimensional electrophoresis using cationic rehydrated strips. Electrophoresis. 29:1511-1517.
Wildgruber, R., Harder, A., Obermaier, C., Boguth, G., Weiss, W., Fey, S. J., Larsen, P. M., Görg, A. (2000)
Towards higher resolution: two-dimensional electrophoresis of Saccharomyces cerevisiae proteins using overlapping
narrow immobilized pH gradients. Electrophoresis 21:2610-2616.
Wilkins, M. R., Gasteiger, E., Sanchez, J.-C., Bairoch, A., Hochstrasser, D. F. (1998) Twodimensional gel
electrophoresis for proteome projects: the effects of protein hydrophobicity and copy number. Electrophoresis
19:1501-1505.
Wright, G.L. (1972) High resolution two-dimensional polyacrylamide electrophoresis of human serum proteins.
Am. J. Clin. Pathol. 57:173-185.
 Zahedi, R. P., Meisinger, C., Sickmann, A. (2005) Two-dimensional benzyldimethyl-n-hexadecylammonium
chloride/SDS-PAGE for membrane proteomics. Proteomics. 5:3581-3588.
Zhao, Y., McCabe, J. B., Vance, J., Berthiaume, L. G. (2000) Palmitoylation of apolipoprotein B is required for
proper intracellular sorting and transport of cholesteroyl esters and triglycerides. Mol. Biol. Cell 11:721–734.
 3.9. ELECTROFOREZA PREPARATIVĂ
Rezoluția excelentă și simplicitatea gel-electroforezei analitice a condus la tentativa trecerii la
scală mare a procedurii și pentru realizarea unei rezoluții înalte a componentelor speciilor
macromoleculare și izolarea lor prin gel-electroforeză la scală preparativă mai ales în cazul unor
studii suplimentare când proteinele şi acizii nucleici pot fi purificați prin electroforeză pe gel în
diverse moduri. O mare varietate de sisteme de separare electroforetică sunt cunoscute în ceea ce
priveşte mediul suport (mediu liber, hârtie, amidon, agaroză, poliacrilamidă, etc), tamponul de
separare (pH, prezenţa/absenţa agenţilor de disociere, etc) şi aparatura utilizată (tub
vertical/orizontal, placă verticală/orizontală, capilar, etc.). Printre aceste sisteme, electroforeza
pe gel de poliacrilamidă (PAGE) este cel mai utilizată pe scară largă pentru analiza de proteine şi
peptide datorită modului simplu de funcţionare, rezoluţia înaltă şi reproductibilitatea excelentă,
alături de flexibilitatea în pregătirea gelurilor de poliacrilamidă la concentraţiile dorite în
prezenţa unor aditivi diverși. Un număr de sisteme tampon, factori majori care definesc rezoluţia
în PAGE, au fost raportate pentru PAGE nedisociativ în condiții alcaline (Ornstein, 1964; Davis,
1964), condiţii neutre (Williams și Reisfeld, 1964; Taber și Sherman, 1964; Hashizume și colab.,
1984) şi acide (Reisfeld și colab., 1962). PAGE bidimensională (O'Farrell, 1975) şi focalizarea
izoelectrică (IEF) în gel de poliacrilamidă (Righetti, 1983) sunt, de asemenea, în uzul curent.
Sistemele tampon pentru PAGE care conţin agenţi disociativi precum ureea (Reisfeld și Small,
1966; Swank și Munkres, 1971) şi dodecil sulfat de sodiu (Weber și Osborn, 1969; Laemmli,
1970; Neville, 1971) sunt de asemenea intrate în rutină. Progresele recente în microanaliza
proteinelor au reunit metodele "analitice" şi "preparative", în ceea ce privește obținerea unor
cantități de ordinul microgramelor de proteină recuperate dintr-o singură piesă de gel, după
separarea prin PAGE, cantitate care poate fi suficientă pentru o analiză a compoziţiei în
aminoacizi, a secvenței şi cartografierii peptidice (Kennedy și colab., 1988; Shively și colab.,
1989; Simpson și colab., 1989; Ward și colab., 1990). Mai mult, proteinele cu masă moleculară
mare şi cele membranare, cu o minimă solubilitate într-o soluţie apoasă, care sunt greu de
separat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC), sunt deseori izolate prin SDS-
PAGE şi apoi supuse microanalizei (Simpson și colab., 1989). În acest context, recuperarea
proteinelor dintr-un gel de poliacrilamidă este de o importanţă crescândă. Pentru a obține o
rezoluție și o recuperare optimă a componentelor țintă prin aplicații preparative ale electroforezei
pe gel este necesară o alegere cu grijă a următorilor parametrii: compoziția și concentrația
gelului, dimensiunile lui, încărcarea probei, gradientul de voltaj, durata electroforezei și viteza
de migrare.
Compoziția și concentrația gelului. În electroforeza pe gel la scală preparativă se utilizează în
principal două tipuri de geluri, cel de poliacrilamidă și cel de agaroză, cel din poliacrilamidă
fiind pe departe cel mai frecvent folosit.
Durata electroforezei și viteza de migrare. O metodă convenabilă de migrare care corespunde
unui schimb a camerei de eluție per minut se utilizează în mod obișnuit care conduce la un timp
de eluție de aproximativ 5 ore pentru geluri de 6 cm. După cum în electroforeza continuă benzile
cu viteză de migrare lentă ar fi eluate în volume substanțial de mari de tampon comparativ cu
cele cu viteză de migrare rapidă la care volumul de tampon este semnificativ mai mic, este
avantajos a se utiliza o decelerare graduală a vitezei de eluție a tamponului. Acest proces poate fi
realizat prin controlul vitezei pompei de eluție înzestrată cu un sistem electronic sau printr-un
sistem cu came de încetinire a vitezei motorului. În scopul separării unor proteineori a unor acizi
nucleici, s-au descris o serie de aparate destinate special gel-electroforezei la scală
micropreparativă. Totuși, electroforeza pe gel de poliacrilamidă a fost puțin acceptată în
biochimie ca tehnică preparativă, fiind raportate puține izolări semnificative care nu ar fi posibile
prin procedurile de fracționare convenționale. S-a sperat că o înțelegere a problemelor tehnice și
a variabilelor ca influențează separarea amestecurilor macro-ionice la scală preparativă va
conduce la creșterea popularității acestei importante tehnici.
În ultimii ani, au fost dezvoltate două metode de gel-electroforeză preparativă:
(1) În prima metodă, amestecul de proteine (sau de alți macroioni) este în primul rând separat
prin migrare electroforetică pe un gel de poliacrilamidă; în continuare zonele sunt localizate,
decupate, mărunțite iar materialul este apoi eluat sau eliberat din gel prin migrare electroforetică.
În asemenea proceduri, gelurile preparative destinate extracţiei de proteine sau de acizi
nucleici sunt mai groase decât geluri analitice (1,5 -3 mm). În multe cazuri, godeul se întinde pe
toată suprafața gelului. Cantitatea maximă de probă care poate fi încărcată pe un gel depinde de
cât de bine moleculele de interes sunt separate de celalalte proteine din amestec de probă.
Deoarece benzile proteice devenin mai largi datorate procesului de difuziune, o cantitate mmare
de probă conduce la rezoluții de separare în cele din urmă inacceptabilă. De obicei, este utilizată
o încărcare de 10-50 de ori mai mare pe unitatea de secţiune transversală a gelului față de cea
realizată în cazul gelurilor rulate în electroforeza analitică. Astfel, cu unele geluri plate mari, se
pot recupera cantități de ordinul a zeci de miligrame. În cazul SDS-PAGE, pentru vizualizarea
benzilor proteice este recomandabilă colorația cu cupru (vezi subcapitolul 4.2), deoarece această
colorație nu folosește solvenţi fixatori. După identificarea benzilor colorate dorite, gelurile se
decupează iar excesul de cupru este eliminat prin incubarea piesei de gel de trei ori (timp de 10
minute fiecare) într-o soluție de tampon Tris-HCl, 0,25 M, pH=9,00 care conține 0,25 M EDTA
(Lee și colab., 1987), sau în tamponul de migrare, Tris-Glicină. În continuare, piesele de gel se
incubează în tampon de eluție corespunzător. În cazul gelurilor native, se realizează o bandă
marcată separat, pentru fiecare gel în parte, care se taie şi se colorează cu Coomassie. Cum în
timpul procesului de colorare și decolorare, tratamentul cu metanol conduce la deshidratarea și
astfel la micșorarea gelului de poliacrilamidă, după identificarea benzii de interes, gelul se
rehidratează până la dimensiunea sa iniţială, prin înmuiere în apă. Banda de marcaj poate fi
aliniată cu secţiunea utilizată în scop preparativ a gelului mamă (inițial) pentru a localiza benzile
proteice de interes. Benzile de acizi nucleici sunt excizate după colorare cu bromură de etidiu
(Garfin, 1995).
Se poate totuși remarca că această procedură se aplică în special macro-ionilor colorați (de
exemplu, hemoproteinelor);
(2) În a doua procedură, compușii care sunt separați pe un gel cilindric sunt lăsați să migreze
până la capătul gelului, într-o cameră de unde sunt eluați cu un tampon de (eluție) transport către
un monitor UV și în continuare către un colector de fracțiuni. Tamponul de eluție poate fi livrat
pentru sisteme atât continue, cât și discontinue (eluție intermitentă).
Fiecare dintre aceste metode au avantaje cât și limite determinate de numărul relativ și de
proporția fracțiilor, de mărimea componentelor țintă, de mobilitatea lor și de viteza lor de
difuziune.
Difuzia pasivă. Proteinele și acizii nucleici sunt deseori extrași din maceratul fragmentelor de
gel prin simplă difuzie (Sambrook și colab., 1989). Fragmentele de gel care conțin moleculele de
interes sunt strivite într-un mojar cu ajutorul unui pistil după care sunt lăsate acoperite cu cu
tampon până când moleculele difuzează în fluidul de supernatant. Acizii nucleici pot fi
recuperați din geluri de agaroză cu punct de topire scăzut. Această agaroză se topește la
aproximativ 65oC și gelifică la aproximativ 30oC. Temperatura de topire a acestei agaroze este
suficient de scăzută astfel încât strucutra dublu-catenară a DNA este menținută în condițiile
topirii ei. Fragmentele excizate de gel se acoperă cu tampon și se încălzesc la 65 oC până când
agaroza se lichefiază. În continuare se realizează o extracție cu fenol și o precipitare cu etanol,
tratamente care conduc la recuperarea DNA ori a RNA. O procedură alternativă de recuperare a
DNA din agaroze cu punct de topire scăzut este reprezentată de tratamentul gelului cu o enzimă,
denumită agarază, care digeră agaroza lichefiată (Burmeister și Lehrach, 1989). Tratamentul cu
agarază este recomandat pentru recuperarea fragmentelor mari de DNA. Pentru lichefierea
gelurilor de poliacrilamidă, este recomandată alternativa utilizării agenților bifuncționali
solubilizabili, alții decât bisacrilamida (vezi subcapitolul 3.6.1. Agenți de reticulare).
Tratamentul adecvat al gelurilor are ca efect desfacerea punților labile ale agentului bifuncțional
ceea ce conduce la lichefirea lor. Alternativa agenților bifuncționali labili nu este complet
satisfăcătoare deoarece moleculele de interes trebuie să fie separate de lanțurile de
poliacrilamidă, liniare, reziduale (Garfin, 1995).
Practic, gelurile sunt îndepărtate din tuburile cilindrice prin injectare de apă cu ajutorul unei
seringi, iar porțiunile care conțin fracțiunile dorite sunt separate și mărunțite cu ajutorul unor
foarfeci. Eluția completă este apoi realizată cu un tampon convenabil, eluatul se separă prin
centrifugare iar operațiunea se repetă de trei ori. Supernatanturile se reunesc și se concentrează
prin ultrafiltrare. Această procedură este consumatoare de timp și dă randamente de recuperare
minore.
Eluția electroforetică (Electroeluția). Eluția electroforetică reprezintă o metodă eficientă
pentru recuperarea proteinelor și acizilor nucleici din fragmentele de gel. În cea mai simplă
versiune a acestei metode, proteinele și acizii nucleici sunt îndepărtate electroforetic din
fragmentele (piesele) de gel în interiorul unor saci de dializă într-un aparat utilizat la
electroforeza gelurilor cilindrice (Sambrook și colab., 1989). Aparate mai sofisticate comerciale
disponibile pentru recuperarea rapidă a proteinelor și acizilor nucleici din volume mici de gel, cu
randamente aștepate mai mari de 70% (Harrington, 1990). Timpul de eluție este de aproximativ
3 ore și se realizează în tampoane adecvate. În absența SDS, deseori, acizii nucleici se leagă la
membranele utilizate într-o serie de dispozitive comercializate, ceea ce limitează randamentele
de obținere. Andrews (1986) descrie o serie de variante de eluție electroforetică.
Practic, componentele probei de separat sunt localizate, decupate și mărunțite. Tubul, de 1,2
cm diametru, în care se realizează eluția, gol, se închide la un capăt cu o membrană de dializă,
iar la capătul de jos al tubului se adaugă 3 ml de tampon Tris-HCl, 0,025M (pH=8) care conține
sucroză 6%. Soluția este acoperită cu un amestec de polimerizare alcătuit din 2,17 ml de H3PO4
(1 M), 0,17g de tris, 0,35 ml de tetraetilmetilendiamină (TEMED), 2,5 g de acrilamidă, 0,63 g de
bisacrilamidă, 0,5 mg de riboflavină și apă până la 100 ml pentru a forma un gel de circa 10 mm
înălțime. Amestecul este fotopolimerizat timp de 1 oră. Gelul mărunțit care conține componentul
dorit a se extrage este împachetat peste stratul de gel și acoperit cu un tampon Tris-HCl (pH=8)
care conține 6% sucroză. În continuare, tubul este încărcat cu același tampon, din care se omite
sucroza iar electroeluția se realizează cu tampon Tris-glicină (pH=8,9) (Tris, 6,4g; glicină, 4,0g;
apă până la 1 litru).
Gel-electroforeza preparativă cu eluție discontinuă. Eluția continuă a fracțiilor separate pe
gel necesită un echipament complex și poate conduce la diluția considerabilă a componentelor
izolate. Pentru a evita aceasta, au fost descrise o serie de aparate care utilizează eluția
intermitentă.
Într-un aranjament simplu, a unui sistem de eluție discontinuu, gelul este format într-o
coloană de sticlă de 3 cm diametru, la care capătul de jos este potrivit un sac de dializă care
conține 12-15 ml de tampon de electrod. În sacul de dializă se insertează două capilare care se
cuplează la o pompă și la un monitor UV, într-un circuit închis. Migrarea electroforetică se
realizează în mod obișnuit. Când componentul amestecului care se dorește separat migrează în
sacul de dializă, absorbanța UV crește până când atinge o valoare limită; electroforeza se
întrerupe, sacul de dializă este îndepărtat și înlocuit un un altul. Izolarea următoarelor
componente este realizată în manieră similară. Metoda este simplă și convenabilă numai pentru
separarea benzilor bine separate.
 3.9.1. METODE DE RECUPERARE A PROTEINELOR DIN GELURI
O metodă simplă şi de încredere prin care se pot recupera cantități de ordinul microgramelor
de proteine din gelului de poliacrilamidă, de preferinţă în forma activă biologic, este esenţială
pentru caracterizarea unor proteine foarte puțin abundente și care sunt adesea obiectul de
cercetărilor moderne. În abordările iniţiale, proteinele de interes aflate în gel, după PAGE sunt
extras prin difuziune spontană în urma agitării piesei excizate mărunțite de gel într-un tampon
corespunzător (Shuster, 1971; Bray și Brownlee, 1973; Bernabeu și colab., 1978; Hames, 1990).
Deşi această metodă este simplă şi adecvată pentru recuperarea proteinelor cu masă molecular
mică (Jacobs și Clad, 1986), are un randament şi o reproductibilitate redusă, este consumatoare
de timp, chiar şi pentru recuperarea unor urme de proteine (Hames, 1990). Mai mult, prezenţa de
SDS în tamponul eluţie este esenţială pentru o eluţie eficientă, deşi SDS este bine cunoscut ca
denaturant al proteinelor (Hames, 1990). Metodele de recuperare a proteinelor de gel de
poliacrilamidă prin solubilizarea lor în H2O2, în concentrație de 30% la o temperatură de 50oC
(Young și Fulhorst, 1965) şi utilizarea unor agenți de reticulare depolimerizabili (Hansen, 1981;
Anker, 1970; Baumann și Chrambach, 1976; O'Connell și Brady, 1976) dau naştere la cantităţi
mari de contaminanţi derivați din gel și ca atare, proteinele recuperate necesită în mod inevitabil
o purificare suplimentară. Conform unor mulți autori, două dintre cele mai eficiente metode
pentru recuperarea proteinelor din gel de poliacrilamidă sunt (1) "electroeluția", prin care se
recuperează proteinele de interes din fragmentul de gel excizat electroforetic şi (2) "eluţia
continuă" a proteinelor care se aplică la scară preparativă în timpul electroforezei, în cazul în
care proteinele separate electroforetic migrează prin gel într-un flux de tampon din partea de jos
a gelului, prin fracţionare consecutivă. Ambele metode pot recupera proteinele cu o puritate
mare, un randament şi o reproductibilitate bună (Shoji și colab., 1995).
3.9.1.1. Electroeluția proteinelor din gelul de poliacrilamidă
Electroeluția, ca metodă de recuperare a proteinelor din geluri excizate, după PAGE, devine
din ce în ce mai populară datorită excelentei recuperări şi reproductibilității crescute, fără a se
utiliza un sistem ori un aparat scump.
3.9.1.2. Factorii care afectează recuperarea proteinelor din gel.
În tehnologia de electroeluție a proteinelor din gel, după PAGE, eficienţa de recuperare
depinde de:
(1) gelul de concentrare şi sistemul tampon (pH, putere ionică, prezenţa/absenţa agenţilor
disociativi) din PAGE;
(2) sistemul tampon pentru electroeluție, tensiunea aplicată şi timpul de eluţie
(3) natura proteinelor individuale care urmează să fie recuperate, de exemplu, pI şi masa
moleculară.
Condiţiile optime ale PAGE şi ale electroeluției ulterioare, nu sunt neaparat valabile pentru
toate proteinele. Ele depind de tipul de proteină motiv pentru care condiţiile corespunzătoare
fiecărei specie proteică trebuie să fie determinate individual, în experimente preliminare.
Alegerea concentraţiei de gel și sistemul tampon se examinează în detaliu pentru fiecare proteină
(Shuster, 1971; Chrambach, 1980; Chrambach și Rodbard, 1971).
În general, sistemul de tampon pentru electroeluție este în concordanţă cu tamponul pentru
PAGE ori este oarecum modificat. Sistemele tampon pentru PAGE pot fi clasificate în cele
realizate pentru condiţii nedisociative ori disociative. În condiţii nedisociative, în cazul în care
proteina de interes își poate menţine, probabil, activitatea biologică, natura intrinsecă a proteinei
(pI, masa moleculară, hidrofobicitatea, etc.) defineşte sarcina netă şi solubilitatea proteinei în
mediul tampon dat. Prin urmare, ar trebui să fie evitate utilizarea de tampoane de electroeluție la
pH-uri din jurul pI a proteinei analit, deoarece migrarea electroforetică a proteinelor încetineşte
considerabil la pI ca urmare a pierderii sarciniielectrice nete, iar uneori, multe proteine precipită
în matricea de gel, rezultând astfel un randament scăzut de protein extrasă, chiar şi după o
electroeluție prelungită (Shoji și colab., 1995).
Pentru o electroeluție eficientă a proteinelor, pH-ul tamponului de electroeluție trebuie să
difere cu cel puţin o unitate de pH față de pI-ul proteinei, atât timp cât se conservă activitatea
biologică în condiţiile date. PAGE în sisteme tampon alcaline (Davis, 1964), neutre (Hashizume
și colab., 1984) şi acide (Reisfeld și colab., 1962), în combinaţie cu fiecare sistem tampon
recomandat pentru electroeluție (Hashizume și colab., 1984) poate conduce la recuperarea, în
esenţă, a tuturor proteinelor. Este cunoscut că în PAGE în condiţii nedisociative, cu cât
concentraţia gelului de poliacrilamidă este mai mare, cu atât mai mare devine absorbţia
proteinelor în gelul matrice, ceea ce conduce la o migrare pe o distanţă mai lungă a proteinelor.
Absorbția acestora în matricea de gel scade randamentul de recuperare prin electroeluție
(Kapadia și Chrambach, 1972). Astfel, nu este recomandată integrarea fragmentelor de geluri
excizate în gelul de poliacrilamidă înainte de electroeluție în scopul reducerii convecţiei şi a
fluxulului de curent lateral (Jacobs și Clad, 1986). Pentru electroeluțșia proteinelor cu masă
molecular mare, se recomandă utilizarea unui gel de separare mare cu pori care poate fi preparat
prin reducerea concentraţiei de N,N'-metilenbisacrilamidă (Hirano și Wittmann-Liebold, 1989).
Într-un gel de focalizare izoelectrică, proteinele migrează într-un gradient de pH spre punctul
izoelectric, pI, concentrându-se într-o bandă foarte subțire de gel, caz în care proteinele precipită
frecvent. Acest proces poate fi evitat prin reducerea cantităţii de proteinele încărcate sau prin
adăugarea de uree (Ui, 1971) ori alţi detergenţi (Hjelmeland și Chrambach, 1981). Pentru
electroelutia dintr-un gel după focalizare izoeletrică, procedura este în esenţă acelaşi ca cel
pentru un gel PAGE în condiții nedisociative (Suzuki și colab., 1973), deşi tratamentul anterior
gelului focalizat izoelectric excizat, înainte de electroeluție îmbunătăţeşte uneori randamentul
efectiv de extracție al proteinelor.
În SDS-PAGE, proteinele sunt denaturate fundamental şi astfel solubilizate prin formarea
unui complex SDS-proteină (Pitt-Rivers și Impiombato, 1968; Reynolds și Tanford, 1970). Toate
complexele SDS-proteină au, în esenţă, pe suprafaţă, aceeaşi densitate de sarcină negativă şi
migrează în gelul de poliacrilamidă spre anod cu mobilităţi care reflectă dimensiunea proteinelor
și nu reflectă sarcina intrinsecă a proteinei native. Deşi a fost descrisă renaturarea proteinelor
recuperate după SDS-PAGE (Hanaoka și colab., 1979; Hager și Burgess, 1980), această metodă
funcţionează doar pentru unele proteine excepţional de rigide. Astfel, o combinaţie de PAGE și
de electroeluție în condiţii nedisociative este recomandată pentru recuperarea unor proteine
biologic active, în special a celor care cuprind subunităţi (Shoji și colab., 1995).
Progresele recente în microanaliza proteinelor au relevat probleme serioase în existența unor
artefacte datorate alterării proteinelor în timpul separării electroforetice, electroextracției, ori a
proceselor de electroblotting (de electrotransfer pe membrane). De exemplu, după PAGE,
proteinele prezintă adesea modificări precum ar fi distrugerea resturilor de triptofan, histidină şi
metionină datorate atacului radicalilor liberi şi oxidanților derivați din agenţii de gel-
polimerizare (Koziarz și colab., 1978; Hunkapiller și colab., 1983). Legătura dintre resturile
Asp-Pro din structura proteinelor este de sensibila la hidroliză acidă, această reacţie putând
continua chiar şi în timpul procesării gelului în soluția de colorare-decolorare, când acesta intră
în contact cu soluții acide (Hunkapiller și colab., 1983). Reactivii contaminați cu aldehide, care
reacţionează cu grupările -NH2 ale proteinelor şi cei contaminați cu compuşi care conţin grupări
-NH2 induc un zgomot în condițiile analizei secvenței de aminoacizi, motiv pentru care nu
trebuie să fie utilizați.
Trebuie acordată atenţie la calitatea ureei, care este frecvent utilizată pentru gelurile folosite
în focusare izoelectrică, pentru a evita carbamoilarea grupărilor -NH2 ale proteinelor cu
contaminanți cianat (Hunkapiller și colab., 1983). Aceste efecte nedorite ale contaminanţilor pot
fi minimizate prin utilizarea în electroforeză a unor geluri și reactivi de înaltă puritate și calitate.
Pre-electroforeza gelului de poliacrilamidă şi încorporarea unor antioxidanți, cum ar fi
tioglicolatul de sodiu şi glutationul (forma redusă) în tamponul catodic sunt, de asemenea,
eficiente (Hunkapiller și colab., 1983; Moo și colab., 1988). În PAGE, viteza de migrare a unei
proteine este proporţională cu tensiunea aplicată, şi prin urmare, este de preferat să se utilizeze o
tensiune mai mare pentru o electroeluție mai rapidă, în cazul în care este permis efectul produs
de căldura Joule. Căldura Joule generată în timpul electroeluției conduce la denaturarea termică
a proteinelor (Allington și colab., 1978), conduce la colmatarea proteinelor în matricea de gel
(Nguyen și colab., 1980), care interferează în electroeluția eficientă. Căldura poate spori, uneori,
digestia proteolitică a proteinelor de analit datorită urmelor de proteinaze contaminate din proba
încărcată (Hunkapiller și colab., 1983). Aceste efecte datorate căldură Joule de denaturare şi
digestie enzimatică a proteinelor țintă, precum şi perturbările în cursul eluarării proteinelor din
cauza convecţiei termice pot fi minimizate dacă procedura de electroeluție se operează la rece
(Shoji și colab., 1995). Tampoanele de electroeluție cu concentraţii scăzute permit funcţionarea
la tensiuni mari, cu o mică generare de căldură, dar trebuie avut grijă să se evite o schimbare a
pH-ului tamponului, mai ales în cazul unor electroeluții prelungite (Allington și colab., 1983). În
electroeluția cu tampoane de concentraţii mici, pH-ul poate fi menţinut constant prin circulația
soluție de tampon între cei cei doi electrozi (Hunkapiller și colab., 1983) sau prin utilizarea unor
rezervoare auxiliare care conţin o soluţie de tampon concentrat (Allington și colab., 1983).
Adăugarea de SDS la tamponul de electroelutie creşte randament efectiv de transfer al
proteinelor (Hager și Burgess, 1980) prin solubilizarea proteinei fixate/colorate în gel (Strålfors
și Belfrage, 1983) şi accelerează migrarea proteinelor posesoare de sarcină negativă. Prezența
SDS în tamponul electroelutie este esenţială pentru a recupera proteinelor care sunt greu solubile
într-o soluţie de apoasă (Bhown, și colab., 1980). În metodele de electroeluție care folosesc
membrane pentru captarea proteinei eluate, încorporarea SDS în tamponul electroelutie previne
atât adsorbţia permanentă de proteine pe membrană cât şi posibilitatea pierderii ei prin porii
membranei în mod eficient prin acoperirea suprafeței membranei cu micele de SDS (Jacobs și
Clad, 1986; Hunkapiller și colab., 1983). În general, este adesea inclus în tamponul de
electroelutie SDS în concentraţii de 0,02-0,1%. Trebuie remarcat, totuşi, că tampoanele care
conţin SDS formează cu uşurinţă un precipitat la rece (Hunkapiller și colab., 1983).
3.9.1.3. Proceduri premergătoare electroeluției
Este o condiţie preliminară importantă pentru recuperarea cu succes a proteinei de interes
înalt purificate după electroelutie ca aceasta să fie net separată de alte proteine contaminante
după PAGE. Astfel, condiţiile de separare pentru procedura PAGE, inclusiv sistemul de tampon,
concentraţia de gel şi cantitatea de proteină încărcată, trebuie să fie determinată cu atenţie
(Shuster, 1971; Chrambach, 1980; Chrambach și Rodbard, 1971).
3.9.1.2.1. Localizarea proteinei de interes
Pentru recuperarea cu succes a unei proteine analit este crucială identificarea locaţiei exacte
pentru a fi excizată cu exactitate din gel. În acest sens, trebuie să se aibă în vedere faptul că
procedura de localizare nu trebuie să afecteze calitatea proteinei sau potențialele interferențe în
cadrul electroeluției ulterioare. Colorarea proteinelor din geluri cu coloranţi, de tipul Coomassie
Brilliant Blue (CBB), cu o sensibilitate de 2-300 ng proteină/bandă (Hunkapiller, și colab.,
1983), permite manipulări exacte în disecarea părții relevante de gel care conţine proteina-analit.
Totuși, procedura de fixare/colorare scade randamentul de extracție a proteinei (Tuszynski și
colab., 1977), astfel încât trebuie să fie evitat un contact prelungit al gelului cu soluţiile acide de
fixare/colorare. Astfel, după o scurtă colorare cu CBB R-250, 0,25% în metanol, 50% care
conţine acid acetic, 10% (Merril, 1990), urmează o decolorare rapidă, dacă este necesar, benzile
de proteine din gel fiind identificate prin iluminare, iar partea relevantă din gel care conţine
proteina de interes este decupată cu un bisturiu. Pentru gelurile supuse focusării izoeletrice se
recomandă utilizarea colorantului CBB G-250 (Merril, 1990). Trebuie remarcat faptul că o serie
de coloranţi precum CBB şi Amido Black nu interferă în analiza secvenței de aminoacizi din
compoziţia proteinelor ori analiza capătului amino-terminal al acestora (Hunkapiller, și colab.,
1983; LeGendre și Matsudaira, 1988). După cum s-a menţionat anterior, legăturile Asp-Pro din
proteine sunt susceptibile la hidroliză acidă şi astfel, se recomandă un minim contact între gel și
soluţiile acide de fixare, colorare şi decolorare (Hunkapiller, și colab., 1983).
Deseori, localizarea unei proteine într-un gel necolorat este determinată prin interpolarea
gelului care conține proteina cu o serie de benzi de ghidaj, care se colorează. Cu toate acestea,
interpolarea, uneori, duce la rezultate inexacte din cauza umflării ori a scăderii benzilor de ghid
în timpul proceselelor de fixare, colorare şi decolorare, astfel încât, pentru o localizare exactă a
proteinei sunt necesare o serie de corecţii. Într-un gel placă, sunt necesare trei benzi de ghidaj
pentru o interpolare exactă, una rezultată din zona centrală și câte una, din fiecare parte laterală a
sa. Această metodă permite extragerea cu succes a fragmentului care conține banda omogenă de
proteină dintr-un gel atunci când nu sunt în imediata apropiere a proteinei-analit, proteine
contaminante, la o distanță de mai mult 3 mm. Benzile de ghidaj trebuie să fie colorate cât mai
repede posibil, păstrând în acelaşi timp gelul necolorat la rece (cu excepţia gelurilor după SDS-
PAGE), în scopul de a reduce la minimum dispersia spontană a proteinelor. De asemenea, există
proceduri rapide pentru colorarea benzilor de ghidaj, cu care colorarea și decolorarea sunt
complete în decurs de o oră (Shoji și colab., 1995). Pentru localizarea exactă cu deteriorarea
minimă a proteinelor, proteina de interespoate fi identificată, deşi nu cu mare sensibilitate, într-
un gel SDS-PAGE prin imersarea gelului într-o soluție 0,25-1 M clorură de potasiu (Hager și
Burgess, 1980; Nelles și colab., 1976) sau acetat de sodiu 4 M (Higgins și Dahmus, 1979) pentru
sedimentarea SDS şi a complexelor SDS-proteină. Este cunoscut de asemenea faptul că ionii de
metale grele, precum cuprul şi zincul pot evidenția benzile proteice atât în geluri cu SDS cât și în
cele fără detergent (Lee și colab., 1987; Dzandu și colab., 1988). Detectarea rapidă şi sensibile
de proteine poate fi efectuată în termen de 5 minute prin expunerea gelului la o soluție de CuCl2,
0,3 M, în cazul în care proteinele din gel devin translucide în timp ce fondul de gel devine
albastru pal, atât în prezența cât și în absenţa SDS. Benzile de proteine sunt uşor de detectat prin
plasarea gelului pe un suport negru. Ionii de cupru care se leagă de proteine pot fi îndepărtați
prin cufundarea gelului într-un tampon Tris-HCl, 0,25 M (pH=9,0) care conţine EDTA, 0,25 M.
Sensibilitatea acestei metode este de 10-80 ng de proteină/bandă într-un gel cu o grosime de 2
mm, atât în prezenţa cât şi în absenţa SDS (Lee și colab., 1987). În cazul în care proteina de
interes este disponibilă într-o formă înalt purificată, banda sa în gel după PAGE dintr-un preparat
de proteină poate fi uşor identificată prin co-electroforeză cu o aceeași proteină-țintă, marcată
fluorescent sau radioactiv (Stephens, 1975; Rickwood, 1990). Deşi metoda de marcare permite
detectarea directă a proteinei relevante în gel, fără un contact cu alte substanţe chimice care o
alterează este dificil de procurat o atare proteină marcată (Shoji și colab., 1995).
3.9.1.2.2. Pretratamentul gelului excizat
În general, înainte de electroeluție nu este necesar nici un tratament al gelului cu excepţia
cazului în care acesta a fost expus la conditii extreme, cum ar fi pH-ul soluției de colorare cu
CBB R-250 care conține metanol, 50% şi acid acetic, 10% (Merril, 1990). În practică, după o
scurtă colorare, piesa excizată de gel este scufundată în tampon de electroeluție şi echilibrată
pentru câteva minute, înainte de eluare. Dacă timpul de colorare în condiții acide este realizată
într-o perioadă extinsă, gelul se tratează succesiv prin imersare într-o soluție 1M de NaOH timp
de 1 minut după care se imersează într-o soluție 0,1M de NaOH care conţine SDS, 0,1% timp de
30 de minute, iar în final se echilibrează în tamponul de electroeluție. Gelul după focalizare
izoelectrică nu necesită o pre-tratare, atâta timp cât proteina este menținută în formă solubilă în
gel (Suzuki și colab., 1973). În condițiile în care proteina precipită în gelul de focalizare
izoelectrică, proteina necesită solubilizarea înainte de electroeluție prin expunere la condiţii
extreme alcaline timp de 5 minute, la 0oC (Nguyen și colab., 1980), cu toate că este inevitabilă
denaturarea permanentă a proteinei, chiar şi după neutralizarea imediată. (Shoji și colab., 1995).
 S-a raportat că eficienţa de recuperare a proteinei poate fi îmbunătăţită prin mărunţirea
gelului. După unii autori îmbunătăţirea extracției este atribuită creșterii suprafeței de contact
dintre fragmentul de gel și tamponul de eluție (Hunkapiller și colab., 1983; Bhown și colab.,
1980; Nguyen și Chrambach, 1979).
3.9.1.4. Metode de electroeluție
Una dintre cele mai importante caracteristici care ilustrează diferenţele între metodele de
electroeluție constă în modul în care proteina eluată este capturată. Principiul şi aplicarea fiecărei
metode sunt prezentate pe scurt în tabelul 3.13.
3.9.1.3.1. Capturarea proteinei eluate pe membrane semipermeabile
Dispozitivele de electroeluție care captează proteina eluată cu membrane semipermeabile pot
fi clasificate în patru tipuri majore (tabelul 3.13.), trei dintre ele fiind comercializate. Membrana
semipermeabilă pentru captarea proteinelor trebuie să fie chimic inertă şi să aibă o capacitate
scăzută de adsorbţie a acestora. Membranele pot fi selectate dintr-o varietate de membrane
disponibile comercial, cum ar fi tuburile din celuloză, metilceluloză ori acetat de celuloză
(Jacobs și Clad, 1986; Kim, 2009), în funcţie de raza moleculară a proteinelor țintă și de
aparatura de eluţie utilizată (Jacobs și Clad, 1986). Trebuie să se ţină seama de faptul că unele
membrane de dializă au, mai mult sau mai puţin, caracteristici comune de adsorbție a proteinelor
şi de asemenea, dimensiunile porilor sunt extinse în câmpul electric (Ochiai și colab., 1987).
Pentru a minimiza adsorbţia proteinelor pe membrană, adesea, se încorporează în tamponul de
electroeluție concentraţii scăzute de SDS. În experimentele de rutină, după electroeluție, pentru a
se realize o recuperare eficientă a proteinelor, membrana de captare este de spălată cu soluţie
într-o cameră de blocare printr-o pipetare viguroasă, altfel încât să se realizeze un curent invers
și care se aplică pentru o perioadă scurtă de timp (cca. 30 secunde) înainte de a se colecta
proteina (Sulitzeanu și colab., 1967; Lemaire și colab., 1993). Pentru o recuperare a proteinei
pure, este o cerinţă absolută ca membrana să fie foarte bine spălată înainte de utilizare
(Hunkapiller și colab., 1983; Bhown și colab., 1980).
3.9.1.3.2. Electroeluția în tuburi de dializă
Recuperarea electroforetică a proteinelor din geluri după SDS-PAGE poate fi pur şi simplu
de realizat utilizând tuburi de dializă (McDonal și colab., 1986; Sulitzeanu și colab., 1967).
Tuburile de dializă care conţin fragmentele de gel excizate gel sunt umplute cu tampon de
electrod, care include în general SDS și este plasat într-o cameră de electroforeză în poziție
paralelă cu electrozii şi scufundate în tamponul de electrod. După electroeluție, soluţia de
interior care conţine proteinele eluate este centrifugată pentru a elimina reziduurile de gel şi
supernatantul este colectat. Această metodă simplă de eluție a proteine funcţionează bine doar
pentru geluri care conţin cantităţi mari de proteine, fiind caracterizată printr-o pierdere
semnificativă de proteine care apare ca urmare a adsorbţiei pe o suprafaţă mare ca cea a
membranei (Hames, 1990). Această metodă recuperează, de obicei, concentraţii scăzute de
proteine eluate cu un volum relativ mare de tampon de electrod în tubulatura de dializă.
Tabelul 3.13. Metode de electroeluție (după Shoji și colab., 1995).
Metodă Probă și cantități Tip PAGE Tampon de eluție Putere
electrică
Membrană
Tub de dializă - + SDS fosfat de sodiu, 20-200 V
0,1M (pH=7,4)-SDS, (100mA)
0,1%
Verticală Hemoglobină/DNP- - SDS, Tris, 12,5mM- 25-35 mA per
albumină; globulină T%=7,5% glicină, 96mM (pH=8,3) tub (140-180 V)
marcată fluorescent, etc
7-20 mg (cca. 2 ml)
Verticală dimer β-tubulină + SDS, 2.5 mM Tris- 1-2 mA per
marcată fluorescent, etc. T%=5-10% glycine (pH 8.3)- SDS, tub (350-400V)
ca. 1 mg 0.1%
 Orizontală Proteine de membrană, + SDS, T% = Tris, 25mM- 10 V/cm (70
colorate (Mr=3000-19000) 8,75% glicină, 192mM mA)
(pH=8,3) – SDS, 0,l%
Pasaj H-2Kk radiomarcată + SDS, NEMb 50mM - 1 W (4-7mA)
(Mr=12000-68000) gradient, T% = 5- acetat (pH 8.5)-
20% 0.001% SDS
Pasaj proteină radiomarcată + SDS NH4HCO3, 50mM- 50 și 80V
(Mr=65000) SDS, 0,1% [Tris-acetat,
1µg-1mg 50mM (pH=7,8) – SDS,
0,1%c]
Gradient ATP-citrat liază + SDS Tris, 25mM-glicină, 4,0 mA
discontinuu de colorată și proteine 75mM (pH=8,8) - DTEd
conductivitate colorate 1mM-glicerol, 40%.
0,1-0,5µg (două Captare: NaCl, 2M
fragmente de gel)
Stivuire în stare Hormon de creștere - SDS, Electroforeză 6-7mA/cm2,
staționară uman radiomarcat T%=6% zonală multifazică. apoi 3-3,5mA/cm2
Sistem tampon
2950.0.X
Stivuire în stare Proteina de legare a + SDS, Le: NEM, 23mM- 4 mA per tub
staționară, cu retinolului T%=15% HCl, 10mM
f
Sephadex G-25 0,3-4mg (1-5ml) (pH=8,0);T : Tris,
30mM-6ACAg, 500mM
(pH=9,1) –SDS, 0.1%
Sh: Tris, 3 mM-
6ACA, 50 mM
(pH=9,1)- SDS, 0.1%
Stivuire în stare Albumină necolorată, +/- SDS Pentru geluri 250-300 V
staționară, cu etc. (cca. 0,5ml de gel) alcaline, L: Tris, 378
ionului frontal mM – HCl, 124mM
concentrat (pH=8,5)- sucroză,
10%; T: Tris, 2,5mM-
glicină, 10mM (pH=8,5)
a
IEP = imunoelectroforeză; bNEM = N-etilmorfolină; cTampon pentru operații la rece; dDTE=ditioeritritol; eTampon frontal;
f
Tampon posterior; g6-ACA=acid 6-aminocaproic; hTamponul din rezervorul probei.
3.9.1.3.3. Electroelutorul de tip vertical
Un aparat simplu vertical pentru electroeluția de proteine poate fi construite foarte ușor cu
mici cheltuieli, de exemplu, prin fixarea unei plase din nailon cu ochiuri mari între o pereche de
tuburi de sticlă şi cu o membrană semipermeabilă bine fixată la capătul din partea de jos cu
ajutorul unor tuburi din material plastic. Schema de principu este prezentată în figura 3.80.
(Hashizume și colab., 1984; Stephens și colab., 1975; Sulitzeanu și colab., 1967; Lewis și Clark,
1963; Weliky și colab., 1975). Electroeluția cu acest aparat realizat în laborator poate fi efectuată
ca printr-o clasică electroforeză pe geluri cilindrice (disc-electroforeză) după plasarea
fragmentului de gel excizat pe ochiurile plasei de nailon.
Proteina care este eluată din gel migrează prin tamponul de electroeluție într-un flux de
curent fiind captată de membrană şi menținută în interiorul
unităţii de jos a compartimentului, de unde este recuperată,
după îndepărtarea unității superioare. Electroeluterul de tip
vertical are ca avantaje operarea uşoară cu recuperarea
completă a unor cantităţi mici de proteine dintr-un gel excizat.
O atenţie deosebită trebuie acordată evitării prinderii de bule
de aer sub membrana semipermeabilă şi în ochiurile
membranei de nailon pe tot parcursul asamblării aparatului şi
electroeluției, deoarece bulele de aerconduc la întreruperea
fluxului de curent.
 Figura 3.80. Reprezentarea schematică a capturării proteinei printr-un sistem în stare staționare de coconcentrare.
Fragmentul de gel excizat (G) este amplasat pe o plasă de nailon de sprijin (S) care se atașează în compartimentul
superior (UC), fiind umplut cu tampon care conține ionul final. Proteina eluată din gel migrează, într-un flux electric
constant și se concentrează într-o zonă subțire (P), între ionul conducator şi ionul final din compartimentul inferior
(LC). Direcţia de migrare a proteinelor este indicată prin săgeată. În cazul stării de echilibru la concentrare (stivuire)
cu un tampon concentrat ion principal frontal descris de Hashizume și colab. (1984), membrana semipermeabilă (M)
este folosită pentru a asigura recuperarea proteinelor. (După Shoji și colab. 1995).

Ihara și colab. (1987) a aplicat modul de concentrare Centricon, un disponibil comercial la

capturarea proteinelor eluate, facilitând astfel concentrarea simultană şi schimbul de tampon al
soluţiei de proteine în aceeaşi vas, pentru a minimiza pierderile posibile ale acestora.
3.9.1.3.4. Electroeluterul de tip orizontal
Aparatul de electroeluție orizontală a fost introdus pentru prima dată de către Tuszynski și
colab. (1977) şi dezvoltat de către Jacobs și Clad (1986), cu acelaşi principiu, dar cu un design
mult mai practic (figura 3.81.). La un vas deschis la partea superioară din plastic se lipseşte o
pereche de pereţi laterali fiind astfel compartimentat cu o pereche de membrane semipermeabile.
Spaţiul dintre membrane este în continuare divizat cu un filtru grosier în compartimente de
eluare şi de colectare și care blochează particulele de gel. După introducerea dispozitivului într-o
cameră de electroforeză orizontală se toarnă tamponul în compartimente, astfel încât să acopere
gelul și se realizează electroeluția. Proteină eluată care migrează din gel în compartimentul de
colectare prin filtru este capturată de membrana semipermeabilă.
Figura 3.81. Reprezentarea schematica a
electroeluterului de tip orizontal. Într-un câmp
electric, proteina este eluată din gelul excizat
(G), care a fost plasat în compartimentul de
eluţie (CE), şi care migrează prin porii mari ai
filtrului (LPF), spre compartimentul de
colectare (CC), unde proteinele eluate (P) sunt
este capturate printr-o membrană cu pori mici
(SPM). Săgeata indică direcţia de migrare a
proteinelor iar BL este nivelul de tampon.
(După Shoji și colab. 1995).

O trăsătură caracteristică a acestui aparat, care permite randamente ridicate de proteine, este
utilizarea a două tipuri specifice de membrane și care prezintă o adsorbţie foarte redusă a
proteinelor. Una dintre membrane poate reţine macromolecule cu masa moleculară mai mare de
5000, în timp ce cealaltă membrană altă parte, dimensiunea porilor de care este 2µm, exclude
eficient debriurile de gel. Structura deschisă din partea superioară a acestui aparat elimină
posibilitatea de blocare a câmpului electric datorate bulelor de aer şi permite monitorizarea
uşoară a procesului de eluare cu o colectare ușoară a soluţiei de proteine recuperate în
compartimentul special conceput.
3.9.1.3.5. Electroeluterul de tip pasaj
Electroeluterul de tip pasaj, care a fost iniţial dezvoltat pentru concentrarea electroforetică a
proteinelor (Allington și colab., 1978), și constă dintr-un vas de tip pod cu o gură largă şi un altul
îngust de la ambele capete, care poate traversa soluția de tampon de electrod dintr-un rezervor în
celălalt, unde se află cei doi electrozi, anodic şi catodic (figura 3.82.).
 Figura 3.82. Reprezentarea schematica a
electroeluter de tip pasaj. Gelul excizat (G) este plasat pe
membrana semipermeabilă (M) în vasul mare (LC).
Proteina eluată din gelul se mișcă în fluxul de curent spre
vasul mic (SC) şi este capturatș ca un strat concentrat (P)
prin membrana semipermeabilă. Săgeata indică direcţia
de migrare a proteinei iar BL reprezintăi nivelul de
tampon. (După Shoji și colab. 1995).

Ambele capete ale aparatului sunt izolate cu membrane înainte de a se introduce piesa de gel
și tamponul de migrare. Gelul este plasat pe membrana din vasul mai mare, la capătul anodic şi
se efectuează electroeluția. Proteină eluată este captată pe membrana din vasul mic a vasului de
colectare (Hunkapiller și colab., 1983; Allington și colab., 1978; Bhown și colab., 1980).
Hunkapiller și colab (1983) arată că prin această metodă pot fi recuperate semicantitativ catități
de ordinul microgramelor de proteine cu mase molecular cuprinse între 2000 și 250000 Da din
fragmente de geluri, după separarea lor prin SDS-PAGE, în prezența ori în absența unor agenţi
de reducere, de tipul ditiothreitolului (Smith, 1991).
Această metodă este utilă nu numai pentru eluţia proteinelor din gel, dar, de asemenea, și
pentru concentrarea electrolitică a macromoleculelor, mai ales atunci când se dorește eliminarea
simultană a unor soluții neionice de tipul zaharozei (Allington și colab., 1978). În cazul în care
nu se pune problema îndepărtării unor substanţe neionice dizolvate, electroeluția se poate realiza
rapid prin plasarea fragmentului de gel excizat chiar deasupra vasului de colectare (Ochiai și
colab., 1987). Colectarea proteinei eluate trebuie să fie efectuată cu mare atenţie datorită
pericolului de diluare cauzată de reamestecarea ei cu tamponul de eluţie (Bhown și colab., 1980).
3.9.1.3.6. Capturarea proteinei printr-un sistem discontinuu de gradient de conductivitate
Capturarea de proteine electroeluate într-o soluţie de înaltă conductivitate a fost iniţial
raportată de Otto şi Snejdarkova (1981) şi a fost îmbunătăţită de către Strålfors și Belfrage
(1983). În fluxul de curent, proteina eluată din gel migrează rapid în stratul tampon de mică
conductivitate (figura 3.83.).
În momentul în care proteina intră în stratul cu o concentrație ridicată de sare, migrarea ei
este prompt încetinită şi în esenţă, se stopează după cum contribuţia proteinei ca electrolit devine
neglijabilă în comparaţie cu cea a ionilor din jur. Ca rezultat, proteina este stivuită şi concentrată
la interfaţa dintre straturile cu conductivitate scăzută și înaltă. Unul dintre avantajele majore ale
blocării proteinei în soluţia de înaltă de conductivitate este faptul că din sistemul de electroeluție
se pot exclude membranele semipermeabile. Prin urmare, toate problemele care apar ca urmare a
utilizării de membrane în electroeluție, inclusiv adsorbţia proteinei,
colmatarea porilor şi scurgerea de proteine prin membrană, sunt
eliminate. Această metodă are în plus avantajul că peptidele mici, care nu
pot fi reţinute pe membranele sunt recuperate cu succes.
Trebuie remarcat faptul că proteinele capturate la interfaţa de tampon
sunt deseori supuse procesului de salte out prin contactul lor cu
concentraţiile ridicate de săruri iar activitatea biologică este uneori
pierdută, deşi proteinele pot fi uşor recuperate sub forma unui precipitat
prin centrifugare.
 Figura 3.83. Reprezentarea schematică a dispozitivului de capturare a proteinei într-un sistem discontinuu cu
gradient de conductivitate. Proteina este eluată din gel (G) care este plasat pe un suport (S) într-un flux de curent şi
migrează în direcţia arătată de săgeată, prin stratul de tampon cu conductivitate scăzuta (LCL) şi se depune într-un
strat subţire (P) la interfaţa dintre LCL şi stratul de înaltă conductivitate (HCL). (După Shoji și colab. 1995).

În plus, o electroeluție în timp îndelungat, în acest sistem, poate conduce la scăderi

semnificative în randament din cauza unei concentraţii scăzute de ioni în zona înaltă de
conductivitate (Shoji și colab., 1995).
3.9.1.3.7. Capturarea proteinei eluate intr-un sistem de tampon de concentrare în stare de
echilibru
Sistemul tampon de stivuire a proteinelor în stare de echilibru, a fost introdus pe scară largă şi
utilizat în mod curent pentru concentrarea proteinelor în PAGE de către Ornstein (1964) şi Davis
(1964). Principiul acestui sistem tampon este detaliat diverse lucrări (Chrambach, 1980; Jovin,
1973) și în subcapitolul 3.6.6. Sistemul tampon implică o pereche de ioni, denumiți ioni
conducători şi finali, ale căror mobilităţi electroforetice sunt mai mari, respectiv mai mici decât
ale proteinei analit; acest principiu este efectiv aplicat la electroeluție în scopul capturării
proteinei eluate (figura 3.84.).

Figura 3.84. Reprezentarea schematică mecanismului de capturare a unei proteine

printr-un sistem de concentrare în stare de echilibru. Gelul excizat (G) este amplasat pe o
rețea de sprijin (S) aflată în compartimentul superior (UC), care este umplut cu tampon
alcătuit din ioni terminali. Proteina eluată din gel migrează, într-un câmp electric şi se
concentrează într-o zonă îngustă (P), aflată între ionii frontali și ionii terminali din
compartimentul inferior (LC). Direcţia de migrare a proteinelor este indicat de săgeată. În
cazul concentrării în starea staționară într-un tampon concentrat care conține ionul frontal
în conformitate cu Hashizume și colab. (1984), membrana semipermeabilă (M) este
folosită pentru a asigura recuperarea proteinei. (După Shoji și colab. 1995).

Compartimentul inferior al aparatului de electroeluție este umplut cu

tampon care conţine ioni conducători iar compartimentul superior conține
tampon care are în compoziție ioni posteriori. Proteina din gel este eliberată de către ionul final
în compartimentul superior și migrează între ionul conducător şi cel final în compartimentul
inferior. Se formează un front îngust format din ionii frontali şi terminali care se deplasează și
care conţine bandă proteică eluată, în formă concentrată. Au fost raportate mai multe metode
similare (Nguyen și colab., 1980; Wachslicht și Chrambach, 1978; Öfverstedt și colab., 1981;
Öfverstedt și colab., 1983) care utilizează o aparatură similară cu electroeluterul de tip vertical. Cu
toate acestea, suprapunerea celor două tampoane trebuie să se realizeze cu atenţie, astfel că
interfaţa dintre ele să nu fie tulburată, deoarece compoziţiile lor sunt diferite. În plus, trebuie să
fie alese cu atenție combinația sistemului celor două tampoane, conducător, respectiv terminal.
Este de remarcat că în acest sistem există posibilitatea pierderii de proteina din cauza adsorbţiei,
denaturării ori a colmatării membranei semipermeabile (Öfverstedt și colab., 1981; Duesberg și
Rueckert, 1965).
 3.9.1.3.8. Capturarea proteinei eluate prin stivuire în stare staționară, cu ionul frontal
concentrat
O metodă îmbunătățită de electroeluție a proteinelor din gelul de poliacrilamidă a fost
descrisă de Hashizume și colab. (1984) prin stivuire în stare staționară, cu ionul frontal
concentrat. Un avantaj al acestei metode constă în capacitatea ameliorată de capturare a proteinei
în tampon inferior, care permite un timp de eluare prelungit și o schimbare a pH-ului. Teoretic,
pentru eluţia completă a proteinelor din gel este de preferat mai degrabă o perioadă mai lungă de
electroeluție la tensiuni mai mari. În practică, în cazul electroeluției prin stivuire în stare
staționară, cu ionul frontal concentrat la tensiuni mari, de obicei, proteina eluată, coboară rapid și
înfundă membrana ceea ce conduce la un randament scăzut de recuperare a proteinei, în timp ce
o eluţie prelungită cu modificarea pH-ului tamponului de eluţie, de multe ori alterează activitatea
biologică a proteinei. Cu toate acestea, în electroeluția prin stivuire în stare staționară, cu ionul
frontal concentrat, gradientul de tensiune este menţinut scăzut în stratul inferior de tampon iar
timpul de eluţie fiind suficient pentru tranziția de pH, de la cel cu capacitate de tamponare mare
la tampon cu concentrație mai scăzută. Un alt avantaj al acestei metode îl reprezintă faptul că se
poate evitata precipitarea proteinei la interfaţa dintre tamponul cu concentraţie mare proces care
are loc frecvent în sistemul discontinuu cu gradient de conductivitate. Electroeluția prin această
metodă se realizează în acelaşi mod ca şi cel descris pentru metoda de concentrare în stare de
echilibru (figura 3.77.), cu excepţia faptului că sunt folosite diferite compozitii ale tampoanelor
cu ioni de conducere şi ioni terminali (Hashizume și colab., 1984). După electroeluție, unitatea
superioară este scosă iar soluţia de proteină din compartimentul inferior este fracţionată, picătură
cu picătură, prin intermediul unui orificiu realizat în partea inferioară a membranei. Deşi acest
sistem a fost dezvoltat iniţial pentru recuperarea proteine biologic active din geluri alcaline după
PAGE, au fost stabilite sisteme similare pentru geluri neutre ori acide (Hashizume și colab.,
1984). Acest sistem se aplică de asemenea la electroeluția proteinelor din geluri compozite
agaroză/poliacrilamidă (Rashid și Hashizume, 1982). O electroeluție de succes a albuminei din
geluri după SDS-PAGE, cu o recuperare de 94% a fost demonstrată cu un sistem care conține
tampon alcalin (Ofverstedt și colab., 1981). Metoda de electroeluție descrisă mai sus permite cu
succes transferul direct de proteine eluate pe membrane de poli(difluorură de viniliden) (PVDF),
prin suprapunerea membranei de PVDF pe membrana de celuloză. Astfel, analiza secvenței de
aminoacizi a proteinei de interes poate fi determinată direct, prin utilizarea unui singur fragment
sau mai multe de gel excizat (Shoji și colab. 1995).
3.9.1.3.9. Capturarea proteinei prin electroeluție în câmp electric inversat
Metoda de electroelutie cu câmp electric inversat (figura 3.85) reprezintă o tehnică de
separare a unei proteine țintă, după PAGE convenţională realizată în condiții native sau
denaturante, urmată de electroeluția proteinelor de interes din gel utilizând un sistem asemănător
celui electroforetic dar cu modificări minore, nefiind necesare dispozitive scumpe sau
membranele semipermeabile.

Figura 3.85. O reprezentare schematică a procesului de

electroelutie în câmp electric inversat: (A) electrod anodic din platină;
(B) tampon de incintă superioară (soluţie de electrod); (C) fragment de
gel care conţine proteina țintă; (D) gel de sprijin (gel din
poliacrilamidă, T%=5%); (E ) electrod catodic. Săgeţile indică direcţia
de migrare. (După Lim și colab., 2003).
 Prin aplicarea acestei tehnici s-a reușit purificarea rapidă, într-o singură etapă, din extractul
proteic total, a izoformelor inhibitorului chemotripsinei din Ganoderma lucidum (Lim și colab.,
2003). Electoeluția se realizează după cum urmează: se prepară 4ml de gel-suport de
poliacrilamidă, 5%, peste care se așează fragmentul de gel excizat, iar în continuare se plasează
o cantitate mică de soluție de poliacrilamidă, cu aceeași concentrație (sub forma unui sandwich
de poliacrilamidă). Soluţia tampon de electrod (Tris-HCl, 0,5 M) se plasează peste edificiul de
poliacrilamidă, într-un strat de circa 0,5 cm înălțime, pe partea superioară a plăcilor. În
continuare se conectează la sursa de curent invers decât în cazul electroforezei, electrodul anodic
la polul negativ, iar electrodul catodic la polul pozitiv (cablul roşu la conectorul negru pe sursa
de alimentare în timp ce cablul negru se leagă la conectorul roşu). Procesul se realizează la o
intensitate a curentului de 30mA, timp de o oră, când migrarea proteinei din fragmentul de gel se
va realiza în sus în loc de jos, cum se întâmplă de obicei. Figura 3.85 descrie schematic procesul
de electroelutie inversă. După eluație, toată soluţia de electrod se colectează cu ajutorul unui vârf
de pipetă sau cu o seringă, iar pH-ul soluţiei se ajustează la pH-ul optim pentru analiză. Eficiența
eluției proteinei din fragmentul de gel se analizează printr-o colorație cu Coomasie Blue (Lim și
colab., 2003).
3.9.1.5. Monitorizarea procesului de electroelutie
Monitorizarea procesului de electroelutie este esenţială pentru recuperarea de succes de
proteine, în special pentru a determina punctul final al procesului de capturare a acestora. Cu
excepţia unor proteine care sunt colorate sau care pot fi colorate cu coloranţi, procesul de eluţie
este de obicei monitorizat prin observarea migraţiei colorantului trasor; frontul de migrare a
colorantului conţinut în gel, este tăiat după electroforeză şi utilizat pentru monitorizarea
procesului (Hashizume și colab., 1984). În mod alternativ, colorantul trasor de tipul albastrului
de bromfenol (pentru geluri alcaline), albastrului de metilen, (pentru geluri neutre) sau verdelui
de metil şi pironinei Y (Mendel-Hartvig, 1982) pentru gelurile acide (figura 3.78.), poate fi uşor
încorporat într-o serie de fragmente de gel martor printr-o o incubare scurtă într-o baie de
colorare.
Monitorizarea se efectuează de preferinţă separat ori concomitent, pe fragmente de gel care
conţin numai colorantul, în scopul de se evita legarea permanentă a colorantului la proteina
eluată (Hashizume și colab., 1984).
3.9.1.6. Tratamente post-electroeluție a proteinelor recuperate
Proteină recuperată după electroeluție necesită de obicei un tratament înainte de a fi supusă
analizei finale, de exemplu, îndepărtarea de contaminanţii nedoriți, schimbarea tamponului,
concentrarea ei, etc. Moleculele mici, precum cele de Tris și glicină se elimină eficient prin
dializă ori electrodializă (Jacobs și Clad, 1986; Hunkapiller și colab.,1983). Gel filtrarea este
utilă pentru o schimbare rapidă a tamponului, cu eliminarea simultană a acestor molecule mici
(Nguyen și colab., 1980) ori a poliacrilatului liniar rezultat din tratamentul gelurilor realizate cu
agenți de reticulare solubili (Chrambach și Rodbard, 1971; Nguyen și colab., 1980). SDS, care
de multe ori interferă în tratamentele chimice şi enzimatice a proteinelor, poate fi eliminat prin
precipitare, extracţie cu solvenţi organic, cromatografie de perechi de ioni pe coloană ori
cromatografie în fază inversă pentru eliminarea SDS ori Coomassie-ul legat din proteinele eluate
(Hager și Burgess, 1980; Kapp și Vinogradov, 1978; Furth, 1980; Konigsberg și Henderson,
1983; Wessel și Flügge, 1984; Ratajczak și colab., 1988; Simpson și colab., 1987). Amfoliții
transportori pot fi eliminați din gelul de focalizare izoelectrică prin cromatografie bifuncţională
de schimb de ioni (Baumann și Chrambach, 1975). Concentrarea proteinelor recuperate este în
general realizată prin liofilizare folosind tampoane volatile, precum tampon carbonat acid de
amoniu, 50mM (Hunkapiller și colab., 1983) ori acetat de N-etil-morfolină, pH=8,5 (Bhown, și
colab., 1980), deşi procesul de liofilizare conduce, frecvent pierderi semnificative de proteină,
mai ales în condițiile purificării unor cantităţi mici de proteine. Concentratorul de tip Centricon
este util pentru concentrarea unor volume mici de soluţie de proteine, în timp ce metodele de
concentrare prin ultrafiltrare sunt eficiente doar pentru volume mai mari (Ben-David și
Chrambach, 1977).
3.9.1.7. Eluţia continuă a proteinelor după electroforeza pe gel de poliacrilamidă la scală
preparativă
În electroeluția continuă (figura 3.86), proteinele din probă sunt încărcate pe partea de sus a
unui gel și migrează în jos, sub un flux de current, fiind separate unele de altele în conformitate
cu procesul electroforetic la care sunt supuse. De îndată ce proteinele părăsesc gelul, acestea sunt
capturate într-un flux de tampon care se circulă la marginea inferioară a gelului, şi apoi
distribuite unui colector de fracţii prin intermediul unui detector care le monitorizează.
Câteva exemple a utilizării metodelor de eluție continuă (Lewis și Clark, 1963; Jovin și
colab., 1964; Hjerten și colab., 1965a; Hjerten și colab., 1965b; Gordon și Louis, 1967;
Brownstone, 1969; Hjerten și colab., 1969) sunt prezentate în tabelul 3.14.
Avantajele metodei de eluţie continuă rezidă în cantitatea mare de încărcare a proteinelor (50-
1000mg) cu un sistem simplu de colectare şi uşor de monitorizat ”on-line” proteinele eluate. În
această metodă sunt eliminate procedurile plictisitoare și consumatoare de timp care însoţesc
metodele clasice de electroeluție, precum localizarea, excizia şi eluarea electroforetică a
proteinelor de interes. Eliminarea procesului de colorare poate fi evitată ceea ce evită
denaturarea proteinelor. Pe de altă parte, un dezavantaj major al electroeluției continue, este
rezoluţia sa inferioră în comparaţie cu tehnicile electroforetice obişnuite. Rezoluţia slabă este
atribuită amestecului benzilor de proteine separate electroforetic în timpul proceselor de blocare
şi distribuție a acestora în tampon care se curge.

Figura 3.86. Reprezentarea schematica a eluţiei continue de

proteine prin electroforeză. Proteinele (P1 şi P2) sunt separate
electroforetic pe gel de poliacrilamidă, care se află sprijinit pe o plasă
(G). Proteinele separate migrează spre fluxul de tampon (indicat de
săgeată deschis) care circulă între plasa de sprijin şi membrana
semipermeabilă (M). Proteina care este eluată de către fluxul de
tampon (B) este distribuită la colectorul de fracţii prin detectorul de
monitorizare (D). (După Lim și colab., 2003).

Un flux lent de tampon are ca rezultat o difuzie şi o reamestecare a proteinelor care tocmai au
fost separate, în timp ce un flux rapid conduce la diluția acestora. În scopul de a atinge o
rezoluţie ridicată, cu o concentraţie mare de proteină capturată, sunt necesare experimente
preliminare pentru optimizarea condiţiilor de eluare, inclusiv a concentraţiei şi a mărimii gelului
de separare, a tensiunii aplicate şi a debitului de tampon (Chrambach, 1980; Gordon și Louis,
1967), operații consumatoare de timp.
 Tabelul 3.14. Aplicații ale metodelor de eluție continuă. (După Lim și colab., 2003).
Viteza de
Proteină Caracteristi Condiții curgere a Recuper Puritat Referință
(cantități) cile gelului de eluție tamponului are [%] e bibliografică
(ml/h)
-SDS,
Albumină/α 50mA Gordon și
T%=8% 400 x 45 18 - -
globulină (50-60 mg) (75V) 22h Louis, 1967
mm
+/-SDS,
Proteine cu mase 0,5- O
T%=5-7,5%
moleculare cuprinse 0,7mA singură Sheer și
0,9-1,5 80-90
între 14.460 și 92.500 bandă după colab., 1990
(1-300µg) 1-2,5 x 50 SDS-PAGE
1-5h
mm
7,5V/cm O Shain și
+SDS,
Lizozim/ovalbum singură colab., 1992;
T%=12% 4- 1,5-6 >70
ină (8-14µg) bandă după Ruggiero-Lopez
6 x 15 mm 2h SDS-PAGE și colab., 1993

Un alt dezavantaj al metodei de eluţie continue este faptul că necesită un aparat scump. Eluţia
continuă este utilă în special în experimentele de rutină pentru recuperarea unor cantități mari de
proteine specifice din probe parţial purificate în condiţii bine stabilite electroforetic.
3.9.2. METODE DE RECUPERARE A ACIZILOR NUCLEICI DIN
GELURILE DE AGAROZĂ
Uneori este necesar să se izoleze un fragment de individual ADN de alte fragmente. De multe
ori, de exemplu, se dorește să se utilizeze un anumit fragment ca sondă pentru un protocol de
blotting sau se încearcă clonarea sau subclonarea unui fragment special de ADN. Eluția poate
salva o mare parte din timp, mai ales atunci când se încearcă clonarea fragmentului de acid
nucleic după o digestie genomică. De exemplu, localizarea pe gel a unui fragment special, care
se dorește să se cloneze, se poate realiza prin hibridizare. Astfel, se digeră ADN-ul total, după
care se identifică fragmentul de interes iar în continuare se îmbogăţește fragment de interes
înainte de clonare. În acest ultim caz, se are în vedere scăderea efortului în termen de timp,
deoarece se reduce numărul de clone care trebuie să fie căutare pentru a găsi una dorită.
Îmbogăţirea în fragmentul de interes este, în general, realizată prin eluţie acestuia din gelul de
agaroză, după electroforeză. În timp ce procedeul pare deosebit de simplu, deseori se complică
din cauza improbabilității tăierii fine a gelurilor ori a existenței unor urme de agaroză, mai ales
dacă aceasta este impură care poate producă o inhibare a enzimelor utilizate ulterior într-un
proces de clonare.
3.9.2.1. Eluţia acizilor nucleici din geluri de agaroză
Există mai multe metode pentru eluţia fragmentelor de ADN din piesele de agaroză, după
cum există diferite tipuri de agaroză utilizate în acest scop. Metoda cea mai simplă constă în
introducerea fragmentului de gel care conţine moleculele de ADN de interes într-un sac de
dializă cu un tampon adecvat. Sacul este apoi plasat într-un incintă care conţine, de asemenea,
acelaşi buffer şi este aplicat un curent electric. După o perioadă de timp (de obicei 5-30 minute
la 50 la 200 V, într-o incintă mică, în funcţie de dimensiunea fragmentului de gel şi greutatea
moleculară a ADN) tensiunea este inversată pentru 15-60 secunde pentru a elimina orice ADN-
ul care este blocat în punga de dializă. Soluţia în interiorul sacului este apoi colectată iar ADN-ul
din soluţie este precipitat cu etanol. Astfel de dispozitive de electroeluție sunt disponibile și
comercial.
O altă metodă este cea de a decupa gelul direct la capătul benzii de interes şi se introduce în
fantă o bucată de hârtie modificată chimic (DEAE-celuloză sau hârtie DE-81), care va lega
electrostatic, moleculele de ADN. O bucată de membrană de dializă este, de asemenea, plasată in
spatele hârtiei (pe partea îndepărtată de banda de ADN) pentru a se evita orice trecere a
moleculelor de ADN dincolo de membrană. Este aplicat apoi un câmp electric până când
moleculele de ADN se transferă pe hârtia activată chimic. Hârtia este apoi colectată iar prin
schimbarea concentraţiei de sare, moleculele de ADN sunt trecute în soluție şi în continuare
precipitate cu etanol. Această metodă dă însă rezultate inconsistente. O metodă similară cu
aceasta este să se realizeze un godeu în faţa bandei de interes şi care se umple cu tampon.
O bucată de membrană de dializă este plasată pe latura îndepărtată (pe partea electrodului
pozitiv) a godeului pentru a acţiona ca și o barieră în calea ADN (dar nu și pentru trecerea
curentului electric). În continuare este aplicat un curent electric, astfel încât macromoleculele de
ADN se deplasează în godeu. Orice macromoleculă de ADN care trece în godeu este oprită de
membrană de dializă. După ce banda este transferată în totalitate din gel în godeu şi pe
membrană, curentul este inversat pentru 15-60 secunde pentru a elimina orice macromoleculă de
ADN de pe această membrană iar soluţia din godeu este preluată. În continuare,
macromoleculele de ADN sunt precipitate din această soluţie.
Alte metode de purificare a ADN, după electroforeză, folosesc perle de sticlă sau coloane, la
care, fie că se leagă moleculele de ADN ori se atașează contaminanţii. Principala problemă în
cazul acestor metode o reprezintă adesea degradarea ADN, mai ales dacă fragmentul este mai
mare decât 5Kb.
Metoda cea mai folosită este cunoscută sub denumirea de ”metodă optimizată de congelare și
extracție”, (Thuring și colab., 1975; Tautz şi Renz, 1983) și care are mai multe avantaje faţă de
celelalte tehnici (Rogers' Lab.):
 este mult mai curată decât celelalte metode, mai ales în cazul în care este de dorit să se
obțină cantităţi mici de ADN ori în cazul în care este utilizată bromura de etidiu;
 este o metodă foarte simplă și rapidă;
 randamentele de recuperare a ADN sunt excelente. Fragmentele mici (mai mici de 5Kb)
sunt eluate și recuperate într-un procent de 80-95%. Chiar ADN lambda (de 50 Kb) poate fi
recuperat într-un randament de până la 50%.
 macromoleculele de ADN își păstrează forma, după precipare.
 dacă în cazul altor metode de eluţie, există o degradare semnificativă a
macromoleculelor de ADN, cu această metodă, chiar şi ADN lambda poate fi obţinut fără o
deteriorare aparentă. Figura 3.87 prezintă schematic un protocol de extracție a fragmentelor de
ADN după electroforeză pe gel de agaroză (Rogers' Lab.).
 Figura 3.87. Reprezentarea schematică a protocolului de extracție a fragmentelor de ADN după electroforeză pe
gel de agaroză (după Rogers' Lab.).

3.9.3. ELECTROFOREZA PREPARATIVĂ A ORGANITELOR ȘI

PARTICULELOR CELULARE ÎN GELURI DE AGAROZĂ
Metodele tradiţionale de fracţionare subcelulară, de separare a organitelor celualre utilizează
ultracentrifugarea în gradient (atât prin viteza de sedimentare cât și prin gradient izopicnic).
Rezoluţia structurilor subcelulare este, prin urmare, dependentă de mărimea şi densitatea
acestora. În cazul organitelor mai mari aceste diferenţe sunt, în general, suficiente pentru a
permite o purificare relativ completă. Cu toate acestea, structurile mai mici, precum veziculele
netede, veziculele acoperite, ribozomii şi microfilamente fragmentate, care au diferenţe relativ
minore în valorile de sedimentare şi de densitate, în multe cazuri, separarea lor completă devine
dificilă. Virusologi se confruntă cu probleme similare în purificarea virionilor şi au folosit geluri
de poliacrilamidă la separarea unor bacteriofagi şi a unor virioni (Childs și Birnboim, 1975;
Hutchison și colab., 1967). Cum dimensiunea porilor gelurilor de poliacrilamidă este relativ
mică, a condus iniţial la utilizarea unor geluri mixte/compozite de poliacrilamidă/agaroză
(Lishanskaya și Mosevitsky, 1973; Yamaguchi și Yanagida, 1980); ulterior, virionii au fost
separați pe geluri simple de agaroză, prin utilizarea unor preparate diluate, care au conţinut
0,035% biopolimer (Serwer și Pichler, 1978; Serwer și Hayes, 1982; Serwer, 1981). O tehnică
electroforetică pe gel de agaroză a fost utilizată la purificarea unor vezicule acoperite
(Rubenstein și colab., 1981; Gottlieb și colab., 1985), care posedă un diametru ce variază între
70-120 nm (Pearse, 1976).
Dacă la început, din cauza dificultăţilor tehnice în extragerea structurilor purificate în gel și a
recuperărilor scăzute, astfel de geluri de agaroză au fost folosite exclusiv în scopuri analitice
(Rubenstein și colab., 1981), Kedersha și Rome (1986) au descris o tehnică preparativă de
electroforeză pe gel orizontal de agaroză. Această modificare a sistemului standard de
electroforeză în gel de agaroză, presupune adăugarea unui "godeu de eluție", situat în aval de
godeul electroforetic al probei (figura 3.88). Circulația continuă a tamponului în acest godeu,
realizat perpendicular pe direcția de migrare electroforetică, se realizează cu ajutorul unei pompe
peristaltice cu două canale, care colectează conținutul godeului și îl direcționează spre un
colector de fracţiuni, ceea ce permite recuperarea completă şi nedistructivă a organitelor ori a
particulelor care s-au separat pe gel.

Figura 3.88. Schema sistemului de electroforeză orizontală pe

gel de agaroză utilizat la separarea preparativă a organitelor și
particulelor celulare. Se prezintă linia și direcția de eluție. Detaliul
insertat: godul realizat prin tăierea perpendiculară a gelului; în
partea interioara se introduce tubulatura de extractie care
direcţionează fluxul de tampon din godeu. (După Kedersha și
Rome 1986).

În atare condiţii, utilizând un gel cu concentrație și electroendoosmoză redusă, separarea

particulelor mici pare să se bazeze în principal pe diferenţele de sarcină (Yamaguchi și Yanagida,
1980; Childs, 1980), procesul fiind în mare măsură independent de dimensiunea şi de densitatea
lor dinamică. Ca și cele mai multe tehnici comune de preparare a organitelor celulare ea se
bazează mai ales pe viteză şi gradienţi izopicnici, dimensiunea particulelor şi densitatea lor fiind,
de obicei, parametrii pe care astfel de separări îi ating. Separarea dependentă de sarcină a
organitelor celulare mici, indiferent de mărimea şi densitatea lor, permite separarea diferitelor
structuri care posedă dimensiuni similare şi o densitate care, prin alte tehnici sunt în prezent greu
pentru a fi purificate. Prin această tehnică se pot separa și recupera ribozomi, fragmente
microfilamentoase, complexe de proteine precum și formele heterogene ale feritinei. Utilizând
această procedură s-a reușit rezolvarea fracției microzomale într-o serie de fracțiuni discrete,
după două etape de centrifugare diferențială (Kedersha și Rome 1986).
3.9.4. ELECTRODIALIZA PREPARATIVĂ A PROTEINELOR DIN GELURI
DE AMIDON
Ca o metodă de separare a macromoleculelor incarcate electric, electroforeza pe gel de
amidon este, uneori, de neegalat. Două obstacole au împiedicat realizarea la întregul său
potenţial al acestei tehnici pentru prepararea unei probe. Unul este reprezentat de limitarea
dimensiunii probei: de obicei, într-un singur gel, se pot procesa doar aproximativ 0,3-0,4 ml. Un
al doilea obstacol este cel de dificultate în extragerea probei din gelul de amidon, după separare,
din cauza unor fenomene de adsorbţie nespecifică. Koen și Shaw (1964) au descris o metodă
preparativă pe geluri amidon, cu un volum al probei de până la 1,5 ml de soluţie cu ajutorul
căreia pot fi separate prin eluare cu randament ridicat diverse proteine (enzime) prin
electrodializă.
Au fost descrise o serie de metode de electrodializă a gelului de amidon (Morewi și colab.,
1958; Tsuyuki, 1963; Lloyd și Meares, 1964), cu randamente de extracție diferite ori deseori prea
lente sau complicate. Metoda descrisă de Koen și Shaw (1962) pare a fi mai simplă şi rapidă,
conducând la rezultate deseori foarte bune. Astfel, ei utilizează geluri de 30 cm lungime, cu 12
cm lăţime și 1 cm adâncime, în care se realizează godeuri de 2,5 cm lungime, 1,6 mm lățime și 8
mm adâncime, în total putându-se separa un volum total de 1,2-1,5 ml de probă.

Figura 3.89. Prezentarea schematică a aparaturii utilizate la electrodializa gelului de amidon. Se observă sacul de
dializă suspendat în tamponul din rezervor. În detaliu se prezintă fragmentele de gel de amidon aflate într-un sac de tip
plasă, introdus în sacul de dializă (după Koen și Shaw, 1962).
După o separare electroforetică care se efectuează în condiții obişnuite, gelul este crestat la
un colţ, pentru orientare; o piesă de 1,6 mm, este prelevată prin secționarea orizontală a gelului și
care este utilizată la studiul compusului particular separat în conformitate cu o tehnică
corespunzătoare. În momentul în care benzile componentului analizat devin vizibile, soluţia de
dezvolatre a culorii este înlocuită cu apă distilată, neutilizându-se astfel soluții specifice de
fixare, deoarece acestea vor cauza contracția gelului. Piesa de gel în care s-a dezvoltat reacția de
culoare după ce a fost imersată în apăși plasată în camera rece timp de 15 sau 20 de minute, până
când se răceşte suficient pentru a fi trată, în continuare, cu uşurinţă. Între timp, piesele neutilizate
la identificarea benzii de interes sunt învelite în folie alimentară (Saran Wrap) si lăsate în camera
frigorifică. Când s-au răcit, una din piesele de gel la care nu s-a dezvoltat reacția de culoare este
plasată pe o foaie curată din plexiglas, la care se suprapune piesa în care s-a identificat compusul
de interes, potrivindu-se cu atenţie toate colţurile şi marginile. Zonele corespunzătoare benzii
dorite este apoi tăiată cu o lamă de bisturiu prin ambele piede de gel. Secţiunea superioară de gel
în care s-a dezvoltat reacția de identificare este eliminată, iar secţiunea inferioară este astfel
pregătită pentru electrodializă.
Principial, electrodializa este o dializă concentrică. Aceasta implică utilizarea unui sac
realizat dintr-o plasă care este situat într-un sac de dializă. Sacul din plasă poate fi confecționat
dintr-o dantelă obişnuită, comercială, ori poate fi realizat din nylon sau nylon şi având o
dimensiune a ochiurilor de aproximativ 1,5 mm. Dantela se taie în pătrate de aproximativ 4 x 4
cm. Din această plasă se modează prin plierea dantelei un mic sac care este cusut de-a lungul
marginilor opus. Piesele de amidon sunt introduse în sac care se închide printr-unfir și care
asigură securitatea acestora, lăsând însă un fir lung la capătul terminal.O bucată dintr-un sac de
dializă, puţin mai mare decât sacul din dantelă se îmbibă în tampon, după care sacul din dantelă
se introduce la o distanţă scurtă față de unul dintre capete, după care se pipetează, în interiorul
lui, tampon de captare (cel mult 0,5 ml). Sacul de dializă se închide iar firul care a fost lăsat din
sacul de dantelă se atașează la marginea tancului electroforetic iar capătul opus, este legat cu un
alt fir, care se atașează la partea opusă a sistemului electroforetic (figura 3.89., cadranul interior).
Tancul electroforetic este umplut cu acelaşi tampon ca și cel utilizat în sacul de dializă, sacul
este cufundat în el, iar firele sunt ataşate la fiecare capăt al incintei, astfel încât acesta să
orienteze longitudinal (figura 3.89.). Ambele capete ale sacului de dializă trebuie să fie așezate în
aşa fel încât să-l mențină cufundat în tampon. Electrozii sunt ataşați la fiecare capăt al tancului
de electrodializă, în tampon. Se aplică în continuare un curent, cu polaritate astfel aleasă încât
moleculele să migreze din sacul de plasă în soluţia de captare. Cum rezistenţa curentului este
mică, are loc o cădere mare de potențial la o tensiune relativ scăzută (de exemplu, 100 mA la 80
volţi), iar particulele încărcate se vor mișca rapid. În mod obișnuit procesul de electrodializă
durează circa patru ore, fiind de obicei timp suficient pentru ca și cei mai lenți ioni să migreze
complet din gelul de amidon în tamponul de captare. După electrodializă, sacul de dializă este
deschis iar soluţia care conţine proteina de interes este transvazată într-o eprubetă. Prin presiune
uşoară asupra pieselelor de amidon din sacul de dantelă va conduce la o mai bună recuperare a
proteinei de interes. În plus, gelul de amidon poate fi ușor agitat cu 0,1 ml de soluţie tampon,
care se adaugă apoi la soluţia principală care conține componentul țintă.
3.9.5. ELECTROELUȚIA PROTEINELOR DUPĂ SDS-PAGE, FĂRĂ
SECȚIONAREA GELULUI
SDS-PAGE și electroforeza bidimensională ca tehnici înrudite, sunt universal utilizate la
separarea proteinelor. În multe aplicații, cum ar fi studiul structurii proteinei și a modificărilor
acestora, analize imunologice ori funcționale, proteinele de interes, separate, necesită a fi extrase
din gel. O cale convențională de eluție o reprezintă difuzia ori electroforeza pieselor de gel care
conțin spotul (banda) proteinei țintă (Harrington și colab., 1991). O cale alternativă este cea de
electroeluție a proteinei din banda de gel fără secționarea acestuia (“electroeluție directă”) prin
plasarea conexiunilor electrozilor într-un gel intact, în poziția benzii proteice de interes, și astfel
inducându-se un câmp electric ortogonal, orientat spre gelul de separare. Comparativ cu metoda
de secționare, această metodă are avantajul vitezei, economicității, fiind candidată la
automatizare (Yefimov și colab., 2000; Chang și colab., 2001; Yefimov și colab., 2001).
Buzas și colab. (2001) au demonstrat fezabilitatea electroeluției directe a unei proteine intacte
aplicată pe geluri de mici dimensiuni. Tehnica a fost detailată sub aspect cantitativ de către
Radko și colab. (2002) care au extins procedura la un domeniu larg de mase moleculare proteice
(între 14 și 120kDa). În procedura de electroeluție a fost introdusă colorarea proteinelor cu un
colorant fluorescent, care să permită o bună observare a benzilor de proteine direct, în timpul
electroeluției, precum şi o abordare simplă (de ultrafiltrare secvenţială) să concentrează
proteinele electroeluate cu diminuarea consecutivă a cantității de SDS din proba electroeluată,
până la un nivel compatibil cu spectrometria de masă a proteinelor. Pentru o bună electroeluție a
proteinelor de pe geluri pentru transferul acestora spre spectrometrul de masă, cu minimizarea
modificărilor structurale și funcționale a acestora se utilizează colorația reversibilă cu K, Cu, ori
Zn (Buzas și colab. 2001; Steinberg și colab., 1996; Jensen și colab. 1997; Patton, 2000).
O abordare alternativă este folosirea fluorescenţei cu ajutorul coloranţilor SYPRO (Patton,
2000), care sunt cunoscuți a se lega de învelișul de SDS al proteinelor învelite în detergent
(Steinberg și colab., 1996). După îndepărtarea SDS în timpul sau după eluare, colorantul este, de
asemenea, îndepărtat, făcând astfel reversibilă coloraţia proteinelor. Coloraţia cu Zn a fost
utilizată anterior în ceea ce privește electroeluția directă a proteinelor din geluri (Buzas și colab.
2001). Cu toate acestea, o astfel de coloraţie necesită o solubilizare ulterioară precipitatului
proteic spre permite o electroeluție a proteinelor. Prin contrast, utilizarea colorantului
fluorescent, SYPRO-red, permite electroeluția proteinelor direct, dintr-o bandă colorată, fără o
astfel de etapă de "decolorare".
Benzile fluorescent-colorate pot fi pur şi simplu
vizualizate în timpul electroeluției prin poziţionarea,
în mod regulat a gelului într-un iluminator vertical UV
laborator, ori prin iluminarea gelului cu un laser verde.
Utilizarea coloraţiei fluorescente permite poziţionare
uşoară a bandei între tubul de eluție şi fitilul catodic
(figura 3.90), făcând astfel procedura de electroeluție,
directă și simplă.
 Figura 3.90. O reprezentare schematică a setup-ului experimental utilizat în electroeluția directă a proteinelor din
gel, fără secționare. (După Radko și colab., 2002).

Sensibilitatea de detecţie este de 0,5-1 µg de proteină pe bandă, la iluminare UV, dar crește la
0,1-0,2 µg, la iluminare cu laser. Această sensibilitate este comparabilă sau depăşeşte chiar
sensibilitatea colorării cu Coomassie în soluţii apoase, în sistem metanol:acid acetic (Radko și
colab., 2002). Deşi sensibilitatea colorației cu SYPRO-red poate fi ulterior mărită prin adăugare
de acid acetic (5-7,5%) în soluţia de colorare (Steinberg și colab., 1996), totuși creșterea
ușuirnței fixării împiedică procesul de electroeluție. În principiu, pentru a putea spori, de
asemenea, sensibilitatea de detecție, se înlocuie detecția vizuală cu o cameră video adecvată
(Sutherland și colab., 1993). Cu toate acestea, se consideră că desfăşurarea manuală a
electroeluției și urmărirea pe un ecran de computer ar conduce la dificultăți în compare, față de
efectuarea observaţiei vizuale a comportamnetului gelului fluorescent (Radko și colab., 2002).
Aparatul este astfel configurat la sistemul de eluție încât impiedică scăderea preogresivă a
pH-ului, proces care apare în timpul extragerii spotului proteic din gel.
3.9.6. ELUŢIA ENZIMELOR DIN GELURI
În cazul enzimelor, dacă tehnicile de evidenţiere “in situ”, de localizare în gel, nu sunt
posibile, este posibilă eluţia acestora urmată de determinarea activităţii lor, realizată prin
tehnicile convenţionale. Eluţia din geluri poate fi realizată prin omogenizarea mecanică, prin
difuziune ori prin electroeluţie (Kårsnäs și Roes, 1977; Hager și Burgess, 1980). Omogenizarea
gelurilor într-un omogenizator de ţesuturi din sticlă ori teflon este simplă (Hager și Burgess,
1980; Djondjurov și Holtzer, 1979) dar excizia benzii care conţine enzima din gel şi extragerea
ei într-un tampon optim este cel mai puţin eficientă. În acest sens, a fost descrisă o tehnică de
electroeluţie a proteinelor excizate din gelul de separare şi de trecere a fragmentelor de gel într-
un sac de dializă (Lewis și Clark, 1963; Stephens, 1975; Nguyen și colab., 1980; Bhown și
colab., 1980; Tuszynski și colab., 1977).
3.9.7. CONCLUZII
 Au fost raportate diverse tehnici de electroeluţie precum cea în gradienţi de
conductivitate, metodă care presupune reținerea proteinelor eluate din piesele de gel într-un
gradient discontinuu de conductivitate Metoda, conduce la recuperări semnificative de proteină
(circa 0,1 micrograme) cu randamente mari (85-95%) într-un interval de 2 ore dintr-un volum
mai mic de 0,1 ml (Strålfors și Belfrage, 1983; Otto și Snejdárková, 1981).
 O altă tehnică implică eluția prin gradienţi de sucroză (Kårsnäs și Roes, 1977). Astfel a
fost descris un aparat care îmbunătățește tehnica de electroeluție din geluri plate de
poliacrilamidă într-un gradient de sucroză, concentrând electroforetic componentele probei într-
un sac de colodiu prin alterarea intensității curentului. Metoda este aptă să elueze cantități mici
de probă fără material de background care provine din gel și permite în continuare dializa și
ultrafiltrarea fără pierderi la transfer. Ea poate fi realizată atât în tampoane bazice cât și acide
fiind aplicată la purificarea tirotropinei umane hipofizare.
 Tehnica care implică hidroxilapatita dezvoltată de Ziola și Scraba (1976), permite
purificarea proteinelor în cantități necesare caracterizării lor fizico-chimice. Proteina ce urmează
a fi purificată este separată de contaminanți prin electroforeză într-un sistem de disc-
electroforeză pe geluri de poliacrilamidă în prezență de dodecil sulfat de sodiu. Regiunea de gel
care conține banda de proteină țintă este apoi tăiată iar bucățile de gel sunt trecute într-un alt tub.
În continuare proteina este transferată electroforetic din părțile de gel pe un pat de
hidroxilapatită, fiind apoi elută de pe hidroxilapatită cu un tampon fosfat de sodiu, 0,5M
(pH=6,4) care conține SDS, 0.1% și ditiotreitol, 1mM. Proteina se recuperează mai mult de 90%.
 Nguyen și colab. (1980) au dezvoltat o tehnică de concentrare a proteinelor în stare
staţionară. Astfel, cu ajutorul unui dispozitiv simplu (Wachslicht și Chrambach, 1978) proteina
din probă se concentrează în stare staționară. Aparatul este capabil să concentreze mai multe
geluri simultan cu un randament de peste 70%.
 Tehnica de eluție și de concentrare prin matrici capilare (trans-eluție) elaborată de
Thelu (1988) este simplă și rapidă care permite purificarea macromoleculelor blocate în geluri de
poliacrilamidă în urma electroforezei. Această metodă de purificare constă dintr-un transfer
lateral de macromolecule de pe gelul placă către un suport inert, sub influenţa unui câmp
electric. În contrast cu rolul membranei de nitroceluloză folosită în tehnica ”Western blot”, în
acest caz, suportul nu se leagă de macromolecule. El este alcătuit dintr-o reţea capabilă să
păstreze tampon prin capilaritate. Proteinele electroelutate rămân în soluţia-tampon şi astfel este
uşor să fie recuperate (Gabriel și Gersten, 1992).
Bibliografie
Allington, W. B., Cordry, A. L., McCullough, G. A., Mitchell, D. E., Nelson, J. W. (1978) Electrophoretic
concentration of macromolecules. Anal. Biochem. 85:188-196.
Andrews, A. T. Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical and Clinical Applications, 2nd ed. Oxford
University Press, Oxford, 1986.
Anker, H. S. (1970) A solubilizable acrylamide gel for electrophoresis. FEBS Lett. 7:293.
Baumann, G., Chrambach, A. (1975) Quantitative removal of carrier ampholytes from protein fractions derived
from isoelectric focusing. Anal. Biochem. 69:649-651.
Baumann, G., Chrambach, A. (1976) A highly crosslinked, transparent polyacrylamide gel with improved
mechanical stability for use in isoelectric focusing and isotachophoresis. Anal. Biochem. 70:32-38.
Ben-David, M., Chrambach, A. (1977) Preparation of bio- and immunoactive human prolactin in milligram
amounts from amniotic fluid in 60% yield. Endocrinology 101:250-261.
Bernabeu, C., Conde, F. P., Vazquez, D. (1978) Extraction of pure ribosomal protein and removal of Coomassie
blue from acrylamide gels. Anal. Biochem. 84:97-102.
Bhown, A. G., Mole. J. E., Hunter, F., Bennett, J. C. (1980) High-sensitivity sequence determination of proteins
quantitatively recovered from sodium dodecyl sulfate gels using an improved electrodialysis procedure. Anal
Biochem.103:184-190.
Bhown, A. S., Mole, J. E., Hunter, F., Bennett, J. C. (1980) High-sensitivity sequence determination of proteins
quantitatively recovered from sodium dodecyl sulfate gels using an improved electrodialysis procedure. Anal.
Biochem. 103:184-190.
Bray, D., Brownlee, S. M. (1973) Peptide mapping of proteins from acrylamide gels. Anal. Biochem. 55:213-221.
Brownstone, A. D. (1969) A versatile system for preparative electrophoresis in acrylamide gel. Anal. Biochem.
27:25-46.
Burmeister, M., Lehrach, H. (1989) Isolation of large DNA fragments from agarose gels using agarase. Trends
Genet. 5:41.
Buzas, Zs., Chang, H.-T., Vieira, N. E., Yergey, A. L., Stastna, M., Chrambach, A. (2001) Direct vertical
electroelution of protein from a PhastSystem band for mass spectrometric identification at the level of a few
picomoles. Proteomics 1:691–698.
Buzas, Zs., Chang, H.-T., Vieira, N. E., Yergey, A. L., Stastna, M., Chrambach, A. (2001) Proteomics 1:691–698.
Chang, H.-T., Yergey, A. L., Chrambach, A. (2001) Electroelution of proteins from bands in gel electrophoresis
without gel sectioning for the purpose of protein transfer into mass spectrometry: elements of a new procedure.
Electrophoresis 22:394–398.
Childs, J. D. (1980) Effect of hoc protein on the electrophoretic mobility of intact bacteriophage T4D particles in
polyacrylamide gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 141:163-173.
Childs, J. D., Birnboim H. C., (1975) Polyacrylamide gel electrophoresis of intact bacteriophage T4D particles. J.
Virol. 16:652–661.
Chrambach, A. (1980) Electrophoresis and electrofocusing on polyacrylamide gel in the study of native
macromolecules. Mol. Cell. Biochem. 29:23-46.
Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. VCH, Weinheim, 1985.
 Chrambach, A., Nguyen, N. Y. Preparative electrophoresis, isotachophoresis and electrofocusing on
polyacrylamide gel. In Electrokinetic Separation Methods (P. G. Righetti, C. J. van Oss, J. W. Vanderhoff, eds.), pp.
337-368. Elsevier/North-Holland, Amsterdam, 1979.
Chrambach, A., Rodbard, D. (1971) Polyacrylamide gel electrophoresis. Science 172:440-451.
Davis, B. J. (1964) Disc electrophoresis. ii. method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci.
121:404-427.
Djondjurov, L., Holtzer, H. (1979) A method for recovery of proteins from sodium dodecyl sulfate--
polyacrylamide gels. Anal Biochem. 94:274-277.
Duesberg, P. H., Rueckert, R. R. (1965) Preparative zone electrophoresis of proteins on polyacrylamide gels in 8
M urea. Anal. Biochem. 11:342-361.
Dzandu, J. K., Johnson, J. F., Wise, G. E. (1988) Sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis: Staining of
polypeptides using heavy metal salts. Anal. Biochem. 174:157-167.
Furth, A. J. (1980) Removing unbound detergent from hydrophobic proteins. Anal. Biochem. 109:207-215.
Gabriel, O., Gersten, D. M. (1992) Staining for Enzymatic Activity after Gel Electrophoresis, I. Review. Anal.
Biochem. 203:1-21.
Garfin, D. E. Chapter 7: Gel Electrophoresis of Proteins, in Essential. Cell Biology, Volume 1: Cell Structure, A
Practical Approach, Edited by John Davey and Mike Lord, Oxford Univesity Press, Oxford UK, Pag. 197-268, 2003.
Garfin, D. E. Electrophoretic Methods. in Glasel JA and Duetscher MP (eds) Introduction to Biophysical Methods
for Protein and Nucleic Acid Research, Academic Press, San Diego, pag. 53-109, 1995. http://books.
google.ro/books?id=g_scOXFJvTEC&pg=PA53&lpg=PA53&dq=garfin+electrophoretic+methods+chapter+2&sourc
e=bl&ots=UKe0aWa3mW&sig=joK-bEHMNXpuMB9VjNyMRZoSdNs&hl=ro&sa=X&ei=5fqkUIPoAs7Tsgawp
IDoDw&ved=0CD0Q6AEwBA#v=onepage&q=garfin%20electrophoretic%20methods%20chapter%202&f=false
Gordon, A. H., Louis, L. N. (1967) Preparative acrylamide electrophoresis: A single gel system. Anal. Biochem.
21:190-200.
Gottlieb, M. H., Steer, C. J., Steven, A. C., Chrambach, A. (1985) Applicability of agarose gel electrophoresis to
the physical characterization of clathrin-coated vesicles. Anal. Biochem. 147:353-363.
Grierson, D. Gel electrophoresis of RNA. In Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. (D. Rickwood and R. D.
Hames, editors.) Oxford University Press, Oxford, UK. 12-14, 1990.
Hager, D. A., Burgess, R. R. (1980) Elution of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels,
removal of sodium dodecyl sulfate, and renaturation of enzymatic activity: results with sigma subunit of Escherichia
coli RNA polymerase, wheat germ DNA topoisomerase, and other enzymes. Anal Biochem. 109:76-86.
Hames, B. D. Gel Electrophoresis of Proteins, in B. D. Hames and D. Rickwood (Editors), IRP Press, Oxford, 2nd
ed., 1990.
Hames, B. D. One-dimensional Polyacrylamide gel electrophoresis. In Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical
Approach, 2nd edn (Hames B.D. & Rickwood, D., editors) IRL Press, Oxford, 1990.
Hanaoka, F., Shaw, J. L., Mueller, G. C. (1979) Recovery of functional proteins from sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 99:170-174.
Hansen, J. N. (1981) Use of solubilizable acrylamide disulfide gels for isolation of DNA fragments suitable for
sequence analysis. Anal. Biochem. 116:146-151.
Harrington, M. G. (1990). Elution of protein from gels. Methods Enzymol. 182:488-495.
Harrington, M. G., Gudeman, D., Zewert, T., Hood, L. (1991) Methods: a companion to methods in enzymology
Methods 3:98–108.
Hashizume, S., Rashid, M. A., Shoji, M., Kuroda, K. (1984) Electrophoretic extraction-concentration of proteins
from polyacrylamide gels under alkaline, neutral and acidic conditions. Electrophoresis 5:30–34.
Hediger, M. A. (1984). Apparatus and method for preparative gel electrophoresis. Anal. Biochem. 142:445-454.
Higgins, R. C., Dahmus, M. E. (1979) Rapid visualization of protein bands in preparative SDS-polyacrylamide
gels. Anal. Biochem. 93:257-260.
Hirano, H., Wittmann-Liebold, B. Methods in Protein Sequence Analysis. in B. Wittmann Liebold (Editor),
Springer, Berlin, 1989.
Hjelmeland, L. M., Chrambach, A. (1981) Electrophoresis and electrofocusing in detergent-containing media: a
discussion of concepts. Electrophoresis 2:1-11.
Hjerten, S., Jerstedt, S., Tiselius, A. (1965 a) Electrophoretic “particle sieving” in polyacrylamide gels as applied to
ribosomes. Anal. Biochem. 11:211-218.
Hjerten, S., Jerstedt, S., Tiselius, A. (1965b) Some aspects of the use of “continuous” and “discontinuous” buffer
systems in polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 11:219-223.
Hjerten, S., Jerstedt, S., Tiselius, A. (1969) Apparatus for large-scale preparative polyacrylamide gel
electrophoresis. Anal. Biochem. 27:108-129.
Hrkal, Z. J. Chromatography Library Vol. 18, Electrophoresis: a survey of techniques and application, Part A,
techniques., Deyl, Z. ed, Everaerts, F. M., Prusík, Z., Svendsen P. J., coeds. Elsevier Scientific Publishing Company,
1979 http://books.google.ro/books?id=NsvzQ7Lqo8kC&pg=PA299&lpg=PA299&dq=preparative +electrophoresis
&source=bl&ots=_EX2T8s0ed&sig=3qRkREJyf5lj6-hZZda63YmXaoM&hl=ro&ei=SCA CTK __OJmXO
Kvo6NYE&sa=X&oi=book_ result&ct=result&resnum=4&ved=0CC4Q6AEwAzgU#v=onepa ge&q=preparative
%20electrophoresis&f=false
Hunkapiller, M. W., Lujan, E., Ostrander, F., Hood, L., E. (1983) Isolation of microgram quantities of proteins
from polyacrylamide gels for amino acid sequence analysis. Methods Enzymol. 91:227-236.
Hutchison, C. A., Edgell, M. H., Sinsheimer, R. L. (1967) The process of infection with bacteriophage ϕX174.
XII. Phenotypic mixing between electrophoretic mutants of ϕX174. J. Mol. Biol. 23:553-575.
Ihara, S., Suzuki, H., Kawakami, M. (1987) Recovery of polypeptides from polyacrylamide gels by
electrophoretic elution in a centrifugation concentrator. Anal Biochem. 166:349-352.
Jacobs, E., Clad, A. (1986) Electroelution of fixed and stained membrane proteins from preparative sodium
dodecyl sulfate-polyacrylamide gels into a membrane trap. Anal. Biochem. 154:583-589.
Jensen, O. N., Shevchenko, A., Mann, M., in: Creighton, T. E., (Ed.), Protein Structure: A Practical Approach,
Oxford University Press, New York 1997, pp. 29–58.
Jovin, T. M. (1973) Multiphasic zone electrophoresis. 3. Further analysis and new forms of discontinuous buffer
systems. Biochemistry 12:890-898.
Jovin, T. M., Chrambach, A., Naughton, M. A. (1964) An apparatus for preparative temperature-regulated
polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 9:351-369.
Kapadia, G., Chrambach, A. (1972) Recovery of protein in preparative polyacrylamide gel electrophoresis. Anal
Biochem. 48:90-102.
Kapp, O. H., Vinogradov, S. N. (1978) Removal of sodium dodecyl sulfate from proteins. Anal. Bochem. 91:230-
235.
Kårsnäs, P., Roes, R (1977) Two methods for electrophoretic elution of proteins from polyacrylamide gels. Anal
Biochem. 77:168-175
Kedersha, N. L., Rome, L. H. (1986) Preparative agarose gel electrophoresis for the purification of small
organelles and particles. Anal. Biochem. 156:161-170.
Kennedy, T. E., Wager-Smith, K., Barzilai, A., Kandel, E. R., Sweatt, J. D. (1988) Sequencing proteins from
acrylamide gels. Nature 336:499-500.
Kim, S. M. (2009) Microfluidic system for electroelution of proteins from a clinical sampling strip. Microsyst.
Technol. 15:695–701.
Koen, A. L., Shaw, C. R. (1964) A Preparative Method Employing Starch Gel Electrophoresis and Electrodialysis.
Anal Biochem. 9:495-498.
Konigsberg, W. H., Henderson, L. (1983) Removal of sodium dodecyl sulfate from proteins by ion-pair
extraction. Methods Enzymol. 91:254-259.
Koziarz, J. J., Köhler, H., Steck, T. L. (1978) A system for preparative polyacrylamide gel electrophoresis in
sodium dodecyl sulfate. Anal. Biochem. 86:78-89.
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227:680-685.
Lee, C., Levin, A., Branton, D. (1987) Copper staining: A five-minute protein stain for sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 166:308-312.
LeGendre N., Matsudaira, P. (1988) Direct protein microsequencing from Immobilon-P transfer membrane.
BioTechniques 6:154-159.
Lemaire M., Deschamps S., Moller J. V., Lecaer J. P., Rossier J. (1993) Electrospray Ionization Mass
Spectrometry on Hydrophobic Peptides Electroeluted from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis Application to the Topology of the Sarcoplasmic Reticulum Ca 2+ ATPase. Anal. Biochem. 214:50-57.
Lewis, U. J., Clark, M. O. (1963) Preparative methods for disk electrophoresis with special reference to the
isolation of pituitary hormones. Anal. Biochem. 6:303-315.
Lim, J. I., Bae, B. N., Jhun, B. S., Kang, I.-S., Kim, S.-J. (2003) A Simple Preparative Polyacrylamide Gel
Electrophoresis for the Purification of Chymotrypsin Inhibitor Isoforms from Ganoderma lucidum. Bull. Korean
Chem. Soc. 24:1531- 1534.
Lishanskaya, A. I., Mosevitsky, M. I. Size dependent separation of high molecular weight double-stranded DNA
by means of gel electrophoresis. (1973) Biochem. Biophys. Res. Commun. 52:1213-1220.
Lloyd, H. M., Meares, J. D. (1964) An electrophoretic method for recovery of proteins from starch gel. Clin.
Chim. Acta 9:192-194.
McDonald, C., Fawell, S., Pappin, D., Higgins, S. (1986) Electroelution of proteins from SDS gels. Trends Genet.
2:35.
Mendel-Hartvig, I. (1982) A simple and rapid method for the isolation of peptides from sodium dodecyl sulfate-
containing polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 121:215-217.
Merril, C. R. (1990) Gel-staining techniques. Methods Enzymol. 182:477-488.
Moos, M. Jr., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. (1988) Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically
separated and transferred to an inert support. J Biol Chem. 263:6005-6008.
Moretti, J., Boussier, G., Jayle, M. F. (1958) New method of purifying proteins by electrophoresis in starch gel.
Bull. Soc. Chim. Biol. 40:59-65.
 Nelles, L. P., Bamburg, J. R. (1976) Rapid visuallzation of protein-dodecyl sulfate complexes in polyacrylamide
gels. Anal. Biochem. 73:522-531.
Neville, D. M. (1971) Molecular weight determination of protein-dodecyl sulfate complexes by gel
electrophoresis in a discontinuous buffer system. J. Biol. Chem. 246:6328-6334.
Nguyen, N. Y., Chrambach, A. (1979) A three-step method for isolating a few to several hundred milligrams of
protein. J. Biochem. Biophys. Methods 1:171-187.
Nguyen, N. Y., DiFonzo, J., Chrambach, A. (1980) Protein recovery from gel slices by steady-state stacking: an
apparatus for the simultaneous extraction and concentration of ten samples. Anal Biochem. 106:78-91.
Ochiai, H., Jin, K., Kakihara, N., Hanafusa, T. (1987) Elution of proteins from sodium dodecylsulfate-
polyacrylamide gels and the antigenicity of the recovered proteins. Seikagaku 59:1164-1167.
O'Connell, P. B. H., Brady, C. J. (1976) Polyacrylamide gels with modified cross-linkages. Anal. Biochem. 76:63-
73.
O'Farrell P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250:4007-4021.
Öfverstedt, L.-G., Johansson, G., Froman, G., Hjerten, S. (1981) Protein concentration and recovery from gel slabs
by displacement electrophoresis (isotachophoresis) and the effects of electroosmosis and counter flow.
Electrophoresis 2:168–173.
Öfverstedt, L.-G., Sundelin, J., Johansson, G. (1983) Recovery of proteins on a milligram scale from
polyacrylamide electrophoresis gels, exemplified by purification of a retinol-binding protein. Anal Biochem. 134:361-
367.
Ornstein, L. (1964) Disc electrophoresis-1: background and theory. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121:321–351.
Otto, M., Snejdárková, M. (1981) A simple and rapid method for the quantitative isolation of proteins from
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 111:111-114.
Patton, W. F. (2000) A thousand points of light: the application of fluorescence detection technologies to two-
dimensional gel electrophoresis and proteomics. Electrophoresis 21:1123–1144.
Pearse, B. M. (1976) Clathrin: a unique protein associated with intracellular transfer of membrane by coated
vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 73:1255–1259.
Pitt-Rivers, R., Impiombato. F. S. (1968) The binding of sodium dodecyl sulphate to various proteins. Biochem J.
109:825-830.
Radko, S. P., Chen, H.-T., Zakharov, S. F., Bezrukov, L., Yergey, A. L., Vieira, N. E., Chrambach, A. (2002)
Electroelution without gel sectioning of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis:
Fluorescent detection, recovery, isoelectric focusing and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight of
the electroeluate. Electrophoresis 23:985-992.
Rashid, M. A., Hashizume, S. (1982) Electrophoretic extraction-concentration of ribonucleic acid from agarose-
acrylamide composite gels. Anal. Biochem. 127:334-339.
Ratajczak, T., Brockway, M. J., Hähnel, R., Moritz, R. L., Simpson, R. J. (1988) Sequence analysis of the
nonsteroid binding component of the calf uterine estrogen receptor. Biochem Biophys Res Commun. 151:1156-1163.
Reisfeld, R. A., Lewis, U. J., Williams, D. E. (1962) Disk electrophoresis of basic proteins and peptides on
polyacrylamide gels. Nature 195:281-283.
Reisfeld, R. A., Small, P. A. (1966) Electrophoretic heterogeneity of polypeptide chains of specific antibodies.
Science 152:1253-1255.
Reynolds, J. A., Tanford, C. (1970) Binding of dodecyl sulfate to proteins at high binding ratios. Possible
implications for the state of proteins in biological membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 66:1002-1007.
Rickwood, D. in B. D. Hames and D. Rickwood (Editors), Gel Electrophoresis of Proteins, IRP Press, Oxford, 2nd
ed., 1990.
Righetti, P. G. lsoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Elsevier, Amsterdam, 1983.
Rogers' Lab. Department of Biological Sciences, Bowling Green State Univeristy, Bowling Green, Ohio, USA,
http://personal.bgsu.edu/~gangz/Page099-103_Elution_of_DNA_from _Agarose_Gels.pdf
Rubenstein, J. L. R., Fine, R. E., Luskey, B. D., Rothman, J. E. (1981) Purification of coated vesicles by agarose
gel electrophoresis. J. Cell Biol. 89:357-361.
Ruggiero-Lopez, D., Louisot, P., Martin, A. (1993) A Nondenaturing Preparative Gel Electrophoresis System for
the Recovery of Functional Proteins. Application to the Identification of an Endogenous Protein Inhibitor of Fucosyl-
Transferase Activities. Anal. Biochem. 212:247-252.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor
Lab., Cold Spring Harbor, NY., 1989.
Serwer, P. (1981) Improvements in procedures for electrophoresis in dilute agarose gels. Anal. Biochem. 112:351-
356.
Serwer, P., Hayes, S. J. (1982) Detection of bacteriophage-antibody complexes by agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis 3:76-80.
Serwer, P., Pichler, M. E. (1978) Electrophoresis of bacteriophage T7 and T7 capsids in agarose gels. J Virol.
28:917-928.
Shain, D. H., Yoo, J., Slaughter, R. G., Hayes, S. E., Ji, T. H. (1992) Electrofractionation: A technique for
detecting and recovering biomolecules. Anal. Biochem. 200:47-51.
 Sheer, D. G., Yamane, D. K., Hawke, D. H., Yuan, P. M. (1990) The use of micropreparative electrophoresis of
protein/peptide isolations for primary structure determinations. BioTechniques 9:486-495.
Shively, J. E., Paxton, R. J., Lee, T. D. (1989) Highlights of protein structural analysis. Trends Biochem Sci.
14:246-252.
Shoji, M., Kato, M., Hashizume, S. (1995) Electrophoretic recovery of proteins from polyacrylamide gel. J.
Chromatogr. A 698:145-162
Shuster, L. (1971) Preparative gel-density gradient electrophoresis. Methods Enzymol. 22:434-437.
Simpson, R. J., Moritz, R. L., Begg, G. S., Rubira, M. R., Nice, E. C. (1989) Micropreparative procedures for high
sensitivity sequencing of peptides and proteins. Anal Biochem. 177:221-236.
Simpson, R. J., Moritz, R. L., Nice, E. E., Grego, B. (1987) A high-performance liquid chromatography procedure
for recovering subnanomole amounts of protein from SDS-gel electroeluates for gas-phase sequence analysis. Eur. J.
Biochem. 165:21-29.
Smith, J. A. in J. E. Coligan, A. M., Kruisbeek, D. H., Margulies, E. M., Shevach, W. Strober (Editors), Current
Protocols in Immunology, Unit 8.8., Wiley, New York, 1991.
Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. (1996) SYPRO orange and SYPRO red protein gel
stains: one-step fluorescent staining of denaturing gels for detection of nanogram levels of protein. Anal. Biochem.
239:223–237.
Stephens, R.E. (1975) High-resolution preparative SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: Fluorescent
visualization and electrophoretic elution-concentration of protein bands. Anal. Biochem. 65:369-379.
Strålfors, P., Belfrage, P. (1983) Electrophoretic elution of proteins from polyacrylamide gel slices. Anal.
Biochem. 128:7-10.
Sulitzeanu, D., Slavin, M., Yecheskeli, E. (1967) Simplified technique for preparative disc electrophoresis : II.
Further improvements in apparatus and some details of performance. Anal. Biochem. 21:57-67.
Sutherland, J. C., in: Chrambach, A., Dunn, M. J., Radola, B. J. (Eds.), Advances in Electrophoresis, Vol. 6,
VCH,Weinheim 1993, pp. 1–43.
Suzuki, T., Benesch, R. E., Yung, S., Benesch, R. (1973) Preparative isoelectric focusing of CO hemoglobins on
polyacrylamide gels and conversion to their oxy forms. Anal. Biochem. 55:249-254.
Swank, R. T., Munkres, K., D. (1971) Molecular weight analysis of oligopeptides by electrophoresis in
polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate. Anal. Biochem. 39:462-477.
Taber, H. W., Sherman, F. (1964) Spectrophotometric analyzers for disc electrophoresis: studies of yeast
cytochrome c. Ann N Y Acad Sci. 121:600-615.
Tautz, D., Renz, M. (1983) An optimized freeze-squeeze method for the recovery of DNA fragments from agarose
gels. Anal. Biochem. 132:14-19.
Thelu, J. (1988) Trans-elution: a method for the purification of components of complex biological extracts. Anal
Biochem. 172:124-129.
Thuring, R. W. J., Sanders, J. P. M., Borst P. (1975) A freeze-squeeze method for recovering long DNA from
agarose gels. Anal. Biochem. 66:213-220.
Tsuyuki, H. (1963) Multiple elution of protein zones from starch gel electrophoretically. Anal. Biochem. 6:205.
Tuszynski, G. P., Damsky, C. G., Fuhrer, J. P., Warren, L. (1977) Recovery of concentrated protein samples from
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Anal Biochem. 83:119-129.
Ui, N. (1971) Isoelectric points and conformation of proteins. I. Effect of urea on the behavior of some proteins in
isoelectric focusing. Biochim. Biophys. Acta 229:567-581.
Wachslicht, H., Chrambach, A. (1978) A simple device for protein concentration by steady-state stacking. Anal.
Biochem. 84:533-538.
Ward, L. D., Reid, G. E., Moritz, R. L., Simpson, R. J. (1990) Strategies for internal amino acid sequence analysis
of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. J Chromatogr. 519:199-216.
Weber, K., Osborn, M. (1969) The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 244:4406-4412.
Weliky, N., Leaman, D. H. Jr., Kallman, B. J. (1975) A simple method for recovering and concentrating
fractionated sample components from cylindrical gels. Anal. Biochem. 67:507-514.
Wessel, D., Flügge, U. I. (1984) A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the
presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138:141-143.
Williams, D. E., Reisfeld, R. A. (1964) Disc electrophoresis in polyacrylamide gels: extension to new conditions
of ph and buffer. Ann N Y Acad Sci. 121:373-381.
Yamaguchi, Y,, Yanagida, M. (1980) Head shell protein hoc alters the surface charge of bacteriophage T4.
Composite slab gel electrophoresis of phage T4 and related particles. J. Mol. Biol. 141:175-193.
Yefimov, S., Sjomeling, C., Yergey, A. L., Li, T., Chrambach, A. (2000) Recovery of sodium dodecyl sulfate-
proteins from gel electrophoretic bands in a single electroelution step for mass spectrometric analysis. Anal. Biochem.
284:288–295.
Yefimov, S., Yergey, A. L., Chrambach, A. (2001) Stacking of unlabeled sodium dodecyl sulfate-proteins within a
fluorimetrically detected moving boundary, electroelution and mass spectrometric identification. Electrophoresis
22:2881–2887
 Young, R. W., Fulhorst, H. W. (1965) Recovery of 35S radioactivity from protein-bearing polyacrylamide gel.
Anal. Biochem. 11:389-391.
Ziola, B., Scraba, D. G. (1976) Recovery of SDS-proteins from polyacrylamide gels by electrophoresis into
hydroxylapatite. Anal Biochem. 72:366-371.
 3.10. GELURI COMPOZITE DE AGAROZĂ/POLIACRILAMIDĂ
Identificarea și înțelegea funcției unor proteine specifice, obținerea unor informații asupra
localizării lor spațiale în interiorul celulelor, precum și interacțiile dintre acestea cu alte proteine
la situsul lor celular este crucială. Electroforeza pe gel de poliacrilamidă (PAGE) este o tehnică
deosebit de utilă care este utilizată la separarea proteinelor țintă dintr-un amestec complex
celular și de identificare a interacțiilor proteină-proteină. PAGE în condiţii nedenaturante este
una dintre metodele cele mai frecvent utilizate pentru analiza macromoleculelor biologice,
precum acizii nucleici, proteinele, şi a complecşilor acestora (Sambrook și colab., 1989). În
astfel de electroforeză, operată în condiții native, separarea de biomolecule se realizează atât pe
baza proprietăților hidrodinamice (formă, mărime) cât şi pe baza proprietăților lor electrostatice
(sarcina netă electrostatică), în condiţii de migrare electroforetică, spre deosebire de separările
realizate exclusiv pe baza caracteristicilor hidrodinamice care se exploatează în cromatografia de
excludere moleculară (gel-filtrare, gel-permeaţie) ori pe baza greutăţii moleculare în cazul
ultracentrifugării analitice. Dacă cromatografia de excludere moleculară este adecvată
determinării dimensiunilor macromoleculelor, electroforeza în gel de poliacrilamidă, în condiţii
nedenaturante nu poate fi întrebuințată, PAGE nativă având totuși avantajul de a stabiliza
interacţiunile intermoleculare în matricea de gel. Electroforeza nativă este, prin urmare, o
metodă importantă pentru evaluarea formării și comportării complexelor macromoleculare, în
special atunci când această tehnică este aplicată în combinație cu cromatografia de excludere
moleculară şi/sau ultracentrifugarea analitică. Cu toate acestea, în cazul unor specii
macromoleculare ultra mari sau asambluri macromoleculare apar complicaţii tehnice care trebuie
să fie rezolvate prin PAGE în condiții nedenaturante. Din nefericire, o limitare semnificativă a
PAGE este cea de pierdere a informației spațiale asupra proteinelor țintă (precum cea de
localizare subcelulară a acestora). Imunohistochimia este o tehnică de ales pentru identificarea
localizării subcelulare a proteinelor. Cu toate acestea, spre deosebire de PAGE, această metodă
nu poate fi utilizată în mod definitiv pentru stabilirea interacțiilor proteină-proteină. De exemplu,
suprapunerea a două specii proteice marcate fluorescent poate indica că cele două proteine
posedă o localizare apropiată fiind într-o relație strânsă, deși nu se poate concluziona că ele
interacționează semnificativ. În aceste cazuri, este necesară reducerea dramatică a procentului de
acrilamidă, pentru a forma ochiuri de rețele suficient de mari pentru a permite migrarea
diferențială a biomoleculelor individuale sau ansamblurilor macromoleculare pe distanţe
adecvate pentru a permite, în continuare analiza acestora (Childs, 1980; Childs și Birnboim,
1975).
Deși cel mai mic procent de acrilamidă care permite gelificarea este de aproximativ 3%
(concentrație sub care polimerul rămâne sub formă lichidă), în realitate, gelurile de acrilamidă
realizate cu mai puţin de 4% acrilamidă:bisacrilamidă sunt extrem de dificil de manipulat. Cu
toate acestea, tehnica PAGE în condiții nedenaturante s-a dovedit a fi cea mai efectivă în
caracterizarea unor interacții proteină-DNA ori interacţii proteină-RNA, în mod clar datorită
caracteristicilor de sarcină electrică favorabilă, adică, datorită sarcinilor preponderent negative
ale acizilor nucleici oligomerici. În astfel de studii, activitatea potenţială de legare a DNA sau
RNA de proteinele de recunoașter este monitorizată ca o schimbare a mobilității electroforetice a
acidului nucleic marcat, fie izotopic, fie fluorescent (Laniel și colab., 2002). În cazul legării
proteinelor plasmatice cu dimensiuni moleculare neobișnuit de mari (peste 200kDa), această
tehnică suferă constrângeri practice, deoarece este foarte dificil să se realizeze migrarea
complexului acid nucleic-proteină in geluri de poliacrilamidă (de obicei cu T%≥4%).
Dificultatea tehnică este bine exemplificată în studiile biochimico-structurale ale RNA
polimerazei II, o proteină de dimensiuni mari, la eucariote (500kDa), când se utilizează practic
gelul de agaroză în loc de cel de poliacrilamidă pentru identificarea complexului binar Pol II-
DNA ori a complexului ternar Pol-II-DNA-RNA (Gnatt și colab., 1997). Tehnica care utilizează
gelul nativ de agaroză s-a dovedit a reprezenta un pas important în seria de studii care a culminat
cu rezolvarea structurii cristalografice a complexului ternar (Gnatt și colab., 2001).
Deşi electroforeza nativă pe gel de agaroză a rezolvat suficient de bine complexele ternare
Pol II, aplicarea acesteia la alte ansambluri proteice de mari dimensiuni în lipsa unei interacții cu
acizii nucleici pune probleme practice suplimentare, inclusiv o difuzie severă a benzilor, datorită
timpului lung de rulare electroforetică (fiind necesară o creștere accentuată a timpului datorită
absenţeia sarcinilor negative prezente la nivelul acizilor nucleici), în afară de faptul că aceste
geluri pot fi realizate doar în setările orizontale, ceea ce face extrem de dificilă unui cuplaj cu
electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezență de SDS în a doua dimensiune.
O soluţie evidentă la problemele generate de electroforeza pe gel de poliacrilamidă sau cea pe
matrice de agaroză este cea de a combina proprietăţile utile din ambele tipuri de separări în câmp
electric. Gelurile compozite utilizate în aceste tehnici includ agent de polimerizare (precum
acrilamida), un agent de reticulare de tipul bisacrilamidei, alături de un stabilizator polizaharidic,
deseori agaroza. În acest context, Uriel (1966) a descris pentru prima dată un gel hibrid compus
din atât din acrilamidă cât şi agaroză, dar o concentrație de poliacrilamidă mai mică de 3% din
acrilamidă nu s-a putut atinge în acest studiu. În schimb, Peacock şi Dingman (1968) au formulat
un gel compozit de agaroză, 0,5% şi acrilamidă, 2% pentru a separa acizi ribonucleici de mari
dimensiuni. Mai recent, Tatsume şi Hattori (1995), au raportat obținerea unui gel hibrid de
agaroză-poliacrilamidă care facilitează separarea prin electroforeză în condiții denaturante, în
prezență de SDS a proteinelor miofibrilare gigantice. Totuși, puțin a fost făcut pentru a dezvolta
în continuare tehnica de geluri compozite din cauza procedurilor destul de complicate şi delicate
implicate în manipularea lor (Suh și colab., 2005).
În studiul interacțiilor dintre Pol II din drojdia de bere cu un număr de factori asociaţi
(Woychik, 1994; Gnatt, 2002), este necesară separarea eficientă a unor ansambluri multiproteice
de mari dimensiuni, prin urmare, tehnica de separare pe gel compozit, fiind o metodă de înaltă
rezoluţie pentru separarea complexelor mari de proteine şi de investigație a interacţiunile
proteină-proteină în statele lor nativă este soluția care se adoptă.
Matrici de geluri compozite agaroză-poliacrilamidă. Gelurile compozite agaroză-
poliacrilamidă pot fi realizate în două moduri:
a. soluţia caldă de agaroză, dispersată în tampon se amestecă cu toate ingredientele
necesare preparării gelului de poliacrilamidă și se incubează la peste 35oC până la polimerizarea
completă a poliacrilamidei, după care se permite solidificarea agarozei printr-o răcire ulterioară;
b. alternativ, soluţia de agaroză este răcită la 20oC, astfel încât agaroza se solidifică prima.
Uriel şi Berges (1966) au utilizat a doua procedură în pregătirea unor geluri compozite care au
conținut 0,8% agaroză şi cantităţi variabile (2,5-9%) de acrilamidă.
Figura 3.91. Reprezentarea schematică a unei matrice
compozită, agaroză-poliacrilamidă. Fibrele groase de
agaroză sprijină structura fragilă de poliacrilamidă, foarte
puțin concentrată. Astfel de matrici compozite permit o
rezoluţiei fină a fragmentelor mai mici de acizi nucleici intr-
un interval mare mase moleculare (după Boschetti, 1985).

Potrivit lui Peacock şi Dingman (1968), nu

există nici o diferenţă observabilă între gelurile la care agaroza este gelifiată prima şi cele în care
acrilamida, la o concentrație de peste 3% poliacrilamidă, când aceasta a fost prima componentă
solidificată. În schimb la gelurile compozite unde concentrația amestecului de polimerizare este
sub 3%, acrilamida polimerizată rămâne lichidă sau formează, în final un gel cu proprietăți
mecanice foarte slabe, din acest motiv fiind important ca agaroza să fie solidificată prima.
Utilizând aeastă procedură, ei au reușit să obțină geluri compozite care conţin agaroză într-o
concentrație de 0,5-2% şi 1-3% poliacrilamidă. Structura acestor geluri compozite este
prezentată schematic în figura 3.91.
Astfel de geluri au fost destul de populare în fracţionarea acizilor nucleici, ceea ce a permis o
rezoluţie fină a DNA cu masă moleculară mică și RNA, fiind însă rareori folosite în metodele
moderne electrocinetice. Cu toate acestea, astfel de geluri, sub formă perlată, sunt încă utilizate
în scopuri cromatografice (Boschetti, 1985): Ele sunt de un interes deosebit, de asemenea,
deoarece ele pot fi transportatori ideali pentru liganzi imobilizați prin exploatarea reacţiilor cu
grupările hidroxil ale agarozei şi amino ale poliacrilamidei (Righetti, 1989).
Gelurile compozite sunt ideale în detecția și analiza proteinelor cu ajutorul sondelor marcate
cu nanoparticule de tipul quantum dots (nanocristale semiconductoare, ale căror excitoni -
electroni în stare legată - sunt limitați, în toate cele trei dimensiuni spaţiale).
Aceste matrixuri au fost construite iniţial pentru a oferi un suport structural de agaroză
matrice, gelurilor de poliacrilamidă, care, la concentraţii în jur de 3%, nu conduc la geluri ferme.
Prin această combinare, rezultă geluri extrem de puternice (figura 3.92) şi care oferă
caracteristici de cernere pentru o gamă mare de mase moleculare mari (Shainoff, 1993).

Figura 3.92. Demonstrarea tăriei mecanice a

unui gel compozit. (după Shainoff, 1993).

După Peacock şi Dingman (1968), geluri puternice sunt obţinute doar atunci când metoda de
obținere implică solidificarea gelului de agaroză înainte de polimerizarea acrilamidei. Prin
folosirea poliacrilamidei nereticulate ori a celei reticulate cu agenți bifuncționali alcalino- sau
periodat degradabile de tipul 1,2-dihidroxietilen-bis-acrilamidă, în locul obişnuitei bis-
acrilamide (vezi subcapitolul 3.6.1. Agenți de reticulare), poliacrilamida, slab permeabilă, poate
fi îndepărtată, lăsând astfel o matrice de agaroză extrem de penetrabilă, care permite
caracterizarea imunochimică directă a componentelor fixate pe electroferogramă.
3.10.1. GELURI COMPOZITE ÎN ANALIZA PROTEINELOR
Electroforeza pe gel în prezență de SDS este una dintre cele mai obișnuite metode utilizate în
analiza proteinelor (Hames, 1998). Incubarea la fierbere într-o soluție ușor bazică (cu un pH de
aproximaiv 8,0) cu SDS, 0,1% în prezență de agent reducător (β mercaptoetanoll), conduce la
ruperea legăturilor disulfurice și în continuare (concomitent) disocierea catenelor peptidice în
configurații aleatoari, în momentul legării de detergent. (Gerstner și colab., 2000). Proteinele
care nu prezintă modificări post-translaționale leagă SDS într-un raport constant de 1,4g SDS/g
proteină (Chrambach, 1985), ceea ce conduce la rapoarte de masă/sarcină similare pentru toate
complexele SDS-proteine și care, în continuare, pot fi analizate din punct de vedere al greutății
lor moleculare prin electroforeză pe gel, fie cu o singură concentrație, fie pe un gel cu gradient
de concentrație. Proteinele care suferă modificări post-transalaționale (recese de glicozilare,
fosforilare, etc) pot conduce la rapoarte sarcină/masă diferite, ceea ce cauzează alterarea
comportamentului lor de migrare (Andrews, 1986). În electroforeza în prezență de SDS
convențională, cea mai utilizată matrice este gelul de poliacrilamidă reticulată, cu o concentrație
mai mare de 5%, sau, dacă se utilizează gradient de gel, cu o concentrație de până la 25%. Când
separarea electroforetică este completă, benzile rezolvate sunt uzual vizulalizate printr-un proces
de colorare, de obicei cu Coomasie Brillant Blue sau colorare cu argint (Sutherland, 1996) sau,
mai recent, cu coloranții fluorescenți înalt sensibili precum Nile Red (Daban și colab., 1991;
Daban, (2001) ori Sypro OrangeTM (Steinberg, și colab., 1996). Mai mult, față de colorațiile
comune utilizate post-electroforeză, proteinele pot fi de asemenea marcate cu agenți care se
leagă covalent de tipul fluorescein-5-izotiocianat (FITC) (Sutherland, 1996) sau de tipul
tetrametil rodamină (TAMRA) (Hunt și Nashabeh, 1999), etc.
Matricea de poliacrilamida reticulată este alegerea cea mai obișnuită, fiind utilizată în
electroforeza proteinelor pe gel, în prezență de SDS; totuşi, utilizarea polimerilor nereticulați
precum poliacrilamida sau polioxietilenă au fost de asemenea raportate în electroforeza pe geluri
placă (Bode, 1976; Chen și Chrambach, 1996) și mai târziu în electroforeza capilară (Ganzler și
colab.,1992). Mai recent, geluri speciale de agaroză au fost de asemenea utilizate pentru a
furniza separări de mare rezoluție a complexelor SDS-proteine (Wu și Kusukawa, 1998; Chen și
Chrambach, 1997).
Agaroza, cu o tărie mecanică destul de adecvată, chiar în cazul gelurilor cu concentrație
scăzută, având inerție biologică și stabilitate în domeniul de pH cuprins între 4,00-9,00 este
foarte populară, fiind utilizată drept matrice de separare electroforetică. Relativa sa mare
diferență între temperatura de gelificare și temperatura de topire (35-40oC, față de 70-90oC) fac
posibilă utilizarea ei ca un mediu efectiv de separare chiar în câmp electric cu tărie mai mare, de
40V/cm, în special în condițiile separării pe straturi ultrasubțiri, la care căldura generată prin
efect Joule este disipată eficient (Guttman și colab., 1998). În scopul creșterii stabilității
mecanice și/sau a capacității de rezolvare a matricilor pe bază de agaroză, au fost raportate
utilizarea gelurilor compozite care conțin agaroză în amestec cu alți polimeri, de tipul
poliacrilamidei reticulate (Righetti, 1989). În continuare, poliacrilamida nereticulată (Zintz și
Beebe, 1991) și alți polimeri lineari hidrofili, precum polizaharidele neionice (Perlman și colab.,
1987) au fost cu succes folosite drept aditivi pentru gelurile de agaroză compozite. Ca tehnică de
separare eficientă în analiza proteinelor, a fost introdusă electroforeza automatizată pe geluri
ultrasubțiri (Stegemann și colab., 1991; Brumley și Smith, 1991; Chen și colab., 1995; Hietpas și
colab., 1997; Guttman, 1999). Gerstner și colab. (2000) au propus o tehnică de separare
automată pe gel, în prezență de SDS a acestora. Electroforeza pe gel ultrasubțire în prezență de
SDS este o nouă combinație a SDS-PAGE (cu putere înaltă în format multi-linie) și electroforeza
pe gel capilar în prezență de SDS (cu performanțe înalte de separare). Ei au investigat efectul
diverselor compoziții de gel și aditivi asupra caracteristicilor de migrare și de separare a unor
proteine standard, de masă moleculară, marcate cu FITC, utilizând geluri de agaroză și agaroză
compozită cu aditivi de tipul matricilor polimerice liniare precum poliacrilamida liniară,
hidroxietilceluloza și polietilen oxidul. Ei au evaluat influența compoziției gelului și a
concentrației de aditivi de polimeri lineari asupra diagramelor Ferguson și Arrhennius. Prin
injecția unor diluții seriale de markeri proteici marcați cu FITC au determinat sensibilitatea
detecției.
O cantitate de agaroză pulbere se suspendă în tampon Tris/Acid N-tris(hidroximetil)metil-3-
aminobutansulfonic/SDS (TTS), se fierbe repetat în cuptorul cu microunde până devine clară,
după care se păstrează la 60oC timp de 10 minute înainte de utilizare. Aditivii polimerici liniari
se dizolvă în agaroza topită într-un domeniu de concentrație cuprins între 0,5-3,0%. Pentru
electroforeza pe geluri ultrasubțiri în prezență de SDS, amestecul de agaroză/aditivi, caldă se
toarnă într-o casetă preîncălzită (45-50oC) iar după câteva minute de răcire/solidificare, caseta
este gata de utilizare. Gelurile utilizate în caseta de separare se înlocuiesc prin simpla pompare a
unei matrici compozite proaspete în stare lichidă după fiecare rulare electroforetică (Guttman,
1999). Preîncălzirea casetei de separare ajută la solidificarea prematură a gelului turnat în timpul
procesului de înlocuire a matricei de separare. Lungimea efectivă de separare (distanța dintre
punctul de injecție și punctul de detecție) a casetei ultrasubțire încărcată cu gel de agaroză este
de 6 cm, iar tensiunea aplicată este de 900V (care generează o intensitate a curentului de 14-16
mA).
Bibliografie
Andrews, A. T. Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical and Clinical Applications, 2nd ed. Oxford
University Press, Oxford, 1986.
Bode, H. J. (1976) SDS - polyethyleneglycol electrophoresis: a possible alternative to SDS-polyacrylamide gel
electrophoresis. FEBS Lett. 65:56-58.
Boschetti, E. In: Dean, P. G. D., Johnson, W. S., Middle, F. A. (Eds.), Affinity Chromatography, IRL Press,
Oxford, pp. 11-15, 1985.
Brumley, R. L. Jr., Smith, L. M. (1991) Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis.
Nucleic Acids Res. 19:4121-4126.
Chen, D., Peterson, M. D., Brumley, R. L. Jr., Giddings, M. C., Buxton, E. C., Westphall, M., Smith, L., Smith, L.
M. (1995) Side Excitation of Fluorescence in Ultrathin Slab Gel Electrophoresis. Anal Chem. 67:3405-3411.
Chen, N., Chrambach, A. (1996) Improved resolution in the gel electrophoresis of proteins by a periodically
interrupted electric field. J Biochem Biophys Methods 33:163-170.
Chen, N., Chrambach, A. (1997) The resolution between two native proteins and between their sodium dodecyl
sulfate-complexes in agarose and polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis 18:1126-1132.
Childs, J. D. (1980) Effect of hoc protein on the electrophoretic mobility of intact bacteriophage T4D particles in
polyacrylamide gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 141:163–173.
Childs, J. D., Birnboim H. C., (1975) Polyacrylamide gel electrophoresis of intact bacteriophage T4D particles. J.
Virol. 16:652–661.
Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. VCH, Weinheim, 1985.
Daban J. R. (2001) Fluorescent labeling of proteins with nile red and 2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone:
physicochemical basis and application to the rapid staining of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels and
Western blots. Electrophoresis 22:874-880.
Daban, J. R., Bartolomé, S., Samsó, M. (1991) Use of the hydrophobic probe Nile red for the fluorescent staining
of protein bands in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Anal Biochem. 199:169-174.
Ganzler, K., Greve, K. S., Cohen, A. S., Karger, B. L., Guttman, A., Cooke, N. C. (1992) High-performance
capillary electrophoresis of SDS-protein complexes using UV-transparent polymer networks. Anal Chem. 64:2665-
2671.
Gerstner, A., Csapo, Z., Sasvari-Szekely, M., Guttman, A. (2000) Ultrathin-layer sodium dodecyl sulfate gel
electrophoresis of proteins: effects of gel composition and temperature on the separation of sodium dodecyl sulfate-
protein complexes. Electrophoresis 21:834-840.
Gnatt, A. (2002) Elongation by RNA polymerase II: structure–function relationship. Biochim. Biophys. Acta
1577:175–190.
Gnatt, A. L., Cramer, P., Fu, J., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. (2001) Structural basis of transcription: an RNA
polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science 292:1876–1882.
Gnatt, A., Fu, J., Kornberg, R. D. (1997) Formation and crystallization of yeast RNA polymerase II elongation
complexes. J. Biol. Chem. 272:30799–30805.
Guttman, A. (1999) Automated DNA fragment analysis by high performance ultra-thin-layer agarose gel
electrophoresis, LC/GC Magazine 17:1020-1026.
Guttman, A. (1999) High performance ultra-thin-layer agarose gel electrophoresis. Trends Anal Chem 18:694-
702.
Guttman, A., Barta, C., Szöke, M., Sasvári-Székely, M., Kalász, H. (1998) Real-time detection of allele-specific
polymerase chain reaction products by automated ultra-thin-layer agarose gel electrophoresis. J. Chromatogr. A.
828:481-487.
Hames, B. D., Rickwood, D. Gel Electrophoresis Of Proteins: A Practical Approach, 4th Edition. Hames, B. D.,
Editor, Oxford University Press, USA, 1998.
Hietpas, P. B., Bullard, K. M., Gutman, D. A., Ewing, A. G. (1997) Ultrathin slab gel separations of DNA using a
single capillary sample introduction system. Anal Chem. 69:2292-2298.
Hunt G, Nashabeh W. (1999) Capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate nongel sieving analysis of a
therapeutic recombinant monoclonal antibody: a biotechnology perspective. Anal. Chem. 71:2390-2397.
Laniel, M. -A., Beliveau, A., Guerin, S. L. in: T. Moss (Ed.), DNA–Protein Interactions, vol. 148, Humana Press,
Totowa, 2002.
Peacock, A. C., Dingman, C. W. (1968) Molecular weight estimation and separation of ribonucleic acid by
electrophoresis in agarose–acrylamide composite gels. Biochemistry 7:668–674.
Perlman, D., Chikarmane, H., Halvorson, H. O. (1987) Improved resolution of DNA fragments in polysaccharide-
supplemented agarose gels. Anal Biochem. 163:247-254.
Righetti, P G. (1989) Of matrices and men. J Biochem Biophys Methods. 19:1-20.
 Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Shainoff, J. R. (1993) Electrophoresis and direct immunoprobing on glyoxyl agarose and poyacrylamide
composites. Adv. Electrophor. 6:61-177.
Stegemann, J., Schwager, C., Erfle, H., Hewitt, N., Voss, H., Zimmermann, J., Ansorge, W. (1991) High speed
on-line DNA sequencing on ultrathin slab gels. Nucleic Acids Res. 19:675-676.
Steinberg, T. H., Haugland, R. P., Singer, V. L. (1996a) Applications of SYPRO orange and SYPRO red protein
gel stains. Anal. Biochem. 239:238-245.
Suh, M.-H., Ye, P., Datta, A. B., Zhang, M., Fu, J. (2005) An agarose–acrylamide composite native gel system
suitable for separating ultra-large protein complexes. Anal. Biochem. 343:166-175.
Sutherland, C. In: A. Chrambach, M.J. Dunn and B.J. Radola, Editors, Advances in Electrophoresis Vol. 6, VCH,
Weinheim, 1996.
Tatsumi, R., Hattori, A. (1995) Detection of giant myoWbrillar proteins connectin and nebulin by electrophoresis
in 2% polyacrylamide slab gels strengthened with agarose. Anal. Biochem. 224:28–31.
Uriel, J. (1966) Method of electrophoresis in acrylamide–agarose gels. Bull. Soc. Chim. Biol. (Paris) 48:969–982.
Uriel, J., Berges, J. (1966) Un nouveau support pour des séparations électrophorétiques: le gel mixte d'acrylamide-
agarose. C. R. Acad. Sci. Paris 262:164-170.
Woychik, N. A. (1994) Regulating the regulators. Trends Biochem. Sci. 19:103–105.
Wu, M., Kusukawa, N. (1998) SDS agarose gels for analysis of proteins. Biotechniques. 24:676-678.
Zintz, C. B., Beebe, D. C. (1991) Rapid re-amplification of PCR products purified in low melting point agarose
gels. Biotechniques 11:158-162.
 3.11. IZOTACOFOREZA
Izotacoforeza sau electroforeza de dizlocuire, după cum a fost denumită la un moment dat,
este o dezvoltare mai recentă a principiului descris în 1920, fiind o metodă de separare în funcție
de sarcina electrică. Ea se utilizează pentru separarea particulelor care se deosebesc în special
prin încărcătura electric netă și nu prin dimensiuni fizice, vitezele de separare ale fracțiunilor din
probă, după ce separarea este completă, când s-a atins o stare de echilibru, sunt egale, de unde și
denumirea acestei metode. În această tehnică electrolitul dintre cei doi electrozi nu este o singură
soluție uniformă, ci este formată dintr-o secvență discontinuă de soluții diferite (figura 3.93.), în
care ionii acestora migrează cu aceeași viteză (iso = egal, tachos = viteză, phoresis = migrare).

Figura 3.93. Reprezentarea schematică a procesului de izotacoforeză. Ionul probei este intercalat între electrolitul
frontal și electrolitul terminal.

Izotacoforeza este similară ”stivuirii”, concentrării în faza staționară sau electroforezei zonale
în sisteme multifazice. În practică, totuși se face distincție între aceste metode. Concentrarea în
faza staționară se realizează în două moduri:
 Concentrarea selectivă (selective stacking) prin care componentul/componentele de
interes sunt incluse în fronul mobil, iar celelalte componente rămân în afara acestuia (unstacked).
Este de altfel cazul izotacoforezei;
 Excluderea selectivă (selective unstacking) prin care componentul/componentele de
interes sunt excluse selectiv din frontal mobil, iar celelalte componente sunt incluse în acesta.
Utilizarea unui contraion comun de tamponare, care defineşte pH-ul şi, prin urmare,
mobilitatea efectivă precum şi ordinea de migrare a zonelor în starea staționară, sub formă
stivuită reprezintă o caracteristică a separării izotacoforetice. Acest proces este de altfel
reprezentativ sistemului discontinuu de electroliți din stadiul de concentrare (stivuire) descris de
Ornstein (1964) şi Davis (1964). În ultimă instanță această procedură este un proces de
izotacoforeză. Totuși, în disc-electroforeză, analiza efectivă este derivată din a doua etapă, care
este o electroforeză zonală, procesul izotacoforetic fiind folosit în acest caz, pur şi simplu pentru
a concentra zonele de proteine, în scopul îmbunătăţirii rezoluţiei de separare în etapa a doua, de
electroforeză zonală (Holloway și Trautschold, 1982).
De multe ori prin izotacoforeză se subînțelege numai tehnica capilară, dar procesul se poate
realiza și în geluri de poliacrilamidă ori agaroză, geluri cu porii mari, și în astfel de condiții se
pot separa proteine cu masa moleculară de până la 500.000 Da.
În anul 1986 a fost elaborat principiul izotacoforezei din punct de vedere al focalizării
izoelectrice, propunându-se o nouă metodă de separare a proteinelor, focalizarea
izotacoforetică, tehnică care are două caracteristici noi:
 Se formează un spectru de mobilitate continuă;
 Zonele cu componentele separate sunt imobilizate sau cel puțin întârziate.
Din punct de vedere fizic, în condiții identice de concentrație și voltaj, ionii diferiți posedă
mobilități electroforetice diferite și din această cauză, pentru a se mișca cu aceeași viteză sunt
necesari diferiți gradienți de voltaj pentru fiecare grup de ioni. Acești gradienți diferiți se
dezvoltă spontan în timpul procesului de electroforeză.
În practică, izotacoforeza este în mod obișnuit realizată în tuburi înguste cu electrozi situați la
capetele acestora, fiind astfel considerată o formă de electroforeză capilară. Pentru separarea
unui tip particular de ion, de exemplu, un anion, se selectează două soluții electrolitice
tamponate care au anioni diferiți dar un cation comun cu o capacitate de tamponare. Unul dintre
anioni (denumit electrolit frontal, leading electrolyte) trebuie să prezinte o mai mare mobilitate
decât cea a celorlalți anioni și ocupă capătul anodic al tubului. Anionul cel mai lent (electrolit
terminal, terminating electrolyte) ocupă capătul catodic al tubului, cu o graniță îngustă de
separare între cele două soluții. Aplicarea unei diferențe de potențial de-a lungul tubului va
conduce la migrarea cationului de tamponare comun către catod, iar a celorlalți doi anioni spre
anod. Situația imposibilă aunui spațiu ionic rezultat din mobilitățile diferite ale celor doi anioni
este prevenită prin dezvoltarea unei căderi de potențial discontinuu, spontan, de-a lungul tubului
electroforetic (figura 3.94.), cu dezvoltarea unui gradient mai larg de-a lungul electrolitului
terminal față de electrolitul frontal, ceea ce conduce la aceeași viteză de migrare a tuturor ionilor.
Dacă o probă care conţine diferiți anioni este introdusă între electrolitul frontal și electrolitul
terminal, diferiţii ioni vor migra cu o viteză care depinde de mobilitatea lor ionică şi gradientul
de tensiune. Un anumit ion, aflat în electrolitul terminal se va deplasa mai rapid din cauza
tensiunii mai mari, iar în momentul în care va migra în electrolitul frontal, acesta îl va încetini,
din cauza unui gradient mai redus de tensiune. Ca o consecinţă ionii vor migra în zone în ordinea
descrescătoare a mobilităţi lor ionice, un profil de tensiune se va dezvolta de-a lungul tubului
care are drept consecință menţinea unei viteze constante a tuturor ionilor. Acest fenomen
constituie baza fizică a izotacoforezei calitative sau preparative.

Figura 3.94. Reprezentarea schematică a unui proces

izotacoforetic. Dezvoltarea spontană a unor gradienți diferiți
de voltaj de-a lungul celor două soluții de electroliți are ca
efect migrarea cu aceeași viteză a tuturor anionilor. (După
Holme și Peck, 1998).

3.11.1. CARACTERISTICILE PROCESULUI DE SEPARARE

PRIN IZOTACOFOREZĂ
Pentru a înțelege efectele și caracteristicile acestei tehnici trebuie avută ca imagine patru
fenomene care însoțec izotacoforeza (și care sunt prezentate în figurile 3.95. A-D):
 Migrarea tuturor ionilor se realizează cu aceeași viteză;
 Separarea componentelor se realizează sub un model de tren ionic;
 Apariția efectelor de îngustare a zonei;
 Efectele de reglare a concentrației.
Principala pre-necesitate pentru o separare izotacoforetică este sistemul dicontinuu de tampon
care conține un electrolit frontal și unul, terminal. Dintre anionii din probă care se doresc a fi
determinați anionii frontali trebuie să aibă cea mai mare mobilitate iar anionii terminali trebuie
să aibă cea mai mică mobilitate decât componentele probei.
Într-o separare anionică, electrolitul frontal va fi la partea anodală, iar electrolitul terminal se
va regăsi la partea catodală. Sistemul conține de asemenea un contraion comun cationic.
Izotacoforeza se realizează la un curent constant deci, cu menținerea constantă a tăriei
câmpului electric în fiecare zonă. În continuare, viteza de migrare trebuie să fie aceeași în timpul
separării.
 3.11.1.1. Migrarea cu aceeași viteză
Când se aplică un câmp electric, ionii încep să migreze cu o viteză dată de ionul terminal,
ionul cu mobilitatea cea mai mică. Toți ionii conduc curent electric. Ionii din probă și ionii
frontali nu se pot mișca mai rapid decât ionul terminal, deoarece acesta va cauza un spațiu ionic
gol prin care curentul nu ar putea fi transportat (figura 3.95.A).

Figura 3.95.A. O ilustrare grafică a fenomenului de migrare cu

aceeași viteză. Într-un sistem de tampon discontinuu, ionii sunt forțați
să migreze cu aceeași viteză. (După Westermeier, 2004).

3.11.1.2. Separarea componentelor printr-un model de tren ionic

Deoarece toți ionii sunt forțați să migreze cu aceeași viteză, tăria câmpului electric este mai
mare în aria ionilor cu mobilitate mai mică și este mai redusă în domeniul ionilor mai mobili. În
timpul acestei migrații se formează zone pure alăturate ale probei alcătuite din analiți individuali.
La echilibru, ionul cu cea mai mare mobilitate migrează în front, ceilalți migrând în spatele lui în
ordinea scăderii mobilității:

mL->mA->mB->mT-

Figura 3.95.B. O ilustrare grafică a fenomenului de migrare sub

model de tren ionic în separarea componentelor. Ionii sunt separați,
iar fiecare zonă circulă (migreză) una după alta. (După Westermeier,
2004).

unde m reprezintă mobilitatea, L-, simbolizează ionul frontal, T-, ionul terminal, A- și B- fiind ioni
din cadrul probei. Zona cu cea mai mare mobilitate posedă cea mai mică tărie a câmpului
electric, iar zona cu cea mai mică mobilitate prezintă cea mai înaltă tărie ionică a câmpului.
Produsul tăriei ionice și a mobilității fiecărei zone este astfel constant (figura 3.95.B).
 3.11.1.3. Efectul de îngustare a zonei
În cursul procesului de separare izotacoforetică, se
formează zone înguste. Dacă un ion difuzează într-o
zonă cu mobilitate mai înaltă, mișcarea sa este
încetinită din cauza câmpului electric mai scăzut.
Astfel el va migra înapoi în propria zonă. Dacă un ion ar
rămâne mai în urmă, el va fi accelerat și va depăși
zonele învecinate, așezîndu-se în zona sa caracteristică
de mobilitate prin intermediul câmpului electric mai
înalt (figura 3.95.C).

Figura 3.95.C. O ilustrare grafică a efectului de îngustare a

zonei. Din cauza încetinirii ori accelerării ionilor în diferite arii de
câmp electric, zonele sunt îngustate. (După Westermeier, 2004).

3.11.1.4. Efectul de reglare a concentrației

Bazele analizei cantitative prin izotacoforeză o reprezintă ”funcția de reglare” descrisă de
Kohlrausch (1897). Ea definește condițiile de graniță între doi ioni diferiți, L- și A- cu același
contraion, R+ în timpul migrării acestor zone de graniță într-un câmp electric.
Raportul concentrațiilor CL- și CA- a ionilor L-, A- și R+ urmează ecuația:
C L- m L- m - m +
= x A + R
C A - m L- + m R + m A-
unde m, reprezintă mobilitatea și este exprimată în cm2/V•s fiind constantă pentru fiecare ion,
în condiții definite.

Figura 3.95.D. O ilustrare grafică a efectului de reglare a

concentrației. Efectul de reglare a concentrației reprezintă baza
cuantificării în izotacoforeză. (După Westermeier, 2004).

La o concentrație dată a electrolitului L-, concentrația lui A- este fixă după cum toți ceilalți
parametrii sunt constanți. Aceasta se poate aplica și la zona care urmează: dacă concentrația lui
A- este definită, concentrația lui B- este determinată, și așa mai departe. Figura 3.95.D prezintă
modul prin care acest efect de reglare convertește situațiile (a) și (b) într-o situație stabilă, (c).
Într-un model teoretic simplificat al izotacoforezei, se consideră mai întâi o interfață între
două zone conectate, care conţine speciile anionice A- și B-, cu mobilitățile mA>mB. Influența
difuziei sau a altor factori se neglijează. Presupunând că speciile contraionice Q sunt similare în
ambele zone și au o mobilitate constantă, mQ, toți ionii sunt monovalenți și total ionizați în
prezența H+, iar ionii OH- pot fi neglijați; lucrând la o densitate de curent constantă, se pot scrie
următoarele ecuații:
  Potrivit principiuliui electroneutralității, cantitatea de ioni negativi și pozitivi din
ambele zone trebuie să fie egală, deci:
cA,1=cQ,1
și
cB,2=cQ,2
Indicii indică speciile ionice și zonele în care se află; de exemplu c A,1 reprezintă concentrația
ionilor A din prima zonă (A).
 Considerând condițiile izotacoforetice, zonele trebuie să aibă viteze identice, adică:
v1=v2 (3.1)
sau
mA•E1=mB•E2 (3.2.)
ori
E1/E2=mB/mA (3.3)
 Conform legii lui Ohm,
I=constant=E1•λ1=E2•λ2 (3.4.)
și conductivitățile zonelor pot fi scrise ca:
λ1= cA1,•mA•F+cQ,1•mQ•F=cA,1•F(mA+mQ) (3.5.)
(3.6.)
λ2=cB,2•mB•F+cQ,2•mQ•F=cB,1•F(mB+mQ)
Prin urmare,
E1•cA,1• (mA+mQ)=E2•cB,2•(mB+mQ) (3.7.)
sau:
E1 (mA+mQ)
cB,2 = cA,1
E2 (mB+mQ)
Înlocuind E1/E2 cu mB/mA, conform ecuației 3.3:
mB (mA+mQ)
cB,2 = cA,1 (3.8.)
mA (mB+mQ)
Din ecuația 3.8. se poate observa faptul că concentrația tuturor zonelor este determinată de
concentrația de electrolit frontal și depinde de mobilitățile speciilor ionice în cauză.
Deși acest model teoretic este simplificat în mare măsură, se poate statua că concentrațiile în
zone este constantă într-un sistem dat și că concentrațiile ionice scad spre partea posterioară.
Concentrațiile nu depind de compoziția probei. Dacă proba este foarte diluată apoi în alte tehnici
(de exemplu electroforeză zonală sau gaz-cromatografie), concentrațiile vor scădea în
continuare. Totuși, în izotacoforeză, concentrațiile totdeauna ating o valoare fixată de compoziția
electrolitului frontal. Prin urmare, izotacoforeza este uneori utilizată alături de alte tehnici pentru
concentrarea probei în zone înguste. De exemplu, în disc-electroforeză, prima etapă presupune
concentrarea probei într-o zonă așa-numită ”electroforeză de concentrare”. Importanța acestui
fenomen este clară atunci când se realizează, deoarece concentrațiile în zone sunt constante,
lungimea zonei (distanța dintre două semnale diferențiale) este o măsură directă a concentrației
speciilor ionice din probă.
3.11.2. APLICAȚII ALE IZOTACOFOREZEI
Izotacoforeza este utilizată frecvent în separarea şi detecția analiților într-o gamă largă de
aplicaţii de la cele farmacologice şi genetice până la analiza și depistarea unor toxine din
alimente (Auroux și colab., 2002; Dittrich și colab., 2006). Detecția, în ITP poate fi realizată
prin măsurarea schimbărilor de conductivitate, de absorbanţă UV sau de intensitate a
fluorescenţei.
Identificarea este de obicei procesul de determinare a identităţii unuia sau a mai multor analiţi
care au provocat o schimbare observabilă în semnal la detector. Acest proces poate fi dificil
atunci când există mai mulți analiţi de interes ale caror proprietati nu sunt apriori cunoscute.
Pentru astfel de aplicaţii, identificarea trebuie să se bazeze pe o abordare mai generală a
caracteristicilor fizico-chimice, precum masa, sarcina electrică, constantele de disociere, sau
mobilitățile electroforetice (Bercovici și colab., 2010a).
Hirokawa şi Kiso (1982) iar mai târziu Jokl și colab. (1987) precum și Pospichal și colab.
(1989) au realizat experimente multiple de ITP pentru a caracteriza pe deplin mobilităţile total
ionizate şi constantele de disociere ale unui număr mare de specii ionice. Ei au măsurat
conductivitatea zonei la mai multe valori ale pH-ului şi a folosit o simulare pe calculator pentru a
determina mobilitatea şi valorile pKa care se potrivesc cel mai bine datelor experimentale.
Santiago și Chambers (2009) au sugerat că o abordare similară poate fi utilizată în identificarea
analiților pe baza unor metode de detectare prin fluorescenţă indirectă. Bercovici și colab. (2009)
utilizează un amfolit transportor fluorescent care poate fi folosit pentru a identifica şi cuantifica
ionii analitului în condițiile existenței unor minime informaţii în ceea ce priveşte mobilitatea
acestora sau având la bază constantele de disociere acide sau bazice.

Figura 3.96. Reprezentarea schematică a separării

izotacoforetice şi detectarea indirectă utilizând analiza prin
amfoliți transportori fluorescenți: (a) în absenţa de analiți,
amfoliți transportori marcați se concentrează la interfaţa dintre
electrolitul frontal (LE) și electrolitul terminal (TE)
conducând la un semnal fluorescent continuu şi (b) analiţii
concentrați prin izotacoforeză dizlocuiesc subseturi de
amfoliți transportori creând intervale (breșe) în semnal.
Semnalul integral normalizat (care este o funcție integrală a
intensității fluorescenței semnalului și a coordonatelor axiale
ale electrolitului frontal și terminal, reprezentat prin linie
curbă punctată) este o parte integrantă cumulativă a
semnalului de fluorescent dinspre LE spre TE. Zonele de
platou din semnalul integral normalizat (marcat printr-un ×)
sunt asociate cu intervale (breșe) în semnalul fluorescent şi cu
prezenţa unor analiți specifici concentrați. Valoarea
semnalului integral normalizat pentru fiecare analit este o
măsură a fracţiunii de amfolit transportor dintre analit şi
electrolitul frontal. Ultima fracţiune poate fi legată de
mobilitatea efectivă a analitului. (După Bercovici și colab.,
2010).

Pentru detecția indirectă a analiților prin izotacoforeză a fost descrisă o nouă metodă care
necesită amfoliți fluorescenți transportatori (Bercovici și colab., 2010b). Tehnica utilizează o
mică cantitate de probă și nu necesită etape de pregătire a probelor. În cazul analizelor prin
izotacoforeză cu amfoliți transportori se folosește un amestec de amfoliți marcați introduși în
electrolitul terminal (Bercovici și colab., 2010a) înainte de izotacoforeză.
În absenţa analitului, amfoliții transportori marcați se concentrează la interfaţa dintre
electrolitul frontal și electrolitul terminal creând astfel o zonă de linie de bază continuă,
fluorescentă. În prezența analiţilor, care de asemenea, se concentrează la interfaţă, aceștia se vor
deplasa în grupuri de amfoliți transportori şi vor crea discontinuități în semnalul captat de
detector. Figura 3.96 descrie schematic acest proces. În analiza a semnalului, fiecare
decalaj/discontinuitate în semnal denotă existenţa unui analit, în timp ce lăţimea discontinuității
este direct proporţională cu concentraţia iniţială a analitului (Khurana și Santiago, 2008). În plus
faţă de aceste aspecte calitative, izotacoforeza poate fi, de asemenea, utilizată în scopuri
cantitative.
 3.11.2.1. Izotacoforeza preparativă
ITP este o tehnică de separare deosebită pentru analiza ori prepararea unor substanțe ionice
(Everaerts și colab., 1976; Bocek și colab., 1988; Moscher și colab., 1992). Cu toate că utilitatea
analitică a ITP a fost general acceptată, utilitatea sa preparativă rămâne încă limitată, în special
când câmpul de separare nu poate utiliza mediile suport solide.
În scopul obținerii unei cantități mari de analit experimentele de izotacoforeză preparativă
utilizează unități electroforetice la care limitele maxime ale intensității, tenisunii și puterii sursei
de curent sunt de 250 mA, 2500 V respectiv 100 W. Experimentele preparative se realizează în
compartimente de separare unde se pot testa o serie de transportori în condiții electroforetice
identice. Pentru îndepărtarea interferențelor datorate fluxurilor electroosmotice, în unele cazuri
se utilizează o serie de aditivi precum hidroxietil celuloza, sau metil-hidroxietil celuloză la o
concentrație de 0,2% dizolvate în electrolitul frontal (Hirokawa și Kiso, 1994).
3.11.2.2. Izotacoforeza analitică
În multe domenii de aplicare a cromatografiei, precum analize de mediu, a produselor
alimentare şi în biochimie, sunt necesare proceduri corecte, mai puţin consumatoare de timp al
analizelor precum și o sensibilitate a lor de ordinul nanogramelor sau subnanogramelor. Puterea
de separare limitată şi sensibilitatea de detecţie a sistemelor cromatografice necesită adesea o
procedură de pretratare a probei, înainte de analiză cromatografică. Procedurile analitice constau
dintr-o serie de etape, precum pretratarea secvenţială a probei, separarea, detecţia şi manipularea
datelor. Dintre acestea, pretratarea probei, reprezintă o parte integrantă a analizei, fiind adesea
partea cea mai vulnerabilă a întregii proceduri.
Deoarece cea mai slabă parte a unui lanţ determină în mare parte rezultatul final, este
important ca pretratarea probei să fie integrată cu alte dezvoltări care pot fi observate în
procesele de separare şi în tehnicile de detectare. De obicei, procedurile de pretratare a probei
implică izolarea componentelor de interes şi într-un număr de cazuri de asemenea, o
preconcentrare a componentelor, pentru a se încadra în limita de detecție necesară.
În general, procedurile de pretratare a probei trebuie să îndeplinească următoarele criterii:
 o mare capacitate a probei;
 metoda trebuie să fie selectivă pentru componentele luate în studiu, precum şi evitarea
fenomenelor de interferenţă cu alte componente;
 înaltă capacitate de recuperare a componentei de interes și o mare reproductibilate.
 este preferabil ca procedura să fie cât mai rapidă și să fie automatizată.
În prezent, pentru analize HPLC, sunt aplicate o multitudine de proceduri de pretratamet.
Dintre acestea, metodele cromatografice lichid-lichid de izolare sunt, în general, selective,
datorită largii game de opţiuni de transfer al componentelor aflate în studiu dintr-o fază în alta.
Procesele includ extracţia cu ajutorul unor solvenți adecvați, alterarea pH-ului, a polarității, a
puterii ionice ori prin agenți ionici de asociere, ion pairing agents (Metha, 1986; Poole și
Schuette, 1983; Peters, 1982). Totuși, procedurile de izolare cromatografice lichid-lichid sunt, în
general dificile, laborioase, greu de automatizat şi, adesea, se finalizează cu volume relativ mari
de probă, motiv pentru care o etapă de concentrare devine necesară.
Metodele de pretratament lichid-solid care, în general, sunt efectuate pe coloane HPLC,
proba este fracţionată în grupuri distincte de componente, datorită interacţiunii cu componenta
specifică fazei staţionare (Leyden și Wegsheider, 1981), însă concentraţiile componentelor sunt
reduse datorită procesului cromatografic de diluție a analitului. Astfel de metode pot fi efectuate
fie în modul ”online” fie în modul ”offline” (Werkhoven-Goewie și colab., 1981; Lankelma și
Poppe, 1987; Koyosi și colab., 1988; Ascalone și Dal Bó, 1987).
Tehnicile de extracție în fază solidă utilizeză o serie de adsorbenți, unii dintre aceștia fiind
aplicabili în analizele HPLC. Ei sunt folosiți pentru a izola componentele de interes şi de
aîndepărta componentele de interferenţă. Aceste metode sunt adesea bazate pe un adsorbent
nespecific iar interacţiunile cu componenta de interes din probă sunt deseori complicate de
efectele matricei și capacitatea limitată de probă (Grossi și colab., 1987; Doyle și colab., (1987);
Li și colab., 1987; Claessens și colab., 1988).
Tehnicile de extracție în fază solidă sunt aplicate după procedurile de îmbogăţire în analitul
de interes sau pentru a schimba solventul în care sunt dizolvate component/ele de interes
(Putzien, 1987; Rebello, 1987). Recurgerea la metodele electroforetice ca tehnici de pretratare a
probei poate fi, de asemenea, o soluție datorită echipamentului relativ simplu şi, în plus, a
posibilităţilor promiţătoare de automatizare. Printre multe tehnici electroforetice, electroforeza
zonală şi izotacoforeza sunt de interes în ceea ce priveşte procedurile de pretratare a probei
(Schoots și Evereaerts, 1983; Kok, 1987).
În ceea ce priveşte izotacoforeza există două avantaje suplimentare față de alte tehnici
electroforetice, adică existența proprietății de autocorectare şi a efectului de concentrare a
zonelor separate în cadrul procesului de separare (Evereerts și colab., 1976; Deyl, 1979).
Proprietatea de auto-corectare a izotacoforezei stabilizează zonele de limită difuze dintre
componente, ceea ce conduce la benzi înguste ale acestora. Acest proces se datorează câmpului
electric distinct și constant dn fiecare zonă, după ce s-a atins starea de echilibru în conformitate
cu ecuația 3.9:
vef = mef•E (3.9)
unde:
vef = viteza efectivă a unei substanțe ionice sub condiții experimentale [m•s-1];
mef =mobilitea efectivă a unei substanțe ionice sub condiții experimentale [m2•v-1•s-1];
E = intensitatea câmpului electric aplicat [V•m-1].
În izotacoforeză, concentrația fiecărui component separat în zona sa este dată de funcţia de
reglare Kohlrausch (Evereerts și colab., 1976.; Deyl, 1979). Astfel, pentru un sistem anionic (Ion
A-) următoarea ecuaţie poate fi derivată:

(3.10)

unde:
CA- = concentrația anionului A- din probă, în zona separată;
CL - = concentrația de ion frontal;
mA, mL și mQ reprezintă mobilitățile absolute ale anionilor A-, L-, respectiv a contraionului Q.
Ecuația Kohlrausch poate fi simplificată și exprimată astfel:
CA- = CL- x constantă
La echilibru, concentrația ionilor, CA- din probă este proporțională cu concentrația ionului
frontal, CL-. Aceasta înseamnă că în orice zonă concentrația ionică este constantă. Numărul de
ioni din fiecare zonă este proporțional cu lungimea zonei. O caracteristică a izotacoforezei este
faptul că o cuantificare a fiecăror componente este dată prin măsurarea lungimii zonei. Figura
3.95.D., arată cum, în timpul migrării izotacoforetice, stările a și c determină automat starea b.
Pentru a determina concentrația unei substanțe, sunt necesare cel puțin două migrări: în
prima, se separă proba nemodificată, iar în a doua separare, se adaugă o cantitate cunoscută de
substanța pură. Cantitatea de substanță care se dorește a fi analizată poate fi dedusă din lungimea
zonei. Figura 3.97. prezintă profilul penicilinelor separate prin ITP.
 Figura 3.97. Aplicații ale izotacoforezei în separarea penicilinelor. (După Westermeier, 2004).

După dezvoltarea zonelor analiților din probă, conductivitatea fiecărei zone şi prin urmare,
căderea de tensiune dezvoltată, va fi în relație directă cu concentrația de ioni și în scopul
menţinerii uniforme a conductivității concentrației (adică volumul ocupat de fiecare
componentă) aceasta se va modifica. Prin urmare, la echilibru, nu numai că se vor separa unele
componente de altele dintr-un amestec, volumul ocupat de fiecare componentă fiind proporţional
cu concentraţia sa iniţială din probă (figura 3.98). Detectori similari cu cei descriși pentru HPLC
pot fi potriviți acestei tehnici, cu toate că izotacoforeza este o procedură specială motiv pentru
care sunt necesare instrumente speciale). Aparatura, se aseamănă oarecum cu cea utilizată pentru
tipul de electroforeză capilară.
3.11.3. APARATURA UTILIZATĂ ÎN TEHNICILE DE IZOTACOFOREZĂ
În 1967, Hjerten a descris un aparat pentru electroforeza zonală liberă, într-un tub rotativ.
Acesta a permis studii, de separare a ionilor anorganici și organici, a, peptidelor, proteinelor,
acizilor nucleici, a viruşilor şi bacteriilor. Determinările de mobilitate au putut fi realizate cu
mare precizie. Echipamentul, a putut fi de asemenea utilizat în focalizare izoelectrică şi
izotacoforeză (Vesterberg, 1989).
Izotacoforeza a fost mult promovată prin dezvoltarea unor detectoare adecvate. În 1970,
Arlinger şi Routs (1970) au introdus un detector de absorbţie UV, iar în anul 1972, Verheggen și
colab. (1985) au prezentat un detector de conductivitate. Cele două detectoare au fost apoi
incluse în instrumente comerciale (Everaerts și colab., 1976). Imprecizia analizei a scăzut, în
zilele noastre, sub 1% la nivel de ordinul nanogramelor de analit. Au fost publicate o multitudine
de comentarii cu privire la analiza izotacoforetică (Scott,
http://physicalchemistryresources.com/downloads.htm). Izotacoforeza se realizează obișnuit în
tuburi capilare de teflon (Everaerts și colab., 1976; Hjalmarsson și Baldesten, 1981), ori în
tuburi capilare de cuarț (Jorgenson și Lukacs, 1981; Hjerten, 1983). În detecția izotacoforetică a
componentelor separate sunt adesea folosite tensiuni foarte mari (de până la 400V/cm). Prin
folosirea unui tensiuni înalte este astfel posibilă obţinerea unei rezoluţii îmbunătăţite, utile
pentru, determinări ale concentraţiilor unor diverse substanţe ionice, de exemplu în testarea
calității apei, analiza purității unor medicamente, monitorizarea unor metaboliţi, deoarece toate
aceste substanţe ionizate pot fi analizate fără derivatizare, proces adesea necesar în gaz-lichid
cromatografie (Everaerts și colab., 1976; Vesterberg, 1989).

A Acid izoascorbic B Acid ascorbic

 Figura 3.98. Izotacoforeza analitică. Acidul ascorbic (vitamina C, figura A) este prezent în mod natural în multe
alimente și deseori adăugat în altele. Ocazional, se utilizează izomerul mai ieftin, acidul izoascorbic (figura B), care
nu are acțiune vitaminică, fiind distinctibil față de izomerul natural prin diverse metode analitice, printre care și prin
izotacoforeză. Panelul (a) arată analiza unei probe comerciale de suc de fructe în timp ce panelul (b) arată același suc
de fructe la care s-a adăugat o cantitate cunoscută (4 nmoli) de acid izoascorbic. (După Holme și Peck, 1998).
Sistemele de detecție pe capilar au fost aplicate în scopuri analitice şi micropreparative.
Astfel, compuşii migrează electroforetic prin capilar sunt transportați prin pompare printr-un
lichid de înaltă performanţă spre monitorul UV iar apoi sunt îndreptați spre un colector de
fracţiuni. Prin analiza absorbţiei luminii la aproximativ 185 nm, pot fi monitorizate concentraţii
foarte scăzute de proteine ori a altor substanţe. Figura 3.99. prezintă schema de principiu a unui
aparat de izotacoforeză. Tensiunea aplicată este de până la 30 kV iar intensitatea curentului este
de ordinul amperilor. Pentru diferențierea efectivă dintre zonele continue, utilizează de asemenea
detectori termici ori de conductivitate.
În eforturile de monitorizare a mediului şi de evaluare a calităţii apei sunt necesare o
multitudine de analize chimice, disponibile pe scară largă, necostisitoare precum şi tehnologiile
care utilizează senzori de gaze (Wanekaya și colab., 2008) ori a metodelor gaz-cromatografice
sau lichid-cromatografice cuplate la spectrometria de masă. O astfel de platformă este utilizată în
prezent la detectarea unor substanțe toxice în apa potabilă (U.S. Environmental Protection
Agency). În timp ce aceste metode sunt considerate suficient de sensibile şi precise, utilizarea lor
este cea mai mare parte limitată la analizele de laborator, din cauza dimensiunii lor, a greutății, a
necesarulului de energie electrică, a echipamentelor periferice, a costului, ori a etapelor necesare
de pregătire a probelor. Din această cauză sunt dorite tehnici de detecție ieftine, sensibile, iar
aparatura utilizată să fie portabilă.
Miniaturizarea sistemelor de cromatografie tradiţionale reprezintă o abordare în această
direcție. Totuși, cu toate eforturile depuse în scăderea greutății și de reducere a dimensiunilor,
integrarea componentelor cromatografice rămâne în continuare o provocare. O mare parte a
cercetărilor în această direcție se axează pe punerea în aplicare a unor faze staţionare eficiente în
microstructuri şi în miniaturizarea surselor de presiune, pompe şi valve (Lindner, 2001).
O abordare alternativă în curs de dezvoltarea de sisteme de testare noi este realizarea unor
detectoare portabile cu un preț scăzut care au o funcţionalitate crescută și care evită prelucrarea
probelor complexe (de exemplu, marcarea lor) şi care sunt compatibile cu o arhitecturi de sistem
ieftină. Detecţia pe bază de fluorescenţă este metoda cea mai sensibilă pentru aplicaţii ”onchip”
(Landers, 2007), dar această tehnologie necesită de obicei o metodologie de analiză pe baza
autofluorescenței analitului (o proprietate care nu este posedată de cele mai multe substanțe
toxice de interes) sau de o maracre fluorescentă (de exemplu, prin folosirea marcării
imunofluorescente în analiză) (Jiang și colab., 2008). Kuhr şi Yeung (1988) au demonstrat
detecția indirectă, prin deplasarea ionilor detectabili prin fluorescenţă în electroforeză capilară
(CE). Cu toate acestea, este necesară o concentraţie ridicată de analit pentru deplasarea sa fizică,
ceea ce conduce la limitarea sensibilității acestuia la concentraţii de ~ 100 µM. Problema s-a
rezolvat relativ recent, când au fost propuse mai multe metode izotacoforetice indirecte bazate pe
detecție fluorescentă (Chambers și Santiago, 2009; Khurana și Santiago, 2008).

Figura 3.99. Schema de principiu a unui ansamblu izotacoforetic de tip analitic. (După Righetti, 2005).
În izotacoforeză, ionii din probă se concentrează şi se separă, în acelaşi timp, în funcţie de
mobilităţile lor electroforetice între un electrolit conducător și un electrolit terminal. Acest
proces creează, zone adiacente, de mare concentrare, care electromigrează cu o viteză uniformă.
Chambers şi Santiago (2009) au dezvoltat o metoda de detectare indirectă, denumită metoda cu
trasor fluorescent nefocusat, în care zonele de analit sunt detectate prin analiza intensității locale
a unei molecule trasor fluorescent nefocalizate, care electromigrează prin zonele de analiţi
concentrate dar nemarcate. Pentru analize multiple, metoda cu trasor fluorescent nefocalizat
necesită doar un singur fluorofor, timp în care intensitatea semnalului fluorescent este în
domeniul de concentraţie iniţială (care poate fi limitată prin autostingere, absorbanța peretelui,
sau de interacţiunea cu analiţii). Khurana şi Santiago (2008) au prezentat un test de detecție
indirectă prin izotacofoerză care utilizează markeri de mobilitate pentru a identifica şi cuantifica
analiți nemarcați.
În această abordare, speciile fluorescente, atent selectate, (denumite markeri de mobilitate) se
amestecă cu analitul, care se concentrează în zonele izotacoforetice, împreună cu substanţele de
analizat. Lipsa semnalului fluorescent al markerilor indică apoi prezenţa şi cantitatea de analit
specific care este aplicat. Dacă puternica deplasare fizică a ionilor în izoacoforeză a condus la o
capacitate de detecție directă a aproximativ 10 µM analit nefluorescent, detecția cu markeri
fluorescenti prezenţi în mediul de detecție conduce la determinări de analiți la o concentraţie pe
ordinul 1 mM. De obicei, analiții se concentrează în formă de peak (îngust, de tip Gaussian,
asociat cu o concentraţie redusă) şi prin urmare, sunt uşor de identificat folosind analiza peak-
ului unui standard. Un dezavantaj al tehnicii de mobilitate a markerilor este că moleculele
marker-fluorescente şi condiţiile izotacoforetice a tamponului trebuie să fie selectate pentru
fiecare analit; în plus, există doar un număr limitat de fluorofori cu mobilităţi relevante
disponibili. În ciuda acestor aspecte în detectarea indirectă, existând o nevoie de o aplicabile pe
scară largă, testul de fluorescenţă indirectă prin care se pot detecta un număr mare de substanţe
de analizat a fost pus în aplicare într-un dispozitiv cu preț scăzut. Astfel au fost puse la dispoziție
dispozitive portabile cu separare, detecţie prin fluorescenţă și de analiză ”on-chip”. Inițial, Burns
și colab. (1998) au arătat posibilitatea integrării microelectronicii cu microfluidica. Ei au
prezentat un dispozitiv de analiză a ADN, bazat pe integrarea unei fotodiode şi a unui dispozitiv
optic, electronic, remarcând că funcţionalitatea la tensiune înaltă este un factor limitativ în
realizarea unui sistem integrat. Lagally și colab. (2001) au prezentat un sistem portabil pentru
analiză genetică, bazat pe markeri de mobilitate fluorescenţi. Ei au arătat posibilitatea limitei de
detecţie a 2-3 celule bacteriene, dar tehnologia s-a bazat pe componente cu preț crescut, precum
cele de optică confocală şi un sistem fotomultiplicator.
 Într-o serie de lucrări publicate Behnam și colab., (2008) au prezentat un dispozitiv (chip
microelectronic) capabil să furnizeze, să comute şi să controleze tensiunea înaltă (de sute de
volţi) de la o sursă de 5V. Bazat pe acest chip, Kaigala și colab., (2009) au demonstrat utilitatea
acestuia în electroforeza capilară într-un dispozitiv relativ ieftin, portabil, dotat cu detector prin
fluorescenţă. Într-o lucrare recentă, s-a prezentat o versiune îmbunatațită a dispozitivului şi s-a
demonstrat utilitatea acestuia în izotacoforeză (Kaigala și colab., 2010).
Bercovici și colab. (2010) au prezentat un dispozitiv ieftin de mână (240 g), care pune în
aplicare microcipul izotacoforetic, cu sistemul de detecție prin fluorescență indusă de laser
(figura 3.100). Acest instrument de sine stătător integrează funcţionalitatea necesară pentru
generarea de înaltă tensiune pe un chip microelectronic și include sistemul de detecție prin
fluorescență indusă de laser fiind alimentat de un port Universal Serial Bus (USB), direct de la
un computer laptop.

Figura 3.100. Un dispozitiv care pune în aplicare microchip-ul

izotacoforetic dotat cu un sistem de detecție prin fluorescență indusă
de laser. (După Bercovici și colab., 2010).

Folosind acest dispozitiv, s-a demonstrat posibilitatea analizei unor specii fluorescente, cu o
limită de detecţie de 100 pM. Răspunsul la detector este liniar, cu concentraţia de analit, ceea ce
face acest dispozitiv adecvat pentru analiza cantitativă.
3.11.4. AVANTAJELE UTILIZÎRII TEHNICII IZOTACOFORETICE
Izotacoforeza este o tehnica electroforetică neliniară utilizată la separarea unei mari varietăți
de compusi ionici, de la molecule mici, cum ar fi ionii de metal (Prest și colab., 2004), ori pentru
separarea unor moleculele mari precum proteinele (Stowers și colab., 1995). Spre deosebire de
electroforeza "liniară", în care se separă benzile de solut în zone continue și care se dispersează
prin difuziune sau dispersie, izotacoforeza formează zone auto-îngustate, adiacente, de substanţă
pură din soluţie a cărei concentraţie depăşește adesea domeniul de mg/ml.
Cu 110 ani în urmă, Kohlrausch a dezvoltat teoria de bază a izotacoforezei, dar până la
dezvoltarea de electroforezei capilare, în anii 1970, nu a primit o prea mare atenţie. De atunci,
izotacoforeza, împreună cu electroforeza zonală şi focalizarea izoelectrică, au devenit
instrumente analitice indispensabile, datorită, în special, rezoluţiei înalte şi a posibilității unei
analize rapide a probelor biologice. Această evoluţie a fost fundamentată, acoperind complet
teoria electroforezei prin aplicaţii moderne şi simulări pe calculator ale procesului de separare.
Pe parcursul ultimului deceniu, dezvoltarea rapidă electroforezei bazate pe microfluidică face
din izotacoforeză un candidat promiţător pentru a înlocui electroforeză pe gel ori electroforeza
capilară (Mosher și colab., 1992). ITP a jucat un rol tot mai important în aplicarea tehnologiei
electroforetice de microcipuri datorită a două caracteristici unice:
În primul rând, izotacoforeza este o metodă de concentrare extrem de puternică. Nu contează
cât de scăzută este concentrația probei, ea poate fi concentrată până la o valoare de platou, care,
în cazul ideal, este descrisă de următoarea ecuaţie:
 unde C este concentraţia, z este sarcina electrică şi ω, mobilitatea electroforetică. Această
caracteristică unică a izotacoforezei este foarte utilă atunci când vine vorba de microchip-uri
electroforetice în cazul în care detecția este dificilă datorită cantității reduse de probă şi a
existenței unei mici ferestre de detecție în chip-ul microfluidic. Cel mai bun mod de creştere a
capacității de încărcare a unui chip microfluidic este ce a pre-concentra proba; izotacoforeza
oferă o metodă simplă și efectivă de concentrare, care pot fi integrată cu uşurinţă pe un chip,
înainte de alte operaţiuni on-chip, mai ales în cazul electroforezei zonale (Cui și Ivory, 2008).
În al doilea rând, izotacoforeza conduce la o auto concentrare, de exemplu, zonele stivuite
poate recupera rapid forma lor, dupa un eveniment dispersiv. Această caracteristică face din
izotacoforeză o metodă foarte de dorită în aplicaţiile de microchip-uri în cazul în apar fenomene
de dispersie.
Izotacoforeza și-a demonstrat deja superioritatea sa față de alte tehnici de separare
electroforetică în ceea ce priveşte aceste două caracteristici discutate mai sus. Cu multe alte
caracteristici, de exemplu, predictia poziţiilor zonelor la starea de echilibru şi rotirea indusă prin
focalizare izotacoforetică în canale microfluidice, izotacoforeza tinde să-și găsească o utilizare
pe scară largă în aplicaţii biologice, precum purificarea la microscală a proteinelor şi testarea
activității enzimatice pe chips-uri microfluidice compacte (Paschkewitz și colab., 2007).
Bibliografie
Arlinger, L., Routs, R. J. (1970) Boundary sharpness in capillary-tube isotachophoresis demonstrated by UV
detection. Sci. Tools 17:21.
Ascalone, V., Dal Bó, L. (1987) Automated high-performance liquid chromatographic and column-switching
technique for on-line clean-up and analysis of diltiazem in human plasma. J. Chromatogr. 423:239-249.
Auroux, P., Iossifidis, D., Reyes, D. R., Manz, A. (2002) Micro total analysis systems. 2. Analytical standard
operations and applications. Anal. Chem. 74:2637–2652.
Behnam, M., Kaigala, G. V., Khorasani, M., Marshall, P., Backhouse, C. J., Elliott, D. G. (2008) An integrated
CMOS high voltage supply for lab-on-a-chip systems. Lab Chip 8:1524–1529.
Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. (2010b) Method for analyte identification using isotachophoresis and
a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82:2134-2138.
Bercovici, M.; Kaigala, G. V.; Backhouse, C. J.; Santiago, J. G. (2010a) Fluorescent carrier ampholytes assay for
portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82:1858-1866.
Burns, M. A., Johnson, B. N., Brahmasandra, S. N., Handique, K., Webster, J. R., Krishnan, M., Sammarco, T. S.,
Man, P. M., Jones, D., Heldsinger, D., Mastrangelo, C. H., Burke, D. T. (1998) An Integrated Nanoliter DNA
Analysis Device. Science 282:484–487.
Chambers, R. D.; Santiago, J. G. (2009) Imaging and Quantification of Isotachophoresis Zones Using
Nonfocusing Fluorescent Tracers. Anal. Chem. 81:3022–3028.
Claessens, H. A., Lemmens, A. A. G., Sparidans, R. W., Everaerts, F. M. (1988) Pretreatment of Body Fluids by
Preparative Isotachophoresis Prior to Chromatographic Analysis. Chromatographia 26:351- 358.
Cui, H., Ivory, C. F. (2008) Isotachophoresis. www.aesociety.org/areas/pdfs/Isotacho phoresisCuiIvory2-08.pdf
Davis, B. J. (1964) Disc electrophoresis. ii. method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci.
121:404-427.
Deyl Z. (ed.), Electrophoresis, J. Chrom. Lib., Vol 18, Elsevier, New York, 1979.
Dittrich, P. S., Tachikawa, K., Manz, A. (2006) Micro total analysis systems. Latest advancements and trends.
Anal. Chem. 78:3887–3908.
Doyle, E., Pearce, J. C., Picot, V. S., Lee, R. M. (1987) Analysis of drugs from biological fluids using disposable
solid phase columns. J. Chromatogr. 411:325-333.
Everaerts, F. M., Becker, J. M., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis, theory, instrumentation and applications.
J. Chromatogr. Library. Vol. 6. Elsevier, Amsterdam, 1976.
Everaerts, F. M., Geurts, M., Mikkers, F. E. P, Verheggen, Th. P. E. M. (1976) Analytical isotachophoresis. J.
Chromatogr.A 119:129-155.
Evereerts, F. M., Backers, J. L., Verheggen, Th. P. E. M. Isotachophoresis, Elsevier, New York, 1976.
Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. (1987) A fully automated catecholamines analyzer based on
cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia 24:842-846.
Hirokawa, T., Kiso, Y. (1982) Isotachophoretic determination of mobility and pKa by means of computer
simulation : I. Estimation of accuracy of the evaluated constants. J. Chromatogr. A. 252:33–48.
Hirokawa, T., Kiso, Y. (1994) Preparative procedures in isotachophoresis J. Chromatogr. A. 658:343-354.
Hjalmarsson, S.-G., Baldesten, A. In: CRC Critical Review in Anal. Chem. 261–352, 1981.
Hjerten, S. (1967) Free zone electrophoresis. Chromatogr. Rev. 9:122–219.
 Hjerten, S. (1983) High-performance electrophoresis: the .electrophoretic counterpart of high-performance liquid
chromatography. J. Chromatogr. 270:1–6.
Holloway, C. J., Trautschold, I. (1982) Principles of isotachophoresis. Fresenius' J. Anal. Chem. 311:81-93.
Holme, D. J., Peck, H. Analytical Biochemistry. Third Edition. 3.3.4. Isotachophoresis. Pearson Education
Limited, Edinburgh Gate, Harlow, 1998.
Jiang, X.; Li, D.; Xu, X., Ying, Y., Li, Y., Ye, Z., Wang, J. (2008) Immunosensors for detection of pesticide
residues. Biosens. Bioelectron. 23:1577–1587.
Jokl, V.; Polasek, M.; Pospıchalova, J. (1987) Isotachophoretic determination of the ionic mobilities and
ionization constants of weak monoacidic bases by a simple computer-aided slope-intercept method. J. Chromatogr., A
391:427–432.
Jorgenson, J.W., Lukacs, K. D. (1981) Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries. Anal. Chem.
53:1298–1302.
Kaigala, G. V., Bercovici, M., Behnam, M., Elliott, D. G., Santiago, J. G., Backhouse, C. J. (2010) Miniaturized
system for isotachophoresis assays Lab Chip 10:2242–2250.
Kaigala, G., Behnam, M., Bliss, C., Khorasani, M., Ho, S., McMullin, J., Elliott, D., Backhouse, C. (2009)
Inexpensive, universal serial bus-powered and fully portable lab-on-a-chip-based capillary electrophoresis instrument.
IET Nanobiotechnol. 3:1–7.
Khurana, T. K., Santiago, J. G. (2008) Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent
analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80:279–286.
Kohlrausch, F. (1897) Uber Concentrations-Verschiebungen durch Electrolyse im Inneren von. Lösungen und
Lösungsgemis. Ann Phys. 62:209–220.
Kok, W. T. (1987) Theoretical considerations for zone electrophoretic sample treatment in liquid chromatography.
Chromatographia 24:442-448.
Koyosi, M., Haruhito, K., Harimi, I., Hirosaki, T., Masuo, U. Matsumoto, K., Kikuchi, H., Iri, H., Takahasi, H.,
Umino, M. (1988) Automated determination of drugs in serum by columnswitching high-performance liquid
chromatography II. Separation of theophylline and its metabolites. J. Chromatogr. 425:323-330.
Kuhr, W. G., Yeung, E. S. (1988) Optimization of sensitivity and separation in capillary zone electrophoresis with
indirect fluorescence detection. Anal. Chem. 60:2642–2646.
Lagally, E. T., Medintz, I., Mathies, R. A. (2001) Singlemolecule DNA amplification and analysis in an integrated
microfluidic device. Anal. Chem. 73:565-70
Landers, J. P. Handbook of Capillary and Microchip Electrophoresis and Associated Microtechniques, CRC Press;
Boca Raton, FL, 2007.
Lankelma, J., Poppe, H. (1987) Determination of methotrexate in plasma by on-column concentrations and ion-
exchange chromatography. J. Chromatogr. 149:587-598.
Leyden, D. E., Wegnheider, W. (1981) Preconcentration for trace element determination in aqueous samples.
Anal. Chem. 53:1059A–1065A
Li, F., Lim, C. K., Peters T. J. (1987). Solid phase extraction and direct HPLC separation of bilirubin and its
conjugates in plasma. Chromatographia 24:637-638.
Lindner, D. (2001) The μChemLabTMproject: micro total analysis system R&D at Sandia National Laboratories.
Lab Chip 1:15N–19N.
Metha, A. C. (1986) Sample pretreatment in the trace determination of drugs in biological fluids. Talanta 33:67-
73.
Metha, A. C. (1987) Drug determination in biological fluids-approaches to method validation. Talanta 34:609-
613.
Mosher, R. A., Saville, D. A., Thormann, W. The Dynamics of Electrophoresis; VCH: New York, 1992.
Ornstein, L. (1964) Disc electrophoresis-1: background and theory. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121:321–351.
Paschkewitz, J.S., Molho, J. I., Xu, H., Bharadwaj, R., Park, C. C. (2007) Turn-induced isotachophoretic focusing
in microfluidic channels. Electrophoresis 28:4561-4571.
Peters, T. L. (1982) Comparison of continuous extractors for the extraction and concentration of trace organics
from water. Anal. Chem. 54:1913–1914.
Poole, C. F., Schuette, S. A. (1983) Isolation and concentration techniques for Capillary column GC analysis. J.
High Resolut. Chromatogr. 315:526-549.
Pospichal, J.; Gebauer, P.; Bocek, P. (1989) Measurement of mobilities and dissociation constants by capillary
isotachophoresis. Chem. Rev. 89:419–430.
Prest. J. E., Baldock, S. J., Fielden, P. R., Goddard, N. J., Kalimeri, K., Treves Brown, B. J., Zgraggen, M., (2004)
Use of miniaturised isotachophoresis on a planar polymer chip to analyse transition metal ions in solutions from metal
processing plants. J. Chromatogr. A 1047:289–298.
Putzien, J. (1987) Enrichment and Determination of Pesticides in. Drinking Water. Vom Wasser 68:33-41.
Rebello, T. (1987) Trace enrichment of biological folates on solid-phase adsorption cartridges and analysis by
high-pressure liquid chromatography. Anal. Biochem. 166:55-64.
Schoots, A. C. Evereaerts, F. M. (1983) Isotachophoresis as a preseparation technique for liquid chromatography.
J. Chromatogr. 277:328-332.
 Scott R. P. W. Books in the physical chemistry series. Book IV ~ Isotachophoresis. Physical Chemistry Resource
books. http://physicalchemistryresources.com/downloads.htm.
Stowers, A. W., Spring, K. J., Saul, A. (1995) Preparative scale purification of recombinant proteins to clinical
grade by isotachophoresis. Biotechnology (N Y) 13:1498-1503.
U.S. Environmental Protection Agency. Safe Drinking Water Act Analytical Methods and Laboratory
Certification. http://www.epa.gov/safewater/methods/analyticalmethods.html.
Verheggen, Th. P. E. M., Everaerts, F. M., Reijenga J. C. (1985) UV detection at 206 nm in isotachophoresis. J.
Chromatogr. 320:99-104.
Verheggen, Th. P. E. M., van Ballegooijen, E. C., Massen C. H., Everaerts, F. M. (1972) Detection electrodes for
electrophoresis. J. Chromatogr. 64:185-189
Vesterberg, O. (1989) History of electrophoretic methods. J. Chromatog. 480:3-19.
Wanekaya, A. K., Chen, W., Mulchandani, A. (2008) Recent biosensing developments in environmental security.
J. Environ. Monit. 10:703–712.
Werkhoven-Goewie, C. E., Brinkman, U. A. Th., Frei, R. W. (1981) Trace enrichment of polar compounds on
chemically bonded and carbonaceous sorbents and application to chlorophenol. Anal. Chem. 53:2072–2080.
Westermeier, R. Electrophoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein
Separations, revised and enlarged Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2004.
 3.12. ELECTROFOREZA CAPILARĂ
Electroforeza, definită ca migrarea unor analiți într-o soluţie de electrolit sub acțiunea unui
câmp electric, a reprezentat un sprijin în dezvoltarea metodelor de separare și analiză biochimice
odată cu descrierea ei realizată de Tiselius. Electroforeza în "mediu liber", ca metodă originală, a
fost limitată de instabilitatea aparatului şi, mai semnificativ, de efectul de difuziune, exacerbat de
efectul de încălzire datorat câmpului electric, care compromite rezoluţia de separare a
componentelor probei de analizat. Creşterea în popularitate a tehnicii s-a datorat introducerii
„mediilor suport” precum hârtia sau gelul de amidon. Scopul mediului suport a fost cel de a
conţine electrolitul sau tamponul de migrare şi astfel, să creeze fenomene de alterare a mișcării
analitului în circulația sa liberă, în așa fel încât influenţa aleatoare a proceselor de difuzare să fie
limitate (Kemp, 1998).
Electroforeza capilară (capillary electrophoresis, CE), s-a dezvoltat ca tehnică la sfârşitul
anilor 1980 şi a crescut constant în popularitate de atunci. În forma sa cea mai simplă şi mai
frecvent utilizată, CE reprezintă o întoarcere la metoda originală descrisă de Tiselius, dar
popularitatea sa nu se bazează numai pe această simplitate inerentă, ci și cu privire la avantajele
suplimentare date de viteză, versatilitate și costuri reduse. Fiind în esenţă o metodă analitică, ea
și-a găsit aplicabilitatea în separarea biopolimerilor, cum ar fi peptide, proteine, oligonucleotide,
ioni de metale și ioni anorganici, precum şi în analiza de produse farmaceutice ori în
monitorizarea calităţii apei (Altria și Bryant, 1997). Deşi metodologia de bază presupune
separarea moleculelor pe baza raportului sarcină electrică/masă moleculară, există simple
modificări la procedură, imprumutate de la tehnicile existente, bine stabilite, care permit separări
pe baza dimensiunii sau a punctului izoelectric, sau care să permită separarea unor molecule fără
sarcină electrică, în timp ce gradul de rezoluţie poate să conducă la separari de izomeri optici. În
acest sens au fost publicate o serie de articole privind aplicarea tehnicilor de CE la separarea
proteinelor (Wijnen și Van Diejenvisser, 1996), fragmentelor de ADN (Righetti și Gelfi, 1997),
hidraţilor de carbon (Weber și Lundte, 1996; Paulus și Klockow, 1996) ori a diverselor
medicamente sau diferite studii de metabolism a acestora (Bressolle și colab., 1996; Naylor și
colab., l996; Nguyen și Siegler, 1996; Riekkola și Jumppanen, 1996).
3.12.1. PRINCIPII DE BAZĂ ÎN ELECTROFOREZA CAPILARĂ
Electroforeza capilară este o metodă de separare a componentelor unui amestec lichid pe baza
mobilităţi lor diferite în interiorul unui câmp electric. Această metodă se aplică la molecule care
posedă sarcină fie pozitivă, fie negativă şi care migrează într-un câmp electric cu viteze diferite.
Separarea diferitelor componente dintr-un amestec este dependentă de timp și depinde de doi
factori principali: mobilitatea electroforetică şi fluxul electroendoosmotic.
3.12.1.1. Parametrii de migrare în electroforeza capilară
(1) Mobilitatea electroforetică efectivă. Mobilitatea (migrarea) electroforetică efectivă se
referă la mişcarea de moleculele încărcate electric într-o soluţie de electroliţi considerată a fi
"imobilă", spre electrodul de semn opus. Într-adevăr, o moleculă încărcată, într-un câmp electric,
este supusă la o forţă care este proporţională cu sarcina efectivă a acestuia (q) şi câmpul electric
care este aplicat (E). Speciile neutre nu sunt separate cu excepţia cazului în care există unele
asocieri cu ionii de electrolit în sine, care să conducă la diverse forţe atractive. Mobilităţile
diferite sunt desemnate ca (+) sau (-) în funcţie de sarcina pe care o poartă moleculele. Pentru
speciile care nu au o sarcină netă, mobilitatea este zero.
(2) Mobilitatea aparentă. Mobilitatea aparentă corespunde vitezei efective de migrare a
moleculelor din interiorul capilarului. Ea reprezintă suma mobilităţilor electroforetice ale unei
specii de molecule și a fluxului electroosmotic. Astfel, în electroforeza capilară, timpul necesar
pentru un solut să migreze depinde de mobilitate sa electroforetică şi de mobilitatea fluxului.
 (3) Injecția probei. În electroforeză capilară, există două modalităţi principale pentru
injectarea probei: injecţia hidrodinamică şi electromigrarea. Injectare hidrodinamică poate
utilizea presiunea sau vacuum-ul. Ea nu poate fi utilizată pentru electroforeza capilară în gel sau
în prezenţa unor soluţii tampon vâscoase, care necesită perioade mai lungi de injectare. Injecţia
la presiune este metoda cea mai comună în care volumul de injecţie este limitat la 1-2% din
volumul total al capilarului. Injectarea poate fi realizată prin presiune gravitașională, aceasta
fiind o metodă care constă în ridicarea pur şi simplă a probei. Metoda permite ajustarea
volumului de probă care poate fi injectat cu o precizie mai mare decât cea realizată la
presiune/vacuum. Metoda electromigrării este mult mai puţin frecventă.
Deoarece pereţii capilarelor au o sarcină imobilizată (fixă) apare un flux electroosmotic
dinspre anod, spre catod (Figura 3.102.). astfel, migrarea unei molecule încărcate pozitiv de la
anod la catod depinde de gradientul de tensiune aplicat şi fr fluxul electroosmotic. Molecule
neîncărcate sunt separate pe capliarul de silice datorită fluxului electroendoosmotic. Pentru
molecule încărcate, rata aparentă a migrării este suma algebrică a mobilității electroforetice și s
fluxului electroosmotic. Mobilitatea electroforetică este dependentă de raportul masă/sarcină.
Pentru a se reduce fluxul electroosmotic coloanele capilare de silice sunt de obicei acoperite,
ceea ce conduce la o separare de calitate mai înaltă. În prezenţa fluxului electroosmotic,
moleculele încărcate migrează într-o formă eliptică, dar atunci când migrarea este exclusiv
generată de gradientul de tensiune aplicat, fronuș de molecula are o formă ascuțită, ceea ce
conduce la un peak îngust. Utilizarea unor tampoane cu pH-uri extreme (pH-uri mai mari de 10,0
şi mai mici de aproximativ 2,0) determină o scădere a adsorbţiei electrostatice. Grupările silanol
sunt încărcate negativ la un pH mare şi sunt protonate la pH acid (Figura 3.103a).

Figura 3.103a. Mecanismul blocării grupărilor silanol prin echilibru (Hafiz, 2005).
La pH de 10,0, cele mai multe proteine (cu excepția acelora foarte bazice) sunt încărcate
negativ, iar peretele capilar este, de asemenea, încărcat negativ, interacţiunea electrostatică fiind
astfel minimizată. În mod similar, la pH-ul foarte mic (de aproximativ 2,0), atât peretelui capilar
cât şi proteinele sunt încărcate pozitiv, ceea ce are ca rezultat o adsorbţie electrostatică redusă a
proteinelor de către peretele capilar. Cu toate acestea, această practică nu este populară pentru că
asemenea valori extreme de pH este posibilă denaturarea proteinelor soldată cu pierderea
activităţii biologice (Hafiz, 2005).
3.12.2. ELECTROENDOSMOZA ÎN ELECTROFOREZA CAPILARĂ
În condiții ideale de electroforeză în absenţa oricărui mediu suport, mobilitatea oricărui ion
este guvernată de forţa de propulsie generată de câmpul electric iar efectul de întârziere este
rezultanta vâscozității sale, care, în termen general este o funcţie de masa moleculară şi forma sa.
În aceste condiții, secțiunea transversală mică a tubului capilar aduce în discuție fenomenul de
electroendosmoză, proces ușor ignorat în electroforeza convenţională. Electroforeză capilară se
realizează în mod normal în tuburi capilare fabricate din silice topită. Grupările silanol negative
prezente în acest material dau naştere unei suprafeţe încărcate cu sarcină negativă (cu potenţial
zeta, ζ), care este responsabilă de fenomenul de electroendoosmoză (vezi 1.4.3.
Electro(endo)osmoza). Această suprafaţă încărcată cu sarcină conduce la o distribuţie distinctă a
speciilor cationice din oricare soluţie ionică aflată într-un tub capilar (figura 3.102).
Prin urmare, fluxul electroosmotic (sau electroosmolaritatea) este parametru care afectează
mobilitatea substanţelor dizolvate. Ea îşi găseşte originile în peretele interior al tubului capilar
care este acoperit cu grupări silanol. Aceste grupuri devin ionizate la pH=2,0 sau mai mult şi de
a crea astfel o acoperire negativă în interior. Pentru a menţine neutralitatea electrică cationii din
soluţia tampon acoperă această “căptuşeală”, creând astfel un al doilea strat. Atunci când este
creat un câmp electric, cationii de la suprafaţa stratului dublu migrează spre catod. Mişcarea lor
trage soluţia de tampon şi se creează astfel un flux denumit flux electroendoosmotic. Acest flux
poate fi controlat prin schimbarea tensiunii electrice, a pH-ului, a tipului de capilar folosit şi prin
includerea unor aditivi specifici. Din cauza debitului electroosmotic, moleculele neutre şi anioni
se pot deplasa în direcţia detectorului care este de obicei situat la capătul catodic al capilarului.

Figura 3.102. Electroforeza capilară zonală: (a) mecanismul de separare prin care se arată mobilitatea
electroforetică a ionilor pozitivi (μM+) și a celor negativi (μM−); N reprezintă o moleculă neutră. (b) Ordinea de
migrare a ionilor.

În acest sistem, are loc apariția unui strat de cationi atașat la imediata vecinătate a peretelui
capilar precum şi un strat cationic mai difuz, asociat de asemenea, în mare măsură la peretele
capilarului. La aplicarea unui câmp electric rezultată o circulaţie în mod obligatoriu spre anod a
acestor cationi difuz atașați, iar cum aceștia sunt hidratați, rezultă o mișcare de lichid în masă a
acestora în aceeaşi direcție. Existenţa curgerii electroendosmotice (EOF) presupune ca
moleculele neutre şi chiar şi cele cu o sarcină negativă să se deplaseze spre catod. EOF are o
influenţă majoră iar variantele de electroforeză capilară precum cea de cromatografie
electrocinetică capilară micelară (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)
depind de procesul de electroendoosmoză ca forţă motrice primare.
Prin urmare, electroendoosmoza nu este neapărat dezavantajoasă, dar amploarea şi influenţa
trebuie să fie controlată, altfel reproductibilitatea separării fiind compromisă.
Electroendoosmoza poate fi ușor măsurată prin injectarea unei soluții neutre, precum acetona ori
DMSO şi de identificare a timpului necesar pentru ca aceasta să ajungă la detector. Compoziţia
electrolitului va influenţa fenomenul de electroendoosmoză. Valorile înalte de pH va conduce la
creştea ionizării grupărilor silanol şi, prin urmare, se va accentua efectul electroendoosmotic, în
timp ce creşterea tăriei ionice va conduce la diminuarea lui. Adaosul de solvenți organici
afectează, de asemenea, electroendoosmoza, dar mai puţin previzibil.
În cele mai multe experimentale fluxul electroendoosmotic poate fi controlat efectiv prin
schimbarea condiţiilor de lucru precum pH-ul tamponului, (care afectează disocierea silanolilor
din peretele capilarului), tăria ionică (care afectează potenţialul ƺ), solvenţii organici (care
acţionează atât asupra potenţialului ƺ cât şi asupra vâscozității tamponului) ori aditivii prezenți în
tampon (de exemplu agenții tensioactivi, metilceluloza, poliacrilamida, aminele cuaternare).
Acoperirea peretelui capilar (cu poliacrilamidă, celuloză, polietilen glicol-PEG, ori alcool
polivinilic-PVA, de exemplu) prin meetode fizice sau chimice adsorbite sau legate, sunt, de
asemenea, extrem de active în suprimarea sau modularea fluxului electroendoosmotic.
În ceea ce privește curgerea electroendoosmotică, încărcarea negativă a grupările silanol de
pe suprafața capilarului are drept consecință imobilizarea ionilor pozitivi hidratați. Deși o serie
dintre acestea sunt intim atașate la sarcinile negative imobilizate, mișcarea lor va conduce la
apariția unui volum de lichid în direcția în direcția catodală.
În electroforeza capilară se utilizează câmpuri electrice puternice care permit separări foarte
rapide. Un alt avantaj al electroforezei capilare este capacitatea acesteia de a genera de la
400.000 la 1 milion de talere teoretice, tensiunile mai mari mărind eficienţa procesului de
separare. Ca regulă, macromolecule care au în mod normal, coeficienţii de difuzie mai mici, au
randamente de separare mai mari decât moleculele mici, cu coeficienți de difuziune mai mari.
Fenomenul poate fi demonstrat atunci când volumele de injecţie şi de detecţie din electrofoeza
capilară sunt foarte mici, lărgirea peak-ului fiind cauzată în principal de difuzia axială sau de
efectul de încălzire Joule, generat de câmpul electric. Cu alte cuvinte, o migrare mai rapidă a
speciilor chimice conduc la obținerea unor peak-uri fine.
3.12.3. APARATURA UTILIZATĂ ÎN ELECTROFOREZA CAPILARĂ
Principiile de bază dezvoltate în electroforeza capilară au fost prezentate în detaliu de către
Holland și colab. (1997), Bruin și Paulus (1995) și Weinberger (1993). După cum sugerează şi
numele, trăsătura distinctivă a acestei metode o reprezintă separările efectuate într-un tub capilar
(figura 3.101), a cărei secțiune transversală (de obicei de 50 µm), are ca scop controlul uşor a
temperaturii. Lungimea capilarei diferă în funcție de aplicaţii diferite, dar este în mod normal în
domeniul de 20-50 cm. Capilarul este umplut cu un tampon de migrare iar proba este introdusă
prin injectare la un capăt al coloanei, după care se aplică un câmp electric (injecţie electro-
cinetică) ori se aplicare o presiune de gaz (injecţie de presiune). Migrarea prin capilar este
realizată, în mod direct sau indirect, prin aplicarea unui câmp electric, iar analiţii sunt detectați în
momentul în care se deplasează prin dreptul unei ferestre situate în capătul opus al capilarului.
Detecția se realizează în mod obișnuit prin absorbanță ori, în alte cazuri prin analiză de
fluorescență. Detecția prin impulsuri amperometrice a fost utilizată pentru analiza de glucide ca
o alternativă la premigrare cu markeri fluorescenți derivatizați (Paulus și Klockow, 1996).

Figura 3.101. Schema de principiu al unui aparat de

electroforeză capilară. Sunt prezentate părțile principale ale
sistemului. Liniile continue indică condițiile de separare, în
timp ce liniile discontinue indică condițiile electrocinetice de
injecție. (După Tagliaro și colab., 1998).

Datorită lungimii scurte de parcurgere, analiza produșilor de separare a analitului necesită un

echipament sensibil de monitorizare. Limitele de detecţie pot fi îmbunătăţite prin introducerea
unei bucle a tubului capilar.
3.12.4. VARIANTE ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE
Ca tehnică de diagnostic, electroforeza capilară se bazează pe diferenţa de mobilităţi între
două substanţe distincte supuse unui câmp electric. Prin urmare, ea este complementară
cromatografiei lichide și joacă un rol important în cadrul diferitelor tehnici analitice disponibile
în prezent.
3.12.4.1. Electroforeza zonală capilară
Electroforeza zonală capilară (CZE) este cea mai simplă formă de electroforeză, fiind în
esență o electroforeză în mediu liber unde migrarea analiților în soluție, realizată sub influența
unui câmp electric, este afectată de raportul sarcina biomoleculei/mărimea ei, fiind opusă
forțelor fricționale din soluția de electrolit. Această mișcare este o funcție complexă, la care
contribuie dimensiunea ionilor, inclusiv orice stratul de hidratare şi vâscozitatea electrolitului.
Prin urmare, în practică, predicţia de mobilitate, nu este simplă, dar o relaţie empirică, utilă, a
fost dezvoltată de Rickard și colab. (1991) care arată o bună corelare între mobilitatea unei
peptide cu funcţia q/M2/3 unde q reprezintă sarcina transportată de un ion din masă, M.
Procesul de injectare a probei aduce o contribuţie importantă atât la rezoluţia de separare care
poate fi realizată cât şi la limitele de detecţie realizate prin CZE. Injectarea se realizează în mod
normal prin presiune sau prin aspirare şi aşa cum ar fi de aşteptat, rezoluţia de separare se va
reduce odată cu creșterea volumului de probă. Cu toate acestea, în cazul în care proba este
introdusă într-un tampon cu tărie ionică redusă, fenomenul de stivuire în zona de probă va
conduce la o concentrare a analiților. Intensitatea câmpului electric din zona de probă va fi mai
mare datorită puterii ionice mai mici și astfel, a unei conductivități mai mici. Ca o consecinţă,
mobilităţile analiţilor din această zonă vor fi mai mari decât atunci când aceștia pătrund într-un
electrolit tampon cu o tărie ionică mai mare şi prin urmare o intensitate a câmpului mai mică a
tamponului electrolit. Scăderea în mobilitate a analitului, atunci când traversează bariera de
electrolit va provoca astfel o îngustare a zonei după cum partea frontală a zonei de analit
încetinește și ca urmare permițând frontului posterior să prindă din urmă frontul anterior. Acest
fenomen conduce atât la creşterea rezoluţiei cât şi a sensibilității. De obicei probele sunt
introduse în capilar aflându-se într-o soluţie de tampon la o concentraţia de tampon-electrolit de
zece ori mai mică. Exemple de separare prin electroforeză zonală capilară sunt prezentate în
figura 3.103. În panelul (a) se prezintă utilizarea electroforezei zonale capilare în analiza unei
proteaze dintr-un adenovirus (Grierson și colab., 1994). Substratul sintetic, peptida
LSGAGFSW este clivată de protează la nivelul legăturii A-G iar cele două peptide produse sunt
uşor de separat una de alta şi astfel de peptida de origine. Diferența de înălțime a peak-urilor
celor două peptide produse prin clivare este dată de prezența restului de triptofan în GFSW. CZE
este de asemenea capabilă de a rezolva forme monomerice şi dimerice de peptide care conţin
cisteină (figura 3.103. b).

Figura 3.103. Separarea unor peptide prin CZE. (a) l, LSGA; 2, GFSW; 3,
LSGAGFSW. (b) Rezoluția unor forme dimerice (l) și monomerice (2) ale
GVQSLKRRRCF. Electroforeza s-a realizat într-un tampon fosfat, 0,2 M,
pH=2,5 la o tensiune de 10kV (după Kemp, 1998) .

Cele mai populare aplicații ale electroforezei capilare sunt separările unor peptide și proteine,
cu toate că, în unele cazuri speciale existenţa unui potenţial ƺ pe suprafaţa capilarului poate
conduce la serioase probleme. Astfel, peptidele cele mai încărcate pozitiv vor fi retardate din
cauza interacţiunilor ionice cu peretele capilar, existând posibilitatea de a se fixa într-o
multitudine de puncte de acesta, cea ce conduce la împrăștierea (lărgirea) zonei și pierderea
rezoluţiei. În cazul polipeptidelor mai mari și a proteinelor interacţiunea globală poate fi mai
puternică și care conduce la pierderea de analit. Această problemă este, evident, mult mai acută,
la pH-uri mai mici şi poate fi atenuată prin efectuarea separărilor la valori cuprinse între 1 și 2
unităţi deasupra punctului izoelectric al analitului în cazul în care analitul posedă aceeaşi sarcină
electrică ca și peretele capilarului. Interacţiile ionice pot fi, de asemenea, reduse prin creşterea
tăriei ionice a electrolitului tampon, dar acest procedeu va conduce la o creştere a conductivității,
care la rândul său, poate produce probleme asociate cu producerea unui exces de căldură şi de
împrăștiere a zonei din cauza scăderii eficienţei procesului de stivuire a analitului.
În contrast cu cromatografia lichidă standard, unde proteinele sunt de obicei, detectate la 280
nm (lungime de undă unde drumul optic al detectorului este, de 1 cm), detecția semnalului într-
un sistem de electroforeză capilară nu este satisfăcătoare la această lungime de undă din cauza
lungimii foarte scurtă a căii de detecţie (25 la 75μm). Deşi absorbţia proteinelor la 200 nm este
de aproximativ 50-la 100 de ori mai mare decât cea observată la 280 nm, pentru multe aplicaţii
în electroforeza capilară, detectarea acestora în regiuni mici ale UV, de asemenea, nu este
adecvată. Alternativ, proteinele pot fi detectate datorită fluorescenţei lor intrinsece datorată
resturilor de triptofan și de tirozină din structura acestora. Totuși, detecția fluorescenţei intrinseci
a proteinelor necesită detectoare cu laser, foarte costisitoare (Wehr și colab., 1999). Astfel,
pentru a creşte sensibilitatea de detecţie a proteinelor în cazul electroforezei capilare, au fost
dezvoltate tehnici de derivatizare pre-şi postcoloană. Derivatizarea precoloană este utilizată pe
scară largă pentru analiza de aminoacizi, folosind o varietate de reactivi, precum
fenilizotiocianatul sau o-ftalaldehida, care reacţionează cu grupările amino ale proteinelor.
Există unele probleme inerente în derivatizarea proteinelor înainte de electroforeză. Spre
deosebire de aminoacizi, care au unul sau două site-uri de reacţie, proteinele pot avea mai multe
site-uri reactive care conduc la o derivatizare multiplă (heterogenă), cu rezultat în obținerea unor
produși cu mobilitati diferite. Acest lucru conduce la împrăștierea peak-ului de proteine.
Producerea de derivați heterogeni poate fi redusă la minimum, într-o oarecare măsură, prin
utilizarea fie a unor condiţii blânde, fie a unor condiții drastice de derivatizare. În prima condiție,
numai site-urile cele mai reactive vor fi derivatize, în timp ce în a doua cale toate site-urile
posibile reactive vor fi marcate (Hafiz, 2005).
În ultimii ani au existat progrese în pregătirea unor capilare acoperite stabile de dioxid de
siliciu, care ecranează sarcina electrică existentă pe suprafaţa lor. Într-o anumită măsură, chimia
proceselor utilizate pentru această mascare a sarcinilor a fost pusă în valoare în procedurile
HPLC unde materialul silicic din care este echipată coloana este în mod curent derivatizat, în
cele mai multe cazuri, cu un strat hidrofob. Acest strat hidrofob joacă un rol fundamental în
cazul unui proces cromatografic prin apariția unor interacțiuni diferenţiate cu moleculele de
analit, dar în cazul CE, separarea poate fi realizată prin exploatarea proprietăţilor intrinseci ale
sarcinii şi masei, în timp ce existența unor astfel de interacţiuni este total contra-productivă Din
acest motiv, sunt de preferat materiale hidrofile de acoperire, şi deşi au fost publicate puţine
date, sunt disponibile în comerţ capilarele preacoperite cu poliacrilamidă sau polivinilalcool
suficient de stabile timp de mai mult de 1000 de utilizări a unui singur capilar.
3.12.4.2. Focalizarea izoelectrică capilară
Focusarea izoelectrică este o tehnică bine-stabilită pentru separarea moleculelor amfotere
precum sunt cele ale proteinelor și care poate fi ușor adaptată la mediul capilar. Tehnica se
bazează pe formarea unui gradient de pH prin utilizarea unor molecule amfotere cunoscute sub
denumirea de amfoliți, compuși, în general caracterizați drept poliamine sntetice alifatice ori
acizi polcarboxilici sau polisulfonici. Aplicarea unui câmp electric la un amestec de amfoliți
conduce la formarea unui gradient de pH după cum amfoliții se așează într-o ordine conform
punctului lor izoelectric. Amfoliții sunt ținuți în mediul suport prin utilizarea unei soluții
catodice cu pH înalt (obișnuit hidroxid de sodiu) și o soluție anodală cu un pH scăzut precum cea
de acid fosforic. După cum proteinele sunt molecule amfotere, ele vor avea un comportament de
manieră identică și vor fi concentrate într-o poziție dictată de punctullor izoelectric. Rezoluția
înaltă asociată cu această metodă este datorată de faptul că o moleculă amfoteră care difuzează
din poziția ei corespunzătoare, în zone cu pH mai mare sau mai mic este readusă la linia de bază
corespunzătoare pH-lui ei izoelectric.
Convențional, focusarea izelectrică este realizată pe medii suport atât de poliacrilamidă cât și
de agaroză, utilizate pentru a contracara excesele de convecție sau difuzie datorate câmpului
electric, procese care cresc timpul de atingere a poziției la pH-ul lor izoelectric a moleculelor
mari. Într-un capilar, un astfel de suport nu este necesar şi prin urmare, timpii de focalizare sunt
mult mai scurți. De asemenea, procesul este mult mai economic deoarece volumul capilarului
este de ordinul nanolitrilor și se utilizează astfel, mult mai puţin amfolit transportor. Totuși
electroosmoza reprezintă o problemă potențială, motiv pentru care ea trebuie să fie eliminată sau
cel puțin controlată. În condiții extreme, procesul de electroendoosmoză poate antrena analiţii
care vor trece prin dreptul detectorului înainte de a fi focalizate. În plus, efectele sale pot fi
imprevizibile după cum sarcina grupărilor silanol de pe suprafață este dependentă de pH,
parametru care variază de-a lungul capilarului în timpul focalizării izoelectrice. EOF se va
manifesta de asemenea, la valori scăzute ale pH-ului tamponului de la anod care intră în capilare
şi acest proces va conduce la perturbarea gradientului de pH. Efectele nefaste ale electroosmozei
pot fi eliminate prin utilizarea unor capilare căptuşite care împiedică în esenţă electroosmoza sau
prin utilizarea de aditivi, precum ar fi metilceluloză, care o va reduce.

Figura 3.104. Mobilizarea anodică după focalizare

izoelectrică. (a) după focalizare amfoliții și proteinele au atins
punctul lor izoelectric și conductivitatea este asigurată de ionii
OH- și H+. (b) Adăugarea de sare la catod conduce la înlocuirea
ionilor OH- cu ioni Cl- în furnizarea de conductivitate și astfel
ionii H+ vor cauza o scădere de pH ceea ce are ca efect migrarea
proteinelor spre anod (După Kemp, 1999).

Cu toate acestea, există un pas suplimentar necesar in tehnica capilară pentru ca proteinele
separate, care nu pot fi detectate “in situ”, trebuie să migreze prin fața fereastrei detectorului.
Această treaptă de mobilizare poate fi realizată în mai multe moduri. Dacă electroosmoza este
suficient de redusă prin adăugarea de metilceluloză, atunci concentrarea (focalizarea) va avea loc
înainte ca fluxul de gradient de pH să se deplaseze prin fereastra detectorului. Figura 3.104.
ilustrează o metodă de mobilizare a probei într-un capilar acoperit cu un film în cazul în care
electroosmoza este mică sau absentă.
Atunci când focalizarea este completă curentul din sistem este scăzut, cu numai ioni hidroxil
la catod şi ioni de hidrogen de la anod care contribuie la conductivitate (figura 3.104.a). În cazul
în care o sare, precum clorura de sodiu se adaugă la catod, apoi ioni de clorură vor predomina și
își vor aduce o contribuţie majoră la conductivitatea, cauzând pH-ului sistemului o alterare
progresivă prin ionii de hidrogen care migrează de la anod (figura 3.104.b). Proteinele
concentrate vor câştiga astfel în sarcină electrică şi vor migra spre anod. Mobilizarea spre
electrodul opus poate fi realizată într-un mod analog prin adăugarea de sare la anod.
 3.12.4.3. Cromatografia electrocinetică capilară micelară
Una dintre limitările evidente ale electroforezei este că, aproape prin definiţie, gama de
molecule care pot fi separate este limitată la acele care pot transporta o sarcină electrică.
Cromatografia electrocinetică capilară micelară este o versiune a electroforezei capilare care
combină fenomenul de curgere electroendoosmotică, cu o formă de cromatografie de partiţie
pentru a extinde gama de molecule care pot fi separate pentru a le include și pe cele care nu
posedă sarcină. După cum s-a arătat mai sus, potenţialul zeta de pe peretele unui capilar
neacoperit combinat cu diametrul mic al acestui capilar, în sine, duce la producerea unui flux
electroendoosmotic semnificativ.
Acest fenomen de curgere electroendoosmotică va avea ca efect în cazul moleculelor
neîncărcate electric o trecere prin capilar, deși în esență toate vor migra cu aceeași viteză.
Cromatografia de partiție în forma ei simplă constă dintr-o fază staţionară şi o fază mobilă în
cazul în care separarea de molecule se bazează pe exploatarea afinităţilor lor diferite pentru una
dintre cele două faze. În cazul cromatografiei electrocinetice capilare micelară echivalentul fazei
staţionare sunt micelele de agent tensioactiv ionic; deşi în cromatografia electrocinetică capilară
micelară acestea nu reprezintă faza staţionară, fiind totuși supuse atât curgerii
electroendoosmotice cât și forțelor electromotoare. Separarea se bazează pe împărţirea/partiția
moleculelor între faza micelară şi tamponul de electrolit, preponderenţa curgerii
electroendoosmotice asigurând că, în cele din urmă, toate moleculele de analit şi micele vor trece
prin fereastra detectorului (figura 3.105.).

Figura 3.105. Cromatografia electrocinetică capilară micelară. Micelele încărcate negativ sunt atrase spre anod,
dar, datorită marii amplitudini a curgerii electroendoosmotice are loc o deplasare înspre capătul catodic al capilarului.
Moleculele încărcate pozitiv sunt retardate prin asocierea cu micelele încărcate negativ,, moleculele neutre posedând o
mobilitate intermediară se partiţionează între fazele micelară şi electrolit în timp ce moleculele încărcate negativ sunt
respinse din micele. (După Kemp, 1999).
Cel mai frecvent agent tensioactiv utilizat este SDS, în parte deoarece utilizarea sa comună în
alte tehnici de laborator înseamnă că este disponibil într-o formă suficient de pură, posedă o
solubilitate bună în apă şi o capacitate crescută de a solubiliza moleculele nepolare. În timp ce
separarea de molecule neutre se bazează pe coeficientul lor de partiţie între micele şi electrolit,
prezenţa unor micele anionice pe bază de SDS va însemna că moleculele cationice se vor asocia
cu faza micelară în timp ce anionii vor fi respinși dar și “măturați” de-a lungul fereastrei
detectorului de curgerea electroendoosmotică. După cum o serie de factori influenţează migraţia
analiţilor, există o serie de modalităţi prin care în care cromatografia electrocinetică capilară
micelară îi poate manipula pentru a realiza separări cu rezoluție crescută. În ceea ce priveşte
considerentele teoretice, gama de separare a tehnicii este delimitată de curgerea
electroendoosmotică care determină t0 şi timpul de migraţie al micelei (tm), care este la rândul lor
sunt în funcţie de sarcina sa electrică. Selectivitatea care se încadrează în această arie este
influenţată de coeficientul de partiţie între micele şi electroliţi, precum şi orice sarcină intrinsecă
a analitului va determina nu numai mobilitatea ei electroforetică, ci de asemenea și gradul de
interacţiune cu micelele ionice.
pH-ul. Efectul pH-ului este complex după cum el influenţează starea de ionizare a analitului
individual, care va fi de asemenea influenţată, de asemenea de potenţialul zeta şi astfel va
determina amploarea fluxului electroendoosmotic. La valori scăzute de pH în cazul în care
ionizarea grupărilor silanol este suprimată, fluxul electroendoosmotic poate fi depăşită de viteza
micelară şi astfel necesită o schimbare în polaritatea electrozilor pentru a se asigura că toate vor
trece prin fereastra detectorului.
Surfactanții. Utilizarea unor agenţi tensioactivi diferiți va influenţa coeficienţii de partiţie şi
astfel vor influenţa separările. Adăugarea unui agent tensioactiv neutru, pentru a forma micele
mixte va avea un efect similar, dar se va modifica, de asemenea, sarcina netă a micelelor,
diminuându-se, prin urmare, tm care va conduce la timpi mai scurți de separare.
Polaritatea electrolitului. Polaritatea electrolitului poate fi modificată prin adăugarea unor
substanţe dizolvate și astfel putându-se modifica coeficienţii de partiţie. Deoarece electrolitul
este prin natura sa un mediu polar, modificările sale implică de obicei o scădere în polaritate prin
adăugarea de solvenţi organici, cum ar fi metanolul sau acetonitrilul.
Cele mai multe dintre aceste efecte sunt dificil de anticipat, deoarece acestea vor determina
modificari la unul sau la mai mulți parametri. Cu toate acestea, uşurinţa de a realiza astfel de
modificări, legate de necesitățile tehnice și de economie va avea ca efect o scurtare a timpului de
separare. Astfel, o simplă optimizare empirică este uşor şi rapid de realizat.
3.12.4.3. Separări chirale
O aplicație a electroforezei capilare care a atras un mare interes implică separarea de
stereoizomeri (enantiomeri). Enantiomerii au proprietăţi chimice identice şi în mod clasic, sunt
separați unul de celălalt printr-o reacţie cu un alt compus chiral pentru a forma diastereoizomeri
cu proprietăţi diferite, care sunt apoi exploatate pentru a se realiza separarea lor. Mai recent, a
fost dezvoltată separarea chirală prin cromatografie lichidă de presiune înaltă (HPLC) în cazul în
care o fază staţionară este derivatizată cu o moleculă chirală iar separarea se realizează ca urmare
a afinităţilor diferite ale enantiomerilor față de faza staţionară (Pirkle și Hyun, 1984).
În electroforeza capilară principiul este similar ca tehnică și depinde de utilizarea unor aditivi,
care, din cauza unei inerente chiralități proprii, au afinităţi diferite pentru izomerii şi prin urmare,
sunt denumiți de obicei, aditivi enantioselectivi. În electroforeza capilară aditivii enantioselectivi
nu sunt staţionari, trecând prin dreptul detectorului sub acțiunea curgerii electroendoosmotice ori
a unei forțe rezultate prin combinarea acesteia cu mobilitatea electroforetică, şi, în din această
cauză separările chirale pot fi considerate ca o formă specială de cromatografie electrocinetică
capilară micelară. Această proprietate și-a găsit o aplicație specială în industria farmaceutică, în
cazul în care se dorește, de exemplu, o evaluare a purităţii optice a unor medicamente pot fi de
importanţă (Soini și alții, 1994; Ward, 1994). Printre agenţii enantioselectivi cei mai frecvent
utilizați sunt ciclodextrinele. Acestea sunt oligozaharide ciclice descoperite cu mai mult de un
secol în urmă, care constau din 6-8 unităţi de D-glucopiranozil legate printr-o legătură α-1,4
glicozidică. Cele trei forme (α, β și δ) au o formă toroidă cu o cavitate hidrofobă care delimitează
printr-o deschidere o zonă hidrofilă datorată prezenței unor grupări hidroxil. În aceste condiții, ce
pot realiza o serie de factori care influenţează separarea. Accesul la cavitatea hidrofobă depinde
de forma moleculei precum şi de polaritatea ei, în timp ce partiţionarea între faza selectivă şi
totalul de analiți este afectată de concentrația ciclodextrinei. Ciclodextrinele pot fi modificate, fie
pentru o creştere a solubilității ori pentru a se modifica sau influenţa selectivitatea sau viteza de
migrare electroforetică. Sărurile biliare ori eterii coroană sunt de asemenea utilizați ca agenţi
enantioselectivi (Kemp, 1999).
3.12.4.4. Gel electroforeza capilară
Electroforeza pe gel ca mediu suport a devenit clasică în analizele biomoleculare pe parcursul
ultimelor cinci decenii. Introducerea poliacrilamidei la mijlocul anilor 1960 a fost urmată de
utilizarea SDS ca detergent. Poliacrilamida poate fi uşor polimerizată pentru a forma un gel cu
proprietăţi mecanice bune şi cu o dimensiune a porilor, care va restricţiona libera circulaţie a
proteinelor, minimizând astfel procesul de difuziune şi crescând rezoluţia de separare. SDS se
leagă în cantități mari de proteine, îmbrăcând cu sarcini negative și nelăsând sarcina intrinsecă a
proteinei să se manifeste. Când este utilizat în combinaţie cu un agent de reducere, precum ar fi
beta mercaptoetanolul sau ditiotreitolul pentru a rupe legăturile disulfurice, toate proteinele au
tendinţa de a adopta probabil o conformație similară extinsă. Consecinţa practică a acestui fapt
este că, în tehnica SDS-PAGE, mobilitatea electroforetică este legată de masa moleculară
oferind astfel, prin urmare, nu numai informaţii cu privire la puritatea soluţiei de proteine, dar de
asemenea, date referitoare la masa moleculară, utile în caracterizarea componentelor individuale.
Dimensiunea mai mare a porilor care poate fi realizată la geluri pe bază de agaroză a adus
avantaje similare la analiza a ADN și ARN.
Un principiu similar poate fi aplicat și în cazul electroforezei capilare pentru a permite
separări bazate pe dimensiunea biomoleculelor. Matricea de sortare poate fi un gel rigid format
prin polimerizarea acrilamidei în prezenţa unui agent de reticulare, precum metilen-
bisacrilamida. Acest gel poate fi realizat în capilar sau poate fi pompat sub o presiune ridicată.
Pregătirea unui astfel de gel într-un capilar nu este o sarcină simplă. Producerea de energie
termică în timpul procesului de polimerizare şi de răcire ulterioară a gelului poate conduce la
contracții sau la formarea de bule de aer. De fapt astfel de capilare încărcate cu gel sunt
disponibile în comerţ.
Dificultăţile în pregătirea unor capilare reproductibile umplute cu gel rigid reticulat au condus
la selecția unor aplicaţii bazate pe prezenţa unui gel nereticulat, în cazul în care porii sunt creați
prin răsucire unor polimeri lungi, liniari. Acești polimeri pot fi reprezentați de dextrani,
metilceluloză sau poliacrilamidă liniară –acrilamidă polimerizată în absenţa unui agent
bifuncționale de reticulare. Ei au avantajul de a fi uşor introduse în capilare sub presiune scăzută
şi pot fi înlocuiți după fiecare utilizare ceea ce prelungește viața capilarului și reduce costurile
acestui procedeu.
Electroforeza capilară s-a dovedit a fi foarte eficientă în separarea ADN, motiv pentru care
aceasta a devinit utilizată pe scară largă, cu toate că electroforeza în gel de agaroză oferă în
continuare o alternativă ieftină, bine-stabilită şi foarte eficientă, cu posibilități de recuperare a
unor cantități utile de ADN purificat, după separare. Separarea de oligonucleotide mici poate fi
realizată atât prin electroforeză capilară zonală cât și prin cromatografie electrocinetică capilară
micelară în timp ce gel-electroforeza capilară realizată fie cu poliacrilamidă liniară fie efectuată
pe agaroză, la temperaturi peste punctul de topire, este metoda optimă în analiza
oligonucleotidelor mai mari ori a ADN. O comparaţie între gel electroforeza capilară şi gel
electroforeză pe agaroză a furnizat dovezi că rezoluţia realizată în gel electroforeza capilară este
egală şi în unele cazuri superioară celei obţinute prin metode convenţionale (Paulus și Husken,
1993). Îmbunătăţirea în continuare a rezoluţiei prin această metodă a condus la includerea de
bromură de etidiu în tamponul de rulare şi astfel s-au raportat separări de fragmente de ADN cu
o lungime egală, dar cu o compoziţie în baze diferită (Guttman și Cooke, 1991).
3.12.4.5. Izotachoforeza capilară
Izotachoforeza, termen care din punct de vedere semantic semnifică o deplasare cu aceeaşi
viteză, este o altă variantă de electroforeză, care este uşor transferabilă pentru mediu capilar.
Deşi sunt disponibile instrumentele specifice pentru o astfel de aplicaţie, ea folosește în general,
capilare cu un diametru mai mare obținute din alte materiale decât silicea topită. Metoda poate fi,
de asemenea, realizată într-un aparat convenţional de electroforeză capilară cu un capilar cu
format uzual.
Viteza (v, cm/s) unui ion într-un câmp electric de putere E (volți/cm) depinde de mobilitatea
ionului (m) - o funcţie complexă şi intrinsecă, care este influenţată de masa moleculară, sarcină,
forma şi gradul de solvatare a speciilor ionice. Acești factori dau naştere ecuaţiei fundamentale a
electroforezei:
v = mE
necesară pentru a înţelege natura izotacoforezei.
 Izotacoforeza diferă de electroforeza convenţională prin absența unui electrolit transportator.
Astfel, moleculele care urmează să fie separate sunt capacitate între un electrolit conducător, cu
un ion de mare mobilitate şi un electrolit final, cu un ion de mobilitate scăzută. Pentru ca metoda
să fie de succes, electrolitul conducător trebuie să aibă ionii cu cea mai mare mobilitate din
sistem, în timp ce electrolitul final, ioni cu cea mai mică mobilitate. În practică, tamponul din
partea de rezervor dinspre detector (figura 3.92) şi capilare sunt umplute cu electrolit conducător,
iar celălalt rezervor este umplut cu electrolit final, în timp ce proba este injectată între cei doi
electroliți.
Atunci când este aplicat un câmp electric, componentele probei incep să se rezolve în zone, în
funcţie de mobilitățile lor. Acei ioni cu cea mai mare mobilitate au și cea mai mare
conductivitate şi astfel, intensitatea câmpului este cea mai scăzută în acea zonă. În schimb, acei
componenți ai probei cu cele mai mici mobilități vor genera câmpul electric cel mai mare și
astfel, viteza lor va fi crescută. La echilibru, componentele din proba care s-au separat în zone
individuale şi care sunt în contact unele cu altele se vor muta (vor migra) cu aceeași viteză (v =
mE, dar cu un m scăzut se generează o E mai mare). Zonele rămân în contact astfel că nu există
nici un electrolit transportator pentru a umple golul dintre ele dar nici nu se amestecă, după cum
orice tendinţă a vreunui ion de a se deplasa în zone învecinate ar însemna că acesta a întâlnit un
câmp electric diferit și ca atare viteza lui va încetini sau va crește având ca rezultat net revenirea
la zona originală, de unde a venit.
O consecinţă a principiului izotacoforezei este faptul că prin această tehnică în condițiile în
care se separă cantităţi mai mari din orice componentă dintr-o probă acestea sunt reflectate
printr-o creştere a lățimii zonei, mai degrabă decât o creștere a înălţimii peak-ului. În plus,
concentraţii mai mici ale oricărui analit tind să genereze tării mai mari ale câmpului în zona
respectivului analit, care, la rândul său tinde să crească viteza de migrare. Cu toate acestea, după
cum s-a mai discutat, analiţii nu pot părăsi din zona în timp ce efectul net al acestui fapt este că
zona se comprimă iar concentraţia de analit este crescută, proces care reprezintă unul dintre
avantajele majore ale acestei metode.
Deşi metoda nu este frecvent utilizată (Altria și Bryant, 1997) iar dezvoltarea metodei este
mult mai complicată şi consumatoare de timp decât electroforeza capilară zonală sau
cromatografia capilară electrocinetică capilară (Kemp, 1998), izotacoforeza capilară prezintă o
serie de avantaje. Astfel, ea este o metodă deosebit de eficientă îmbogăţire în componente aflate
în urme, proces care poate fi utilizat ca și componentă de injecţie a probei pentru a creşte
sensibilitatea procesului de electroforeză capilară zonală. În plus, prin folosirea judicioasă a unor
space-ri - molecule cu o mobilitate intermediară introduse deliberat pentru a separa zonele
analiţilor de interes - izotacoforeza capilară prezintă probabil cea mai bună alegere pentru
aplicațiile micropreparative.
3.12.5. APLICAȚII ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE
Deşi tehnologia de separare prin electroforeză capilară poate fi aplicată în multe domenii de
cercetare, ea și-a câştigat o mare reputaţie în studiul unor molecule care au fost dintotdeauna
dificil de separat. În acest context, gama de opțiuni disponibile prin intermediul electroforezei
capilare zonale și a cromatografiei electrocinetice capilară micelară în special, creează o
metodologie versatilă care este uşor aplicabilă la o gamă largă de diverși analiţi. Astfel, au fost
dezvoltate o multitudine de aplicații ale electroforezei capilare, mai ales în aria biotehnologiilor
şi în special în industria farmaceutică, domenii care au înflorit în ultimii ani.
În general, când se are în vedere separarea unor analiți extrem de polari, electroforeza
capilară ar trebui să fie luată în considerare în primul rând, ea excelând în analiza ionilor atunci
când sunt de dorit, rezultate rapide, devenind astfel predominantă în tehnicile de analiză a
produselor farmaceutice de bază ori a celor chirale. Această tehnologie se face remarcată în
domeniul biotehnologiei, înlocuind electroforeza tradiţională pentru caracterizarea și analiza
unor macromolecule, de tipul proteinelor și carbohidraților, promițând să reprezinte un
instrument valoros în abordarea provocărilor reprezentate de analiza și caracterizarea întregului
proteom. Tehnologia de electroforeză capilară, a servit de asemenea, pentru a accelera
acumularea de cunoştinţe la nivel genomului prin secvenţierea automată a ADN și genotipare.
Abordarea „în soluţie”, element cheie al acestei tehnici, este, de asemenea, ideală pentru crearea
unui mediu în care interacţiunile moleculare pot fi detectate și studiate.
Dintre aplicaţiile valoroase ale electroforezei capilare se numără:
 Analize genetice;
 Analize de produse farmaceutice (care conţin baze azotate);
 Produse farmaceutice care conțin centre chirale (enantiomeri);
 Analize ale unor contra-ioni în dezvoltarea unor noi medicamente;
 Caracterizarea unor proteine și a unor proteine terapeutice;
 Analiza de carbohidrați pentru determinarea modificărilor post-
translaţionale.
3.12.5.1. Analize genetice
De la prima publicare de către Watson şi Crick a structurii dubla elicoidale a ADN în 1953,
electroforeza a reprezentat un standard printre analizele instrumentale utilizate în biochimia
modernă. Capacitatea electroforezei capilare la automatizare şi cuantificare au făcut din aceasta
un succesor natural al electroforezei pe geluri plate în analize genetice. Prin introducerea geluri
fizice înlocuibile (polimeri în soluţie), într-un capilar, este creat o sită moleculară care rezolvă
uşor de molecule de ADN şi ARN în funcție de mărime. Capacitatea de automatizare a acestui
format a permis progrese semnificative în analizele genetice, accelerând descoperirea de noi
informaţii genomice. Actualmente, există sisteme genetice de laborator la care analiza genetică
este complet automatizată, care posedă o serie de capilare „filmate” (căptușite), noi coloranţi de
infraroşu, un gel liniar de poliacrilamidă optimizat (LPA) şi o informatică compresivă total
automatizată de procesare completă a secvenţierii ADN, expresia genelor şi a analize de
fragmente. Existența unor coduri de bare și de transmisie a lichidelor furnizează o automatizare
eficientă de urmărire a probei care generează astfel rezultate foarte reproductibile. Simplitatea de
funcţionare a electroforezei capilare a mutat sarcinile anterior complexe de analiză genetică din
mâinile a câtorva specialiști în domeniul de expertiză a mai multor specialiști și care să permită
oamenilor de ştiinţă să se concentreze asupra problematicii de interes din biologie, mai degrabă
decât cele de tehnologie. Tehnologia electroforezei capilare este acum de rutină pentru analiza
purității oligonucleotidelor și siRNA. Dacă nu sunt pure, oligonucleotidele sintetizate pot
provoca probleme în reacţiile de hibridizare, care astfel asigură calitatea și în acest context
conducând la economii de timp şi de bani. Această caracterizare este deosebit de riguroasă este
esenţială în dezvoltarea unor procese terapeutice bazate pe acizi nucleici.
Pool-urile de ARN mesager (mRNA) sunt utilizate pe scară largă pentru crearea de biblioteci
cADN, dezvoltarea de secvenţe tag exprimate (EST), baze de date şi pentru realizarea unui profil
al exprimării genetice. Pot fi realizate tabloul expresia genetice şi sisteme de detecție în timp real
a unei secvenţei care s-au îmbunătăţit prin mijloacele de studii de expresie genetică. Cu toate
acestea, calitatea mARN este un element important, deoarece aceste molecule sunt foarte
sensibile la degradarea lor naturală de către RNAze. Separarea unor molecule de ARN prin
electroforeză capilară pe gel poate fi efectuată rapid şi în mod automat, permiţând utilizatorului
să evalueze într-un termen scurt calitatea ARN, aparatele moderne cu detecție de fluorescență
induse prin laser fiind ideale pentru efectuarea unui profil rapid, fără supraveghere a până la 96
de probe de ARN pe o sesiune, cu timpi de ciclu de mai puţin de cinci minute per probă.
3.12.5.2. Analize de produse farmaceutice care conţin în structura lor baze azotate
Natura foarte polară a produselor farmaceutice care conţin gruparea amino drept grupare
funcţională de bază face utilizarea cromatografiei destul de complexă. Reactivii care conțin ioni
de asociere şi stricta regenerare a coloanei sunt adesea necesari pentru a reduce interactiunile
nespecifice ionice care apar în cromatografia de fază inversă. În cazul electroforezei capilare,
aceste amine extrem de funcţionale sunt favorizate şi pot fi exploatate pentru a oferi rezoluţie
extraordinară. Forma de funcţionare cea mai uzuală şi simplificată este cea de utilizarre a unor
capilare din siliciu la un pH acid bine definit. În aceste condiţii, suprafaţa capilarului este în
esenţă nereactivă în timp ce grupările amino funcţionale ale unui analit sunt maximal ionizate,
făcând astfel din electroforeza capilară un test simplu și robust pentru analiza unor medicamente
de bază. Sistemele dezvoltate de analiză, cuplată cu o detecţie matricială cu foto diode, sunt
utilizate în această aplicație, fiind eficiente în industria farmaceutică pentru analiza de produse
farmaceutice de bază, profile farmaco-cinetice, determinări de biodisponibilitate, studii ale unor
proteine plasmatice şi de determinare a nivelului de consum a unor medicamente/droguri.
Una dintre provocările în aria descoperirilor de medicamente este în curs de dezvoltare pentru
metodele de analiză farmacocinetică efectuând profile pentru candidați de noi medicamente. În
acest proces este importantă dezvoltarea de metode rapide, metode generice care permit
screening-ul unui număr mare de compuşi izolați probe cu matrici complexe. Electroforeza
capilară este utilizată în mod curent pentru a cuantifica medicamente din plasma sanguină,
precum și din țesutul cerebral, rinichi ori inimă. Randamentul ridicat şi lipsa unor interferenţe cu
matricea probei fac din electroforeza capilară un instrument analitic rapid si simplu pentru
screening-uri farmacocinetice. O aplicație derivată a acesteia este de asemenea utilizată pentru
screening-ul de medicamente cu interes toxicologic, capabilă să combine o semnătura spectrală a
analitului cu mobilitatea sa electroforetică pentru a oferi identificări foarte reproductibile.
3.12.5.3. Analize de enantiomeri (produse farmaceutice cu centrii chirali)
Produsele farmaceutice care posedă atomi de carbon asimetrici și care există ca enantiomeri
constituie o provocare semnificativă. Deoarece acești stereoizomeri sunt din punct de vedere
fizic şi chimic identici, trebuie să se aibă în vedere identificarea și obținerea unor medii chirale
pentru a facilita separarea lor. Unul dintre atributele unei tehnici realizate în soluţie, precum ar fi
electroforeza capilară, este uşurinţa cu care se pot defini condiţiile experimentale. Capilarul
oferă un format ideal pentru crearea unui mediu chiral, pentru ca reactivi chirali din soluţie să fie
uşor de introduși prin aplicarea unei simple presiuni, în acest context, fiind dezvoltate sisteme cu
metodele adecvate acestui proces. Cei mai eficienți reactivi chirali au fost ciclodextrinele înalt
sulfatate. Prin această abordare, separarea amestecurilor racemice conduc de obicei la valori ale
rezoluţiei de cinci sau mai mult. În consecinţă, o rezoluţie bună reprezintă capacitatea de a
detecta impurități enantiomerice rapid, la niveluri cu mult sub 0,1%. Această abordare este
aplicată de un număr mare de companii farmaceutice şi devine rapid metodologia primară pentru
dezvoltarea unor noi metode de testare de enantiomeri noi din compoziția unor preparate
farmaceutice.
3.12.5.4. Analize de ioni
În faza de descoperire și de dezvoltare a unor produse farmaceutice, analizele biologice
dependente de concentraţie, sunt folosite pentru a testa eficacitatea unor compuşi utilizați în
tratamente împotriva unor maladii. În acest context, electroforeza caplară este foarte eficientă în
analiza unor biomolecule cu caracter ionic. Prin natura lor, ionii sunt specii polare extrem de
încărcate electric care se pretează cel mai bine la formatul electroforezei capilare. Analiza de
ioni este una din cele mai de rutină analiză care folosește capilare de silice încărcate cu sisteme
tampon simple care transportă un agent tensioactiv cationic pentru a inversa şi modula fluxul
electroosmotic. Modul primar de detecţie pentru această activitate e reprezentat de absorbţia
indirectă UV, prin care un ion absorbant UV, se adaugă ca un electrolit de background iar
deplasarea acestuia ion de background poate oferi o bază pentru detecție.
3.12.5.5. Caracterizarea unor proteine
Medicamentele pe bază de proteine sunt utilizate pe scară largă în prevenirea şi tratamentul
unor maladii. Printre acestea, anticorpii monoclonali, vaccinurile și proteinele recombinante s-au
dovedit a fi eficace în combaterea diferite tipuri de cancer ori a unor boli imune, ceea ce a
condus la o creştere dramatică a studiilor clinice semnificative asupra efectelor acestora într-o
varietate de aceste boli. Din această cauză, o caracterizare atentă a moleculelor în cauză este
esenţială pentru a asigura o siguranţă şi o eficacitate a acestora. Tehnologia de electroforeză
capilară joacă un rol cheie în procesul de caracterizare astfel transferând punctele sale forte la
determinarea purităţii, eterogenității şi identității unor proteine, înainte de utilizarea lor în
clinică. Pe de altă parte, caracterizarea de proteine implică utilizarea tehnologiei de electroforeză
capilară care s-a dovedit valoroasă în caracterizarea unor macromolecule utilizate atât în scopuri
biologice cât și cele de studiu proteomice. Analiza unor proteine la un nivel proteomic implică
nu numai caracterizarea şi cuantificarea acestora, dar de asemenea, și studiul interacţiunilor unor
proteine cu alte proteine, acizi nucleici ori molecule mici.
3.12.5.6. Analize de greutăți moleculare prin electroforeză pe gel, în prezență de SDS.
Electroforeza capilară a devenit un înlocuitor de succes a electroforezei pe geluri plate, prin
tehnologie manuală, datorită automatizării, cuantificării, vitezei și a înaltei eficiențe. Multe
biomolecule, de tipul proteinelor, glucidelor, acizilor nucleici sunt separate prin electroforeză
folosind o matrice de gel, prin cernere moleculară, utilizând o tehnică denumită anterior
electroforeză capilară în gel (CGE). Pentru polipeptide şi proteine, este necesară o denaturare
prealabilă a probei, în prezenţă de SDS, un detergent anionic, care se leagă proteinele într-un
raport constant proteine:detergent de 1:1,4. Raportul constant masă/sarcină electrică conduce la
separarea proteinelor în funcţie de diferenţele de dimensiune moleculară.
3.12.5.7. Analize de focalizare izoelectrică.
Focalizarea izoelectrică (cIEF) a fost utilizată pe scară largă pentru separarea unor proteine pe
baza diferenţelor date de punctele lor izoelectrice. Metoda de focalizare izoelectrică se realizează
printr-o electroforeză de proteine sau peptide într-un gradient de pH stabil până când acestea
ajung la un pH egal cu punctul lor izoelectric (pI), moment în care sarcina netă şi implicit
mobilitatea devin zero. pI-ul unei proteine necunoscute poate fi interpolată pe o curbă de
calibrare realizată prin migrarea unor standarde de proteine puncte izoelectrice cunoscute. Prin
urmare, în plus faţă de furnizarea unei separări cu rezoluţie mare, aceasta metoda poate fi
folosită în screening-ul pentru o gamă largă de proteine şi peptide (pI=3-10) şi de identificare a
pI.
3.12.5.8. Analize de carbohidraţi.
Analiza de carbohidrați este esenţială pentru a caracteriza pe deplin o glicoproteină, proces
mult timp considerat ca și o sarcină destul de dificilă. Electroforeza capilară a fost efectiv
utilizată pentru a separa în mod eficient şi a cuantifica oligozaharide eliberate din structura unor
glicoproteine. Deoarece cele mai multe glucide, nu posedă grupări funcţionale uşor ionizabile iar
capacitatea de a absorbi sau de a genera fluorescenţă, această procedură necesită de obicei o
reacție de aminare reductivă folosind reactivi cum ar fi 1-aminopiren-3,6,8-trisulfonat (APTS)
pentru a oferi specificitatea, sarcina şi o fluorescenţă puternică oligozaharidelor. APTS a fost
utilizat cu succes pentru derivatizare atât a oligozaharidelor cât și a monozaharidelor conferind
astfel informaţii cantitative crescute, cu o sensibilitate ridicată și cu o mare putere de rezolvare.
3.12.5.9. Cartografierea peptidelor
O tehnică frecvent utilizată pentru identificarea proteinelor o reprezintă separarea
electroforetică de peptide generate prin digestia enzimatică a acestora. Proteine diferite vor
genera peptide diferite după digestie cu enzime proteolitice iar prin separarea acestor peptide
folosind electroforeza produce o "hartă" sau o "amprentă" caracteristică a fiecărei proteine. În
acest scop este frecvent utilizată tripsina (EC 3.4.21.4), o enzimă proteolitică. Electroforeza
capilară este un instrument ideal pentru studierea hărţilor peptidice ale proteinelor, datorită
vitezei, rezoluţiei şi reproductibilității de separare, care poate fi atinse. Această tehnologie poate
fi utilizată atât într-un format independent, fie cu o detecţie UV sau în fluorescenţă, putând fi de
altfel interfațată cu un spectrometru de masă (MS) pentru identificarea completă a mai multultor
proteine.
În industria biotehnologică această tehnică a fost utilizată în domeniul de control al calităţii şi
s-a dovedit utilă în separarea şi analiza unor diferite izoforme glicoproteine. Componenta
oligozaharidică are un efect dramatic asupra structurii şi proprietăţilor glicoproteinei afectând
conformaţia şi care, la rândul său conferă o serie de proprietăţi precum ar fi activitatea,
solubilitatea, antigenitatea și turnover-ul său in vivo. Modificările minore în componenta
glicoproteică sunt dificil de detectat prin tehnici convenţionale şi în acest context electroforeza
capilară s-a dovedit a avea un rol important în asigurarea unor produse terapeutice glicoproteice,
de exemplu, cu o calitate constantă (Kopp și colab., 1996; Chakel și colab., 1997). O aplicație
specifică care au fost raportată esgte utilizarea electroforezei capilare pentru analiza
eritropoietinei din formulele de medicamente (Bietlot și Girard, 1997); metoda dezvoltată
permite separarea eritropoietinei de albumina serică umană care este adăugată drept excipient lae
formulă, permițând astfel separarea unor izoforeme diferite de glicoproteine. Eritropoetina
reglează producţia de eritrocite crescând capacitatea de transport a oxigenului de către sânge.
Din acest motiv ea a fost suspectată de a fi folosită drept medicament pentru îmbunătăţirea
performanţelor de către sportivi, electroforeza capilară fiind utilizată ca metodă de detecție
pentru investigarea utilizării sale ilegale (Choi și colab., 1996). În acest context există multe
rapoarte de utilizare a electroforezei capilare în toxicologia medico-legală (Tagliaro și colab.,
1996), fiind o tehnică versatilă cu o capacitate mare de separare a moleculelor, de la ioni
anorganici la proteine şi fragmente de ADN, fiind complementară tehnicii convenționale
cromatografice, ceea ce face din ea un instrument puternic în acest domeniu (Kemp, 1998).
În plus faţă de utilizarea sa în analiza şi detecția de medicamente/droguri ilicite, versatilitatea
şi simplitatea electroforezei capilare a condus la aplicarea ei în creştere în industria farmaceutică
(Holland și colab., 1997; Altria și colab., 1996). O relevanţă deosebită este abilitatea de a
dezvolta metode care sunt capabile de a rezolva izomeri optici deoarece activitatea biologică a
unui medicament este adesea limitată la un singur izomer, existând posibilitatea ca celălalt
izomer sa aibă efecte nocive. În unele privinţe factorul care limitează metoda este sistemul de
detecție, dezvoltările viitoare în următorii câţiva ani vor fi probabil în acest domeniu (Kemp,
1998). Gama de detectare a acestei tehnici frecvent utilizată în prezent cuprinde absorbţia UV,
fluorescența, metodele electrochimice de detectare şi cele de spectrometrie de masă, extinzându-
se și expandându-de prin aplicarea unor noi tehnici, precum ar fi fluorescența laser indusă şi
luminescența cu transfer de energie prin intermediul ionilor de lantanide (Rieutord și colab.,
1997).
Poate că limitarea majoră în electroforeza capilară este faptul că sunt necesare concentraţii
relativ mari de analit, cu alte cuvinte, există o limită de concentraţie scăzută de detecţie. Acest
lucru este exacerbat în tehnici precum electroforeza zonală capilară unde efectul de stivuire creat
prin injectarea probei la o tărie ionică mult mai mică decât cea a electrolitului este importantă nu
numai pentru rezoluţie, ci și pentru o mai mare sensibilitate. Aceasta înseamnă că nu numai ca
proba să fie în mod normal, diluată pentru a răspunde acestui proces, dar, de asemenea, prezenţa
chiar a unor cantităţi moderate de sare poate conduce la extinderea zonei şi prin urmare să se
compromită sensibilitatea. Din acest motiv îmbunătățirile aduse sistemelor de detecție vor crește
performanțele metodelor existente. După cum dezvoltările tehnologiilor date de cercetările în
domeniul electronic precum și introducerea unor capilare mai performante, alături de
îmbunătăţiri aduse detecției spectrofotometrice, vor conduce la progrese semnificative și la
dezvoltarea unor noi metodologii de analiză.
O altă direcție o reprezintă dezvoltarea electroforezei capilare ca tehnică preparativă, odată cu
creșterea sensibilității altor tehnici precum cele de secvențiere a proteinelor care conduce la
exploatarea puterii incontestabile de rezoluţie, dezvoltându-se tehnici de colectare a unor volume
de ordinul nanolitrilor pe membrane de PVDF de unde secvenţierea proteinelor poate fi efectuată
în mod direct.
În concluzie, datorită gamei de metode care pot fi aplicate pe un singur instrument,
electroforeza capilară reprezintă o metodă extrem de versatilă de separare a moleculelor.
Tehnici, precum electroforeza capilară zonală şi electroforeza capilară pe gel, în cazul în care
câmpul electric furnizează forţa motrice, sunt predictibile în natură şi o cunoaştere a structurilor
moleculelor care urmează să fie separate poate oferi un indicator fiabil al separării care urmează
să fie obținut. Progresele realizate în chimia materialelor de acoperire a capilarului a arătat că o
asemenea contribuţie a forțelor electroosmotice poate fi eliminată sau redusă la minimum. Cu
toate acestea, abilitatea de a crea un flux reproductibil printr-un capilar fără un strat protector
înseamnă că electroforeza capilară, deşi în esenţă o metodă electroforetică, nu se limitează la
separarea de molecule încărcate electric, cromatografia capilară electrocinetică micelară oferind
mijloace de separare pentru o gamă largă de molecule. Costurile de exploatare reduse, timpul
scurt de separare şi cantităţile foarte mici de probă necesare analizei, reprezintă o combinaţie de
calități care conduc la o premiză de exploatare versatilă a tehnicii de electroforeză capilară, care
permite ca dezvoltarea unei metode să fie un proces rapid, care nu necesită în mod normal, mai
mult de 1 sau 2 zile de experimentare.
Bibliografie
Altria, K. D., Bryant, S. M. (1997) Survey into the status of capillary electrophoresis. LC/GC Int. 10:26-30.
Altria, K. D., Elgey, J., Lockwood, P., Moore, D. (1996) An overview of the applications of capillary
electrophoresis to the analysis of pharmaceutical raw materials and excipients. Chromatographia 42:332–342.
Bietlot, H. P., Girard, M. (1997) Analysis of recombinant human erythropoietin in drug formulations by high-
performance capillary electrophoresis. J. Chromatogr. 759:177–184.
Bressolle, F., Audran, M., Pham, T. N., Vallon, J. J. (1996) Cyclodextrins and enantiomeric separations of drugs
by liquid chromatography and capillary electrophoresis: basic principles and new developments. J. Chromatogr. B
Biomed. Appl. 687:303-336.
Bruin, G. J. M., Paulus, A. (1995) Biopolymer separations with capillary electrophoresis. Anal. Methods Instrum.
2:3-26.
Chakel, J. A., Pungor, E., Hancock, W. S., Swedberg, S. A. (1997) Analysis of recombinant DNA-derived
glycoproteins via high-performance capillary electrophoresis coupled with off-line matrix-assisted laser desorption
ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. 689:215–220.
Choi, D., Kim, M., Park. J. (1996) Erythropoietin: physico- and biochemical analysis. J. Chromatogr. 687:189–
199.
González, E., Becerra, A., Laserna, J, J. (1996) Direct determination of diuretic drugs in urine by capillary zone
electrophoresis using fluorescence detection. J Chromatogr B Biomed Appl. 687:145-150.
Grierson, A. W., Nicholson, R., Talbot, P., Webster, A., Kemp, G. (1994) The protease of adenovirus serotype 2
requires cysteine residues for both activation and catalysis. J. Gen. Virol. 75:2761–2764.
Guttman, A., Cooke, N. (1991) Capillary gel affinity electrophoresis of DNA fragments. Anal. Chem. 63:2038-
2042.
Holland, L. A., Chetwyn, N. P., Perkins, M. D., Lunte, S. M. (1997) Capillary electrophoresis in pharmaceutical
analysis. Pharm. Res. 14: 372–387.
Kemp, G. (1998) Capillary electrophoresis: a versatile family of analytical techniques. Biotechnol. Appl. Biochem.
27:9-17.
Kopp, K., Schluter, M., Werner, R. (1996) Monitoring the glycosylation pattern of recombinant interferon-omega
with high-pH anion-exchange chromatography and capillary electrophoresis. Drug Res. 46:1191–1196.
Naylor, S., Benson, L. M., Tomlinson, A. J. (l996) Application of capillary electrophoresis and related techniques
to drug metabolism studies. J. Chromatogr. A. 735:415-438.
Nguyen, N. T., Siegler, R. W. (1996) Capillary electrophoresis of cardiovascular drugs. J. Chromatogr. A.
735:123-150.
Paulus, A., Husken, D. (1993) DNA digest analysis with capillaryelectrophoresis. Electrophoresis 14:27-35.
Paulus, A., Klockow, A. (1996) Detection of carbohydrates in capillary electrophoresis. J. Chromatogr. 720:353-
376.
Pirkle, W. H., Hyun, M. H. (1984). A chiral stationary phase for the facile resolution of amino acids, amino
alcohols and amines as the N-3,5-dinitrobenzoyl derivatives. J. Org. Chem 49:3042–3046.
Rickard, E. C., Strohl, M. M., Nielsen, R. G. (1991) Correlation of electrophoretic mobilities from capillary
electrophoresis with physicochemical properties of proteins and peptides. Anal. Biochem. 197:197-207.
Riekkola, M. L., Jumppanen, J. H. (1996) Capillary electrophoresis of diuretics. J. Chromatogr. A 735:151-164.
 Rieutord, A., Prognon, P., Brion, F., Mahuzier, G. (1997) Liquid chromatographic determination using lanthanides
as time-resolved luminescence probes for drugs and xenobiotics: advantages and limitations. Analyst 122:59R-66R.
Righetti, P. G., Gelfi, C. (1997) Recent advances in capillary electrophoresis of DNA fragments and PCR products
in poly(n-substituted acrylamides). Anal. Biochem. 244:195-207.
Soini, H., Stefansson, M., Riekkola, M. L., Novotny, M. V. (1994) Maltooligosaccharides as chiral selectors for
the separation of pharmaceuticals by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 66:3477–3484.
Tagliaro, F., Manetto, G., Crivellente, F., Smith, F. P. (1998) A brief introduction to capillary electrophoresis.
Forensic Sci. Intl. 92:75–88.
Tagliaro, F., Turrina, S., Smith, F. P. (1996) Capillary electrophoresis: principles and applications in illicit drug
analysis. Forensic Sci. Int. 77:211–229.
The Swiss Laboratory for Doping Analyses (LAD) http://www.doping.chuv.ch/en/lad_home/lad-prestations-
laboratoire/lad-prestations-laboratoire-appareils/lad-prestations-laboratoire-appareils-ec.htm
Ward, T. J. (1994) Chiral media for capillary electrophoresis. Anal. Chem. 66:632–640.
Weber, P. L., Lundte, S. M. (1996) Capillary electrophoresis with pulsed amperometric detection of carbohydrates
and glycopeptides. Electrophoresis 17:302-309.
Wehr, T., Rodriguez-Diaz, R., Zhu, M. În Capillary Electrophoresis of Proteins, Mercel Dekker, Inc., NY. 1999.
Weinberger, R. Practical capillary electrophoresis, Academic Press, San Diego, U.S.A., 1993.
Wijnen, P. A. H. M., Van Diejenvisser, M. P. (1996) Capillary Electrophoresis of Serum Proteins Reproducibility,
Comparison with Agarose Gel Electrophoresis and a Review of the Literature. Eur. j. Clin. Chem. Clin. Biochem.
7:535-545.
 3.13. ELECTROFOREZA DE AFINITATE
Electroforeza de afinitate, în sens larg, include toate metodele utilizate în biochimie și
biotehnologie în care un anumit tip de interacțiune specifică are loc între un component din
proba supusă electroforezei și un alt component prezent în constituția mediului suport, denumit
ligand specific. Cu ceste metode, unele înrudite cu imunoelectroforeza, altele, cu cromatografia
de afinitate, se detectează componentele dintr-o probă care prezintă afinitate pentru un ligand, se
determină omogenitatea sau heterogenitatea legării componentului/componentelor de ligand,
modificările induse de diverse tratamente și uneori cantitatea de component/componente care
leagă specific ligandul, sau se elfectuează studii cantitative privind formarea complexelor
component-ligand (în speță, proteină-ligand).
Ligandul poate fi liber sau impobilizat în mediul suport. Dacă masa sa moleculară este foarte
mică în raport cu masa moleculară a proteinelor țintă, modificările electroforetice vor fi relativ
mici sau char neglijabile, în special dacă și sarcina ligandului este mică sau zero (de exemplu
substratele cu masă moleculară mică și inhibitorii enzimatici). Efectele asupra mobilității
electroforetice vor fi mai evidente dacă ligandul și proteinele țintă sunt cu mase moleculare
relativ apropiate, sau dacă ligandul are fie o sarcină electrică mare, fie o structură ramificată,
care să perimtă interacțiunea simultană cu mai multe molecule țintă de proteine. În aceste cazuri
interacțiunea se va concretiza printr-o scădere sau creștere semnificativă a mobilității
electrroforetice a proteinelor sau prin apariția unui precipitat.
Toate aceste posibilități stau la baza diferitelor metode aparținând de electroforeza de
afinitate. Cele mai cunoscute metode sunt :
 Imunoelectroforeza încrucișată;
 Imunoelectroforeza tip rachetă;
 Imunoelectroforeza zonală;
 Electroforeza încrucișată;
 Imunoafinoelectroforeza încrucișată;
 Afinoelectroforeza bidimensională;
 Afinoforeza;
 Electroforeza de afinitate propriu-zisă (care este asemănătoare ca principiu
cromatografiei de afinitate).
Imunoelectroforeza încrucișată. Tehnica a fost pusă la punct de către Bog-Hansen, în
perioada 1973-1980 și este utilizată la separarea, identificarea și caracterizarea glicoproteinelor
cu ajutorul lectinelor și a anticorpilor specifici.
Metoda are aplicabilitate în cercetare (de exemplu la studiul interacțiilor anticorpilor
monoclonali) ori în clinică (în laboratorul de diagnostic al maladiilor în care sunt implicate
glicoproteine anormale).
Afinoelectroforeza bidimensională. Tahnica are la bază acelați principiu ca și
imunoelectroforeza încrucișată, dar spre deosebire de aceasta anticorpii specifici se găsesc într-o
membrană de nitroceluloză. Metoda se caracterizează printr-o rezoluție foarte bună și este o
metodă de perspectivă.
Afinoforeza. A fost pusă la punct de către Shimura și Kasai (1982-1987). Tehnica are la bază
interacțiunea dintre un ligand macromelecular solubil cu sarcină electrică mare (afinofor) și o
proteină. Complexul proteină-afinofor se remarcă printr-o mobilitate electroforetică substanțial
mai mare decât al proteinei libere.
Electroforeza de afinitate propriu-zisă. Este analogă cromatografiei de afinitate. În această
tehnică, ligandul este imobilizat într-un gel astfel că proteina țintă, în cursul electroforezei, este
împiedicată și astfel întârziată datorită interacțiunii specifice.
Se poate remarca faptul că nu există o delimitare netă între variantele asemănătoare
imunoelectroforezei și variantele asemănătoare cromatografiei de afinitate, deoarece
imobilizarea ligandului, în cazul variantelor cromatografice nu este necesar să fie completă, mai
ales pentru liganzii mari.
3.13.1. IMOBILIZAREA LIGANZILOR ÎN GEL
Sistemul electroforetic prezintă proprietăți specifice, de exemplu separarea se efectuează într-
un gel care nu permite folosirea procedeelor de cuplare covalentă a ligandului, aplicate în
cromatografia de afinitatedin această cauză se preferă proceduri de cuplare și medii suport care
nu dau naștere la fluxuri electroosmotice mari și care nu afectează evidențierea fracțiilor proteice
separate. Pe de altă parte, concentrația liganzilor în gel este mică, dar mai mare decât cea a
proteinelor țintă cu care interacționează specific.
Imobilizarea oricărui ligand într-un gel de afinitate printr-o metodă care implică un
macroligand necesită existența unei abilități de a cupla ligandul printr-o tehnică adecvată de
transportatorul solubil, macromolecular. Aceasta se poate face în mai multe moduri. Pentru
imobilizare, există patru tipuri de proceduri:

Figura 3.106. Reprezentarea schematică a tehnicilor utilizate pentru imobilizarea liganzilor în geluri de
poliacrilamidă. (1) metoda cu macroligand: se polimerizează o soluţie de acrilamidă şi un agent de reticulare care
conţine macroligand (structura polimerizată poartă reziduurile de ligand, L. Macroligandul este sechestrat în matricea
de gel (dreapta). (2) incorporarea unor perle cu ligand substituirt în gel. Astel, se suspendă perlele de gel de agaroză
care conține ligand substituit în soluţia de polimerizare. Amestecul este turnat în tuburi de sticlă echipate cu un strat de
gel de agaroză (a) care la capătul inferior (b) se sprijină pe o rețea de nylon (c). În continuare tubul este centrifugat un
timp scurt, astfel încât să sedimenteze un strat dens de perle cu ligand atașat, formându-se astfel un gel polimerizat
(d). Tubul este în continuare inserat, stratul de agaroza se elimină cu un jet de apă, gelul de afinitate fiind gata pentru
electroforeză. (3) copolimerizarea directă în gelul de poliacrilamidă a derivaților copolimerizabili ai ligandului. După
copolimerizare, matricea de gel conţine molecule de ligand încorporate, cu toate că o parte din derivat al ligandulului
poate să rămână nepolimerizat. (După Horejsi, 1986).
(1) Încorporarea (imobilizarea) derivaților macromoleculari solubili ai ligandului
(macroliganzi). Dacă o macromoleculă (macroligand) se va adăuga unei soluții de monomeri
care prin polimerizare va forma un gel de poliacrilamidă, această macromoleculă va fi prinsă în
rețeaua de gel, fiind astfel imobilizată. Eficiența imobilizării este în funcție de raporturile dintre
dimensiunile macromoleculei de ligand și dimensiunile porilor de gel. Dacă o macromolecula
suficient de mare este adăugată la soluţia de monomeri utilizată în mod normal pentru prepararea
unui gel de poliacrilamidă, după reacţia de copolimerizare și formarea gelului, macromolecula
este sechestrată şi astfel, imobilizată într-un mod eficient (figura 3.106.). În multe cazuri, există
macroliganzi naturali, precum de exemplu polizaharidele care, având diverse structuri,
interacţionează cu lectinele sau cu unele enzime. Apoi, polizaharidele sau alte glucide complexe
macromoleculare pot fi, pur şi simplu încorporate în concentraţie adecvată într-un gel de
poliacrilamidă, şi în aceste condiții, gel de afinitate este gata de utilizare.
Această abordare a fost luată în primele studii care utilizează tehnica de electroforeză
afinitate pentru a identifica şi pentru a investiga fosforilazele şi alte enzime reactive la
polizaharide (Siepman şi Stegemann, 1967; Siepman şi Stegemann, 1967; Gerbrandy şi
Doorgeest, 1972; Takeo şi Nakamura, 1972) precum şi în mai multe studii care se ocupă de
carbohidrați specifici imunoglobulinelor (Takeo şi Kabat, 1978; Sugii şi colab., 1979; Sugii şi
Kabat, 1980; Sharon şi colab., 1982) sau de lectine şi derivatele acestora (Etzler şi Borrebaeck,
1980; Borrebaeck şi Etzler, 1980; Etzler şi colab., 1981; Borrebaeck şi colab., 1981; Lönnerdal
şi colab., 1983) (a se vedea, de asemenea, tabelul 3.14). Tehnica necesită cuplarea ligandului de
un purtător solubil. Drept moleculă purtătoare se poate utiliza dextranul pe care se cuplează
polietilenglicol (este cazul unui ligand linear) sau copolimeri sintetici (produși prin
copolimerizarea acrilamidei cu un derivat al ligandului care posedă grupări alil sau acril). Deși
metoda este simplă, este dificil să se obțină derivați copolimerizabili ai ligandului.
Tabelul 3.14. Diferite sisteme biologice studiate prin electroforeză de afinitate* (după Horejsi, 1986).
Componentul electroforezat Ligand imobilizat Ligand liber (solubil)
Amilaze, fosforilaze Amidon, glicogen Oligozaharide
Dehidrogenaze, kinase, albumină serică Cibacron Blue
Dehidrogenaze 2'-AMP
Lactat dehidrogenază 5'-AMP Nucleotide
Tripsină p-Aminobenzamidină
Colinesterază Procaină, derivați terțiari de
amine
Ribonuclează UDP
Imunoglobuline Dextrani Oligozaharide
Fructani Oligozaharide
Groupări DNP, TNP
D-Gal-NAc D-GalNAc
α-D-Galactozidază D-Gal
Galactozo oxidază D-Gal Zaharuri
Lectine Substanțe ale grupurilor de Zaharuri
sânge
Glycoproteins
Polizaharide Zaharuri
Diverse zaharide Zaharuri
Insulină Zaharuri
Glicoproteine Lectine
Albumină Anticorpi
Diverse protein și enzyme Grupări hidrofobe
DNA Coloranți
Agaroză
În primul rând, o substanţă naturală macromoleculară, cum ar fi dextranul, poate fi
derivatizată cu un ligand (Cerovsky şi colab., 1980; Ticha şi colab., 1978; Nakamura şi colab.,
1979), precum polietilenglicolii liniari (Muller şi colab., 1981). Cuplarea unui ligand la o astfel
de macromolecula poate fi complicată de o serie de reacţii secundare care conduc la reticulare şi,
astfel, la produse insolubile. În mod alternativ, pot fi preparaţi copolimerii sintetici care posedă
grupări reactive potrivite şi ulterior, derivatizabile cu un ligand (Cerovsky şi colab., 1980; Ticha
şi colab., 1980). O alta posibilitate de cuplare este cea de a realiza macroligandul prin
copolimerizarea acrilamidei sau a unor monomeri similari cu un derivat copolimerizabil adecvat
al ligandului. În acest sens sunt utili derivații de liganzi care posedă grupări alil, alchenil
(Horejsi şi colab.,1978; Horejsi şi colab., 1977; Nakamura şi colab., 1980a; Nakamura şi colab.,
1980b; Ek şi colab., 1980) ori acrilil (Chen și Morawetz, 1981; Masson şi colab., 1982; Masson
și Vallin, 1983).
Copolimerizarea monomerului şi a derivatului de ligand într-o soluţie apoasă, în absenţa
agentului de reticulare se realizează într-un singur pas și conduce la o soluţie de copolimer
solubil care conţine ligandul legat covalent. Concentraţia de ligand pot fi reglată prin
concentrația de derivat monomeric în amestecul de reacţie iar lungimea catenei de copolimer
prin concentraţia iniţiatorului de polimerizare. După reacţia de copolimerizare, monomerii care
nu au reacţionat sau oligomerii cu masă moleculară mică sunt eliminați prin dializă; copolimerul
(macroligandul) putând fi liofilizat şi stocat pentru o utilizare ulterioară. Metoda este simplă şi
convenabilă, dar pregătirea unui derivat adecvat al ligandului polimerizabil nu este întotdeauna
ușoară (cu toate că, de exemplu, în cazul de alil α-glicozizilor este foarte simplă). Această
metodă a fost utilizată la prepararea gelurilor de afinitate geluri care conţin zaharuri (Horejsi şi
colab., 1978; Horejsi şi colab., 1977; Ek şi colab., 1980), liganzi hidrofobi (Chen și Morawetz,
1981), derivaţi de nucleotide (Nakamura şi colab., 1980a; Nakamura şi colab., 1980b), derivaţi
terţiari de amine (Masson şi colab., 1982; Masson și Vallin, 1983) sau coloranţi reactivi cu
secvenţe de nucleotide specifice (Muller, şi colab., 1981).
(2) Încorporarea ligandului cuplat pe particule sferice insolubile. În acest caz se
imobilizează în gel particule mult mai mari, purtătoare de liganzi (de exemplu, particule sferice
de agaroză pe care s-a cuplat un anumit tip de ligand. Trebuie avut însă în vedere ca particulele
(a) să nu afecteze formarea gelului de poliacrilamidă; (b) să nu interfere cu colorantul utilizat la
evidențiere; (c) să nu mărească procesul de electroosmoză.
În locul transportatorilor solubili de ligand macromolecular, pot fi încorporate în matricea de
gel particule mai mari şi anume perle de gel care transportă resturi de ligand. În esenţă, aceleaşi
tipuri de particule (perle) gel care conțin ligand substituiţi, care pot fi utilizate și în
cromatografia de afinitate în condițiile în care aceste particule nu inhibă formarea produșilor de
incluziune în matrice de gel de poliacrilamidă şi că acestea nu interferă puternic în etapele
ulterioare, de exemplu, din cauza unei electroendoosmoză mare sau în colorarea
postelectroforetică a componentelor separate. Un avantaj al acestei tehnici este că numeroasele
metode simple şi rapide existente pentru legarea ligandului la perlele de gel pot fi folosite. Cu
toate acestea, unele procedee, de exemplu cel de activare cu bromură de cianprin care se pot
obţine derivați are o utilizare limitată din cauza proceselor de electroendoosmoză ridicate și a
unei reacții puternice de colorare cu a proteinelor comun separate. Studiile arată că perlele de gel
din agaroză sau dextran activate prin oxidare cu periodat şi, ulterior, cuplate cu ligand amino
printr-o reacție de aminare reductivă sunt cele mai potrivite (Horejsi şi colab., 1982; Turkova şi
colab., 1983). De asemenea, este necesar a se preveni sedimentarea neuniformă a perlelor de gel
în soluţia de polimerizare înainte de formarea matricei de gel. Acest lucru poate fi realizat printr-
o procedură simplă (Horejsi şi colab., 1982) care conduce la formarea rapidă a unei strat de gel
cu densitate de perle de gel uniformă (figura 3.106). Avantajul tehnicii este dat de simplicitatea
metodei și de rapiditatea cu care se pot cupla diferiți liganzi de particulele sferice de agaroză.
(3) Încorporarea derivaților „fuzibili” ai ligandului reprezintă o variantă care combină
primele două tehnici prezentate anterior. În acest caz purtătorul solubil macromolecular a
ligandului este agaroza, un polizaharid solubil la temperaturi ridicate. Aceasta se topește pe baia
de apă iar soluția de macroligand rezultată se adaugă în concentrația dorită. Un mare avantaj al
agarozei îl reprezintă disponibilitatea comercială a perlelor de gel care pot fi cuplate cu uşurinţă
cu un ligand (purificarea macroligandului este în acest caz, realizată printr-o simplă spălare a
perlelor de gel derivatizate), după care se solubilizează prin încălzire pe o apă de apă şi
amestecate la o concentraţie corespunzătoare cu o soluţie preîncăzită de agaroză nederivatizată.
După turnarea soluţiei în tuburi (sau în casete plate), după răcire, se formează gelul de afinitate.
În cazul gelurilor de poliacrilamidă, încorporarea derivaților fuzibili se realizează în
conformitate cu cerințele de preparare a gelurilor mixte (compozite). Metoda conduce la
obținerea unor geluri de agaroză afine în care macroligandul este imobilizat eficient, aparent prin
încorporarea catenelor de agaroză cu ligand substituit în rețelele lanţurilor de agaroză
nesubstituite. Se poate remarca faptul că încorporarea altor macroliganzi (precum dextranii,
macromolecule sintetice) în gelul de agaroză cu afinitate este de aşteptat să fie dificilă din cauza
porozității mari a acestor geluri (Johnson și colab., 1980). Totuși, pregătirea gelurilor afine de
agaroză în acest mod este extrem de simplă. Cu toate acestea, trebuie amintit că în multe reacţii
prin care se modifică structura agarozei se poate obține un produs reticulat, care nu poate fi fi
lichefiat la o încălzire suplimentară. Acest fenomen este valabil mai ales pentru gelurile activate
cu bromcian. O metodă convenabilă de preparare a perlelor de agaroză derivatizate care se
lichefiază în condiții optime este activarea lor prin oxidare cu periodat urmată de cuplarea prin
aminare reductivă la un ligand amino (Horejsi și colab., 1982), care conduce la derivați care se
topesc complet la încălzire. Metoda se bazează pe oxidare grupărilor hidroxi vicinale ale
agarozei cu metaperiodat de sodiu care generează grupări aldehidice funcționale (figura 3.107).
În mod similar, derivaţi care se lichefiază complet la încălzire pot fi preparați prin cuplarea
coloranţi unor reactivi triazinici direct cu perlele de gel de agaroză nederivatizate (Johnson și
colab., 1980).
Pentru imobilizarea liganzilor în geluri de poliacrilamidă pot fi utilizați, de asemenea, derivați
lichefiabili de agaroză (Horejsi și colab., 1980). În acest caz, soluţia caldă de agaroză substitutită
cu ligand se adaugă la o soluţie de monomeri preîncălziți de acrilamidă-bisacrilamidă care în
mod normal este utilizată la prepararea gelurilor de poliacrilamidă, iar gelurile sunt lăsate să
polimerizeze la o temperatură relativ ridicată şi apoi sunt răcite. În această tehnică, care este de
fapt tehnica frecvent utilizată la prepararea geluri compozite de acrilamidă-agaroză, trebuie
utilizate concentraţii mai mici de catalizator al reacției de polimerizare (din cauza temperaturii
ridicate utilizate) iar aceste geluri trebuie să fie corespunzător termostatate în timpul periadei de
polimerizare. Cum unii liganzi pot inhiba polimerizarea şi astfel pot contracara efectul datorat
temperaturii ridicate, concentraţia optimă a catalizator utilizată în reacția de polimerizare se
determină empiric în fiecare caz aparte (Horejsi, 1986).

Figura 3.107. Metoda de activare

și derivatizare a agarozei prin oxidare
cu metaperiodat de sodiu. (După
Schalkhammer, 2002).,

(4) Încorporarea directă a derivaților liganului în gelul de poliacrilamidă. Derivatul

polimerizabil al ligandului este adăugat în concentrația dorită direct în soluția de monomeri
(acrilamidă-bisacrilamidă), gelurile pentru electroforeza fiind pregătite în mod obişnuit (figura
3.106.c). În acest caz imobilizarea este covalentă iar distribuția ligandului în gel este aleatoare
dar mult mai uniformă decât în celelalte cazuri. În figura 3.107 se prezintă schematic cele patru
tehnici descrise mai sus. Această metodă a fost testată doar cu alil-glicozide ca derivați
polimerizabili de ligand (Horejsi și Kocourek, 1974; Horejsi și Kocourek, 1973), şi în acest caz
existat o problemă serioasă în sensul că reacția de copolimerizare a acestor alil-derivaţi ai
monomerului de acrilamidă a fost incompletă; cantităţi mari de alil-glicozid nepolimerizat
rămâne în gel şi trebuie să fie eliminate prin spălare. Din acest motiv, metoda a fost abandonată
după introducerea macroliganzilor sintetici.
3.13.2. CONDIȚII DE ELECTROFOREZĂ
Condiţiile utilizate pentru electroforeza de afinitate sunt în principiu aceleaşi ca şi cele
folosite în metodele uzuale de electroforeză. Cantitatea de ligand imobilizat în gel este de obicei
scazută, astfel că în majoritatea cazurilor acesta nu afectează semnificativ proprietăţile gelului.
Cu toate acestea, trebuie subliniat faptul că este necesară existența unui gel de control (fără
interacții), care este rulat în paralel cu gelurile de afinitate. Este de dorit să se folosească geluri
de control care conţin aceeaşi cantitate de macroligand imobilizat (adică o moleculă foarte
asemănătoare cu ligandul imobilizat în gelurile de afinitate, dar fără nici o afinitate pentru
proteine), ca gel de afinitate comparabil. Acest lucru se realizează în scopul de a elimina efectele
ligandului imobilizat sau ale transportatorui de ligand asupra proprietăţilor generale ale gelului,
cum ar fi porozitatea, electroendoosmoza, etc. Unii liganzi pot, de exemplu, să inhibe într-o
oarecare măsură polimerizarea poliacrilamidei şi astfel, proprietăţile gelului pot fi schimbate.
Aceste efecte nespecifice ale geluri afinitate trebuie să fie verificate în avans.
Există o serie de aspecte care ar trebui luate în considerare. În primul rând, trebuie evitate
tampoanele sau celelalte componente ale sistemului electroforetic care ar putea interfera în
interacţiunea proteină - ligand (de exemplu, uree concentrată, dodecil sulfatul de sodiu, etc); de
obicei, tamponul borat nu poate fi utilizat în cazul în care se studiază o interacţiune cu
carbohidrați imobilizați; în mod similar zaharoza trebuie omisă din soluţia de probă, iar în unele
situații se renunță la gelul de concentrare (Horejsi, 1986).
În al doilea rând, unele tipuri de geluri de afinitate pot fi puternic colorate prin tehnicile
curente de colorare a proteinelor comune. În acest caz se apelează la metode alternative de
localizare a componentelor separate precum autoradiografia, colorarea specifică a unor enzime
sau proceduri de transfer pe membrană.
Electroforeza de afinitate se poate efectua pe geluri cilindrice sau pe geluri plate.
Aranjamentul cu gel plat este util dacă se au în vedere separarea mai multor probe și compararea
lor pe un singur gel. În cazul în care un proba trebuie să fie testată pe geluri cu afinități diferite
(care diferă în natura şi/sau concentraţia de liganzii), sunt recomandate geluri cilindrice. Gelurile
cilindrice sunt, de asemenea, mai economice, lucru care poate fi important în cazul liganzilor
scumpi.
Porozitatea gelului de afinitate nu pare a fi foarte importantă, cel puţin în cazul în care
tehnica este folosită în scopuri simple, calitative. În studii ale interacţiunilor proteină - ligand
cantitative, atunci când efectele nedorite nespecifice ale matricei de gel trebuie să fie reduse la
minimum, sunt de preferat gelurile cu porozitate mare. În alte cazuri, porozitatea gelului trebuie
să fie optimizată în scopul rezolvării diverselor componente ale probei. Este interesant faptul că
tăria aparentă a interacțiunii proteină - ligand poate creşte odată cu creșterea concentraţiei de gel
(Masson și Marnot, 1985). Pot fi utilizate atât sisteme de tampon continue cât și discontinue,
primele fiind de preferat, în studii cantitative ale interacţiei proteine - ligand. Sistemele
discontinue de tampon la care concentraţia zonelor de proteine apare la începutul separării,
conduc la o rezoluţie clară a zonelor benzilor de proteine înguste.
Principiul electroforezei afinitate poate fi folosit, de asemenea, în combinaţie cu focalizarea
izoelectrica (IEF) (Horejsi și Ticha, 1981). Oricare dintre metodele de imobilizare a ligandului
prezentate anterior pot fi utilizate, ținându-se cont de faptul că sistemul de focalizare izoeletrică
este mult mai sensibil la procesul de electroendoosmoză crescut din gelurile de afinitate. Prin
urmare, trebuie să fie evitate concentraţie ridicate de molecule încărcate electric imobilizate. IEF
are o foarte mare putere de rezoluţie, care poate fi uşor modificată prin gama de pH utilizată.
Aceasta poate fi utilă în special dacă componentele amestecurilor complexe care se leagă de
ligand se doresc identificate.
3.13.3. APLICAȚII CALITATIVE ŞI CANTITATIVE ALE
ELECTROFOREZEI DE AFINITATE
Electroforeza de afinitate ca tehnică derivată a cromatografiei de afinitate poate fi folosită, în
principal pentru detectarea şi identificarea componentelor care se leagă la ligand prezente într-o
probă. În acest scop, se compară modelul obţinut pe un gel de control adecvat (fără interacţie) și
un gel specific, cu afinitate; interacţiunea specifică se manifestă prin întârzierea componentei
care se leagă la ligand pe gelul de afinitate, în comparaţie cu gelul de control. Această tehnică
este utilă în diverse experimente. Pe scurt, electroforeza de afinitate poate fi utilizată:
  pentru a demonstra prezenţa şi numărul de componente care se leagă la ligant dintr-un
amestec complex (Siepman și Stegemann, 1967a; Siepman și Stegemann, 1967b; Gerbrandy și
Doorgeest, 1972; Sharon și colab., 1982; Ticha și colab., 1978; Masson şi Privat de Garilhe,
1982; Masson şi Vallin, 1983; Masson şi Marnot, 1985); o metodă foarte eficientă poate fi
electroforeza bidimensională de afinitate, în care proba de analiyat este mai întâi separată prin
focalizare izoelectrică şi apoi gelul din prima dimensiune este folosit ca probă pentru a doua
dimensiune, de electroforeză de afinitate pe un gel placă vertical;
 pentru a verifica omogenitatea de legare a unui preparat purificat şi pentru a detecta
amestecuri inactive (Horejsi și Ticha, 1981; Horejsi și colab., 1977).
 pentru verificarea evoluției și rezultatele unei reacţii care ar putea afecta site-ul de
legare a ligandului (Etzler, și colab., 1981; Borrebaeck și colab., 1981; Horejsi și colab., 1977;
Horejsi, 1979; Masson și colab., 1984; Nováková și colab., 1981);
 pentru evaluarea efectelor unor factori diverși, precum pH-ul (Hauzer și colab., 1979),
puterea ionică (Turkova și colab., 1980), temperatura, efectul unor detergenţi (Pechova și colab.,
1982) sau a lungimii spacer-ului ligandului (Cerovsky și colab., 1980; Ticha și colab., 1980) cu
privire la activitatea de legare a ligandului la proteine;
 pentru pre-testarea unor materiale destinate utilizării lor în continuare, în
cromatografiea de afinitate preparativă (Bog-Hansen, 1973).
În unele dintre aceste aplicaţii, este posibilă cel puţin o evaluare semicantitativă a
rezultatelor, iar prin aceasta se poate demonstra în mod clar care dintre componente
interacţionează mai puternic sau în care condiţii interacţiunea proteină-ligand este mai puternică
ori mai slabă în comparaţie cu condiţiile standard. Pentru evaluarea cantitativă a tăriei interacției
proteine-ligand imobilizat în termen de constante de disociere, au fost introduse o serie de relaţii
simple (Gerbrandy și Doorgeest, 1972; Takeo și Nakamura, 1972; Horejsi și colab., 1977).
Astfel, ecuaţia de bază folosită în acest sens poate fi scrisă ca:

sau într-o formă echivalentă:

unde d şi d0 sunt mobilităţile benzii proteice pe un gel de afinitate, respectiv de control, Ki

este constanta de disociere a complexului proteină-ligand imobilizat iar ci este concentraţia de
ligand imobilizat. Astfel, Ki se obţine ca pantă d/(d0-d) faţă de 1/ci, sau ca intercepție 1/(d0-d),
faţă de 1/ci (figura 3.108).

Figura 3.108. Aplicaţii cantitative ale electroforezei de afinitate. (a) reprezentarea schematică a unei serii de
geluri de afinitate pentru evaluarea constantelor de disociere. 1=gelul de control; 2-4- geluri de afinitate care conţin
concentraţii crescătoare de ligand imobilizat (ci);. R = o substanţă de referinţă de mare mobilitate care nu
interacționează cu gelul de afinitate și care serveşte ca un standard a mobilităţii interne la care se normalizează
mobilităţile d0 şi d ale proteinei care interacționează cu ligandul (P) pentru a elimina o uşoara variaţie care apare în
geluri individuale. (b) estimarea grafică Ki în conformitate cu ecuația 1.
Limitările practice majore sau tehnice ale acestei metode sunt:
 necesitatea de a imobiliza ligandul în gel;
 necesitatea de a alege un sistem tampon adecvat în care mobilitatea componentei care
urmează să fie studiată este suficient de mare, astfel încât diferenţa între gelul-control şi gelul de
afinitate să fie în mod clar perceptibilă (prin urmare, nu este posibil să se lucreze prea aproape de
valoarea pI; utilizarea IEF de afinitate ar putea fi, uneori, cea mai simplă soluţie, dacă este
suficiente informaţii calitative);
 interpretarea exactă a valorilor constantelor de disociere obţinute prin această metodă
poate fi uneori complicată. Cu toate acestea, valorile Ki pot fi cu siguranţă utilizate în scopuri
cantitative comparative.
3.13.4. ELECTROFOREZA DE AFINITATE CU METAL IMOBILIZAT
Cromatografia de afinitate pe coloană, cu metal imobilizat (IMAC) este una dintre cele mai
populare metode folosite la extragea fosfoproteinelor sau fosfopeptidelor (Anderson și Porath,
1986; Witze și colab., 2007; Gaberc-Porekar și Menart, 2001; Neville și colab., 1997). Lee și
colab. (2008) au inclus principiul acestei tehnici cromatografice în electroforeza de afinitate prin
încorporarea de ioni de metal în gelul de poliacrilamidă. În această tehnică, denumită
electroforeză de afinitate cu metal imobilizat ionul de metal este imobilizat în matricea de gel în
timpul reacției de polimerizare. Au fost testate o serie de săruri unor metale la capturarea
fosfoproteinelor: clorura ferică (III), clorura feroasă (II), clorura de nichel (II), clorura de
mangan (II), clorura de magneziu, clorura de argint (II), clorura de staniu, oxid de scandiu (III)
clorură de aluminiu, clorură de vanadiu (III), nitrat de galiu (III), sulfat de cupru (II), clorură de
crom (III), fosfat acid de zirconiu (IV), clorura de sodiu, clorura de potasiu, dioxid de titan (III)
acetat de calciu şi nanopudră de oxid de titan (IV) (Lee și colab., 2008). Dintre acestea, numai
ionii de Al+3, Ti+3, Fe+3, Fe+2 și Mn+2 sunt capabili să lege și să imobilizeze fosfoproteine, după
cum s-a demonstrat prin analiza unui amestec de proteine nefosforilate (albumina serică umană,
anhidraza carbonică, α-cazeina defosforilată şi a hemoglobinei umane) precum și a unor
fosfoproteine, α-cazeina, β-cazeina şi fosvitina (ultima fiind o proteină naturală cu un grad mare
de fosforilare, la care din 216 reziduuri de aminoacizi prezente în secvenţa sa, 109 sunt
fosforilate) (Miller și colab., 1982). De asemenea, α și β-cazeina au opt respectiv cinci situsuri
fosforilate (Cao și Stults, 2000; Alverdi și colab., 2005).
Tehnica de electroforeză de afinitate cu metal imobilizat poate fi utilizată chiar dacă sistemul
conține detergent (SDS-PAGE) sau într-un sistem bidimensional (Lee și colab., 2008). Astfel,
dacă în cazul electroforezei monodimensionale ioni de metal, precum Fe+3 sau Mn +2 sunt
încorporați într-o zonă distinctă a gelului de poliacrilamidă pentru reținerea fosfoproteinelor, în
cazul celei bidimensionale, după o separare prin focalizare izoelectrică într-o primă dimensiune,
în a doua dimensiune ionii de Fe+3 sunt încorporați în partea de sus a gelului de poliacrilamidă
pentru a captura şi imobiliza fosfoproteinele, care pot fi ușor identificate în gel după digestie cu
tripsină şi spectrometrie de masă. Figura 3.109 prezintă un exemplu de separare prin
electroforeză bidimensională pe gel de poliacrilamidă a unui amestec de fosfoproteine,
amiloglucozidază, β-cazeină, albumină umană, anhidrază carbonică şi lizozim, comparativ cu 2-
D-PAGE normal (Gupta și colab., 2010). Față de metoda de cromatografie de afinitatecu ioni
metalici imobilizați, care conduce la o îmbogăţire în fosfoproteine metoda electroforetică le
separă în plus și în funcție de pI-ul acestora.
 Figura 3.109. Electroforeza bidimensională pe gel de poliacrilamidă a unui amestec de proteine alcătuit din
amiloglucozidază, β-cazeină, albumină umană, carbonic anhidrază și lizozim. (A, B) 2-D-PAGE normală și (C,D)
electroforeză de afinitate Fe+3-2-D cu metal imobilizat, pe un gel de poliacrilamidă în gradient de pori 7,5–15% în
condiții native în tampon tris-glicină, cuun tampon de migrare care conțne SDS. (A, C) proteinele se vizualizează prin
colorație cu Coomassie blue G-250; (B, D) Fosfoproteinele se evidențiază prin colorație specific cu Pro-Q diamond
(După Gupta și colab., 2010).
Bibliografie
Alverdi, V., Pancrazio, F. D., Lippe, G., Pucillo, C., Casetta, B., Esposito, G. (2005) Determination of protein
phosphorylation sites by mass spectrometry: a novel electrospray-based method. Rapid Commun Mass Spectrom
19:3343–3348.
Anderson, L., Porath, J. (1986) Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe+3) affinity
chromatography. Anal. Biochem. 154:250–254.
Bocek, P., Deml, P., Gebauer, M., Dohtik, V. in B.J. Radola (Editor), Analytical Isotachophoresis, VCH,
Weinheim, New York, 1988.
Bog-Hansen, T. C. (1973) Crossed immuno-affinoelectrophoresis. An analytical method to predict the result of
affinity chromatography. Anal Biochem. 56:480-488.
Borrebaeck, C. A. K., Etzler, M. E. (1980) A study of binding properties of the isolectins from the Dolichos
biflorus plant using affinity electrophoresis. FEBS Lett. 117:237-240.
Borrebaeck, C. A., Lönnerdal, B., Etzler, M. E. (1981) Metal ion content of dolichos biflorus lectin and effect of
divalent cations on lectin activity. Biochemistry. 20:4119-4122.
Cao, P., Stults, J. T. (2000) Mapping the phosphorylation sites of proteins using on-line immobilized metal
affinity chromatography/capillary electrophoresis/electrospray ionization multiple stage tandem mass spectrometry.
Rapid Commun Mass Spectrom 14:1600–1606.
Cerovsky, V., Ticha, M., Horejsi, V., Kocourek, J. (1980) Studies on lectins. XLIX. The use of glycosyl
derivatives of Dextran T-500 for affinity electrophoresis of lectins. J. Biochem. Biophys. Methods 3:163--172.
Cerovsky, V., Ticha, M., Turkova, J., Labsky, J. Interaction of trypsin with immobilized p-aminobenzamidine
derivatives studied by means of affinity electrophoresis. (1980) J. Chromatogr. 194:175-181.
Chen, J.-L., Morawetz, H. (1981) Affinity electrophoresis in gels containing hydrophobic substituents. J. Biol.
Chem. 256:9221-9223.
Ek, K., Gianazza, E., Righetti, P. G. (1980) Affinity titration curves: determination of dissociation constants of
lectin-sugar complexes and of their pH-dependence by isoelectric focusing electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta
626:356-365.
Etzler, M. E., Borrebaeck, C. A. K. (1980) Carbohydrate binding activity of a lectin-like glycoprotein from stems
and leaves of Dolichos biflorus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 96:92-107.
Etzler, M. E., Gupta, S., Borrebaeck, C. A. K. (1981) Carbohydrate binding properties of th Dolichos biflorus
lectin and its subunits. J. Biol. Chem. 256:2367-2370.
Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, Th. P. E. M. Isotachophoresis -Theory, Instrumentation and
Applications, Elsevier, Amsterdam, 1976.
Gaberc-Porekar, V., Menart, V. (2001) Perspectives of immobilized metal affinity chromatography. J Biochem
Biophys Methods 49:335–360.
Gerbrandy, S. J., Doorgeest, A. (1972) Potato Phosphorylase isoenzymes. Phytochemistry 11:2403-2407.
 Gupta, S., Lasanthi, G. D.,Jayathilaka, P., Huang, J. S., Lee, B. S. (2010) Two-dimensional immobilized metal
affinity electrophoresis for capturing a phosphoprotein. J Biomol Tech. 21:160-162.
Hauzer, K., Ticha, M., Horejsi, V., Kocourek, J. (1979) Studies on lectins. XLIV. The pH dependence of lectin
interactions with sugars as determined by affinity electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta 583:103-109.
Horejsi, V. (1979) Galactose oxidase. An enzyme with lectin properties. Biochim. Biophys. Acta 577:383-388.
Horejsi, V. (1986) Qualitative and quantitative applications of affinity electrophoresis for the study of protein-
ligand interactions: a review. J. Chromatogr. 376:49-67.
Horejsi, V., Kocourek, J. (1973) Studies on phytohemagglutinins XII. O-Glycosyl polyacryl-amide gels for
affinity chromatography of phytohemagglutinins. Biochim. Biophys. Acta 297:346-351.
Horejsi, V., Kocourek, J. (1974) Affinity electrophoresis: separation of phytohemagglutinins on O-glycosyl
polyacrylamide gels. Methods Enzymol. 34:178-181.
Horejsi, V., Smolek, P., Kocourek, J. (1978) Studies on lectins. XXXV. Water-soluble O-glycosyl polyacrylamide
derivatives for specific precipitation of lectins. Biochim. Biophys. Acta 538:293-298.
Horejsi, V., Ticha, M. (1981) Affinity isoelectric focusing in polyacrylamide gel-a method to detect ligand-
binding proteins. Anal Biochem. 116:22-26.
Horejsi, V., Ticha, M., Kocourek, J. (1977) Studies on lectins. XXXI. Determination of dissociation constants of
lectin. Sugar complexes by means of affinity electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta 499:290-300.
Horejsi, V., Ticha, M., Tichy, P. Holy, A. (1982) Affinity electrophoresis: new simple and general methods of
preparation of affinity gels. Anal. Biochem. 125:358-369.
Johnson, S. J., Metcalf, E. C., Dean, P. D. G. (1980) The determination of dissociation constants by affinity
electrophoresis on Cibacron Blue F3G A-agarose-polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 109:63-66.
Lee, B. S., Lasanthi, G. D., Jayathilaka, P., Huang, J. S., Gupta, S. (2008) Immobilized metal affinity
electrophoresis: a novel method of capturing phosphoproteins by electrophoresis. J Biomol Tech. 19:106-108.
Lee, C., Levin, A., Branton, D. (1987). Copper staining: A five-minute protein stain for sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 166:308-312.
Lönnerdal, B., Borrebaeck, C. A., Etzler, M. E., Ersson, B. (1983) Dependence on cations for the binding activity
of lectins as determined by affinity electrophoresis. Biochem. Biophys. Res.Commun. 115:1069-1074.
Masson, P., Marnot, B. (1985) Affinity electrophoresis in polyacrylamide gel. Influence of the concentration in the
gel on the apparent affinity of cholinesterase for an anionic ligand site. J. Chromatogr. 328:135-144.
Masson, P., Marnot, B., Lombard, J.-Y. Morelis, P. (1984) Electrophoretic study of aged butyrylcholinesterase
after inhibition by soman. Biochimie 66:235-249.
Masson, P., Privat de Garilhe, A., Burnat, P. (1982) Multiple molecular forms of human plasma
butyrylcholinesterase. II.-Study of the C1, C3 and C4 components by means of affinity electrophoresis Biochim.
Biophys. Acta 701:269-284.
Masson, P., Vallin, P. (1983) Possibilities of study of the human plasma cholinesterase variants by affinity
electrophoresis. J. Chromatogr. 273:289-299.
Miller, M. S., Benore-Parsons, M., White, H. B. (1982) Dephosphorylation of chicken riboflavin-binding protein
and phosvitin decreases their uptake by oocytes. J Biol Chem 257:6818–6824.
Moscher, R. A., Saville, A. D., Thormann, W. The Dynamics of Electrophoresis, VCH, Weinheim, 1992.
Muller, W., Hattesohl, I., Schutz H.-J., Meyer, G. (1981) Polyethylene glycol derivatives of base and sequence
specific DNA ligands: DNA interaction and application for base specific separation of DNA fragments by gel
electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9:95-119.
Nakamura, K. Kuwahara, A. Ogata H., Takeo, K. (1980 a) Study of the interaction between L-lactate
dehydrogenase isoenzymes and immobilized 8-substituted adenosine 5'-monophosphate by means of affinity
electrophoresis. J. Chromatogr. 192:351-362.
Nakamura, K., Kuwahara, A., Takeo, K. (1979) Study of the interaction between phosphorylase and hydrophobic
groups by means of affinity electrophoresis. J. Chromatogr. 171:89-100.
Nakamura, K., Kuwahara, A., Takeo, K. (1980 b) Study of the interaction between NADP-dependent
dehydrogenase and immobilized adenosine 2'-monophosphate by means of affinity electrophoresis. J. Chromatogr.
196:85-99.
Neville, D. C., Rozanas, C. R., Price, E. M., Gruis, D. B., Verkman, A. S., Townsend, R. R. (1997) Evidence for
phosphorylation of serine 753 in CFTR using a novel metal-ion affinity resin and matrix-assisted laser desorption
mass spectrometry. Protein Sci. 6:2436–2445.
Nováková, J., Tichá, M., Kocourek, J. (1981) Studies on lectins. LI. The role of Mn2+ in the activity of the
soybean lectin. Biochim Biophys Acta. 670:401-407.
Pechova, L., Ticha, M., Kocourek, J. (1982) Studies on lectins: LIII. Affinity electrophoresis in the study of the
effect of detergents on the interaction of lectins with carbohydrates J. Chromatogr. 240:43-50.
Schalkhammer, T. G. M. Analytical biotechnology. Methods and tools in Biosciencies and Medicine.
Schalkhammer, T. G. M. Ed., Boston Berlin Birkhauser, Birkhauser Verlag Bassel/Swetzerland, 2002, pag. 17.
Sharon, J., Kabat, E. A., Morrison, S. L. (1982) Association constants of hybridoma antibodies specific for alpha
(1 leads to 6) linked dextran determined by affinity electrophoresis. Mol. Immunol. 19:389-398.
Shimura, K., Kasai, K. (1982) Affinophoresis of trypsins. J. Biochem. 92:1615-1622.
 Siepman, R., Stegemann, H. (1967a) Amylases, phosphorylase and related enzymes: nanogram demonstration in
relation to polyacrylamide (PAA-) electrophoresis. Naturwissenschaften 54:116-117.
Siepman, R., Stegemann, H. (1967b) Ezyme electrophoresis in embedding polymerisates of acrylamide. A.
Amylases, phosphorylases. Z. Naturforsch. 22b:949-955.
Sugii, S., Kabat, E. A. (1980) Binding constants of levans and D-fructo-oligosaccharides to BALB/c and NZB D-
fructan-specific, myeloma proteins, determined by affinity electrophoresis. Carbohydr. Res. 82:113-124.
Sugii, S., Takeo, K., Kabat, E. A. (1979) Binding constants of NZB myeloma antidextrans for dextrans and
isomaltose oligosaccharides determined by affinity electrophoresis. J. Immunol. 123:1162-1168.
Takeo, K., Kabat, E. A. (1978) Binding constants of dextrans and isomaltose oligosaccharides to dextran-specific
myeloma proteins determined by affinity electrophoresis. J. Immunol. 121:2305-2310.
Takeo, K., Nakamura, S. (1972) Dissociation constants of glucan phosphorylases of rabbit tissues studied by
polyacrylamide gel disc electrophoresis. Arch. Biochem. Biophys. 153:1-7.
Ticha, M., Barthova, J. , Labsky, J., Semansky, M. (1980) Determination of the interaction of lactate
dehydrogenase with high-molecular-weight derivatives of amp by affinity electrophoresis. J. Chromatogr. 194:183-
189.
Ticha, M., Horejsi, V., Barthova, J. (1978) Affinity electrophoresis of proteins interacting with Blue dextran.
Biochim. Biophys. Acta 534:58-63.
Turkova, R., Ticha, M., Kocourek, J. (1980) Studies on lectins. LIV. Affinity electrophoresis of lectins and trypsin
on affinity gels prepared from Sephadex derivatives incorporated into a polyacrylamide gel matrix. J. Chromatogr.
192:408-412.
Turkova, R., Ticha, M., Kocourek, J. (1983) Studies on lectins. LIV. Affinity electrophoresis of lectins and trypsin
on affinity gels prepared from Sephadex derivatives incorporated into a polyacrylamide gel matrix. J. Chromatogr.
257:297-303.
Witze, E. S., Old, W. M., Resing, K. A., Ahn, G. N. (2007) Mapping protein post-translational modifications with
mass spectrometry. Nat. Methods 4:798–806.
 3.14. IMUNOELECTROFOREZA
Imunoelectroforeza reprezintă o metodă care combină electroforeza în mediu stabilizat cu
reacția antigen-anticorp. Această asociere, între rezoluția proprie și specificitatea reacțiilor
imunochimice, permite caracterizarea calitativă și cantitativă a amestecurilor complexe de
proteine. Imunoelectroforeza este o denumire generică pentru o serie de metode biochimice de
separare şi caracterizare a proteinelor care au la bază preocedee electroforetice şi reacţii cu
anticorpi. Toate variantele de imunoelectroforeză necesită imunoglobuline, anticorpi care
reacţionează cu proteinele separate sau caracterizate.
Anticorpii reprezintă un grup de proteine plasmatice denumite imunoglobuline, care sunt
produse de sistemul imunitar ca răspuns la apariția în corp a unor macromolecule străine,
denumite antigene. Din punct de vedere chimic, antigenul reprezintă orice substanță care are
capacitatea de a produce un răspuns imun specific mediat de un anticorp și /sau de celule
antigenice reactiv specifice. De cele mai multe ori, antigenele sunt macromolecule complexe sau
chiar celule întregi, dar rãspunsul imun, dupã injectarea lor în organism, este orientat
predominant faţã de situsuri discrete, strict limitate ale antigenului, denumite grupări
determinante de specificitate, situsuri antigenice, determinanţi antigenici sau epitopi. Fiecare
anticorp se leagă în mod specific la un epitop (regiunea limitatã a antigenului care induce un
rãspuns imun specific, se combinã cu situsul activ al moleculei de anticorp şi determinã
specificitatea reacţiei antigen-anticorp, partea a moleculei de antigen, la nivelul careia se leagă
anticorpul specific, ceea ce îi dă caracteristica de determinant antigenic. Antigenii posedă de
obicei mai multi determinanți care pot fi diferiți unii de alții sau pot fi structuri repetitive.
Virtual, întreaga suprafață a unei proteine este potențial antigenică) pe una din macromolecule.
Această proprietate permite utilizarea anticorpilor la detecția și determinarea cantitativă a unor
proteine specifice din amestecuri complexe.
În 1938 Tiselius şi Kabat au demonstrat experimental că, de cele mai multe ori, funcţia de
anticorp este asociatã cu fracţia gama a proteinelor serice şi le-au dat denumirea de
gamaglobuline. În 1970, prin consens între specialişti, OMS a stabilit ca substanţele cu
proprietãţi de anticorp, sã fie grupate în categoria imunoglobulinelor, pornind de la faptul cã
toate substanţele din acest grup au funcţie imunitarã şi sunt cuprinse în fracţia globulinicã a
serului (Mihăescu, 2001). Anticorpii nu sunt numai gamaglobuline. Există şi alte globuline cu
funcţie de anticorp, dupã cum există şi gamaglobuline care nu au activitate de anticorp (de
exemplu, proteinele patologice Bence-Jones) (Mihăescu, 2003).
Teoretic orice substanță proteică, lipidică sau glucidică poate deține un potențial antigenic.
Practic însă, există antigene complete-care incită formarea de anticorpi „in vivo” (care se
denumesc substanțe imunogene, având capacitatea de a induce formarea anticorpilor și/sau a
reacțiilor imune celulare și reacționează specific cu ei „in vitro” și antigene incomplete
(denumite haptene), substanțe care injectate unui animal nu induc formarea de anticorpi, fiind
însă capabil de a reacționa specific „in vitro” cu anticorpii, fie pentru a da o reacție de
precipitare, fie pentru a inhiba precipitarea antigenului complet (care conține haptena), cu
anticorpul corespunzător.
Anticorpii sunt, în general, izolați din serul sanguin al unor animale, cu excepţia cazului în
care sunt extrași din culturi de țesuturi sub formă monoclonală. În continuare, serul trebuie să fie
titrat pentru a se determina concentraţia de anticorpi şi specificitatea acestora. De asemenea,
determinările de concentraţie sunt adesea necesare pentru amestecurile de antigeni, tehnicile de
imunodifuzie şi imunoelectroforeză fiind tehnici utile acestor scopuri. Dacă un anticorp şi un
antigen sunt prezenți în soluţie la concentraţii aproximativ egale, ei formează un agregat, care
precipită, acest precipitat putând să fie dizolvat prin adăugarea unui exces de anticorp sau de
antigen (figura 3.110).
 Figura 3.110. Ilustrarea principiului care stă la baza utilizării
fenomenului de imunodifuzie și imunoelectroforeză. Într-o matrice
de gel, în care este stabilit un gradient de concentraţie de anticorpi
care scade liniar într-o direcţie dată, iar concentrația de antigen
creşte în gradient din direcție opusă, se va forma o bandă de
precipitat perpendicular pe direcția gradientului, într-un punct de
concentraţie a antigenului respectiv a anticorpului aproximativ egală.

Când sunt prezenți la concentraţii aproximativ egale,

antigenul şi anticorpul vor precipita ca un agregat. În figura de mai sus se ilustrează principiul
care stă la baza utilității fenomenului de imunodifuzie după cum modificarea concentraţiei de
anticorpi conduce la o schimbare corespunzătoare în regiunea de precipitare. Într-o matrice de
gel, în cazul în care este stabilit un gradient de concentraţie de anticorpi care scade liniar într-o
direcţie dată, în timp ce concentrația de antigen creşte în aceeaşi direcţie, se va forma o bandă de
precipitat perpendicular pe direcția gradientului, într-un punct de concentraţie a antigenului
respectiv a anticorpului aproximativ egală. Acest proces reprezintă baza fizico-chimică a celor
două tehnici, cea de imunodifuzie şi cea de imunoelectroforeză. În ambele tehnici, se formează
un gradient de antigen sau un dublu gradient de anticorpi şi de antigen, stabilindu-se o linie de
precipitat în gel. Poziţia liniei dă o imagine orientativă asupra concentraţiei de antigen sau de
anticorp din probă, putându-se calibra cu standarde.
Metodele imunoelectroforetice au fost dezvoltate şi utilizate pe scară largă în a doua jumătate
a secolului XX, într-o ordine cronologică, care cuprinde analiza imunoelectroforetică
(imunoelectroforeza mono-dimensională, denumită și tehnica Grabar), încrucișatăt
(imunoelectroforeza bi-dimensională cantitativă, numită și tehnica Clarke şi Freeman),
imunoelectroforeza tip rachetă (imunoelectroforeza mono-dimensională cantitativă, denumită și
modelul Laurell), imunoelectroforeza de tip rachetă fuzibilă sau tehnica Svendsen şi Harboe și
imunoelectroforeza de afinitate, denumită și tehnica Bøg-Hansen.
În 1966, Laurell a publicat metoda de electroimunoanaliză, subliniind aspectele sale
cantitative. În această abordare, antigenele sunt forţate să migreze într-un gel care conţine un
antiser monospecific, fără o separare electroforetică preliminară. Conurile de precipitat
(„rachete” sau „vârfuri”) formate, sunt proporţionale în lungime (sau, mai precis, în zona de
suprafaţă), cu cantitatea de antigen şi invers proporționale cu titrul de anticorpi.
Metoda reacției încrucișate antigen-anticorp, nu este absolut cantitativă în versiunea Laurell
(unde cantitatea de antigen supus imunoprecipitării nu este cunoscută cu exactitate), a fost
modificată de Clarke şi Freeman rezultând o metodă complet cantitativă, care poate fi folosită în
analizele clinice (Clarke și Freeman, 1966). În acelaşi an, un grup de americani din Denver a
publicat o dezvoltare independentă a metodei, “electroimunodifuzie”, aproape identic cu metoda
reacției încrucișate descrise de Laurell (Hartley și colab., 1966 Merrill și colab., 1967). Dacă
Laurell şi Freeman au utilizat ca mediu sabilizant gelul de agaroză, grupul din Denver, în scopul
de a exploata dezvoltarea unui curent endosmotic mai mare pentru cuantificarea unor
imunoglobuline în lichidul cefalorahidian a folosit un gel de agar.
Din metoda originală descrisă de Laurell și Freeman, care utilizează gelul de agaroză, au fost
dezvoltate o serie de metode aplicații răspândite (Verbruggen, 1975a) și s-au conturat metodele
de imunoelectroforeză încrucișată în analiza proteinelor (Keyser, 1972).
Așadar imunoelectroforeza este o tehnica pentru studiul antigenelor şi anticorpilor (Axelsen,
1983; Garvey și colab., 1977; Lizana, 1989; Marchalonis şi Warr, 1982). Probele care conțin un
antigen sunt mai întâi separate în părţile lor componente prin electroforeză pe geluri de agaroză.
Ele sunt apoi cercetate cu anticorpi în timp ce fracțiile sunt încă în gel. Deoarece tehnica se
bazează pe difuzia unor molecule mari, este necesară o structură deschisă a porilor gelului de
agaroză pentru etapa electroforetică. Aceasta limitează rezoluţia electroforetică care poate fi
obţinută. Cu toate acestea, specificitatea ridicată a anticorpilor permite identificarea multor
antigeni dintr-o probă dată.
În cea mai simplă versiune a metodei, probele care conțin antigenul sunt plasate în mici
godeuri (2-4 mm), circulare cu a adâncime de (1-2 mm) realizate într-un gel de agaroză cu o
concentrație de 1%. Gelurile sunt turnate pe plăci de sticlă sau foi de plastic, tratate şi plasate în
camera electroforetică, între cei doi electrozi, într-un sistem orizontal. Celulele electroforetice
utilizate în imunoelectroforeză sunt deosebit de simple alcătuite dintr-o simplă cutie de plastic cu
cei doi electrozi situați în camere separate. Contactul dintre tampoanele electroforetice și gelurile
supuse imunoelectroforezei se realizează prin punți de hârtie de filtru saturate în tampon. Un
tampon adecvat imunoelectroforezei este Tris 0,08 M/ Tricină 0,02 M/lactat de calciu 0,3M;
pH=8,6. Câmpurile electrice utilizate în imunoelectroforeză sunt de ordinul a 5 V/cm.
Când electroforeza este finalizată, în fantele tăiate și plasate longitudinal, paralel cu calea de
migrare, se adaugă antiseruri. Fantele cu o lăţime de 1-2 mm, sunt plasate la aproximativ 0,5 cm
de godeurile cu probă. O fantă se realizează pe fiecare parte a benzii probei separate. Se pot
plasa antiseruri diferite în cele două fante. Geluri sunt incubate peste noapte timp în care
antigenele şi anticorpii difuzează unii faţă de alţii, în gel. Arcele de proteine precipitate
(precipitine), în formă de curbă realizate în gel de antigene şi anticorpi se întâlnesc la
concentraţii adecvate (la echivalență).
Arcurile majore de precipitine sunt vizibile direct în geluri în timp ce arcurile minore pot fi
vizualizate prin colorare. Prezenţa unui arc de precipitine este o dovadă atât pentru existența
antigenului în proba supusă electroforezei şi a anticorpilor din antiser. Complexitatea structurii
arcului de precipitină depinde atât de numărul cât şi de tipurile de antigeni din probă, precum şi
de numărul şi tipurile de anticorpi prezente în antiser.
Aşa-numitele imunoelectroforeză în rachetă mono și bidimensională reprezintă două variante
majore de tehnici de imunoelectroforeză. Numele de “rachetă” provine din forma peak-ului de
precipitină rezultat în urma reacției antigen-anticorp. Înălţimile peak-urilor de precipitine în
imunoelectroforeza tip rachetă sunt aproximativ proporţionale cu concentraţiile de antigen din
probă, astfel că aceste două metode sunt semicantitative.
Când antigenii migrează într-un câmp electric aplicat unui gel plat de agaroză, care conține
anticorpi în faza staționară, distribuiți omogen se formează un precipitat a cărui suprafață este
aproximativ proporţională cu cantitatea de antigen şi invers proporțională cu titrul anticorpilor
specifici. Acest principiu poate fi aplicat practic în două moduri: mono- şi bidimensional.
3.14.1. ELECTROIMUNOANALIZA MONODIMENSIONALĂ
Electroimunoanaliza monodimensională (sinonime: imunoelectroforeza tip rachetă, cu peak-
uri, electroimunodifuzia, electroforeza încrucișată simplă). Antigenul, aplicat într-o în godeul
gelului placă, este forţat imediat spre gelul care conține anticorpi, conurile (rachetele) formate au
o suprafaţă aproape proporţională cu cantitatea de antigen. Lungimea conului (peak-ului) va da,
în general, o aproximare suficient de exactă a concentrației de antigen (Figura 3.111).
În imunoelectroforeza tip rachetă, antigenele sunt supuse separării electroforetice în gel de
agaroză în care se încorporează anticorpii. pH-ul tamponului de electroforeză este apropiat de pI-
ul moleculelor de anticorpi, astfel încât anticorpii nu migrează în timpul gel-electroforezei. În
imunoelectroforeza mono-dimensională tip rachetă, probele de
antigeni sunt plasate în godeuri realizate în gelul care conţine
anticorpii introduși anterior migrării electroforetice. Rachetele se
formează în timpul electroforezei în cazul în care antigenul şi
anticorpul se întâlnesc la echivalenţă.
 Figura 3.111. Reprezentarea schematică a tehnicii de electroimunoanaliză și
imaginea unui gel după imunoelectroforeză tip rachetă. (După Verbruggen, 1975;
GeNeiTM Teaching Kit Manual, Bangalore Genei, 2007).

Prin compararea înălţimii rachetei din probele de testat (necunoscute) cu cele formate de
standardele cunoscute, dilutate corespunzător, se pot determina concentraţiile unor antigeni
specifici. În acest scop se realizează o curbă semilogaritmică log concentrație proteică de antigen
(dată în mg/ml sau U.I./ml) și înălțimea rachetelor (dată în mm). Figura 3.111. prezintă o astfel
de curbă de regresie.

Figura 3.112. Curbă standard de cuantificare după o

imunoelectroforeză tip rachetă (după GeNeiTM Teaching Kit Manual,
Bangalore Genei, 2007)

Imunoelectroforeza cantitativă se aplică în laboratorul clinic și de cercetare biomedicală

pentru studiul unor proteine solubile din diverse organe (ficat, splină, inimă) al proteinelor serice
sau plasmatice, pentru studiul polimorfismelor.
Figura 3.113. Cuantificarea componentei P amiloide serice din intima
aterosclerotică prin imunoanaliză. Extractele secvențiale ale componentei P amiloide
serice supuse extracției în tampon TRIS/ CaCl2 salin, TRIS/ EDTA salin, TRIS/
guanidină salin, ori supus digestiei cu colagenază (godeurile de la 1, la 4) au fost
aplicate pe un gel de agaroză 1% care conține antiser de iepure 0,15% (anti-
componentă P amiloide serică) și supuse analizei Laurell tip rachetă. Godeurile de la 5
la 8 au fost încărcate cu standarde de plasmă umană diluate la concentrații de 20, 10, 5,
respectiv 2,5 mg/l (după Li și colab., 1995).
 În figura 3.113 este prezentată modalitatea de cuantificare a componentei P amiloide serice
din intima aterosclerotică prin imunoanaliză (Li și colab., 1995).
Cele mai mari avantaje ale acestei metode sunt viteza, dacă se compară cu metodele de
difuziune şi specificitatea acesteia. Antigenele individuale pot fi cuantificate fără a fi izolate de
celelalte componente.
3.14.2. ELECTROIMUNOANALIZA BIDIMENSIONALĂ
Identificarea şi analiza cantitativă a unor antigene multiple se realizează prin tehnica de
imunoelectroforeză tip rachetă bidimensională (încrucișată). Prima etapă în această metodă este
reprezentată de o electroforeză normală pe un gel de agaroză, pentru a separa antigenele prezente
în probă. În continuare linia (banda) electroforetică se taie din gel și se introduce într-un gel de
agaroză care conţine anticorpii încorporați, după care se realizează o a doua electroforeză, într-
un unghi drept faţă de prima direcţie. În timpul celei de a doua etape de electroforeză, antigenele
migrează printre anticorpii din al doilea gel (secundar). Se formează arcuri de precipitine de-a
lungul regiunilor de echivalenţa produse în urma reacțiilor dintre perechile antigen-anticorp.
Multitudinea de arcuri de precipitine depinde de complexitatea probei de antigeni şi de tipul de
antiser din gelul secundar (Garfin, 1995). Electroimunoanaliza bidimensională denumită și
imunoelectroforeză încrucișată, electroforeză antigen-anticorp încrucișată, imunoelectroforeză
cantitativă, electroforeză Laurell (-Freeman).
După separarea electroforetică iniţială, într-o primă dimensiune a antigenilor, aceștia sunt
forţați să se deplaseze pe un gel placă care conține anticorpi, într-un unghi drept față de prima
dimensiune (figura 3.114.). Aceleaşi relaţii cantitative pentru electroimunoanaliză sunt valabile
și în electroimunoanaliza bidimensională. După Verbruggen (1975a) electroimunoanaliza
bidimensională calitativă cuprinde trei tipuri de reacţii de bază care pot apărea: (a) identitate, (b)
identitate parţială, şi (c) nonidentitate , după cum este ilustrat și în figura 3.114.

Figura 3.114. Reprezentarea schematică a

imunoelectroforezei încrucișate în versiunea Laurell. (a)
reprezentarea unor antigene cu mobilitate anodică identică;
(b) reprezentarea unor antigene cu mobilitate anodică
parțial identică; (c) reprezentarea unor antigene cu
mobilitate anodică neidentică. (După Verbruggen, 1975a).

Prima lucrare publicată a fost realizată prin aplicarea unei piese de gel separate într-o primă
dimensiune, la capătul superior al unui gel care conține anticorpi (Laurell, 1965a; Laurell, 1965b;
Briscoe și colab., 1966). În acest mod, pot apărea unele probleme cu privire la linia de bază, deși
în experimentele publicate ulterior, fâșia de gel din prima dimensiune a fost încorporat într-o
fantă realizată în gelul care conține anticorpii.
Deoarece partea de gel decupată din prima dimensiune nu poate fi prelevată cu o precizie
absolută, cantitatea de antigen transferată în al doilea imunogel nu este cunoscută cu exactitate,
motiv pentru care tehnica Laurell va conduce la randamente bune dar relative în termen de
migare electroforetică, cu toate că nu se pot obţine rezultate cantitative reproductibile, de la un
experiment la altul (Verbruggen, 1975a). Pentru a remedia acest lucru, Clarke şi Freeman au
modificat metoda originală. Toate antigene aplicate în migrarea din prima dimensiune (circulară
sau în fantă), se precipită în a doua dimensiune, prin transferul întregului gel din prima
dimensiune pe o altă placă pe care se află imunogelul turnat (Glarke și Freeman, 1966). Ambele
metode (metoda Laurell și metoda Clarke şi Freeman) sunt deseori descrise.

Figura 3.115. Imunoelectroforeza încrucișată a

unor antigene și a unui antiser. Într-o primă
dimensiune proteinele sunt separate printr-o
electroforeză de tip standard. Proteinele astfel
separate sunt supuse unei migrări într-o a doua
dimensiune, la un unghi de 90 față de prima
dimensiune. Gelul conține în a doua dimensiune un
antiser, care generează un model de imunoprecipitare
ca cel prezentat în figură.

Metoda imunoelectroforetică unidimensională urmată de imunodifuzie, propusă de Grabar și

Williams (1953) suferă de dezavantajul că măsurătorile cantitative nu sunt ușor de realizat iar
imunoelectroforeza tip rachetă nu poate fi aplicată cu rapiditate în cazul unor amestecuri
complexe (Grabar și Williams, 1953) ca în cazul imunoelectroforezei tip rachetă.
În figura 3.115. este prezentată o imagine a unei imunoelectrofograme după tehnica de
analiză bidimensională anterior descrisă.
3.14.3. CONDIȚII DE SEPARARE ÎN IMUNOELECTROFOREZĂ
Electroforeza pe gel de agaroză este prima etapă a tehnicii bidimensionale şi merită o
oarecare atenţie. În versiunea Laurell a tehnicii de imunoelectroforezei încrucișate, rezoluţia este
primordială (Johansson, 1972). În versiunea Clarke-Freeman, rezoluţia este secundară, iar
electroforeza se execută în condiţii oarecum diferite: proba se aplică într-un godeu circular, mai
degrabă decât într-o fantă, iar separarea se realizează într-un tampon mai puţin concentrat, şi
astfel cu o rezistenţă electrică a câmpului mai mică. Toţi aceşti factori determină o împrăștiere a
peak-urilor mai mare decât în cazul versiunii Laurell. Din mai multe motive, acelaşi tampon este
utilizat de obicei atât în prima dimensiune cât și în a doua dimensiune (Verbruggen, 1975a).
3.14.3.1. Tampoane utilizate în imunoelectroforeză
În general, motivele pentru alegerea unui anumit tampon nu sunt menţionate în mod expres.
Totuși, în cazul analize imunoelectroforetice, selecția tamponului se realizează pe baza unei
delimitări clare a peak-urilor și de atingerea unei sensibiliți dorite (Schuller și colab., 1972a;
Schuller colab., 1972b). O combinaţie între ioni voluminoși, în sisteme în care atât cationii cât şi
anionii au abilități de tamponare, conduce la capacităţi de tamponare mari şi la conductivități
mici care permit utilizarea unor câmpuri electrice ridicate (Miller și Mutzelberg, 1973; Pizzolato,
1973).
În ceea ce priveşte existența unor condiții referitoare la mobilitatea proteinelor ori la
imobilizarea anticorpilor în gelul de agaroză, sunt stabilite limitări în funcție de un pH dat. Ionii
constituenți ai tamponului depind atât de molaritatea acestuia precum și de agaroza sau alt
substrat ales deoarece atât mediul de gel (caracterizat prin fenomenul de endoosmoză) cât și tăria
ionică influenţează mobilitatea electroforetică.
Tampoanele acid 5,5-dietilbarbituric/5,5-dietilbarbiturat de sodiu (Veronal/Veronal sodic,
figura 3.115), au fost utilizate pe scară largă în astfel de electroforeză, și au fost, de asemenea,
utilizate cu rezultate bune în imunoelectroforeza încrucișată. Un tampon adecvat ar trebui să
rezolve toate antigenele în prima dimensiune. Tampoanele veronal îndeplinesc această cerinţă
pentru ser şi multe alte sisteme de analiză.
Deşi pentru imunoelectroanaliză nu este nevoie de o rezoluţie înaltă, au fost identificate o
serie de tampoane optime pentru fiecare antigen în parte, cu toate că majoritatea autorilor care au
folosit această tehnică au utilizat același tampon, Veronal. pH-ul tamponului trebuie să permită o
imunoprecipitare optimă, care în general are loc într-un domeniul de pH 6,5-8,2 (Acesta este un
motiv pentru care protocolul imunoelectroforetic Grabar-Williams se realizează la un pH de 8,2,
deşi majoritatea tehnicilor electroforetice se derulează la un pH de 8,6. Există cu siguranţă o
multitudine de excepţii, deși cele mai multe precipitate se vor dizolva la un pH ridicat. Acest
fenomen se întâmplă adesea atunci când tamponul este utilizat pentru un timp prea mare în
incinta catodică a aparatului de electroforeză. Veronalul are un pK de 7,34; un pH egal cu 8,6
mai sus arătat este, aşadar, în domeniul capacității optime de tamponare în timp ce, la un pH mai
mic, fenomenul de insolubilitate a veronalului îl exclude din categoria tamponului.

Figura 3.116. Structura chimică a acidului 5,5-dietilbarbituric

(C8H12N2O3). Alte denumiri utilizate: veronal, barbital, acid barbituric sau
5,5-dietil-2,4,6(1H,3H,5H)-pirimidin trionă. Sarea sa de sodiu este utilizată
drept a doua componentă în prepararea tamponului Veronal/Veronal sodic
(tampon 5,5-dietilbarbituric/5,5-dietilbarbiturat de sodiu).

Au fost explorate o serie de combinații de tampon de tipul veronal cu alți ioni: veronal-acetat,
pH=8,2; pH=8,6; veronal-acetat-clorură, pH=8,6 și 7,4; veronal-Tris, pH=8,89; pH=8,6; veronal-
Tris-glicină, pH=8,8; pH=8,7 (+surfactant). Alte tampoane utilizate: fosfat, pH=8,6; pH=7,4;
pH=6,5; Tris-fosfat, pH=8,6; Tris-glicină, pH=8,7; Tris-maleat, pH=8,6; pH=7,4; TEMED-
acetat, pH=5; borat, pH=8,4; glicină, pH=10,3 (Verbruggen, 1975a). Dintre acestea tamponul
Tris-Tricină prezintă caracteristici de performanță egale sau superioare aplicabile la un spectru
larg de tehnici imunoelectroforetice față de formulele clasice (Brogren și colab., 1975;
Monthony și colab., 1978).
Urmărindu-se tăria tamponului utilizat în imunoelectroforeză, se consideră că dacă proba este
bine echilibrată în acesta, concentraţia lui nu trebuie sa fie prea mare pentru o bună stabilitate a
pH-ului în gel. Totuși, pentru o serie de separări clare, interacţiile proteină-proteină trebuiesc
prevenite printr-o rezistenţă ionică suficient de ridicată. Astfel, adăugând o sare neutră într-un
tampon diluat, se pot îmbunătăţi anumite separări electroforetice într-o primă dimensiune. Cu
toate acestea, odată cu creșterea rezistenţei ionice are loc o scădere a mobilității proteinelor în
câmp electric. Deoarece curentul endoosmotic este guvernat de aceleași legi ca și legate de
mișcarea electroforetică, fenomenul de electroendoosmoză poate fi reds printr-o creștere a tăriei
ionice. Deși la tării ionice scăzute electroendoosmoza este mai puţin favorabilă iar rezoluţia este
oarecum redusă (datorită interacţiunilor proteină-proteină), mulţi practicieni aleg tampoane de
tărie ionică scăzută, pentru a accelera migrarea proteinelor în gel, cu toate că forțe ionice mai
mari conduc, în general, la curenţi mai mari în timp ce puterea disipată în gel, sub formă de
caldură Joule, trebuie să fie eliminată prin răcire.
În general sunt utilizate tampoanele cu tării ionice mici (0,02-0,03 moli/litru barbital, de
exemplu) la o tensiune de 10-13V/cm, cu un sistem de răcire cu apă. Dacă tampoanele sunt mai
concentrate (0,075 moli/litru, de exemplu) se folosește o cădere de tensiune de 20V/cm și un
sistem de răcire a tancului electroforetic de tip criostat, avându-se în vedere că sistemul de răcire
trebuie să fie adaptat la tăria ionică utilizată în separările imunoelectroforetice (Verbruggen,
1975a).
3.14.3.2. Aditivi utilizați în imunoelectroforeză
Au fost descriși o serie de agenți tensioactivi utilizați în imunoelectroanaliză precum dodecil
sulfatul de sodiu, deși s-a raportat că, în general, acesta ar produce interferențe în procesul de
imunoprecipitare. Astfel, Haupt și colab. (1973) au reușit să-l utilizeze în analiza uromucoidului.
Bog-Hansen și colab. (1974) au folosit detergentul neionic Triton X 100 (un
octilfenoxipolietoxi-etanol) drept agent tensioactiv atât în experimente de imunoelectroforeză
monodimensională cât și în cele ce implică ambele dimensiuni, în cazul analizei unor proteine
membranare. Vestergaard (1973) a folosit Triton X 100 într-o primă dimensiune şi
polietilenglicol în cea de a doua, în studiul activității unor proteine virale.
Prezenţa sau absenţa unor cationi bivalenți sau a unor agenți complexanți în sistemul
electroforetic este de mare importanţă. Astfel, prezența Ca2+ conduce la obținerea unor linii de
precipitare mai ascuțite în multe sisteme antigen-anticorp în conformitate cu tehnica descrisă de
Laurell (1972). De mai mare importanță sunt însă diferenţele calitative (zone mai clare şi
mobilităţi relative modificate) observate în electroforeza după adăugarea sau eliminarea Ca 2+,
din cauza faptului că acesta modifică afinităţile multor proteine pentru cationi bivalenți. De
regulă, se utilizează 1-2 mM lactat de calciu (Laurell, 1972). Alți autori nu încearcă să obţină cea
mai mare rezoluţie posibilă iar în consecință utilizează etilendiaminotetraacetat (EDTA, 2
mmoli/litru) în compoziția unor tampoane care are interacționează cu ionii de Ca2+ pe care îl
complexează cantitativ (Laurell, 1965a; Johansson, 1972). Este cazul unor studii privind
proteinele sistemului complement şi factorii de coagulare ai sângelui. În cazul analizei sistemului
complement au fost incluși în gel ioni de Mg2+ (Arvilommi, 1972), în timp ce în cazul analizei
activității proteinei C-reactive gelurile au conținut ioni de Ba2+ (Kindmark, 1971).
Un exemplu ingenios de încorporare corespunzătoare a ionilor de Ca2+ în gel este dat de
Ganrot şi Nilehn (1968a;1968b) în electroimunoanaliza protrombinei. Astfel, la aplicarea probei
de plasmă în godeurile imunoplăcii care conţine Ca2+ în tampon, procesul de coagulare conduce
la formarea unor rachete slab definite. În schimb, fără prezența ionilor de Ca2+, rachetele sunt
însă bine-definite, dar apar ca fiind deplasate, departe de punctul de aplicare. Din această cauză,
o serie de autori rezolvă această prolemă prin aplicarea plasmei într-o secțiune de gel fără ioni de
calciu incluși sau anticorpi, urmată de o separare electroforetică pentru un anumit timp și apoi de
aplicarea unui gel care conține anticorpi și lactat de calciu (2,5 mmol/litru), astfel, factorii de
coagulare se separă înainte de de imunoprecipitare în secţiunea gelului secundar (Ganrot și
Nilehn, 1968a; Ganrot și Nilehn, 1968b; Hallen și Laurell, 1972; Laurell, 1972).
Agaroza, a fost utilizată în cele mai multe lucrari de imunoelectroforeză încrucișată deoarece
acest mediu permite imobilizarea anticorpilor din tamponul veronal (pH=8,6), fiind astfel
deoasebit de eficientă în realizarea reacţiilor de imunoprecipitare. Este însă necesară o
temperatură de topire/solidificare scăzută şi bună rezistență mecanică a gelului. În plus, o
caracteristică importantă a agarozei utilizate într-o serie de tehnici imunoelectroforetice este
conținutul redus de sarcini electrice, deoarece acestea contribuie substanțial la apariția și
dezvoltarea fluxului electroendosmotic, concretizat printr-un flux de lichid spre electrodul de
acelaşi semn ca și aceste sarcini și care are ca urmări deformarea gelului, supra-curgerea și
apariția de crăpături la interfețele acestuia (Catsimpoolas, 1973). În plus, unele proteine
încărcate pozitiv (histonele și proteazele alcaline) se absorb pe agar și într-o măsură mai mică de
asemenea pe agaroză, proces care conduce la scăderea rezoluției și apariția de artefacte prin
sugerarea unei heterogenități electroforetice în imunoalaniza încrucișată.Acest fenomen a condus
la necesitatea introducerii unui material nou, cu o electrendoosmoză scăzută. Deși poliacrilamida
nu reprezintă un astfel de material ideal, o serie de autori o utilizează în cazul analizelor
imunoelectroforetice bidmensionale, când, separarea într-o primă dimensiune (în etapa de
focusare izoelectrică sau electroforeză), este urmată de imunoprecipitare cantitativă în cea de a
doua dimensiune. Efectul sarcinilor ionice poate fi eliminat după cum urmează:
1. Îndepărtarea fizică a acestora prin de-ionizare. Acest procedeu implică utilizarea unor
scimbători de ioni de tipul dietilaminoetil Sephadex (Johansson și Stenflo, 1971) sau a unui
schimbător de anioni cuaternar, QAE Sephadex (Johansson, 1972; Johansson și Hjerten, 1974).
Trebuie remarcat că nu există nici o diferenţă fundamentală între utilizarea unei agaroze de înaltă
calitate și a uneia deionizată prin tehnica descrisă mai sus. De altfel, agaroza deionizată este
recomandată ca un mediu de separare prin focalizare izoelectrică de Quast (1971) fiind utilizată
la analiza proteinelor serice (Johansson, 1972; Propp și Alper, 1968) şi a sistemelor hormonale
(Propp și Alper, 1968).
2. Îndepărtarea chimică a sarcinii electrice prin hidroliza grupărilor sulfat și reducerea
grupărilor carboxil din agar (Laas, 1972). Produsul rezultat este în general superior dar, procesul
conduce la o degradare parţială a agarozei. După unii autori procesul de hidroliză este suficient
pentru a avea o endoosmoză zero, dacă produsul inițial este reprezentat de către agaroză și nu
agar (Verbruggen, 1975a).
3. Introducerea unor sarcini de semn contrar: o modalitate de a elimina procesul de
electroendoosmoză este cea de a introduce sarcini chimice organice pozitive pe structura
agarozei, produsul rezultat fiind excelent aplicat în imunoelectroforeza încrucișată, și în cea
bidimensională, când în prima dimensiune se utilizează poliacrilamida (Grubb, 1973).
4. Introducerea unor aditivi care conduc la creşterea vâscozității: metilceluloza (masă
moleculară de 200000) poate fi introdusă în gelul de agaroză pentru a reduce fluxul
electroendoosmotic. Totuși tehnica pare a nu fi perfectă (Verbruggen, 1975). În acelaşi scop,
Skude şi Jeppsson (1972) au adăugat glicerol la un amestec de poliacrilamidă/agaroză, în timp ce
Schuller și colaboratorii (1972) au adăugat hidroxietilceluloză, pentru o electroimunoanaliză a
IgA, IgM şi a α2-macroglobulinei. Aceşti autori sugerează că scăderea procesului de
electroendoosmoză se realizează printr-o complexare a anionilor din gelul de agaroză cu un
polimer neionic sau datorită creşterii vâscozității. Aceasta îmbunătăţeşte analiza proteinelor cu
greutate moleculară foarte mare şi mobilitate redusă, prin creşterea vitezei lor de migrare
anodică. Ei nu explică totuși de ce o vâscozitate mai mare nu afectează de asemenea mobilitatea
antigenului. Pe de altă parte, Laurell și Persson (1973) au introdus poliacrilamida nereticulată
drept aditiv în separările efectuate într-o primă dimensiune, pentru a diminua endoosmoza și
pentru creşterea vâscozităţii. Acelaşi aditiv a fost folosit în ambele dimensiuni de Johansson și
Hjerten (1974).
Dacă se are în vedere geometria gelului placă, se constată că în general, o concentraţie de
agaroză de 10 g/litru este cel mai des utilizată, fiind însă raportate și concentrații cuprinse între
8-18g/l (Schuller și colab., 1972). În ceea ce privește grosimea gelului, aceasta este cuprinsă
între 1 mm și 1,5 mm (Bach și colab., 1971; Crowle și colab., 1974; Rosenfeld și colab., 1969),
fiind raportate și experimente cu geluri de 0,5 mm grosime (Crowle, 1973; Crowle și Jarrett,
1972). În studiile de imunoprecipitare, grosimea gel nu reprezintă un parametru critic în cazul în
care este certă concentrația de anticorpi de pe gelul placă. Cu toate acestea, în cazul în care
prima dimensiune este reprezentată de o separare electroforetică, rezultate reproductibile poate fi
de aşteptat în cazul în care grosimea gelului este bine definită, pentru că această variabilă
afectează temperatura şi relaţia tensiune-intensitatea curentului, şi astfel, mobilitatea proteinelor
care se separă pe gel. In geluri mai subţiri de1,5 mm, trebuie să se evite procesul de evaporare.
Analizând sistemul de punți și legături se constată că o serie de autori consideră că pentru a
avea cea mai înaltă rezoluţie, în mod constant se preferă ca toate sistemele (gelu placă și vasul de
tampon) să fie puse în contact prin intermediul gelului de agaroză (Johansson, 1972). Alți
preferă ca legăturile de contact dintre gel și tampon se se realizeze prin suporți de hârtie ori
fitiluri de bumbac. Unii autori folosesc membrane de dializă, interpuse bridă și gelul de agaroză
pentru a stopa acumularea de lichid electroendoosmotic la anod, dar mai ales pentru a preveni
contaminarea cu tampon a blocurilor de proteine (Verbruggen, 1975a).
Din punct de vedere al manipulării, în cazul versiunii Freeman-Clarke, există o serie de
descrieri despre modul în care se prepară plăcile de imunoelectroforeză încrucişată și modul de
turnare a imunogelurilor (Clarke și Freeman, 1966; Clarke și Freeman, 1968). Există o serie de
articole unde sunt descrise modalitățile de manipulare a gelului în versiunea Laurell (Grubb,
1974; Ressler, 1960; Laurell, 1965a; Laurell, 1965b).
 Imunogelurile pot fi turnate într-o matriţă pentru a obține o grosime bine-definită (în
versiunea Laurell), sau pe o placă orizontală (în versiunea Clarke-Freeman), pentru a se obține
un titru bine-definit al plăcii. Aceste diferenţe reflectă practic obiectivele diferite ale celor două
versiuni. Imunogelurile pentru electroimunoanaliză sunt mai uşor de realizat (Laurell, 1972;
Laurell, 1966a).
3.14.3.3. Antiseruri și anticorpi
În scopul de a obţine un titru de anticorpi bine-definit în gel, anticorpul este în general,
amestecat cu o soluţie caldă de agaroză, cu toate că o serie de autori, preferă introducerea de
anticorpi în placa de gel solidificat printr-o simplă difuzie (Crowle, 1973; Crowle, 1972a;
Crowle și colab., 1972). Aceleași procedee se utilizează dacă se are în vedere introducerea
antigenului în gel dacă este vorba de o procedură inversă. În mod ideal, antiserul sau anticorpul
amestecat în agaroză trebuie să fie dializat împotriva tamponului utilizat în separarea
electroforetică (Lopez și colab., 1969). Cum volumul adăugat este minor, o soluţie diferită de
anticorpi, în general, nu va afecta calitatea rezultatelor.
Deoarece ariile formate de precipitate sunt invers proporţionale cu titrul de anticorpi, prin
măsurarea ariei și nu a înălțimii rachetei va creşte sensibilitatea, mai ales atunci când sunt
utilizați anticorpi cu titruri mici, procesul fiind limitat de scăderea vizibilității odată cu scăderea
cantității de precipitat. În cazul imunoelectroforezei încrucișate, un antiser mai diluat poate
indica uneori mai multe detalii despre peak-urile formate, grupate împreună la linia de bază.
Titrul unui antiser poate fi estimat astfel cum este descris pentru antiseruri monospecifice,
una dintre metodele fiind analiza imunoelectroforetică, deși au fost descrise diferite moduri de a
măsura şi de a defini titrul unor anticorpi. Kroll (1969) a descris o variantă de
imunoelectroforeză cantitativă denumită “electroforeză în linie”, care permite compararea
simultană a titrurilor unui număr mare de anticorpi specifici dintr-un antiser polispecific. Acest
proces este util, deoarece în imunoelectroforeza încrucișată când titrul anticorpilor faţă de fiecare
din antigenele individuale studiate este important. În cazul imunoelectroforezei încrucișate, nici
o cuantificare pe plăcă nu este posibilă, cu excepţia cazului în care antiserul este titrat pentru
fiecare antigen specific, sau în cazul în care sunt disponibile standarde de antigen.
Pentru a se reduce background-ul gelului, după colorare, anticorpii neprecipitați din imunogel
trebuie să fie eliminați de pe placa de gel după electroforeză fiind astfel de preferat să se lucreze
cu anticorpi purificați decât cu un antiser integral. Din acelaşi motiv utilizarea unui anticorp
diluat este recomandabilă.
Aspectul şi dimensiunea precipitatelor poate fi afectată de prezenţa unor proteine
neprecipitate din antiser, denumite „proteine balast” (Lopez și colab., 1969). În special în cazul
unor experimente noi, preliminarii la care nu se cunosc condițiile optime de lucru, este indicat să
se utilizeze imunoglobuline purificate, pentru a se evita interferenţele datorate unor interacţiuni
necunoscute. De exemplu, în cazul în care se lucrează cu tripsină, complexarea antigenului de
către inhibitorii tripsinei serice va afecta calitatea rezultatelor. Din această cauză în analiza
imunoelectroforetică a tripsinei la câine se utilizează anticorpi purificați (Ohlsson, 1971). În mod
similar, analiza subtilizinei, prin imunoelectroforeză încrucișată este posibilă numai cu anticorpi
purificați, deoarece apare o reacie nespecifică de legare la inhibitorii tripsinei serice
(Verbruggen, 1975a).
Când sunt folosite antiseruri monospecifice din surse comerciale este necesară o deosebită
atenţie deoarece acestea sunt de multe ori adsorbite, pot conţine cantităţi considerabile de
antigeni liberi ori complexe antigen-anticorp, care contribuie la colorarea background (Giebel și
Saechtling, 1973). În asemenea cazuri o tehnică de fracţionare este necesară pentru a se elimina
aceste proteine-balast. De asemenea, s-a descris o metodă de detecție denumită tehnica cu gel
intermediar care presupune adsorbția acestora. În plus faţă de metodele menţionate anterior, se
mai utilizează metoda de purificarea a imunoglobulinelor descrisă de Steinbuch ori metoda
Audran care utilizează acid caprilic (Ohlsson, 1971; Steinbuch și Audran, 1969; Steinbuch, și
colab., 1970).
Anticorpii purificați prin cromatografie de afinitate sunt cu siguranță cei mai fezabili și care
conduc la un background redus după colorare, cu toate că, din punct de vedere economic, sunt
mai costisitori. Cu toate acestea anticorpii astfel purificați, sunt foarte utili atunci când, de
exemplu, se dorește radiomarcarea lor (Kindmark și Thorell, 1972).
O marea parte a publicaţiilor în care sunt descrise experimente de imunoelectroforeză mono
sau bi dimensională utilizează anticorpi de iepure, acest animal fiind o sursă excelentă de
anticorpi. Alte surse de anticorpi raportate sunt: ovinele (Kostner și Holasek, 1972; Miller și
Mutzelberg, 1973; Studd și colab., 1970a; Studd și colab., 1970; Versey și Slater, 1973), cobaiul
(Ganrot și Nilehn 1968) sau capra (Aryan și Shaw, 1973; Claman și colab., 1967; Clarke și
Freeman, 1966; Clarke și Freeman, 1968; Darcy, 1972; Hartley și colab., 1966; Kostner și
Holasek, 1972; Watkins și colab., 1971). Lopez și colab. (1969) au arătat că în cazul anticorpilor
produși de capră, ea biosintetizează atât imunoglobuline G lente cât și imunoglobuline G rapide,
ceea ce explică de ce antiserul este adecvat pentru experimente efectuate atât pe geluri de agar-
agar cât şi pe cele de agaroză. Trebuie avut însă în vedere că antiserul integral de capră conţine o
componentă care se leagă cu randamente ridicate de agaroză și conduce la colorarea fondului de
gel (Clarke şi Freeman, 1966). În acest caz este necesară o fracționare prealabilă a acestuia,
utilizarea de imunoglobuline purificate fiind obligatorie. Cu antiserul de iepure acest fenomen de
legare nespecifică nu este observat Verbruggen, 1975a) în timp ce anticorpii de cal au fost
suspectați a nu fi adecvați experimentelor de imunoelectroforeză încrucișată, deoarece
precipitatul format este deosebit de solubil într-un exces de anticorpi, o condiţie care există în
mod clar în imunogel (Clarke şi Freeman, 1966).
Într-o serie de publicaţii a fost raportată utilizarea unor seruri umane (Axelsen, 1971; Axelsen
și Kirkpatrick, 1973; Axelsen și Svendsen, 1971; Svendsen și Axelsen, 1972) în diagnosticul unor
anticorpi din ser ori în detecția antigenulului asociat hepatitei (antigenul Australia) la om
(Saravis și Bonacker, 1970). Alte surse de anticorpi raportate sunt oaia, porcul sau maimuța
(Verbruggen, 1975a).
Dacă se analizează specificitatea anticorpilor, se observă ca regulă generală că experimentele
de imunoanaliză necesită antiseruri monospecifice, în timp ce antiserurile polispecifice au cea
mai mare utilizare în imunoelectroforeza încrucișată (Verbruggen, 1975a).
În condițiile în care mobilitatea medie a unor proteine într-un sistem electroforetic are o
componentă electrică şi o componentă electroendosmotică, urmărind mobilitatea populaţiei de
anticorpi se constată că imunoelectroforeza încrucișată poate fi realizată numai în cazul în care
anticorpii din gel pot fi păstrați imobilizați (staţionari), în timp ce antigenele sunt forţate să se
miște/migreze în gel. Aceasta este o imagine ideală, deoarece anticorpii sunt din punct de vedere
electroforetic heterogeni, comportamentul populaţiei de anticorpi utilizați fiind privită ca o
medie a mobilității, egală cu zero, în condițiile în care orice abatere de la această valoare va
afecta proporţionalitatea dintre suprafaţa peak-ului şi cantitatea de antigen. În acest context a fost
descris un test de de urmărire a comportamentului nonideal al unei populaţi de anticorpi: după
finalizarea imunoanalizei polaritatea câmpului electric este inversată, iar o probă identică se
reaplică pe aceeaşi placă, urmărindu-se dacă dimensiunea conului (peak-ului) obținut este
identică dar în direcție opusă. Abaterile de la idealitate pot fi corectate în imunoelectroforeza
monodimensională prin utilizarea unor standarde analizate pe aceeaşi placă cu probele
necunoscute. Această operațiune este însă dificil de realizat în cazul tehnicii de
imunoelectroforeză încrucișată (Verbruggen, 1975a). În plus, după cum o matrice de gel
încărcată negativ generează, într-un câmp electric, un flux de lichid spre catod, printr-o alegere
corespunzătoare a tăriei ionice și a pH-ului tamponului de electroforeză se poate obține o
mobilitate netă egală cu zero pentru anticorpii incluși în gel (Johansson și Hjerten, 1974; Kroll,
1968). Anticorpii de iepure, cei mai utilizați în cele mai multe analize imunoelectroforetice sunt
staţionari sau foarte lenți în mișcarea lor catodică la un pH de 8,6 și la o tărie ionică de 76
mmoli/litru (Laurell, 1966b). Există trei modalităţi de a evita comportamentul nonideal la alte
valori ale pH-ului, diferite de 8,6:
1. Pentru a fi utilizată o populaţie a unui anumit anticorp poate fi selectată printr-un proces de
schimb ionic realizat pe o coloană sau printr-o tehnică discontinuă, de tipul precipitării cu
rivanol (Grubb, 1970).
2. În scopul analizei IgG la o valoare a pH-ului egală cu 5,0, Bjerrum și colab. (1973) au
modificat chimic structura anticorpilor prin carbamoilarea grupărilor amino printr-o reacție cu
KOCN în condiţii bine-controlate. În mod similar, printr-o modificare a grupărilor carboxil ale
IgG, se pot realiza analize imunoelectroforetice la un pH de 10,3 și s-a observat că site-uri
antigenice ale IgG par să fie mai stabil decât funcţia de anticorpi ale sale, în timp ce o modificare
mai amplă a structurii IgG va conduce la randament inferior al titrului de anticorpi (Grubb,
1974).
3. Pregătirea anticorpilor cu mobilitate dorită prin selectarea adecvată a antigenului. În acest
context, Grubb (1970) a arătat că în scopul analizei imunoelectroforetice a IgG, este necesară o
populaţie de anticorpi predominant catodală, motiv pentru care este necesară o imunizare cu o
componentă anodală și a elaborat apoi o metodă elegantă de imunoelectroforeză încrucișată
pentru analiza distribuirii în funcție de mobilitate a populaţiei de anticorpi specifici (Grubb,
1972). În unele cazuri, este necesară carbamoilarea probei, în cazul antigenelor lente, pentru a le
face mai mobile anodic, proces exemplificat de IgG, transferină, fibrinogen ori a anhidrazei
carbonice (Verbruggen, 1975a). O tehnica similară, tratamentul cu formaldehidă (o reacție de
formilare), este utilizată în plăcile de analiză imunoelectroforetică comerciale (Bergrahm, 1973).
Grubb (1972) a aplicat o reacție de carbamoilare chiar unui ser integral. În acelaşi scop, de
modificare, în ansamblu, a tuturor proteinelor serice a fost introdusă β-propiolactona
(Verbruggen, 1975a). S-a raportat, de asemenea utilizarea unor agenţi tensioactivi pentru
solubilizarea antigenelor (Haupt și colab., 1973).
La o concentrație normală a antigenului și la o concentrație mică de anticorp se observă linii
de precipitare difuze în apropierea șanțului în care s-a aplicat imunoserul. Când concentrația
anticorpilor este foarte mare, liniile de precipitare sunt prea îndepărtate de șanț și astfel prea
puțin distincte; acelașii fenomen se observă în cazul în care concentrația de antigen este prea
mică. Pentru a se obține o dimensiune corectă a precipitatelor vizibile, dimensiunea probei şi
concentrația sa trebuie să fie ajustate cu nivelul de anticorpi. Pentru a evita formarea de inele de
precipitat, atunci când probele sunt aplicate în imunoanaliză, proba se poate aplica cu precauţie
în timp ce placa de gel este sub o tensiune foarte mică (Verbruggen, 1975a). Prin
imunoelectroforeză se disting atât componentele cu mobilități identice cât și componentele cu
constante de difuziune identice. Componentele cu mobilități electroforetice identice dar cu
constante de difuziune diferite formează în urma reacției cu imunoserul, linii de precipitare
independente. În schimb, componentele cu constante de difuziune dar cu mobilități
electroforetice diferite formează cu imunoserul corespunzător linii de precipitare etalate de-a
lungul gelului.
Proteinele care prin electroforeză sunt separate în zone compacte dau naștere unui arc de cerc
scurt. Este cazul, de exemplu a transferinei (transferina are rol esențial în transportul fierului
necesar sintetizării hemoglobinei începând de la celulele intestinale până la măduva osoasă.
Creşte în anemie cu deficiență de fier, sarcină şi terapie cu estrogeni. Scade în boli de ficat,
malnutriție, stări inflamatoare, cancer).
Arcul asimetric (coroiat) apare când una din două componente ale unei zone este în exces, în
timp ce mobilitățile electroforetice sunt numai puțin diferite. Dacă masa moleculară a proteinei
este mare, difuziunea sa este mult mai lentă, în comparație cu anticorpul, iar arcul de precipitare
este la distanță față de șanțul (fanta) cu imunoser (Imunoglobulină M, α2 macroglobulină,
lipoproteină).
 Când concentrația unei proteine este prea mare, se formează un arc timpuriu în apropierea
șanțului sau atinge marginea acestuia (aspect de barcă).
Dacă imunoserul conține anticorpi pentru proteinele plasmatice (așa-zisul imunoser
polivalent) se formează mai mult de 30 de linii de precipitare. Proteinele (antigenii) cu
determinante comune o linie de precipitare continuă (identitate),în timp ce proteinele antigenice
cu determinante diferite formează linii de precipitare care se intersectează (neidentitate). Poziția
și intensitatea liniilor de precipitare sunt în funcție de raportul dintre concentrațiile de
antigen/anticorp; la o concentrație optimă arcul de precipitare este foarte net și intens.
Cele mai utilizate suporturi ale gelurilor de agaroză sunt cele din sticlă, a căror dimensiune a
plăcilor poate fi adaptată la nevoile experimentului, deși trebuie avut în vedere că dimensiunile
mari ale acestor suporturi necesită o mare cantitate de anticorpi (Platt și colab., 1973; Rebeyrotte
și colab., 1969). Din acest motiv au fost dezvoltate sisteme miniaturizate (Verbruggen, 1975a).
Este important să se adapteze dimensiunea plăcii la condiţiile de lucru şi la aparatul
electroforetic ales, deoarece o distanță dintre electrozi mai mare necesită o tensiune mai mare la
sursa de alimentare. Astfel, un gel gros sau foarte mare va necesita o cantitate mai mere de
curent. De exemplu, un gel de 18 cm lungime, la o cădere de tensiune de 20V/cm, necesită o
sursă de alimentare puternică, mai mare de 500 V. În plus, trebuie avut în vedere că și grosimea
plăcii de sticlă afectează transferul de căldură. Astfel, plăcile cu o grosime de 0,7 mm pot fi
folosite fără a genera probleme de fragilitate.
O serie de autori, pentru a realiza o separare mai bună, au folosit plăci de sticlă, cu o lungime
de 20 cm, pentru a evidenția mai mult de 60 de antigene din serul uman (Alper și colab., 1970;
Alper și colab., 1968; Alper și colab., 1971; Bach și colab., 1971; Fuller și Keyser, 1972;
Rosenfeld și colab., 1969), în condițiile în care, o separare considerată normală, presupune
utilizarea unui gel cu o lungime de 10 cm a plăcii, și evidențierea a doar aproximativ 40 de
antigene diferite (Weeke, 1970).
Din punct de vedere al aparaturii, tehnicile de imunoelectroforeză utilizează o serie de tipuri
de aparate de electroforeză, multe dintre acestea special dedicate acestui tip de tehnică de
separare și analiză. Trebuie avut în vedere că este necesar să se urmărească apariția unui
echilibru între puterea electrică și capacitatea de răcire a aparatului electroforetic, în condițiile în
care în electroforeză, mobilitatea unei proteine este o funcţie de diferenţa de potenţial pe distanță
(centimetru). Această diferență de potențial poate fi măsurată cu ajutorul unui multimetru, fiind
importantă în selectarea parametrilor optimi de migrare.
3.14.3.4. Aplicații ale imunoelectroforezei calitative și cantitative
Imunoelectroforeza calitativă se utilizează la investigarea creșterii globulinelor gama. Astfel,
în cazul unei gamapatii monoclonale se constată creșterea unei proteine specifice (paraproteină).
Ea este în primul rând remarcată prin electroforegramă, după care este identificată imunologic cu
un imunoser specific. Paraproteinele monoclonale sunt caracteristice mielomului multiplu.
Imunoelectroforeza cantitativă este o metodă bazată pe o “migrare asistată” a antigenului,
putându-se considera o variantă a electroforezei de afinitate. Ea a fost introdusă de Laurell prin
anii 1965-1966 (Laurell, 1966), fiind cunoscută drept imunoelectroforeza model Laurell sau
imunoelectroforeza tip rachetă. În principiu, metoda constă din migrarea electroforetică a
antigenilor în gel de agaroză care conține un imunoser specific de tip precipitant. În urma
reacției antigenilor cu anticorpii specifici se formează linii de precipitare cu aspect de rachetă.
Forma rachetei se consideră a fi un triunchi având suprafața egală cu baza (diametrul godeului)
deînmulțită cu înălțimea (egală cu distanța de la centrul godeului la vârful rachetei; cum
diametrul godeurilor este constant, atunci între cantitatea de antigen (proporțională cu suprafața
rachetei) și înălțimea ei există o relație liniară, simplă. Determinarea cantitativă se face prin
raportare la un antigen standard corespondent, de concentrație cunoscută. Imunoelectroforeza
cantitativă este folosită pentru identificarea și analiza cantitativă a complexelor de antigen și
pentru calculul concentrației componentelor antigenice identificabile.
 Practic, se prepară un gel de agaroză cu o electroosmoză standard într-o concentrație de
0,75%, dintr-o soluție caldă (56oC) de agaroză 1,5%, tampon de lucru (acid dietilbarbituric-
dieltilbarbiturat de sodiu/glicină-Tris) și imunoser anterior testat. Grosimea gelului este de obicei
de 1,5 mm, diametrul godeurilor este de 3 mm iar distanța dintre godeuri este de 5 mm.
Gelul se introduce în aparatul de electroforeză, se activează sistemul de răcire și se realizează
joncțiunea dintre gel și tamponul din cuvă prin intermediul unor punți din hârtie de filtru
Whatman 3MM și se pune sub tensiune (70-100V).
Se aplică probele (circa 5 µg proteină) după care tensiunea se ridică la 280-300 V. În aceste
condiții migrarea durează 2-4 ore, timp suficient pentru epuizarea antigenului și în proba cu cea
mai mare concentrație. După oprirea electroforezei, gelul se usucă și se colorează cu soluție de
Coomassie Brillant Blue R-250 (0,5%) preparată în etanol, 45% și acid acetic (10%), timp de 10
minute. Decolorarea se realizează în soluție de etanol 45% și acid acetic, 10%, până la realizarea
unui fond clar, cu rachete bine evidențiate.
3.14.4. CONTRAIMUNOELECTROFOREZA
Contraimunoelectroforeza, denumită uneori și imunoelectroforeză supraîncrucișată este o
tehnică de laborator utilizată la evaluarea legării unui anticorp de antigenul său. Metoda, care nu
trebuie confundată cu cea de imunoelectroforeză încrucișată, este similară cu imunodifuzia, dar
la care se adaugă un câmp electric aplicat unui mediu de difuzie, de obicei un gel de agar sau de
poliacrilamidă.
Figura 3.117. Demonstrarea prezenței antigenului Australia. Două seruri
pozitive (Au) se depun în godeurile situate la partea catodică, în timp ce anticorpul
uman anti-Au se introduce în godeurile situate pe partea anodală. Se observă că
reacția de identitate indică specificitatea reacției antigen-anticorp (După Kohn,
1970).

Efectul este migrarea rapidă a anticorpului și a antigenului din godeurile respective, unul față
de altul, pentru a forma o linie de precipitaţie, care indică legarea; specificitatea liniilor de
precipitare este stabilită prin reacția de identitate cu un control pozitiv, încorporat în sistemul de
testare. Spre deosebire de toate celelalte forme de imunoelecoforeză, aceasta metodă se
realizează in geluri de agar cu flux electroosmotic puternic (Culliford, 1964). Condițiile de lucru
(pH, tărie ionică, etc.) sunt astfel alese încât antigenul/ele să se deplaseze spre anod, în timp ce
anticorpii (γ globulinele) sunt dirijați de către fluxul electroendoosmotic spre catod. Când cele
două macromolecule se vor întâlni, se va forma o linie de precipitare, clară (Andrews, 1996).
Figura 3.117 prezintă demonstrarea prezenței antigenului Australia într-o serie de probe.
În mod obișnuit, tehnica folosește agarul dar și cellogelul în care se excavează perechi de
godeuri. Placile de gel se prepară în mod obișnuit într-un tampon cu pH de aproximativ 8,5 și
după solidificare, se realizează godeuri cu diametrul de 1,5-2mm, la o distanță de 5mm, unele de
celelalte. Antigenul(ele) se plasează în godeurile pentru probă de pe partea catodică a fiecărei
perechi de godeuri, în timp ce anticorpii (antiserul) se așează pe partea catodică. Placa de agar-
agar este plasată în tancul electroforetic și se conectează la rezervoare prin intermediul unor
punți (de 4-5cm lățime) de hârtie de filtru, bumbac, sau gel de agar. Rezervoarele de
electroforeză şi conexiunile conțin o soluţie tampon barbital, pH=8,6, 0,5M, ca şi pentru o
electroforeză convenţională (Andrews, 1996).
Se recomandă un curent constant de 2-15mA/cm lațime de bandă care corespunde la o cădere
de potenţial de aproximativ 5-20V/cm. În aceste condiţii, antigenul și anticorpul se îndreaptă
unul spre celălalt, se întâlnesc și vor forma o bandă de precipitare, liniile de precipitare devenind
vizibile după 30 minute până la două ore. Metoda este rapidă și permite examinarea unui număr
foarte mare de probe, pe o singură placă de gel. După finalizarea electroforezei plăcile cu gel de
agar pot fi fotografiate sau, mai convenabil, după o inspecţie vizuală şi o înregistrare a
rezultatelor, ele pot fi spălate peste noapte într-o soluție de NaCl, 3%, după care se usucă şi se
colorează în mod clasic, printr-o metodă consacrată pentru imunoelectroforeză, deoarece liniile
slabe de precipitare sunt mult mai proeminente după colorare (Kohn, 1970).
Metoda este deosebit de valoroasă prin aceea că necesită doar cantități foarte mici de
antigen/anticorp. Capacitatea de a manevra foarte rapid un număr mare de probe o face deosebit
de atrăgătoare în screening, deși utilizarea sa este limitată la un rol strict calitativ, dacă se are în
vedere depistarea unor antigene sau a unor anticorpi necunoscuti, necesari de pildă, în analize de
medicină legală sau în screening-ul unor pacienți în vederea semnalării prezenței unor anumiți
anticorpi datorați unor stări patologice sau unor reacții alergice. Contraimunoelectroforeza este
utilă la identificarea și testarea purității unui antigen ori pentru testarea răspunsului imun al unor
animalele aflate în curs de imunizare cu antigene pure. (Andrews, 1996). În plus, tehnica de
contraimunoelectroforeză a fost dezvoltată pentru detecția unor cantităţi mici de antigen, fiind
utilizată pe scară largă pentru identificarea unor antigene precum antigenul Australia (Prince şi
Burke, 1970). Ea este mult mai rapidă şi mai sensibilă decât metodele de difuzie dublă (White și
colab., 1971). Această tehnică a fost aplicată la detecția antigenului meningococic în LCR
precum şi în serul pacienţilor cu infecţii meningococice, atât în Statele Unite ale Americii
(Edwards, 1971) cât şi în Africa (Greenwood și colab., 1971).
3.14.5. CONCLUZII
 Gelurile plate orizontale de aproximativ 1 mm grosime de agaroză 1% într-un tampon
la pH ridicat (în jurul valorii de 8,6) sunt, în mod tradiţional preferate tehnicii electroforetice
adiacente imunoelectroforezei, precum şi reacţiei antigen-anticorp.
 Agaroza a fost aleasă ca matrice de gel, deoarece posedă pori mari, care astfel permite
electromigrarea practic liberă şi separarea proteinelor, oferind, în plus posibilitatea ancorării
immunoprecipitatelor proteine-anticorpi specifici. A fost ales un pH astfel de mare, deoarece
anticorpii sunt practic imobilizați la un pH ridicat. Din punct de vedere al echipamentului, este
recomandat un aparat orizontal de electroforeză orizontală prevăzut cu un sistem de răcire.
 Imunoprecipitatele pot fi văzute în gelul umed de agaroză, dar în continuare sunt
colorate specific pentru evidențierea proteinelor prin tehnici precum cea cu Coomassie Brilliant
în gelul uscat. În contrast cu gel electroforeza în prezență de SDS, electroforeza în agaroză
permite menținerea condiţiilor native, păstrând astfel structura nativă şi activităţile proteinelor în
timpul nanlizei; prin urmare, imunoelectroforeza permite caracterizarea unor activităţi ale
enzimelor și evidențierea unor interacții cu un ligand, în plus faţă de separarea electroforetică.
 Analiza imunoelectroforetică tip Grabar este metoda clasică de imunoelectroforeză
când proteinele sunt separate prin electroforeza, după care anticorpii sunt aplicați într-o serie de
fante, plasate lângă proteinele separate urmărindu-se imunoprecipitatele care se formează, după
o perioadă de timp în care are loc difuzia proteinelor separate și interacția acestora cu anticorpii.
Introducerea analizei imunoelectroforetice a dat un mare impuls cercetării în chimia proteinelor,
unele dintre primele rezultate fiind o creștere a rezoluţiei proteinelor din fluidele şi extractele
biologice. Printre observaţiile importante făcute au fost cele referitoare la numărul mare de
proteine diferite din ser, precum și existenţa mai multor clase de imunoglobuline alături de
heterogenitatea lor electroforetică.
  Imunoelectroforeza încrucișată denumită și imunoelectroforeza bidimensională
cantitativă ori tehnica Clarke şi Freeman se bazează pe separarea proteinelor prin electroforeză
într-o primă dimensiune, urmată apoi în loc de difuzie faţă de anticorpi, de o nouă electroforeză
a proteinelor pe un gel care dew această dată conține anticorpul, într-o a doua dimensiune.
Imunoprecipitarea se va produce în timpul electroforezzei din a doua dimensiune iar
imunoprecipitatele au ca și caracteristică o formă de clopot/rachetă, fiecare reprezentând un
antigen precipitat, poziţia precipitatului fiind dependentă de cantitatea de proteine, precum și de
cantitatea de anticorpi specifici din gel, astfel încât poate fi efectuată o cuantificare relativă.
Sensibilitatea şi marea putere de rezoluţie a imunoelectroforezei încrucișateă a condus la
dezvoltarea unor variante ale tehnicii, utile în diverse scopuri. Imunoelectroforeza încrucișată a
fost folosită în studiul unor proteine din fluidele biologice, în special în serul uman și în extracte
biologice.
 Imunoelectroforeza tip rachetă este de asemenea o imunoelectroforeză cantitativă
unidimensională. Metoda a fost folosită pentru cuantificarea proteinelor serice umane, înainte ca
metodele automate să devină disponibile.
 Imunoelectroforeza tip rachetă fuzibilă este o metodă modificată a imunoelectroforezei
cantitative unidimensionale și este utilizată la analiza unor fracţiuni proteice, în experimentele de
separare a proteinelor.
 Imunoelectroforeza de afinitate se bazează pe modificările modelului electroforetic al
proteinelor prin interacţiunea lor specifică sau prin formare de complexe cu alte macromolecule
sau liganzi. Imunoelectroforeza de afinitate a fost utilizată pentru estimarea constantelor de
legare, de exemplu, cu lectinele sau pentru caracterizarea unor proteine, cu caracteristici
specifice, precum ar fi conţinutul lor de glicani sau de legare a ligandului. Unele variante de
imunoelectroforezei de afinitate sunt similare cu cele de cromatografie de afinitate prin utilizarea
unor liganzi imobilizați.
 În cazul proteinelor plasmatice umane, lungimea și forma arcului depind de
omogenitatea/heterogenitatea mobilității electroforetice ale proteinelor care din punct de vedere
imunologic sunt identice. Astfel, imunoglobulinele G dau, în mod normal, un arc lung.
 În ultima decadă, ca instrumente de cercetare, metodele imunoelectroforetice au fost, în
mare parte, înlocuite prin tehnicile de imunotransfer. Totuși, în prezent, imunoelectroforeza este
mai frecvent utilizată în aplicaţiile clinice, reprezentând în acest moment metodele de bază a
analizelor serologice.
Figura 3.118. prezintă cele trei principii de bază ale imunoelectroforezei.

Figura 3.118. Cele trei principii ale imunoelectroforezei: A, Contraimunoelectroforeza conform Bussard (1959):
într-un gel de agaroză care manifestă o electroendosmoză mare, tamponul este stabilit la un pH=8,6, astfel că
anticorpii nu posedă nici o sarcină netă. Proba şi anticorpii sunt plasați în godeuri şi se mișcă unul faţă de celălalt:
antigenele care posedă sarcină migrează electroforetic iar anticorpii se mișcă prin intermediul
fluxululuielectroosmotic. B, Electroforeză zonală/imunodifuzie în conformitate cu Grabar şi Williams (1953): la
început se realizează o electroforeză zonală într-un gel de agaroză, urmată de difuziunea fracţiuniilor de antigen spre
anticorpul care se află depus în godeurile realizate paralel cu direcția câmpului electric; C, Tehnica tip “rachetă”, în
conformitate cu protocolul dezvoltat de Laurell (1966), precum şi metodele conexe acestuia: antigenele migrează într-
un gel de agaroză, care conţine o concentraţie determinată de anticorp. Ca şi în metoda contraimunoelectroforetică
anticorpii nu posedă sarcină datorită tamponului ales, astfel, că în mementul în care proba (antigenul) migrează, ea se
va lega la anticorp până la un raport la care concentraţiile corespund punctului de echivalenţă al imunocomplexului.
(După Westermeier, 2005).
 Prin utilizarea acestor tehnici un biochimist poate realiza un diagnostic serologic
detaliat, inclusiv estimări destul de precise ale concentraţiilor de antigeni, printr-un set de
modele imunoelectroforetice (Garfin, 1995).
Bibliografie
*** Protocols in Molecular biology. Rocket Immunoelectrophoresis. GeNeiTM Teaching Kit Manual, Bangalore
Genei, 2007, https://sites.google.com/site/dhruvbiotech/Home/protocols-in-molecular-biology.
Alper, C. A., Abramson, N., Johnston, R. B. Jr., Jandl, J. H., Rosen, F. S. (1970) Studies in vivo and in vitro on an
abnormality in the metabolism of C3 in a patient with increased susceptibility to infection. J. Clin. Invest. 49:1975-
1985.
Alper, C. A., Propp, R. P., Watson L. (1968) Genetic polymorphism of the third component of human complement
(C’3). J. Clin. Invest. 47:2181-2191.
Alper, C. A., Robin, N. J., Refetoff, S. (1971) Genetic polymorphism in rhesus C3 and Gc globulin. J. Immunol.
107:96-98.
Andrews, A. T. Electroforeza: Teorie, tehnici și aplicații biocimice și clinice, Editura Tehnică, 1996. traducere
după Andrews, A. T., Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical and Clinical Applications, 2nd ed.
Oxford University Press, Oxford, 1986.
Andrews, A. T. Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical and Clinical Applications, 2nd ed. Oxford
University Press, Oxford, 1986.
Arvilommi, H. (1972) Studies on serum Pi- and C3-polymorphism in Finland. Acta Pathol. Microbiol. Scand.,
Sect. B. Suppl. 234:1-50.
Aryan, D. A., Shaw, L. M. (1973) Two-directional immunoelectrophoresis: Technique and applications in the
clinical laboratory. Separ. Sci. 8:23-142.
Axelsen, N. H. (1971) Human precipitins against a micro-organism (Candida albicans) demonstrated by means of
quantitative immunoelectrophoresis. Clin. Exp. Immunol. 9:749-752.
Axelsen, N. H. Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques. Scand. J. Immunol., 17, Suppl. 10.
Blackwell, ed., Oxford, 1983.
Axelsen, N. H., Kirkpatrick, C. H. (1973) Simultaneous characterization of free Candida antigens and Candida
precipitins in a patient’s serum by means of crossed immunoelectrophoresis with intermediate gel. J. Immunol.
Methods 2:245-249.
Axelsen, N. H., Svendsen, P. J. (1971) Candida precipitins characterized by a modified antigen-antibody crossed
electrophoresis. Protides Biol. Fluids, Proc. Colloq. 19:561-564.
Bach, S., Ruddy, S., McLaren, J. A., Austen, K. F. (1971) Electrophoretic polymorphism of the fourth component
of human complement (C4) in paired maternal and foetal plasmas. Immunology 21:869-878.
Bergrahm, B. (1973) The ExaPhor ready-made electro-immunoassay plate-a new tool for the clinical
immunologist. Sci. Tools 20:21-36.
Bjerrum, O. J., Ingild, A., Lowenstein,H., Weeke, B. (1973) Quantitation of human IgG by rocket
immunoelectrophoresis at pH 5 by use of carbamylated antibodies. A routine laboratory method. Clin. Chim. Acta
46:337-343.
Bog-Hansen, T. C., Svendsen, P. J., Bjerrum, O. J., Nielsen, C. S., Ramlau, J. (1974) Preparative isotachophoresis
of membrane proteins in solubilizing and dissociating media. Protides Biol. Fluids, Proc. Colloq. 22:679-683.
Briscoe, W. A., Kueppers, F., Davis, A. L., Beam, A. G. (1966) A case of inherited deficiency fo serum alpha a-1-
antitrypsin associated with pulmonary emphysema. Amer. Rev. Resp. Dis. 94:529-539.
Brogren, C. H., Bogt-Hansen, T. C., Just Svendsen P., Bjerrum, O. J. (1975) Antisera against purified asialo-
orosomucoid and a sialocholinesterase. Scand. J. Immunol. 4:59-65.
Bussard A. (1959) [Description of a technic simultaneously combining electrophoresis and immunological
precipitation in gel: electrosyneresis]. Biochim Biophys Acta. 34:258-260.
Catsimpoolas, N. (1973) Immuno-isoelectrofocusing. Ann. N. Y. Acad. Sci. 209:144-146.
Claman, H. N., Merrill, D. A., Hartley, T. F. (1967) Salivary immunoglobulins: normal adult values and
dissociation between serum and salivary levels. J. Allergy 40:151-159.
Clarke, H. G. M., Freeman, T. (1966) A quantitative immuno-electrophoresis method (Laurell electrophoresis).
Protides Biol. Fluids, Proc. Colloq. 14:503-509.
Clarke, H. G. M., Freeman, T. (1968) Quantitative immunoelectrophoresis of human serum proteins. Clin. Sci.
35:403-413.
Crowle, A. J. (1973) Two-dimensional electroimmunodiffusion. Exp. Physiol. Biochem. 6:183-200.
 Crowle, A. J., Atkins, A. A., Revis, G. J. (1974) Reversed electroimmunodiffusion for quantitating precipitins. J.
Immunol. Methods 4:173-188.
Crowle, A. J., Jarrett, K. S. (1972a) 2-D single electroimmunodiffusion: A simplified miniaturized technique. Fed.
Proc. 31:807.
Crowle, A. J., Revis, G. J., Jarrett, K. (1972b) Preparatory electroimmunodiffusion for making precipitins to
selected native antigens. Immunol. Commun. 1:325-336.
Culliford, B. J. (1964). Precipitin reactions in forensic problems. Nature (Lond.) 201:1092-1094.
Darcy, D. A. (1972) A general method of increasing the sensitivity of immune diffusion. Its application to CEA.
Clin. Chim. Acta 38:329-337.
Edwards, E. A. (1971). Immunologic investigations of meningococcas disease. I. Group specific Neisseria
meningitidis antigen present in the serum of patients with fulminant meningococcaemia. J. Immunol. 106:314-317.
Fuller, J. M., Keyser, J. W. (1972) Some technical aspects of quantitative immunoelectrophoresis of human serum
and cerebrospinal fluid. Clin. Chem. 18:625-629.
Ganrot, P. O., Nilehn, J.-E. (1968a) Plasma prothrombin during treatment with dicumarol. II. Demonstration of an
abnormal prothrombin fraction. Scand. J. CIin. Lab. Invest. 22:23-28.
Ganrot, P.O., Nilehn, J.-E. (1968b) Immunochemical determination of human prothrombin. Scand. J. Clin. Lab.
Invest. 21:238-244.
Garfin, D. E. Electrophoretic Methods. pp 53-109 in Glasel JA and Duetscher MP (eds) Introduction to
Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research, Academic Press, San Diego, 1995.
Garvey, J. S., Cremer, N. E., Sussdorf, D. H. "Methods in Immunology: A Laboratory Text for Instruction and
Research." Benjamin/Cummings, Reading, MA, 1977.
Giebel, W., Saechtling, H. (1973) A combination of microdisc electrophoresis with antigen-antibody crossed
electrophoresis. Identification and quantitative determination of individual serum proteins. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol.
Chem. 354:673-681.
Grabar, P., Williams, C. A. (1953) Méthode permettant l'étude conjuguée des propriétés électrophorétiques et
immunochimiques d'un mélange de protéines. Application au sérum sanguin. (Method permitting the twin study of
electrophoretic and immunochcmical properties of a mixture of proteins. Application to blood serum.) Biochim.
Biophys. Acta 10:193-194.
Greenwood, B. M., Whittle, H. C., Dominic-Rajkovic, O. (1971). Counter-current immunoelectrophoresis in the
diagnosis of meningococcal infections. Lancet 2:519-521.
Grubb, A. (1970) Quantitation of immunoglobulin G by electrophoresis in agarose gel containing antibodies.
Scand. J. Clin. Lab. Invest. 26:249-255.
Grubb, A. (1972) Quantitative determination of the distribution of the specific antibodies of antisera subjected to
gel tlectrophoresis. Immunochemistry 9:635-645.
Grubb, A. (1973) Preparation of electroendosmosis-free agarose gel and exemplification of its use in crossed
immunoelectrophoresis. Anal. Biochem. 55:582-592.
Grubb, A. O. (1974) Crossed immunoelectrophoresis and electroimmunoassay of IgM. J. Immunol. 112:1420-
1425.
Hallen, J., Laurell, C.-B. (1972) Plasma protein patterns in cirrhosis of the liver. Scand. J. Clin. Lab. Invest.
29:97-103.
Hartley, T. F., Merrill, D. A., Claman, H. N. (1966) Quantitation of immunoglobulins in cerebrospinal fluid. Arch.
Neurol. 15:472-479.
Haupt, H., Bichler, K. H., Becker, W. (1973) Characterization and immunochemical quantitation of human
uromucoid. Protides Biol. Fluids, Proc. Colioq. 21:529-535.
Haupt, H., Bichler, K. H., Becker, W. (1973) Characterization and immunochemical quantitation of human
uromucoid. Protides Bioi. Fluids, Proc. Colloq. 21:529-535.
Johansson, B. G., Hjerten,S. (1974) Electrophoresis, crossed immunoelectrophoresis, and isoelectric focusing in
agarose gels with reduced electroendosmotic flow. Anal. Biochem. 59:200-213.
Johansson, B. G., Stenflo, J. (1971) Polyacrylamide slab electrophoresis followed by electrophoresis into
antibody-containing agarose gel. Anal. Biochem. 40:232-236.
Johansson, B. O. (1972) Agarose gel electrophoresis. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 29:7-19.
Keyser, J. W. (1972) Immunoelectrophoresis-applications and recent developments. Chem. Brit. 8:480-483.
Kindmark, C.-O. (1971) Stimulating effect of C-reactive protein on phagocytosis of various species of pathogenic
bacteria. Clin. Exp. Immunol. 8:941-948.
Kindmark, C.-O., Thorell, J. I. (1972) Quantitative determination of individual serum proteins by
radioelectroimmunoassay and use of 125I-labelled antibodies (application to C-reactive protein). Scand. J. Clin. Lab.
Invest. 29:49-53.
Kohn J. (1970) Method for the detection and identification of alpha fetoprotein in serum. Technical methods. 733-
735. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC476880/pdf/jclinpath00088-0085.pdf
Kostner, O., Holasek, A. (1972) Influence of dextran and polyethylene glycol on sensitivity of two-dimensional
immunoelectrophoresis and electroimmunodiffusion. Anal. Biochem. 46:680-683.
 Kroll, J. (1968) Quantitation of protein by electrophoresis in a cellulose acetate membrane impregnated with
antiserum. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21:187-189.
Kroll, J. (1969) Comparison of the antibody content in polyvalent antisera by an immunoelectrophoretic
technique. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 23:227-230.
Laas, T. (1972) Agar derivatives for chromatography, electrophoresis and gel-bound enzymes. II Charge-free
agar. J. Chromatogr. 66:347-355.
Laurell, C.-B. (1965a) Antigen-antibody crossed electrophoresis. Anal. Biochem. 10:358-361.
Laurell, C.-B. (1965b) Electrophoretic microheterogeneity of serum α-antitrypsin. Scand. J. Glin. Lab. Invest.
17:271-274.
Laurell, C.-B. (1966a) Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in antibody-containing agarose gel.
Protides Biol. Fluids, Proc. Colloq. 14:499-502.
Laurell, C.-B. (1966b) Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in agarose gel containing antibodies.
Anal. Biochem. 15:45-52.
Laurell, C.-B. (1972) Electroimmunoassay. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 29:21-37.
Laurell, C.-B., Persson, U. (1973) Analysis of plasma α1-antitrypsin variants and their microheterogeneity.
Biochim. Biophys. Acta 310:500-507.
Li, X. A., Hatanaka, K., Ishibashi-Ueda, H., Yutani, C., Yamamoto, A. (1995) Characterization of Serum Amyloid
P Component From Human Aortic Atherosclerotic Lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology
15:252-257.
Lizana, J. A. Immunoelectrophoresis. In "Protein Purification. Principles, High Resolution Methods, and
Applications" (J.-C. Janson and L. Ryden, eds.), pp. 404-427. VCH, Weinheim, 1989.
Lopez, M., Tsu, T., Hyslop, N. E., Jr. (1969) Studies on electroimmunodiffusion, immunochemical quantitation of
proteins in dilute solutions. Immunochemistry 6:513-526.
Marchalonis, J. J., Warr, G. W. "Antibody as a Tool: The Applications of Immunochemistry." Wiley, New York,
1982.
Merrill, D., Hartley, T. F., Claman, H. N. (1967) Electroimmunodiffusion (EID): A simple, rapid method for
quantitation of immunoglobulins in dilute biological fluids. J. Lab. Clin. Med. 69:151-159.
Mihăiescu G. Imunologie și imunochimie. Editura Universității București, 2003. http://ebooks.unibuc.ro
/biologie/mihaiescu/1a.htm
Mihăiescu G. Imunologie și imunochimie. Editura Universității București, 2001, http://www.justmed.eu
/files/mihaescu.pdf
Miller, J. N., Mutzelberg, I. D. (1973) Laurell electrophoresis on cellulose acetate. J. Chromatogr. 75:165-168.
Monthony, J. F., Wallace, E. G., Allen, D. M. (1978) A Non-Barbital Buffer for Immunoelectrophoresis and Zone
Electrophoresis in Agarose Gels. Clin. Chem. 24:1825-1827.
Ohlsson, K. (1971) Isolation and immunochemical studies of dog trypsin. Biochim. Biophys. Acta 251:450-455.
Pizzolato, M. A. (1973) Two-dimensional immunoelectrophoresis on cellulose acetate: Improved method for
routine protein estimation. Clin. Chim. Acta 45:207-214.
Platt, H. S., Sewell, B. M., Feldman, T., Souhami, R. L. (1973) Further modifications of the two dimensional
electrophoretic technique of Laurell. Clin. Chim. Acta 46:419-429.
Prince, A. M., Burke, K. (1970). Serum hepatitis antigen (SH): rapid detection by high voltage
immunoelectroosmophoresis. Science 169:593-595.
Propp, R. P., Alper, C. A. (1968) C’3 synthesis in the human fetus and lack of transplacental passage. Science
162:672-673.
Quast, R. (1971) The electroosmotic flow in agarose gels and the value of agarose as stabilizing agent in gel
electrofocusing. J. Chromatogr. 54:405-412.
Rebeyrotte, P., Koutsoukos, A., Labbe, J.-P. (1969) Modifications de la methode d’immunoelectrophorese
quantitative de Laurell, Mise en evidence des γ-globulines. C. R. Acad. Sci. Ser. D. 269:531-534.
Ressler, N. (1960) Electrophoresis of serum protein antigens in an antibody-containing buffer. Clin. Chim. Acta
5:359-365.
Rosenfeld, S. I., Ruddy, S., Austen, K. F. (1969), Structural polymorphism of the fourth component of human
complement. J. Clin. Invest. 48:2283-2292.
Saravis, C. A., Bonacker, L. (1970) Membrane-complement fixation test for hepatitis associated antigen. Nature
228:61-62.
Schuller, E., Delasnerie, N., Moreno, P., Tompe, L. (1972 a) Electro-immunodiffusion des proteines du liquide
cephalorachidien. Dosage de l’ α1-lipoproteine, de la β1E (C’4) et de la β2 glycoproteine I. Clin. Chim. Acta 39:233-
238.
Schuller, E., Lefevre., M., Tompe, L. (1972 b) Electroimmunodiffusion of α2M, IgA, and IgM in nanogram
quantities with a hydroxyethylcellulose-agarose gel: Applications to unconcentrated CSF. Clin. Chim. Acta 42:5-13.
Skude, O., Jeppsson, J.-O. (1972) Thin layer electrofocusing followed by electrophoresis in antibody containing
gel. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 29:55-58.
Steinbuch, M., Audran, R. (1969) The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid. Arch.
Biochem. Biophys. 134:279-284.
 Steinbuch, M., Audran, R., Pejaudier, L. (1970) Isolement d’immunoglobulines γ 1 et γ2 des plasmas de chevre, de
mouton et de boeuf. C. R. Soc. Biol. Seances Paris 164:296-301.
Studd, J. W. W., Blainey, J. D., Bailey, D. E. (1970 a) A study of serum protein changes in late pregnancy and
identification of the pregnancy zone protein using antigen antibody crossed immunoelectrophoresis. J. Obstet.
Gynaecol. Brit. Commonw. 77:42-51.
Studd, J. W. W., Starkie, C. M., Blainey, J. D. (1970 b) Serum protein changes in the parturient mother, fetus and
newborn infant. J. Obstet. Gynaecol. Brit. Commonw. 77:511-517.
Svendsen, P. J., Axelsen, N. H. (1972) A modified antigen-antibody crossed electrophoresis characterizing the
specificity and titre of human precipitins against Candida albicans. J. Immunol. Methods 1:169-176.
Tobin, B. M., Jones, D. M. (1972) Immunoelectroosmophoresis in the diagnosis of meningococcal infections. J.
Clin. Path. 25:583-585.
Verbruggen, R. (1975a) Quantitative Immunoelectrophoretic Methods: A Literature Survey. Clin. Chem. 21:5-43.
Verbruggen, R. (1975b) Subtilopeptidase A Isoenzyme System Interaction with serum components and its
importance for quantitative immunoelectrophoresis. Biochem. J. 151:149-155.
Versey, J. M. B., Slater, L. (1973) Simplified area measurement in two-dimensional immunoelectrophoresis. Ann.
Clin. Biochem. 10:1-3.
Vestergaard, B. F. (1973) Crossed immunoelectrophoretic characterization of Herpesvirus hominis type 1 and 2
antigens. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B 81:808-810.
Watkins, J., Atkins, B., Holborrow, B. J. (1971) Quantitative estimation of protein by electroimmunodiffusion on
Cellogel acetate membranes. J. Clin. Pathol. 24:665-667.
Weeke, B. (1970) The serum proteins identified by means of the Laurell crossed electrophoresis. Scand. J. Clin.
Lab. Invest. 25:269-275.
Westermeier, R. Electrophoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein
Separations. Fourth, revised and enlarged Edition. in collaboration with Gronau, S., Becket, P., Bulles, J., Schickle,
H.,Theßeling, G. ISBN 3-527-30354-5. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA, Weinheim, 2005
http://filetram.com/download/file/307704860/electrophoresis-in-practice-4th-ed-westermeier-r-pdf-rar?
White, G. B. B., Lasheen, R. M., Baillie, M. B., Turner, G. C. (1971). Comparison of three serological methods
for the detection of hepatitis-associated antigen. J. Clin. Path. 24:8-12.
Wild D. The immunoassay handbook, David Wild. Published by Elsevier Ltd. Elsevier B.V., Radarweg 29,
Amsterdam, The Netherlands, 2005.
http://books.google.ro/books?id=_9kEeTjyJdMC&pg=PA99&lpg=PA99&dq=Laurell+Electro+Immunoassay+Scand
&source=bl&ots=2NOK7Ko7Kp&sig=C1xoRQ4m7mbWKacN0OyHOSDhEm4&hl=ro&sa=X&ei=syQtT8aLNof04
QTP5p2wDg&ved=0CFIQ6AEwBDgK#v=onepage&q=Laurell%20Electro%20Immunoassay%20Scand&f=false
 4. METODE DE DETECȚIE POSTELECTROFORETICĂ A
PROTEINELOR
Căutarea unor metode de a vizualiza proteinele rezolvate prin electroforeza pe oricare suport,
de la benzi de acetat de celuloză la geluri de poliacrilamidă datează de la originile electroforezei
în sine. Odată cu introducerea disc-electroforezei, la inceputul anilor 1960 (Davis, 1964), cea
mai frecvent utilizată colorație a proteinelor s-a realizat cu amido black. Cum nevoia de metode
de colorare cu sensibilitate înaltă şi colorare uniformă a crescut pentru a satisface cerinţele de
cuantificare proteine în geluri, colorația cu amido negru a devenit improprie. Colorantul amido
black nu are sensibilitate necesară, calitatea variază de la lot la lot iar de multe ori proteinele se
colorează multicromatic (Wilson, 1983).
O combinaţie a unor idei inteligente şi a unor cercetări aprofundate de-a lungul anilor, a dat
naştere la o serie de tehnici de colorare a proteinelor pe gel înalt sensibile și efective. Acestea
includ alături de populara tehnică de colorare cu Coomassie Blue, metodă de încredere, o
varietate de tehnici de colorare cu săruri de argint, colorarea reversibilă negativă cu săruri ale
unor metale grele, coloranți fluorescenți, precum și evidențierea unor coloranți mai puțini
cunoscuți, cu o serie de proprietăţi interesante. În plus, utilizarea unor soluri de aur coloidal
pentru a colora proteinele pe membrane de transfer este bine caracterizată şi foarte utilă. În cele
din urmă, un dispozitiv de colorare automată a gelurilor este acum pe piata (Brush, 1998).
Colorația cu argint este în prezent considerată drept metoda de colorare cea mai sensibilă,
detectând cantități de mai puţin de 1 nanogram de proteină pe bandă, în comparaţie cu cantitățile
de 30 de nanograme la 100 nanograme pe bandă detectate prin metoda de colorare cu Coomassie
Brillant Blue (Steinberg și colab., 1996a; Steinberg și colab., 1996b). Cu toate acestea,
proteinele pot şi răspund diferit la colorația cu argint. De fapt, unele proteine nu se pot colora în
totalitate, așa că valorile de sensibilitate pentru colorația cu argint pot varia în funcţie de
proteină. Colorația cu argint are, de asemenea, aplicații în colorarea DNA şi RNA, rezolvate pe
geluri de agaroză ori poliacrilamidă (Brush, 1998).
Motivată prin lipsa unei proceduri de colorare adecvat pentru vizualizarea proteinelor
separate prin electroforeza pe benzi de acetat de celuloză, Fazekas St Groth și colaboratorii
(1963) au testat sistematic un numar mare de tehnici standard de colorare utilizate în industria
textilă convenabili ca potențiali coloranți ai proteinelor după electroforeză. În 1963 ei au
introdus în practica electroforetică un colorant acid, Coomassie Brilliant Blue 250, tradițional
utilizat pentru colorarea lânei, colorant convenabil din punct de vedere al gradului crescut de
sensibilitate, a marii intensități a culorii și a absorbanței peakului. În anul 1965, Meyer şi
Lambert (1965) au aplicat cu succes metoda de colorare cu Coomassie Blue descrisă de St.
Groth la detectarea unor proteine din salivă, separate prin electroforeza pe benzi de gel din
acrilamidă. Succesul experimentului de colorare i-a condus pe cercetători în a conchide că
"Commasie Brillant Blue și-ar putea găsi o aplicare în cadrul investigațiilor altor fluide
biologice prin electroforeză în gel de poliacrilamidă".
Metoda lui Griffith (1972) utilizează coloranţii reactiv Remazol pentru colorarea proteinelor
după denaturare, înainte de SDS-PAGE, în timp ce Datyner şi Finnimore (1973) folosesc un
colorant cationic de compoziţie nespecificată pentru precolorarea proteinelor înainte de
electroforeză. Deşi este evident că și alți coloranţi reactivi pot fi utilizați pentru colorarea
proterinelor înainte de electroforeză, colorarea postelectroforetică a proteinelor separate este, de
departe, metoda cea mai preferată şi poate implica una sau mai multe proceduri de vizualizare.
Acestea includ protocoale bazate pe:
 coloranți organici (Wilson, 1983);
 săruri de metale anorganice (Switzer și colab., 1979; Merril și colab., 1979; Merril și
colab., 1982; Merril și colab., 1983; Merril și Harrington, 1984; Hochstrasser și colab., 1988;
Merril, 1990; Oakley și colab., 1980; Wray și colab., 1981; Morrissey, 1981; Sammons și
colab., 1981);
 marcare fluorescentă de grup;
 capacităţi specifice de legare proteină-ligand (Leong și colab., 1992);
 detecția unei activități enzimatice (Gabriel și Gersten, 1992);
 colorare specifică de grup:
o glicoproteine;
o fosfoproteine;
o lipoproteinelor (Gander, 1984; Cutting, 1984; Prat și colab., 1969;
King și Morrison, 1976; Dahlberg și colab., 1969)
 imunocolorarea cu anticorpi (McMaster-Kaye și Kayes, 1974; Gander, 1984; Cutting,
1985; Weber și colab., 1993; Queiroz-Claret și Meunier, 1993; Min și Cowman, 1986;
Campbell și colab., 1983; Wallace și Begovac, 1985; Zacharius și colab., 1969).
Alternativ, proteinele care sunt marcate cu izotopi, fie înainte, fie postelectroforetic pot fi
vizualizate prin utilizarea unor detectori autoradiografici şi fluorografici cu impresionarea unui
film de radiații X (Hahn, 1983; Bonner și Laskey, 1974; Laskey și Mills, 1975). Cu toate acestea,
o metodă specială de detecție a proteinelor va depinde de numeroşi factori, inclusiv, cel mai
important, modului experimental abordat. Alte consideraţii includ uşurinţa şi reproductibilitatea
procedurii de vizualizare, precum şi gradele de sensibilitate şi de precizie în cuantificare
necesare. Deşi au fost descrise o multitudine de protocoale de colorare-vizualizare a enzimelor,
nici una nu este total ideală, deseori fiind necesară utilizarea combinată a tehnicilor de colorare a
proteinelor şi/sau marcarea acestora.
Selecția metodei optime în detecția proteinelor este deosebit de importantă deoarece în
abordările proteomice se măsoară schimbările cantitative în nivelurile expresiei din probele
biologice. Există un număr variat de diverse tehnici. În mod ideal, limita de detecție trebuie să
fie cât mai scăzută cu un raport optim al semnalului și al zgomotului de fond. Pentru
cuantificarea adecvată a proteinelor din probe caracteristice, metoda de detecție trebuie să aibă
un domeniu dinamic larg cu o mare linearitate dintre cantitatea de proteină și intensitatea benzii
proteice colorate. Procedura trebuie să se realizeze ușor, și repede, să fie compatibilă cu analizele
de spectrometrie de masă, să nu fie toxică și să nu polueze mediul înconjurător și nu în ultimul
rând să nu fie foarte costisitoare. Până în prezent nici o metodă de detecție a proteinelor nu
îndeplinește toate aceste necesități, fiind astfel necesară selecția metodei optime din punct de
vedere a problematicii biologice, a tipului de probă ori a necesităților metodologice.
După electroforeza bidimensională (2-D) proteinele sunt detectate în geluri de poliacrilamidă
cu pori de mărime mică, proteinele nefiind înfășurate. Sub astfel de condiții, este simplu a se
preveni difuzia proteinei în și în afara matricei de gel. Fixarea proteinelor prin tratament cu
soluții foarte concentrate de acid tricloracetic nu este uneori necesară.
4.1. EVIDENȚIEREA NESPECIFICĂ A PROTEINELOR PRIN COLORAȚII CU
COMPUȘI ORGANICI SAU CU SĂRURI ANORGANICE
Proteinele, care sunt în mod inerent colorate, cum ar fi hemoglobina ori mioglobina sunt ușor
de observat, direct, în geluri de poliacrilamidă, odaată cu expunerea lor la lumină, în spectrul
vizibil. Din păcate, acest lucru nu este posibil în cazul marii majorități de proteine, a căror
vizualizare necesită utilizarea unor coloranţi. Mulți dintre coloranții organici, iniţial utilizați în
industria textilă, au fost adaptați pentru detectarea de proteine în geluri de poliacrilamidă, fiind
eleborate o multitudine de tehnici de colorare.
În prezent, cele mai frecvent utilizați coloranţi organici includ Amido Black 10B, Procion
Blue RS, Ponceau S, Alcian Blue, Fast Green FCF, Coomassie Brilliant Blue R-250 (R = nuanţă
de roşu, figura 4.1.a.) şi Xilen Cyanine Brilliant G (care se confundă deseori cu colorantul
Coomassie Brilliant Blue G-250, G = nuanţă verzuie, figura 4.1.b.). Mai recent au fost dezvoltate
o serie de proceduri alternative de vizualizare a proteinelor care implică colorarea cu săruri
anorganice (Wirth și Romano, 1995).
4.1.1. COLORAȚIA CU COOMASSIE BRILLIANT BLUE
Tehnica de colorare introdusă de Fazekas de St. Groth și colab., (1963) cu ajutorul
colorantului organic Coomassie Brilliant Blue (CBB) este de departe cea mai utilizată în detecția
proteinelor în geluri de poliacrilamidă, după electroforeză. CBB, un colorant anionic
trifenilmetanic este utilizat în două forme: Coomassie R-250 (de culoare roșie) și Coomassie G-
250 (de culoare verde), ultimul având două grupări metil adiționale (figura 4.1.). În prezența
unui mediu acid, acești coloranți se leagă de grupările amino a proteinelor prin interacții
electrostatice și hidrofobe. În protocoalele originale gelurile sunt plasate pentru o perioadă de
timp într-o soluție de colorare de 0,1% colorant CBB dizolvat într-un amestec de metanol, 45%
(v/v), apă, 45% (v/v) și acid acetic 10%; background-ul se decolorează într-un amestec alcătuit
din metanol, 25% (v/v), apă, 65% (v/v) și acid acetic 10%.

The Coomassie dyes (R-250 and G-250) bind to proteins through ionic interactions
between dye sulfonic acid groups and positive protein amine groups as well as through
Van der Waals attractions. Coomassie R-250, the more commonly used of the two, can
detect as little as 0.1 ug of protein. Though less sensitive, Coomassie G-250 can be used
in place of the R-250form to create a rapid and convenient staining procedure. This
capability of G-250 is due to its particular properties. Coomassie G-250 manifests a
leuco form below pH 2. Solutions of the dye, dark blue black at pH 7, turn a clear tan
upon acidification. The leuco form recovers its blue color upon binding to protein,
apparently due to the more neutral pH of the environment around the protein molecule.
Under proper conditions, a gel placed in an acidified solution of Coomassie G-250 will
manifest blue protein bands on a light amber background. The bands develop rapidly and
there is no need to destain, for the background color is so light as to be essentially clear.
This stain is less sensitive than Coomassie R-250 protocols, detecting 0.5 µg of most
proteins. The loss in sensitivity is offset by the speed and convenience of the protocol,
which saves up to 11 hours versus the most sensitive R-250 procedures.
 Figura 4.1. Coloranții trifenilmetanici Coomassie Brillant Blue R-250 (CBB-G 250, de culoare roșie, a) și
Coomassie Brillant Blue G-250 (CBB-G 250, de culoare verde, b)
The two Coomassie blue dyes, R-250 and G-250, differ by only two methyl groups. In
function, the more popular Coomassie R-250 is more sensitive while G-250 is more
convenient.

Uneori metanolul se înlocuiește cu etanol ori izopropanol. Practica a arătat că această

procedură nu este reproductibilă și nu este demnă de încredere în cuantificare, deoarece în
prezența unui alcool o serie de proteine sunt eliberate din complexul lor cu colorantul în procesul
de decolorare precum și faptul că o serie de proteine (precum colagenul) se decolorează mai
repede decât gelul de poliacrilamidă. Colorația cu CBB coloidal se arată mai reproductibilă și
poate atinge o mare sensibilitate, în condițiile în care se aplică suficient sau în mod repetat.
Aceasta nu este o metodă de decolorare a background-ului. Datorită faptului că această metodă
este de tip „endpoint” se obțin rezultate înalt reproductibile. Procedura cea mai utilizată este
protocolul îmbunătățit al lui Neuhoff și colab. (1988). În prima etapă gelul este plasat într-o
soluție de fixare (acid o-fosforic, 1,3% (w/v) și metanol, 20% (v/v) preparată în apă) timp de o
oră. Soluția de colorare este preparată prin adăugarea lentă a 100 g de sulfat de amoniu la 980 ml
de soluție de H3PO4, 2% (w/v) până la completa dizolvare. Se adaugă apoi 1 g CBB G-250
dizolvat în 20 ml de apă. Această soluție de colorare nu trebuie filtrată, în schimb trebuie agitată
înainte de utilizare. Colorarea se realizează cu 160 ml de soluție de colorare plus 40 ml de
metanol peste noapte pe un shaker orbital. În continuare gelul este plasat într-o soluție de
neutralizare alcătuită din tampon Tris/H3PO4, 0,1 moli/l, pH=6,5, timp de 3 minute. Gelul este
apoi clătit timp de maxim 1 minut intr-o soluție apoasă de metanol 25% (v/v) Complexul
proteină–colorant este stabilizat prin plasare timp de o zi într-o soluție apoasă de sulfat de
amoniu, 20% după care colorarea și celelalte trepte se repetă timp de încă două ori. Gelul poate
rămâne în soluția de colorare sau în cea de stabilizare mai multe zile fără vreun efect asupra
rezultatelor. Pentru o sensibilitate optimă cu o limită de detecție de ordinul a câtorva nanograme
per bandă, procedura totală poate dura până la o săptămână.
STANDARD PROTOCOL - COOMASSIE BLUE R-250

1. Gel may be prefixed in 50% MeOH, 10% HoAC, 40% H2O for 30 minutes to
overnight.
2. Stain gel in the above solution, with 0.25% Coomassie Blue R-250, for 2 - 4
hours, until the gel is a uniform blue color. Staining is complete when the gel is
no longer visible in the dye solution. Prior to complete staining, the gel will
appear as a lighter area against the dark staining solution.
3. Destain for 4 - 24 hours in 5% MeOH, 7.5% HOAC, 87.5% H2O. Bands will
begin to appear in 1 - 2 hours. Destain until background is clear. Note: This
method will detect as little as 0.1µg/band.
4. Store gels in 7% HOAC.

Modificarea realizată de Anderson și colab., (1991) este mai puțin laborioasă, dar poate da
rezultate comparabile în ceea ce privește sensibilitatea. În primul rând gelul este fixat pentru cel
puțin 3 ore într-o soluție etanol, 50% (v/v)/acid fosforic, 3% (w/v) după care gelul se spală de
trei ori timp de 29 minute cu apă. După o preincubare timp de o oră într-o soluție metanol, 34%
(v/v)/acid fosforic, 3% (w/v)/sulfat de amoniu, 17% (w/v), se adaugă 0,53g Coomassie Brilliant
Blue G-250 pudră la 1,5 l soluție. Gelul este colorat timp de 4–5 zile pe un shaker orbital iar end-
point-ul se atinge după 4–5 zile. În continuare gelul este spălat câteva minute cu apă pentru
îndepărtarea colorației de fond. Ca atare, prin această procedură, la gelurile cu o grosime de 1,5
mm se atinge o limită de detecție de aproximativ 15 ng per spot/bandă.
O altă procedură utilizată este colorația rapidă cu soluție fierbinte de CBB 0,025% (w/v).
Colorantul CBB R-250 se dizolvă în acid acetic 10% (v/v). Procedura se realizează prin incubare
la 50oC într-un vas metalic acoperit, timp de 15 minute ori soluția de colorare, încălzită la 90oC,
este turnată peste gel aflat într-un vas de oțel acoperit cu capac. În continuare vasul acoperit se
plasează într-un shaker de laborator timp de 10 minute. Decolorarea se produce prin plasarea
gelului într-un vas, într-o soluție de acid acetic 10% pentru cel puțin 2 ore la temperatura
camerei. Soluția este schimbată de mai multe ori și reciclată prin trecerea ei printr-un filtru la
care se adaugă un cartuș de cărbune activ, ori se plasează un prosop de hârtie în soluția de
decolorare pentru a adsorbi colorantul. Soluțiile de colorare și decolorare pot fi utilizate repetat;
totuși, sensibilitatea nu este la fel de înaltă precum cea obținută prin cele două proceduri
coloidale.
RAPID PROTOCOL - COOMASSIE BLUE R-250

1. Fix gel in 25% IPA, 10% HOAC in water for 30 - 60 minutes.

2. Stain gel in 10% acetic acid in water, containing 60 mg/L of Coomassie Blue R-
250. Bands will appear in 30 minutes. Allow staining to proceed until desired
band intensity is reached. In this protocol, background staining is low due to the
very low dye concentration used.
3. Destain gel in 10% acetic acid for 2 hours or more. Store gels in 7% HOAC.

Avantajele metodelor de colorare cu Coomassie sunt reprezentate de legarea cantitativă a

colorantului la proteine, prețul scăzut și buna reproductibilitate. Pentru analizele spectrometrice
de masă colorantul este îndepărtat din gel cu bicarbonat înainte de digestia triptică. Când
proteina este detectată cu CBB, ca regulă, întreaga proteină este prezentă pentru analizele
spectrometrice de masă, corespunzătoare prin MALDI ToF.
Dezavantajele acestor metode sunt date de timpii lungi de colorare, relativa mică sensibilitate
și domeniul dinamic de linearitate îngust.
Reisner și colab. (1975) și Wilson (1983) au descris o modificare a acestei proceduri în care
soluția de CBB-G 250 în concentrație de 0,04% (w/v) este preparată în acid percloric 3,5%.
Gelurile sunt imersate într-un volum sufficient de soluție de colorare astfel încât raportul dintre
volumul de apă din gel și volumul de soluție de colorare să fie de 3:5. În acid percloric 3,5%
CBB-G este orange dar în momentul legării de protein culoarea sa se modifică în albastru.
Colorarea este foarte rapidă și proteinele destul de abundente devin vizibile în circa 10 secunde,
iar cele mai multe benzi se vizualizează în 10 minute. După cum numai proteinele se colorează,
decolorarea fondului de gel nu este necesară. Senzibilitatea poate fi crescută de trei ori prin
plasarea gelurilor în soluție apoasă de acid acetic 5% după colorare când benzile coloarate se
intensifică iar background-ul devine albastru pal. Pentru stocarea pe termen lung gelurile pot fi
plasate într-o soluție de acid percloric 3,5% care conține CBB-G 250, 0,005%. Această metodă,
ca atare nu este potrivită pentru SDS-PAGE deoarece prin legarea SDS la proteină se produce o
interferență marcantă asupra interacției colorant-proteină (Wirth și Romano, 1995).
În scopul creșterii sensibilității, au fost realizate și alte îmbunătăţiri la protocolul original de
colorare a proteinelor cu Coomassie Brillant Blue (Fazekas de St Groth și colab., 1963). Pentru a
spori puterea de detecție a proteinelor mai puțin abundente prin transformarea moleculelor de
colorant în particule coloidale, au fost introduse două modificări majore:
  Neuhoff și colaboratorii (1988), au adăugat metanol, 20% şi concentraţii mari de sulfat
de amoniu în soluția de CBB G-250, de colorare de bază (Neuhoff și colab., 1988) şi în 2004,
Candiano și colaboratorii (2004) au realizat colorația ”Blue Silver” folosind CBB G-250
împreună cu acid fosforic, în prezenţă de sulfat de amoniu şi metanol. Cu toate acestea, aceste
modificări permit doar o scădere a limitei de detecție până la aproximativ 10 ng de
proteină/bandă.
 Un protocol care utilizează colorarea proteineor cu Coomassie coloidal a fost publicat
de Kang și colaboratorii (2002), în care s-a modificat protocolul lui Neuhoff de utilizare a CBB
coloidal în relație cu proprietățile sale complexante. Astfel, se utilizează în loc de sulfat de
amoniu, sulfat de aluminiu, iar metanolul este înlocuit cu mai puţin toxicul etanol. Studiul noii
colorații bazate pe săruri de aluminiu realizat de Kang arată o sensibilitate superioară, limita de
detecție scăzând până la 1 ng/bandă (fosforilază b) cu o variaţie mică a sensibilității, în funcţie
de proteinele studiate (Dyballa și Metzger, 2009). Figura 4.2 dovedește marea sensibilitate a
colorației bazate pe săruri de aluminiu descrise de Kang comparativ cu protocolul convențional
de colorare cu CBB G-250, Sypro Ryby ori colorația cu argint.

Figura 4.2. Colorația proteică pentru fetuine (proteine sanguine cu rol de legare, sintetizate în ficat și secretate în
fluxul sanguin) prin (A) protocolul cu Coomassie coloidal descris de Kang (fără decolorare) comparativ cu (B) o
colorație convențională cu CBB G-250 (40% metanol și 10% acid acetic), (C) Sypro Ryby și (D) colorație cu argint
descrisă de Shevchenko și colab. (1996). Cantitatea de proteină a fost diluată până la 2 ng și a fost migrată prin SDS-
PAGE.
Din punct de vedere al utilității, pe lângă limitele de detecţie îmbunătăţite realizate prin
protocolul de colorare descris de Kang și colab. (2002), această metodă de colorare care
utilizează Coomassie oferă mai multe caracteristici care o face preferenţială față de tehnicile de
colorare cu descrise de Neuhoff și colab. (1988), ori Candiano și colab. (2004), chiar şi în
protocoale analizate prin fluorescenţă:
 Fixarea şi colorarea se realizează într-o singură etapă;
 Sunt necesare nu mai mult de 4 etape în total;
 Primele rezultate ale colorării sunt vizibile rapid (în majoritatea cazurilor, în mai puţin
de 20 de minute);
 Procedura necesită doar 2 ore pentru evidențierea completă în proporție de 80%;
 Rezultă un background (fond) minim;
 Procedura de marcare este foarte reproductibilă (este o metodă ”endpoint„);
 Nu se mai manipulează un alcool toxic (metanolul este înlocuiet cu etanol);
 Soluţia devine aproape inodoră (nu se utilizează acid acetic);
 Se utilizează CBB G-250 în concentraţii scăzute.
În sumar, formula de colorare cu CBB este destul de convenabilă, relativ nepericuloasă,
prietenoasă față de mediu şi ieftină. Mai mult, tehnica de colorare descrisă de Kang și colab.
(2002) este complet compatibilă cu analizele de spectrometrie de masă, fiind excelentă pentru
din punct de vedere a rapidității şi detecției analitice a proteinelor pe gel, fiind utilă chiar şi în
abordări proteomice (Dyballa și Metzger, 2009).
Staining Gels with Coomassie Blue R-250 or Coomassie Blue G-250

STANDARD PROTOCOL - COOMASSIE BLUE R-250

5. Gel may be prefixed in 50% MeOH, 10% HoAC, 40% H2O for 30 minutes to
overnight.
6. Stain gel in the above solution, with 0.25% Coomassie Blue R-250, for 2 - 4 hours,
until the gel is a uniform blue color. Staining is complete when the gel is no longer
visible in the dye solution. Prior to complete staining, the gel will appear as a lighter
area against the dark staining solution.
7. Destain for 4 - 24 hours in 5% MeOH, 7.5% HOAC, 87.5% H2O. Bands will begin to
appear in 1 - 2 hours. Destain until background is clear. Note: This method will detect
as little as 0.1µg/band.
8. Store gels in 7% HOAC.

9. Troubleshooting

RAPID PROTOCOL - COOMASSIE BLUE R-250

4. Fix gel in 25% IPA, 10% HOAC in water for 30 - 60 minutes.

5. Stain gel in 10% acetic acid in water, containing 60 mg/L of Coomassie Blue R-250.
Bands will appear in 30 minutes. Allow staining to proceed until desired band intensity
is reached. In this protocol, background staining is low due to the very low dye
concentration used.
6. Destain gel in 10% acetic acid for 2 hours or more. Store gels in 7% HOAC.

RAPID PROTOCOL - COOMASSIE BLUE G-250 Troubleshooting

1. To make the Coomassie Blue G-250 staining reagent, dissolve 0.2g dye in 100 ml H2O
(this will require warming to approximately 50°C). Cool and add 100 ml 2N H2S04.
Incubate at room temperature 3 hours to overnight, then filter. To filtered solution,
CAREFULLY add 22.2 ml 10N KOH, then add 28.7g TCA. Allow to stand > 3 hours,
then filter again if necessary to obtain an amber-brown solution without blue
precipitate.
2. To stain, immerse gel in above solution. Bands will begin to appear within 15 minutes.
Intensity and sensitivity will continue to improve for several hours.
3. Staining solution is stable for 2 - 3 weeks @ 25°C.

https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/staining-protein-gels-
coomassie-blue
 4.1.2. ALȚI COLORANȚI ORGANICI UTILIZAȚI ÎN EVIDENȚIEREA
POSTELECTROFORETICĂ
Gorovsky și colab (1970) au descris o metodă simplă de colorare a proteinelor cu Fast Green
FCF (food green 3) care pare ușor de utilizat în densitometria cantitativă. Fast Green FCF (figura
4.3.) manifestă o mare linearitate în intensitatea culorii până la 150-200µg/6 mm gel comparativ
cu CBB-R. O proprietate adițională a Fast Green FCF este capacitatea sa de a forma complexe
cu histonele și a forma un complex stabil, proprietate ce-l face un colorant specific de grup
(McMaster-Kaye și Kayes, 1974). Fast Green FCF poate de asemenea să fie utilizat la colorarea
proteinelor pe geluri, după focusare izoelectrică. Opus CBB-R și CBB-G, Fast Green nu se leagă
la amfoliți, colorând astfel numai proteinele (Allen și colab., 1980).

Figura 4.3. Structura chimică a Fast Green FCF, un

colorant fenilmetanic utilizat în practica biochimică la colorarea
totală a proteinelor.

Hong și colab. (1993) au raportat o procedură de colorare a proteinelor în geluri de SDS-

PAGE comparabilă ca sensibilitate cu colorația CBB utilizând acidul 1-(2-hidroxi-4-sulfo-1-
naftilazo)-2-hidroxi-3-naftoic (acidul calconcarboxilic, NN, figura 4.4.).

Figura 4.4. Structura chimică a acidului

calconcarboxilic (acid [1-(2-hidroxi-4-sulfo-l-
naftilazo)-2-hidroxi-3]-naftoic, NN). (După Choi și
colab., 2002).

Procedura poate fi realizată utilizând atât tehnicile de colorare simultană cât și

postelectroforetică. Colorarea simultană utilizează NN, 0,01% în rezervorul superior de tampon
eliminând astfel etapa de postcolorare, și în continuare se permite detectarea mai rapidă și mai
simplă a proteinelor. În urma colorării cu NN se pot detecta aproximativ 10 ng de albumină
serică bovină prin post-colorare ori circa 25 ng BSA prin colorare simultană, comparativ cu o
cantitate de 50 ng, detectabilă prin tehnica de post-colorare ccare utilizează CBB (Hong și
colab., 1993).
4.1.3. COLORAȚIA “STAINS-ALL”
Metoda care utilizează colorantul cationic carbocianinic – bromură de (l-etil-2-[3-(l-etil-
nafto[l,2-d]tiazolin-2-iliden)-2-metilpropenil]nafto[1,2-d] tiazoliu, colorant total, Stains-all,
figura 4.5.) este o tehnică sensibilă utilizată la caracterizarea electroforetică a gelurilor
compozite de agaroză-acrilamidă (Dahlberg și colab., 1969), precum și a gelurilor de
poliacrilamidă care conțin acid hialuronic (Bader și colab., 1972). În plus, Stains-all diferenţiază
fosfoproteinele, cum ar fi cazeina, de proteinele nefosforilate (Green și colab., 1973). Metoda
este potrivită pentru colorarea diferenţiată a acizilor nucleici şi a proteinelor, după cum urmează:
ARN (albastru-violet), ADN (albastru, abs=675nm), proteine (roşu, abs= aprox. 510nm),
mucopolizaharidele acide-culori variate (Andrews, 1988).
Pe baza poziţiei absorbţiei maxime spectrale, au fost diferenţiate mai multe tipuri diferite de
complexe Stains-all cu proteine ori cu alți polielectroliţi,: α (575 nm), β (535 nm), γ (500-510
nm), βα (550 nm), S (470 nm) și J (600-650 nm). colorantul liber, în formă monomerică
absoarbe la 575 nm, ori se află în starea a, în solvenţi organici sau în concentraţii foarte mici în
apă (Bean și colab., 1965; Kay și colab., 1964). În etilen glicol 30% soluție preparată în apă,
colorantul liber absoarbe la 535 şi 575 nm, adică afişează banda β, respectiv banda α (Sharma și
colab., 1989). De exemplu, el produce o culoare albastră, în prezenţa proteinelor care leagă Ca 2+
şi o culoare roşie sau roz, cu alte proteine (Jones și colab., 1979; Jones și Cala, 1981; Campbell
și colab., 1983; Sharma și colab., 1989). În medii diferite, acest colorant cianinic prezintă un
număr de peak-uri modificate ș o singură bandă J la 650 nm (Kumar și colab., 1999).

Figura 4.5. Structura chimică a colorantulului cationic carbocianinic – bromură de (l-etil-2-[3-(l-etil-nafto[l,2-

d]tiazolin-2-iliden)-2-metilpropenil]nafto[1,2-d] tiazoliu, denumit colorant total sau Stains-all (formula brută,
C30H27BrN2S2)
Protocolul obișnuit de colorare prevede utilizarea unei soluții stoc de colorant (care se
prepară în formamidă, 100 mg%). Pentru colorare se utilizează o soluție de lucru alcătuită din:
10 ml soluție stoc de coloare, 10 ml formamidă, 50 ml izopropanol, 1 ml soluție tampon Tris-
HCl, 3,0 M, pH=8,8 și 129 ml de apă (Dahlber și colab., 1969; Allen și Maurer, 1974;
Chrambach și colab., 1967; Peacock și Dingman, 1974). Pentru colorare, se cufundă gelurile în
amestecul de colorare într-un recipient acoperit, la întuneric, peste noapte. Decolorarea se
realizează prin spălări în apă, la întuneric. Expunerea la lumina produce un background galben-
mat. Decolorarea se mai poate realiza prin expunerea gelului la lumină timp de 30 minute. Prin
această tehnică se pot determina pe un gel de poliacrilamidă cantități mai mici de 3 ng (este
cazul unui fragment de ADN) ori 90 ng tARN.
Dintre coloranții organici care posedă proprietatea de a produce o colorație specifică de grup,
“Stains-all”, a fost evidențiat a colora sialoglicoproteinele și fosfoproteinele în albastru și apoape
toate celelalte proteine în roșu (King și Morrison, 1976; Dahlberg și colab., 1969).
4.2. COLORAȚIA CU ARGINT
Pentru majoritatea aplicaţiilor, vizualizarea proteinelor cu CBB este suficient de sensibilă. Cu
toate acestea, în cazul în care cineva este interesat de a stabili puritatea absolută a unei proteine
sau doreşte să determine cantitățile de urme dintr-o probă proteică, sunt necesare tehnici de
vizualizare mult mai sensibile. Cu o posibilă excepţie, cea a detecției autoradiografică şi
fluorografice a proteinelor marcate radioactiv, colorarea cu argint oferă cea mai mare
sensibilitate în detectarea unei proteine neradioactive.
Observaţia că azotatul (nitratul) de argint, principalul compus al colorației cu argint, poate
colora sau marca în negru substanţele organice, inclusiv pielea umană, este creditată contelui
Albert von Bollstadt în secolul al XII-lea însă aplicaţiile ştiinţifice de colorare cu argint au fost
inițiate prin metdele histologice de colorare a ţesuturilor proaspete, dezvoltate de C. Krause în
anul 1844 (Merril și colab., 1988). Colorația cu argint a fost introdusă ca metodă generală de
detecție a proteinelor și a altor biopolimeri (ADN ori ARN) separate prin electroforeză pe gel de
poliacrilamidă în anul 1979 (Merril și colab., 1979; Switzer și colab., 1979), ea fiind mult mai
sensibilă decât cea mai frecvent utilizată colorație a proteinelor cu coloranți organici (Coomassie
blue) cu un factor care, pentru proteinele cele mai susceptibile, mai mare de 100 (figura 4.6.) cu
sensibilitate comparabilă, sau chiar mai mare, decât cele autoradiografice, în cazul polipeptidelor
(Wirth și Romano, 1995).
 Figura 4.6. Compararea sensibilității colorației
pentru cei mai utilizați coloranți. Proteine standard: A=
miozină (Mr=200.000); B = β-galactozidaza
(Mr=16.000); C = albumină serică bovină (Mr
=66.000); D= ovalbumină (Mr=45.000); E = anhidrază
carbonică (Mr=31.000); F = inhibitorul tripsinei din
soia (Mr=21.500) s-au separat pe un gel cu T%=10%,
colorându-se cu una din metodele prezentate pe figură.
Concentrațiile proteice sunt în domeniul 25-
5000ng/godeu. (După Wirth și Romano, 1995).

Mecanismele chimice care stau la baza colorării cu argint a proteinelor din geluri sunt relativ
bine înţelese. Practic, detecția proteinelor depinde de legarea ionilor de argint la catenele de
amino-acizi și la grupările sulfhidril şi carboxil primare ale proteinelor (Switzer și colab., 1979;
Oakley și colab., 1980; Merril și colab., 1981, 1986), urmată de reducerea la argint metalic
(Rabilloud, 1990; 1999). Acolo unde are loc reducerea, benzile de proteine sunt vizualizate ca
spoturi imaginea rezultată reprezentând distribuţia proteinelor în gel și care are la bază diferenţa
de potenţial oxido-reductiv dintre zona de gel ocupată de proteine şi site-uri libere, adiacente.
Simple modificări în procedura de colorare cu argint pot schimba echilibrul redox într-un mod
care conduce la vizualizarea benzilor proteice atât ca și colorație pozitivă, cât și ca și colorație
negativă (Merrill și colab., 1986).
Protocoale de colorare cu argint pot fi împărţite în două categorii generale (Merrill, 1990):
1. Cu argint diaminic (metode alcaline de colorare cu argint);
2. Colorare cu nitrat de argint (metode acide de colorare cu argint).
În general, nivelul de detecţie cu ajutorul diverselor proceduri este determinat de cât de
repede benzile de proteine se dezvoltă în relaţie cu background-ul gelului (de exemplu, raportul
dintre semnal și zgomotul de fond). Metodele cu argint aminic sau metodele alcaline au, de
obicei, un background mai mic şi în consecință sunt cele mai sensibile, dar necesită proceduri
extinse ca manoperă și timp. Protocoalele acide sunt mai rapide; cu toate acestea, sunt mai puţin
sensibile. O serie de autori (Sorensen și colab., 2002; Mortz și colab., 2001) au prezentat o
analiză comparativă a sensibilităţii unui număr de proceduri de colorare cu argint. În mod
evident, fiecare protocol are diferite avantaje în ceea ce priveşte timpul necesar, sensibilitate,
cost ori compatibilitate cu alte metode analitice, în special cea de spectrometrie de masă (MS),
tehnică consacrată utilizării în tandem cu gel-electroforeza sau cu metodele cromatografice de
identificare rapidă a proteinelor. Până de curând, de cele mai multe protocoale de colorare cu
argint utilizau glutaraldehida drept sensibilizator, în etapa de fixare și bensibilizare, ceea ce
conducea la introducerea unor modificări chimice în structura proteinelor, prin legarea
încrucișată a două resturi de lizină în cadrul catenei polipeptidice a proteinelor (care afectează
astfel analiza MS prin alterarea capacității de digestie cu tripsină) și prin reducerea capacității de
extracţie a proteinelor din gel (Rabilloud, 1990). În general, colorația cu argint detectează în
principal proteinele de pe suprafața gelului, motiv pentru care analiza acestora prin colorație cu
argint este posibilă.
Astfel, detecția proteinelor prin colorație cu argint este larg utilizată deoarece sensibilitatea ei
este de aproximativ 1 ng per spot, costurile pentru reactivi sunt relativ scăzute, și, deși presupune
o procedură multistadială, rezultatele sunt disponibile relativ repede. Ideal spoturile sunt brun-
închise spre negru pe un background ușor bej. După introducerea colorației cu argint a gelurilor
de poliacrilamidă de către Merrill și colab., (1979) s-au publicat peste o sută de modificări ale
protocolului de colorare (Rabilloud și colab., 1994) În principiu, protocoalele se divid în trei
grupe: colorația rapidă coloidală în prezența acidului tungstosilicic este primul protocol de
colorare cu argint a gelurilor de agaroză descris de Kerenyi și Gallyas (1972) Acest protocol are
sensibilitatea cea mai scăzută față de cele trei grupe, dar este compatibil cu MS.
După Wirth și Romano (1995) procedurile de colorare cu argint pot fi împărţite în trei
categorii de bază (Merril și colab., 1982; Merril și colab., 1983a; Merril și colab., 1983b):
(a) colorarea cu argint diaminic sau argint amoniacal;
(b) colorarea prin reacție chimică, de tip nediaminic;
(c) colorara prin fotoreducerea sărurilor de argint.
Colorațiile diaminice sau cu argint amoniacal utilizează hidroxid de amoniu, pentru a forma
complexe solubile argint-diaminic. Gelurile fixate, care se spală intensiv, pentru a se elimina
excesul de SDS, sunt incubate în această soluţie iar proteinele sunt vizualizate prin acidificarea
mediului de incubare a gelului, de obicei, cu acid citric, în prezenţă de formaldehidă. Această
procedură iniţial dezvoltată de către Switzer și colab. (1979), modificată apoi de către Oakley și
colab. (1980) şi Wray și colab. (1981), este deosebit de fezabilă pentru colorarea proteinelot
separate pe geluri de mai groase de 1 mm. Colorațiile nediaminice sunt în general mai rapide
decât colorația diaminică şi sunt cele mai potrivite pentru geluri mai subțiri de 1 mm (Wirth și
Romano, 1995).
Dezvoltarea culorii în colorația nediaminică are la bază reducerea selectivă a ionilor de argint
la argint metalic de către formaldehidă, la un pH alcalin (Morrissey, 1981; Sammons și colab.,
1981). Colorațiile prin fotoreducerea argintului sunt cele mai rapide și care permit vizualizarea
profilului proteic în 10 de minute după separarea electroforetică (Harrington și Merril, 1984;
Merril și colab., 1984), cu toate acestea, ele sunt cele mai puţin sensibile metode de colorare cu
argint. Prin introducerea a unor etape suplimentare de amplificare sau de reutilizare au fost
făcute o serie de încercări pentru a creşte sensibilitatea de colorare cu argint. Este posibil să se
recoloreze gelurile deja colorate prin introducerea unei oi etape de tratament cu nitrat de argint,
ceea ce conduce la o creştere semnificativă a intensităţii spotului/benzii (Merril și colab., 1982).
Berson (1983) a descris o procedură de amplificarea a intensității colorației cu CBB pe care o
consideră mai rapidă, simplă şi mai eficientă decât recolorarea cu argint. Mai recent
Hochstrasser și colab. (1988) au dezvoltat o metodă monocromatică de colorare cu argint, care,
în esenţă, conduce eliminarea oricărui background.
Se consideră că dezvoltarea culorii în reacțiile fotochimice depinde în principal de două
variabile: dimensiunea particulelor de argint şi media distanței interspațiale dintre două particule
(Merril și colab., 1988). Cu toate acestea, o a doua explicaţie a fost, de asemenea dată pentru
culorile benzilor de proteine din geluri după colorație cu săruri de argint, prin formarea unor
complexe specifice proteină-particulă de argint (Nielsen și Brown, 1984). În acest caz, culorile ar
rezulta probabil din sistemele de legături conjugate formate prin interacţiuni corespunzătoare ale
atomului/atomilor de argint cu grupări funcţionale ale moleculelor de proteine. Studiile lui
Merril și colab., (1988) au demonstrat că există o relație directă între dimensiunile particulelor
de argint asociate la proteine și diferențele de nuanță și culoare a benzilor evidențiate (figura
4.7.). Ei au arătat că nuanțele de culoare ale complexelor argint-proteină din geluri de
poliacrilamidă sunt cauzate de împrăştierea prin difracţie a luminii produsă de particulele de
argint cu dimensiuni caracteristice. Variaţia concentraţiei de proteine poate produce, de
asemenea, schimbări în culoare. În plus, culoarea obținută poate depinde de proprietăţile
intrinseci ale proteinelor individuale. În acest context, Nielsen şi Brown (1984) au arătat că
resturile aminoacizilor din catena proteinelor joacă un rol important în formarea culorii.

Figura 4.7. Electroforegrama a două proteine: albumină serică umană

(banda de sus, notată cu 4) și polipoproteina A-II (banda inferioară, notată
cu 2 şi 5.) separate pe gel de poliacrilamidă și colorate cu argint. Benzile,
de la stânga la dreapta, conţin 80, 40, şi 10 ng de albumină serică umană şi
90, 45, şi 11 ng de apoliproproteină A-II. Particulele de argint prezente în
regiunile numerotate din gel au fost examinate prin microscopie
electronică: Regiunea 1: zonă de background, banda 2, banda principală de
apolipoproteină, cu o culoare maro închis, banda 3, o bandă minoră
albastră, situată în fața benzii principale de apolipoproteină; banda 4,
albumină serică umană, care se colorează în galben; banda 5, bandă
principala de apolipoproteină la o concentraţie mai mică decât proteina din
banda 2; banda 6, o regiune de gel colorată negativ. (După Merril și colab.,
1988).

Principiul unui protocol de colorare cu azotat de argint este următorul: în prima etapă
proteinele sunt fixate; SDS-ul și componentele tamponului sunt îndepărtate prin spălare cu o
soluție de etanol, 40% și acid acetic, 10%. Următoarea treaptă combină legarea încrucișată a
proteinelor din matricea de gel cu ajutorul glutardialdehidei și de sensibilizare cu tiosulfat de
sodiu în prezență de acetat de sodiu. După un număr de spălări cu apă distilată la intervale exacte
de timp, gelul se plasează într-o soluție care conține azotat de argint 0,25% și o cantitate mică de
formaldehidă. Dezvoltarea se realizează cu formaldehidă la o valoare bazică de pH, care se
realizează cu ajutorul carbonatului de sodiu. Reacția este stopată prin plasarea gelului într-o
soluție de acid acetic, 5% ori într-o soluție de EDTA 1,5%. În practică se urmează două
protocoale (Heukeshoven și Dernick, 1985; Blum și colab., 1987) care dau cele mai bune
rezultate cu cea mai mare sensibilitate (sub 100 pg per spot) În condițiile în care spoturile sunt
luate în analiză de spectrometrie de masă, glutardialdehida trebuie să fie omisă din soluția de
sensibilizare și formaldehida din soluția de nitrat de argint (Shevchenko și colab., 1996) În
scopul de a se obține o colorație eficientă, treapta de colorare este realizată printr-o cantitate
dublă de formaldehidă comparativ cu protocoalele standard. Această modificare reduce
sensibilitatea la aproximativ ¼.
Tabelul 4.1. prezintă o metodă de colorare, compatibilă cu spectrometria de masă (nu toate
protocoalele de colorare cu argint au această proprietate) utilizat în analiza proteinelor de către
UNSW Biological Mass Spectrometry and Protein Analysis Laboratory. Colorația este utilă la
colorații de proteine cuprinse în domeniul 1 ng-1 mg. Dacă nu se poate realiza colorația, gelurile
se pot decolora și recolora. Trebuie notat că această metodă este mai sensibilă și mult mai rapidă
decât tehnica cu CBB coloidal, recuperarea peptidelor pentru digestia în gel, proces tipic
spetrometriei de masă fiind crescută (Blum și colab., 1987).
Pentru decolorare se dizolvă 0,4g fericianură de potasiu (K3Fe(CN)6) în 200ml de soluție de
tiosulfat de sodiu (0,2 g/L, soluție preparată în etapa C). Gelul se imersează în această soluție și
se agită până când benzile nu mai sunt vizibile (uneori gelul poate fi ușor galben). În continuare
gelul se spală de 4-5 ori timp de 15 min cu apă milli-Q până când devine transparent și nu mai
prezintă une fond colorat. Urmează apoi recolorarea gelului după protocolul mai sus prezentat
din treapta C (tabelul 4.1.). Gelul poate fi stocat în soluție de acid acetic, 5% la 4°C pentru mai
multe luni înainte de a fi digerat. Alternativ, piesele de gel pot fi stocat uscate.
 Tabelul 4.1. Etapele unui protocol de colorare cu argint (După Blum și colab. 1987)*.

Etape Reactivi Volumul final=100 ml Operare Timp

Etapa A Metanol, 50%; Acid acetic 10% Fixare 30 min

metanol 5% Incubare 15 min

Etapa B
3x5
H2O milli-Q Spălare de 3 ori
min

Tiosulfat de sodiu (Na2S2O3•5H2O) 0,2 g/L proaspăt! rece! Incubare 120 sec
Etapa C
3 x 30
H2O milli-Q Spălare de 3 ori
sec

Azotat de argint (AgNO3) 0,2 g/100 ml proaspăt! rece! Incubare 25 min

Etapa D
3 x 60
H2O milli-Q Spălare de 3 ori
sec

Carbonat de sodiu (Na2SO3) 37%

3 g/100 ml 10 min
Etapa E Formaldehidă Developare
50 µl/100 ml;2 ml/100 ml (max.)
Soluție Na2S2O3•5H2O (sol. C)

Finalizarea
Na2-EDTA (14g / L) 10 min
developării
Etapa F
H2O milli-Q Spălare
* Toate soluțiile și toți reactivii se prepară chiar înainte de utilizare!
Îmbunătăţirea dezvoltării culorii prin tehnica cu argint a fost folosită în scopul identificării
unor proteine (Goldman și colab., 1980; Sammons și colab., 1981; Nielsen și Brown, 1984).
Dezvoltarea culorii în colorația cu argint depinde de multe variabile. De exemplu, este posibil ca
prin scăderea concentraţiei de agent de reducere și prin creșterea consecutivă a timpului de
dezvoltare a culorii, ori prin adăugare de alcalii sau, simpu, prin ridicarea temperaturii să se
obțină o dezvoltare convenabilă a culorii.
Protocoalele care au la bază complexul de argint amoniacal arată în principiu asemănător cu
cele anterioare: fixarea este deseori combinată cu un sensibilizator care în acest caz este naftalen
disulfonatul. După mai multe trepte de spălare, gelul este plasat într-o soluție de argint
amoniacal. Dezvoltarea reacției de culoare se realizează în condiții acide, cu formaldehidă.
Reacția este stopată cu acid acetic și etanolamină. Această procedură a fost introdusă de către
Eschenbruch și Bürk (1982) și apoi îmbunătățită de diverse grupuri cu precădere de către
Rabilloud (1992). Metoda are un moment critic în momentul formării precipitatului de argint
metalic pe suprafața gelului (numit „oglindă”) când urmele de impurități dintr-o soluție pot da
reacție pozitivă. În plus, metoda necesită o cantitate mult mai mare de azotat de argint față de
protocoalele anterioare.
Colorația cu argint fiind o procedură multistadială, și nu o tehnică de tip endpoint,
intensitatea culorii poate varia de la un gel la altul. Utilizarea unui sistem automat de colorare
face posibilă ca metoda să devină mai convenabilă și să i se crească substanțial
reproductibilitatea. Din nefericire colorația cu argint prezintă un domeniu de linearitate extrem
de îngust nefiind astfel de încredere în cuantificarea proteinelor. Un fenomen des observat este
acela că proteinele deosebit de abundente produc spoturi cu un centru gălbui. Acest efect poate fi
reparat prin tonalități de albastru (Berson, 1983), proces care crește sensibilitatea procedurii.
Metoda dezvoltată de Meril și colab. (1981) poate fi de 100 de ori mai sensibilă decât
vizualizarea cu coloranți organici, benzile care conțin 10-100ng de proteină putând fi ușor
observate. În acest protocol, timpul de reacție variază cu grosimea gelului. Etapele colorației cu
argint sunt:
 Se fixează proteinele din gel cu aproximativ 400ml de metanol, 40%, acid acetic, 10%
(v/v) (sau metanol, 40%, acid tricloracetic, 10%) pentru 30 de minute-peste noapte;
 Se fixează de două ori cu 400 ml etanol, 10%, acid acetic, 5% (v/v) pentru 15-30 min;
 Se cufundă gelul timp de 3-10 min. în 200 ml soluție oxidantă (dicromat de potasiu,
0,0034M, acid azotic, 0,0032N);
 Se spală gelul de trei ori timp de 5-10 min ăn 400ml de apă, până când colorația
galbenă se elimină;
 Se cufundă gelul în 200ml de reactiv de argint (azotat de argint, 0,012M) timp de 15-
30min;
 Se spală gelul cu 400ml de apă timp de 1-2 min;
 Se spală gelul timp de aproximativ 1 min în soluție de developare (carbonat de sodiu,
0,28M, paraformaldehidă, 1,85%);
 Se dizlocuie soluția de developat cu soluție proaspătă timp de 5 min;
 Se înlocuiește soluția de developare a doua oară, și se lasă să acționeze până ce
colorația dezvoltată este satisfăcătoare;
 Se stopează reacția prin imersare în acid acetic, 5% (v/v)
Uneori, în regiunea 50-70kDa, se observă dungi verticale ori benzi independente de probă.
Astfel de artefacte au fost atribuite reducerii contaminanților, care din neatenţie, au fost introduși
în probă (Ochs, 1983). Aceștia pot fi eliminați prin adăugare în exces de iodacetamidă în soluția
de probă după tratamentul cu tamponului SDS-reducător (Görg și colab., 1988).
Pentru a vizualiza proteinele care pot fi ulterior recuperate din gel, digerate şi supuse analizei
MS, au fost dezvoltate mai multe adaptări ale procedurii de colorare cu azotat de argint
(Shevchenko și colab., 1996; Yan și colab., 2000).
Pentru a obţine cele mai bune rezultate, anume sensibilitate mare şi un background redus, este
foarte important să se urmeze îndeaproape timpul de incubare de-a lungul tuturor etapelor date în
protocol (Gromova și Celis, 2004). Procedura de evidențiere necesită următoarele soluţii:
1. Soluţia de fixare: etanol (sau metanol), 50%; acid acetic, 12%; formol, 0,05%. Pentru a
prepara 1 litru de soluție se adaugă 120 ml de acid acetic glacial la 500 ml de etanol 96% și
500µl de formaldehidă, 35% (formalina comercială este formaldehidă, 35%). Se aduce volumul
la 1 litru cu apă deionizată. Soluția se păstrează la temperatura camerei.
2. Soluţia de spălare: etanol (sau metanol), 20%. Pentru a obține 1 litru, se adaugă 200 ml de
etanol 96% la 800 ml de apă deionizată. Soluția se păstrează la temperatura camerei.
3. Soluţia de sensibilizare: tiosulfat de sodiu (Na2S203), 0,02% (g/v). Pentru a prepara 1 litru,
se adaugă 200 mg de tiosulfat de sodiu anhidru într-un volum mic de apă deionizată, se dizolvă
şi se aduce la volum final de 1 litru.
4. Soluţia de colorare: azotat de argint (AgNO3), 0,2% (g/v); formaldehidă, 0,076%. Se
prepară proaspăt. Pentru a oține 1 litru, se adaugă 2 g de AgNO3 la o cantitate mică de apă
deionizată. Se adaugă 760 µl de formaldehidă, 35%. Se dizolvă şi se aduce la volumul final cu
apă deionizată. Soluția se răcește la 4oC înainte de utilizare.
5. Soluţia de dezvoltare: carbonat de sodiu (Na2CO3), 6% (g/v); de tiosulfat de sodiu
(Na2S203), 0,0004%; formaldehidă, 0,05% (w/v). Pentru a pregăti 1 litru, se dizolvă 60 g de
Na2CO3 într-o cantitate mică de apă deionizată. În paralel, se dizolvă 4 mg de tiosulfat de sodiu
anhidru într-un volum mic de apă deionizată. Se amestecă cele două soluţii, se adaugă 500 µl de
formaldehidă, 35% şi se aduce la volumul final cu apă. Soluția se poate păstra la temperatura
camerei.
6. Soluţia de finalizare: acid acetic, 12%. Pentru a produce 1 litru, se adaugă 120 ml de acid
acetic glacial la 500 ml de apă deionizată. Se amestecă bine şi se aduce la volumul final cu apă.
Soluția se păstrează la temperatura camerei.
 7. Soluţia de uscare: etanol, 20%. Pentru a obține 1 litru, se adaugă 200 ml de etanol la 800
ml de apă deionizată. Se amestecă bine. Soluția se poate păstra la temperatura camerei.
Etapele procedurii de evidențiere sunt următoarele:
 Fixarea, are rol de a restricţiona difuzia proteinelor separate electroforetic în matricea
de gel şi de eliminare a ionilor de interferenţă ori detergenţilor, prezenți în gel. Ea poate
îmbunătăți sensibilitatea colorației şi conduce la o scăde a backgroundul gelului. Astfel, după
electroforeză, se îndepărtează gelul din casetă şi se plasează într-un vas care conţine un volum
corespunzător de soluţie de fixare. Se imersează gelul în această soluţie timp aproximativ 2 ore.
Operațiunea se poate realiza și peste noapte.
 Spălarea (1). Se varsă soluţia de fixare şi se spală gelul cu etanol 20% timp de 20 min.
Se schimbă soluţia de trei ori pentru a se elimina ionii de detergent rămași. Se recomandă să se
utilizeze o soluţie de etanol 20% în loc de apă deionizată pentru a preveni umflarea gelului, după
cum dimensiunea sa poate fi restabilită prin incubarea gelului într-o soluție de etanol, 20%, timp
de 20 de min în cazul în care este utilizată apa în etapa de spălare.
 Sensibilizarea. Se aruncă soluţia de etanol şi se adaugă un volum suficient din soluţia
de sensibilizare și se incubează timp de 2 min, cu o agitare prin rotaţie, blândă. Această etapă
creşte sensibilitatea şi contrastul la colorare.
 Spălarea (2). Se aruncă soluţia de sensibilizare şi se spală de două ori gelul, timp de
câte 1 min, cu apă deionizată, care se varsă, apoi.
 Colorarea. Se adaugă soluţie de colorare (azotat dfe argint) rece şi se agită timp de 20
de minute, pentru a se permite ionilor de argint să se lege la proteine. Soluţia se adaugă de la un
colţ al vasului (tavei), nefiind indicat să se toarne soluţia de colorare direct pe gel deoarece se
poate obține un background inegal. .
 Spălarea (3). După ce colorarea este completă, se îndepărtează soluţia de colorare şi se
spală gelul, cu un volum mare de apă deionizată timp de 20-60 secunde pentru a se elimina
excesul de ioni de argint nelegați. se repetă spălarea încă o dată. Trebuie avut în vedere că
mărirea duratei de spălarer la 1 minut, de exemplu, conduce la eliminarea ionilor de argint din
gel și care ca rezultat în scădere a sensibilității.
 Spălarea (4). Se clăteşte gelul pentru un timp scurt cu soluţie de dezvoltare, care apoi
se aruncă.
 Dezvoltarea culorii se incubează gelul în 300 ml de soluţie de dezvoltare a culorii
proapătă, pentru 2-5 minute şi se urmărește apariția imaginii benzilor/spoturilor proteice. Reacţia
poate fi oprită de îndată ce este atinsă o intensitate dorită a benzilor.
 Finalizarea se realizează prin stoparea dezvoltării culorii din reacția de reducere odată
cu adăugarea a 50 ml de soluţie de finalizare direct, pe gel, cât timp acesta este încă cufundat în
soluţia de dezvoltare, agitându-se uşor, timp de 10 minute. Finalizarea este terminată când nu se
mai produc bule de CO2.
 Conservarea. Gelurile umede pot fi păstrate în acid acetic 12% la 4oC în pungi de
plastic închise ermetic, sau se introduc într-o soluție de deshidratare timp de 2 ore înainte de
uscarea lor în vid.
La alegerea protocolului de colorare cu argint, este necesar să ne reamintim că nu toate
proteinele sunt colorate în mod egal prin această tehnică. Astfel, mai multe clase de proteine,
încărcate extrem de negativ, inclusiv proteoglicanii şi mucinele, care conţin niveluri ridicate de
reziduuri de zaharuri sulfatate sau unele proteine foarte acide sunt detectate slab prin colorație cu
argint (Goldberg și colab., 1997). Se poate nota că gama dinamică liniară a colorației cu argint
de pata este limitată la aproximativ un domeniu de 10 ori, ceea ce împiedică astfel utilizarea
acestei metode în analiza cantitativă a expresiei unei proteine (Gromova și Celis, 2004). Pe de
altă parte, din cauza toxicității sale, metanolul poate fi înlocuit cu etanol în toate soluţiile de
fixare, cu toate că utilizarea etanolului în combinaţie cu acidul acetic poate conduce la formarea
de acetat de etil, care poate în continuare să interfere la identificarea proteinelor prin
spectrometrie de masă.
Merril și colab. (1988) utilizează următorul protocol de colorare: pentru început, gelurile se
fixează prin incubarea lor timp de 20 de minute într-o soluţie care conţine metanol 50% (vol/vol)
şi acid acetic, 10% (vol/vol). În continuare gelurile se clătesc timp de 20 min, într-o soluție de
fixare alcătuită din metanol, 10% şi acid acetic, 5%. Colorarea re realizează inițial prin tratarea
gelurilor cu o soluţie de 32,6 mM de ditiotreitol, timp de 20 de minute, urmată de imersarea și
agitarea uşoară a gelurilor într-o soluţie de azotat de argint, 12 mM timp de 15 minute. Imaginea
se dezvoltă prin cufundarea și incubarea gelurilor într-o soluție de carbonat de sodiu 0,283 M
care conține formaldehidă (0,5 ml de soluţie de formaldehidă, 37% într-un litru de soluție de
carbonat). Dezvoltarea culorii se finalizează prin spălări repetate în apă deionizată.
În tehnica manuală de evidențiere a biomoleculelor prin colorație cu argint este necesar să se
aibă în vedere și următoare aspecte practice (Gromova și Celis, 2004):
 Pentru a mări sensibilitatea de colorare, este necesară o spălare pentru a se elimina toate
reziduurile acide; extinderea timpului va reduce background-ul în timpul dezvoltării;
 Creșterea perioadei de dezvoltare poate scădea randamentul de evidențiere a peptidelor
pentru analiza ulterioară de spectrometrie de masă. Acest fapt se datorează în principal
necolorării peptidelor din partea internă a gel care sunt apoi eluate de soluțiile utilizate în
continuare la digestia triptică a proteinelor;
 Atunci când se aplică un exces de proteine, poate fi observată o colorare negativă;
 Datorită prezenţei unei concentraţii mari de agent de reducere (2-mercaptoetanol sau
ditiotreitol) în tamponul probei, în unele cazuri, se pot observa benzi artefactuale, cu o masă
moleculară de aproximativ 50-70kDa, precum şi un background cu striaţii sau cu o nuanță
galbenă;
 S-a raportat că pentru analize MS recuperarea de peptide din gel ar putea fi crescută
prin decolorarea benzilor de proteine imediat după procedura de colorare cu argint
(Gharahdaghi și colab., 1999);
Se mai poate adăuga că, în acest moment, sunt disponibile o serie de kit-uri de colorare cu
argint, care oferă o sensibilitate îmbunătăţită şi care sunt compatibile cu analiza ulterioară prin
spectrometrie de masă.
4.3. STRATEGII DE MARCARE POSTELECTROFORETICĂ MULTIPLĂ
SDS-PAGE și focalizarea izoelectrică sunt metode excelente pentru determinarea purității,
precum şi anumite proprietăţi fizico-chimice ale proteinelor specifice, precum masa moleculară
sau punctul izoelectric, dar rareori oferă informaţii în ceea ce priveşte natura biofizică sau
biologică a proteinelor separate. Din acest motiv sunt necesare tehnici analitice auxiliare
electroforezei pentru caracterizarea biochimică a proteinelor, în continuare separate. Colorarea
funcţională de grup (Gander, 1984; Cutting, 1984; Prat și colab., 1969; King și Morrison, 1976;
Dahlberg și colab., 1969) precum şi colorațiile specifice ale activităţilor enzimatice, direct pe
geluri 1D- ori 2D-PAGE, au fost folosite pentru a identifica o gamă largă de proteine (Gabriel și
Gersten, 1992; Gabriel, 1971; Heeb și Gabriel, 1984; Gersten și Gabriel, 1992).
Dezvoltarea anticorpilor de mare afinitate față de proteine pecifice, a fost larg abordată în
identificarea unor proteine specifice, deşi utilizarea lor în „situ”, îndirect, în geluri de
poliacrilamidă este limitată din cauza difuziunii lor lente în matricea de gel (Wirth și Romano,
1995). Această problemă a fost rezolvată prin dezvoltarea tehnicii de “Western blot” (Burnette,
1981) pentru transferul de proteine separate electroforetic de pe geluri de poliacrilamidă pe
matrici solide de tip membrană (membrane de nylon, nitroceluloză, difluorură de poliviniliden)
(Beisiegel, 1986; Towbin și colab., 1979; Gershoni și Palade, 1983; Bers și Garfin, 1985;
Gershoni, 1988; Towbin și colab., 1989; Renart și colab., 1979). Membrana cu proteineă
imobilizată este apoi modificată chimic după care se vizualizează şi se analizează detaliat
utilizând una sau o combinaţie de tehnici imagistice: autoradiografia, fluorografia proteinelor,
marcare izotopică, colorare directă, imunocolorare folosind anticorpi specifici (imunoblotting),
legare cu ligand-specific, sau colorare pentru activităţi enzimatice specifice (Beisiegel, 1986;
Andrews, 1986; Gershoni, 1988; Timmons și Dunbar, 1990; Gershoni, 1985).
Sensibilitatea, simplicitatea și relative rapiditate a colorației cu Coomassie Brillant Blue au
făcut din această tehnică o metodă de ales în detecția de rutină și în analiza cantitativă a benzilor
proteice separate pe gel, după electroforeză, cu multe aplicații. În scopul creșterii sensibilității
detecției proteine aflate în urme, dar prezente în același gel, s-a raportat o metodă de colorare
dublă, atât cu CBB cât și cu săruri de argint (Irie și coab., 1982). În plus, colorația cu CBB,
combinată cu o imagine după colorare cu argint a fost folosită pentru a intensifica (DeMoreno și
colab., 1985; Ross și Peters, 1990), precum şi pentru a diferenţia diferite clase de proteine
(Rochette-Egly și Stussi-Garaud, 1984; Dzandu și colab., 1984). Cele mai multe proteine se
colorează monocromatic cu argint, conducând la apariția unor benzi predominant maro sau
negre, deşi colorația cu argint poate conduce la diferite nuanțe de negru, albastru, maro, roșu și
galben (Sammons și colab., 1981).
Intensificarea benzilor proteice, precum şi diferenţierea dintre diferitele clase de proteine (de
Moreno și colab. 1986; Ross și Peters, 19905) a condus la introducerea colorației cu CBB
combinată cu imagistica rezultată după colorația cu argint (Rochette-Egly și Stussi-Garaud,
1984; Dzandu și colab., 1984). Cele mai multe proteine se colorează monocromatic cu argint,
producând predominant benzi maro sau negre, cu toate că, prin colorare cu argint se pot obține
colorații cu nuanțe diferite de negru, albastru, maro, roşu ori galben (Sammons și colab., 1981).
Lipoproteinele au tendinţa de a se colora în albastru în timp ce unele glicoproteine apar brun-
gălbui, roşu (Goldman și colab., 1980). Formarea culorii depinde foarte mult de condiţiile de
dezvoltare a ei, deşi kiturile standardizate pe bază de colorație cu argint sunt disponibile în
comerţ și care reduc variabilitatea colorației. Lipoproteinele au tendinţa de a se colora în
albastru, în timp ce unele glicoproteine apar în nuanțe galben-brun ori roşie (Goldman și colab.,
1980). Formarea culorii este înalt dependentă de condiţiile de dezvoltare a imaginii, deşi kiturile
disponibile în comerţ, standardizează culoarea, cu reducerea variabilității ei. După cum arată
Dunbar și colab. (1985) modificările post-translaţionale, precum glicozilarea sau fosforilarea, nu
par să modifice colorația polipeptidei, prin urmare, proteinele modificate cu altă sarcină electrică
și deci alt pI pot fi identificate prin 2D-PAGE. Culorile contrastante derivate din colorarea cu
argint de bază pot reprezenta un avantaj în distincția spoturilor care se suprapun permițând
detecția unor proteine minore, care co-migrează electroforetic cu proteinele mult mai abundente
în gelurile supraîncărcate, care ar fi imposibil de distins cu colorații monocromatice.
Dzandu și colab. (1984) au speculat una dintre limitările majore la utilizarea de colorației cu
argint anume, incapacitatea colorării unor anumite proteine (de exemplu diverse proteine care
leagă calciu, precum calmodulina) şi au combinat, în studiul proteinelor membranei eritrocitelor
umane, colorarea argentică cu colorarea CBB-R, a sialoglicoproteinelor şi lipidelor (Figura 4.8.).
Gelurile, colorate în primul rând cu argint şi apoi cu CBB-R, au arătat caracteristici de colorare
cu CBB a tuturor proteinelor membranare predispuse la legarea colorantului, în timp ce
sialoglicoproteinele şi lipidele au fost colorate în galben, prin argentare. Deşi, prin metodele
tradiţionale de colorare cu CBB sau cu săruri de argint a gelurilor de poliacrilamidă
proteoglicanii se evidențiază cu o intensitate scăzută, aceștia se identifică în mod obişnuit, cu
ajutorul unor coloranți anionici precum albastru Alcian sau albastru de toluidină, cu o limită de
detecțiedestul de scăzută (de ordinul µg). Moller și colab. (1993) au combinatcolorația cu argint
neutru cu cea cu Alcian Blue pentru a spori sensibilitatea colorării de 10-100 ori față de colorația
combinată argint diaminic/Alcian Blue.
 Figura 4.8. O ilustrare a avantajului colorației duble
CBB/argentare în analiza proteinelor din membrane
eritrocitului. Benzi: A-C, evidențierea proteinelor de
membrana fantomelor eritrocitare pe geluri (T=11%)
separate prin SDS-PAGE prin protocolul Laemmli,
colorate cu argint; D-E, evidențierea proteinelor de
membrană separate în aceleași condiții, însă colorate
numai cu CBB-R 250;F-H, evidențierea proteinelor de
membrană separate în aceleași condiții colorate cu
Ag/CBB. Liniile A, D, F, proteine nefracționate din
fantome, liniile B, E și G, proteine din peletul insolubil în
NaOH, liniile C și H, sialoglicoproteine. (După Dzandu și
colab. 1984)

Hardy și Castellanos-Serra (2004) prezintă un protocol de colorare dublă, CBB/SDS-

imidazol-zinc în detecția proteinelor care afişează o afinitate scăzută pentru colorant și de
evidențiere a unor componente minore care nu se pot vizualiza prin colorație cu colorant, fiind
sub limita de detecție. Această procedură, care completează colorarea cu CBB, oferă o imagine
mai realistă a complexităţii unei probe supuse analizei. Procedura de colorare (Fernandez-
Patron și colab., 1995) presupune spălarea gelurilor colorate cu CBB cu 10 volume de apă (de
două ori, timp de 25 minute, fiecare), pentru a se elimina metanolul şi acidul acetic (gelul se mai
poate incuba într-un volum mare de apă peste noapte), după care se colorează conform
protocolului clasic de colorare inversă a biomoleculelor separate. Colorația dublă a gelurilor va
arata benzi tipice colorate cu CBB suprapuse peste benzi mai transparente, provenite din
colorarea negativă, extrem de sensibilă, precum și benzi colorate negativ care nu au fost anterior
detectate. Sensibilitatea este la fel de mare ca și în cazul gelurilor colorate negativ și nu depinde
de gradul de decolorare a gelurilor colorate cu CBB (de exemplu, limita de detecție pentru
streptokinază este de 1,6ng). În plus, gelurile colorate cu CBB pot fi colorate negativ în orice
moment, după depozitare în pungi de polietilenă, închise etanș.
Se poate reaminti că și gelurile de agaroză pot fi colorate secvențial cu albastru de
toluidină/”Stains-All”, pentru analiza complexelor glicozaminoglicanilor (heparina, sulfat de
heparan, condroitin/dermatan sulfat) ori a polianionilor nesulfatați (hialuronat, polizaharidul
capsular defructozilat-K4), precum şi compararea specificităților enzimelor glicozaminoglican-
degradante şi de identificare ori de cuantificare (Vezi Electroforeza pe gel de agaroză).
Procedura de colorare poate fi utilizată la evaluarea posibilelelor afinităţi dintre proteine și
polizaharide.
Întrucât vizualizarea proteinelor individuale, folosind tehnici multple de colorare au fost
utilizate în scopuri speciale, în unele cazuri, procedurile de colorare dublă pot fi înlocuite prin
metode radioizotopice, mai sensibile (Wirth și Romano, 1995).
4.4. COLORAȚII REVERSIBILE
În opoziție cu procedurile de colorare pozitive, au fost publicate o serie de tehnici alternative
de colorare, mai puţin sensibile, bazate pe formarea de complexe insolubile ale unor săruri de
metale (cupru, zinc, potasiu,etc). Aceste metode, denumite de obicei colorații negative sau
colorații inverse, se limitează la identificarea proteinelor pe geluri în prezență de SDS şi se
manifestă printr-un background semi-opac a suprafeței gelului în timp ce proteinele sunt
detectate ca benzi transparente sau spoturi atunci când vizualizate pe un fundal negru, sau atunci
când sunt în mod corespunzător iluminate (Dzandu și colab.,1988; Lee și colab., 1987; Adams și
Weaver, 1990; Ortiz și colab., 1992; Fernandez-Patron și colab., 1992; Ferreras și colab.,
1993).
 Procedurile de colorare sunt rapide (se realizează în circa 15min), prezintă o sensibilitate
cuprinsă între cea a colorației cu CBB şi colorarea cu argint, nu necesită fixarea prealabilă a
proteinelor în matricea de gel, iar cum proteinele rămân necolorate, ele sunt mai uşor de
recuperat din geluri (<90 %), pentru caracterizări biochimice ulterioare, inclusiv Western
immunoblotting ori pentru analize de aminoacizi și microsecvențiere Edman (Wirth și Romano
1995).
4.4.1. COLORAȚIA CU IONI DE CUPRU

Colorația reversibilă cu cupru este o metodă realizată într-o singură etapă pentru detectarea
rapidă a proteinelor fracţionate prin SDS-PAGE. În această tehnică nu este necesară o etapă de
decolorare. Colorarea se bazează pe interacţiunea ionilor de cupru cu poliacrilamida şi cu
proteinele separate. Tehnica de colorare implică precipitarea ionului de cupru în gel care astfel
devine verde opac, în timp ce SDS previne legarea ionului de cupru la proteine, rezultând astfel
o imagine negativă. În final se evidențiază benzi clare de proteine pe un fundal semiopac
albastru-verzui de poliacrilamidă. Benzile proteice sunt vizualizate în mai putin de 5 minute.
Sensibilitatea colorației reversibile este cuprinsă între 0,5ng și 12ng/bandă proteică. Colorarea nu
interferă cu tehnicile ulterioare de electroeluție a proteinelor și nu modifică proprietăţile
biologice ale acestora. Gelurile colorate reversibil cu ioni de cupru pot fi decolorate în 20-25 de
minute, înainte de transferul sau electroeluția proteinelor din gel. Un dezavantaj major totuși,
este că această colorațioe nu este compatibilă cu gelurile native sau gelurile care conţin Tricină
sau glicină (G-Biosciences, St Louis).
În cazul BSA sensibilitatea metodei ajunge la 0,5-10 ng proteină/bandă, fracțiile proteice
fiind vizibile după o separare pe un gel de poliacrilamidă cu T=12%. În cazul gelurilor cu o
concentraţie mai mică de 12% sensibilitatea scade din cauza creșterii dimensiunilor porilor, cu
consecință în creșterea procesului de difuziune a benzilor de proteine.
După electroforeză, gelurile se echilibrează în tamponul de migrare timp de 15 minute. Cele
mai bune rezultate se obțin în condițiile migrării proteinelor în tampon tris/glicină/SDS. Se pot
utiliza de asemenea și tampoane care conțin MES sau MOPS. Gelurile se imersează în
continuare într-o soluție de CuCl2, 0,3M timp de 5 minute când benzile proteice se vor vizualiza
pe un background albastru-verzui.
Rybicki și Purves (2005) prezintă următorul protocol: după electroforeza realizată în condiții
denaturante (SDS-PAGE) gelul se clătește cu apă distilată după care se introduce într-o soluţie
de clorură de cupru (0,3M) cu agitare, pentru aproximativ 20 de minute, la temperatura camerei.
În continuare gelul se clăteşte cu apă distilată şi se scufundă într-un volum suficient pentru a
acoperi gelul de apă distilată proaspătă (aceasta acţionează ca și etapă de decolorare). Gelul se
păstrează într-o cutie de plastic.
Protocolul descris de Merril (1990) implică spălarea scurtă a gelului cu apă distilată, urmat de
cufundarea gelului timp de 5 minute într-o soluție de clorură de cupru (0,3M) , după care gelul se
spală timp de 2-3 minute cu apă distilată.
Benzile proteice sunt ușor de observat și fotografiat după depunerea gelului pe o suprafață
închisă la culoare. Proteinele nu sunt permanent fixate prin această metodă, ele putând fi eluate
cantitativ după tratarea gelului cu agenți de chelatare a ionului de cupru. Profilul electroforetic
este piedut după ce gelurile colorate cu cupru sunt uscate, deci ele trebuie imediat fotografiate,
ori după recolorate cu CBB sau sunt stocate în apă. Figura 4.9. prezintă profilul electroforetic al
unui preparat proteic după colorare cu ioni de cupru.
Rybicki și Purves (2005) descriu o metodă simplă de colorare cu ioni de cupru. Metoda
implică imersarea gelului imediat după electroforeză pe gel de poliacrilamidă în prezență de SDS
timp de 15 minute într-o soluție de CuCl2, 0,3 M, după care gelul se spală rapid cu apă
deionizată şi se urmăresc benzile proteice ca zone clare pe un fundal albastru, translucid. Metoda
de detecție a proteinelor este intermediară ca sensibilitate fiind cuprinsă între colorația cu
Coomassie şi cea cu argint. Gelurile pot fi depozitate în apă timp de până la câteva luni la
temperatura camerei, fără o decolorare substanțială deoarece proteinele sunt imobilizate în gel
sub forma unui complex Cu-SDS-polipeptid, care conduce la zone translucide în timp ce
opacitatea background-ului se datorează unui complex dintre Cu-SDS-tris. Gelurile pot fi
decolorate complet prin spălare repetată într-o soluție Tris, 0,1-0,25M/EDTA, 0,25M pH=8,0 şi
apoi electrotransferate pe membrrană sau eluate din gel în caz de alte scopuri.

Figura 4.9. Profilul electroforetic al unui preparat proteic după

colorare cu cupru. După http://www.gbiosciences.
com/ReversibleCopperStain-desc.aspx

În plus, este posibil de a se realiza o colorație reversibilă a gelurilor înainte de a fi transferate

pe membrană prin cea mai simplă tehnică posibilă, adică prin cufundarea gelului într-o soluție
rece (ținută pe gheață) de clorură de potasiu 1M. În asemenea condiții, SDS precipită sub formă
de dodecilsulfat de potasiu, iar proteinele sunt vizibile ca zone mai albe pe un fond opac-
translucid. Totuși metoda nu este sensibilă (Rybicki și Purves, 2005).
Dintre avantajele aplicaţiilor colorației cu cupru amintim:
 Metoda este potrivită pentru colorarea gelurilor de proteine înainte de transferul pe
membrană sau electroeluția lor.
 Gelul poate fi depozitat în apă timp de câteva săptămâni, fără pierderea rezoluției
benzilor proteice.
 Perfecționarea tehnicii de colorare prin utilizarea unor reactivi specifici de colorare-
decolorare a condus la creșterea sensibilității spre ate: 0,1-1 ng de proteină/bandă.
Cu toate că metoda de colorare cu soluție de clorură de cupru realizată de Lee și colab. (1987)
este mai rapidă, mai ușoară și mai sensibilă decât colorația cu Coomassie, ea nu a devenit total
acceptată pentru aplicațiile din cercetarea proteomică (Westermeier și Marouga, 2005).
4.4.2. COLORAȚIA NEGATIVĂ IMIDAZOL-SDS-ZINC
În scopul analizelor ulterioare de detecție a proteinelor s-a descris o metodă de detecție care
nu modifică proteina și vizualizează background-ul matricei de gel. Un complex al sării de zinc,
al SDS și imidazolului precipită în gelul de poliacrilamidă și formează un background alb opac,
dar care rămâne solubil în prezența spotului proteic (Fernandez-Patron și colab., 1992). Zonele
proteice devin vizibile ca un background închis la culoare. Sensibilitatea detecției (care este de
ordinul a câtorva nanograme) este cuprinsă între cea a CBB și colorația cu argint. Randamentul
peptidelor după digestia lor din gel este mai mare decât în cazul colorării directe a proteinelor.
Precipitatul salin poate fi dizolvat cu un tampon Tris–EDTA, care permite transferul
electroforetic al proteinelor în cazul unei etape de transfer (Western blotting). Cu toate că este
considerată o procedură care permite determinarea cantitativă a proteinelor (Ferreras și colab.,
1993), această afirmație este disputată deoarece se detectează direct numai background-ul nu și
proteina.
Fernandez-Patron și colab. (1995) recomandă recolorarea gelurilor colorate cu CBB după ce
se spală cu apă distilată. În această primă treaptă, orice urme de metanol și acid acetic sunt
eliminate prin două schimbări a apei la un interval de 15 minute, sau, alternativ prin depozitarea
gelurilor în apă, peste noapte. Gelurile sunt apoi incubate în 30-50 ml de imidazol, 0,2 M, care
conține 0,1% SDS, sub agitare blândă, timp de 15 minute. Această soluție se îndepărtează și se
înlocuiește cu o soluție de sulfat de zinc, 0,2 M, și se agită timp de 30-60 secunde.
Supracolorarea este evitată prin îndepărtarea soluție de sulfat de zinc și spălarea gelului de 3 ori,
timp de 1 minut cu 50 ml de apă distilată.
Gradul de dezvoltare a colorației se monitorizează în timpul agitării manuale a gelurilor pe o
suprafaţă de culoare închisă, reacția fiind stopată prin îndepărtarea rapidă a soluției de sulfat de
zinc și clătirea gelurilor cu apă distilată timp de 10-15 secunde (în loc de spălările iniţiale
descrise de Fernandez-Patron și colab.).
După cum dezvoltarea background-ului continuă pentru câteva secunde după ce se
îndepărtează soluția de dezvolatare a culorii, reacţia se stopează când benzile de interes devin
vizibile (Gillespie și Elliott, 2005).
Simpson (2007) utilizează următoarele soluții:
 Soluție de fixare pentru colorare negativă: Metanol (50% [v/v]):Acid acetic glacial (5%
[v/v]):H2O (45%)
 Soluție de imidazol-SDS. 6,8 g imidazol și 0,5 g SDS se dizolvă în 500 ml H2O.
Concentrațiile finale sunt: imidazol, 0,2 M și SDS, 0,1%.
 Soluție de sulfat de zinc (0,2 M). 28,7 g ZnSO4·•7H2O se dizolvă în 500 ml H2O.
4.4.2.1. Mecanismul general al colorației negative cu săruri imidazol-SDS-zinc.
Coloarea fondului de gel. În timpul primei trepte de colorare inversă, imidazolul și SDS
difuzează în matricea de gel. Concomitent, benzile proteice se încarcă cu SDS. Când apoi, gelul
este îmbibată în soluția de colorare cu zinc, are loc formarea unui complex insolubil pe suprafața
gelului. Acest complex este insolubil în amoniac, deci nu este în general format din hidroxid de
zinc (Fernandez-Patron și colab., 1992). Complexul nu pare a fi dat prin precipitarea
precipitarea micelelor de detergent datorată ionilor de zinc deoarece complexul Zn-SDS nu poate
precipita într-un tub de testare într-un domeniu mare de concentrații de zinc. Astfel, cu toată că
natura precisă a complexului insolubil care se formează prin colorarea reversă a gelului rămâne
încă necunoscută, ea implică aparent imidazolul, SDS și zincul. Se poate specula că de asemenea
SDS formează o parte a complexului insolubil care formează background-ul de gel deoarece în
prezența SDS particulele formate sunt mai mari și aparent mai grele decât cele observate în
absența detergentului la același raport zinc:imidazol (Fernandez-Patron și colab., 1995).
4.4.2.2. Aplicaţiile analitice şi micropreparative ale colorației cu imidazol-zinc
Aplicaţiile analitice şi micropreparative ale colorației cu imidazol-zinc au fost extinse și la
alte biomolecule. Acestea includ acizii nucleici (Hardy și colab., 1996; Castellanos-Serra și
colab., 1997; Hardy și colab., 1998), lipopolizaharide bacteriene (LPS), şi catene laterale libere
LPS O-specifice care conţin o regiune extrem de variabilă, fiind legate prin regiunile
oligozaharidice de lipide A (lipooligozaharide; LOS) (Fernandez-Patron și colab., 1998; Hardy
și colab., 1997; Hardy și colab., 1998; Pupo și colab., 2000; Pupo și colab., 1999).
Pentru a permite detectarea unor benzi minore şi pentru a creşte sensibilitatea de detecţie
metoda originală imidazol-zinc (Fernández-Patrón și colab., 1992) a fost modificată. Acest
lucru a fost realizat prin schimbarea ordinii de aplicare a reactivilor de colorare concomitent cu
scăderea concentraţiei de zinc la aproximativ 10-15 mM (Hardy și colab., 1996; Hardy și colab.,
1997; Hardy și colab., 1998). Cu toate că par aparent diferite, colorarea inversă imidazol-zinc
(Fernández-Patrón și colab., 1992), imidazol-SDS-zinc (Ortiz și colab., 1992), şi zinc-imidazol
(Hardy și colab., 1996; Hardy și colab., 1997; Hardy și colab., 1998) toate cele trei variante de
colorare negativă au în comun sinteza ZnIm2. Ele prezintă zone unde biomoleculele apar ca
benzi transparente incolore, datorită capacitații lor de a se asocia cu cationi de zinc. Această
asociaţie reduce concentraţia efectivă de Zn (II) liber în zonele de localizare a biomoleculelor şi
previne o precipitare ”in situ” efectivă indusă de imidazol a ionilor de zinc.
 Asocierea zincului la grupările încarcate negativ sau polarizabile pot să apară prin
intermediul resturilor de aminoacizi His, Cys, Glu și Asp din structura proteinelor, a grupărilor
fosfat din structura acizilor nucleici ori a grupărilor polihidroxilice din resturile monozaharidice,
grupărilor carboxilat (ale acizilor sialici) ori fosfat din structura lipidului A prezent în LPS/LOS
(Hardy și Castellanos-Serra, 2004). În esență această metodă se bazează pe o precipitare
selectivă a complexului imidazolate-zinc în gel (Fernandez-Patron și colab., 1998), cu excepţia
zonelor unde se regăsesc fracțiile proteice sau a altor macromolecule, cum DNA (Hardy și
Castellanos-Serra, 2004; Castellanos-Serra și Hardy, 2001; Hardy și colab., 1996; Hardy și
Castellanos-Serra, 2004) ori a lipopolizaharidelor (Hardy și Castellanos-Serra, 2004;
Castellanos-Serra și Hardy, 2001; Hardy și colab., 1997; Pupo și colab., 2000).
Există mai multe avantaje în utilizarea colorației inverse cu imidazol-zinc în cercetarea
proteomică curentă. În primul rând, colorația inversă cu imidazol-zinc este foarte sensibilă.
Pentru geluri de proteine, s-a demonstrat că această colorație oferă o sensibilitate egală sau mai
bună decât colorația cu Sypro Ruby sau în unele cazuri față de colorația cu argint, după cum se
observă și în figura 4.10 (Hardy și Castellanos-Serra 2004; Castellanos-Serra și Hardy, 2001).
Figura 4.10. Detecția proteinelor după colorație cu imidazol/SDS/zinc.
S-au utilizat o serie de diluţii identice dintr-un extract total de proteine
din Escherichia coli care au fost separate prin SDS-PAGE (T%=12,5%).
A. gelul a fost colorat cu argint, după o fixare anterioară cu
glutaraldehidă (Heukeshoven și Dernick, 1985). B. gelul a fost incubat
timp de 15 min într-o soluție de imidazol 0,2M conţinând 0,1 SDS%,
apoi spălate rapid cu apă şi incubatate în sulfat de zinc 0,2M, timp de
aproximativ 1 minut. Săgeţilele superiore indică cea mai mică diluţie
detectată prin tehnica de colorare cu argint A şi apariţia sa în gelul
colorat cu imidazol-SDS-zinc B. Săgeţile de jos indică cea mai mică
diluţie detectată prin colorare cu imidazol-SDS-zinc. (După Hardy și
Castellanos-Serra, 2004).

Prin colorație negativă pot fi detectate în gel benzi proteice, la o cantitate mai mică de 1 ng
(Lin și colab., 2006). În al doilea rând, realizarea colorării inverse zinc-imidazol este extrem de
simplă în comparaţie cu colorația cu argint, care necesită o pregătire continuă a unor soluții
proaspete. Colorarea inversă cu imidazol-zinc necesită doar două soluţii de colorare, care pot fi
uşor diluate din soluţii stoc. În al treilea rând, este remarcabil de rapidă, luând în general, mai
puţin de 20 de minute pentru a fi completă (Hardy și Castellanos-Serra 2004; Castellanos-Serra
și Hardy, 2001).
Se cunoaște că metoda de colorare cu argint, deși este foarte sensibilă, nu detectează o serie
de proteine, printe acestea incluzându-se și glicoproteinele. Colorația reversibilă cu imidazol-
zinc, având o sensibilitate comparabilă cu metoda de colorare cu argint, este aptă să coloreze
aceste heteroproteine precum și fosfoproteinele (Figura 4.11.).

Figura 4.11. Evidențierea fosvitinei după colorare reversibilă cu

imidazol-zinc (http://www. gbiosciences. com/ReversibleZincStain -
desc. aspx)
 Se observă diferențe în evidențiere pentru glicoproteine între colorația cu argint și colorația
cu zinc. Fosvitina, o fosfoglicoproteină, este rezolvată pe ambele două geluri dar este detectată
numai prin colorare cu imidazol-zinc.
În final, colorația inversă imidazol-zinc este pe deplin compatibilă cu aplicaţii în aval,
precum cele de spectrometrie de masă (Castellanos-Serra și colab., 1999; Scheler și colab.,
1998; Gulin și colab., 2003; Pupo și colab., 2004), secvențiere Edman (Fernandez-Patron și
colab., 1992; Fernandez-Patron și colab., 1995; Fernandez-Patron și colab., 1998),
electroeluție (Fernandez-Patron și colab., 1992; Fernandez-Patron și colab., 1995; Hardy și
Castellanos-Serra. 2004; Hardy și colab., 1996) şi tehnici de transfer pe membrană (Hardy și
Castellanos-Serra, 2004; Castellanos-Serra și Hardy, 2001). Deşi intervalul dinamic de colorare
pentru colorația reversibilă imidazol-zinc pare a nu fi la fel de satisfăcătoare ca în cazul
colorației cu Sypro Ruby, în zilele noastre laboratoarele care nu sunt echipate cu sistem
sincronizat de capacitare (culegere) a spoturilor prin utilizarea unor scanerele fluorescente,
uneori recurg la recolorare cu Sypro Ruby, după care culeg manual spoturile proteice de interes
după electroforeză bidimensională, în scopul identificării acestora prin spectrometrie de masă
(Lin și colab., 2006).
4.5. COLORAȚIA FLUORESCENTĂ
Odată cu naşterea proteomicii, la mijlocul anilor ’90 s-a reînnoit interesul cercetătorilor în
domeniul tehnologiilor de detectare a proteinelor (Patton, 2000). Interesul a fost motivat de
necesitatea de a combina înalta sensibilitate de detecţie cu o mare capacitate de cuantificare,
precum şi pentru a oferi noi abordări de detecție, care să fie mult mai compatibile cu tehnicile de
identificare a proteinelor, în special MS. Detecția pe bază de fluorescență a fost astfel introdusă
în prim plan, deoarece detectarea unui semnal fluorescent oferă un răspuns liniar în ceea ce
privește cantitatea de proteină pe o gamă mult mai largă decât metodele alternative
nefluorescente, prcum colorația cu CBB ori cea cu argint. Printre tehnologiile de detectare
nefluorescente disponibile, doar radio-marcarea oferă capabilități comparabile (Patton, 2005).
Coloranții fluorescenți prezintă un mare domeniu de linearitate dinamică, de peste 4 ori
magnitudine față de colorațiile clasice, cu rezultate înalt reproductibile deoarece colorația
fluorescentă este o metodă de tip endpoint. De la introducerea colorării cu Nile Red (Bermudez
și colab., 1994) în ultimii ani, au fost dezvoltați o varietate de coloranți cu diverse și marcante
sensibilități și proprietăți, precum familia coloranților Sypro® (Orange, Red, Tangerine și
Ruby) (Steinberg și colab., 1996; Berggren și colab., 2002).
În ultimii ani o serie de categorii de metode de detecție fluorescentă au câştigat importanţă în
domeniul proteomicii. În prima categorie sunt incluși coloranții interacţionează cu proteinele în
mod indirect şi necovalent (Bermudez și colab., 1994; Steinberg și colab., 1996; Kang și colab.,
2003; Steinberg și colab., 2000). Acești fluorofori sunt practic nefluorescenți, în soluţie apoasă,
dar devin fluorescenți în momentul legării lor la complexele SDS-proteină.
Deoarece SDS se leagă de proteine într-o stoichiometrie relativ constantă, cuantificarea unei
proteine prin această abordare pare mult mai fiabilă decât metodele bazate numai pe
interacțiunea cu aminele primare ale proteinelor. Coloranții cei mai cunoscuți din această clasă
sunt colorantul roșu de Nil (figura 4.12), coloranții SYPRO Orange, SYPRO Red, SYPRO
Tangerine, coloranții hidrofobi ai fluoresceinei (5-amino dodecanoilfluorescină, 5-amino
hexadecanoil fluoresceină şi 5-octa decanoil fluorescein-amino) (Bermudez și colab., 1994;
Steinberg și colab., 1996; Kang și colab., 2003; Steinberg și colab., 2000) şi colorantul Deep
PurpleTM care conține drept fluorofor „epicocconona” din fungul Epicoccum nigrus (Mackintosh
și colab., 2003). În mod obișnuit această familie de coloranţi posedă sensibilităţi de detecţie care
sunt echivalente cu colorarea cu CBB coloidal ori cu metodele rapide de colorare cu argint.
Colorația cu Deep Purple ori cu coloranţi hidrofobi de fluoresceină, pare la fel de sensibilă ca
cele mai sensibile metode de colorare cu argint (Bermudez și colab., 1994; Steinberg și colab.,
2000).

Figura 4.12. Structura chimică a colorantului hidrofob

Nile red. (După Daban, 2001).

Deep Purple™, este chiar mai sensibil decât Sypro® Ruby (un complexele coloidal
luminescene al ruteniului), cu o limită de detecție sub câteva sute de picograme. De altfel pe
lângă marea sensibilitate a ultimului colorant acesta mai posedă o serie de avantaje: nu creează
pete în background și este un produs natural, ușor de procurat(Mackintosh și colab., 2003).
Deoarece toți acești coloranţi lipofili se leagă de proteine în mod indirect, prin intermediul
SDS, detectarea fluorescentă a proteinelor în geluri, după IEF, se poate realiza folosind Nile red
ori SYPRO (Red, Orange și Tangerine) care, pentru a putea fi utilizați, trebuie să fie preincubați
cu gelurile în prezența acestui detergent anionic (Bermudez și colab., 1994; Steinberg și colab.,
1996; Steinberg și colab., 2000), însă principalele dezavantaje ale utilizării acestor coloranți
fluorescenți în colorarea gelurilor după IEF sunt sensibilitatea de detecţie mult mai mică decât
metoda standard de colorare cu CBB şi introducerea unei noi trepte de incubare în SDS care este
de natură să conducă la o pierdere de proteine.
A doua categorie de colorații fluorescente a proteinelor totale cuprinde complexele coloidale
luminescente ale metalelor tranziţionale, de tipul celor de ruteniu, element aflat la baza
colorantrului SYPRO Ruby, și care este strâns legat structural (dar nu identic) cu fluoroforul
ruteniuII tris (batofenantrolin disulfonat). (Berggren și colab., 2001; Berggren și colab., 2002;
Lamanda și colab., 2004; Lopez și colab., 2000; Nishihara și Champion, 2002; Rabilloud și
colab., 2001; Steinberg și colab., 2000). Acești coloranți se leaga de proteine printr-un
mecanism destul de asemănătorcolorației cu CBB şi sunt la fel de sensibili ca cele mai bune
proceduri de colorare cu argint disponibile. Coloranţii sunt totuși superiori arginului în ceea ce
privește gama dinamică liniară şi compatibilitatea metodei cu tehnicile de identificare a
proteinelor care au la bază MS. Este notabil să se arate că SYPRO Ruby permite o evidențiere
fluorescentă sensibilă a benzilor proteice în geluri după IEF (Steinberg și colab., 2000). Benzile
proteice sunt selectiv colorate în timp ce matricea de gel de poliacrilamidă rămâne incoloră, într-
o manieră similară colorării cu CBB coloidal. În plus, dacă sensibilitățile coloranților Sypro®
Orange, Red și Tangerine sunt similare celei de colorație cu Coomassie Blue; Sypro ® Ruby
poate detecta sub 1 ng de proteină per spot. Rabilloud și colab., (2001) au publicat un protocol
pentru colorația cu complexul fluorescent de ruteniu cu o mare sensibilitate.
 Figura 4.13. Reprezentarea schematică a diferențelor în proteine premarcate a unui gel după electroforeză (după
Westermeier și Marouga, 2005)
Ultima categorie de fluorofori frecvent utilizați pentru detectarea post-electroforetică a
proteinelor în gel de poliacrilamidă sunt fluoroforii amino- și sulfhidril-reactivi, în special
coloranții cianinici (Unlu și colab., 1997; Tonge și colab., 2001; Shaw și colab., 2003) și
reprezintă un salt uriaș în metodologia electroforezei bidimensionale, prin introducerea
coloranților cianinici cu mărime și sarcină diferită (CyDye™ DIGE Fluors), cu lungimi de undă
de excitație și emisie, de asemenea diferită pentru proteinele marcate, după cum se observă și în
figura 4.13. unde este exemplificată premarcarea cu coloranți fluorescenți diferiți pentru probe
diferite (Ünlü și colab., 1997).
Structurile 2-D rezultate pot fi vizualizate la o cantitate sub 1 µg din proteina totală. Deoarece
toate resturile de cisteină disponibile sunt marcate, există multe proteine marcate multiplu.
Paternurile spoturilor rezultate sunt diferite de cele obținute prin colorare post electroforetică a
proteinelor sau de marcare a lizinei din structura lor. După scanarea gelului la diverse lungimi de
undă, spoturile de proteină co-migrată din probe de origini diferite sunt co-detectate prin
utilizarea unui software dedicat, care permite o evaluare foarte rapidă și complet automatizată,
cu evitarea oricărei suspiciuni introduse de operator. Metoda, denumită „gel-electroforeză prin
diferență” (difference gel electrophoresis-DIGE), permite multiplexarea probelor și utilizarea
unui standard intern care este creat prin marcarea amestecului de proteine din toate probele
supuse separării electroforetice (figura 4.14). Cu ajutorul acestui pattern creat prin intermediul
standardului, care este supus electroforezei în fiecare gel, structurile spoturilor diferitelor geluri
vor fi marcate iar volumele spoturilor din probă vor fi normalizate cu un volum al spotului din
standard iar în continuare, analiza imaginilor conduce la rapoarte ale diferențelor proteinelor cu
mare acuratețe și cu o confidență statistică ridicată (Alban și colab., 2003; Friedman și colab.,
2004). Această metodă permite obținerea unor rezultate calitative și cantitative de mare acuratețe
deoarece este eliminată variația dată de un gel sau altul. Există două concepte alternative:
marcarea minimă prin atașarea colorantului la grupările amino ale resturilor de lizină și marcarea
la saturație a tuturor resturilor de cisteină. În prima variantă numai 3–5% din proteinele totale
vor primi un ligand fluorescent, care asigură că numai proteine singulare vor fi detectate. În acest
caz proteinele premarcate vor co-migra cu cele nemarcate în ambele direcții de separare
(focusare izoelectrică și electroforeză 2D), imaginea care rezultă în urma separării 2D fiind
asemănătoare celei obținute prin colorare postelectroforetică. Practic, se adaugă 400 pmol/l din
unul dintre cei trei coloranți cianinici disponibili la 50 µg proteină din fiecare probă sau amestec
standard. Sensibilitatea detecției este comparabilă cu cea obținută prin metoda de colorare cu
argint.
 Figura 4.14. Reprezentarea schematică a
îmbunătăţirii confidenței în schimbările de
abundenţă a unor proteine. folosind tehnologia
multi-fluorescentă DIGE. http://www.med.uc.
edu/proteomics/dige.htm

Proteinele sunt, de obicei, premarcate cu un colorant fluorescent sensibil înainte de

electroforeza propriu-zisă, cu toate că ele pot fi marcate, de asemenea, și după electroforeză.
Spoturile pot fi analizate direct pe gel (când acesta este încă în caseta electroforetică); în aceste
condiții se utilizează sticlă de fluorescență scăzută. Asemănător altor coloranți fluorescenți,
această marcare o sensibilitate înaltă și un mare domeniu dinamic al semnalului. În cele mai
multe cazuri, introducerea acestor marcaje fluorescente in proteine implică o interacţiune
covalentă între colorant și grupările α-NH2 terminale ori ε-NH2 ale resturilor de lizină din
structura proteinelor, modificându-se astfel sarcina netă totală (și implicit pI) a
macromoleculelor. În SDS-PAGE convenţională aceste efecte sunt nesemnificative, deoarece
mobilitatea unei proteine depinde predominant de masa ei moleculară, moleculele de colorant,
fiind de obicei, prea mici pentru a produce un efect semnificativ (Barger și colab., 1976; Pace și
colab., 1974). Totuși, în cazul experimentelor analizelor 2D-PAGE, premarcarea cu markeri
fluorescenți pot modifica semnificativ migrarea proteinei dacă, în primă dimesiune se efectuează
IEF (O'Farrell, 1975). Astfel, în electroforeza bidimensională, proteinele pot fi premarcate cu un
colorant fluorescent după de focusarea izoelectrică (Urwin și Jackson, 1991) cu toate că unii
compuși precum monobromobiman poate fi utilizat chiar înainte de IEF (Urwin și Jackson,
1993).
Alți fluorofori frecvent utilizați la marcarea proteinelor înainte de electroforeză includ:
 clorura de 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfonil (dansil) (Schetters și McLeod, 1979; Stephens,
1978; Stephens, 1975; Tjissen și Kurstak, 1979);
 4-fenilspiro [furan-2 (3H)-l’-ftalan]-3,3’-diona (fluorescamina) (Eng și Parker, 1974);
 2-metoxi-2,4-difenil-3-(2H)-furanona (MDPF) (Barger și colab., 1976);
 N-(7-dimetilamino-4-metilcumarinil)-maleimida (DACM) (Yamamoto și colab., 1978);
 o-ftaldialdehida (OPA) (Weidekamm și colab., 1973).
Deşi clorura de dansil a fost primul colorant fluorescent folosit pentru precolorara
proteinelor, în studiile ulterioare au fost utilizați coloranți precum fluorescamina care s-a dovedit
capabilă să detecteze mai puţin de 6 ng de mioglobină (Ragland și colab., 1974) în timp ce
MDPF este de 2,5 ori mai sensibilă decat fluorescamina și are un răspuns liniar în domeniul 1-
500 ng (Barger și colab., 1976). De asemenea, proteinele pot fi detectate, post-electroforetic cu
reactivi fluorescenți precum 1-anilinonaftalen-8-sulfonatul (ANS) (Hartman și Udenfriend,
1969); Bis-ANS (Harowitz și Bowman, 1987) fluorescamina (Jackowski și Liew, 1980), p-
hidrazinoacridina (Carson, 1977) ori OPA (Andrews, 1986.). Deoarece marcarea cu acești
reactivi este, de obicei, efectuată în condiții nedenaturante, ei pot fi folosiți destul de avantajos
pentru detectarea rapidă a proteinelor în timpul electroforezei preparative (Wirth și Romano,
1995).
 4.5.1. COLORAȚII FLUORESCENTE SPECIFICE PENTRU STUDIUL MODIFICĂRILOR
POST-TRANZLAȚIONALE
Una dintre provocările cele mai importante cu care se confruntă proteomica este de a
descoperi rapid şi complet modificările post-translaţionale ale proteinelor (Wirth și Romano,
1995). Două importante modificări post-translaţionale ale proteinelor, glicozilarea și fosforilarea,
sunt uşor detectabile după PAGE. Astfel, pentru a studia fi studiate aceste modificări post-
translaționale, se utilizează colorații specifice. Procedura cu reactiv acid periodic Schiff pentru
detecția specifică a glicoproteinelor, introdusă de Zacharius și colab., (1969) devine mai
sensibilă prin cuplarea ei cu o reacție fluorescentă (Eckhardt și colab., 1976). Astfel, o colorație
verde-fluorescent sensibilă și specifică colorației glicoproteinelor, care utilizează colorantul Pro-
Q® Emerald 300, detecteaza glicoproteine direct în geluri de poliacrilamidă sau pe membrane
de difluorură de polifluoriden, PVDF (Steinberg și colab., 2001; Hart și colab., 2003;
Schulenberg și colab., 2003). Colorantul este conjugat cu glicoproteinele prin intermediul unei
baze Schiff conjugată cu acid periodic (PAS), reacţia realizându-se în condiţii ambientale. Prin
această metodă se pot detecta mai puţin de 300 pg de α1-glicoproteină acidă (care conține 40%
carbohidrați), direct, în geluri, domeniul dinamic liniar de detecție extinzându-se pe un ordin de
magnitudine de 2-3 (Steinberg și colab., 2001). Evidențierea benzilor glicoproteice necesită
iluminare UV, care le face improprii scanner-elor laser. Un colorant înrudit, Pro-Q Emerald
488, care are ca lungime de undă de excitație în domeniul vizibil, permite detecția și analiza
glicoproteinelor cu ajutorul scanner-elor laser dar, din păcate, această colorație alternativă este
de aproximativ 10 ori mai puţin sensibilă decât în cazul complexului care este excitat în UV
(Hart și colab., 2003).
Colorantul pentru fosfoproteine Pro-Q Diamond detectează uşor fosfoproteine care conţin
fosfoserină, fosfotreonină, precum şi resturi fosfotirozinice pe geluri de poliacrilamidă, în
prezență de SDS, geluri după focalizare izoelectrică, geluri 2-D, membrane de electrotransfer,
ori proteine după microarrays, printr-un mecanism care combină un fluorofor chelator şi un ion
metalic tranziţional (Martin și colab., 2003; Schulenberg și colab., 2003; Steinberg și colab.,
2003). Colorarea este relativ rapidă, simplă, ușor reversibilă şi pe deplin compatibilă cu
procedurile moderne de analiză microchimică, precum ar fi MALDI-TOF-MS. Colorantul Pro-Q
Diamond poate detecta mai puţin de 8 ng de pepsină, o proteina monofosforilată şi 1 ng de
proteină care conține două sau mai multe grupări fosfat de tipul ovalbuminei sau β-cazeinei
(Steinberg și colab., 2003). Răspunsul liniar al colorantului fluorescent permite o riguroasă
cuantificare a schimbărilor în fosforilare a proteinelor pe un dmeniu de concentrații de 2-3
magnitudine.
Detectarea fosfoproteinelor separate în geluri, după IEF, folosind colorantul Pro-Q Diamond
a prezentat iniţial anumite provocări, relativ la tehnica de conjugare a acestuia în prezența
amfoliților și s-a elaborat un protocol prin care colorarea se realizează după precipitarea
proteinele cu o soluție de metanol/acid tricloracetic (10%/40%) și îndepărtarea amfoliților prin
spălări extinse.
4.5.2. CONCLUZII
 Colorația fluorescentă este metoda optimă care combină marea sensibilitate de detecție
cu cuantificări de mare certitudine pe un domeniu linear dinamic deosebit de crescut. Totuși,
coloranții sunt mai scumpi decât cei utilizați în colorațiile vizuale; este necesară existența unui
scanner de fluorescență pentru vizualizarea spoturilor și de asemenea este nevoie de sistem de
achiziție de imagine pentru analiza de imagini;
 Metodele fluorescente de vizualizare a proteinelor după separarea electroforetică sunt
extrem de sensibile, dar, în general, sunt utilizate mai puţin frecvent decât protocoalele de
colorare cu CBB datorită, în principal relativei lor complexităţi în utilizare (acestea de exemplu,
necesită iluminare ultravioletă pentru o vizualizare a benzilor/spoturilor proteice și o serie de
echipamente sofisticate pentru o analiză cantitativă) precum şi un preț crescut (Wirth și Romano,
1995).
 Este posibil a se colora gelul secvențial cu coloranți specifici diferiți, iar la final să se
realizeze o colorație totală.
 Toți acești coloranți, sub formă de kit-uri și instrumentația specifică sunt disponibile în
comerţ.
4.6. EVIDENȚIEREA POSTELECTROFORETICĂ A PROTEINELOR CARE
CONȚIN ÎN STRUCTURA LOR, IONI DE VANADIU
Antipov și colab., (2003) au dezvoltat o metodă simplă de detectare a proteinelor care conţin
vanadiu.

Figura 4.15. Structura chimică a troponei (2-hidroxi-2,4,6-cicloheptatrien-1-onă).

Această tehnică are la bază capacitatea tropolonei (un derivat al troponei cu o grupare
hidroxilică în poziția 2, figura 4.15.) de a forma un complex insolubil, colorat cu ionii de
vanadium, în condiţii puternic acide (Rizvi și Singh, 1972). După PAGE, gelul se cufundă într-o
soluție de acid tricloracetic 12,5% (w/v) care conţine 0,2 g/l tropolonă. După 10 minute de
incubare de la 20°C, benzi proteice care conţin ioni de vanadiu se colorează în albastru. Gelurile
pot fi stocate în acid acetic, 5% (v/v) sau se lasă să se usuce. Este de preferat ca proteine care
conțin vanadium legat (Antipov și colab., 2000) să fie folosite ca un control pozitiv.
4.7. EVIDENȚIEREA POSTELECTROFORETICĂ A PROTEINELOR PRIN
MARCARE CU IZOTOPI
Marcarea proteinelor, fie înainte fie după electroforeză utilizând izotopi radioactivi rămâne în
continuare una dintre cele mai sensibile metode disponibile pentru detecția lor. Izotopii cei mai
frecvent utilizați sunt 14C, 35S, 32P, 3H şi 125I, deşi izotopi ai unor metale, precum 59Fe (Chen și
Drysdale, 1993), 45Ca (Maruyama și colab., 1984), 63Ni (Lin și colab., 1989) şi 75Se au fost
folosiți pentru a se identifica proteinele care leagă Fe, Ca şi Ni, respectiv proteinele care conțin
Se-cisteină (Wirth și Romano, 1995).
După electroforeză, detecția semnalului poate fi realizată cu ajutorul unui film, prin
autoradiografie directă pentru a izotopii care emit γ sau prin fluorografie pentru izotopii care β.
Fluorografia utilizează amplificatori fluorescenți impregnați în matricea de gel care imbunătațesc
detectia emisiei radioactive, prin generarea de lumină. Pentru anumiți izotopi de mare energie,
precum 32P şi 125I, pot fi utilizate ecrane de intensificare pentru a consolida semnalul. Aceste
ecrane absorb emisiile radioactive care trec prin film, fluorescenţa şi generare de lumină care
expune filmul. În ultimile decenii, sistemele de stocare a imaginilor de fosfor și analizoarele
placă microcanal au început să înlocuiască filmul autoradiografic în deteția proteinelor marcate
radioactiv. Cele mai noi tehnologii oferă o gamă dinamică mai largă şi o sensibilitate mai mare
de detecţie decât filmul fotografic (Patton, 2002).
Radiomarcarea a fost larg folosită în experimente metabolice „in vivo”. Pentru a se evalua, în
acelaşi timp, nivelele totale ale proteinelor exprimate, alături de analiza vitezelor de sinteză a
acestora, precum și pentru a oferi repere vizuale în localizarea unor proteine puțin abundente în
geluri, după 2D-PAGE se recurge la metode de colorare care implică coloranți organici sau
colorația cu argint, folosite de obicei în conjucție cu tehnicile de radiomarcare (Kuhn și colab.,
1989; Luo și Wirth, 1993; Westbrook și colab., 2001). Cu toate acestea, utilitatea generală a
radiomarcării ca instrument de evaluare a vitezelor de sinteză a proteinelor a fost pusă în discuție
după cum s-a constatat că încoporarea metabolică a unor compuși radiomarcați precum [35S]
metionina, în doze standard, induce fragmentarea ADN-ului, niveluri ridicate ale proteinei
supresoare tumorale p53, modificarea morfologiei celulare/nucleare şi stoparea ciclului celular
sau apoptoză (Patton, 2002). Deși se realizează uşor o detecție sensibilă, radiomarcarea este atât
periculoasă cât și şi costisitoare (Hofer și Hughes, 1971; Kassis și colab., 1980).
4.7.1. Marcarea cu izotopi radioactivi
În lucrarea de pionerat a lui O´Farrell (1975) asupra rezoluției înalte a electroforezei 2D se
arată că autoradiografia este de 100–1000 ori mai sensibilă decât colorația cu CBB. Marcarea
este realizată predominant în celule vii, în bacterii, drojdii sau culturi de celule cu ajutorul 35S-
metioninei și/sau 32P-ortofosfatului. Este de asemenea posibil să se aplice marcare specifică, de
exemplu 32PO43˗ pentru detecția fosfoproteinelor. Marcarea post-sintetică, de exemplu prin
iodurare cu 125I ori de alchilare a resturilor de cisteină cu 14C- ori 3H-iodoacetamidă este
problematică datotită probelemelor legate de reproductibilitate și sensibilitate. Deoarece stratul
umed de gel stingel semnalul radioactiv, este necesar ca gelurile să fie uscate înainte de
expunerea la un film de raze X ori de analiză a stocării fosforului.
4.7.2. Fluorografia
Gelurile umede pot fi utilizate iar sensibilitatea poate fi crescută prin autoradiografie de
scintilație, numită și fluorografie. Gelul care conține proteine marcate cu 35S, 14C- ori 3H este
impregnat după fixare cu un fluor precum 2,5-difeniloxacolul. Particulele de energie joasă β
excită moleculele de fluor, care vor emite apoi un semnal luminos. Cu toate că metoda pare a fi
ușoară ea nu este foarte utilizată în aplicațiile proteomice deoarece spoturile cu expresie proteică
scăzută nu conțin proteină suficientă pentru următoarele analize de spectrometrie de masă. În
plus, din rațiuni de mediu înconjurător, autoradiografia și fluorografia devin mai puțin
importante.
4.7.3. Marcarea cu izotopi stabili
Metodele de marcare cu izotopi stabili pentru analiza diferențelor dintre două probe pot fi
utilizate numai când este disponibilă tehnica de spectrometrie de masă de rezoluție înaltă. Pentru
asemenea abordări diferențiale, celulele pot fi marcate prin adaptarea unor tehnici dezvoltate
pentru rezonanța magnetică nucleară prin utilizarea sării de amoniu ca sursă de azot cu marcare
14
N față de 15N ori a glucozei ca sursă de carbon, cu marcare 12C față de 13C. Detecția se
realizează prin spectrometrie de masă a proteinei din spotul electroforetic, după digestia triptică
a sa. Deoarece ionizarea este egală pentru aceleași peptide care conțin izotopi diferiți, înălțimea
peak-urilor shiftate putând fi utilizate la măsurarea rapoartelor cantitative (Oda și colab., 1999)
Pentru izotopul stabil legat la proteină după sinteză, marcarea cu izotop afin codat la capăt
(isotope coded affinity tag-ICAT), o tehnică de măsurare a cantităţilor relative de proteine iîntr-o
probă în raport cu un alt eşantion prin utilizarea capetelor libere-tag-urilor care conţin izotopilor
stabili de mase diferite, cunoscută ca analiză de spectrometrie de masă diferențială, a fost de
asemenea aplicată pentru electroforeza 2-D (Smolka și colab., 2002)
4.8. METODE DE MARCARE POSTELECTROFORETICĂ BAZATE PE
PROCESE DE CHEMILUMINESCENŢĂ
Se poate defini termenul de chemiluminescență (CL) drept o emisie de radiație în domeniul
ultraviolet, vizibil ori infraroșu dintr-o moleculă sau atom ca rezultat al tranziției dintr-o stare
electronic excitată, rezultată adrept consecință a unei reacții chimice. Această reacție produce o
cantitate suficientă de energie pentru a induce tranziția unui electron din starea sa de bază într-o
stare excitată. Această tranziție electronică este însoţită adesea însoțită de schimbări vibraționale
și rotaționale în moleculă. În molecule organice, tranzițiile cele mai frecvent implicate în emisia
chemoluminiscentă sunt π→π* și n→π* (Dodeigne și colab., 2000). Când reacția se manifestă în
organismele vii sau este derivat dintr-un asemenea proces, fenomenul este denumit
bioluminescență.
Cel mai cunoscut exemplu ca și reacție directă este oxidarea luminolului (5-
aminoftalilhidrazida) într-un mediu alcalin cu producerea anionului excitat 3-aminoftalat, care
emite o cuantă de lumină când se relaxează și trece în stare fundamnetală, cu un randament
cuantic de aproximativ 0,01 în apă și 0,05 în dimetil sulfoxid (DMSO) (Gamiz-Gracia și colab.,
2005). Drept oxidanţi pot fi folosiți permanganatul, periodatul, hexacianoferatul (III) şi
peroxidul de hidrogen. Reacţia este catalizată, în toate cazurile, de către ionii metalici (Fe (II),
Cu (II) şi Co (II), de exemplu), oferind un sistem puternic de detecție cu aplicații bio-analitice
diverse (Yamaguchi și colab., 2002).
Din punct de vedere analitic, reacţiile CL sunt atractive (Jimenez și Navas, 2002) din cauza
aptului că:
 Au o sensibilitate excelentă și o limită de detecție excepțională deoarece nu există o
sursă de zgomot de fond sau o împrăştiere, fiind rapide și cu o reproductibilitate ridicată.
 Uneori, selectivitatea mare, este limitată la un număr reacţii disponibile.
 Instrumentele utilizate sunt simple, robuste și ieftine (Schmidt, 1999) potrivite tuturor
tehnicilor de laborator.
Folosite de obicei pentru detectarea proteinelor după electroblotting, metodele
chemiluminescente nu au fost inițial utilizate pentru a analiza profilului proteic direct, pe geluri
de poliacrilamid, introducerea acestor metode fiind raportată relativ recent (Akhaven-Tafti și
colab., 2001; Desai și colab., 2001).
Acridan fosfatul, un derivat maleimidic, utilizat drept reactiv de marcare CL a fost utilizat la
pre-derivatizarea albuminei serice bovine, înainte de SDS-PAGE (Akhaven-Tafti și colab.,
2001). Gelurile au fost apoi tratate cu un tampon acid şi bazic care conţineau un peroxid, și care
au iniţiat o generare rapidă de lumină, putându-se astfel detecta prin această procedură între 1 și
650ng de BSA. Acest proces trebuie să fie considerat în cel mai bun scenariu deoarece BSA este
o proteină neobșnuită care canține un număr mare de resturi de cisteina (35 în total) atunci când
este în formă redusă. Sensibilitatea de detecție pentru proteine cu un număr mediu de reziduuri
de cisteina este de aproximativ 10ng, nivel de sensibilitate realizate și de colorația cu CBB
coloidal. În prezent, metoda de detecție chemiluminiscentă a fost validată din punct de vedere al
fezabilității numai pe un model de proteine și rămâne de văzut dacă tehnica marcare va permite
detectarea proteinelor din probe biologice complexe, cu o sensibilitate de detectare, care să fie
competitivă cu metodele de colorare fluorescente, colorații negative sau colorare cu argint
(Patton, 2002). Detectarea specifică a unui antigen, direct pe gelurile de poliacrilamidă în
prezență de SDS, fără a fi necesară o etapă de electrotransfer a fost de asemenea, demonstrată
(Desai și colab., 2001). Metoda este simplă și se bazează pe proceduri vechi de imunodetecție pe
geluri, care au fost în uz înainte de lucrarea lui Towbin (1979) referitoare la electroblotting.
În ultimii ani, disponibilitatea metodelor chemiluminescente, extrem de sensibile, a făcut
tehnica de evidențiere pe gel un procedeu suficient de sensibil pentru o serie de aplicaţii (Patton,
2002; Liu și Cheng, 2002).
Bibliografie

Adams L. D., Weaver, K. M. (1990) Detection and recovery of proteins from gels following zinc chloride
staining. Appl. Theor. Electrophoresis 1:279-282.
Akhaven-Tafti, H. DeSilva, R. Sugioka, K. Handley, R. Schaap, A. (2001) Chemiluminescent acridan phosphate
labelling compounds for detection in gels. Luminescence 16 187-191.
Alban, A., David, S., Bjorkesten, L., Andersson, C., Sloge, E., Lewis, S., Currie, I. (2003) A novel experimental
design for comparative two-dimensional gel analysis: two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a
pooled internal standard. Proteomics 3:36–44.
Allen, R. E., Masak, K. C., McAllister, P. K. (1980) Staining protein in isoelectric focusing gels with fast green.
Anal. Biochem. 104:494 -498.
 Anderson, N. L., Esquer-Blasco, R., Hofmann, J.-P., Anderson, N. G. (1991) A two-dimensional gel database of
rat liver proteins useful in gene regulation and drug effect studies. Electrophoresis 12:907–930.
Andrews, A.T., Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical and Clinical Applications, 2nd ed.,
(Oxford University Press, NY, 1988) pp.38-42.
Antipov, A. N., Lyalikova, N. N., L'vov, N. P. (2000) Vanadium-binding protein excreted by vanadate-reducing
bacteria. IUBMB Life 49:137-141.
Antipov, A. N., Sorokin, D. Y., L'vov, N. P., Kuenen, J. G. (2003) New enzyme belonging to the family of
molybdenum-free nitrate reductases. Biochem J. 369:185-189.
Bader, J. P., Ray, D. A., Steck, T. L. (1972) Electrophoretic determinations of hyaluronate produced by cells in
culture. Biochim Biophys Acta. 264:73-84.
Barger, B. O., White, R. C., Pace, J. L., Kemper, D. L., Ragland, W. L. (1976) Estimation of molecular weight
by polyacrylamide gel electrophoresis using heat stable fluorophors. Anal. Biochem 70:327-335.
Bean, R. C., Shepherd, W. C., Kay, R. E., Walwick, E. R. (1965) Spectral changes in a cationic dye due to
interaction with macromolecules. J. Phys. Chem. 69:4368-4379.
Beisiegel, U. (1986) Protein blotting. Electrophoresis 7:1–18.
Berggren, K. N., Schulenberg, B., Lopez, M. F., Steinberg, T. H., Bogdanova, A., Smejkal, G., Wang, A., Patton,
W. F. (2002) An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: comparison with the original formulation
and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics 2:486-498.
Berggren, K., Chernokalskaya, E., Steinberg, T. H., Kemper, C., Lopez, M. F., Diwu, Z., Haugland, R. P., Patton,
W. F. (2001) Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis 21:2509-2521.
Bermudez, A., Daban, J. R., Garcia, J. R. Mendez, E. (1994) Direct blotting, sequencing and immunodetection of
proteins after five-minute staining of SDS and SDS-treated IEF gels with Nile red. Biotechniques. 16:621-624.;
Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. (1996) SYPRO orange and SYPRO red protein gel stains:
one-step fluorescent staining of denaturing gels for detection of nanogram levels of protein. Anal. Biochem. 239:223-
237.
Bers, G., Garfin, D. (1985) Protein and nucleic acid blotting and immunobiochemical detection. Biotechniques
3:276–288.
Berson, G. (1983) Silver staining of proteins in polyacrylamide gels: increased sensitivity by a blue toning Anal.
Biochem. 134:230–234.
Blum H., Beier, H., Gross, H. J. (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in
polyacrylamide gels. Electrophoresis 8:93-99. http://www.biochem.uwo.ca/wits/bmsl/polyacrylamide_gel_staining
.pdf
Bonner, W. M., Laskey, R. A. (1974) A film detection method for tritium-labelled proteins and nucleic acids in
polyacrylamide gels. Eur. J. Biochem. 46:83-88.
Brush M. (1998) Dye Hard: Protein Gel Staining Products. The Scientist 12:16.
Burnette, W.N. (1981) "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--
polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein
A. Anal. Biochem. 112:195-203.
Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O. (1983) Staining of the Ca2+-binding proteins, calsequestrin,
calmodulin, troponin C, and S-100, with the cationic carbocyanine dye "Stains-all". J. Biol. Chem. 258:11267-11273.
Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L.,
Rigetti, P. G. (2004) Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.
Electrophoresis 25:1327-1333.
Carson, S. D. (1977) Hydrazinoacridine staining of proteins and glycoproteins in polyacrylamide gels. Anal.
Biochem. 78:428-435.
Castellanos-Serra, L. R., Hardy, E., Sánchez, J. C. (1998) Fast passive elution of DNA from zinc–imidazole
negatively stained polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 257:227–228.
Castellanos-Serra, L., Hardy E. (2001) Detection of biomolecules in electrophoresis gels with salts of imidazole
and zinc II: a decade of research. Electrophoresis 22:864-873.
Castellanos-Serra, L., Proenza, W., Huerta, V., Moritz, R. L., Simpson, R. J. (1999) Proteome analysis of
polyacrylamide gel-separated proteins visualized by reversible negative staining using imidazole-zinc salts.
Electrophoresis 20:732-737
Chen, Y., Drysdale, J. (1993) Detection of iron binding proteins by a blotting technique. Anal. Biochem. 212:47-
49.
Choi, J.-K., Hong, H.-Y., Yoo, G.-S. Protein Staining with Calconcarboxylic Acid in Polyacrylamide Gels. In The
Protein Protocols Handbook Edited by: J. M. Walker Humana Press Inc., Totowa, NJ, pag. 197-201, 2002.
Chrambach, A., Reisfeld, R.A., Wyckoff, M., Zaccari, J. (1967) A procedure for rapid and sensitive staining of
protein fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 20:150-154.
Cutting, J. A. (1984) Gel protein stains: phosphoproteins. Methods Enzymol. 104:451-455.
Cutting, J. A. (1985) [32] Gel protein stains: Phosphoproteins. Methods Enzymol. 104:451-455.
 Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. (1969) Electrophoretic characterization of bacterial
polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J. Mol. Biol. 41:139-147.
Datyner, A., Finnimore, E. D. (1973) A prestaining method for the quantitative assay of proteins on
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 55:479-491.
Davis, B. J. (1964) Disc electrophoresis. ii. method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci.
121:404-427.
de Moreno, M. R., Smith, J. F., Smith, R. V. (1985) Silver staining of proteins in polyacrylamide gels: increased
sensitivity through a combined Coomassie blue-silver stain procedure. Anal. Biochem. 151:466-470.
de Moreno, M. R., Smith, J. F., Smith, R. V. (1986) Mechanism studies of coomassie blue and silver staining of
proteins. J Pharm Sci. 75:907-911.
Desai, S. Dworecki, B. Cichon, E. (2001) Direct immunodetection of antigens within the precast polyacrylamide
gel. Anal. Biochem. 297:94-98.
Dodeigne, C., Thunus, L. Lejeune, R. (2000). Chemiluminecence as a diagnostic tool. A review. Talanta 51:415-
439.
Dunbar, B. S., Dudkiewicz, A. B., Bundman, D. S. (1985) Proteolysis of specific porcine zona pellucida
glycoproteins by boar acrosin. Biol. Reprod. 32:619-630.
Dyballa, N., Metzger, S. (2009). Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in
Polyacrylamide Gels. J Vis Exp. 30. http://www.jove.com/index/details.stp?id=1431, doi: 10.3791/1431.
Dzandu, J. K. Johnson, J. F., Wise, G. E. (1988) Sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis: staining of
polypeptides using heavy metal salts. Anal. Biochem. 174:157-167.
Dzandu, J. K., Deh, M. E., Barratt, D. L., Wisw, G. E. (1984) Detection of erythrocyte membrane proteins,
sialoglycoproteins, and lipids in the same polyacrylamide gel using a double-staining technique. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 81:1733-1737.
Eng, P. R., Parker, C. O. (1974) Selectrophoresis of fluorescamine-labelled proteins. Anal. Biochem. 89:323-329.
Fazekas de St Groth, S., Webster, R. G., Datyner, A. (1963) Two new staining procedures for quantitative
estimation of proteins in electrophoresis strips. Biochim. Biophys. Acta. 71:377–391.
Fernandez-Patron, C. Castellanos-Serra L. and Rodriquez, P. (1992) Reverse staining of sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gels by imidazole-zinc salts: sensitive detection of unmodified proteins. Biotechniques. 12:564-573.
Fernandez-Patron, C., Calero, M., Collazo, P. R., Garcia, J. R., Madrazo, J., Musacchio, A., Soriano, F., Estrada,
R., Frank, R., Castellanos-Serra, L. R., Mendez, E. (1995) Protein reverse staining: high-efficiency microanalysis of
unmodified proteins detected on electrophoresis gels. Anal. Biochem. 224:203-211.
Fernandez-Patron, C., Castellanos-Serra, L., Hardy, E., Guerra, M., Estevez, E., Mehl, E., Frank, R. W. (1998)
Understanding the mechanism of the zinc-ion stains of biomacromolecules in electrophoresis gels: generalization of
the reverse staining technique. Electrophoresis 19:2398–2406.
Fernandez-Patron, C., Hardy, E., Sosa, A., Seoane, J., Castellanos, L. (1995) Double staining of coomassie blue-
stained polyacrylamide gels by imidazole-sodium dodecyl sulfate-zinc reverse staining: sensitive detection of
coomassie blue-undetected proteins. Anal Biochem. 224:263-269.
Ferreras, M. Gavilanes J.G. Garcia-Segura, J.M. (1993) A permanent Zn2+ reverse staining method for the
detection and quantification of proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 213:206-212.
Gabriel, O. Locating enymes on gels, În Methods in Enzymology, vol. 22 (Colowick, S. P. and Kaplan, N. O.,
eds.), Academic, New York, p. 578-604, 1971.
Gabriel, O., Gersten, D. M. (1992) Staining for enzymatic activity after gel electrophoresis, I. Anal. Biochem.
203:1-21.
Gamiz-Gracia, L., Garcia-Campana, A. M., Soto-Chinchilla, J., Huertas-Perez, J. F., Gonzalez-Casado, A. (2005)
Analysis of pesticides by chemiluminescence detection in the liquid phase. TrAC (Trends in Analytical Chemistry).
24:927-942.
Gander, J. E. (1984) Gel protein stains: glycoproteins. Methods Enzymol. 104:447-451.
Gershoni, J. M. (1985) Protein blotting: developments and perspectives. Trends Biochem. Sci. 10:103-106
Gershoni, J. M. (1988) Protein blotting: a manual. Methods Biochem Anal 33:1-58.
Gershoni, J. M., Palade, G. E. (1983) Protein blotting: principles and applications. Anal. Biochem. 131:1-15.
Gersten, D. M., Gabriel, O. (1992) Staining for enzymatic activity after gel electrophoresis. II. Enzymes
modifying nucleic acids. Anal. Biochem. 203:181-186.
Gharahdaghi, F., Weinberg, C. R., Meagher, D. A., Imai, B. S., Mische, S. M. (1999). Mass spectrometric
identification of proteins from silver-stained polyacrylamide gel: A method for the removal of silver ions to enhance
sensitivity. Electrophoresis. 20:601-605.
Gillespie, A. S., Elliott, E. (2005) Comparative advantages of imidazole–sodium dodecyl sulfate–zinc reverse
staining in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 345:158–160.
Goldberg, H. A., and Warner, K. J. (1997). The staining of acidic proteins on polyacrylamide gels: Enhanced
sensitivity and stability of "Stains-all" staining in combination with silver nitrate. Anal. Biochem. 251:227-233.
Goldman, D., Merril,C. R., Ebert, M. H. (1980) Two-dimensional gel electrophoresis of cerebrospinal fluid
proteins. Clin. Chem. 26:1317-1322
 Görg, A., Postel, W., Günther, S., Weser, J., Strahler, J. R., Hanash, S. M., Somerlot, L., Kuick, R. (1988)
Approach to stationary two-dimensional pattern: influence of focusing time and immobiline/carrier ampholytes
concentrations. Electrophoresis. 9:37-46
Gorovsky, M. A., Carlson, K., Rosenbaum, J. L. (1970) Simple method for quantitive densitometry of
polyacrylamide gels using fast green. Anal. Biochem. 35:359-370.
Green, M. R., Pastewka, J. V., Peacock, A. C. (1973) Differential staining of phosphoproteins on polyacrylamide
gels with a cationic carbocyanine dye. Anal Biochem. 56:43-51.Griffith, I. P. (1972) Immediate visualization of
proteins in dodecyl sulfate-polyacrylamide gels by prestaining with Remazol dyes. Anal Biochem. 46:402-412
Gromova, I., Celis, J. E. Protein detection in gels by silver staining: A procedure compatible with mass-
spectrometry, in Cell Biology. A Laboratory Handbook (Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K.,
and Small, J. V., eds) Vol. 4, Academic Press, San Diego, 2004.
Gulin, S., Pupo, E., Schweda, E. K., Hardy, E. (2003). Linking mass spectrometry and slab-polyacrylamide gel
electrophoresis by passive elution of lipopolysaccharides from reverse-stained gels: analysis of gel-purified
lipopolysaccharides from Haemophilus influenza strain Rd. Anal. Chem. 75:4918-4924.
Hahn, E.J. (1983) Autoradiography: A review of basic principles. Am. Lab. 15:64-71.
Hardy, E., Castellanos-Serra, L. (2004) “Reverse-staining” of biomolecules in electrophoresis gels: analytical and
micropreparative applications. Anal. Biochem. 328:1-13.
Hardy, E., Pupo, E., Casalvilla, R., Sosa, A. E., Trujillo, L. E., López, E., Castellanos-Serra, L. (1996) Negative
staining with zinc–imidazole of gel electrophoresis-separated nucleic acids by zinc–imidazole. Electrophoresis
17:1537–1541.
Hardy, E., Pupo, E., Castellanos-Serra, L., Reyes, J., Fernandez-Patron, C. (1997) Sensitive reverse staining of
bacterial lipopolysaccharides on polyacrylamide gels by using zinc and imidazole salts. Anal. Biochem. 244:28-32.
Hardy, E., Pupo, E., Santana, H., Guerra, M., Castellanos-Serra, L. R. (1998) Elution of lipopolysaccharides from
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 264:127–129.
Hardy, E., Pupo, E., Silva, J. A., Silva, R., Coizeau, E., Castellanos-Serra, L. (1998) Elution of unmodiffied
oligodeoxynucleotides from zinc–imidazole negatively stained polyacrylamide ges. Anal. Biochem. 264:127–129.
Hardy, E., Silva, R., Pupo, E., Hermida, L., Coizeau, E., Niebla, O., Castellanos-Serra, L. (2001) Comparison of
two electrophoresis-based DNA micropurification methods for molecular cloning. Biotecnol. Apli. 18:29–32.
Harowitz, P. M., Bowman, S. (1987) Ion-enhanced fluorescence staining of sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels using bis(8-p-toluidino-1-naphthalenesulfonate). Anal. Biochem. 165:430-434.
Harrington, M. G., Merril, C. R. (1984) Two-dimensional electrophoresis and "ultrasensitive" silver staining of
cerebrospinal fluid proteins in neurological diseases. Clin. Chem. 30:1933-7.
Hart, C., Schulenberg, B., Steinberg, T. H., Leung, W. Y., Patton, W. F. (2003) Detection of glycoproteins in
polyacrylamide gels and on electroblots using Pro-Q Emerald 488 dye, a fluorescent periodate Schiff-base stain.
Electrophoresis. 24:588-598.
Hartman, B. K., Udenfriend, S. (1969) A method for immediate visualization of proteins in acrylamide gels and its
use for preparation of antibodies to enzymes. Anal. Biochem. 30:391-394.
Heeb, M. J., Gabriel, O. (1984) Enzyme localization in gels. Methods Enzymol. 104:416-439.
Heukeshoven, J., Dernick, R. (1985) Simplified method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and
the mechanism of silver staining. Electrophoresis 6:103–112.
Hochstrasser, D. F., Harrington, M. G., Hochstrasser, A. C., Miller, M. J., Merril, C. R. (1988) Methods for
increasing the resolution of two-dimensional protein electrophoresis. Anal Biochem. 173:424-435.
Hofer, K. Hughes, W. (1971) Radiotoxicity of intranuclear tritium, 125 iodine and 131 iodine. Radiat. Res. 47:94-
101.
Hong, H.-Y., Choi, J.-K., Yoo, G.-S. (1993) Detection of proteins on polyacrylamide gels using calconcarboxylic
acid. Anal. Biochem. 214:96-99.
http://tools.invitrogen.com/Content/SFS/ProductNotes/F_050711_NuPage-TS-TL-MKT-HL.pdf
http://www.gbiosciences.com/ReversibleZincStain-desc.aspx
http://www.med.uc.edu/proteomics/dige.htm
http://www.mpbio.com/detailed_info.php?family_key=04800128&country=175
Irie, S., Sezaki, M., Kato, Y. (1982) A faithful double stain of proteins in the polyacrylamide gels with Coomassie
blue and silver. Anal Biochem. 126:350-354.
Jackowski, G., Liew, C. C. (1980) Fluorescamine staining of nonhistone chromatin proteins as revealed by two-
dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 102:321-5.
Jimenez, A. M., Navas, M. J. (2002) Chemiluminescence Methods (Present and Future). Grasas y Aceites. 53:64-
75.
Jones, L. R., Besch, H. R. Jr., Fleming, J. W, McConnaughey, M. M., Watanabe, A. M. (1979) Separation of
vesicles of cardiac sarcolemma from vesicles of cardiac sarcoplasmic reticulum. Comparative biochemical analysis of
component activities. J Biol Chem. 254:530-539.
Jones, L. R., Cala, S. E. (1981) Biochemical evidence for functional heterogeneity of cardiac sarcoplasmic
reticulum vesicles. J Biol Chem. 256:11809-11818.
 Kang, C., Kim, H. J., Kang, D., Jung, D. Y., Suh, M. (2003) Highly sensitive and simple fluorescence staining of
proteins in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide-based gels by using hydrophobic tail-mediated enhancement of
fluorescein luminescence. Electrophoresis 24:297-3304.
Kang, D., Gho, S.G., Suh, M., Kang, C. (2002) Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie
Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11:1511-
1512.
Kassis, A. I., Adelstein, S. J., Haydock, C., Sastry, K. S. (1980) Radiotoxicity of 75Se and 35S: theory and
application to a cellular model. Radiat Res. 84:407-425.
Kay, R. E., Walwick, E. R., Gifford, C. K. (1964) Spectral changes in a cationic dye due to interaction with
macromolecules. I. Behavior of dye alone in solution and the effect of added macromolecules. J. Phys. Chem.
68:1896-1906.
King, L. E., Morrison, M. (1976) The visualization of human erythrocyte membrane proteins and glycoproteins in
SDS polyacrylamide gels employing a single staining procedure. Anal. Biochem. 71:223-230.
Kuhn, L., Kettman, J., Lefkovits, I. (1989) Consecutive radiofluorography and silver staining of two-dimensional
gel electrophoretograms: application in determining the biosynthesis of serum and tissue proteins. Electrophoresis
10:708-713.
Kumar Mandal, A., Goswami, A., Kanta Pal, M. (1999) Spectralanalysis of the aggregates of Stains-all in the
presence of non-ionic surfactant Triton X-100 by principal componentanalysis method. Colloids and Surfaces A:
Physicochem. Eng. Aspects 154:383–388.
Lamanda, A., Zahn, A., Roder, D., Langen, H. (2004) Improved Ruthenium II tris (bathophenantroline
disulfonate) staining and destaining protocol for a better signal to-background ratio and improved baseline resolution.
Proteomics 4:599-608.
Laskey, R. A., Mills, A. D. (1975) Quantitative film detection of H and 14C in polyacrylamide gels by
fluorography. Eur. J. Biochem. 56:335–341.
Lee, C., Levin, A., Branton, D. (1987) Copper staining: a five-minute protein stain for sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 166:308-312.
Leong, L. M., Tan, B. H., Ho, K. K. (1992) A specific stain for the detection of nonheme iron proteins in
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 207:317-320.
Lin, C.-Y., Huang, H.-M., Chen, H.-M. (2006) Use of backlit light plate to enhance visualization of imidazole-
zinc reverse stained gels. BioTechniques 41:560-564.
Lin, S.-M., Hopfer, S. M., Brennan, S. M., Sunderman, F. W. (1989) Protein blotting method for detection of
nickel-binding proteins. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 65:275-288.
Liu, Y.-M., Cheng, J.-K. (2002) Ultrasensitive chemiluminescence detection in capillary electrophoresis. J.
Chromatograph. A. 959:1-13.
Lopez, M. F., Berggren, K., Chernokalskaya, E., Lazarev, A., Robinson, M. Patton, W. F. (2000) A comparison of
silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and
identification by peptide mass profiling. Electrophoresis 21:3673-3683.
Luo, L., Wirth, P. (1993) Consecutive silver staining and autoradiography of 35S and 32P-labeled cellular proteins:
application for the analysis of signal transducing pathways. Electrophoresis 14:127-136.
Martin, K., Steinberg, T. H., Goodman, T., Schulenberg, B., Kilgore, J. A., Gee, K. R., Beechem, J. M., Patton,
W. F. (2003) Strategies and solid-phase formats for the analysis of protein and peptide phosphorylation employing a
novel fluorescent phosphorylation sensor dye. Comb. Chem. High Throughput Screen 6:331-339.
Maruyama, K., Mikawa, T., Ebashi, S. (1984) Detection of calcium binding proteins by 45Ca autoradiography on
nitrocellulose membrane after sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis. J. Biochem. (Tokyo) 95:511-519.
Maurer; H. R., Allen, R. C. (eds.), Electrophoresis and isoelectric focusing in polyacrylamide gel; advances of
methods and theories, biochemical and clinical applications, Walter de Gruyter (New York: 1974), p. 253.
McMaster-Kaye, R., Kayes, J.S. (1974) Staining of histones on polyacrylamide gels with amido black and fast
green. Anal. Biochem. 61:120 -132.
Merril, C. R. (1990a) Gel-staining techniques. Methods Enzymol. 182:477-488.
Merril, C. R. (1990b). Silver staining of proteins and DNA. Nature 343:779-780
Merril, C. R., Bisher, M. E., Harrington, M., Steven, A. C. (1988) Coloration of silver-stained protein bands in
polyacrylamide gels is caused by light scattering from silver grains of characteristic sizes. Proc Natl Acad Sci U S A.
85:453-457.
Merril, C. R., Dunau, M. L., Goldman, D. (1981). A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide
gels. Anal. Biochem. 110:201-207.
Merril, C. R., Goldman, D., Van Keuren, M. L. (1982) Simplified silver protein detection and image enhancement
methods in polyacrylamide gels. Electrophoresis 3:17–23.
Merril, C. R., Goldman, D., Van Keuren, M. L. (1983) Silver staining methods for polyacrylamide gel
electrophoresis. Methods Enzymol. 96:230-239.
Merril, C. R., Goldman, D., Sedman, S, A., Ebert, M. H. (1981) Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide
gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins. Science. 211:1437-1438.
 Merril, C. R., Harrington, M. G. (1984) "Ultrasensitive" silver stains: their use exemplified in the study of normal
human cerebrospinal fluid proteins separated by two-dimensional electrophoresis. Clin. Chem. 30:1938-1942.
Merril, C. R., Harrington, M., Alley, V. (1984) A photodevelopment silver stain for the rapid visualization of
proteins separated on polyacrylamide gels. Electrophoresis. 5:289-296
Merril, C. R., Pratt, M. E. (1986). A silver stain for the rapid quantitative detection of proteins or nucleic acids on
membranes or thin layer plates. Anal. Biochem. 156:96-110.
Merril, C. R., Switzer, R. C., Van Keuren, M. L. (1979) Trace polypeptides in cellular extracts and human body
fluids detected by two-dimensional electrophoresis and a highly sensitive silver stain. Proc Natl Acad Sci U S A.
76:4335-4339.
Meyer, T. S., Lambert, B. L. (1965) Use of Coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram
quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochim. Biophys. Acta 107:144-145.
Min, H., Cowman, M. K. (1986) Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in
polyacrylamide gels: application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Anal Biochem. 155:275-
285.
Møller, H. J., Heinegård, D., Poulsen, J. H. (1993) Combined alcian blue and silver staining of subnanogram
quantities of proteoglycans and glycosaminoglycans in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Anal. Biochem.
209:169-175.
Morrissey, J. H. (1981) Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: a modified procedure with enhanced
uniform sensitivity. Anal Biochem. 117:307-310.
Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. (2001). Improved silver staining protocols for high sensitivity
protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics 1:1359-
1363.
Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. (1988) Improved staining of proteins in polyacrylamide gels
including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-
250 and R-250. Electrophoresis. 9:255–262.
Nielsen, B. L., Brown, L. R. (1984) The basis for colored silver-protein complex formation in stained
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 141:311-315.
Nishihara, J. C. Champion, K. M. (2002) Quantitative evaluation of proteins in one- and two-dimensional
polyacrylamide gels using a fluorescent stain. Electrophoresis 23:2203-2215.
O’Farrell, P. H. (1975) High-resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250:4007-
4021.
Oakley, B. R., Kirsch, D. R., Morris, N. R. (1980) A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in
polyacrylamide gels. Anal Biochem. 105:361-363.
Ochs, D. (1983) Protein contaminants of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Anal Biochem. 135:470-
474.
Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. (1999) Accurate quantitation of protein expression
and site specific phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:6591–6596.
Ortiz, M.L. Calero, M. Patron, C.F. Castellanos L. Mendez, E. (1992) Imidazole-SDS-Zn reverse staining of
proteins in gels containing or not SDS and microsequence of individual unmodified electroblotted proteins. FEBS
Lett. 296:300-304.
Pace, J. L., Kemper, D. L., Ragland, W. L. (1974) The relationship of molecular weight to electrophoretic
mobility of fluorescamine-labeled proteins in polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 57:482-487.
Patton, W. F. (2000) A thousand points of light: the application of fluorescence detection technologies to two-
dimensional gel electrophoresis and proteomics. EIectrophoresis. 21:1123-1144.
Patton, W. F. (2002) Detection technologies in proteome analysis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life
Sci.771:3-31.
Patton, W. F., Protein detection and imaging in IEF gels. În Handbook of Isoelectric Focusing and Proteomics.,
Separation Science and Technology, Volume 7, Pag. 165-179, Garfin, D., Ahuja, S. eds. Elsevier Inc. , 2005.
Peacock, A.C., Dingman, C.W. (1967) Resolution of multiple ribonucleic acid species by polyacrylamide gel
electrophoresis. Biochemistry 6:1818-1827.
Prat, J. P., Lamy, J. N., Weill, J. D. (1969) Staining of lipoproteins after electrophoresis in polyacrylamide gel.
Bull Soc Chim Biol (Paris). 51:1367.
Pupo, E., Aguila, A., Santana, H., Núñez, J. F., Castellanos-Serra, L., Hardy, E. (1999) Mice immunization with
gel electrophoresis-micropurified bacterial lipopolysaccharides. Electrophoresis 20:458–461.
Pupo, E., Lopez, C. M., Alonso, M., Hardy, E. (2000) High-efficiency passive elution of bacterial
lipopolysaccharides from polyacrylamide gels. Electrophoresis 21:526-530.
Pupo, E., Phillips, N. J., Gibson, B. W., Apicella, M. A., Hardy, E. (2004). Matrix-assisted laser
desorption/ionization-time of flightmass spectrometry of lipopolysaccharide species separated by slab-polyacrylamide
gel electrophoresis: high-resolution separation and molecular weight determination of lipooligosaccharides from
Vibrio fischeri strain HMK. Electrophoresis 25:2156-2164.
Queiroz-Claret, C., Meunier, J. C. (1993) Staining technique for phosphatases in polyacrylamide gels. Anal.
Biochem. 209:228-231.
 Rabilloud, T. (1990). Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: A 10-year synthesis.
Electrophoresis 10:785-794.
Rabilloud, T. (1999). Silver staining of 2-D electrophoresis gels. Methods Mol Biol. 112:297-305.
Rabilloud, T., Strub, J. M., Luche, S., van Dorsselaer, A. Lunardi, J. (2001) A comparison between Sypro Ruby
and ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) as fluorescent stains for protein detection in gels. Proteomics
1:699-704.
Ragland, W. L., Pace, J. L., Kemper, D. L. (1974) Fluorometric scanning of fluorescamine-labeled proteins in
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 59:24-33.
Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. (1979) Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and
detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
76:3116-3120.
Rizvi, G. H., Singh, R. P. (1972) Tropoloae as a specific reagent for the determination of vanadium (V). Talanta
19:1198-1201.
Rochette-Egly, C., Stussi-Garaud, C. (1984) Selective detection of calmodulin in polyacrylamide gels by double
staining with Coomassie Blue and silver. Electrophoresis. 5:285-288.
Ross, M., Peters, L. (1990) Double staining to increase the sensitivity of protein detection in polyacrylamide gels.
Biotechniques 9:532-533.
Rybicki, E., Purves, M. A Manual of Online Molecular Biology Techniques. Copyright Ed Rybicki, 2005.
http://www.mcb.uct.ac.za/Manual/molbiol_manual.htm
Sammons, D. W., Adams, L. D., Nishizawa, E. E. (1981) Ultrasensitive silver-based color staining of polypeptides
in polyacrylamide gels. Electrophoresis 2:135–141.
Scheler, C., Lamer, S., Pan, Z., Li, X. P., Salnikow, J., Jungblut, P. (1998) Peptide mass fingerprint sequence
coverage from differently stained proteins on two-dimensional electrophoresis patterns by matrix assisted laser
desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS). Electrophoresis 19:918-927.
Schetters, H., McLeod, B. (1979) Simultaneous isolation of major viral proteins in one step. Anal. Biochem.
98:329-334.
Schmidt, B. (1999). Light Minded: Instruments for chemiluminescence and fluorescence measurements.The
Scientist 13, (http://www.the-scientist.com/yr1999/may/profile1990510.html).
Schulenberg, B., Aggeler, R., Beechem, J. M., Capaldi, R. A. Patton, W. F. (2003) Analysis of steady-state protein
phosphorylation in mitochondria using a novel fluorescent phosphosensor dye. J. Biol. Chem. 278:27251-27255.
Schulenberg, B., Beechem, J. M., Patton, W. F. (2003) Mapping glycosylation changes related to cancer using the
Multiplexed Proteomics technology: a protein differential display approach. J. Chromatogr. B 793:127-139.
Sharma,Y., Rao, C. M., Rao, S. C., Krishna, A. G., Somasundaram, T., Balasubramanian, D. (1989) Binding site
conformation dictates the color of the dye stains-all. A study of the binding of this dye to the eye lens proteins
crystallins. J Biol Chem. 264:20923-20937.
Shaw, J., Rowlinson, R., Nickson, J., Stone, T., Sweet, A., Williams, K., Tonge, R. (2003) Evaluation of
saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics 3:1181-1195.
Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained
polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68:850-858.
Simpson, R. J. Cold Spring Harb. Protoc.; 2007; doi:10.1101/pdb.prot4701, adaptat după Peptide Mapping and
Sequence Analysis of Gel-Resolved Proteins," Chapter 7, in Proteins and Proteomics by Richard J. Simpson. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2003.
Smolka, M., Zhou, H., Aebersold, R. (2002) Quantitative protein profiling using two-dimensional gel
electrophoresis ,,isotope coded affinity tag labeling and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 1:19–29.
Sorensen, B. K, Hojrup, P., Ostergard, E., Jorgensen, C. S., Enghild, J., Ryder, L. R., Houen, G. (2002). Silver
staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by
polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 304:33-41.
Steinberg, T. H., Lauber, W. M., Berggren, K., Kemper, C., Yue, S., Patton, W. F. (2000) Fluorescence detection
of proteins in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using environmentally benign, nonfixative, saline solution.
Electrophoresis. 21:497-508.
Steinberg, T. H., Agnew, B. J., Gee, K. R., Leung, W. Y., Goodman, T., Schulenberg, B., Hendrickson, J.,
Beechem, J. M., Haugland, R. P., Patton, W. F. (2003) Global quantitative phosphoprotein analysis using Multiplexed
Proteomics technology. Proteomics 3:1128-1144.
Steinberg, T. H., Chernokalskaya, E., Berggren, K., Lopez, M. F., Diwu, Z., Haugland, R. P., Patton, W. F. (2000)
Ultrasensitive fluorescence protein detection in isoelectric focusing gels using a ruthenium metal chelate stain.
Electrophoresis 21:486-496.
Steinberg, T. H., Haugland, R. P., Singer, V. L. (1996 a) Applications of SYPRO orange and SYPRO red protein
gel stains. Anal. Biochem. 239:238-245.
Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. (1996 b) SYPRO orange and SYPRO red protein gel
stains: one-step fluorescent staining of denaturing gels for detection of nanogram levels of protein. Anal. Biochem.
239:223-237.
 Steinberg, T. H., Pretty. On Top, K., Berggren, K. N., Kemper, C., Jones, L., Diwu, Z., Haugland, R. P., Patton,
W. F. (2001) Rapid and simple single nanogram detection of glycoproteins in polyacrylamide gels and on electroblots.
Proteomics. 1:841-855.
Stephens, R. E. (1975) High resolution preparative SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: fluorescent
visualization and electrophoretic elution-concentration of protein bands. Anal. Biochem. 65:369-379.
Stephens, R. E. (1978) Fluorescent thin-layer peptide mapping for protein identification and comparison in the
subnanomole range. Anal. Biochem. 84:116–126.
Switzer, R. C. 3rd, Merril, C. R., Shifrin, S. (1979) A highly sensitive silver stain for detecting proteins and
peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98:231-237.
Timmons, T. M., Dunbar, B. S. (1990) Protein blotting and immunodetection. Methods Enzymol. 182:679-688.
Tjissen, P., Kurstak, E. (1979) A simple and sensitive method for the purification and peptide mapping of proteins
solubilized from densonucleosis virus with sodium dodecyl sulfate. Anal. Biochem. 99:97-104.
Tonge, R., Shaw, J., Middleton, B., Rowlinson, R., Rayner, S., Young, J., Pognan, F., Hawkins, E., Currie, I.,
Davison, M. (2001) Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis
proteomics technology. Proteomics. 1:377-396.
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:4350–4354.
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. (1989) Immunoblotting in the clinical laboratory. J. Clin. Chem. Clin.
Biochem. 27:495-501.
Unlu, M., Morgan, M. E., Minden, J. S. (1997) Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting
changes in protein extracts. Electrophoresis 18:2071-2077.
Wallace, R. A., Begovac, P. C. (1985) Phosvitins in Fundulus oocytes and eggs. Preliminary chromatographic and
electrophoretic analyses together with biological considerations. J Biol Chem. 260:11268-11274.
Weber, G., Schwamberger, G., Ferber, E. (1993) A fast and sensitive method for detection of phospholipid-
binding proteins on nitrocellulose membranes. Anal. Biochem. 209:251-257.
Weidekamm, E., Wallach, D. F. H., Flückiger, R. (1973) A new sensitive, rapid fluorescence technique for the
determination of proteins in gel electrophoresis and in solution. Anal Biochem. 54:102-114.
Westbrook, J., Yan, J., Wait, R., Dunn, M. (2001) A combined radiolabelling and silver staining technique for
improved visualisation, localisation, and identification of proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis.
Proteomics 1:370-376.
Wilson, C. M. (1983) Staining of proteins on gels: comparisons of dyes and procedures. Method Enzymol. 91:236-
247
Wirth, P. J., Romano, A. (1995) Staining methods in gel electrophoresis, including the use of multiple detection
methods. J. Chromatogr. A 698:123-143.
Wray, W., Boulikas, T., Wray, V. P., Hancock, R. (1981) Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Anal
Biochem. 118:197-203.
www.GBiosciences.com
Yamaguchi, M., Yoshida, H,, Nohta, H. (2002) Luminol-type chemiluminescence derivatization reagents for
liquid chromatography and capillary electrophoresis. J Chromatogr A. 950:1-19.
Yamamoto, K., Okamoto, Y., Sekine, T. (1978) Fluorescent tracer method for protein SH groups. II. Anal
Biochem. 84:313-318.
Yan, J. X., Wait, R., Berkelman, T., Harry, R. A., Westbrook, J. A., Wheeler, C. H., Dunn, M. J. (2000). A
modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix-assisted laser
desorption/ionization and electrospray ionization-mass spectrometry. Electrophoresis 17:3666-3672.
Zacharius, R. M., Zell, T. E., Morrison, J. H., Woodlock, J. J. (1969) Glycoprotein staining following
electrophoresis on acrylamide gels. Anal Biochem. 30:148-152.
 4.9. DETECȚIA POSTELECTROFORETICĂ A UNEI ACTIVITĂȚI
ENZIMATICE ÎN GEL
Detectarea proteinelor cu activitate enzimatică după gel-electroforeză şi stabilirea exactă a
benzilor individuale proteice produse astfel datorită activităţii catalitice specifice rămâne o ţintă
fascinantă. Acest lucru a fost bine evidenţiat de numărul mare de studii concentrate în acest scop
(Seymour și Lazarus, 1989; Marshall și colab., 1984; Leibenguth, 1974; Holstein și colab.,
1967; Shaw și Prasad, 1970; Schimke şi Grossbard, 1968). Cu o vedere spre trecut este
interesant de observat legăturile intime dintre metodele de evidenţiere postelectroforetice de cele
histochimice din care, majoritatea metodelor de evidenţiere au provenit. În acelaşi timp, noi
enzime continuă să fie descoperite, de unde noi probleme în evidenţierea lor postelectroforetică.
O strategie optimă în alegerea unei metode care nu este prezentată o reprezintă consultarea unor
lucrări de histologie, deoarece metodele histologice sunt aplicabile cu modificări minore la
evidenţierea specifică postelectroforetică prin dezvoltarea culorii în geluri de poliacrilamidă ori
agaroză. O serie de metode vechi conţin principii teoretice valoroase care pot fi uşor adaptate
utilizând tehnicile moderne. De exemplu, o descriere a tehnicii de acoperire a gelului cu hârtie de
filtru poate fi adaptată uşor la utilizarea transferului pe membrană sau pe un alt gel acoperitor,
după cum principiul metodei rămâne neschimbat (de exemplu enzime auxiliare, necesităţile în
cationi, cosubstrate, etc) rămân neschimbate (Gabriel şi Gerstent, 1992a).
O proprietate importantă a procesării post-electroforetice în scopul evidenţierii activităţilor
enzimatice de care trebuie să se ţină mereu seama este aceea de verificare clară dacă colorarea
reprezintă activitatea enzimatică dorită, şi nu reprezintă un artefact ori o altă activitate
enzimatică. Astfel sunt necesare o serie de experimente pentru a răspunde la următoarele
întrebări: precum dacă este colorarea dependentă de substrat; inhibitorii specifici conduc la
dispariţia culorii; enzima denaturată reacţionează în cursul procesului de culoare; lipsa
cofactorilor esenţiali conduce la dispariţia culorii.
Singurele probleme sunt întâmpinate din cauza faptului că activitatea enzimatică trebuie
demonstrată după rezolvarea gelului. Separarea proteinelor native care îşi menţin activitatea
biologică în timpul procesului electroforetic este una din metodele posibile. Alternativ, separarea
poate fi realizată în condiţii denaturante de exemplu în prezenţa dodecilsulfat de sodiu (SDS),
urmată de renaturarea în scopul recuperării activităţii enzimatice maxime. În orice instanţă,
activitatea poate fi determinată direct pe gel ori după transfer pe un suport potrivit. Alegerea
tehnicii electroforetice specifice va depinde de proprietăţile individuale ale enzimelor, de alţi
componenţi ale probei ori de rezoluţia maximă atinsă în condiţii native deoarece proteinele
native nu pot fi la fel de bine rezolvate precum cele denaturate. S-a descris astfel o metodă care
combină analiza de difuziune radială şi electroforeza, metodă analogă imunoelectroforezei tip
rachetă care utilizează o combinaţie dintre imunoanaliza difuzională şi electroforeza [8]. Această
tehnică, denumită electroforeza tip rachetă a fost aplicată în scopul cuantificării proteazelor şi
lipazelor. Şi în acest caz au fost constatate o serie de limitări, precum cea de a încorpora
substratul în gelul de separare (Poulsen și colab., 1989). Din nefericire, tentativele de a
cuantifica activităţile enzimatice prin reacţii de culoare trebuie să fie privite cu atenţie.
Evenimentele cinetice din matricea gelului sunt complexe şi necesită o evidenţă experimentală
considerabilă în scopul de a stabili dacă cantitatea de enzimă este singurul factor limitativ al
vitezei şi că o parte din enzimă nu este parţial distrusă în timpul separării electroforetice şi a
evidenţierii postelectroforetice.

Gabriel, O., Gerstent, D. M. (1992) Staining for Enzymatic Activity after Gel
Electrophoresis. II. Enzymes Modifying Nucleic Acids. Anal. Biochem 203:181-186.
 Un exemplu practic de detecţie postelectroforetică a unei enzime
O serie de aplicaţii de evidenţiere postelectroforetică prin culoare urmează un protocol
general, datorită similarităţii reacţiilor care conduc la evidenţierea benzii cu activitate
enzimatică. Astfel, utilizarea coloranţilor tetrazolici pentru evidenţierea dehidrogenazelor poate
servi drept model pentru alte enzime din această clasă.
Astăzi, detecţia activităţilor enzimatice sunt în mod uzual realizate pe geluri plate verticale,
mai mult decât pe geluri cilindrice. Compararea proprietăţilor de migrare este mai uşor realizată
şi este de preferat în condiţii identice, faţă de cele realizate în condiţiile gelurilor cilindrice. Pe
de altă parte, acoperirea cu tampon-substrat care conţine enzime auxiliare, substrat, coenzime,
ori alţi cofactori necesari poate fi produsă maxim numai în cazul gelurilor plate, factori de
asemenea importanţi în detectarea activităţii. Alternativ, transferul pe alte membrane poate
reprezenta o altă alternativă în evidenţierea postelectroforetică a activităţilor enzimatice.
Separarea electroforetică a protein-enzimelor poate fi însoţită de două trăsături diferite. Este
vorba de sarcina intrinsecă a proteinei, proprietate ce poate fi utiliza în procesul de migrare
electroforetică, sau de sarcina extrinsecă, care poate fi indusă. Separarea pe baza sarcinii
intrinseci, în electroliţi cu o singură valoare a pH-ului ori prin focusare izoelectrică reprezintă
alegeri atractive din cauza faptului că astfel se menţine proteina în starea ei nativă, cu păstrarea
activităţii, ce poate în acest mod determinată direct. Electrofocusarea este în particular utilizată
din cauză că prin ea se rezolvă izoforme apropiate. Separarea bazată pe sarcinile extrinseci are la
bază denaturarea şi legarea SDS la situsurile hidrofobe ale proteinei. Pornind de la aceasta,
treapta de maturare este necesară după electroforeză.

4.9.1. PREPARAREA PROBEI ŞI ELECTROFOREZA EI

Înaintea oricărei separări şi localizări este necesar a cunoaşte proprietăţile enzimei luate în
studiu, precum pH-ul optim, necesităţile în cofactori, inclusiv a cationilor şi a cosubstratelor.
Detergenţii, agenţii de oxidare sau alţi factori detrimentali care pot influenţa activitatea
enzimatică precum pH-ul şi mediul ionic trebuie monitorizaţi cu stricteţe, atât în timpul
preparării probei cât şi în timpul procesului electroforetic. Ieste bine de notat că prezenţa
coloranţilor de evidenţiere a migrării pot ei însuşi să denatureze ireversibil o serie de enzime.
Înaintea electroforezei este esenţial a se determina concentraţia proteică şi a se efectua un test
convenabil al activităţii enzimatice. O cantitate de 1 până la 10 g de proteină pură reprezintă
optimul în timp ce amestecurile de proteine pot conţine până la 100 g. Este important a alege o
cantitate optimă de soluţie proteică care să prezinte o activitate bine-decelată în urma procesului
de evidenţiere postelectroforetică, o cantitate prea mică făcând dificilă identificarea enzimei în
timp ce o încărcare mare va conduce la suprapunerea benzilor şi la o distorsiune a lor.
Electrofocusarea este pe departe mult mai sensibilă la supraîncărcare, după cum proteina va
distorsiona în gradientul de pH.
În condiţiile în care toate informaţiile pertinente sunt obţinute, este necesar un experiment
pilot în determinarea activităţii enzimatice. În acest scop, este preparat un gel care conţine toate
componentele necesare în timpul procesului de separare electroforetică. Proba este plasată într-
un godeu şi lăsată să difuzeze în matricea gelului, fără migrare electroforetică. Metoda de
detecţie este astfel testată fără separare electroforetică, în scopul stabilirii prezenţei sau absenţei
agenţilor denaturanţi ori a inhibitorilor în gel. Dacă testele preliminarii relevă o inactivare a
enzimei, trebuie aleasă şi testată o altă strategie de evidenţiere în scopul menţinerii activităţii
enzimatice în timpul procesului electroforetic.
Cele mai comune şi nedorite componente inhibitorii ale gelului de poliacrilamidă sunt
iniţiatorii reacţiei de polimerizare, persulfatul şi riboflavina, monomerul de acrilamidă
nepolimerizat şi acidul acrilic, deseori prezent în amestecul de polimerizare. Există o serie de căi
în limitarea a efectului acestor componente. De exemplu, pre-electroforeza gelului de separare,
singur, înaintea polimerizării gelului de concentrare va elimina iniţiatorii reacţiei de polimerizare
care au capacitatea de a oxida grupările tiol deseori implicate în actul catalitic. O altă tehnică
este aceea de a adăuga acid cisteic la tamponul de migrare, care va "curăţa" gelul de peroxizi
datorită faptului că acest acid va migra alături de ionul lider, conducător. Alternativ, gelurile
subţiri (de 1 mm sau mai mici) pot fi imersate şi umectate într-un tampon care conţine
ditiotreitol în scopul îndepărtării oxidanţilor. Eliminarea acidului acrilic poate fi realizată prin
recristalizarea monomerului de acrilamidă chiar înaintea polimerizării.
Schumacher, U., Trudung, P.. Ruhnke, M.. and Gossrau, R. (1990) Histochem. J. 22,433
10. Allen. R. C . Budowle, B., Saravis, C. A., and Lack, P. M. (19861 Acta Hidochem Cytochem. 19,637.
11. Radola, B. J. (1989, Elecirophoresis
Utilizarea gelurilor "rehidratabile" [10] elimină o multitudine de contaminanţi mai sus
enumeraţi. Astfel, după polimerizare gelurile sunt spălate cu apă, uscate şi stocate în această
formă. Pentru utilizare, gelurile sunt umectate în electrolitul corespunzător.
Gelurile comerciale, "gata de utilizare" sunt disponibile, conducând la o serie de avantaje
cercetătorului: procesul electroforetic se realizează în mod convenabil, ocolind capcana
polimerizării gelului, procesele electroforetice sunt mai reproductibile, şi datorită stocării,
contaminarea cu iniţiatori de polimerizare este în mare măsură redusă. Sunt de asemenea
posibile achiziţionarea unor tancuri mici de electroforeză care permit procesarea rapidă şi
eficientă a unor geluri comerciale.
Prezenţa unor proteaze în probă poate fi de asemenea detrimentală în detectarea activităţilor
enzimatice. Adăugarea unor inhibitori de proteaze precum fenilmetilsulfonil fluorurii trebuie să
fie utilizată în scopul demonstrării activităţii DNA-azelor [66,67] şi poate atesta detecţia altor
activităţi în prezenţa proteazelor.
Toate metodele descrise în continuare necesită prezenţa enzimei în soluţie, înainte de
electroforeză. În mod alternativ, secţiuni tisulare criostatate pot fi aplicate direct pe geluri de
focusare izoelectrică, urmată de detectarea activităţii enzimatice (
Histochem J. 1990 Aug;22(8):433-8.

Direct tissue isoelectric focusing on ultrathin

polyacrylamide gels. Applications in enzyme, lectin
and immunohistochemistry.
, ,
Schumacher U Trudrung P Ruhnke M Gossrau R , .

[9].

4.9.2. DETECȚIA ENZIMELOR ÎN GEL

Efectele detriemnale ale reactivilor utilizaţi în prepararea gelurilor (agenţi oxidanţi, resturi de
agenţi de polimerizare datoraţi unei polimerizări incomplete) alături de condiţiile necesare
procesului electroforetic de separare (pH-ul şi componentele sistemului tampon) trebuie să fie
luate în vedere în scopul minimalizării efectelor lor asupra activităţii enzimatice, în scopul
preîntâmpinării inactivării activităţii enzimatice. De obicei trebuie făcut un compromis între
condiţiile optime pentru activitate şi necesităţile separării electroforetice a proteinei.
 4.9.2.1. PRINCIPIILE LOCALIZĂRII “IN SITU” A ENZIMELOR ÎN GEL

Separarea enzimelor prin electroforeză şi focusare izoelectrică se realizată în geluri-matrice

restrictive care permit accesul enzimei la substrate cu masă moleculară mică.
Electroforegramele, efectuate rapid, permit detecţia postelectroforetică a activităţii enzimatice în
gel, înaintea apariţiei unei difuziuni apreciabile a proteinei. Există o serie de strategii de bază în
scopul localizării rapide a activităţii enzimatice, strategii prezentate mai jos.
4.9.2.1.1. Captura simultană a produsului reacţiei enzimatice
Produsul reacţiei este cuplat cu un reactiv care conduce la obţinerea unui produs colorat.
Această tehnică este utilizată în toate cazurile în care enzima rămâne activă în prezenţa
reactivilor de colorare. Marele ei avantaj este reprezentat de faptul că procedura este realizată
într-o singură treaptă, fără o difuzie substanţială a enzimei în gel.
4.9.2.1.2. Postincubarea cuplată a substratului
Această tehnică necesită o metodologie în două trepte. Incubarea enzimei prezente în gel cu
substratul este urmată de incubarea cu un reactiv ce permite formarea unui produs secundar
colorat şi insolubil. În cazul acesta, difuziunea se manifestă în timpul perioadei iniţiale de
incubare a gelului cu substratul.
4.9.2.1.3. Metode autocromice
Evoluţia activităţii enzimatice poate fi urmărită în mod direct prin observarea modificărilor
proprietăţilor optice precum absorbţia luminii sau fluorescenţa, produsă de substrat sau de către
produsul de reacţie. O serie de substrate sau coenzime îşi modifică proprietăţile optice în lumină
vizibilă sau ultra violetă în timpul reacţiei enzimatice. Schimbarea fluorescenţei serveşte de
asemenea ca indicator în cazul metodelor autocrome.
4.9.2.1.4. Analiza indicator-matrice
Enzimele de cuplare auxiliare şi substratele cu masă moleculară mare necesită o incubare a
gelului cu un strat care conţine o matrice indicatoare, un gel suplimentar, indicator. Incubarea de
tip sandwich a gelului de separare şi indicator conduce la localizarea activităţii enzimatice. O
variantă a acestei tehnici o reprezintă incubarea după separare cu o matriţă pe care proteina a fost
transferată şi imobilizată. Astfel, după separare, proteina este transferată din gel pe membrană
prin tehnicile descrise ca Western blotting.
4.9.2.1.5. Copolimerizarea substratului în gelul de separare
Substraturile cu masă moleculară mare precum polimerii carbohidraţi, proteinele sau acizii
nucleici pot fi copolimerizaţi în gelul de separare. Acest procedeu poate totuşi influenţa
separarea enzimei. În timpul electroforezei, activitatea enzimatică poate fi stopată prevenindu-se
astel acţiunea ei asupra substratului, de exemplu prin utilizarea unor inhibitori reversibili precum
SDS. După separare, gelul este spălat în tampon fără detergent, ceea ce conduce la renaturarea
sa. O altă cale de prevenire a activării enzimei în timpul procesului de electroforeză este
reprezentată de incubarea cu diverşi agenţi chelatori care leagă ionii metalici esenţiali. După
finalizarea procesului de separare gelul este incubat în tampon care conţine cationul esenţial într-
o concentraţie mai mare decât cea a agentului chelator, şi prin aceasta se restabilește activitatea.
4.9.3. TEHNICI SPECIFICE DE EVIDENȚIERE POSTELECTROFORETICĂ A
ENZIMELOR

4.9.3.1. Oxidoreductazele
Aceste enzime sunt clasificate drept "donor:acceptor oxidoreductaze"; unde substratul este
oxidat şi este donor de electroni. Un nume acceptat pentru aceste enzime este cel de
"dehidrogenaze" (de exemplu glucozo-6-fosfat dehidrogenaza). Un mare număr de
oxidoreductaze utilizează NAD ori NADP drept cosubstraturi (coenzime); participarea acestor
coenzime în reacţie reprezintă baza detecţiei pentru orice metodă de detecţie a activităţii.
Electroforeza celor mai multe oxidoreductaze necesită protecţia resturilor sulfhidril critice,
importante în actul catalitic, separarea în condiţii "native". În unele cazuri este necesară pre-
electroforeza gelului de separare înainte de turnarea gelului de concentrare. Este necesar apoi ca
gelul de concentrare să fie preparat prin polimerizarea iniţiată cu riboflavină, sub acţiunea
luminii în loc de peroxizi. Se recomandă, dacă este posibil, utilizarea gelurilor rehidratabile
pentru focusare izoelectrică şi aplicarea tehnicilor care nu necesită SDS.
4.9.3.1.1. Detecţia enzimelor NAD- şi NADP-dependente prin conversia coloranţilor
tetrazolici la formazani
Aplicarea cu succes a acestei metode necesită ca sensul reacţiei enzimatice să conducă la
oxidarea substratului cu reducerea concomitentă a coenzimei (formarea de NADH ori NADPH)
Echivalenţii de reducere sunt apoi transferaţi spre colorantul tetrazolic, reacţie de cele mai multe
ori mediată de fenazin metosulfat; astfel prin reducerea sării de tetrazoliu rezultă formazan,
colorat şi insolubil. Stoichiometria transferului necesită un echivalent de reducere la o pereche
de electroni transferaţi pentru formarea unui formazan din sărurile monotetrazolice şi doi
echivalenţi pentru sărurile ditetrazolice. Astfel, sărurile monotetrazolice precum MTT (bromură
de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu, tiazolil blue) sunt mult mai sensibile decât
sărurile de sărurile de ditetrazoliu. De exemplu, NBT (clorura de 2,2'-di -p-nitrofenil-5,5'-difenil-
3,3'-(3,3'-dimetoxi-4,4'-difenilen) tetrazoliu, în condiţiile reducerii incomplete, conduce la un
formazan de culoare roşie, în timp ce forma total redusă este albastră. Tabelul 1 prezintă o serie
de protocoale care utilizează săruri de tetrazoliu. Principalul avantaj al metodei este reprezentat
de marea sensibilitate, simplicitate (se utilizează un protocol într-o singură treaptă, un singur
amestec de reacţie), iar produsul de reacţie, formazanul este stabil. Ca dezavantaj, sarea de
tetrazoliu este uşor distrusă lumină şi oxigen, ceea ce conduce la un background (fond) puternic
colorat. ,este necesar deasemenea un control riguros al experimentului pentru a nu permite
apariţia fenomenului denumit "dehidrogenază inexistentă", o activitate enzimatică care rezultă în
formarea de NADH în absenţa aparentă a unui substrat vădit [12].
Exemplu: -Glicerofosfat Dehidrogenaza [13]
Amestecul de reacţie, 50 ml, este astfel preparat să conţină 25 mg de NAD+, 15 mg de clorură
de nitroblue tetrazoliu (NBT), 1 mg de fenazin metosulfat (PMS), 5 ml de -glicerofosfat sare de
sodiu, 1 M, pH 7,0 şi 10 ml de tampon Tris-HCI 0,2 M, pH 8,0. Gelul, care conţine enzima, se
incubează la 37°C până când apar benzile albastre. Gelul se clăteşte cu apă, apoi se fixează într-
un amestec etanol/acid acetic/glicerol/apă (5:2:1:4) Este necesar a se utiliza un control pentru a
arăta dependenţa ulorii de substrat şi nu ca efect al reducerii datorate luminii ori a oxidării
produse de oxigen.
Această metodă poate fi modificată şi utilizată la detecţia altor dehidrogenaze NAD- şi
NADP-dependente. Tabelul 1 prezintă o serie de alte săruri de tetrazoliu care au fost utilizate cu
succes în detectarea oxidoreductazelor.
 4.9.3.1.2. Detecţia enzimelor NAD- şi NADP-dependente prin iluminare UV
Piridin nucleotidele sub formă redusă sunt vizibile direct în lumină UV ca şi fluorescenţă
galbenă în timp ce formele lor oxidate apar ca benzi negre. Faţă de metodologia descrisă mai
sus, această tehnică poate fi aplicată la identificarea atât a formelor reduse cât şi a formelor
oxidate de substrat. O altă însuşire utilizabilă a metodei constă în capacitatea ca de a detecta
benzile “fără dehidrogenaze”, adică a formării de NADH în absenţa substratului, astfel
eliminându-se coloraţiile fals-pozitive. Un dezavantaj al acestei tehnici este reprezentat de
difuzia continuă a substratului în timpul periadei de incubare şi de necesitatea fotografierii îm
timpul evoluţiei reacţiei.
După terminarea electroforezei, gelurile sunt imersate pentru câteva minute într-o soluţie de
piridin nucleotide 1 mM [14]. Dacă reacţia conduce în direcţia reducerii substratului, şi deci a
oxidării NADH ori NADPH, coenzimele sunt dizolvate în tampon Bis-Tris 0,2 M pH 7,0. În
condiţiile oxidării substratului şi deci a reducerii coenzimelor este necesară dizolvarea
coenzimelor în tampon Tris 0,2 M, pH 8,0 sau 9,0. Indiferent de sensul reaţiei, soluţia de piridin
nucleotide trebuie preparată, chiar înainte de utilizare. După incubarea gelului cu tampon-
substratul optim, gelul este spălat puţin cu apă pentru a elimina excesul de substrat, după care
este urmărit într-un transluminator prevăzut cu lampă UV.
După o perioadă scurtă de timp, benzile “fără dehidrogenaze” devin vizibile. Gelul este
acoperit cu hârtie de filtru Whatman No. 1 şi umectate cu o soluţie care conţine substratul şi alţi
compuşi necesari activităţii enzimatice (precum ionii metalici) Benzile substrat-dependente
devin vizibile în timp. Această tehnică necesită existenţa unui sistem de preluare permanentă a
imaginii (cameră video, aparat foto, etc)
4.9.3.1.3. Oxidoreductazele piridin nucleotid-independente
Tirozinaza prezentă în celulele mamiferelor , o enzimă care reţine activitatea chiar şi în
prezenţă de SDS, poate fi dată ca exemplu. Chiar dacă procedeul prezentat include ca treaptă în
de evidenţiere îndepărtarea SDS după separarea electroforetică, ea nu este neapărat necesară în
cazul unei probe care conţine o activitate foarte activă. Enzima catalizează oxidarea L-tirozinei
la L-Dopa (3,4-dihiroxi fenilalanină) şi în continuare la dopaquinonă. Dopaquinona se
converteşte spontan în dopacrom, un produs maro-închis [15]. Cum prima treaptă de oxidare este
foarte lentă, metoda descrisă utilizează Dopa ca substrat [16].
Demonstrarea activităţii tirozinazice.
SDS-PAGE este realizată în absenţa agenţilor reducători precum mercaptoetanolul, care ar
inactiva enzima. Gelul este echilibrat timp de 15 minute la temperatura camerei în tampon fosfat
de potasiu, 0,1 M, pH 6, 8 şi apoi incubat într-o soluţie care conţine 0,1 mg L-Dopa/ml de
tampon fosfat. O probă activă va produce un precipitat maro, după 5 minute, timpul de incubare
putând fi crescut până la 2 ore dacă este necesar.
Tabelul xxx Oxidoreductaze. Metode de evidenţiere postelectroforetică.

Clasificare
Enzima Principiul de detecţie
EC
1.1.1
Incubarea gelului cu substratul şi cofactorul ; vizualizare în
1.2.1
Oxidoreductaze NAD(P)- dependente lumină UV
1.3.1
Test "fără dehidrogenază", lumină UV
1.4.1
1.1.1.1 Alcool dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.1.3 Homoserin dehidrogenaza NADPH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.1.8 Glicerol-3-fosfat dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.1.14 Sorbitol dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.1.22 UDPG- dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.1.27 Lactat dehidrogenaza Formarea de NADH, PMS, NBT
1.1.1.30 D-3-Hidroxibutirat dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.1.35 3-Hidroxiacil CoA dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.1.37 Malat dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
 1.1.1.38 Enzima malică Formarea de NADPH, PMS, MTT
1.1.1.39 Enzima Malică Formarea de NADPH, PMS, MTT
1.1.1.40 Enzima malică Formarea de NADPH, PbiS, MTT
1.1.1.41 Izocitrat dehidrogenaza Formarea de NADH, PMS, NBT
1.1.1.43 Fosfogluconat dehidrogenaza Formarea de NADPH, PMS, NBT
1.1.1.49 Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza Formarea de NADPH, PMS, NBT
1.1.1.51 -Hidroxisteroid dehidrogenaza Formarea de NADH, PMS, NBT
1.1.1.96 -cetoacid aromatic dehidrogenaza Analiză prin intermediul malat ori lactat dehidrogenazei
1.1.1.122 L-Fucozo dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.1.141 15-Hidroxiprostaglandin dehidrogenaza NADH, PMS, NBT, formarea de formazan
1.1.3.1 Glicolat oxidaza Acoperire cu ac. -hidroxiizocaproic, o-dianisidină şi
1.1.3.4 Glucozo oxidaza peroxidază

1.2.1.3 Aldehid dehidrogenaza Acoperire cu gel de agaroză care conţine NAD, MTT
1.2.1.12 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza Precipitarea fosfatului cu Ca2+
1.2.1.20 -Cetoglutarat semialdehid dehidrogenaza Formarea de NADPH, PMS, NBT
1.4.1.2 Glutamat dehydrogenase Stingerea fluorescenţei NADH

1.4.3.2 L-Amino acid oxidaza Enzime cuplate, stingerea fluorescenţei NAD(P)H

1.4.3.3 D-Amino acid oxidaza Enzime cuplate, stingerea fluorescenţei NAD(P)H

1.4.3.4 Amino ozidaza Densitometrarea produsului de reacţie

1.5.16 Folat reductaza Formarea de albastru de tetrahidrofolat tiazolil (MTT)
1.6.2.2. Citocrom-b reductaza, NADH diaforaza NADH, PMS, NBT, formare de formazan
1.6.4.3 Lipoil dehidrogenaza
N-(1-naftil)etilendiamin hidrocloric, sulfanilamidă, alţi coloranţi
1.7.99.4 Nitrat reductaza
azoici
Diaminobenzidină în prezenţă de peroxidază FBS; Formarea de
1.8.3.1 Sulfit oxidaza
precipitat
Reacţie cuplată cu peroxidaza diaminobenzidină
1.11.1.6 Catalaza
Colorare DAB urmată de colorare negativă cu fericianură
Oxidarea 4-hidroxistilbenului, cuplare cu 4-AAP
Guaiacol, Coomassie blue
1.11.1.7 Peroxidaza Colorare cu TMPD
Coloraţie dublă pentru peroxidază şi fosfatază acidă
Diaminobenzidină, H2O2, precipitat maro, peroxidaza din hrean
Acoperirea gelului cu glutation, t-butil hidroperoxid, NADPH,
1.11.1.9 Glutation peroxidaza glutation reductază,
Dispariţia fluorescenţei
Metoda cu o-Dianisidină
13.11.12 Lipoxigenaza
Detecţie selectivă prin ajustarea pH-ului de colorare
14.18.1 Monofenol monooxigenaza L-Dopa +dopaquinonă, producere de dopacrom
Acoperire cu gel de agar care conţine riboflavină şi iluminare ori
15.1.1 Superoxid dismutaza PMS, MTT sau NBT.

Abrevieri utilizate: NBT, nitro blue tetrazoliu; PMS, fenazin metosulfat; L-Dopa, 3,4,-dihidroxifenilalanin; MTT, bromură de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (tiazolil blue); 4-AAP, 4-aminoantipirine; TMPD, NNN’N’-tetrametil-fenilendiamine;
DAB, 3,3'-diaminobenzidină (3,3',4,4'-tetraaminobiphenil tetrahidroclorură; FBS, formaldehid bisulfit.

5.3.1.1.1. Colorații duble

The gels were processed according to the method described previously by Wayne and Diaz
(28). Briefly, after the electrophoresis, the gel was washed three times for 10 min with 0.01 M
phosphate-buffered saline (PBS). The gel was then incubated with 3,39-diaminobenzidine
(DAB) tetrahydrochloride (0.05% in PBS) for 20 min at room temperature. The DAB reagent
was poured off, and the gel was washed with H2O. The gel was then suspended in a solution
containing 10 ml of 30% H2O2 in 100 ml of H2O and agitated continuously for 20 min. The
hydrogen peroxide solution was discarded, and the gel was rinsed in water. The gel was then put
in a pan containing 30 ml each of 2% ferric chloride and 2% potassium ferricyanide. After a
green color began to appear, the ferricyanide reagent was discarded and replaced with water.
Dark bands indicated peroxidase activity, and catalase activity was observed as clear areas over a
green background.
(VERA-CABRERA(1999))

5.3.2. TRANSFERAZELE

Reacţiile de transfer ale grupărilor metil, glicozil, ori fosfat de la un donor spre un acceptor
sunt catalizate de către transferaze. Denumirea generică a acestor enzime este de "donor:acceptor
grup transferaze." Sunt unele cazuri unde donorii sunt ATP ori CoA, care conţin grupări (fosfat
respectiv acil) ce pot fi transferate. În mod curent, detecţia transferazelor implică participarea
unor enzime auxiliare. De exemplu, pentru identificarea hexokinazei (ATP:glucozo
fosfotransferaza) enzima este incubată la început cu glucoză, ATP, şi Mg2+ pentru a produce
glucoză-6-fosfat. Formarea glucozo-6fosfatului este cuplată cu glucozo-6-fosfat dehidrogenaza,
o enzimă NADP-dependentă. Astfel, formarea de NADPH este detectată printr-o metodă
descrisă în cazul oxidoreductazelor precum transferul de echivalenţi dinspre NADPH spre PMS
şi în final spre sarea de tetrazoliu cu producerea unui formazan. Utilizarea enzimelor auxiliare se
realizează în mod curent şi prin tehnica de acoperire a gelului cu o hârtie sau agar, într-o
incubare de tip sandwich. Alternativ, transferul produşilor de electroforeză pe un alt suport
precum membranele de nitroceluloză este urmată de detectarea activităţii enzimatice pe
membrane. Trebuie avut însă în vedere că enzimele auxiliare necesită condiţii specifice care
trebuiesc asigurate pentru a avea activitate catalitică.
5.3.2.1. Tehnicile cu gel indicator şi de transfer pe membrane
5.3.2.1.1. Prepararea gelului indicator (de acoperire)
Tehnica de acoperire cu agaroză este ilustrată pentru fosfogluco mutaza (EC 2.7.5.1) [17]. Se
utilizează 1,6 ml de soluţie tampon (18 g Tris-HCl pH 9,0, care conţine 10 g MgCl2 • 6H2O, and
1 g azidă de sodiu la litru) şi se adaugă 6 ml de apă. La jumătate din această soluţie se adaugă 60
mg agaroză şi se fierbe până când agaroza este în mod cert dizolvată. La cealaltă jumătate, se
adaugă după cum urmează: 350 mg glucozo-l-fosfat, 2,5 mg glucozo-l,6-bisfosfat, .50 mg
NADP+, 10 mg PMS, 100 l glucozo-6-fosfat dehidrogenază, (1 mg/ml), şi 25 mg MTT. Gelul
indicator este preparat prin răcirea soluţiei de agaroză până la aproximativ 10°C faţă de
temperatura sa de gelificare, de exemplu până la aproximativ 60°C. Soluţia care conţine toate
componentele necesare catalizei şi reacţiilor auxiliare (coenzime, ioni metalici, substrate, enzimă
auxiliară) este adăugată şi amestecată pentru a asigura o uniformizarea tuturor componentelor. O
folie de plastic (de tipul GelBond for agarose) este pregătită sub forma unei tăviţe puţin mai
mare decât gelul. Se toarnă în continuare agaroza în tăviţă. Se toarnă agaroza, într-un strat de 1
mm grosime. Dacă se doreşte gelificarea accelerată, se poate introduce în frigider. După
solidificare, matricea indicatoare va avea o stabilitate mecanică bună, dată de tăviţa de plastic.
Pentru evidenţierea activităţii enzimatice, gelul de separare este ataşat gelului indicator. Trebuie
avut însă grijă ca între cele două geluri să nu existe bule de aer. După incubare timp de 2-4 min
la 60oC, gelul de agaroză este îndepărtat. Enzima apare ca bandă de culoare albastru intens.
Trebuie avut în vedere că în exemplul dat, concentraţiiile date sunt mult mai mari decât cele
utilizate în protocoalele cinvenţionale. Deasemenea, temperatura de incubare, de 60oC conduce
la scăderea timpului de reacţie, proces care limitează fenomenul de difuziune şi de aici o
rezoluţie mai bună. Cu modificări minore, tehnica poate fi aplicată multor enzime care utilizează
un gel indicator.
 5.3.2.1.2. Transferul (blotting)
Blotting-ul proteinelor [18] a devenit o tehnică foarte utilizată din cauza faptului separarea
electroforetică iniţială este menţinută după transferul lor pe membrane adecvate. "Western"
blotting-ul a fost pentru prima dată utilizat pentru a localiza o serie de proteine cu anticorpi
specifici, dar tehnica este la fel de bine aplicabilă la detectarea unor enzime. O metodă rapidă de
transfer o reprezintă electroblotting-ul [19]. Avantajele enzimelor imobilizatr pe memnrane sunt
acelea că proteinele sunt concentrate din gel pe o membrană bidimensională; membrana poate fi
incubată pentru o perioadă lungă de timp fără apariţia enomenului de difuziune sau de detaşare
[20]; matricea de transferpoate fi incubată cu enzime auxiliare şi cofactori. După spălare, aceeaşi
membrană poate fi incubată în continuare cu mai mult de un substrat şi poate deasemenea fi
utilizată la identificarea mai multor activităţi enzimatice. Fiecare enzimă poate fi testată în mod
individual şi astfel poate fi stabilită eficienţa transferului ori menţinerea activităţii enzimatice.
Cum nu toate proteinele se leagă la fel de eficient la o membrană dată, pot fi astfel testate un
număr mare de suporturi de transfer. Este indicat ca înainte de a fi utilizată să se spoteze
amestecul de separat pe membrană, să se spele apoi cu tampon, după care să se testeze
activitatea enzimatică. De altfel, o serie de matrici leagă cu mare aviditate multe proteine, ceea
ce conduce la un background înalt, după transfer, este bine să se utilizeze proteine nerelevante
precum albumina, gelatina, sau lapte degresat pentru a bloca ataşarea unor proteine nedorite care
interferă în procesul de analiză. Situsurile de legare ale hârtiei diazobenzoiloxymetyl-ate, de
exemplu pot fi blocate după transfer prin incubarea ei în etanolamină şi gelatină [21], o
procedură care însă poate inactiva o serie de enzime. Se poate reţine că legarea unei proteine la o
membrană poate conduce la a afectare serioasă a activităţii, iar până în prezent nu au fost
elaborate studii referitoare la cinetica de legare a unor enzime de membrană. Acest lucru este
deosebit de important în condiţiile evaluării cantitative. Pe de altă parte, nu toate proteinele sunt
transferate cu aceeaşi eficienţă; în general proteinele mari sunt mai dificil de transferat în
comparaţie cu cele mici. Evaluarea cu atenţie a eficienţei blotting-ului proteinei luată în studiu
este necesară pentru a avea certitudinea detectării activităţii ei.
Electroblotting-ul şi transferul prin capilaritate (capillary blotting) necesită ca gelul să fie
liiber pe ambele părţi, fără nici o placă de sticlă sau plastic. Electroblotting-ul poate deasemenea
necesita prezenţa unor agenţi denaturanţi [19,22]. A fost descris electrotransferul proteinelor
bazice pe membrane de nitroceluloză după separarea electroforetică în condiţii nedenaturante,
urmată de determinarea activităţii enzimatice [59].
5.3.2.2. Detecţia enzimelor după electroforeza în prezenţa SDS prin renaturare
Identificarea activităţii enzimatice necesită toate treptele separării electroforetice, inclusiv
prepararea probei, fiind realizată în condiţii nedenaturante deşi condiţiile denaturante conduc în
general la randamente şi rezoluţii superioare. Procedeele standard de realizare a separărilor
calitativ superioare utilizează agenţi de denaturare, precum SDS [60] dar este bine înţeles că sub
aceste condiţii activitatea enzimatică este deseori ireversibil pierdută. Totuşi au fost raportate o
serie de crecetări prin care o serie de enzime pot fi detectate după SDS PAGE. Astfel, după
separarea completă, enzimele pot fi uneori renaturate prin îndepărtarea detergentului. Sunt
deasemenea exemple care demonstrează activitatea enzimatică în ciuda prezenţei SDS. În
general dar nu ca regulă sigură, enzimele monomere pot mult mai probabil să supravieţuiască
expunerii la SDS comparativ cu enzimele compuse din subunităţi diferite, după cum un efect al
detergentului este acela de a separa proteina în subunităţile componente. Enzimele care sunt
adaptate să funcţioneze în condiţii extreme precum cele din bacteriile termofile, sunt, probabil
candidate în detectarea lor după SDS-PAGE. Renaturarea prin îndepărtarea detergentului poate
conduce numai la restabilirea parţială a activităţii, ceea ce corespunde scopului de a produce o
activitate catalitică suficientă pentru o evidenţiere postelectroforetică.
 Renaturări de succes s-au raportat în cazul -lactamazei [36], protein kinazei [37], fosforilaz
kinazei [38] şi -glucozidazei [39]. Renaturarea UDPG pirofosforilazei, alcool dehidrogenazei şi
lactat dehidrogenazei după electroforeza în prezenţă de SDS a fost realizată după îndepărtarea
detergentului, urmată de colorarea “in situ“ [61]. S-a raportat electroforeza bidimensională în
prezenţa SDS, urmată de eluţie, renaturare, şi determinarea activităţii enzimatice prin metode
convenţionale [62]. Enzimele care modifică acizii nucleici par a fi în mod special rezistente la
denaturarea ireversibilă produsă de către SDS. Prezenţa nucleazelor, de exemplu, a fost
demonstrată după îndepărtarea SDS prin spălarea gelului în tampoane fără detergent [34].
Enzimele care îşi reţin activitatea în prezenţa SDS includ multe proteaze [40,41]; tirozinaza,
protocol descris mai sus, reprezintă alte exemple [16]. A fost raportată renaturarea după
electroforeza în prezenţa SDS a multor amilaze, proteaze, şi dehidrogenaze [35].
Multe cercetări (raportări) ale activităţii enzimatice în prezenţa SDS nu includ treapta de
inactivare termică, utilizată în mod curent în cazul preparării probei pentru electroforeza în
prezenţa SDS [60] dar sunt cazuri în care enzima supravieţuieşte deasemenea denaturării termice
în prezenţa SDS [32, 35, 36].
Renaturarea proteinelor reprezintă un proces complex şi este de notat că se poate fi uneori
realizată doar prin imersarea gelului pentru scurt timp într-un tampon fără SDS (35), dar alţi
autori [43] nu au fost capabili să reproducă acest efect. Au fost descrise metode care conduc
totuşi la o incompletă reactivare prin spălarea rapidă de trei ori cu tampon fară detergent. Eluţia
proteinei şi înlocuirea SDS cu uree 6 M a fost sugerată ca metodă de îndepărtare a SDS,
utilizarea schimbătorilor de ioni (Dowex-1) ori dializa. [44]. O altă metodă de eliminare a SDS
este reprezentată de precipitarea proteinei cu acetonă, urmată de solubilizare în guanidină
hiroclorică 6M şi diluare [23]. A fost raportată adăugarea de tioli precum mercaptoetanolul
pentru a facilita interschimbul disulfură şi reactivarea proteinei [45]. O altă metodă descrisă
pentru reactivarea proteinei este cea care utilizează cazeina în tamponul de spălare a gelului [58].
Această metodă pare a nu fi o procedură efectiv universală pentru renaturarea enzimelor,
sugerându-se tratarea individuală a fiecărei enzime, după caz.
Eluţia enzimelor de pe membranele de transfer poate fi realizată în prezenţa SDS şi/sau
Triton X-100 [46], dar produsul trebuie în continuare activat pentru a se restabili activitatea
enzimatică.
Substituirea SDS cu un detergent nonionic, Triton X-100, facilitatează detecţia activităţii
după electroforeză [63]. Totuşi, această tehnică nu conduce la separarea proteinelor funcţie de
masa lor moleculară. Un detergent care pare a combina avantajele SDS, separarea în funcţie de
mărimea moleculară [64] şi păstrarea activităţii enzimatice este bromura de cetilamoniu (CTAB)
[65]. Dizolvând o enzimă într-o soluţie de CTAB, omiterea treptei de denaturare termică, urmată
de separarea electroforetică, nu a condus la pierderea acticităţii unor enzime separate în condiţii
reducătoare.
Detectarea hexokinazei
Soluţia de incubare (NADP+2 mM, MgCl2 10 mM, ATP, 8 mm, 16 g/ml PMS, soluţie NBT
0,1 mg/ml, glucozo-6-fosfat dehidrogenază 0,4 unităţi/ml, glucoză 0,5 mM, Tris HCl 50 mM, pH
8.0) este preparată chiar înainte de utilizare. Gelul este incubat direct în soluţia substrat-tampon
ori este acoperit cu hârtie de filtru îmbibată în soluţia substrat-tampon, ca şi un sandwich.
Incubarea poate fi realizată la 37°C la întuneric. După ce benzile cu activitate enzimatică apar,
gelul este spălat într-o soluţie de acid acetic 10% şi poate fi stocat la întuneric.
Detectarea activităţii Glutamat-Piruvat Transaminazice [47]
Metoda utilizată este în general aplicabilă pentru multe dehidrogenaze NAD-dependente,
utilizând formarea formazanului ca mod de detecţie. În această reacţie, L-alanina îşi transferă
gruparea amino spre -cetoglutarat ca acceptor, cu piridoxal fosfat drept coenziă. L-Glutamatul,
unul dintre produşii de reacţie, poate fi detectat cu ajutorul glutamat dehidrogenazei. Un analog
al NAD, 3-acetilpiridin adenin dinucleotid (APAD), este utilizată pentru a altera echilibrul
normal al reacţiei de dehidrogenare în favoarea oxidării substratului. Potenţialul redox mai
pozitiv al perechii APAD/APADH afaţă de cea a cuplului NADP/NADPH este responsabilă de
oxidarea L-glutamatului cu formarea concomitentă de APADH. Fenazin metosulfatul mediază
transferul de hidrogende la APADH spre sarea de tetrazoliu (MTT), care, astfel este redusă la
formazanul corespunzător. Schema reacţiilor sunt prezentate mai jos:
L-Alanina + -cetoglutarat piruvat + L-glutamat
L-glutamat + APAD+ -cetoglutarat + APADH + NH3
PMS
APADH + MTT APAD+ + MTT-formazan
Figura 1. Schema reacţiei de identificare postelectroforetică a Glutamat-Piruvat Transaminazei.

Practic, se prepară soluţia de colorare după cum urmeazăchiar înainte de utilizare: 4 ml

tampon Tris-HCI 0,4 M, pH 8,2 care conţine 60 mg de L-alanină, 7 mg de acid -cetoglutaric,
1,5 mg de APAD, PMS 0,4 mg, MTT 0,6 mg, piridoxal fosfat 0,2 mg, şi 2 unităţi de glutamat
dehidrogenază. Gelul este incubat la 37°C, acoperit cu o hârtie de filtru îmbibată în această
soluţie, la întuneric. Este necesar doar un timp redus de incubare datorită concentraţiilor mari de
substrate utilizate în soluţia de colorare. După spălare în acid acetic 10% (v/v), gelul poate fi
păstrat la întuneric.
Detecţia aspartat transcarbamilazei [48]
Este un alt exemplu de protocol care este aplicabil la o varietate de alte enzime, inclusiv
decarboxilaze, sintaze, fosfataze şi pirofosfataze. Produşii ai acestei reacţii (CO2, fosfat ori
pirofosfat) formează săruri insoluble cu ionii de calciu. Detectarea vizuală a precipitatelor de
calciu poate fi amplificată de către roşul de alizarină [49].
Gelurile sunt incubate în tampon glicină-NaOH, 0,5 M la pH 10,0, care conţine aspartat 1
mM, carbamoil fosfat 0,2 M, şi CaCl2 2 mM. După aproximativ 20 de minute de incubare, apare
un precipitat opalescent ce poate fi observat sau fotografiat pe un fond închis. Pentru a creşte
sensibilitatea, fosfatul de calciu poate fi vizualizat sau scanat după colorare timp de 12-24 ore cu
o soluţie de roşu de alizarină S 0,001% care conţine A1Cl3 0,0005% în tampon fosfat de potasiu
0,1 M, pH 11.
Metodele specifice de evidenţiere a transferazelor sunt prezentate în Tabelul 2.

Tabelul 2. Transferazele
EC Enzima Principliul de detecţie
2.1.3. Pi; este precipitat cu molibdat şi vizualizat cu ascorbat
Ornitin transcarbamilaza
3 Precipitarea fosfatului cu Ca2+ sau Pb2+, roşu de alizarină
2.3.2.
-Glutamiltransferaza Cuplarea cu Fast Garnet GBC
2
2.4.1.
Glicogen fosforilaza Colorare cu iod pentru polimer sau eliberarea Pi;
1
2.4.1.
Dextransucraza Utilizarea coloraţiei PAS, tehnică ce ocoleşte artefactele de colorare
5
2.4.1.
Sucrozo fosforilaza Formarea de produşi cu proprietăţi reducătoare, colorare cu TTC
7
2.4.1.
Levansucraza Asemănător dextransucrazei
10
2.4.1.
Glicogen sintaza Incubare cu glicogen şi UDPG marcat radioactiv; autoradiografie
11
2.4.1.
Cetobioz fosforilaza Eliberarea Pi; detecţia sării de Ca2+
20
2.4.1.
ADP-glicogen transferaza Colorare cu iod pentru glicogen
21
2.4.2. Incubare cu [14C]adenină; precipitare cu clorură de lantan;
Adenin fosforibosil transferaza
7 autoradiografie
2.4.2.
Hipoxantin fosforibosil transferaza Precipitarea PPi;
8
 2.6.1.
Aspartat aminotransferaza Substrat cistein sulfinat; Formarea de SO2, NBT
1
2.6.1. Alanin aminotraneferaza; glutamat piruvat Enzimă couplată: glutamat dehidrogenaza; formarea APADH, PMS,
2 transferaza MTT
2.6.1.
Tirozin aminotransferaza PMS, INT
5
Enzimă couplată: glucozo-6-fosfat dehidrogenaza; formarea NADPH;
2.7.1.
Hexokinaza PMS, NBT
1
Radioautografie, asemănător 2.4.2.7
2.7.1.
Galactokinaza Dispariţia NADH; detecţie în UV
6
2.7.1.
6-Fosfo fructokinaza Enzime cuplate; formarea de NADPH, PMS, NBT
11
2.7.1. Enzimă couplată; formarea de NADH, PMS, NBT
Glicerol kinaza
30 Radioautografie, asemănător 2.4.2.7
2.7.1. PAGE-SDS; renaturare; incubare cu [32P]ATP; radioautografie
Protein kinaza
37 Precipitare cu TCA a [32P]fosfohistonei
2.7.1.
Piruvat kinaza Enzime cuplate; formarea de NADPH, PMS, NBT
40
2.7.1.
Neomicin fosfotransferaza Transfer [32P]ATP pe fază solidă cu neomicină legată
9.5
2.7.2. Reacţie cuplată cu glicerofosfat dehidrogenaza; dispariţia fluorescenţei
Fosfoglicerat kinaza
3 NADH
Enzime cuplate; formarea de NADPH, PMS, NBT, şi fluorescenţă
2.7.3.
Creatin kinaza
2 Enzime cuplate; fluorescenţa NADPH
Reactiv CK (Lewes, Sussex, UK)
2.7.4.
Adenilat kinaza
3
Enzime cuplate; formarea de NADPH, PMS, NBT
2.7.4.
Guanilat kinaza
8
2.7.5.
Fosfoglucomutaza Enzime cuplate; formarea de NADPH, PMS, NBT
1
Cuplare cu enolază, piruvat kinază, lactat dehidrogenaza; dispariţia
2.7.5.
Fosfogliceromutaza fluorescenţei totale a NADH; cuplare cu fosfoglicerat kinaza şi
3
gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza; dispariţia fluorescenţei NADH
2.7.7. Enzime cuplate; formarea de NADH, PMS, INT; precipitarea PPi cu
Galactozo-1-fosfat uridililtransferaza
10 Ca2+
Abrevieri utilizate: NBT, nitro blue tetrazoliu; PMS, fenazin metosulfat; L-Dopa, 3,4,-dihidroxifenilalanin;
MTT, bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (tiazolil blue); APAD, 3-acetilpiridin adenin
dinucleotid; INT, p-iodonitrotetrazoliu violet; TCA, acid tricloroacetic; TTC, clorură de 2,3,5-trifeniftetrazoliu; PAS,
acid periodic- Schiff; UDPG, uridin difosfoglucoză.
5.3.3. Hidrolazele
În general, hidrolazele sunt cele mai stabile enzime dintre toate clasele sus menţionate.
Substraturile cromogene pentru multe dintre ele sunt disponibile comercial, evoluţia reacţieie
putând fi monitorizată direct, în lumină vizibilă, ori în UV. Substraturile sau produşii care-şi
schimbă proprietăţile fluorescente sunt deasemenea larg utilizaţi datorită tehnicilor de mare
sensibilitate. Hidrolazele pot fi deasemenea localizate prim metode de cuplare cu derivaţi azoici,
în care substratul hidrolizat reacţionează cu săruri de diazoniu, precum Fast Red TR ori Fast
Blue RR [50].
Detecţia neuraminidazelor (sialidazelor) [51]
Colorarea acestor activităţi enzimatice se poate realiza în diverse moduri. După separarea
electroforetică, gelul este echilibrat pentru 15-20 minute în acetat de potasiu 0,2 M la pH 5,0
suplimentat cu 5 mM CaCl2. Se prepară o soluţie 1 mM de acid 2'-(4-metilumbeliferil)--D-N-
acetil neuraminic în acelaşi tampon, care este spray-ată pe gel. Prezenţa enzimei se observă ca o
bandă fluorescentă la 336 nm. Fluorescenţa poate fi intensificată prin incubarea gelului în
glicină, 130 mM, pH 10,0, conţinând NaCl 60 mM and Na2C03 40 mM timp de 2 minute.
 O altă modalitate de demonstrare a acestei activităţi este aceea de a apela la o tehnică
sandwich, care utilizează membrane de nylon. Membrana de nylon este introdusă pe rând în
glicerol 5% (v/v), uscată, imersată în tampon acetat care conţine derivat de acid metilumbeliferil
neuraminic, 50 mM şi uscată. Membrana este plasată în contact cu gelul, astfel încât să se
prevină includerea unor bule de aer între membrană şi gel, după care se incubează timp de 1-3
minute la 70°C. Metoda fluorogenică permite detecţia neuraminidazei în cantităţi extrem de
mici, sub limita de detecţie a proteinelor prin tehnicile convenţionale. Tehnici analoge sunt
disponibile pentru multe glicozidaze, sulfataze, esteraze ori fosfataze prin utilizarea
corespondentului comercial al derivatului metilumbeliferilic.
O altă variantă este aceea de a înmuia o hârtie de filtru Whatman No. 1 în citrat de sodiu, 0,1
M la pH 4,0 care conţine derivat umbeliferil (0,5 mg/ml) Hârtia este tăiată cu aceleaşi
dimensiuni ca şi gelul, după care gelul şi hârtia de filtru sunt împachetate. După un timp, gelul
poate fi vizualizat în lumină UV. Intensificarea fluorescenţei se realizează prin spray-ere cu
amoniac.
Detecţia fosfatazelor alcaline [52]
Au fost descrise cel puţin trei grupe de protocoale pentru detecţia fosfatazelor: formarea de
formazan, cuplarea diazo şi colorarea cu argint. Tehnica diazo este mai puţin sensibilă, dar mult
mai simplă. Colorarea cu formazan este mai sensibilă şi se realizează aproape la fel de uşor ca şi
tehnica diazo. Colorarea cu argint este cea mai sensibilă nar necesită multe etape, o fac astfel
mai puţin atractivă. Pe de altă parte, probele cu activitate enzimatică scăzută pot fi incubate cu
glicerofosfat timp de 100 ore.
a. Colorarea indoxil fosfat-formazan.
Colorarea gelurilor se realizează la întuneric, într-o soluţie (50 ml) tampon Tris 0,1 M pH
10,0, care conţine 5 mM MgSO4 şi 500 g/ml de indoxilfosfat (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat)
şi 10 g/ml MTT. Gelul se incubează la 37°C până la 16 ore colorarea poate fi accelerată prin
adăugarea de PMS (50 g/ml) Activitatea enzimatică apare ca bandă albastră.
b. Colorarea cu -Naftil fosfat-Fast Red (Diazo)
Gelurile sunt plasate într-un tampon bicarbonat/carbonat 50 mM pH 9,6, care conţine ZnC12
1M; MgCI2, 0,1mM; -naftil fosfat de sodiu 20 mM, and fast red (clorură de 5-cloro-2-
toluendiazoniu) 1 g/litru (numai 15% din colorantul comercial este activ) Gelurile sunt
menţinute la 4°C peste noapte. Benzile cu activitate enzimatică sunt colorate în roşu-cărămiziu.
b. Procedura de colorare -glicerofosfat-argint.
Pentru această tehnică, treptele 3-8 trebuie să fie realizate la întuneric, la o lampă galbenă, de
siguranţă.
1. Se incubează gelurile la 37°C într-o cutie închisă în tampon Tris HCl 0,1 M care conţine
185 mM-glicerofosfat de sodiu, 20 mM MgSO4 şi 60 mM CaSO4;
2. Gelurile se spală succesiv timp de 15, 30 şi 45 minute cu multă apă, într-un shaker rotativ.
3. Se imersează gelurile într-o soluţie 0,2 M de AgNO3 pentru o oră.
4. Se repetă etapa 2.
5. Se expune gelurile la o lampă UV de mare lungime de undă sau se iluminează la lumina
solară pentru 5 minute. Benzile colorate cu activitate enzimatică devin maro-închis.
6. Intensificarea culorii şi creşterea sensibilităţii poate fi obţinută prin imersarea gelurilor
într-o soluţie proaspătă de 500 mg de pudră de acacia în apă (10 ml) şi 10 ml soluţie preparată
din 5 mg de lactat de argint, 100 l dodecyilamidă, 15 mM şi 100 l de Triton X-100, 0.05%
(v/v)
7. Se îndepărtează gelurile şi se plasează în 2.5 ml de citrat de sodiu, 2 M, pH 4,0. Se adaugă
1 ml de quinol 0,6 M şi se incubează timp de 2 minute.
8. Se spală în jet de apă timp de 10 minute.
După această etapă gelurile pot fi expuse la lumină. Exemple pentru utilizarea incubării de tip
sandwich cu gel de agar sunt descrise mai jos.
 5.3.3.1. Detecţia hidrolazelor prin tehnici de tip sandwich
Detecţia lipazei [53].
0,4 grame de agar sunt dizolvate prin încălzire pe baie de apă în 20 ml de succinat de sodiu,
0.1 M, pH 6,0. Amestecul este răcit între 60 şi 65°C, după care se adaugă 4 mg de rodamină B şi
0,5 g de trioleină, emulsifiate timp de 1 min într-un omogenizator. Amestecul este de gazat şi
turnat într-o cameră, încălzită la 100°C, care este formată din două bucăţi de sticlă tratate cu
politetrafluoroetan (200 mm2), separate la margibi cu două garnituri flexibile din cauciuc
siliconic, cu o lăţime de 7 mm şi o înălţime de 0,7 mm. Camera este închisă cu cleme. După
răcire, când gelul este ferm, se îndepărtează plăcile de stică după care gelul este aşezat pe un
plastic transparent (tip GelBond) O tehnică mai simplă a fost descrisă mai sus: amestecul se
toarnă pe o tăviţă de plastic, după tehnica ce gel ajutător. Gelul substrat este depus cu grijă pe
gelul de separare, evitându-se formarea bulelor de aer. Se aşează peste gel o folie impermeabilă
pentru a preveni uscarea gelului şi sandwich-ul este incubat la 37°C. benzile uşor rozalii,
fluorescente la 336 nm, apar pe un fond roşu intens.
Detecţia proteazelor [54].
Agarul (1,5%) şi gelatina (0,5%) sunt suspendate în tampon Tris-HCl 20 mM, pH 8,8 care
conţine 1 mM NiCl2 şi 0,02% NaN3. Amestecul este incubat pe baie de apă până la topirea
agarului şi a gelatinei şi în continuare degazat. Soluţia este turnată într-o cameră caldă, la 100°C
(descrisă anterior pentru detectarea lipazei) Sandwich-ul rezultat prin suprapunerea gelului de
agar-gelatină, indicator, peste gelul de poliacrilamidă este incubat la 37°C timp de 30 minute. În
continuare, gelul indicator este imersat în soluţie saturată de (NH4)2SO4 timp de 5 la 10 minute,
după care este plasat pe un suport transparent de material plastic şi fotografiat pe un fond negru.
O selecţie de metode de colorare pentru hidrolaze este prezentată în tabelul 3.
Tabelul 3. Hidrolaze
EC Enzima Principliul de detecţie
Procedură sandwich; 3-naftil acetat, paraoxon, 5-bromo-4-
cloro-3-indolil acetat
Cuplare cu albastru diazo

3.1
Esteraze Fluorescenţă
Cuplare cu Fast Garnet 1-naphthyl acetate
Cuplare cu Fast Blue B, 4-metilumbeliferil acetat, 1-naftil
acetat, sau naftol AS-D cloroacetat, complex diazonic cu Fast
Garnet GBC
3.1.1.3 Lipaza Rodamină; fluorescenţă; cuplare cu sare Fast Blue B
3.1.1.4 Fosfolipaza A2
3.1.1.5 Fosfolipaza B
3.1.1.7 Colinesteraza I Formarea de cupru-tiocolină
3.1.1.8 Colinesteraza II

3.1.1.32 Fosfolipaza A1
Detecţie prin complex dintre verde malachit şi
3.1.3 Fosfohidrolaze
fosfomolibdat

Cuplare cu Fast Red TR

Intensificarea vizualizării cu ZnCl2

3.1.3.1 Fosfataza alcalină
Colorare comparativă între cuplarea diazo, formazan şi
colorarea cu argint

5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat şi săruri de terazoliu

 Captura fosfatului. Formarea de complex între rodamină B-
fosfomolibdat

Transfer pe membrană de nitroceluloză, -naftil fosfat

Cuplare cu diazo-pararosanilină
3.1.3.2 Fosfataza acidă
Cuplare cu Fast Garnet

Colorare dublă, pentru peroxidază şi fosfatază acid (vezi 1.11.1.7); 4-

metilumbeliferil fosfat

3.1.3.11 Fructozo-l,6 Difosfataza (fructozo Bisfosfataza) Precipitarea PPi cu Ca2+

3.1.3.18 Fosfoglicolat fosfataza 4-Metilumbeliferil fosfat

3.1.3.31 Nucleotidaza Eliberarea Pi
3.1.4.1 Fosfodiesteraza I 4-Metilumbeliferil fenil fosfonat; fluorescenţă
3.1.4.3 Fosfolipaza C
Zonă opacă în gelul acoperitor de agar
3.1.4.4 Fosfolipaza D

Cuplare cu săruri de diazoniu

3.1.4.17 3'5'-Ciclic-nucleatid fosfodiesteraza
Eliberare de p-nitrofenol
3.1.6.1 Aril sulfataza Cuplare cu fericianură de cupru şi diaminobenzidină

Glicozidazele care hidrolizează

3.2.1 Formarea de zaharuri reducătoare, detecţie cu TTC
compuşi O-glicozilici

Glicohidrolaza bacteriană Gel care conţine perete celular bacterian

Incubare cu amidon solubil, detecţie cu I2

3.2.1.1 -Amilaza Produs colorat

Detecţia amidonului cu I2 identificarea zaharurilor reduse cu
TTC
3.2.1.2 -Amylase La fel ca la -amilază
Electroforeză în SDS, gel care conţine lichenan; renaturare;
colorare cu roşu de Congo
Carboximetil-celuloză, hârtie acoperitoare; colorare prin
3.2.1.4 Celulaza spray-ere cu p-anisidină hidroclorică

Acoperire cu gel de agar care conţine carboximetil-celuloză.

Colorare cu roşu de Congo

Gelul conţine laminarină; colorare cu albastru de aniline;

3.2.1.6 -1,3-Glucanaza
evidenţiere UV

3.2.1.8 Endo--glicozidaza Eluţie din gel; detecţie cu 4-metilumbeliferil--D xilozid

3.2.1.10 Izomaltaza Idem 3.2.1.20

3.2.1.11 Dextranaza Evidenţierea zaharurilor reduse cu TTC

3.2.1.13 Chitinaza Gel acoperitor de glicol chitină; lumină UV şi M2R

3.2.1.18 Neuraminidaza 2'-(4-Metilumbeliferil) -D-N-acetilneuraminat

3.2.1.20 -D-Glucozidaza Fluorescenţă

 Cuplare cu Fast blue B

Eliberarea glucozei cuplată cu glucozo dehidrogenaza,

formarea de NADH; PMS, NBT
3.2.1.20 Maltaza
Gel acoperitor care conţine glucozo oxidază, peroxidază, 2,4-
dinitrofenol, şi 4-L-aminofenazonă

3.2.1.21 -D-Glucozidaza
Idem -D-glucozidazei
3.2.1.22 -D-Galactozidaza

Glucozo oxidază, PMS, NBT

3.2.123 -D-Galactozidaza
Cuplare cu diazo blue B

3.2.1.23 Lactaza Asemănător maltazei EC 3.2.1.20

3.2.1.24 -D-Manozidaza Evidenţierea zaharurilor reduse cu TTC

Evidenţierea zaharurilor reduse cu TTC

-D-Fructofuranozidaza (invertaza,
3.2.1.26 Cuplare cu peroxidază şi glucozo oxidază, diaminobenzidină
sucraza)

Cuplare cu glucozo dehidrogenază, mutarotază, PMS, INT

3.2.1..28 , -Trehalaza Cuplare cu peroxidază şi glucozo oxidază, eugenol

Fluorescenţă
32.1.30 -N-Acetyl-D- Glucozaminidaza
Eliberarea de p-nitrofenol

3.2.1.31 -D-Glucuronidază

Acidul hialuronic este inclus în gel, "Coloraţie totală"

3.2.1.35 Hialuronidaza
(Eastman Kodak, 2718)
3.2.1.39 Laminaraza Asemănător EC 3.2.1.6

3.2.1.48 Sucraza Asemănător EC 3.2.1.20

3.2.1.51 -L-Fucozidaza Evidenţierea zaharurilor reduse cu TTC

Cuplare cu diazo Blue B

3.2.1.52 -N-Acetil-D- hexozaminidaza
Fluorescenţă
3.2.1.53 -N-Acetil-D- Galactozaminidaza Asemănător EC 3.2.1.52

Incubare cu laminarină; reacţie cu TTC

Laminarină în gel; colorare cu albastru de anilină;
fluorescenţă
3.2.1.58 -1,3-Glucanase
Acoperire cu hârtie de filtru care conţine laminarin
Evidenţierea zaharurilor reduse cu TTC
3.2.1.68 Izoamilaza
Colorare cu acid p-aminobenzoic
3.2.2.6 NAD(P) nucleozidaza Colorare negativă; cuplare cu alcool dehidrogenază sau
glucozo 6-fosfat dehidrogenază; PMS. NBT

Proteinaze Precipitare cu TCA sau săruri a proteinei nehidrolizate

3.4
Peptidaze Substrate radiomarcate
 Fluorescenţă
Peptide sintetice care conţin 4-nitroanilină; eliberare de
PNA; reacţie cu DACA
Acţiune asupra legăturii peptidice; peptido hidrolaze
În geluri PAG cu SDS care conţin containing BSA legat
Proteaze bacteriene
covalent
3.4.11.1 Leucin aminopeptidaza Incubare cu L-leucin p-nitroanilidă; lumină UV

3.4.11.3 Oxitocinaza L-Cysteine di--naftilamidă şi Fast blue BB

Tripeptidaza (tripeptidamino
3.4.11.4 Cuplare cu L-amino-acid oxidaza, PMS, INT
peptidaza)

3.4.13.11 Dipeptidaza Cuplare cu L-amino-acid oxidaza, PMS, INT

3.4.21.1 Chimotripsina Detecţie cu BApNA şi ATpNA

3.4.21.4 Tripsina Precipitare cu TCA a proteinei nehidrolizate

3.4.21.10 Acrozina Cuplare cu Fast black

3.4.21.11 Elastaza şi proelastaza Scanare la 550 nm; zonă clară în gelul acoperitor
3.4.21.14 Subtilizina Produs vizibil în UV

Urokinaza; activatori de Zone clare în gelul de acoperire opac; colorare pentru

3.4.21.31
plasminogen proteinele nehidrolizate

3.4.22.1 Catepsina B Cuplare cu Fast garnet GBC; scanare

3.4.24.4 Termolizina Precipitare cu TCA a proteinei nehidrolizate

3.5.1.2 Glutaminaza Cuplare cu enzime auxiliare; PMS, NBT

Creşterea pH; colorare selectivă cu argint
3.5.1.5 Ureaza
Schimbarea pH-ului; conversie la formazan

:3.5.1.9 Aril-formilamin amidohidrolaza Cuplare cu Fast garnet GBC

Gel acoperitor cu glicol chitină; calcofluor white M2R;

3.5.1.41 Chitin deacilaza
Fluorescenţă în UV

Cuplare cu urează, ditiotreitol, NBT

3.5.3.1 Arginaza
Cuplare cu L-glutamat dehidrogenază

3.5.4.3 Guanin deaminaza Cuplare cu xantin oxidaza, NBT

3.5.4.4 Adenin deaminaza Cuplare cu L-glutamat dehidrogenază

3.5.4.5 Citidin deaminaza Cuplare cu L-glutamat dehidrogenază

3.5.4.6 AMP deaminaza Cuplare cu L-glutamat dehidrogenază

3.5.4.17 Adenozin deaminaza Cuplare cu L-glutamat dehidrogenază

Molbdat de amoniu; gel acoperitor

3.6.1 Fosfataze şi pirofosfataze
Precipitare cu Ca2+
3.6.1.1 Pirofosfataza anorganică Asemănător 3.6.1

3.6.1.7 Acilfosfataza Incubare cu acetilfosfat; detecţie cu Pb(N03)2

 Eliberarea de Pi; reacţie cu Pb(N03)2, (NH4)2S
3.6.1.15 Nucleozid trifosfataza
ATP, PbCl2, Na2S, precipitat de PbS

Abrevieri utilizate: ATpNA, acetil-l.-tirozin p-nitroanilidă; BApNA, benzoilarginin p-nitroanidă; DACA, p-

dimetilaminocinamaldehidă; INT, clorură de 3-(p-iodofenil)-2-(p-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazoliu; M2R, calcofluor white M2R;
PAG, gel de poliacrilamidă; PNA, p-nitroanilină; BSA, bovin serum albumină; TTC, clorură de 2,3,5-tetrazoliu.
Liazele
În contrast cu hidrolazele, liazele clivează legături covalente, altfel prin adiţia de apă. În
unele cazuri, proprietăţile chimice alterate ale produsului de clivaj însuşi conduce la o cuplare
specifică cu un reactiv cromogen.
Detecţia argininosuccinat liazei [55]
Această metodă utilizează un număr de enzime auxiliare spre enzima indicator, glutamat
dehidrogenaza (figura 2):
Soluţia de colorare este compusă din 50 mg argininosuccinat de bariu, 1 mg (40 unităţi)
arginază, 2 mg (20 unităţi) urează, 25 mg -cetoglutarat, 10 mg NADH, şi 50l glutamat
dehidrogenază (500 unităţi/ml) în 5 ml de tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6. O hârtie de filtru
Whatman 3MM este îmbibată în această soluţie şi apoi este plasată pe suprafaţa gelului.
Sandwich-ul este incubat la 37°C şi apoi examinat pentru benzile nefluorescente, benzile care
sting fluorescenţa în lumină UV. Gelurile se pot fotografia. În extracte totale, pot apare benzi ale
glutamat dehidrogenazice ori lactat dehidrogenazice. În contrast cu benzile de argininosuccinat
liază, cele ale dehidrogenazelor apar în gel înainte de a fi văzute pe hârtia de filtru.

argininosuccinat liazã
argininosuccinat fumarat + L-Argininã
L-Argininã arginazã L-Ornitinã + uree

uree + H2O ureazã CO2 + 2NH3

glutamat dehidrogenazã
-cetoglutarat + NH+
4 +
NADH L-glutamat + H2O + NAD+
Figura …. Secvenţa de reacţii în evidenţierea argininosuccinat liazei

Detecţia dTDP-glucozo-4,6-hidroliazei [56]

Metoda este aplicabilă enzimelor care catalizează conversia unor substraturi nereducătoare în
produşi reducători. Exemplul ales converteşte dTDP-glucoza la dTDP-4-ceto-6-deoxiglucoză.
Electroferograma este acoperită cu o hârtie de filtru imbibată într-o soluţie care conţine 6 mM
dTDP-glucoză în tampon Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Sandwich-ul este incubat la 37°C pentru 10
minute. După ce gelul este clătit cu apă, el este imersat într-o soluţie proaspăt preparată de TTC
(clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu) 0,1% (w/v) în NaOH 1 M. gelul este introdus într-o cutie care
să-i asigure protecţia faţă de lumină, cât timp este incubat în această ultimă soluţiela temperatura
camerei, timp de 10 minute. În continuare gelul se spală cu acid acetic 7,5% (v/v) pentru a
îndepărta excesul de TCC şi poate fi în continuare colorat cu Coomassie brilliant blue pentru
evidenţierea proteinelor. Alte exwmplw sunt prezentate în tabelul 4.
Tabelul 4. liaze
EC Enzima Principliul de detecţie

Precipitarea CO2 cu fosfat

4.1.1.1 Piruvat decarboxilaza
Colorare cu 1,2-dianilinoetan

4.1.1.28 L-amino acid aromatic decarboxilaza Produsul leagă 14C la o hârtie de schimbătoare de ioni care acoperă gelul

4.1.1.32 PEP Carbozilaza Cuplare cu Fast violet B

Cuplare cu o-aminobenzaldehidă, glicină

4.1.2 Aldolazele
Reducerea porfirindinei

4.1.3.1 Izocitrat liaza Cuplare cu reactiv Schiff

4.1.3.2 Malat sintaza Reducerea fericianurii de potasiu

4.1.3.7 Citrat sintaza Reducerea 2,4-diclorofenol-indofenol, MTT

4.1.3.27 Antranilat sintaza Fluorescenţă

4-Metilumbeliferil acetat; fluorescein diacetat; fluorescenţă

4.2.1.1 Carbonat dehidrataza
Reacţie cu DNSA; fluorescenţă la 366 nm
4.2.1.2 Fumaraza Cuplare cu malat dehidrogenază, MTT

4.2.1.3 Aconitate hidrolaza (aconitaza) Formarea de NADPH, PMS, MTT

4.2.1.11 Enolaza Fenilhidrazină; scanare pentru hidrazonă

4.2.1.13 Serin dehidrataza Cuplare cu 1,2-diamino-4-nitrobenzene

4.2.1.16 Treonin deaminaza Reaction with 2,4-dinitrofenilhidrazină

4.3.2.1 Argininosuccinat liaza Coupling with arginase, urease

4.4.1.5 Glioxalaza I Gel acoperitor deamidon; I2

Lactoil glutation liaza

Abrevieri utilizate: DNPH, 2,4-dinitrofenilhidrazina; DNSA, 5-dimetilaminonaftalen-l-sulfonamidă (dansilamidă)

 5.4. Izomerazele

Aceste enzime (Tabelul 5) catalyze the Formarea de isomers by molecular rearrangements.

Glucose-6-phosphate isomerase, for example, establishes an equilibrium between a keto- and an
aldehydohexose-6-phos-phate. The enzymes are of considerable interest from a MgCIZ, 50 mm
KHCO., and 0.3 mm acetyl-CoA. Rinse genetic and clinical viewpoint since they exist in multi-
the gel in water and transfer to a solution of fast violet B ple tissue-specific forms (isoforms)
(1 mg/ml) for 15 min in the dark. Minimize exposure to light and wash the gel with water.
10.1. Detection of Glucose-6-phosphate Isomerase (17)
This method can be adapted for the detection of a number of enzymes. It requires high
concentrations of reactants to speed up the reactions so as to diminish diffusion. Glucose-6-
phosphate dehydrogenase is used as the indicator enzyme as follows:
fructose-6 -phosphate g'°°°.-6-ph°sphate is°merase
glucose-6-phosphate
glucose-6-phosphate + NADLP+ g'.°.-6-ph°aphete dehydrogenese 6-phosphogluconolactone
+ NADPH + H`
NADPH + MTT P"'-~s NADP` + formazan
A solution of 1.8 g of Tris and 100 mg of NaN3 per 375 ml of water is prepared. Agarose, 60
mg, is dissolved by heating in a boiling water bath in 3.8 ml of the TrisNaN3 solution. An
additional 3.8 ml of solution is used to dissolve 350 mg of fructose-6-phosphate, 50 mg of
NADP', 10 mg of PMS, 25 mg of MTT, and 0.1 mg of glucose-6-phosphate dehydrogenase.
Cool the heated agarose solution to 60°C, mix well with the substrate cofactor solution just
prepared, and pour the mixture on a GelBond sheet, allowing it to set. The indicator gel is placed
on top of the electropherogram and incubations are carried out for 2-4 min at 60°C. The
indicator gel is removed and dried. Bands of blue violet appear at the site of the enzyme.

Kaplan, J. C., Teeple, L., Shore, N., and Beutleq E. (1968) Biochem. Biophys. Res. Common.
31, 768. 2 Scopes, R. K., (1964) Nature 201, 924.
' Nichols, E. A., Chapman, V. M., and Ruddle, F. H. (1978) Biochem. Genet. 8, 47. ° De
Lorenzo, R. J., and Ruddle, F. H. (1969) Biochem. Genet, 3, 151.
' Sici)iano, M. J., and Shaw, C. R. (1976) in Chromatographic and Electrophoretic
Techniques (Smith, L, Ed.), P. 198, Heinemann, London. _,ocrutton, M. C., and Fatebene, F.
(1975) Anal. Biochem. 08, 247.
' Manwell, C., Baker, C. M., and Graydon, R. J. (1985) Anim. Blood Groups Biochem.
Genet. 18, 149.
Enzyme
Couple with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Couple with glucose-6-phosphate dehydrogenase

Couple with glucose-6-phosphate dehydrogenase

Pyruvate carboxylase

Triose-phosphate isomerase

TABLE 5 Isomerases and Ligases

Principle of detection
:Vlannose-phosphate isomerase Phosphoglucoisomerase Glucose-phosphate isomerase
 Modified staining procedure Phosphoglycerate phosphomutase Couple with
phosphoglycerokinase Couple with fast violet
Ref.
1,2 3
4756
11. LIGASES
Ligases (Table 5) are enzymes that establish a new bond between two molecules at the
expense of nucleoside triphosphate.
11.1. Detection of Pyruuate Carboxylase (57)
The reaction is carried out in the presence of a positive allosteric effector, acetyl-CoA, and
leads to the Formarea de oxaloacetic acid. Coupling of the reaction product, oxaloacetate, with
fast violet B (6-benzamido4-methoxy-m-toluidine diazonium chloride) results in a red stain.
Incubate the gel after electrophoresis at room temperature in 100 mm Tris-HCl at pH 7.8, 2
mm ATP, 5 mm
REFERENCES

1. Hames, B. D., Rickwood, R. D. (Eds.) (1990) "Gel Electrophoresis of Proteins," 2nd ed., IRL Press,
Oxford.
2. Shaw, C. R., Prasad, R. (1970) Biochem. Genet. 4, 297.
3. Gabriel, O. (1971) in Methods in Enzymology (Jakoby, W. B., Ed.), Vol. 22, p. 578, Academic Press, New
York.
4. Harris, H., Hopkinson, D. A. (1976) Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics, North-
Holland, Amsterdam; Harris, H., and Hopkinson, D. A. (1977 and 1978) Handbook of Enzyme Electrophoresis in
Human Genetics, Supplements, North-Holland, Amsterdam.
5. Siciliano, M. J., Shaw, C. R. (1976) in Chromatographic and Electropharetic Techniques (Smith, L, Ed.),
Vol. 2, p. 185, Heinemann Medical Books, London.
6. Heeb, M. J., Gabriel, O. (1984) in Methods in Enzymology (Jakoby, W. B., Ed.), p. 416, Academic Press.
Orlando.
7. Gersten, D. M., and Gabriel, O. Anal. Biochem., in press.
8. Poulsen, O. M„ Jacobson, T., Hau, J., Jensen, B., Vodder, L., Anderson, F. (1989) Electrophoresis 10, 857-
864.
9. Schumacher, U., Trudung, P., Ruhnke, M., Gossrau, R. (1990) Histachem. J. 22, 433.
10. Allen, R. C., Budowle, B., Saravis, C. A., Lack, P. M. (1986) Acta Histochem. Cytochem. 19, 637.
11. Radola, B. J. (1989) Electrophoresis 1, 43.
12. Marshall, J. H., Bridge, P. D., May, J. W. (1984) Anal. Biochem. 139, 359.
13. Liebenguth, F. (1974) Biochem. Genet. 13, 263.
14. Seymour, J. L., Lazarus, R. L., May, J. W. (1989) Anal. Biochem. 178, 243.
15. Hearing, V. J. (1987) in Methods in Enzymology (Kaufman, S., Ed.), Vol. 142, p. 154, Academic Press,
New York/London.
16. Holstein, T. J. (1967) Proc. Soc. Esp. Biol. Med. 126, 415.
17. Kinzkofer, A., Radola, B. ,J. (1983) Electrophoresis 4, 408.
18. Beisiegel, U. (1986) Electrophoresis 7, 1.
19. Towbin, H., Staehtin, T., Gordon, T. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350.
20. Ohlsson, B.G., Westrom, B.R., Karlson, B.W. (1987) Electrophoresis 8, 415.
21. Renart, J., Reiser, J., and Stark, G. R. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3116.
22. Montelaro, R. C. (1987) Electrophoresis 8, 432.
23. Hagar, D. A-, Burgess, R. R. (1980) Anal. Biochem. 109, 76.
24. Karsnas, P., Roos, R. (1977) Anal. Biochem. 77, 168.
25. Djondjurov, L., Holzer, L. (1979) Anal. Biochem. 94, 274.
26. Lewis, U. J., Clark, M. O. (1963) Anal. Biochem. 6, 303.
27. Stephens, R. E. (1975) Anal. Biochem. 65, 369.
28. Nguyen, N. Y., DiFonzo, J., Chrambach, A. (1980) Anal. Biochem. 106, 78.
29. Bhown, A. G., Mole, J. E., Hunter, F.,Bennett, J. C. (1980) Anal. Biochem. 103, 184.
30. Tuszynski, G. P., Damsky, C. G., Fuhrer, J. P., Warren, L. (1977) Anal. Biochem. 83, 119.
31. Stralfors, P., Belfrage, P. (1983) Anal. Biochem. 127, 7.
32. Ziola, B., Scraba, D. G. (1976) Anal. Biochem. 72, 366.
33. Thelu, J. (1988) Anal. Biochem. 172, 124.
34. Rosenthal, A. L, Lacks, S. A. (1977) Anal. Biochem. 80, 76.
 35. Lacks
36. 62. Scheele, G. A. (1982) Clirz. Chem. 28, 1056.
37. Lk S A and Spnnghorn S S (1980) J Biol. Chem 255, ,Z,.acs,..,,....
38. 7467. ® Hearing, V. J., Klingler, W. G., Ekel, T. M., and Montague, P. M.
39. P. C., ZYk, N., an m d C~t ~, ~ ~'. (1985) Anal. Biochem. 144, 199 ~ (19'6) Ana L. we em. 72, Tai,
113
40. ~ isoWl L LJ Eley' M' H., Burns, P. C., Kannapell, C. C., and Campbell, P. S. Geahlen, R L
Anostano, M`, Low, P. S, and Harr ,
41. (1979) Anal. Biochem. 92, 411.
42. 10. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd
ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
43. 41. Cleveland, D. W., Fisher, S. G., Kirschner, M. W., and Laemmli, U. K. (1977) J. Biol. Chem. 252,
1102.
44. 4`?. Mozhaev, V. V., Berezin, I. V., and Martinek, K. (1987) in Methods in Enzymology (Mosbach, K.,
Ed.), Vol. 135, p. 586. Academic Press, New York/London.
45. ~~ Muilerman, H. G., Ter Hart, H. G. J., and Van Dijk, W. (1982) Ann L. Biochem. 120, 46.
46. 44. Weber, K., and Kuter, J. (1971) J. Biol. Chem. 246, 4504.
47. 45. Chang, L. M. S., Plevani, P., and Bottom, F. J. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 758.
48. 46 Scewczyk, B., and Summers, B. F. (1988) Anal. Biochem. 168,48. 47. Martin, W., and Neibuhr, R.
(1973) Blot 26, 151.
49. 48. Greyson, J. E., Jon, R. J., and Butterworth, P. J. (1979) Biochem. J. 183, 239.
50. Nimmo, H. G., and Nimmo, G. A. (1982) Anal. Biochem- 121, 17. p0. Harris, H., and Hopkinson, D. A.
(1976) in Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics, North-Holland, Amsterdam.
51. Berg, W., Gutschker, G. G., and Schauer, R. (1985) Anal. Biochem. 145, 339.
52. 52. Hodson, .4. W., and Skillen, A. W. (1988) Anal. Biochem. 169,
53. 253.
54. '1~3) Every, D. (1981) Anal. Biochem. 116, 519.
55. HoeHelmann, M., Kittensteiner-Eberle, R., and Schrier, P. (1983) Anal. Biochem. 128, 217.
56. Nelson, R. L., Povey, S., Hopkinson, D. A., and Harris, H. (1977) Biochem. Genet. 15, 1023.
57. y 58. Gabriel, O., and Wang, S. F. (1969) Anal. Biochem. 27,545. S
59. ctutton, M. C., and Fatabene, F. (1975) Anal. Biochem. 69, 247. McGtew, B. R., and Green, D. M. (1990)
Anal. Biachem. 189,68. Van Seuningen, L, and Davril, M. (1990) Anal. Biochem. 186,
60. 306.
60. Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680.
61. Manrow, R. E., and Dottin, R. P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 730.
P Akin, D. T., Shapiro, R., and Kinkade, J. M., Jr. (1985) Anal. Biochem. 145, 170.
(1986) Anal. Biochem. 153, 151.
38. Paudel, H. K., and Carlson, G. M. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 264,641.
39. -Esen, A., and Gungor, G. (1991) Appl. Theor- Electrophoresis 2
Gabriel, O., Gersten, D.M. Staining for Enzymatic Activity after Gel Electrophoresis, I Anal. Biochem. 203,
(1992)
Abbreviations used: SDS, sodium dodecyl sulfate; MTT, 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide; NBT, 2,2'-di -p-nitwophenyl-5,5'-diphenyl-3,3'-(3,3'-dimethoxy-
4,4'-diphenylene)tetrazolium chloride; PMS, phenazine methosulfate; CoA, coenzyme A;
CTAB, cetylammonium bromide; APAD, 3-acetylpyridine adenine dinucleotide; TTC, 2,3,5-
triphenyltetrazolium chloride.
APAD, 3-acetylyridine adenine dinucleotide;
INT, p-iodonitrotetrazo,um violet; TTC, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride; 4-MU, l-
methylumbelGferyl;
o eliminate proteins SDS, followed b soIuY3.1

7.4. Ligazele

Bibliografie

Poulsen, O. M., Jacobsen, T., Hau, J., Jensen, B., Vodder, L., Andersen, F. (1989) Enzyme activity
electrophoresis: development and applications. Electrophoresis. 10:857-864.
 Seymour, J. L., Lazarus, R. A. (1989) Native gel activity stain and preparative electrophoretic method for the
detection and purification of pyridine nucleotide-linked dehydrogenases. Anal Biochem 178:243-247.
Marshall, J. H., Bridge, P. D., May, J. W. (1984) Source and avoidance of the "nothing dehydrogenase" effect, a
spurious band produced during polyacrylamide gel electrophoresis of dehydrogenase enzymes from yeasts. Anal
Biochem. 139:359-362.
Leibenguth, F. (1974) Esterase-2 in Ephestia kühniella. I. Genetics and characterization. Biochem Genet. 10:219-
229.
Holstein, T. J., Burnett, J. B., Quevedo, W. C. Jr. (1967) Genetic regulation of multiple forms of tyrosinase in
mice: action of a an b loci. Proc Soc Exp Biol Med. 126:415-418.
Shaw, C. R., Prasad, R. (1970) Starch gel electrophoresis of enzymes--a compilation of recipes. Biochem Genet.
4:297-320.
Schimke, R. T., Grossbard, L. (1968) Studies on isozymes of hexokinase in animal tissues. Ann N Y Acad Sci.
151:332-350.
Gabriel, O., Gerstent, D. M. (1992a) I. Staining for Enzymatic Activity after Gel Electrophoresis. Anal. Biochem
203:1-21.
7. Schimke, R. T., Grossbard L. (1968) Ann. N Y Acad. ScL 151, 332.
8. Katzen, H. M., Soderman, D. D., Cirillo, V. J. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 351.
9. Tischfeld, J. A., Bernhard, H. P., Ruddle, F. H. (1973) Anal. Biochem. 53, 545.
10. Rogers, P. A., Fisher, R. A., Harrish (1975) Biochem. Genet. 13, 857.
11. Hoti, S. H., Matsui, S. I. (1968) J. Histochem. Cytochem. 16, 62.
12. Shaw, C. H. R., and Koen, A. L. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 149.
13. Criss, W. E., and McKerns, K. W. (1968) Biochemistry 7, 125.
14. Allen, S. L. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 190.
15. Siciliano, M. J., Shaw, C. R. (1976) in Chromatographic and Electrophoretic Techniques (Smith, L, Ed.), Vol
2, p. 185, William Heineman Medical Books, London.
16. Sofer, W., Ursprung, H. (1968) J. Biol. Chem. 243, 3110.
17. Smith, M., Hopkinson, D. A., Harris, H. (1971) Ann. Hum. Genet. 34, 251.
18. Grell, E. H., Jacobson, K. B., Murphy, J. B. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 441.
19.Ogilvie, J. W., Sightler, J. H., Clark, R. B. (1969) Biochemistry 8, 3557.
20. Charlesworth, D. (1972) Ann. Hum. Genet. 35, 477.
21. Allen, J. M. (1961) Ann. N. Y Acad. Sci 94, 937.
22. Werthamer, S., Freiberg, A., Amaral, L. (1973) Clin. Chim. Acta 45, 5.
23. Tarmy, E. M., Kaplan, N. O. (1968) J BioL Chem. 243, 2579.
24. Chen, P. S. (1968) J. Exp. ZooL 168, 337.
25. Schatz, L., Segal, H. L. (1969) J. Biol. Chem. 244, 4393.
26. Cammack, R. (1969) Biochem. J. 115, 55.
27. Craig, L. Toley, E., Borrow, M. (1976) in Birth Defects: Original Article Series, Vol. 12, pp. 114, The
National Foundation, March of Dimes, New York.
28. Allen, S. L. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 190.
29. Henderson, N. S. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 429
30. Villez, C. A. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 222.
31. Murphey, W. H., Barnaby, C., Lin, F. J., Kaplan, N. O. (1967) J. Biol. Chem. 242, 1548. 31a. Parsons, S. J.,
Burns, R. O. (1969) J. Biol. Chem. 244, 996.
32. Cohen, P. T. W., Omenn, G. S. (1972) Biochem. Genet. 7, 303.
33. Povey S., Wilson, D. E., Harris, H., Gormley, I. P., Perry, P., Buckton, K. E. (1975) Ann. Hum. Genet. 39,
203.
34. Turner, B. M., Fisher, R A., Harris, H. (1974) Ann. Hum. Genet. 37, 455.
35. Nimmo, H. G., Nimmo, G. A. (1982) Anal. Biochem. 121, 17.
36. Carda-Abella, P., Perez-Cuadrada, S., Lara-Baruque, S., Gil-Grande, L., Nunez-Puertas, A. (1982) Cancer 49,
80.
37. Simon, K., Chaplin, E. R., Diamond I. (1977) Anal. Biochem. 79, 571.
38. Springell, P. H., Lynch, T. A. (1976) Anal Biochem. 74, 251
39. Gabriel, O., Gersten, D.M. (1992) Anal. Biochem. 203, 1.
40. O'Conner, J. L. (1977) Anal Biochem. 78,205.
41. Schachter, H., Sarney, J., Mcguire, E. J., Roseman, S. (1969) J. Biol. Chem. 244, 4785.
42. Duly, J., Holmes, R. S. (1974) Genetics 76, 93.
43. Charlesworth, D. (1972) Ann. Hum. Genet. 35, 477.
44. Nelson, R. L., Povey, S., Hopkinson, D. A., Harris, H. (1977) Biochem. Genet. 15, 87.
45. Omenn, G. 5., Cheung, S. C. Y. (1974) Am. J. Hum. Genet. 26, 393.
46. Chen, S. H., Anderson, J., Giblett, E. R., Lewis, M. (1974) Am. J. Hum. Genet. 26, 1.
47. Barker, R. F., Hopkinson, D. A. (1977) Ann. Hum. Genet. 41, 27.
48. Ma Lin, A. W.-S., Castell, D. O. (1975) Anal. Biochem. 69, 637.
 49. Nixon, P. F., Blakley, J. (1968) J. Biol. Chem. 243, #722.
50. Albrecht, A. :V. L. , Pearce, F. K., Soling, W. J., Hutchinson, D. J. (1969) Biochemistry 8, 960.
51. Davidson, R. G., Cortner, J. A., Rattazi, M. C., Ruddle, F. H., Lubs, H. A. (1970) Science 169, 391.
52. Williams, L., Hopkinson, D..4. (1975) Hum. Hered. 25, 567.
53. Kaplan, J. C., Beutler, E. (1967) Biochem. Biophys. Res. Common. 29, 605.
54. Millard, S. A., Kubose, A., Gal, E. M. (1969) J. Biol. Chem. 244, '?511.
55. Cohn, M. L., Wang, L., Scouten, W., McManus, I. R. (1968) Biochim. Biophys. Acta 159, 182.
56. Ingle, J. (1968) Biochem. J. 108, 715.
57. Cohen, H. J. (1973) Anal. Biochem. 63, 208.
58. Gregory, E. M., Fridovich, (. (1974) Anal. Biochem. 58-57.
59. I,iu, E. H., and Gibson, D. M. (1977) Anal. Btochem. 79, 597.
60. Cullis, C. A., Kolodynska, K. (1975) Biochem. Genet. 13, 687.
61. Beutler, E., West, C. (1974) Am. J. Hum- Genet. 26, 253.
62. Beauchamp, C., Fridovich, I. (1971) Anal. Biochem. 44,216.
63. Beckman, G., Lundgren, E., Tarnvik, A. (1973) Hum. Hered. 23, 338.
64. Calderon, A. A., Pedrene, M. A., Ros-Barado, A., Munoz, R. (1990) Electrophoresis 11, 507.
65. Shimoni M., Reuveni R. (1988) Anal. B" uochem. 175, 35.
66. Friedrich, C. A., Morizot, D. C., Sizilano, M. J., Ferrell, R. E. (1987) Biochem. Genet. 25, 657.
67. Butler, M. J., Lachance, M. A. (1987) Anal. Biochem. 162, 443.
68. Wayne, L. G., Diaz, G. A. (1986) Anal. Biochem. 157, 89.
69. Heydeck, D., Schewe, T. (1985) Biomed. Biochim. Acta 44, 1261.
70. Funk, M. O., Whitney, M. A., Hausknecht E. C., O'Brien, E. M. (1985) Anal. Biochem. 146, 246.
71. Marshall, J. H., Bridge, P. D., May, J. W. (1984) Anal. Biochem. 139, 359.
72. Fieldes, M. A., Starobin, J., Typson, H. (1984) Anal. Biochem. 137, 146.
73. Board, P. G. (1983) Am. J. Hum. Genet. 35, 914.
74. Tanaka, T., Mori, N. (1986) Prostaglandins Leukotrienes Med. 23, 267.
75. Beckman, G. (1973) Hereditas 73, 305.
76. Akyama W. (1990) Electrophoresis 11, 509.
77. Harada, S. (1989) Electrophoresis 10, 652.
78. Adams, E., Rosso, G. (1967) J. Biol. Chem. 242, 1802.
79. Akin, D. T., Shapiro, R., Kinkade, Jr. (1985) Anal. Biochem. 145, 170.
Biblio tabel 2 transferaze
1. Seymor, J. L., Lazarus, R L., May, J. W. (1989) Anal. Biochem. 178, 243.
2. Marshall, J. H., Bridge, P. D., May J. W. (1984) Anal. Biochem. 139, 359.
3. Liebenguth. F. (1974) Biochem. Genet. 13, 263.
4. Holstein, T. J. (1967) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 126, 415.
5. Shaw, C. R., Prasad R. (1970) Biochem. Genet. 4, 297.
6. Harris, H., Hopkins, D. A. (1976) Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetic, North-Holland,
Amsterdam.
7. Schimke, R. T., Grossbard L. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 161, 332.
8. Katzen, H. M, Soderman, D. D., Cirillo, V. J. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 351.
9. Tischfeld, .J. A., Bernhard, H. P., Ruddle, F. H. (1973) Anal, Biochem. 53, 545.
10. Rogers, P. A., Fisher, R. A., Harrish (1975) Biochem. Genet. 13, 857.
11. Hori, S. H., and Matsui, S. I. (1968) -J. Histochem. Cytochem. 16, 62.
12. Shaw, C. H. R., Koen, A. L. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 149
13. Chris, W. E., McKerns, K.W. (1968) Biochemistry. 7, 125
14. Allen, S. L. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 190.
15. Siciliano, M. J., Shaw, C. R. (1976) in Chromatographic and Electrophoretic Techniques (Smith, L, Ed.), Vol
2, p. 185, William Heineman Medical Books, London.
16. Baron, D. L., Buttery, J. E. (1972) J. Clin. Pathol. 25, 415.
17. Grayson, J. E., Yon, R. J., Butterworth, P. J. (1979) Biochem. J. 183, 239.
18. Izumi, M., Takers, K. (1981) in Electrophoresis '81 (Allen, R. C., and Arnaud, P., Eds.), p. 709, de Gruyter,
Berlin.
19. Fredrick, J. F. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 161, 413.
20. Assaf, S. A., Graves, D. J. (1969) J. Biol. Chem. 244, 5544.
21. Harris, H., Hopkinson, D. A., Luffman, J. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 232.
22 Davis, C. H., Schlisefeld, L. H., Wolf, D. P., Leavitt, C. A., Krebs, E. G. (1967) J. Biol. Chem. 242, 4824.
23. Hedrick, J. L., Smith, A. J., Bruening, G. E. (1969) Biochemistry 8, 4012.
24. Schimke, R. T., Grossbard, L. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 332.
25. Gabriel, O., Wang, S. F. (1969) Anal. Biochem. 27, 545.
26. Alexander, J. K. (1968) J. Biol. Chem. 243, 2899.
27. Mowbray, S., Watson, B., Harris, H. (1975) Ann. Hum. Genet. 36, 153.
 28. Tischfield, J. A., Bernhard, H. P., Ruddle, F. H. (1973) Anal. Biochem. 53, 545.
29. Wasquez, B., Bieber, A. L. (1978) Anal. Biochem. 84, 504.
30. Walker, D. G., Khan, H. H. (1968) Biochem. J. 108, 169.
31. Scandalios, J. G., Sorensen, J. C., Ott, L. A. (1975) Biochem. Genet. 13, 759.
32. Nicholls, E. A., Elsevier, S. M., Ruddle, F. H. (1974) Cytogeaet. Cell Genet. 13, 275.
33. Brock, D. J. H. (1969) Biochem. J. 113, 235.
34. Nissner, N., Beutler, E. (1974) Biachem. Med. 9, 73.
35. Yagi, T., Kagamiyama, H., Nozaki, M. (1981) Arza1. Biochem. 110, 146.
36. Hayashi, S., Lin, E. C. C. (1967) J. Biol. Chem. 242, 3030.
37. Martin, W., Neibuhr, R. (1973) Blut 26, 151.
38. Phan-Dinh-tuy, F., Weber, A., Henry, J., Cottreau, D., Kahn, A. (1982) Anal. Biochem. 127, 73.
39. Gagelman, M., Pyerin, W., Kubler, D., Kinzel, V. (1979) Ana1. Biochem. 93, 52.
40. Hirsch, A., Rosen, M. (1974) Anal. Biochem. 60, 389.
41. Melendez-Hevia, E., Corzo, J., Perez, J. (1981) in Electrophoresis'81 (Allen, R. C., and Arnaud, P., Eds.), p.
693, de Gruyter, Berlin.
42. Siciliano, M. J., Shaw, C. R. (1976) in Chromatographic and Electrophoretic Techniques (Smith, L, Ed.), Vol
2, p. 207, Heinemann, London.
43. Imamura, K., and Tanaka, T. (1972) J Biochem. 71, 1043.
44. Beutler, E. (1969) Biochem. Genet. 3, 189.
45. Graeber, G. M., Reardon, M. J., Fleming, A. W., Head, H. D., Zajtehuk, R., Brott, W. H., Foster, J. H. (1981)
Ann. Thor. Surg. 32,230.
46. Yamashita, T., Utoh, H. (1978) Anal. Biochem. 84, 304.
47. Ha11, N., DeLuca, M. (1976) Anal. Biochem. 78, 561.
48. Yue, R. H., Jacobs, H. K., Okabe, K., Keutel, H. J., Kuby, S. A. (1968) Biochemistry 7, 4291.
49. Wilson, D. E., Povey, S., Harris, H. (1976) Ann. Hum. Genet. 39, 305.
50. Jamil, T., Fisher, R. A., Harris, H. (1976) Hum. Hered. 25, 402.
51. Harris, H., Hopkinson. D. A., Luffman, J. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 232.
52. Dawson, D. M., Mitchell (1969) Biochemistry 8, 609.
53. Kuehn, P., Schmidtmann, U., Spielmann, W. (1977) Hum. Genet. 35, 219.
54. Manrow, R. E., Dottin, R. P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 730.
55. Marrow, R. E., and Dottin, R. P. (1982) Anal. Biochem. 120, 181.
56. Dottin, R. P., Marrow, R. E., Fishel, B. R., Aukerman, S. L., Culleton, J. L. (1979) in Methods in Enzymology
(Moldave, K., and Grossman, L., Eds.), Vol. 60, p. 513, Academic Press, San Diego.
57. Nimmo, H. G., Nimmo, G. A. (1982) Anal. Biochem. 121, 17.
58. Omenn, G. S., Cheung, S. C. Y. (1974) Am. .J. Hum. Genet. 26, 393.
59. Chen, S. H., Anderson, J., Gilbert, E. R., and Lewis, M. (1974) Am. J. Hum. Genet. 26, 73.
60. Ng, W. G., Bergren, W. R., Fields, M., Donnell, G. N. (1969) Binchem. Biophys. Res. Commun. 37, 354.
61. Kameshita, L, Fujisawa, H. Anal. Biochem. (1989) 183 139.
62. Farkas, D. H., Skomra, C. J., Anderson, G. R., Hughes, R. G., .Jr. (1987) Anal. Biochem. 160, 421.
63. Miller, A. W., Robyt, J. F. (1986) Anal. Biochem. 166, 357.
64. Krishman, C. R., Blumenfeld, M. L. (1986) Anal. Biochem. 154, 409.
65. Sirag-Edlin, E., Gercken, G.. Harm, K., Voigt, K. D. (1985) J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 23, 241.
66. Williams, J., Williams, K. M., Marshall, T. (1989) Electrophoresis 10, 579.
67. Markel, D., Schmidt, G., Flachmeier, C., Behrent, G., Coutelle, C., Hunger, H. D. (1989) J. Biochem. Biophys.
Methods 18, 277.
Tabel 3. Hidrolaze
1. Hunter, R. L., Bennet, D. C., Dodge, A. H. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 594.
2. Collins, W. J., Forgash, A. J. (1968) J. Insect Physiol. 14, 1515.
3. Hunter, R. L., Maynard, E. A. (1962) J. Histochem. Cytochem. 10, 677.
4. Coates, P. M.. Mestriner, M. A., Hopkinson, D. A. (1975) Ann. Hum. Genet. 39, 1.
5. Cullins, C. A., Kolodynska, K. (1975) Biochem. Genet. 13, 687.
6. Yourno, J., Mastropaolo, W. (1981) Blood 58, 939.1
7. Rosenberg, M., Roegner, V., Becker, F. F. (1975) Anal. Biochem. 66, 206.
8. Herd, J. K., Tschida, J. (1975) Anal. Biochem. 68, 318.
9. Davis, G. A., Agranoff, B. W., (1968) Nature 220, 277.
10. Das, P. K., Liddell, J., (1970) Biochem. J. 116, 875.
11. Harris, H., Hopkinson, D. A., Robson, E. B. (1962) Nature 196, 1296.
12. Hofelmann, M., Kittsteiner-Eberle, R., Schreier, P. (1983) Anal. Biochem. 128, 217.
13. Nachlase, M. M., Morris, B., Rosenblatt, D., Seligman, A. M. (1960) J. Biophye. Biochem. Cytol 7, 261.
14. Shier, W. T., Trotter, ,J. T. (1978) Anal. Biochem. 87, 604.
15. Iype, P. T., Heidelberger, C. H. (1968) Arch. Biochem. Biophys. 128, 434.
 16. Moss, D. W., Eaton, R. H., Smith, J. K., Whitby, L. G. (1967) Biochem. J. 102, 53.
17. Cox, R. D., Gilbert, P., Griffin, M. J. (1967) Biochem. J. 105, 155.
18. Sussman, H. H., Small, P. A., Cotlove, E. (1968) .J. Biol. Chem. 243, 160.
19. Arsenis, C., Toustet, O. (1968) J Biol. Chem. 243, 5702.
20. Barka, T. J. (1961) J. Histochem. Cytochem. 9, 642.
21. Anderson, P. J., Song, S. K., Christoff, N. (1962) in Proceedings, 4th International Congress on
Neuropathology, Vol 1, p. 75.
22. Igarashi, M., Hollander, V. P. (1968),J. Biol. Chem. 243, 6084.
23. Nimmo, H. G., Nimmo, G. A. (1982) Anal. Biachem. 121, 17.
24. Barker, R. F., Hopkinson, D. A. (1978) Ann. Hum. Genet. 42, 1.
25. Dvorak, H. F., Heppel, L. A. (1968) J. Biol. Chem. 243, 2647.
26. Pilcher, C. W. T., Scott, T. G. (1967) Biochem. J. 104, 41C.
27. Smyth, C. J., Wadstrom, T. (1975) Anal. Biochem. 65, 137.
28. Monn, E., Christiansen, R. O. (1971) Science 173, 540.
29. Lerch, 8. (1968) Experientia 24, 889.
30. Harvey, C. L., Olson, K. C., Wright, R. (1970) Biochemistry, 9, 921.
31. Shapira, E., De Gregorio, R. R., Matalon, R., Nadler, H. R. (1975) Biochem. Biophys. Res. Common. 62,
448.
32. Chang, P. L., Ballantyne, S. R., Davidson, R. G. (1979) Anal. Biochem. 97, 36.
33. Nichols, E. A., Chapman, V. M., Ruddle, F. H. (1973) Biochem. Genet. 8, 47.
34. Mannowitz, P., Goldstein, L. N., Bellomo, F. (1978) Anal. Biochem. 89, 423.
35. Mukasa, H., Shimamura, A., Tsumori, H. (1982) Anal. Biochem. 123, 276.
36. Price, R. G., Dance, N. (1976) Biochem. J. 105, 877.
37. Gabriel, O., Wang, S. F. (1969) Anal. Biochem. 27, 545.
38. Cruickshank, R. H., Wade, G. C. (1980) Anal. Biochem. 107, 177.
39. Ogida, Z. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci.151, 243.
40. Freidman, T., Epstein, C. J. (1967) J. Biol. Chem. 242, 5131.
41. Keller, P. J., Allan, B. J. (1967), J. Biol. Chem. 242, 281.
42. Heller, H., Kulka, R. C. (1968) Biochim. Biophys. Acta 165, 393.
43. Burdett, P. E., Kipps, A. E., Whitehead, P. H. (1976) Anal. Biochem. 72, 315.
44. Lacks, S. A., Springhorn, S. S. (1980) J. Biol. Chem. 255, 7467.
45. Brown, T. L., Yet, M. G., Wold, F. (1982) Anal. Biochem. 122, 164.
46. Erickson, K. E., Peterson, B. (1973) Anal. Biochem. 56, 618.
47. Swallow, D. M., Corney, G., Harris, H., Hirschhorn, R. (1975) Ann. Hum. Genet. 38, 391.
48. Beutler, E., Kuhl, W„ Trinidad, F., Teplitz, R., Nadler, H. (1971) Am. J. Hum. Genet. 23, 62.
49. Beutler, E., Kuhl, W. (1972) J. Biol. Chem. 247, 7195.
50. Beutler, E., Guinto, E., Kuhl, W. (1973) Am. J Hum. Genet. 25, 42.
51. Alpers, D. H. (1969) J. Biol. Chem. 244, 1238.
52. Alpers, D. H„ Steers, E., Jr., Shifrin, S., Tompkins, G. (1968) Ann. N. Y. Acad. Sci. 151, 545.
53. Norden, A. G. W., O'Brien, J. S. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci USA 72, 240.
54. Poenaru, L., Dreyfus, J. C. (1973) Biochim. Biophys. Acta 303, 171.
55. Faye, L. (1981) Anal. Biochem. 112, 90.
56. Babczinski, P. (1980) Anal. Biochem. 105, 328.
57. Killick, K. A., Wang, L. W. (1980) Anal. Biochem. 106, 367.
58. Suguira, M., Ito, K, Sawaki, S. (1977) Anal. Biochem. 81, 481.
59. Kaplan, J. C., Teeple, L., Shore, N., Beutler, E. (1968) Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 768.
60. Robinson, D., Price, R. G., Dance, N. (1961) Biochem. J 102, 525.
61. Fondo, E. Y., Bartalos, M. (1969) Biochem. Genet. 3, 591.
62. Franke, U. (1976) Am. J Hum. Genet. 28, 357.
63. Markert, C. L., Hunter, R. L. (1959) J Histochem. Cytochem. 7, 42.
64. Aminoff, D., Furukawa, K. (1970) J Biol. Chem. 245, 1659.
65. Turner, B. M., Beratis, N. G., Turner, V. S., Hirschhorn, K. (1974) Clin. Chim. Acta 57, 29.
66. Okada, S., Veath, M. L., Lerov, J., O'Brien, J. S. (1971) Am. J Hum. Genet. 23, 55.
67. Flechner, L., Hirschhorn, S., Bekierkunst, A. (1968) Life Sci. 7, 1327.
68. Ravazzolo, R., Bruzzone, G., Garre, C., Ajmar, F. (1976) Biochem. Genet. 14, 877.
69. Lacks, S. A., Springhorn, S. S. (1980) J. Biol. Chem. 255, 7467.
70. Lynn, K. R., Clevette-Radford, N. A. (1981) Anal. Biochem. 117, 280.
71. Every, D. (1981) Anal. Biochem. 116, 519.
72. Burdett, P. E., Kipps, A. E., Whitehead, P. H. (1976) Anal. Biochem. 72, 315.
73. Rapley, S., Lewis, W. H. P., Harris, H. (1971) Ann. Hum. Genet. 34, 307.
74. Heussen, E., Dawdle, E. B. (1980) Anal. Biochem. 102, 196.
75. Andary, T. J., Dabich, D. (1974) Anal. Biochem. 57, 457.
 76. North, M. J., Harwood, J. M. (1979) Biochim. Biophys. Acta 566, 222.
77. Strongin, A. Y., Azarenkova, N. M., Vaganova, T. L, Levin, A. D., Stepanov, V. M. (1976) Anal.
Biochem. 74, 597.
78. Mukasa, H., Shinamura, A., Tsumari, H. (1982) Anal. Biochem. 123, 276.
79. Gertler, A., Trencer, Y., Tinman, G. (1973) Anal. Biochem. 54, 270.
80. Ward, C. W. (1976) Anal. Biochem. ?4, 242.
81. Feinstein, G., Janoff, A. (1976) Anal. Biochem. 71, 358.
82. Dijkhof, J., Poort, C. (1977) Anal. Biochem. 83, 315.
83. Westergaard, J. L., Roberts, R. C. (1981) in Electrophoresis '81 (Allen, R. C., and Arnaud, p., Eds.), p. 677,
84. de Gruyter, Berlin. s" Garner, D. L. (1975) Anal. Biochem. 67, 688.
85. Lyublinskaya, L. A., Belyaev, S. V., Strongin, A. Ya., Matyash, L. F., Stepanov, V. M. (1974) Anal.
Biochem. 62, 371.
86. Granelli-Piperano, A., Reich, E. (1978) J. Exp. Med 148, 223.
87. Heussen, C., Dawdle, E. B. (1980) Anal. Biochem. 102, 196.
88. Mort, J. S., Leduc, M. (1982) Anal. Biochem. 119, 148.
89. Davis, J. N., Prusiner, S. (1973) Anal. Biochem. 54, 272.
90. Shaik-M, M. B., Guy, A. L., Pancholy, S. K. (1980) Anal. Biochem. 103, 140.
91. Marks, N., Datta, R. K., Lajtha, A. (1968) J. Biol. Chem. 243, 2882.
92. Idahl, L. A., Taljedai (1968) Biochem. J. 106, 161.
93. Farron, F. (1973) Anal. Biochem. 53, 264.
94. Nelson, R. L., Povey, S., Hopkinson, D. A., Harris, H. (1977) Biochem. Genet. 15, 1023.
95. Currie, R., Bergel, F., Bray, C. (1967) Biochem. J. 104, 634.
96. Spencer, N., Hopkinson, D. A., Harris, H. (1968) Ann. Hum. Genet. 32, 9.
97. Teng, Y. S., Anderson, J. E., Giblett, E. R. (1975) Am. J. Hum. Genet. 27, 492.
98. Anderson, J. E., Teng, Y. S., Giblett, E. R. (1975) in Birth Defects, Original Article Series, Vol. 11, p. 295,
The National Foundation, March of Dimes, New York.
99. Lomholt, B. (1975) Anal. Biochem 66 569.
100. Fischer, R. A., Turner, B. M., Dorkin, H. L., Harris, H. (1974) Ann. Hum. Genet. 37, 341.
101. Selwin, M. J. (1967) Biochem, J. 106, 279.
102. Abrams, A., Baron, C. (1967) Biochemistry 6, 225.
103. Bank, R. A., Hettema, A. F., Amerougen, A. U. N. Pronk, J. C. (1991) Electrophoresis 12, 7479.
104. Kanellis, A. K., Solomos, T., Mattoo, A. K. (1989) Anal. Biochem. 179, 194.
105. Vallejos, C E (1983) in Isozymes in Plant Genetics and Breeding (Tansksley, S. D., and Orton, T. J., Eds.),
Part A, p. 469, Elsevier, Amsterdam.
106. Mizuno, Y., Ohba, Y., Fujita, H., Kanesaka, Y., Tamura, T., Shiokawa, H., (1989) Anal. Biochem. 183, 46.
107. Trudel, J., Asselin, A. (1989) Anal. Biochem. 178, 362.
108. Martin de Llano, J. J., Gracia Segura, J. M., Gavilanes, J. G. (1989) Anal. Biochem. 177, 37.
109. Sinha, P., Seidel, M., Righetti, P. G., Bause-Niedrig, L, Kottgen, E. (1989) J. Biochem. Biophys. Methods
18, 195.
110. Brisson-Lougarre, A., Vergnes, H., Grozdea, J., Bierme, R. (1988) Electrophoresis 9, 221.
111. Grenier, D., Chao, G., and McBride, B. C. (1989) Infect. Immun. 57, 95.
112. Hadson, A. W., Skillen, A. W. (1988) Anal. Biochem. 169, 253.
113. Schwarz, W. H., Bronnenmeier, K., Grabnitz, F., Staudenbauer, W. L. (1987) Anal. Biochem. 164, 72.
114. Zlotnick, G. W., Gottlieb, M. (1986) Anal. Biochem. 153, 121.
115. Sinha, P. (1985) J. Biochem. Biophys. Methods 11, 327.
116. MeGadey, J. (1970) Histochemie 23, 180.
117. Berg W., Gutschker-Gdaniec, G., Schauer R. (1985) Anal. Biochem. 145, 339.
118. Fiszer-Szafarz, B. (1984) Anal. Biochem. 143, 76.
119. Gopalaswarmy, G., Sri-Krishna, K., Kanagasabapathy, A. S. (1984) Clin. Chem. 30, 1115.
120. Nemoz, G., Prigent, A. F., Pacheco, H. (1983) Anal. Biochem. 133, 296.
121. Beguin, P. (1983) Anal. Biochem. 131, 333.
122. Debruyne, I. (1983) Anal. Biochem. 133, 110.
123. Hawley, D. M., Crisp. M., Hodes, M. E. (1983) Anal. Biochem. 129, 522.
124. Haas, A., Geldmacher von Malinckrodt, M. (1990) Electrophoresi.s 11, 621.
125. Finlayson, S. D., Moore, P. A., Johnston, J. R., Berry, D. R. (1990) Anal. Biochem. 186, 233.
126. Simpson, J. W., Doxey, D. L., Keay, G. (1989) Vet. Res. Commun. 13, 441.
127. Cote, F., Letarte, J., Grenier, J., Trudel, J., Asselin, A. (1989) Electrophoresis 10, 527.
128. Irvine, J. W., Roberts, S. F., Lindberg, I. (1990) Anal Biochem. 190, 141.
129. Trudel, J., Asselin, A. (1990) Anal. Biochem. 189, 249.
130. Abou-Haila, A., Fain-Maurel, M. A. (1990) Electrophoresis 11, 175.
131. Mizuno, Y., Ohba, Y., Fujita, H., Kanesaka, Y., Tamura, T., Shiokawa, H. (1989) Anal. Biochem. 183, 46.
132. Dimo-Simonin, N., Brandt-Casadevali, C., Gujer, H. R. (1989) Electrophoresis 10, 718.
 133. Pan, S. Q., Ye, X. S., Kuc, J. (1989) Anal. Biochem. 182, 136.
134. Takagaki, K., Kon, A., Kawasaki, H., Nakamura, T., Endo, M. (1989) J. Biochem. Biophys. Methods 19,
207.
135. Roth, R. L, Levin, J. (1989) J. Biochem. Biophys. Methods 19,129.
136. Leclerc, D., Asselin, A. (1959) Can. J. Microbial. 35, 749.
137. Cote, F., Letarte, J., Grenier, J., Trudel, J., Asselin, A. (1989) Electrophoresis 10, 527.
138. Li, C. Y., Lann, W., Yam, L. T. (1973) J. Histochem. Cytochem. 21, 1.
139. Akin, D. T., Shapiro, R., Kinkade, J. M., Jr. (1985) Anal. Biochem. 145, 170.
140. White, M., Ralston, G. (1976) Biochim. Biophys. Acta 436, 567.
141. Tuan, R. S., and Knowles, K. (1984) J. Biol. Chem. 259, '3754.
Bibliografie liaze, tabel 4

142. Nimmo, H. G., Nimmo, G. A. (1982) Anal. Biochem. 121, 17.

143. Landon, M. (1977) Anal. Biochem. 77, 293.
144. Cavalli-Sforza, L. L., Santachiara, S. A., Wang, L., Erdelyi, E., Barchas, J. (1974) J. Neurochem. 23, 629.
145. Scrutton, M. C., Fatebene, F. (1975) Anal. Biochem. 69, 247.
146. Lewinaki, N. D., Dekker, E. E. (1978) Anal. Biochem. 87, 66.
147. Christen, P., Gasser, A. (1980) Anal. Biochem. 109, 270.
148. Reeves, H. C., Volk, M. J. (1972) Anal. Biochem. 48, 437.
149. Volk, M. J., Trelease, R. N., Reeves, H. (1974) Anal. Biochem. 58, 315.
150. Craig, I. (1973) Biochem. Genet. 9, 351.
151. Grove, T. H., Levy, H. R. (1975) Anal. Biochem. 65, 458.
152. Hopkinson, D. A., Coppock, J. S., Muehlemann, M. F., Edwards, Y. H. (1974) Ann. Hum. Genet. 38, 155
153. Drescher, D. G. (1978) Anal. Biochem. 90, 349.
154. Tolley, E., Craig, I. (1975) Biochem. Genet. 13, 867.
155. Edwards, Y. H., Hopkinson, D. A. (1978) Ann. Hum. Genet. 42, 303.
156. Slaughter, C. A., Hopkinson, D. A., Harris, H. (1975) Ann. Kum. Genet. 39, 139.
157. Sharma, H. K., Rothstein, M. (1979) Anal. Biochem. 98, 226.
158. Gannon, F., Jones, K. M. (1977) Anal. Biochem. 79, 594.
159. Hatfield, G. W., Umbarger, H. E. (1970) J. Biol. Chem. 245, 1736.
160. Nelson, R. L., Povey, S., Hopkins, D. A., Harris, H. (1977) Biochem. Genet. 15, 1023.
161. Parr, L. W., Bagster, I. A., Welch, S. G. (1977) Biochem. Genet. 15, 109.
162. Charlesworth, D. (1972) Ann. Hum.Genet. 35, 477.
163. Kompf,.J., Bissbort, S., Gussman, S., Ritier, H. (1975) Hum¢rgenetik 27, 141.
164. Zehender, H., Trescher, D., Ullrich, J. (1983) Anal. Biochem. 136, 16.
 5. TRANSFERUL PROTEINELOR DIN GELURI PE ALTE MEDII
SUPORT
Evidențierea capacității de a transfera (de a efectua un blot), de pe o matrice de gel de
poliacrilamidă pe o membrană activă din punct de vedere chimic, a biomoleculelor separate prin
electroforeză, (în cazul în care acestea se leagă de suprafața membranei), a oferit un instrument
proeminent în chimia proteinelor. Proteinele pot fi transferate pe membrane printr-o varietate de
metode, de la cele ce implică procesele de capilaritate și difuziune până la diverse tehnici de
transfer electroforetic. Datorită vitezei și preciziei, transferul electroforetic este pe departe cel
mai des utilizat. Astfel, transferul proteinelor din geluri pe alte medii suport reprezintă procesul
prin care fragmentele de proteine dar și de acizi nucleici ori alte macromolecule separate
electroforetic într-un mediu stabilizant (gel de amidon, poliacrilamidă, agaroză, gel mixt
agaroză-poliacrilamida) sunt eluate şi apoi adsorbite pe un alt mediu suport stabilizant
(nitroceluloză, hârtie modificată chimic, nylon, etc.) în condiţiile în care fracţionarea iniţială,
realizată electroforetic, este păstrată. Procesul (denumit protein blotting) este considerat în
prezent o extindere a electroforezei în geluri de poliacrilamidă şi este utilizat la scară largă la
indentificarea şi caracterizarea enzimelor, proteinelor de membrană şi serice, hormonilor şi
receptorilor, proteinelor nucleare, a antigenilor ori oncogenelor, etc. Odată biomoleculele
imobilizate pe suprafaţa membranei activate, aceasta poate fi utilizată într-o varietate de
proceduri analitice, care altfel ar fi dificil sau imposibil de realizat direct, în gel. Aceste
proceduri includ hibridizarea cu sonde de ADN sau ARN marcat, detectarea cu anticorpi
(probabil, procedura cea mai frecvent utilizată), detectarea prin proceduri specifice de colorare,
analize autoradiografice, ș.a.m.d. (Walker, 2002). Tehnica a fost descrisă în 1979 de către
Renard şi colaboratorii, aproape simultan cu Towbin şi colegii. Iniţial, Renart şi colaboratorii au
adaptat tehnica de transfer a acizilor nucleici la transferul proteinelor, în timp ce echipa de
cercetători a lui Towbin a descris, pentru prima dată, electrotransferul (transferul electroforetic)
al proteinelor din geluri de poliacrilamidă, pe membraane de nitroceluloză, tehnică evident
superioară transferului prin capilaritate. Anterior, Southern (1975) a descris fenomenul de
transfer a fragmentelor de ADN din geluri de agaroză pe membrane de nitroceluloză, tehnică
cunoscută apoi sub denumirea de southern blotting. De altfel, în 1977 s-a descris o altă metodă,
de electrotransfer eficient al fragmentelor de ADN prin înlocuirea membranelor de nitroceluloză
cu hârtie diazobenziloximetilată. Procedeul a permis transferul mai eficient al ARN şi a
fragmentelor mai mici de ADN, proces denumit de mulţi autori northern blotting. De remarcat că
iniţial prin ambele tehnici transferul fragmentelor de macromolecule s-a realizat prin capilaritate.
În contextul adaptării denumirii a transferului de fragmente de acizi nucleici după numele
primului descoperitor, s-a adoptat nomenclatura geografică de western blotting.
Tehnica de Western blotting, de asemenea, cunoscută sub denumirea de immunoblotting sau
protein blotting reprezintă azi o tehnică de bază în proteomică, în biologia celulă și moleculară.
Prin definiție, metoda este folosită pentru a detecta prezenţa unei proteine specifice dintr-un
amestec complex, extras dintr-o celulă. Pentru a fi realizată, procedura Western blotting se
bazează pe trei elemente cheie (Moore, 2009):
 separarea amestecurilor de proteine pe baza dimensiunilor utilizând gel-electroforeza;
 transferul eficient al proteinelor separate pe un suport solid;
 detectarea specifică a unei proteine ţintă cu anticorpi corespunzători.
Odată detectată, proteina țintă va fi vizualizată ca o bandă pe membrana de blott-are, pe un
film fotografic (în cazul radiației X), sau cu ajutorul unui sistem imagistic, cu toate că
procedurile detailate sunt foarte variate. În general, variațiile de metode implică detecția directă
vis a vis de cea indirectă. În cazul metodei directe, anticorpul primar care este utilizat la detecția
antigenului este marcat a cu o enzimă sau un colorant fluorescent. Această metodă de detectare
nu este utilizată pe scară largă, majoritatea cercetatorilor preferând metoda de detecție indirectă,
pentru o varietate de motive. În metoda de detecție indirectă, un anticorp primar se adaugă la
început pentru a se lega la antigen iar în etapa următoare se adaugă un anticorp secundar
direcționat împotriva primului anticorp care este conjugat cu diverse sonde precum biotina, sau
fluorescente, de tipul fluoresceinei sau rodaminei, a unor enzime (peroxidază din hrean sau
fosfatază alcalină). Metoda indirectă oferă multe avantaje faţă de metoda directă (Pierce Protein
Reserch Products, 2012). Tabelul YYY. prezintă o comparație între metodele de detecție directe
și indirecte.
Tabelul YYY. O comparație între avantajele și dezavantajele metodelor de detecție directe și indirecte. (După
Pierce Protein Reserch Products, 2012).
Reprezentarea schematică a
Avantaje Dezavantaje
metodei
 marcarea poate reduce
 mai rapidă, deoarece este
imunoreactivitatea anticorpului
utilizat doar un singur anticorp;
primar;
 nu apar procese de
 anticorpii primari marcați
reactivitate încrucișată cu anticorpul
sunt mai scumpi;
secundar;
 o flexibilitate scăzută în
 este posibilă marcarea
alegerea anticorpului primar marcat;
dublă, prin marcare diferită a
 un semnal de amplificare
anticorpilor primari;
mic;
 anticorpul secundar poate
amplifica semnalul;
 sunt disponibili o
varietate de anticorpi secundari
marcați;
 anticorpii secundari pot
 un anticorp secundar
produce colorații nespecifice;
poate fi utilizat cu mai mulți
 sunt necesare măsuri
anticorpi primary;
suplimentare comparativ cu metoda
 marcarea nu afectează
directă;
imunoreactivitatea anticorpilor
primary;
 schimbarea anticorpului
secundar permite schimbarea
metodei de detective;
Cum tehnica Western blotting se realizează rapid, folosind un echipament simplu şi reactivi
ieftini, ea este una dintre tehnicile de laborator dintre cele mai comune. Rezultatele obţinute sunt,
de asemenea, uşor de interpretat, unice şi lipsite de ambiguitate.

Figura BuBuB... O prezentare generală a procedurii de Western Blotting. Separarea proteinelor din amestecuri
prin electroforeză, transferul de pe gel pe o membrană de blott-are şi detecția proteinei ţintă, care devine vizibilă doar
în faza finală, după cum se observă o bandă de pe linia 3. Linia 1: standarde de masă moleculară precolorate. Liniile 2
și 3: amestecuri de proteine (După Moore, 2009).
Prin urmare, metoda este una de rutină ca atare și împreună cu alte teste biologice, fiind
utilizată în cercetare şi în clinică. S-a constatat că evidenţierea directă este de cel puţin cinci ori
mai sensibilă, datorită multiplicării situsurilor de legare ale celui de al doilea ligand sau anticorp
de primul ligand ori anticorp. O imagine generală a procedurii este prezentată în figura BuBuB.
 Figura CuCu prezintă o diagramă a unor utilizări a proteinelor transferate pe membrană.

Figura CuCu. O diagramă care prezintă o

serie de aplicații ale proteinelor imobilizate (După
Hafiz, 2005).

Garfin (1995) identifică şase etape

interdependente într-un experiment obișnuit de immunoblotting. Acestea sunt:
1. Proteinele sunt, în primul rând fracţionate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă.
2. Proteinele sunt transferate de pegel pe o membrană unde acestea sunt imobilizate ca o
replică a modelului benzilor proteice de pe gel.
3. În continuare, situsurile de legare a proteinelor de pe membrană rămase neocupate sunt
saturate pentru a preveni reacții de legare nespecifice ale anticorpilor.
4. Blott-ul este apoi cercetat pentru proteinele de interes, cu anticorpi primari specifici.
5. Se tratează blott-ul cu anticorpi secundari, specifici pentru tipul de anticorpi primari,
conjugați cu grupări reporter detectabile, precum enzimele sau izotopii radioactivi.
6. În final, benzile de proteină țintă se marchează vizibil de către grupările reporter legate,
care, în cazul enzimelor transformă substratul corespunzător în produsele insolubile, colorate.
Așadar avantajele tehnicii de transfer a proteinelor sunt date de simplitatea, sensibilitatea şi
specificitatea cestei metode. Proteinele imobilizate pe membrane nu difuzează, dodecil sulfatul
de sodiu poate fi îndepărtat, făcând astfel posibilă detectarea proteinelor renaturate cu liganzii lor
specifici, fiziologici precum anticorpii monoclonali. Liganzii pot fi eluaţi de pe antigenul
imobilizat putând-se astfel testa noi liganzi, pe aceeaşi membrană.
Etapele majore ale unui protocol de Western blotting sunt prezentate în schema ogică din
figura AAA..... și figura BBB.....

Figura AAA….. Schema logică a unei metode de transfer a

proteinelor de pe gel pe membrană urmată de etapa de detecție
(După Stoyanov și colab., 2001).
 După terminarea etapei de separare electroforetică (în general, dar nu exclusiv, o separare
prin SDS-PAGE, fie mono-, fie bidiminsională), gelul trebuie să fie incubat pentru scurt timp în
tamponul de transfer adecvat pentru îndepărtarea de SDS şi a altor componente din gel, care ar
putea cauza probleme în timpul transferului. Această etapă minimalizează procesul de
contractare sau de umflare a gelului din timpul transferului şi permite o potenţială renaturare a
unor proteine. După transferul realizat printr-o procedură adecvată, profilul proteinelor separate
electroforetic și transferate pot fi vizualizate folosind un colorant total specific evidențierii
proteinelor.
5.1. MEMBRANE UTILIZATE ÎN TRANSFERUL PROTEINELOR
Alternativ la metodele bazate pe geluri, proteinele pot fi detectate pe membrane activate, cu
capacitate de imobilizare, după ce au fost transferate după separarea electroforetică. În cele mai
multe cazuri, transferul se realizează prin intermediul forței electroforetice, deoarecee difuzia sau
forțele capilare nu sunt suficient de eficiente pentru a mobiliza proteinele din interiorul gelului
de poliacrilamidă (Towbin și colab., 1979). Pentru realizarea transferului de proteine din matrici
poliacrilamide au fost descrise o pleiadă de tipuri de membrane sintetice care leagă suficient de
intim proteinele şi acizii nucleici pentru ca să poată fi folosite drept suporturi pentru imunoteste
în fază solidă, în timp ce biomoleculele legate de membrană sunt uşor accesibile anticorpilor sau
sondelor moleculare, în cazul acizilor nucleici. Acest fenomen a condus la dezvoltarea unei
varietăți de proceduri specifice şi extrem de sensibile (Bers şi Garfin, 1985; Gershoni, 1987). O
serie de membrane utilizate în transferul de proteine precum acetatul de celuloză, celuloza
diazobenziloximetilată, nylon-ul, DEAE-celuloza, celuloza activată cu BrCN, etc., sunt
prezentate în Tabelul xxx. alături de caracteristicile fizico-chimice în relație cu tipul de legare a
proteinelor.
Tabelul xxx. Membrane utilizate în transferul de proteine.
Tip de membrană Încărcare electrică Tipul de legătură stabilit cu proteinele
Nitroceluloză Negativă Electrostatică/Interacție hidrofobă
Acetat de celuloză Negativă Electrostatică
Celuloză
Pozitivă Electrostatică şi covalentă
diazobenziloximetilată
Nylon Pozitivă Electrostatică
DEAE-celuloză Pozitivă Ionică
Celuloză activată cu BrCN Covalentă
Difluorură de poliviniliden Interacție hidrofobă
În general, tipurile de membrane disponibile au pori de diverse mărimi, proprietăți mecanice
și proprietăți de legare diferite. Performanțele metodelor de electrotransfer pot fi limitate din
cauza a două probleme tehnice: o serie de proteine nu se transferă eficient, în particular a celor
cu masă moleculară mare (>80,000 Da) și faptul că o serie de proteine nu se leagă eficient și
migrează prin membrană, acesta fiind cazul proteinelor cu masă moleculară mică. În mod curent,
se utilizează un tampon Tris-glicină care conține până la 20% metanol (pentru creșterea
capacității de legare a proteinei de membrana de transfer) și până la 0,1% SDS (pentru
îmbunătățirea transferului, în particular a proteinelor mai mari) În ambele sisteme descrise,
electrozii sunt paraleli planului gelului.
Nitroceluloza este cea mai cunoscută membrană de transfer, fiind una dintre membranele cele
mai frecvent utilizate în acest moment. Membranele din acest
material prezintă o sensibilitate bună, o rezoluție bună și un
background scăzut, dar prezintă o rezistență mecanică scăzută,
motiv pentru care necesită o precauție crescută în manipulare.
Depunerea nitrocelulozei pe un suport poliesteric conduce la creșterea proprietăților mecanice.
Interacţiunea polipeptidelor denaturate cu nitroceluloza este mediată probabil în cea mai mare
parte prin interacţiuni hidrofobe, deşi mecanismele complete nu este încă pe deplin înţelese
(Stoyanov și colab., 2001). Legarea este instantanee, aproape ireversibil, şi cantitativ pe o gamă
largă de concentraţii de proteine (până la aproximativ 80-100 µg/cm2). Cu toate acestea,
nitroceluloza are o afinitate mică pentru anumite proteine, în special cele cu mase moleculare
mici (Kakita și colab., 1982). Având în vedere această problemă, unii autori au sugerat fixarea
covalentă a proteinelor pe membrana de nitroceluloză prin conjugare cu glutaraldehidă (Kay și
colab., 1983) sau prin reacție cu N-hidroxisuccinimidil-p-azidobenzoat (Kakita și colab., 1982).
Alte matrici care au fost dezvoltate includ hârtia din celuloză diazobenziloximetilată (MC),
hârtie de celuloză modificată (Awine și colab., 1979) şi hârtia diazofeniltioeterică (Reiser și
Wardale, 1981). Proteinele încărcate negativ interactionează electrostatic cu grupările diazoniu
pozitive inserate pe aceste matrici, urmată de o legare covalentă
ireversibilă prin intermediul unor derivați azoici (Awine și colab.,
1979). S-a dovedit că hârtia diazofeniltioeterică este mult mai stabilă
decât hârtia diazobenziloximetilată fiind la fel de eficientă. În plus, față
de proteinele separate, hârtia diazo arată o rezoluție mai mică
comparativ cu membranele de nitroceluloză sau nylon (Burnette, 1981). Mai mult, glicina
prezentă în gel, poate interfera cu proteinele de pe membrana din hârtie diazo (Kakita și colab.,
1982).
Membranele din nylon în forme variate modificate și nemodificate, de asemenea, utilizate în
transferul proteinelor. Unele au o capacitate foarte mare de legare a proteinelor (Gershoni și
Palade, 1982) şi necesită o blocare exhaustivă pentru a se elimina legările nespecifice.
Comparativ cu membranele de nitroceluloză, cele de nylon furnizează în mod constant un
randament mai mare de transfer a proteinelor de pe gelurile cu SDS (Gershoni și Palade, 1982;
Gershoni și Palade, 1983).
Colorarea proteinelor pe membranele de nylon cu coloranți anionici comuni (Coomassie
Blue, Amido Black, etc.) nu este posibilă din cauza sarcinii pozitive a matricei. Cu toate acestea,
membranele de nylon se utilizează când:
(a) este necesară o capacitate de legare a proteinelor crescută (capacitatea de legare de a
membranei din nylon este de 80μg/cm2, fiiind de aproape opt ori mai mare decât cea a
membranei de NC;
(b) proteina se leagă slab la membrana de NC (în special cele cu greutate moleculară mare);
(c) este necesară o rezistenţă mecanică mai mare (Hafiz, 2005).
Cu toate acestea, un dezavantaj al matricelor de nylon este că ele leagă nespecific coloranţi
anionici comuni precum Coomassie Blue și Amido Black, ceea ce conduce la apariția unui
background suficient de puternic care poate masca detecția proteinelor transferate. Membranele
de nylon pot fi utilizate la electrotransferul proteinelor deși, deseori, manifestă un background
inacceptasbil crescut datorită marii sale capacități de legare a proteinelor. Karey și Sirbasku
(1989) recomandă fixarea membranei cu glutardialdehidă după transfer pentru a crește
capacitatea de legare a peptidelor cu masă moleculară mică la membranele de nylon.
Membranele din difluorură de poliviniliden (PVDF) oferă avantajele unei capacități mari de
legare a proteinelor, rezistență mecanică crescută, rezistență fizică și stabilitate chimică mare,
fiind deseori alegerea optimă în cazul imunotransferului. Acestea pot fi de
asemenea utilizate la blotting-ul proteinelor (Pluskal și colab., 1986); ele
sunt de natură hidrofobă iar proteinele legate de acestea pot fi detectate de
majoritatea coloranţilor anionici, precum şi prin protocoale de
imunodetecție (Stoyanov și colab., 2001). Membranele din PVDF leagă cu
eficiență crescută prin interacții hidrofobe proteinele (~ 170-200 µg/cm2)
fiind stabile în procesele chimice care implică determinări ale secvențelor
proteice. Astfel, benzile individuale tăiate din membranele PVDF cu proteine transferate pot fi
introduse direct în secvențiatoarele cu fază solidă (Matsudaira, 1990). Mai mult, o serie de
membrane PVDF particulare, sunt utilizate pentru o creștere în domeniul optim al semnalului.
Este cazul membranelor Hybond care conferă un semnal generat mai puternic decât cele obținute
cu membrane de nitroceluloză sau PVDF (Garfin, 1995). În plus membranele Immobilon cu
retenție scăzută sunt de preferat dacă se dorește extracția ulterioară a proteinelor din membrană
(Harper și Speicher, 2001).
Alegerea unei membrane presupune realizarea următorilor pași:
 Înainte de a începe blotting-ul, trebuie să se selecteze o membrană corespunzătoare.
Cele mai frecvent utilizate membrane sunt cele din nitroceluloză (ca atare sau modificate chimic)
sau cele din PVDF, cu dimensiuni diferite ale porilor, sunt disponibile de la producători diferiţi;
 Trebuie avut în vedere că membranele de nitroceluloză pură deși sunt mai fragile, oferă
de multe ori un raport optim semnal/zgomot mai bun.
 Membranele din PVDF pot îmbătrâni. Atunci când se observă o întunecare inegală a
membranei în timpul etapei de incubaţie în metanol, membrana se îndepărtează;
 Membranele de 0,2µm prezintă o retenţie mai bună a proteinelor decât cele de 0,45µm.
Cu toate acestea, membranele 0,2 µm sunt de multe ori mult mai suscceptibile la sensibile la
background şi au astfel nevoie de etape de spălare mai frecvente şi mai stricte. Pentru proteinele
cu greutate moleculară mică, sunt în general recomandate membranele de PVDF cu pori de 0,2
µm care au o capacitate mai mare de legare a proteinelor și care previn pierderea lor;
 Uneori în cazul membranelor de nitroceluloză pot apărea o serie de probleme. Astfel, se
pot observa zone cu bule unde nici o proteină nu s-a transferat sau o serie de linii în formă
ciudată. Cauza pare a fi reprezentată de neîmbibarea uniformă a membranei, zonele neprocesate
corect neavând capacitatea de legare a proteinelor.
 Membranele activate cu grupări schimbătoare de ioni precum dietilaminoetil- (DEAE)
sau carboximetil-celuloză (CM) sunt utilizate în scopuri preparative, datorită reversibilității
legăturilor ionice.
 Membranele din fibră de sticlă activate sunt utilizate atunci cand proteinele blott-ate
sunt secvențiate direct. Există mai multe metode pentru a activa suprafata unei astfel de
membrane: tratamentul cu bromocian, derivatizarea cu grupări silan încărcate pozitiv (Aebersold
și colab., 1986) sau încărcarea hidrofobă prin siliconare (Eckerskorn și colab., 1988.).
 Din păcate nu există încă o membrană de transfer care să lege moleculele într-o
proporție de 100%. De exemplu, în timpul unui proces de electroblotting, proteinele mici, de
multe ori migrează prin membrană în timp ce proteinele mai mari nu au părăsit încă complet
gelul de poliacrilamidă. Prin urmare, este necesar să se încerce a se obține procese de transfer cât
mai regulate posibil (Westermeier, 2005).
5.2. STRATEGIA GENERALĂ A TRANSFERULUI BIOMOLECULELOR
După electroforeză, proteinele urmează să fie transferate de pe gelul electroforetic pe o
membrană. Procesul de transfer a proteinelor pe membrane poate fi descris de următoarele etape:
 Eluarea proteinelor de pe primul mediu suport (gelul de poliacrilamidă) în care, în
general, nu au fost fixate (cu toate ca a fost descrisă o metodă de transfer a proteinelor fixate şi
colorate) În acest scop, există o varietate de metode, printre care se amintesc transferul prin
difuziune, transferul prin capilaritate, transferul convectiv accelerat de căldură, transferul la vid
şi electroeluția;
 Adsorbţia pe al doilea suport; în funcţie de proprietăţile fizico-chimice ale suportului
este necesară o adsorbţie suficient de bună a proteinelor, altfel spălările şi tratamentele ulterioare
putându-le îndepărta de pe membrană.
 Evidenţierea proteinelor transferate;
Figura de mai jos prezintă principalele etape ale unui proces de transfer.
 Figura BBB. Cele mai importante etape din
timpul transferului de pe gel pe membrană.

Eluarea proteinelor se realizează fie prin difuziune simplă, bidimensională, cu două

membrane, fie prin capilaritate (datorată presiunii capilare, a fluxului de masă al solventului sau
convecţie), la presiune normală sau la vid, fie prin efect electroforetic, într-un câmp electric
omogen, sau într-un câmp electric în gradient. S-a constatat că randamentul de transfer maxim se
obţine prin electrotransfer în timp ce transferul prin difuziune simplă conduce la cele mai
modeste rezultate. Deasemenea s-a constatat că proteinele cu mase moleculare mari migrează
mai încet din gelul de poliacrilamidă decât cele cu masă moleculară mică. Acest dezavantaj se
atenuează prin modificarea compoziţiei chimice a sistemului tampon folosit la transfer, prin
folosirea unui câmp electric în gradient ori prin utilizarea unor geluri mixte agaroză-
poliacrilamidă.
5.1.1. TEHNICI DE TRANSFER A BIOMOLECULELOR DE PE GEL, PE MEMBRANĂ
Cea mai facilă tehnică de transfer este cel prin difuziune. În acest caz, membrana de transfer
se aplică pe suprafaţa gelului obțșinându-se, în final o replică a gelului inițial. Cum moleculele
difuzează în mod normal, în ambele direcțșii, gelul poate fi plasat între două membrane, ceea ce
generează două transferuri, cu o imagine în oglindă (figura HHH.). Difuziea poate fi accelerată
prin creşterea temperaturii, tehnica,fiind cunoscută sub numele de termoblotting. În general
tehnica de transfer prin difuziune este utilizată în principal după o separare electroforetică pe un
gel cu pori mari.

Figura HHH. Transferul de proteine

bidirecționat prin difuziune de pe un gel cu pori
mari, pe membrană.

Atunci când a fost inițial descris (Southern, 1975) transferul biomoleculelor de pe gel pe o
membrană activată a fost efectuat prin intermediul forţelor capilare, într-un mod similar set-up-
ului prezentat în figura CCC.
Gelul este acoperit cu o membrană (în acest caz de nitroceluloză) după care se adaugă un vraf
consistent de hârtie de filtru uscate. Ansamblul este apoi acoperit cu o placă rigidă (din sticlă sau
din material plastic), iar pe partea de sus se plasează o greutate (0,5-1kg). Astfel, stratul
consistent de hârtie de filtru uscat absoarbe lichid din stratul de gel (și odată cu acesta proteinele
separate în gel vor fi dizolvate), ceea ce permite proteinelor eluția lor și captarea de către
membrană. Deşi această metodă nu mai este des utilizată astăzi în cazul SDS-PAGE, ea este
deosebit de eficientă în cazul eluției proteinelor de pe un gel de agaroză cu un timp de transfer de
mai puţin 1 minut (Desvaux și colab., 1990). Transferul sub presiunea capilară poate fi, de
asemenea, eficient adoptat pentru geluri de poliacrilamidă subţiri utilizate la separări prin
focusare izoelectrică, când timpul de contact este de aproximativ 1 oră.
Deşi această metodă durează mai mult decât metodele de transfer în câmp electric (deseori se
întind peste noapte) iar transferul de proteine de pe gel nu este la fel de complet ca în cazul
electrotransferului (cu toate că, în multe scopuri se transferă suficiente proteine), metoda are
utilizările sale specifice. Ea este, desigur, ideală pentru cei care doar doresc să efectueze
experimente ocazionale transfer şi, prin urmare, nu doresc să achiziţioneze aparat special,
necesar în tehnica de electroblotting. În al doilea rând, această metodă este deosebit de util
pentru blotting-ul geluri după focusare izoelectrică, când proteinele care se transferă sunt la
punctul lor izoelectric (când proteinele au sarcina electrică egală cu zero) şi prin urmare, nu sunt
uşor de a fi transferate electroforetic.
Figura CCC. Configurarea unui sistem de transfer prin
capilaritate. Gelul de poliacrilamidă este reprezentat de zona
haşurată dintre cele două strip-uri de plastic Metoda
presupune plasarea pur şi simplu a gelului pe un suport din
hârtie de filtru imbibată in tampon. Tamponul circulă prin
gel prin capilaritate, datorită existenței în partea superiară a
unui material absorbant uscat (hârtie de filtru). Cum
tamponul trece prin gel, el va purta proteinele existente şi le
va depune pe mebrana de nitroceluloză, care este plasată
între partea de sus a gelului şi materialul absorbant uscat.
(După Stoyanov și colab., 2001).
O procedură alternativă este blotting-ul prin vidare (Olszewska și Jones, 1988) când, un
transfer eficient durează circa 30-40 minute, în loc de procedura de blotting prin capilaritate
tipică când transferul se petrece peste noapte. Este importantă existența unui sistem de control și
de menținere la un nivel scăzut de circa 20-40cm coloană de apă a vidului pentru a preveni
colapsul matricei de gel. În acest scop este necesară existența unei pompe de vid deoarece
sistemul de vidare realizat de apă prin intermediului trompei de vid este neregulat. Pe tot
parcursul întregii proceduri, suprafaţa gelului este accesibilă tuturor reactivilor. O diagramă a
unei camere de vid de transfer este reprezentată în figura JJJ.
Alte avantaje ale transferului prin vid față de transferul prin capilaritate sunt:
(a) procesul este cantitativ, nu există pierderi sau artefacte;
(b) conduce la zone mai clare şi la o rezoluţie mai bună;
(c) se reduce stresul mecanic al gelului;
(d) este mai rapid: el se realizează în circa 30 - 40 de minute, în loc de peste noapte;
(e) permite o mai rapidă depurinare, denaturare şi neutralizare;
(f) permite economisirea de soluţii, hârtie de filtru şi membrane.

Figura JJJ. Sistem de transfer al acizilor nucleici (30-40minute)

prin vacuum (După Westermeier, 2005).

Astăzi însă de departe, metoda preferată este cea de transfer electroforetic fie în sistem umed,
fie în sistem semi-uscat. În primul caz, pentru a se realiza procesul de electrotransfer se
realizează un sandwich între gelul de poliacrilamidă și membrană care se introduce într-un tanc
în care se află un tampon și un sistem de electrozi de platină la nivelul pereților vasului („tank
blotting”) ori, în cel de al doilea sistem, „semi-dry blotting”, sandwich-ul de transfer este plasat
între doi electrozi plasați orizontal. În acest caz electrozii sunt confecționați din grafit sau din
platină insertată în ochiurile unei rețele din oțel (Figura DDD). În asemenea condiții, membrana
și gelul sunt saturate cu tampon de transfer după care se așează împreună orizontal, pe hârtie de
filtru saturată corespunzător în tampon, după care se formează sandwich-ul care se introduce în
sistemul planar de electrozi perforați. Electrozii sunt puțin îndepărtați ceea ce conduce la un
câmp electric uniform și crescut și ca urmare un transfer rapid la un voltaj relativ scăzut. În
condițiile în care este necesar un timp crescut de transfer, este preferat tancul de transfer datorită
marii lui capacități de tamponare și a capacității crescute de control a temperaturii.
În principiu, electroblotting-ul produce o replică fidelă a gelului pe o membrană, menţinând
rezoluţia completă a gelului. După cum s-a mai spus, în prezent există două tipuri principale de
tehnologii: (1) sistemul umed, alcătuit din tancuri cu tampon și cu electrozi plasați în mod
corespunzător şi (2) aşa-numitul sistem „semiuscat”, realizat dintr-un aranjament plan cu
electrozi. Aparate de transfer sunt disponibile pentru a se adapta la toate dimensiunile de geluri.
Tancurile de transfer sunt realizate din material plastic cu electrozi montați în sau în apropierea
pereților, în timp ce un sistem de casete neconductive mențin membranele în contact intim cu
gelurile. Acest ansamblu este plasat în rezervoare în timp ce câmpurile electrice care se
manifestă sunt transversale şi se manifestă prin intermediul casetei și tamponului conductiv,
aferent. Datorită volumelor mari de tampon din rezervoare, căldura generată în timpul
transferului este disipată. În sistemul de blotting semi-uscat, gelul și membrana de transfer sunt
imobilizate intim pe orizontală, ca un sandwich cuprins între două pachete consistente de hârtie
de filtru îmbibate în tampon, în contact direct cu cele două plăci solide care conțin electrozii.
Termenul „semiuscat” se referă la cantitatea limitată de tampon, care se regăsește numai în
pachetele de hârtie de filtru, îmbibate. Figura DDD prezintă schematic sistemele utilizate la
transferul electroforetic al proteinelor pe membrane.
Dintre cele două sisteme de blotting, cel umed este recomandat în activitatea de rutină. În
această procedură, temperata poate fi reglată în timpul transferului, procesul fiind oarecum mai
eficient decât în sistemul semiuscat. Din cauza capacităţii reduse de tamponare în condiţiile
blotting-ului semidry, unele proteine mici sunt transferate și depășesc membranele, în timp ce,
prin limitarea timpului de migrare, unele proteine mari sunt slab transferate. Cu toate acestea,
deoarece transferurile semidry necesită o cantitate de tampon considerabil mai mică iar sistemul
este mai uşor de configurat decât în cazul metodei umede, ele sunt adesea favorite de către
laboratoarele care efectuează un număr mare de blot-uri.

Figura DDD. Sisteme de transfer electroforetic. Caracteristic,

aceste sisteme sunt utilizate la transferul electroforetic al proteinelor
din geluri de poliacrilamidă. (A) Tanc de transfer vertical. (B)
Sistem de transfer semiuscat (semidry) După Amersham Pharmacia
Biotech.
 Tamponul utilizat de obicei pentru a transfera proteinele din geluri de poliacrilamidă mono-
sau bi-dimensionale după electroforeză în condiții denaturante pe membrane de nitroceluloză, de
exemplu, este tamponul clasic de electrozi, însă fără SDS, dar care conţine, în schmb, metanol.
În cele mai multe experimente tamponul Tris/glicină, 25mM/192 mM, pH=8,3, care conține
metanol, 20% (v/v) conduce la transferuri de bună calitate. În sistemul „semiuscat”, transferul de
proteine după SDS-PAGE poate fi realizat într-un tampon Tris/glicină, 48 mM/39mM, pH=9,0,
care conține 20% metanol. Metanolul, în tampoanele de transfer, elimină SDS din complexele
proteice şi creşte afinitatea dintre proteine şi membrana de nitroceluloză.

Figura EEE. O imagine schematizată a ansamblării într-un sistem

de electrotransfer semiuscat (semidry).

Cu toate acestea, metanolul determină o reducere generală în dimensiunea porilor de gel, și

limitează transferul unor proteine. El poate provoca, de asemenea, precipitarea anumitor proteine
şi un transfer ineficient. Totuși, o echilibrare delungă durată a gelului în tampon ar trebui să fie
evitată; cele mai bune rezultate se obțin printr-o simplă spălare a gelului în tamponul de transfer.
Metanolul nu este necesar în tampon de transfer atunci când proteinele sunt electroblott-ate din
geluri care nu conţin SDS (Garfin, 1995). În plus, trebuie avut în vedere și existența unui contact
complet a gelului cu membrana, a timpului de transfer, prezenţa de detergenţi şi alcool în
tampon.
5.1.2. APARATURA UTILIZATĂ ÎN TRANSFERUL PROTEINELOR
Un exemplu caracteristic de aparat utilizat în electroblotting este prezentat în figura FFF...: se
constată că membrana de captare este de obicei, poziționată pe partea anodică a gelului de
poliacrilamidă, deoarece după SDS-PAGE complexul proteină-SDS posedă o sarcină net
negativă. Iniţial, s-au folosit tancurile verticale cu electrozi din sârmăde platină, fixate pe cele
două părţi. Pentru această tehnică, membrana de gel şi membrana de transfer sunt prinse în niște
reţele fiind mărginite de hârtii de filtru şi plăcuţe din burete, fiind suspendate într-un tanc umplut
cu tampon.
 Figura FFF. Unitatea de electrotransfer umed. Gelul de poliacrilamidă care conține proteinele care se doresc a fi
transferate este plasat pe o parte netedă a unei folii de polietilenă (ori pe un strat de hârtie de filtru) și este acoperit cu
o membrană de transfer iar în continuare se adaugă o bucată de hârtie de filtru. Acest “sandwich” este apoi transferat,
alături de doi bureți într-o casetă-suport. Caseta astfel asamblată este în continuare plasată într-un tanc care conține
tampon de transfer. Pentru a fi transferate, gelul care conține proteinele încărcate negativ se va poziționa pe partea
anodică. În continuare, proteinele ăncărcate electric sunt transferate electroforetic din gel pe membrană. (După Harper
și Speicher, 2001).
De obicei, aceste tip de transferuri se realizează peste noapte. În ultimii ani, sistemele de
transfer semi-uscate care se execută între două plăci de grafit orizontale au câștigat o mai mare
acceptare.
EnCor Biotechnology Inc. (2012) propune un protocol de migrare electroforetică timp de 30
de minute- 1 oră la o intensitate a curentului de ~100mA. O modalitate mai sigură de transfer
este de a utiliza o sursă de alimentare mai puternică, de 200-500mA care se setează la o
tensiunsiune constantă de 5, până la 10 Volti. Proteinele cu greutate moleculară mică (mai mică
de 20kDa) se vor transfera în circa 30 de minute, la 5 volţi, în timp ce proteinele cu o greutate
moleculară mare (150kDa sau mai mult), necesită un timp de transfer de 60 de minute, la o
tensiune de 10 volţi.
Zhu (2002) propune următoarele condiții de transfer, în condițiile utilizării unei unități de
termostatare, la rece:
Timp de Peste 1
transfer noapte oră

Tensiune 10
aplicată 30V 0V

35
Intensitate 90mA 0mA

Alți cercetători realizează transferul umed al proteinelor de pe gelul de poliacrilamdă pe

membrasană prin electromigrare la o tensiune de 25V, peste noapte. Trebuie avut însă în vedere
existența unui sistem de răcire, de preferat la 4oC. În caz contrar, datorită efectului Joule,
tamponul din tanc se încălzește, iar bulele de aer eliberate din soluţie se vor atașa sandwich-ului
gel-membrană de transfer. În scopul îndepărtării acetor bule se poate așeza tancul de
electrotransfer pe un agitator magnetic și se poate introduce o bară magnetică. Este absolut
esenţial ca părţile sistemului de electrotransfer să fie perfect etanșe pentru a se evita scurgeri
accidentale de curent ceea ce va impieta asupra calității procesului de transfer. De multe ori se
întâmplă ca problemele tehnice care apar în timpul nopții să conducă la întreruperea fluxului de
curent și compromiterea experimentului.
Harper și Speicher (2001) arată că pentru sistemele semidry, la care electrozii sunt de tip
placă se utilizează o intensitate de curent constant de 200-250mA în timp ce timpul de transfer
variază între .1 oră pentru gelurile cu o grosime de 0,5mm, 2 ore pentru gelurile de 0,75-1mm
grosime și 3 ore pentru cele de 1,5mm. O creștere a timpului de transfer nu pare să mărească
randamentul procesului, mai mult, mărirea perioadei poate conduce la supraîncălzirea gelului.
Procesele de electrotransfer se realizează la o tensiune constantă, dar, intensitatea acestuia poate
însă să crească în timpul migrării electroforetice, motiv pentru care trebuie să se trateze cu
prudenţă fenomenele adiacente precum supraincalzirea sistemului și obținerea unor rezultate
inacceptabile.
De obicei la procesele de electrotransfer se utilizează un redresor de 1-5 A, alături de o cuvă
(cu electrozi ficși sau mobili). În cazul transferului prin difuziune se pot realiza maximum două
copii, în timp ce în cazul în cazul electrotransferului se pot realiza maximum zece copii ori se
pot supune concomitent transferului până la 10 geluri de poliacrilamidă în grosime fiecare de 1
mm, unităţile de transfer fiind fiecare izolate.
 5.1.3. FACTORII CARE INFLUENȚEAZĂ TRANSFERUL ELECTROFORETIC PE
MEMBRANĂ
Datorită vitezei şi eficienţei de transfer a proteinelor, cea mai frecvent folosită metodă este
electroeluția sau transferul electroforetic. Această metodă foloseşte mobilitatea electroforetică a
proteinelor pentru a le transfera de pe gel, pe membrană. Transferul electroforetic al proteinelor
presupune plasarea unui gel de poliacrilamidă, după ce s-au separat electroforetic proteinele, în
contact direct cu o membrană de nitroceluloză sau de altă natură, adecvată legării proteinelor,
realizarea unui “sandwich” mărginit de două hârtii de filtru și plasarea acestuia între doi electrozi
scufundați într-o soluţie conducătoare de curent. În momentul aplicării unui câmp electric,
proteinele vor migra din gelul de poliacrilamidă pe suprafaţa membranei, unde acestea vor fi
captate, ceea ce conduce la obținerea unei copii a gelului inițial ca rezultat final. Astfel,
proteinele migrează spre membrană în urma existenței unui curent (I), generat prin aplicarea unei
tensiuni (V) între cei doi electrozi, conform legii lui Ohm:
V=IxR
unde R este rezistenţa generată de materiale plasate între electrozi (tamponul de transfer,
gelul, membrana, şi hârtiile de filtru).
Intensitatea câmpului electric (V/cm), care este generat între electrozi este forţa motrice a
procesului de transfer electroforetic. Eficiența unui proces de transfer poate varia foarte mult
fiind funcție de proprietățile proteinelor precum dimensiune, formă și sarcină electrică, de
abilitatea lor de a migra din gel spre membrană și de capacitatea lor de a se lega de membrană,
sub un anumit set de condiţii. Alți factori care joacă un rol important în viteza de eluție sunt pH-
ul, vâscozitatea, tăria ionică a tamponului de transfer. Atât concentrația (%T) a gelului poate
influenţa de asemenea eluţia unei proteine țintă din gel cât și tensiunea aplicată ori distanţa dintre
electrozi joacă un rol important în impunerea unei rate de eluare a proteinelor din gel. Există
limite practice cu privire la intensitatea câmpului electric, având în vedere eliberarea de căldură
din timpul transferului.
Căldura generată în timpul unui transfer (efectul Joule) este proporţională cu puterea
consumată de elementele electrice (P), care este egală cu produsul dintre intensitatea curentului
(I) şi de tensiunea aplicată (V).
P = I x V = I2 x R
Astfel, căldura Joule creşte temperatura şi scade rezistenţa tamponului de transfer; așadar
modificările rezistenţei poate conduce la o intensitate a câmpului de transfer neconstantă şi în
continuare scăderea până la pierdere a capacității de tamponare. În plus, caldura excesiva poate
provoca deteriorarea gelului și o încorporare a lui în membrană. Capacitatea camerei de a disipa
caldura reprezintă limitarea majoră a oricărei metode de transfer electroforetic.
Tabelul XXX. Factori care pot afecta rezultatele unui procedeu de Western Blotting (După Pierce Biotechnology,
2009).
Factori Caracteristicile variabilelor experimentale
Antigenul țintă conformație, stabilitate, epitop disponibil
Gelul de poliacrilamidă producător, concentrație (procent) poliacrilamidă, vârstă, lot
Membrana producător, vârstă, lot
Anticorpul primar specificitate, titru, afinitate, timp și temperatură de incubare
Conjugatul anticorp secundar-peroxidază din nivelul de activare al enzimei și activitatea sa, animalul sursă,
hrean concentrație
Tamponul de blocare tip, concentrație, reactivitate încrucișată
Spălările tampon, volum, durată, frecvență
Substratul sensibilitate, producător, lot, vârstă
Metoda de detecție vârsta filmului (dacă este cazul), producătorul instrumentului de
preluare a imaginii, timpul de expunere
În general, un transfer optim de proteine este obţinut cu tampoane cu tărie ionică mică şi la o
intensitate mică a curentului. Tabelul XXX.. prezintă o serie de factori care pot afecta rezultatele
unui procedeu de Western Blotting.
 5.1.4. BLOCAREA SITE-URILOR NESPECIFICE
Membranele suport utilizate în procedura “Western blotting“ au o afinitate mare pentru
proteine. Prin urmare, după transferul acestora din gel, este important a se bloca suprafaţele
active rămase ale membranelor pentru a se preveni legări nespecifice și prin urmare artefacte de
detecție cu anticorpi în timpul etapei ulterioare. Soluția de blocare trebuie să îmbunătăţească
sensibilitatea analizei prin reducerea interferenţelor de fond (background), îmbunătăţind raportul
semnal-zgomot. Pentru a se bloca site-urile libere de pe membrana de transfer au fost folosite o
varietate soluții de blocare, începând cu cazeina din lapte sau serul sanguin normal, până la
proteine înalt purificate. Nu există un agent unic de blocare ideal, pentru orice tip de experiment,
deoarece fiecare pereche de anticorp/antigen are caracteristici unice și din acest motiv pentru o
optimizare eficientă este esenţială o testare empirică a soluțiilor de blocare.
Se consideră că, în scopul prevenirii adsorbţiei nespecifice, se utilizează o serie de agenţi de
inactivare/blocare precum albumină serică bovină (în concentraţie de 3-5%), imunoglobuline
(0,2%), hemoglobină (1-5%), gelatină (3%), etanolamină (10%), Tween-20 (0,05%) sau
polivinilpirolidonă (2%).
5.1.5. COMPOZIȚIA TAMPOANELOR DE INCUBARE
Ca şi în alte proceduri imunologice, tehnica Western blotting constă într-o serie perioade de
incubare în prezența a unor reactivi imunochimici diferiți, într-o etape bine-stabilite. Etapele de
spălare sunt necesare pentru a elimina reactivii nelegați și de a reduce background-ul, crescând
astfel raportul semnal/zgomot. O spălare insuficientă va conduce la apariția unui background
crescut, în timp ce o spălare excesivă poate duce la o scădere a sensibilității cauzată de eluţia
anticorpilor şi/sau a antigenului de pe blot. Astfel, în realizarea unui experiment de Western
blotting, pot fi folosite o varietate de tampoane. În unele cazuri, compoziția soluțiilor de spălare
este formată din tampoane fiziologice precum tamponul Tris salin (Tris buffered saline, TBS)
sau tampon salin fosfat (phosphate buffered saline, PBS), fără aditivi. Totuși, mult mai frecvent,
se adaugă în tampon un detergent, precum Tween-20, 0,05%, pentru a facilita eliminarea
materialelor legate nespecific. În funcţie de specificul analizei, cantitatea de Tween-20 din
soluția tampon de spălare poate varia, între concentrația obișnuită de 0,05% până la 0,5%. O altă
tehnică obişnuită este de a adăuga o diluţie de 1:10 soluţie de blocare la tamponul de spălare,
care, alături de detergent conduce la minimizarea background-ului analizei prin prevenirea
eluţiei proteinelor blocate pe membrană şi/sau să permită apariția unor interacţiuni nespecifice
cu proteinele.
Este important de reţinut că detergenţii (NP-40, CHAPS sau Tween-20), ca și soluţiile de
proteine, pot promova o creşterea microbiană, permițând în continuare dezvoltarea unor fungi și
care pot conduce la obținerea unui zgomot de fond crescut. În plus, detergenţii pot conţine
cantităţi semnificative de peroxizi, care vor provoca un semnal de background atunci când se
face apel la peroxidază și se utilizează substraturi pentru ea. Prin urmare, este important să se
folosească detergenţi de mare puritate.
5.1.6. SISTEME DE DETECȚIE A BIOMOLECULELOR ȚINTĂ DUPĂ TRANSFERUL
LOR PE MEMBRANĂ
Metoda de analiză după transfer pe membrană “Western blotting” este de obicei efectuată
utilizând sonde de anticorp primar direcționate asupra biomoleculelor legate de membrană, care,
la rândul lor, recunosc o proteină specifică sau un epitop al unui grup de proteine (de exemplu,
domeniul SH2 sau tirozina fosforilată). Alegerea unui anticorp primar pentru un Western blot va
depinde de antigenul care urmează să fie detectat şi de tipurile de anticorpi disponibili față de
acel antigen. De asemenea, este important să se amintească că nu toți anticorpii primari sunt
potriviți pentru Western blotting, caracteristicile lor trebuind să fie verificate, dacă este posibil,
înainte de a cumpăra un nou anticorp primar.
 În general, anticorpul primar care recunoaşte proteina ţintă într-un test Western blot nu este
direct detectabil. Prin urmare, sunt folosiți ca mijloc de detecție anticorpi secundari marcați sau
alți reactivi de detecţie care, în cele din urmă, detectează antigenul ţintă (printr-o evidențiere
indirectă). Pentru detecția pe Western blot pot fi utilizate o mare varietate de reactivi de marcare
și detecție secundară a caror alegere depinde fie de specia de animale, din care a fost izolat
anticorpul primar (specia gazdă) sau orice marcare a unui anticorp (de exemplu, biotina sau
DIG). De exemplu, dacă anticorpul primar este un anticorp monoclonal nemodificat din șoarece,
apoi anticorpul secundar trebuie să fie o IgG anticorp secundar anti-mouse obţinut de la o gazdă
diferită de organismul primului anticorp, în speță, șoarece.
Anticorpii folosiți în Western blotting sunt de obicei utilizați ca soluţii diluate provenite
dintr-o soluţie stoc de 1mg/ml, a căror diluție variază între 1/100-1/500.000. Diluția optimă a
unui anticorp dat trebuie să fie determinată experimental, într-un anumit sistem de detecție.
Sistemele cele mai sensibile de detectare necesită cantități mai mici de anticorpi decât sistemele
cu sensibilitate mai mică, ceea ce conduce la economii substanţiale în ceea ce privește costurile
de achiziție a anticorpilor şi în plus, creșterea numărului de analize cu aceeași cantitate inițială
de anticorpi. Utilizarea unor cantităţi mai mici de anticorpi poate avea, de asemenea, avantajul
obținerii unui background redus, deoarece o reacția cu o cantitate limitată de anticorpi are la
bază o specificitate crescută și o mai mare afinitate pentru antigenul ţintă. De obicei, diluţiile de
anticorpi sunt realizate în tamponul de spălare. Prezenţa de detergent (Tween 20, 0,05%, de
exemplu) şi o cantitate mică de agent de blocare (ca de exemplu o proteină heterologă balast,
precum lapte degresat, într-o concentrație de 1%) în tamponul care conține anticorpul diluat
conduce, de multe ori, la minimalizarea adsorbției anticorpului-sondă de membrană și la
reducerea background-ului, ceea ce conduce la creșterea raportului semnal:zgomot. În schimb,
prin adăugarea unei cantități prea mare e agent de blocare sau detergent la soluția de diluare a
anticorpului, poate iloradăugând agent de prea mult detergent sau blocarea la soluţia de diluare
de anticorpi poate împiedica legarea eficientă a anticorpilor la antigen, ceea ce conduce la un
semnal redusă, alături de un background redus.
Studiile clinice sau de cercetare din domeniul proteomicii se bazează foarte mult pe metode
de vizualizare „in situ” pentru detecția proteinelor separate prin electroforeză pe gel de
poliacrilamidă ori prin analiza lor după transfer pe membrană (Beisiegel, 1986; Towbin și colab.,
1979; Gershoni și Palade, 1983; Bers și Garfin, 1985).
După transferul proteinelor și blocarea site-uri libere (neocupate) cu un amestec de substanţe
macromoleculare, care nu participă în reacţia de vizualizare are loc legarea specifică cu sonde de
imunoglobuline sau anticorpi monoclonali. Datele de literatură arată că este posibil să se
identifice până la patru antigene diferite prin reacție antigen-anticorp (Westermeier și Marouga,
2005). Pentru vizualizare și amplificare a semnalului de pe membrană, este folosit de obicei un
al doilea anticorp secundar care este conjugat, fie cu aur, fie cu peroxidază din hrean, fosfatază
alcalină sau un complex avidină-biotină-enzimă. Enzimele conjugate sunt detectate printr-o
reacție de culoare ce implică o colorație zimografică cu o sensibilitate ridicată, însă, cea mai
mare sensibilitate, fără a utiliza material radioactiv, se obţine prin metode de detecție prin
intensificarea chemiluminiscenței (Laing, 1986). Semnalul este detectat prin expunerea
membranei la un film sensibil la radiații X sau plasând membrana într-un sistem de documentare
video pentru o anumită perioadă de timp, care este, în principiu, o cameră CCD (CCD reprezintă
un microcip din siliciu, cu o lățime de 5-10 mm, care are delimitat pe el niște mici zone
geometrice-pătrate sau dreptungiuri-numiți pixeli-în speță niște elemente de imagine, cu o
mărime de 7-24 microni. Astfel, un cip CCD este o matrice de pixeli, avand de la 200x300 pixeli
până la 2028x2048 de pixeli și mai mult. Acest circuit integrat din siliciu, sensibil la lumină,
stochează şi afişează datele pentru o imagine, astfel încât fiecare pixel, în imagine, este convertit
într-o sarcină electică, intensitatea fiind în relație cu o culoare din spectrul luminii) într-o cameră
obscură). O dezvoltare a metodei de chemiluminiscenţă a condus la creșterea limitei de detecție
sub o cantitate de 0,1 femtograme de antigen.
Pentru a se studia o serie de interacţiuni proteină-proteină, membranele de transfer pot fi de
asemenea, cercetate cu proteine fără proprietăți de anticorpi (Burgess și colab., 2000). Proteinele
țintă sunt apoi detectate cu un anticorp marcat. Această variantă este denumită „Far-Western
blotting” sau detecți prin suprapunerea proteinelor (Westermeier și Marouga, 2005).
Transferul pe membrane de PVDF ori din fibră de sticlă modificată au fost utilizate pe scară
largă pentru identificarea proteinelor în urma analizelor compoziţiei în aminoacizi, de
secvențiere a aminoacizilor din partea N-terminală, de amprentare a peptidelor și de secvențiere
prin spectrometrie de masă. Noile tehnologii de spectrometrie de masă oferă posibilităţi extinse
prin care pasul de transfer poate fi omis, proteinele putând fi digerate în interiorul stratului de gel
iar peptidele eluate sunt transmise în continuare pentru analiza prin spectrometrie de masă.
Din aceste considerente se poate spune că alegerea metodei adecvate de detecție a proteinei
transferate este foarte importantă, deoarece abordarea proteomică nu numai că are ca scop
identificarea ei ci și determinarea schimbărilor cantitative ale nivelului de expresie a ei în
probele biologice. În acest context, există un număr foarte diferit de tehnici, urmărindu-se ca
limita de detecţie să fie cât mai scăzut posibilă, cu un raport optim semnal/zgomot. Pentru
cuantificarea adecvată a proteinelor din probele obișnuite utilizate în proteomică, metoda de
detectare trebuie să aibă un domeniu dinamic larg şi o relaţie liniară între cantitatea de proteină
şi intensitatea culorii. Procedura trebuie să fie efectuată uşoar şi rapid, nu fie toxică, să fie
mediu-prietenoasă, să fie compatibilă cu spectrometria de masă şi să aibă un preț rezonabil. În
prezent, nici o tehnică de detecție a proteinelor nu îndeplineşte toate aceste cerinţe. Prin urmare,
este necesar a se selecta metoda optimă, în funcţie de proprietățile biologice, tipul de probă şide
alte cerinţe metodologice.
Există mai multe posibilități de detecție a proteinelor transferate de pe membrane după
transfer. Colorația generală a proteinelor blotate este în mare parte aplicată pentru localizarea și
confirmarea poziției spotului precum și pentru confirmarea poziției și identității în conexiune
dintre proteina transferată și cea de pe gel, precum și în cazul analizelor ulterioare. În mod curent
nu se utilizează o metodă alternativă de colorare și de identificare pe gel deoarece aceste
proceduri sunt prea costisitoare atât din punct de vedere financar cât și din punct de vedere al
timpului de lucru. Procedurile cele mai utilizate cuprind protocoale generale de colorare, precum
şi metode specifice de detectație. Din prima categorie, au fost descrise metode simple de
colorare, precum colorarea cu Amido black sau cu CBB, sau metode de colorare deosebit de
sensibilă precum cea cu Indian Ink (Hancock și Tsang, 1983) ori metode de colorare reversibile,
de tipul Ponceau S (Salinovich și Montelaro, 1986) sau Fast Green FCF (Stoyanov și colab.,
2001).
5.1.6.1. Colorații totale a proteinelor pe membrana de transfer
Vizualizarea proteinelor transferate pe membrană are o aplicație importantă în localizarea
benzilor în compararea proteinelor totale, înainte de etapele ulterioare de imunocolorare (Towbin
și colab., 1979; Gershoni și Palade, 1983). În consecință este necesară o colorație sensibilă,
convenabilă și cantitativă pentru colorarea totală a proteinelor pe membrane (Blake și colab.,
1984, Moeremans și colab., 1985). Dintre membranele de transfer disponibile, cele de
nitroceluloză (NC), PVDV și nylon, cele din NC par a fi materialul de ales datorită prețului
relativ scăzut și a necesităților reduse în ceea ce privește simpla blocare pentru legările
nespecifice (Bollag și Edelstein, 1991). Vizualizarea benzilor (spoturilor) de proteine sau
colorarea acestora reprezintă o tehnică simplă prin care benzile (spoturile) devin vizibile pe
membrană. Colorarea poate fi utilizată pentru:
 Verificarea faptului că proteinele au fost transferate pe membrană;
 Evaluarea eficienței generale a procesului de transfer;
 Evaluarea eficienței de transfer pentru sisteme noi de tamponare sau probe noi proteice
 Cel mai important factor în alegerea tipului de colorare a proteinelor pe membrană o
reprezintă modul în care acestea vor fi, mai departe, analizate. De exemplu, dacă, după colorarea
proteinelor urmează o analiză de imunodetecție, nu se recomandă utilizarea unei colorații
ireversibile. În paralel, este necesară și o colorare a gelurilor ori de câte ori se produc modificări
în protocolul de transfer ori se lucrează un nou tip de probă. Această abordare poate verifica
faptul că proteinele au fost, într-adevăr eluate din gel.
În acest moment sunt disponibile o serie întreagă de colorații care pot fi împărțite în două
categorii generale:
 Colorații ireversibile. Acestea manifestă în general o sensibilitate înaltă dar pot să
interfere în analizele ulterioare sau pot să aibă repercusiuni asupra analizelor ulterioare a
proteinelor.
 Colorații reversibile. Deşi sunt mai puţin sensibile, acestea permit evaluarea blot-ului
după care colorantul se poate îndepărta prin spălare de pe membrană. Cu toate acestea, în unele
cazuri există riscul ca anumite proteine să poată suferi modificări chimice în timpul procesului
de colorare sau pot fi îndepărtate prin spălare de pe membrană.
Uneori se utilizează Amido Black (Gershoni și Palade, 1983; Soutar și Wade, 1989) (figura
UUU), Coomassie Brilliant Blue, Fast Green FCF, Ponceau S (Aebersold și colab., 1987;
Salinovich și Montelaro, 1986) ori India Ink (Hancock și Tsang, 1983; Hughes și colab., 1988),
pentru colorarea membranelor blotate. Cea mai sensibilă dintre tehnici sunt cele cu aur coloidal
(Moeremans și colab., 1985) și colorația cu Deep Purple™ cu o limită de detecție sub 3 ng/spot.
Coloranții fluorescenți Sypro® Rose Plus și Sypro® Ruby prezintă sensibilități de aproximativ
12 ng/spot. Limitele de detecție date mai sus sunt măsurate din punct de vedere al cantității de
proteină încărcate pe gel și nu de cantitatea de proteină transferată pe membrană.
5.1.6.1.1. Colorația cu Coomassie Brilliant Blue
Proteinele imobilizate pot fi vizualizate în câteva minute prin colorare cu Coomassie CBB
(Mitra și colab., 1994). Cum această colorare este ireversibilă, membrane care conțin proteinele
transferate și care fac obiectul imunodetecției trebuie să nu conțină urme de colorant. Cu toate
acestea, o importantă aplicație a CBB o reprezintă colorarea unei porțiuni din membrană pentru a
identifica proteinele transferate care urmează a fi imunodetectate. În acest caz se utilizează o
soluție de colorare alcătuită din CBB 0,1% (w/v) dizolvat într-un amestec de metanol, 40%, acid
acetic, 10% și o soluție de decolorare formată din aceeași componenți. Trebuie avut în vedere că
această colorație este ireversibilă și produce benzi negre pe un fond luminos. În plus, această
colorare interferă în procesul de imunodetecție. Trebuie notat că în timpul procesului de
electrotransfer a proteinelor de pe gel pe membrană, o serie de proteine pot fi pierdute, fie
datorită transferului incomplet, fie datorită proprietăților de legare necantitativă a membranei.
După colorarea cu CBB, proteinele imobilizate pot fi vizualizate în câteva minute. Această
procedură este ireversibilă astfel, membranele de transfer care fac obiectul unei imunodetecții
ulterioare nu se colorează cu Coomassie. Alți cercetători utilizează un protocol de colorare cu
CBB-R (un timp de colorare de 1 oră și un timp de decolorare de 1-3 ore) (Millipore, 1997).
Christiansen şi Houen (1992) au analizat în detaliu cele mai frecvent utilizate proceduri de
colorare a membranelor din PVDF precum colorația cu CBB, cea cu mercurocrom, colorația cu
argint, cea cu aur coloidal şi cea cu izotiocianat de dimetilaminoazobenzen. Dintre acestea,
colorarea proteinelor cu CBB a fost cea mai versatilă, fiind complet compatibilă cu procedurile
biochimice ulterioare, inclusiv cu degradarea Edman a aminoacizilor de la capătul N-terminal ori
tehnicile de imunocolorare. Colorațiile cu aur și cea cu argint sunt cele mai sensibile, în timp ce
colorarea cu mercuro-crom permite detecția proteinelor care conțin grupări sulfhidril.
5.1.6.1.2. Colorația cu Amido Black
Prin această procedură de colorare cu Amido Black, se poate identifica o bandă de proteine
într-o gamă mai mică de submicrogram (Bers și Garfin, 1985).
 Figura UUU. Structura chimică a Amido
black 10B, un colorant diazolic utilizat în practica
biochimică la colorarea totală a proteinelor.

Procedura de lucru presupune utilizarea reactivului Amido Black 10B într-o soluție de
colorare și decolorare alcătuită din isopropanol:acid acetic, 25%:10%. Metodologia implică
colorarea membranelor de NC ori PVDF cu reactivul Amido Black 10B, 0,1%, timp de câteva
minute și decolorarea membranlor timp de 30 minute cu o soluție de decolorare, urmată de o
spălare cu apă înainte de uscare.
5.1.6.1.3. Colorația cu India Ink
Cu această colorație benzile proteice apar negre pe un background gri (Glenney, 1986).
Membranele colorate pot fi stocate cel puțin o lună fără vreo pierdere a sensibilității.
Procedura de lucru presupune utilizarea următoarelor soluții:
1. Tampon de spălare: Tween 20 0,3% în tampon fosfat de sodiu, 10mM/NaCl,
150mM pH=7,2 (PBS-T)
2. Soluție India ink: india ink, soluție 1% în tampon de spălare
3. Soluție KOH: 1%
4. Tampon fosfat de sodiu, 10mM/NaCl, 150mM pH=7,2 (PBS)
Metodologia implică:
a. Incubarea membranelor blot-ate timp de 5 min în soluția de KOH, la
temperatura camerei (20°C).
b. Spălarea membranelor de două ori cu PBS (10 min fiecare spălare)
c. Spălarea blot-ului cu tampon de spălare la 37°C (de patru ori, 5 minute
fiecare).
d. Clătire cu apă
e. Colorare cu soluție de India ink cu agitare timp de la 15 min la peste noapte, la
temperatura camerei.
f. Decolorare prin multiple spălări cu PBS
Tabelul BBB prezintă proprietățile și compatibilitățile membranelor de transfer a proteinelor
la câteva tipuri de colorații printre care și la colorația cu India Ink (Sasse și Gallagher, 2003).
5.1.6.1.4. Colorația cu Ponceau S
Colorarea proteinelor imobilizate pe membrana de transfer cu colorantul Ponceau S (figura
SSS) este o procedură reversibilă, deoarece colorantul poate fi îndepărtat complet prin spălare cu
apă (Salinovich și Montelaro, 1986). Această colorație nu este foarte sensibilă. Cu toate acestea,
ea este adesea folosită pentru a monitoriza transferul de proteine înainte de imunodetecție sau
alte aplicaţii. Colorația este de asemenea utilizată pentru a identifica benzile înaiinte de
microsecvențiere.
Procedura de lucru:
1. La sfârşitul perioadei de transfer membrana de inmoaie într-o soluţie de Ponceau S
(Ponceau S, 0,1g/1ml acid acetic/100 ml apă distilată) timp de 5 minute, cu agitare uşoară.
2. Decolorarea se realizează prin spălare cu apă distilată timp de 2 minute, după care blot-ul
poate fi fotografiat.
3. Pentru imunodetecție sau pentru alte aplicaţii, se decolorează membrana complet în apă
timp de 10 min, având grijă ca înainte de a decolorare să se marcheze benzile standardelor de
greutate moleculară.
 Figura. SSS. Structura chimică a colorantului Ponceau S (Acid Red
112, C.I. 27195) o sare disodică a unui compus diazolic utilizat în
practica biochimică la colorarea rapidă și reversibilă a benzilor proteice.

Dacă nu este necesară o sensibilitate înaltă, colorația

reversibilă cu Ponceau red (figura SSS) descrisă de Salinovich și Montelaro (1986) este
procedura standard, aceasta având o limită de detecție în domeniul a unui microgram/spot.
5.1.7.1.5. Colorarea proteinelor pe membranele de transfer cu CPT
Bickar şi Reid (1992) au descris o metodă de mare afinitate pentru colorarea nespecifică a
proteinelor pe membrane de NC, țesuturi sau geluri de agaroză ori poliacrilamidă folosind acid
cupru-ftalocianin-3,4',4'',4'''-tetrasulfonic sare de tetrasodiu (Copper phthalocyanine-3,4',4'',4'''-
tetrasulfonic acid tetrasodium salt, CPT, figura NNN). Colorarea cu CPT este rapidă (<1 min),
reversibilă cu modificarea pH-ului şi mai sensibilă decât oricare dintre metodele raportate
anterior de colorare pe bază de colorant organic (10ng cu CPT faţă de 20 ng cu Fast green sau 1
ng rin colorarea cu aur) (Reinhart și Malamud, 1982; Bickar și Reid, 1992; Li și colab., 1989).
 Figura NNN. Structura chimică a acidului
cupru-ftalocianin-3,4',4'',4'''-tetrasulfonic sare de
tetrasodiu (Copper phthalocyanine-3,4',4'',4'''-
tetrasulfonic acid tetrasodium salt, CPT) utilizat la
colorarea reversibilă și totală a proteinelor
transferate pe membrană.

5.1.6.1.6. Colorarea cu arginta proteinelor pe membrane de transfer

Dintre metodele clasice nici una nu este mai sensibilă decât colorarea cu argint (Moeremans
și colab., 1985). Colorațiile cu metale (cu aur coloidal sau cu argint) a membranelor oferă o
senesibilitate înaltă dar au o serie de dezavantaje: timpi lungi de colorare, o serie de dificultăți în
preparare, utilizarea unor metale scumpe sau imposibilitatea îndepărtării colorației (Moeremans
și colab., 1985; Wirth și Romano, 1995). Colorarea cu iodură de cupru este de asemenea
sensibilă dar sunt necesare etape de pregătire a reactivilor complicate. În plus, această metodă
necesită condiții alcaline puternice (pH=13,8), ceea ce are conduce la alterarea membranei dacă
incubările sunt mai lungi de 5 minute (Root și Reisler, 1989). Cercetările au continuat cu
introducerea unor noi coloranți cu proprietăți de colorare reversibilă a membranelor de transfer
precum chelații de metal:
 complexe ferozină/feroase și ferocianură/ferice (Patton și colab., 1994);
 complexe roșu de pirogalol-molibdat (Shojaee și colab., 1996);
 complexe luminescente de europiu cu disulfonat de batofenantrolină (Lim și colab.,
1997);
 colorații duble cu chelați de metal (Lim și colab., 1996).
Metodele de colorare cu argint sunt cunoscute de mult timp și furnizează o detecșie sensibilă
a proteinelor sau a acizilor nucleici după electroforeză pe geluri de agaroză sau poliacrilamidă.
Tehnologiile de colorare cu argint au fost extinse și la alte medii precum bloturi, plăci de
cromatografie pe strat subțire sau de microtitrare. Cuantificarea proteinelor adsorbite pe plăcile
de microtitrare conduce la informații cantitative ale analizelor de imunosorbent legat de enzimă
(enzyme linked immunosorbent assay) ori a analizelor de interacție a proteinelor. Una dintre
acestea este procedura neradioactivă, a colorației cu iodură de cupru, adături de metoda cinetică
cu argint pentru măsurarea cantității de proteină adsorbită pe microplacă, cu aceeași sensibilitate
(5-150 ng/godeu) dar cu o precizie mai mare (<5%). Procedura, sensibilă la alți contaminanți,
utilizează BSA drept proteină standard de calibrare este mai sensibilă în detecția proteinelor pe
celuloză, după cum acest suport cromatografic este utilizat în tehnicile TLC (Root și colab.,
2002).
Reactivul de colorare cinetică cu argine este alcătuit prin amestecarea a doi reactivi:
 reactivul (A) soluție apoasă de AgNO3, 0,2% (w/v), NH4NO3, 0,2% (w/v), acid
molibdosilicic 1% (w/v), formaldehidă, 0,3% (preparată din soluție stoc de 37% în apă distilată);
 reactivul (B) soluție de Na2CO3, 5% (w/v) în apă distilată
 5.1.6.1.7. Colorarea cu iodură de cupru și sensibilizare cu argint a proteinelor pe membrane
Colorația cu iodură și sensibilizare argentică este desemnată pentru cuantificarea proteinelor
adsorbite pe suprafețe solide precum nitrocelulaoza, nylon, polivinilidendifluorură, silice,
celuloză și polistiren (Jenzano și colab., 1986; Lowry și colab., 1951; Smith și colab., 1985;
Root și Reisler, 1989; Root și Reisler, 1990) și are aplicații importante în Western blotting și
cromatografie pe strat subțire (Root și Reisler, 1990; Talent și colab., 1998). Legarea ionilor
cuprici la scheletul proteinelor în condiții alcaline și reducerea la starea cuproasă reprezintă baza
chimică a mai multor protocoale de analiză incluzând aici metodele biuret, Lowry și bicinconinic
(Jenzano și colab., 1986; Lowry și colab., 1951; Smith și colab., 1985; Sapan și colab., 1999).
În cazul colorației cu iodură de cupru, proteina se leagă de iodură în condiții alcaline. Această
analiză alcalină demonstrează sensibilitate, viteză, reversibilitate, preț scăzut și lipsa unor
substanțe de interferență cunoscute, inclusiv cu acizii nucleici (Root și Reisler, 1989; Root și
Reisler, 1990). Colorația cu iodură de cupru este suficient de sensibilă pentru a permite
cuantificarea proteinelor adsorbite de plăcile de microtitrare (Root și Reisler, 1990). Informația
este în particular de utilitate pentru interpretarea cantitativă a ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay) și experimentele de legare a proteinelor (Root și Wang, 2002). Precizia
determinării proteinei adsorbite pe plăcile de microtitrare prin colorare cu iodură de cupru este în
mod obișnuit de 10-15%. Marea sensibilitate a colorației cu iodură de cupru (de aproximativ 40
pg/µl) poate fi crescută de câteva ori printr-o procedură de sensibilizare cu ioni de arginnt care
conduce la o scădere a limitei spre 10 pg/µl, care astfel este mai sensibilă decât oricare metodă
de analiză în soluție (Sapan și colab., 1999). Sensibilitatea analizei poate fi crescută prin aplicații
repetate a proteinei pe membrană pentru a se concentra. Concentrațiile de proteine pot fi estimate
prin colorare cu iodură de cupru din soluții foarte diluate sau când sunt disponibile numai
cantități mici de proteină țintă ca în cazul analizei cromatografice a fracțiilor (Root și Wang,
2002).
 Reactivul de colorare se prepară prin amestecul a 12 g de CuSO4 • 5H2O, 20 g de KI și
36g de tartrat dublu de sodiu și potasiu cu 60 ml de apă distilată într-un vas de sticlă. Soluția
tulbure se agită viguros și se adaugă încet 10g de NaOH. Soluția se încălzește și își schimbă
culoarea din maro-vernil spre albastru închis. După ce NaOH este complet dizolvat soluția se
răcește la temperatura camerei fără agitare pentru a se lăsa precipitatul maro-roșcat să se depună.
În continuare se aspiră 70 ml din soluție, lăsându-se circa 50 ml de reactiv cu precipitat.
Reactivul este stabil și poate fi stocat într-o sticlă închisă pentru cel puți o lună sau, la 4oC, cel
puțin un an.
 Se prepară soluția de colorare de iodură de cupru amestecarea soluției îndepărtate cu
0,19g de EDTA-Na4 • H2O, 0,28g de NaH2PO4 și 2,14g de Na2HPO4 în 100 ml de apă
deionizată.
 Membranele de nitroceluloză, PVDF sau nylon
Tabelul AAA. O comparație între limitele de detecție a BSA pe baza unor colorații totale pe cele mai utilizate
membrane* (după Root și Wang, 2002).
Colorație NC PVDF N S celul
ylon ilica oză
SECS 0,01 0,071 1 5 0,2
Iodură de cupru 0,04 0,014 30 4 300
0 0
Colorație cinetică cu 40 nu 30 7 0,01
argint 0 0
Coomassie** 9 150 nu 4 300
0
Chelat metal:Europiu*** 150 20 7 150
00 0
Observații:
*
Soluția de albumină serică bovină s-a diluat serial și a fost spotată într-un volum de 1 µl după care spotul s-a uscat, s-a
colorat și s-a evaluat vizual.
 *
S-a realizat după protocolul descris de Lim și colab. (1997)
*
*
S-a realizat după protocolul descris de Christian și Houen (1992). Cololația cu chetal de metal:Eu s-a vizualizat pe un
**
transluminator UV, cu o lungime de undă de excitație de 30 2nm. În momentul în care spoturile s-au excizat și s-a cuantificat
fluorescența complexului limita de detecție pe membrana de NC a fost de 3ng/1µl.
Pentru colorare, se agită reactivul de iodură de cupru viguros la temperatura camerei înainte
de utilizare. Reactivul trebuie să fie ușor tulbure. Se toarnă soluția de reactiv peste membrana de
transfer uscată pentru cel puțin 2 minute (dar nu mai mult de 5 minute) până la apariția unor
benzi brun-roșcate pe blot. În continuare, se cufundă de trei ori, blând, membrana în apă distilată
după care se lasă să se usuce. Blot-ul este apoi cuantificat prin densitometrie și fotografiat,
colorația fiind stabilă circa un an. Dacă este necesară o creștere în sensibilitate blot-ul poate
introdus, direct în procedura de sensibilizare cu argint, iar dacă în continuare se dorește o
imunocolorare pe același blot, membrana se decolorează timp de 15 min. prin agiare blână într-o
soluție de colorare de iodură de cupru, înainte de imunocolorare.
Sensibilizarea cu argint se realizează prin imersarea membranei colorate cu iodură de cupru
timp de 5 min. într-o soluție proaspăt preparată de reactiv de sensibilizare pe bază de argint până
când benzile devin negru-închis.
Reactivul de sensibilizare pe bază de argint se prepară chiar înainte de utilizare prin
dizolvarea a 0,1g de AgNO3, 0,1g de NH4NO3 și 7µl de soluție de β-mercaptoetanol (5%, v/v, în
apă) în 100 ml de apă distilată. După ce toate componentele de dizolvă și imediat înainte de
utilizare se adaugă2,5g de Na2CO3. Soluția de dizlocuire se prepară prin dizolvarea a 33,2g de KI
în 100 ml de apă distilată (concentrația finală de 2M). Tabelul AAA prezintă o comparație între
limitele de detecție a unor colorații pe cele mai utilizate membrane.
5.1.6.1.8. Detecția proteinelor pe membrane utilizând colorantul Direct Blue 71
Hong și colab. (2000) au dezvoltat o metodă de colorare sensibilă, convenabilă și economică
care utilizează colorantul Direct Blue 71 (DB71, C.I. 34140) care produce în apă o culoare
albastră cu un maximum de absorbție la 794 și posedă o mare luminozitate. Metoda se bazează
pe legarea selectivă, în condiții acide a moleculelor de colorant proteinel tansferate pe membrană
şi la apariția unor benzi colorate în violet. Structura colorantului este prezentată în figura RRR.

Figura RRR. Structura chimică a colorantului

Direct Blue 71 (DB71, C.I. 34140).

Relativa mare hidrofobicitate conferită de cele patru inele bifenil ale DB71 este considerată a
îmbunătăți sensibilitatea scăzută observată în cazul colorației cu Ponceau S (figura SSS). Pe baza
acestei rațiuni, DB71 pare a reprezenta un candidat satisfăcător pentru colorarea proteinelor pe
membrane (Hong și colab., 2002). Procedura este simplă şi rapidă, care implică doar etapele de
colorare şi spălare și care necesită doar 7 minute.
Tabelul CCC. Compararea procedurile de colorare a proteinelor blotate pe membrane de PVDF (după Hong și colab., 2002).
Colorant Condiții Limită aprox. de detecție (ng)
Colorare: MeOH:AcH, 50%:7% (10 min.)
Coomassie Brillant Blue, 0,05% Decolorare: MeOH:AcH, 10%:14% (peste 100
noapte la 65oC)
Colorare: MeOH:AcH, 50%:10% (15 min.)
Amido Black 10B, 0,1% 50
Decolorare: 10% AcH
Colorare: AcH, 5% (3 min.)
Ponceau S, 0,1% 100
Decolorare: apă
Colorare: HCl, 12 mM (aprox. 1min.)
CPTS, 0,05% 10
Decolorare: HCl, 12 mM
Colorare: EtOH:AcH, 40%:10% (5 min.)
0,008% DB71 5-10
Decolorare: EtOH:AcH, 40%:10%
 Sensibilitatea acestei metode este de 5-10 ng de proteină pe membrane de NC, și de 10-20 ng
pe proteină pe cele de PVDF, metoda fiind de zece ori mai sensibilă față de procedura de
colorare cu Ponceau S utilizată în mod obişnuit. Mai mult decât atât, colorarea este reversibilă
pentru imunocolorările ulterioare, fără ca imunoreactivitatea să fie însă afectată. Pentru a se
elimina colorant legat pe benzile de proteină, sunt necesare modificări ale pH-ului ori utilizarea
unui solvent hidrofob. Tabelul CCC prezintă o comparație între procedurile de colorare a
proteinelor blotate.
5.1.7.1.1. Metode fluorescente de colorare totală a proteinelor transferate pe membrană
Colorarea totală a proteinelor pe membrane de transfer cu realizată înainte de aplicarea unei
tehnici de detecție specifică a unei proteine asigură o anticipare a eficienţei transferului de
proteine şi face posibilă detecția unor proteine contaminante în probă precum şi pentru a
compara proba cu o serie de standarde de greutate moleculară.
Pentru colorații ale geluri 2-D, procedura conduce la localizarea simplă a proteinei din spotul
de interes. Coloranții fluorescenți strălucitori, roși-portocalii pot fi vizualizați prin iluminare UV
sau prin scanare cu laser. Procedura de colorare este simplă pentru a se efectua şi a se finaliza în
timp de o oră. În acest context, reactivul SYPRO Ruby oferă o metodă rapidă, simplă, deosebit
de sensibilă în detecția proteinele pe membrane de NC sau PVDF. SYPRO Ruby are o limita de
sensibilitate de 2 până la 8 ng/bandă, ceea ce îl face de aproximativ 60 de ori mai sensibil decat
colorațiile reversibile de tipul Ponceau S şi de 20-30 de ori mai sensibilă decât colorația cu
Amido Black sau CBB. Colorarea proteinelor pe membrană cu SYPRO Ruby nu va evidenția
acizii nucleici şi este compatibilă cu imunodetecția şi cu tehnicile colorimetrice, fluorogenice, şi
chemiluminiscente de detecţie, precum şi cu procedurile de degradare Edman predecesoare
spectrometriei de masă.
Colorarea proteinelor totale înainte de aplicarea unor tehnici specifice de proteine de detecție
are rolul de a obține o evaluare a eficienţei transferului de proteine și de a face posibilă detecția
unor presupuse proteine contaminante din probă ori pentru a compara proteina din probă cu
proteinele-standarde de masă moleculară.
5.1.7.1.1.1. Colorarea proteinelor cu MDPF
Alba și Daban (2002) au descris o metodă de detecție a profilului proteinelor totale pe
membrane de PVDF utilizând un colorant fluorogenic, 2-metoxi-2,3-difenil-3(2H)-furanonă
(MDPF) (Alba și Daban, 1998). Această metodă se bazează pe proprietățile fluorescente ale
acestui colorant (Weigele și colab., 1973). După cum se observă în figura OOO, MDPF (A) și
produsul său de hidroliză (C) sunt nefluorescente în schimb, aductul B, format cu proteinele este
fluorescent.

Figura OOO. Reprezentarea

schematică a reacției MDPF (A) cu
grupările amino- primare ale proteinelor
cu formarea a unui aduct fluorescent (B);
excesul de reactiv este hidrolizat cu
formare de produs nefluorescent (C).
(După Alba și Daban, 2002).
 Aceasta face inutilă decolorarea membranei de PVDF după marcarea proteinelor. Întregul
proces de colorare cu MDPF este complet în circa 20 min. membranele umede sunt translucente,
permițând vizualizarea benzilor de proteine marcate cu MDPF prin tranluminare cu o lumină UV
(figura PPP). Benzile electroforetice care conțin mai puțin de 10 ng de proteină transferată pe
membrană pot fi detectate după reacția acestora cu MDPF. Metoda de colorare este compatibilă
cu vizualizarea anterioară a benzilor proteice pe geluri de poliacrilamidă după electroforeză în
prezență de SDS cu colorantul fluorescent necovalent Nile red. Astfel, colorațiile cu Nile red și
MDPF pot fi realizate Secvențial.

Figura PPP. Un exemplu de colorare a diferitelor proteine

cu MDPF pe membrane de PVDF. Blot-urile au fost echilibrate
de două ori (câte 5 min., fiecare) în tampon borat și colorate
pentru 10 min. cu MDPF. Proteinele evidențiate sunt (de sus în
jos) BSA, ovalbumina, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza,
β-lactoglobulina și α-lactalbumina; cantitatea din fiecare
proteină încărcată inițial pe gelul de poliacrilamidă în prezență
de SDS înainte de electrotransfer a fost 100 (linia din stânga)
respectiv 50 (linia din dreapta) ng. (B) După colorare cu
MDPF, ovalbumina a fost imunodetectată (După Alba și
Daban, 2002).

Procedura permite o monitorizare a profilului proteinei totale atât pe gelul de poliacrilamidă

cât și pe membrana de transfer. În plus, colorarea cu MDPF permite imunodetecția în cotinuare a
benzilor proteice cu evidențierea benzilor specifice cu anticorpi policlonali (figura PPP-B). În
final, utilizând condiții adecvate colorația cu MDPF nu influențează negativ analizele de
secvență proteică în benzile selectate (Alba și Daban, 2002).
5.1.7.1.1.2. Colorarea proteinelor cu Deep Purple Total Protein Stain
Deep Purple Total Protein Stain este una dintre colorațiile cele mai sensibile, utilizate în
prezent pentru detectarea şi cuantificare proteinelor în studiile de electroforeză mono- și
bidimensionale. Ca și colorant de gel, Deep Purple Total Protein Stain se caracterizează prin
luminozitate, nivelurile scăzute ale background-ului şi ale artefactelor precum şi o linearitate
cantitativă pe un domeniu de patru ordine de mărime (Bell și Karuso, 2003; Mackintosh și
colab., 2003).
Colorația cu Deep Purple™, se bazează pe reacția unui compus, epicocconona, iosintetizat de
ciuperca Epicoccum nigrum. Epicocconona este o azafilonă (figura ȘȘȘ), cu o fluorescenţă slabă
în apă și care reacţionează cu aminele primare sau cu NH3 aproape instantaneu, pentru a produce
o serie de compuși roşu-fluorescenți, cu o emisie puternică în momentul legării lor la proteine
(λ=610nm).

Figura ȘȘȘ. Structura chimică a epicoccononei, compus

extras din ciuperca Epicoccum nigrum.

Se consideră că mecanismul de legare a epicoccononei implică interacţiunea dintre capătul

său hidrofob și SDS-ul legat la proteine, mecanism similar cu cel implicat în modul de acțiune al
coloranților SYPRO Orange şi SYPRO Tangerine.
 Figura TTT. Spectrele de excitație și emisie al epicoccononei
(colorantul total al proteinelor, Deep Purple™). Se observă cele
două peak-uri de excitație și peak-ul de emisie. (după Bio-Imaging
System).

Spectrul de fluorescență a epicoccononei prezintă un două maxime de excitaţie (la 365nm şi

la 520nm), și un maxim de emisie la 610nm (figura TTT) care nu depăşește însă spectrele de
emisie și care permite utilizarea acestui colorant în SDS-PAGE, la colorațiile duble (de exemplu
cu fluoresceina). În monentul legării al proteine, apare un shift mare (>100nm) față de lungimile
de undă de excitație.
Epicocconona posedă mai multe caracteristici care îi conferă o distincţie în ceea ce privește
clasa superioara a coloranților fluorescenți în biologie. Unele dintre aceste caracteristicile
importante reprezentate de sensibilitatea sa de neegalat, compatibilitatea sa cu spectrometria de
massă, uşurinţa sa de utilizare, necontaminarea mediului, stabilitatea aducților de proteine în
condiţii diferite de pH au condus la o gamă largă de aplicaţii, de la colorări multiplex până la
proceduri de detecție a proteinelor.

Figura ȚȚȚ. Compararea colorației cu Deep Purple Total Protein Stain comparativ cu colorația bloturilor cu
Sypro Ruby Blot Stain pe membrane de PVDF (Hybond-P). Markerii de masă moleculară au fost diluați între
aproximativ 128 până la 1ng și separați pe geluri în gradient 4-20% și transferați pe membrane Hybond-P. (A)
colorație cu Deep Purple Total Protein Stain. (B) colorație cu Sypro Ruby Blot Stain. Vizualizarea realizându-se prin
epiiluminare UVA sau UVB (După Malmport și colab., 2005).
Astfel, Deep Purple™ Total Protein Stain poate fi folosit pentru a colora atât blot-uri precum
și geluri. Rezultatele arată că protocolul de colorare a blot-urilor oferă rezultate rapide, robuste și
extrem de sensibile atunci când se utilizează fie membrana de NC cât și cea din PVDF și s-a
dovedit că sensibilitatea de detecţie a colorației este de cel puţin 16 de ori mai mare decât cea
obținută cu Sypro™ Ruby Blot Stain (figura ȚȚȚ). În plus, blot-urile pot fi colorate atât în formă
umedă cât și în formă uscată (Malmport și colab., 2005).
Sasse și Gallagher (2003) au comparat proprietățile și compatibilitățile unor metode diferite
de colorare a cele mai utilizate membrane (tabelul BBB).
Tabelul BBB. Proprietățile și compatibilitățile membranelor de transfer a proteinelor la câteva tipuri de colorații
(După Sasse și Gallagher, 2003)
Tipuri de membrană Tipuri de gel
Colorați Limită de
N Nylo SDS- Native-
e detecție (ng) PVDF
C n PAGE PAGE
India ink 50 + - + + +
Aur 3 + - + + +
SYPRO 2 + + + + +
Ruby
 Abreviațiuni: NC, nitroceluloză; PVDF, difluorură de poliviniliden; SDS-PAGE, electroforeză pe gel de
poliacrilamidă în prezență de SDS, Native-PAGE, electroforeză pe gel de poliacrilamidă în condiții native.
5.1.7.1.6. Transiluminarea
Deşi nu este din punct de vederea un proces de colorare, transiluminarea poate fi un proces
valoros în vizualizarea benzilor proteice. Acesta abordare oferă o sensibilitate similară cu CBB-
R, fără să existe riscul de a pierde sau de a se modifica proteinele separate. Metoda esre
nedistructivă și reversibilă. Tehnica se bazaează pe schimbarea transparenței membranei de
PVDF, din opac în semitransparent în momentul îmbibării ei în metanol (20%) care va uda într-
un mod expres regiunile membrane care sunt acoperite cu un strat de proteine dar nu şi zonele
fără proteine. Astfel, benzile proteice apar ca zone clare atunci când membrana este plasată pe un
suport-transluminator. Sensibilitatea de detectare este comparabilă cu colorația cu CBB-R atunci
când aceasta este utilizată în combinaţie cu fotografierea (Millipore, 1997).
5.1.7. METODE DE DETECȚIE SPECIFICĂ A BIOMOLECULELOR DUPĂ
TRANSFER
Proteinele individuale pot fi caracterizate prin capacitatea lor de a reacţiona, fie cu anticorpi
specifici, fie cu liganzi specifici de grup (de exemplu, lectine, ADN, ARN sau metale). Pentru o
observație directă, anticorpii primari pot fi marcați dar tehnici indirecte de tip sandwich, folosind
fie un al doilea anticorp, fie proteina A de la Staphylococcus aureus ori o proteină G s-au
conjugat cu markeri detectabili mult mai sensibili. În literatura de specialitate au fost descrise o
gamă diversă de markeri şi de sisteme de detecţie. Al doilea anticorp poate fi marcat radioactiv
(cu 125I, de exemplu) (Burnette, 1981; Renart și colab., 1984), conjugat cu diferite enzime (de
exemplu, peroxidază din hrean, fosfatază alcalină,/β-galatozidază) (Tsang și colab., 1983 ; Blake
și colab., 1984), ori complexat cu biotină/streptavidină (sau avidină) (Wirth și Romano, 1995),
metale grele (de exemplu, aur/argint) (Hsu, 1984; Moeremans și colab., 1983) sau marcat
fluorescent (cu izotiocianat de fluoresceină) (The și colab., 1970).
O serie de metodele de detecție implică proceduri histoenzimologice care utilizează
substraturi cromogenice, reacţii colorimetrice anorganice ori autoradiografice. În plus, a fost
dezvoltat un kit comercial realizat pe baza unui protocol de chemiluminiscenţă neradioactiv
pentru detecția fie directă, fie indirectă a antigenelor (proteinelor) cu anticorpi la care a fost
conjugată peroxidază din hrean (Whitehead și colab., 1979). Tehnica este extrem de sensibilă,
capabilă de detecția a mai puţin de 1 pg de proteină/bandă, şi permite imunodetecții multiple pe
membrană fără nici un prejudiciu față de antigen. O reprezentare schematică a acestei proceduri
este ilustrat în Figura KKK. În continuare, tehnicile de colorare și imunodetecție multiplă sunt
deseori utilizate pentru analiza mai multor antigene pe o membrană de transfer (Kaufmann și
colab., 1987).

Figura KKK.. Ilustrarea schematică a detecției

prin imunoblot pe membrană a proteinelor legate
(antigene). Gelatina, BSA ori laptele degresat
blochează centrele de legare a proteinei neocupate.
Anticorpul primar se incubează cu o proteină
(antigen) specific legat la membrană. În continuare,
se adaugă un anticorp secundar conjugat cu o enzimă,
care se leagă la anticorpul primar, după care se
adaugă reactivul de dezvoltare a culorii pentru a se
localiza complexul antigen-anticorp-anticorp
[substrat-produs]. (După Wirth și Romano, 1995).
 În multe cazuri se pot utiliza, de asemenea, procedee precum:
(a) tehnica generală de imunocolorare, (Kittler și colab., 1984);
(b) colorarea cu aur sau fer coloidal (Moeremans și colab., 1985; Moeremans și colab.,
1986);
(c) autoradiografia;
(d) fluorografia (Burnette, 1981).
Principiile autoradiografiei și ale fluorografiei (tehnici de multe ori cuplate pentru a se obține
o intensificare a semnalului) sunt ilustrate în figura LLL în timp ce figura MMM prezintă modul
prin care radiaţia diferiților izotopi poate penetra o emulsie depusă pe un film (Stoyanov și
colab., 2001).

Figura LLL. Cele trei metode clasice de autoradiografie: (A) prin

expunere directă; (B) prin fluorografie; (C) prin utilizarea uner intensificatori
de ecranare (După Stoyanov și colab., 2001).

Evoluţiile mai recente au condus la introducerea unor noi tipuri de sisteme de intensificare a
ecranării, în care plăcile imagistice de fosfor sunt compuse dintr-un strat subţire (de cca. 500
µm), un strat format din microcristale de BaFBr:Eu2+ captate într-un liant din material plastic
(Johnston și colab., 1990). Experimental, această plăcă imagistică de fosfor este expusă la un gel
uscat mono- sau bi-dimensionale care conţin zone separate de proteine marcate radioactiv. După
expunere, placa este transferată într-un scaner a cărui rază de lumină provine de la un laser HeNe
(λ=633 nm) este absorbită de către centrele de F metastabile activate ale radionuclidului de
căptre ecranul de fosfor și care la randul lor conduc la emisia unei luminiscențe albastre (λ=390
nm), a cărei intensitate este proporţională cu cantitatea iniţială de radiație incidentă de pe placă.
Imaginea benzilor (pentru gelurile monodimensionale) sau a spoturilor (pentru geluriloe
bidimensionale) a gelului original este reconstruită astfel de scaner şi în continuare stocată
digital. Datorită sensibilităţii extrem de ridicată, această tehnică a fost utilizată în special la
cartarea 2-D, fiind realizată pe geluri plate şi uscate de poliacrilamidă (Bonner, 1983). Cu toate
acestea, din cauza riscurilor implicate de emisia unor radiaţii penetrante, cum ar fi emisia γ
produsă de 125I şi a riscului de poluare a mediului, există o tendinţă ca metoda să fie evitată
(Stoyanov și colab., 2001).
 Figura MMM. Capacitate de penetrare a unui film de radiații X de către diferite radiații produse de radioizotopi.
Se poate nota că metoda de intensificare a ecranării cu fosfor poate fi utilizată numai cu emițători de energie înaltă (de
exemplu radiații γ) since they can penetrate through the film thickness and excite the phosphor underneath. deoarece
acestea pot pătrunde prin grosimea filmului de bază si pot să excite stratul inferior de fosfor (După Stoyanov și colab.,
2001).
Ori de câte ori este posibil şi sunt disponibile, se aplelează la metodele specifice de
imunodetecție, deoarece acestea ajung de multe ori la sensibilitati apropiate de cele obținute prin
marcare radioactivă, fără a genera, în schimb, probleme de mediu.

5.1.7.3. Detecţia prin chemoluminiscenţă

Chemiluminescenţa reprezintă producerea unei cuante de lumină detectabilă rezultată în urma
unei reacţii chimice. În detecţia pe membrane de transfer, reacţiile sunt catalizate de către o
enzimă precum fosfataza alcalină ori peroxidaza conjugată cu un anticorp. Semnalul luminos
poate fi capturat prim impresionarea unui film de tipul celor utilizate la captura radiaţiilor X sau
de către sisteme video de captare a imaginilor. Beneficiile detectării semnalelor
chemiluminescente de către un sistem de preluare a imaginilor sunt numeroase. Astfel, domeniul
de linearitate dinamică a sistemelor video este de 2 până la 5 ori magnitudine mai sensibile
comparativ cu sistemele de impresionare a filmului fotografic. Aceste sisteme video digitale de
preluare a imaginii oferă pe lângă o sensibilitate crescută şi o economicitate în sensul eliminării
achiziţionării continue de film ori consumabile de prelucrare al acestuia. Tehnica
chemiluminescentă este uşor de adaptat la procedurile de western blotting existente deoarece
utilizează anticorpi conjugaţi cu enzimă, pentru a genera semnalul luminos. Treptele de blocare
şi spălare sunt comune celor utilizate în în tehnicile de
western
blotting. Cele
mai multe
metode

chemiluminescente necesită puţine componente

necesare în generarea semnalului luminos. În
cazul chemiluminescenţei luminolului, substratul este
oxidat chimic de către HRP cu producţia unui
compus aflat în stare excitată.
Vezi și Liu(1997)
 În cele mai multe metode bazate pe oxidarea luminolului, semnalul luminos se produce în
momentul în care produsul excitat se întoarce la starea sa de bază. Semnalul este vizualizat prin
expunerea membranei pe un film foto sau prin utilizarea sistemelor de achiziţie a imaginii. Pe
lângă luminol sunt, disponibile comercial şi alte substrate chemiluminescent precum substratele
bazate pe acridan (este cazul Lumigen PS-3 (care utilizează AP sau HRP ca enzimă reporter) ori
substraturi pe bază de 1-2-dioxetan (care utilizează AP ca enzimă reporter) Emisia de lumină
poate fi crescută de până la 1000 de ori prin adăugarea unor amplificatori cu structură fenolică.
Amplificatorul diferă de tipul de kit utilizat. Detecţia chemiluminescentă prezintă ca avantaje,
viteza şi sensibilitatea. Timpul mediu de expunere de 30 secunde până la 15 minute. Timpul
scurt este principala îmbunătăţire faţă de metoda bazată pe detecţia cu 125I, care necesită până la
48 de ore de expunere pe film foto. Prin această metodă se pot detecta cantităţi de ordinul
picogramelor de proteină mai sensibile decât majoritatea metodelor colorimetrice şi sunt
aproximativ egale cu cele radioisotopice. Este important a se nota că sensibilitatea detecţiei este
oarecun dependentă de afinitatea antigenului şi a anticorpilor primar şi secundar care poate varia
considerabil de la o probă proteică la alta. Detecţia chemiluminescentă nu prezintă în plus
dezavantajul celei radioiyotopice în ceea ce prezintă riscul de expunere la iradiere, costul crescut
în ceeea ce priveşte măsurile de protecţie faţă de reziduurile radioactive în ceea ce priveşte
contaminarea mediului. Nu în ultimul rând, membranele utilizate în cazul metodelor
chemiluminescente pot fi utilizate de mai multe ori prin spălare şi rebandarea proteinelor, proces
care nu este posibil în cazul tehnicilor de detecţie colorimetrice.
5.1.7.4. Detecţia prin bioluminescenţă
Bioluminescenţa este un fenomen de emisie de lumină de către multe organisme. Sistemele
bioluminescente diferă în structura şi funcţia enzimelor şi cofactorilor implicaţi în proces alături
de mecanismul reacţiilor de generare a luminii. Bioluminescenţa poate fi expolatată ca metodă
de detecţie pe mebrane. Detecţia prin bioluminescenţă implică incubarea membranei care
conţine un antigen legat/complex anticorp-enzimă în prezenţa unui substrat bioluminogenic, cu
măsurarea simultană a luminii emise. Substratul în acest sistem de detecţie este un derivat al
luciferinei. Detecţia luminii este realizată într-o cameră fotoevidenţiere iar proteinele sunt
vizualizate ca spoturi luminoase. Din punct de vedere al sensibilităţii şi a vitezei de realizare,
tehnica este similară celei de chemiluminescenţă dar nu este generalizată datorită numărului mic
de substrate bioluminogenice commercializate. Membrana PVDF este preferabilă în detecţia
bioluminescentă deoarece membrana de nitroceluloză poate conţine substanţe ce inhibă
activitatea luciferazică şi astfel sunt posibile interferenţe în analiză.
5.1.7.5. Detecţia chemifluorescentă
Chemifluorescenţa reprezintă a conversie enzimatică a unui substrat într-un produs
fluorescent. Compuşii fluorogenici (substanţe nonfluorescente sau slab fluorescente care pot fi
convertite în produşi fluorescenţi) sunt utilizaţi cu o mare varietate de enzime, inclusiv cu AP ori
HRP. Enzima clivează o grupare fosfat a unui substrat fluorogenic cu producerea unui compus
înalt fluorescent. Fluorescenţa poate fi detectată prin utilizarea unui sistem de preluare a imaginii
de tipul sistemului Molecular Imager FX™ Pro Plus system or VersaDoc system and şi astfel,
cuantificată de către un program Quantity One®. Chemifluorescenţa poate conduce la produşi de
reacţie fluorescenţi stabili, astfel membranele pot fi analizate în condiţiiile de timp convenabile.
Metoda este compatibilă pentru recolorări şi spălări.
http://www.ivdtechnology.com/article/chemiluminescent-detection
 5.1.7.6. Detecţia prin fluorescență
În cazul detecţiei fluorescente, anticorpul secundar este marcat cu un fluorofor precum
fluoresceină (FITC), Texas Red, rhodamine (TRITC), ori R-phycoerythrin. Principalul avantaj în
detecţia fluorescenţei este faptul că domeniul dinamic linear este de circa 10 ori mai mare decât
în detecţia prin chemiluminescenţă cu o reducere a sensibilităţii de numai 2–4 ori. Detecţia
fluorescentă a proteinelor legate de membrane poate conduce uneori la o mai bună linearitate şi
la cuantificări mai bune în limitele de detecţie. Detecţia fluorescentă poate fi deasemenea
multiplex. Legarea mai multor fluorofori coloraţi la diverşi antigeni conduce la detecţia
simultană a mai multor proteine ţintă pe aceeaşi membrană.
Vezi și Sapsford(FRET-2006)
5.1.7.7. Autoradiografia
Pentru multe aplicaţii radioizotopii pot fi utilizaţi pentru a marca probele (în cazul
membranelor rezultate din transfer este vorba de anticorpul secundar) Radioizotopii cei mai
utilizaţi în ştiinţele biologice sunt 35S, 32P, 33P, 14C, şi 125I. Pentru a detecta radioactivitea, metoda
cea mai utilizată este autoradiografia pe filme de radiaţii X. Autoradiografia conduce la o relaţie
bună între sensibilitate şi rezoluţie fără o investiţie mare. Pentru intensificarea semnalului
autoradiografic se utilizează scintilatori. Există sisteme de analiză a fosforului precum Molecular
Imager FX™ care oferă o alternativă la metodele de detecţie pe film. Marele avantaj al metodei
constă într-o relaţie lineară între intensitatea semnalului şi cantitatea de proteină.
Vezi și 13.6.2. Detection systems after blotting (SDS-PAGE)
5.1.7.8. Detecţia colorimetrică
O serie de substrate sunt convertite la un precipitat colorat de către o serie de enzime precum
HRP ori AP, enzime uzual conjugate la anticorpul secondar. Cele mai comune sisteme utilizează
substraturi precum 5-bromo-4- chloro-3-indolil fosfat/Nitroblue Tetrazoliu (BCIP/NBT) pentru
AP ori diaminobenzidina (DAB) sau 4-cloro-1-naftol (4CN) pentru HRP. În momentul
acumulării de precipitat pe bandă, se dezvoltă un semnal colorat pe membrană. Reacţia
enzimatică poate fi monitorizată şi stopată în condiţiile în care semnalul are o intensitate dorită
pentru a preveni zgomotele de fond. Metoda este cea mai simplă dintre toate tehnicile de
evidenţiere, semnalul detectabil fiind rodul legării anticorpului secundar la un anticorp sepcific
proteinei de interes.

În concluzie, detecţia chemiluminescentă, bioluminescentă, şi chemifluorescentă se bazează

pe generarea unui semnal luminos. În detecţia chemiluminescentă (A) şi bioluminescentă (B),
reacţia însăşi emite lumină. Chemiluminescenţa şi bioluminescenţa se disting prin sursa de
substrat. În detecţia chemifluorescentă (C), produsul este fluorescent. Atât detecţia fluorescentă
cât şi cea autoradiografică (D) înregistrează semnalul generat de un anticorp secundar marcat. În
detecţia fluorescentă, anticorpul este marcat cu un fluorofor în timp ce în autoradiografie, el este
marcat cu un izotop radioactiv. În detecţia colorimetrică (E), semnalul este un precipitat colorat.
Vezi și
CriterionPrecast Gel

Muenker, C., Pizzonia, J. Increased Detection Sensitivity for Chemiluminescent and

Fluorescent Western Blotting Using Signal Enhancer and PVDF Membranes, Carestream
Molecular Imaging Dealer, AP0100 Dec 2010
Transferul proteinelor pe membrană (denumit western blotting) reprezintă o tehnică de rutină,
deosebit de utilizată în detectarea şi caracterizarea proteinelor. Metoda prezintă avantajul
specificităţii anticorpilor care conduc la identificarea fără dubii a proteinelor după separarea lor
prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă şi transferate pe o membrană. Western blotting-ul
implică recunoaşterea secvenţială dintre trei componente: proteina ţintă, anticorpul primar care
recunoaște proteina ţintă şi un anticorp secundar care recunoaşte anticorpul primar şi generează
un semnal detectabil. După legarea proteinelor la o membrană, situsurile nelegate sunt inactivate
(membrana este blocată), incubată cu un anticorp primar, apoi cu un anticorp secundar şi în final,
spălată. Anticorpul primar se leagă la proteina de interes în timp ce anticorpul secundar este
pregătit pentru detecţie.
Anticorpul secundar poate fi marcat cu un radioizotop, un fluorofor, sau cu o enzimă, în
marea majoritate peroxidaza din hrean (horseradish peroxidase- HRP) sau fosfataza alcalină
(AP)
O lungă perioadă de timp, radioizotopii au reprezentat singura cale de marcare a probelor de
anticorpi secundari şi astfel utilizaţi în aplicaţiile de transfer ale proteinelor. Ultimii ani au
dezvăluit noi metode mai puţim periculoase şi mai fezabile decât cele radioactive, care conduc la
rezultate comparabile în ceea ce priveşte sensibilitatea lor. Tehnicile curente de detecţie după
transfer pe membrană includ metode bazate pe detecţia emisiei de lumină (chemiluminiscenţă,
bioluminescenţă, chemifluorescenţă şi fluorescenţă), detecţie prin autoradiografie, ori
colorimetrie. (Tabelul …. şi Figura …..)

Tabelul VVV. Comparație între metodele de detecţie a proteinelor după transfer pe membrană.
Luminescenţă
Propriet Chemi- Fluorescen Radio- Colorimetric
(Chemi- şi Bio-
ăți fluorescenţă ţă izotopică ă
)
Sensibilit
Excelentă Foarte bună Foarte bună Excelentă Foarte bună
ate
Economi
e în utilizarea Excelentă Foarte bună Excelentă Excelentă Bună
anticorpilor
Viteză în
Excelentă Excelentă Excelentă Slabă Bună
detecţie
Reproduc
Foarte bună Acceptabilă Acceptabilă Acceptabilă Slabă
tibi-litate
Posibilita
tea Foarte bună Acceptabilă Excelentă Excelentă Acceptabilă
cuantificării
Durabilit
atea Excelentă Acceptabilă Excelentă Excelentă Bună
rezultatelor

5.1.7.2. Colorații speciale ale proteinelor transferate pe membrană

Pe membranele utilizate la transfer, se pot de asemenea aplica colorații specifice pentru
detecția fosfoproteinelor și glicoproteinelor. Etapele sunt mai scurte decât în cazul gelurilor
deoarece proteinele sunt mai ușor accesibile pe suprafața membranei. Astfel, este disponibil un
kit de detecția specifică a glicanilor pe membrane: glicoproteinele sunt legate de digoxigenină
care la rândul ei se cuplează imun cu fosfatază alcalină conjugată cu antidigoxigenină.
Vizualizarea se realizează prin detecția colorimetrică a fosfatazei alcaline cu nitroblue tetrazoliu.
Sensibilitatea detecției se înscrie în domeniul a câtorva nanograme per bandă proteică,
dependentă de proteina analizată individual. Această tehnică poate fi combinată cu lectine
selectate ca sonde pentru analiza unor structuri de glicoconjugate specifice.

5.1.8. ACHIZIȚIA DE IMAGINE

The complex protein patterns obtained in proteomics research require computeraided image
analysis. Therefore the image needs to be converted into digital format.
Vezi și
http://www.fixingproteomics.org/docs/2D_Image_Capture.pdf
 5.1.8.1. Sisteme (camere) de preluare a imaginii
For chemiluminescence detection usually a camera in a dark cabinet is employed. When all
proteins need to be detected, only scanning cameras can provide enough resolution for an
appropriate image analysis. However, the acquired adjacent image patches need to be stitched
together electronically, which can be a source of errors in the qualitative and quantitative
evaluation.
5.1.8.2. Scannere (densitometre)
Punct şi scanere de linie sunt mult mai potrivite pentru achiziţionarea de modele de proteine
de înaltă rezoluţie. Gelurile cu zone vizibile de proteine trebuie să fie scanate cu transmisie a
luminii, în scopul de a obţine semnale cantitative fiabile. Acest lucru este posibil cu high-end,
lichid-izolate scanere linie de desktop. Înainte de scanare instrumentul trebuie să fie calibrat.
Pentru analiza de imagine adecvată este importantă pentru a scana geluri, în tonuri de gri, modul
de lucru cu cel puţin 16 biţi adâncime de semnal. Pentru colorarea fluorescenta sau etichetarea
scanere speciale de fluorescenta sunt necesare. Mai multe scanere sunt scanere fluorescenta, de
obicei, punct cu surse de lumină laser cu lungimi de undă diferite. Cele mai bune instrumente de
utilizare optica confocal, în scopul de a exclude semnale rătăcite de lumină şi pentru a obţine
semnale de încredere cantitative, cu rezoluţie înaltă. De asemenea, trebuie remarcat faptul că
gama larga dinamic, obţinute cu o metodă de detectare, poate fi menţinută doar în cazul în care
scanerul oferă o gamă largă de dinamic, de asemenea. Mai multe scanere fluorescenta poate fi,
de asemenea, utilizat pentru măsurarea radioactivităţii cu utilizarea de ecrane de stocare de
fosfor.

5.1.9. ANALIZE DE IMAGINI

Software for image analysis should evaluate protein patterns reliably and reproducibly.
Human interference must be kept to a minimum, because of two major reasons: image analysis
with manual adjustments can be a severe bottleneck in the workflow and it is an additional
source of variation. The main steps are spot detection, normalization and spot matching between
different gels, and finally quantitative comparisons of spot volumes. The significance of changes
in protein expression levels detected in different gels, and the confidence level of a measured
quantitative ratio are checked with statistic tools, which are usually supplied with professional
image analysis software. Before results are published, the protein spots of interest must be
further analyzed. It can always happen that an electrophoresis band or spot contains more than
one protein due to insufficient resolution. In such cases the measured spot volume ratios will not
reflect the real situation. Usually this analysis is performed with mass spectrometry.
 Fig. 13.24. Scheme of the system of antibodies building up onto the spot containing the specific antigen blotted
onto a membrane, after a I-D or 2-D electrophoretic separation in a polyacrylamide gel. In this particular example a
cascade of three antibodies is used. Note that the last antibody in this cascade is covalently reacted with a
reporter/amplifier, in this case the enzyme peroxidase from horseradish. Revelation will take place when the
membrane will be confronted with appropriate substrates and dyes which, upon reaction, will form insoluble, stable,
coloured reaction products on the site.
Vezi și http://www.ihcworld.com/_books/Dako_Handbook.pdf

HORSERADISH PEROXIDASE (HRP): This enzyme (molecular weight 40 kD) is isolated

from the root of the horseradish plant. HRP has an iron-containing heme group(hematin) as its
active site and in solution is colored brown.
The hematin of HRP first forms a complex with hydrogen peroxide and then causes it to
decompose resulting in water and atomic oxygen. HRP oxidizes several substances, two of
which are polyphenols and nitrates. Like many other enzymes, HRP and some HRP-like
activities can be inhibited by excess substrate. The complex formed between...
5.1.10. APLICAŢII ALE TRANSFERULUI PROTEINELOR PE MEMBRANE
Transferul proteinelor pe membrane este utilizat la definirea specificităţii unui anticorp dat,
analiza interacţiunilor proteină- proteină, proteină-ligand, testarea anticorpilor monoclonali, etc.
prin îndepărtarea graduală a dodecilsulfatului de sodiu, s-a constatat renaturarea unor enzime şi
astfel se poate determina identificarea acestora pe baza activităţii lor. În plus, proteinele pot fi
secvenţiate direct de pe membrana de transfer (în cazul utilizării de membrane de sticlă sau de
poliviniliden) cu ajutorul unui secvenţiator în fază gazoasă.
În momentul aplicării unui câmp electric, electrozii vor crea un câmp electric cu voltaj
uniform care va acoperi întreaga suprafață a gelului, iar proteinele vor migra electroforetic din
gel spre membrană. În cazul sistemului de transfer electroforetic „semi-dry”, acesta necesită o
mică cantitate de tampon și un voltaj scăzut.
Diffusion blotting

Bibliografie

Kaufmann, S. H., Ewing, C. M., Shaper, J. H. (1987) The erasable Western blot. Anal. Biochem. 161:89-95.
Whitehead, T. P., Kricka, L. J., Carter, T. J., Thorpe, G. H. (1979) Analytical luminescence: its potential in the
clinical laboratory. Clin. Chem.,25:1531-1546.
*** Amersham Pharmacia Biotech, Protein electrophoresis. Technical manual. http://www.scribd.com/doc/
22613588/Amersham-Technical-Manual-Protein-Electrophoresis-Handbook
*** Bio-Imaging System. Application Note #3. Deep Purple™ http://www.berthold-jp.com/products/
bio/pdf/deep_purple.pdf
*** EnCor Biotehnologie Inc., 2012. http://www.encorbio.com/protocols/blotting.htm.
*** Millipore. Protein blotting applications guide. Millipore Corporation. protein blotting. 1997. www.millipore.
com/...nsf/.../tp001en00.pdf
*** Minitrans-blot electrophoretic. PerkinElmer Life Sciences, Inc. Boston, MA USA Western Lightning TM
Chemiluminescence Reagent Plus.
*** Pierce Biotechnology. Chemiluminescent Western blotting technical guide and protocols. TECH TIP # 67.
Thermo Fisher Scientific Inc. 2009. www.thermo.com/pierce.
Aebersold, R. H., Leavitt, J., Saavedra, R. A., Hood, L. E., Kent, S. B. (1987) Internal amino acid sequence
analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel electrophoresis after in situ protease digestion on
nitrocellulose. Proc Natl Acad Sci U S A. 84:6970-6974.
Aebersold, R. H., Teplow, D. B., Hood, L. E., Kent, S. B. (1986) Electroblotting onto activated glass. High
efficiency preparation of proteins from analytical sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels for direct sequence
analysis. J Biol Chem. 261:4229-4238.
Alba, F. J., Daban, J. R. (1998) Rapid fluorescent monitoring of total protein patterns on sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels and western blots before immunodetection and sequencing. Electrophoresis. 19:2407-2411.
Alba, F. J., Daban, J.-R. MDPF Satining of Proteins on Western Blots. In The Protein Protocols Handbook. 2nd
Edition, Walker, J. M. Ed., Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, 2002
http://books.google.ro/books?id=d40c5nGLaK8C&pg=PA392&lpg=PA392&dq=A+high-affinity+protein+stain
+for+western+blots,+tissue+prints,+and+electrophoretic&source=bl&ots=OuoYwZmcjA&sig=7cVtdIZqunga9Xu-
LOgHpRoJORQ&hl=ro&sa=X&ei=_7uiT_HNCM_DswazrOnFBw&sqi=2&ved=0CGIQ6AEwBA#v=onepage&q=A
%20high-affinity%20protein%20stain%20for%20western%20blots%2C%20tissue%20prints%2C%20and%20
electrophoretic&f=false
Alban, A., David, S., Bjorkesten, L., Andersson, C., Sloge, E., Lewis, S., Currie, I. (2003) A novel experimental
design for comparative two-dimensional gel analysis: two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a
pooled internal standard. Proteomics 3:36–44.
Alwine, J. C., Kemp, D. J., Parker, B. A., Reiser, J., Renart, J., Stark, G. R., Wahl, G. M. (1979) Detection of
specific RNAs or specific fragments of DNA by fractionation in gels and transfer to diazobenzyloxymethyl paper.
Methods Enzymol. 68:220-242.
Anderson, N. L., Esquer-Blasco, R., Hofmann, J.-P., Anderson, N. G. (1991) A two-dimensional gel database of
rat liver proteins useful in gene regulation and drug effect studies. Electrophoresis 12:907–930.
Beisiegel, U. (1986) Protein blotting. Electrophoresis. 7:1–18.
Bell, P. J. L., Karuso, P. (2003) Epicocconone: A novel fluorescent compound from the fungus Epicoccum
nigrum. J. Am. Chem. Soc 125:9304-9305.
Berggren, K. N., Schulenberg, B., Lopez, M. F., Steinberg, T. H., Bogdanova, A., Smejkal, G., Wang, A., Patton,
W. F. (2002) An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: comparison with the original formulation
and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics 2:486–498.
Bermudez, A., Daban, J.-R., Garcia, J. R., Mendez, E. (1994) Direct blotting, sequencing and immunodetection of
proteins after five-minute staining of SDS and SDS-treated IEF gels with Nile Red. Biotechniques 16:621–624.
Bers, G., Garfin, D. (1985) Protein and nucleic acid blotting and immunobiochemical detection. BioTechniques. 3:
276–288.
Bers, G., Garfin, D. (1985) Protein and nucleic acid blotting and immunobiochemical detection. BioTechniques
3:276-288.
Berson, G. (1983) Silver staining of proteins in polyacrylamide gels: increased sensitivity by a blue toning Anal.
Biochem. 134:230–234.
Bickar, D., Reid, P. D. (1992) A high-affinity protein stain for western blots, tissue prints, and electrophoretic
gels. Anal Biochem. 203:109-115.
Bickar, D., Reid, P. D. (1992) A high-affinity protein stain for western blots, tissue prints, and electrophoretic
gels. Anal. Biochem. 203:109-115.
Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. (1984) A rapid, sensitive method for
detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Anal. Biochem. 136:175-179.
Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. (1984) A rapid, sensitive method for
detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Anal Biochem. 136:175-179.
Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in
polyacrylamide gels. Electrophoresis 8:93–99.
Bollag, D. M., Edelstein, S. J. Protein Methods. New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, Wiley-
Liss., 1991.
Bonner, W. M. (1983) Use of fluorography for sensitive isotope detection in polyacrylamide gel electrophoresis
and related techniques. Methods Enzymol. 96:215-222.
Burgess, R., Arthur, T. M., Pietz, B. C. (2000) Mapping protein–protein interaction domains using ordered
fragment ladder far-Western analysis of hexahistidine-tagged fusion proteins. Meth. Enzymol. 328:141–157.
Burnette, W. N. (1981) „Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--
polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein
A. Anal Biochem. 112:195-203.
Christian, J., Houen, G. (1992) Comparison of different staining methods for polyvinylidene difluoride
membranes. Electrophoresis. 13:179-183.
Christiansen, J., Houen, G. (1992) Comparison of different staining methods for polyvinylidene difluoride
membranes. Electrophoresis. 13:179-183.
Desvaux, E. X., David, B., Peltre, G. (1990) Multiple successive immunoprinting: a fast blotting technique of a
single agarose isoelectric focusing gel. Electrophoresis. 11:37-41.
Eckerskorn, C., Mewes, W., Goretzki, H., Lottspeich, F. (1988) A new siliconized-glass fiber as support for
protein-chemical analysis of electroblotted proteins. Eur J Biochem. 176:509-519
Eckhardt, A. E., Hayes, C. E., Goldstein, I. J. (1976) A sensitive fluorescent method for the detection of
glycoproteins in polyacrymamide gels. Anal. Biochem. 73:192–197.
Fazekas de St Groth, S., Webster, R. G., Datyner, A. (1963) Two new staining procedures for quantitative
estimation of proteins in electrophoresis strips. Biochim. Biophys. Acta. 71:377–391.
Fernandez-Patron, C., Rodriguez, P., Castellanos-Serra, L. (1992) Reverse staining of sodium dodecil sulfate
polyacrylamide gels by imidazole-zinc salts: sensitive detection of unmodified proteins. Bio-Techniques. 12:564–573.
Ferreras, M., Gavilanes, J. G., Garcia-Segura, J. M. (1993) A permanent Zn2+ reverse staining method for the
detection and quantification of proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 213:206–212.
 Friedman, D. B., Hill, S., Keller, J. W., Merchant, N. B., Levy, S. E., Coffey, R. J., Caprioli, R. M. (2004)
Proteome analysis of human colon cancer by two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry.
Proteomics 4:793–811.
Garfin, D. E. Electrophoretic Methods. pp 53-109 in Glasel JA and Duetscher MP (eds) Introduction to
Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research, Academic Press, San Diego, 1995.
Gershoni, J. M. (1987). Protein blotting: A tool for the analytical biochemist. Adv. Electrophor. 1:141-175.
Gershoni, J. M., Palade, G. E. (1982) Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels to a positively charged membrane filter. Anal Biochem. 124:396-405.
Gershoni, J. M., Palade, G. E. (1983) Protein blotting: principles and applications. Anal Biochem. 131:1-15.
Glenney, J. (1986) Antibody probing of western blots which have been stained with India ink. Anal Biochem.
156:315-319.
Hafiz, A. Principles and reactions of protein extraction, purification, and characterization. CRC Press, Boca Raton
London New York Washington, D.C. 2005. http://www.scribd.com/doc/51529414/65/STAINING-PROTEINS-ON-
BLOT-TRANSFER-MEMBRANE#
Hancock, K., Tsang, V. C. W. (1983) India ink staining of proteins on nitrocellulose paper. Anal. Biochem.
133:157-162.
Harper, S., Speicher, D. W. (2001) Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci.Chapter
10:Unit 10.8.
Hart, C., Schulenberg, B., Steinberg, T. H., Leung, W. Y., Patton, W. F. (2003) Detection of glycoproteins in
polyacrylamide gels and on electroblots using Pro-Q Emerald 488 dye,, a fluorescent periodate Schiff-base stain.
Electrophoresis 24:588–598.
Heukeshoven, J. Dernick, R. (1985) Simplified method for silver staining of proteins in polyacrylamide and the
mechanism of silver staining. Electrophoresis 6:103–112.
Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. (2000) Direct Blue 71 staining of proteins bound to blotting membranes.
Electrophoresis. 21:841-845.
Hong, H.-Y., Yoo, G.-S., Choi, J.-K. Detection of Proteins on Blots Using Direct Blue 71. In The Protein
Protocols Handbook Edited by John M. Walker Second Edition Humana Press, 2002.
http://books.google.ro/books?id=xsVIM8_VOSMC&pg=RA1-PA41&lpg=RA1-PA41&dq=by+electrophoresis,+
and+these+methods+are+described+in+Chapters+39+and+40& source=bl&ots=eHE-W8nd2h&sig=SM7uslXEjG3
zvrNMJn6FSnCA_Es&hl=ro&sa=X&ei=txKUT6vHGMW6-Aay_oi3BA&ved=0CCIQ6AEwAA#v=onepage&q=by
%20electrophoresis%2C%20and%20these%20methods%20are%20described%20in%20Chapters%2039%20and%204
0&f=false
Hsu, Y.-H. (1984) Immunogold for detection of antigen on nitrocellulose paper. Anal. Biochem. 142:221-225.
Hughes, J. H., Mack, K., Hamparian, V. V. (1988) India ink staining of proteins on nylon and hydrophobic
membranes. Anal Biochem. 173:18-25.
Jenzano, J. W., Hogan, S. L., Noyes, C. M., Featherstone, G. L., Lundblad, R. L. (1986) Comparison of five
techniques for the determination of protein content in mixed human saliva. Anal Biochem. 159:370-366.
Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. (1990) Autoradiography using storage phosphor technology.
Electrophoresis. 11:355-360.
Kakita, K., O'Connell, K., Permutt, M. A. (1982) Immunodetection of insulin after transfer from gels to
nitrocellulose filters. A method of analysis in tissue extracts. Diabetes. 31:648-652.
Karey, K. P., Sirbasku, D. A . (1989) Glutaraldehyde fixation increases retention of low molecular weight proteins
(growth factors) transferred to nylon membranes for western blot analysis. Anal Biochem. 178:255-259.
Kay, M. M., Goodman, S. R., Sorensen, K., Whitfield, C. F., Wong, P., Zaki, L., Rudloff, V. (1983) Senescent cell
antigen is immunologically related to band 3. Proc Natl Acad Sci U S A. 80:1631-1635.
Kerenyi, L. Gallyas, F. (1972) A highly sensitive method for demonstrating proteins in electrophoretic,
immunoelectrophoretic and immunodiffusion preparations. Clin. Chim. Acta. 38:465–467.
Kittler, J. M., Meisler, N. T., Viceps-Madore, D., Cidlowski, J. A., Thanassi, J. W. (1984) A general
immunochemical method for detecting proteins on blots. Anal. Biochem. 137:210-216.
Laing, P. (1986) Luminescent visualization of antigens on blots. J. Immunol. Methods. 92:161-165.
Lee, C., Levin, A., Branton, D. (1987) Copper staining: a five-minute protein stain for sodium dodecil sulfate-
polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 166:308–312.
Li, K. W., Geraerts, W. P., van Elk, R., Joosse, J. (1989) Quantification of proteins in the subnanogram and
nanogram range: comparison of the AuroDye, FerriDye, and India ink staining methods. Anal. Biochem. 182:44-47.
Lim, M. J., Patton, W. F., Lopez, M. F., Spofford, K. H., Shojaee, N., Shepro, D. (1997) A luminescent europium
complex for the sensitive detection of proteins and nucleic acids immobilized on membrane supports. Anal Biochem.
245:184-195.
Lim, M. J., Patton, W. F., Shojaee, N., Shepro, D. (1996) Solid-phase metal chelate assay for quantifying total
protein: resistance to chemical interference. Biotechniques. 21:888-892, 894, 896-7.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol
reagent. J Biol Chem. 193:265-275.
 Mackintosh, J. A., Choi, H. Y., Bae, S. H., Veal, D. A., Bell, P. J., Ferrari, B. C., Van Dyk, D. D., Verrills, N. M.,
Paik, Y. K., Karuso, P. (2003) A fluorescent natural product for ultra sensitive detection of proteins in 1-D and 2-D
gel electrophoresis. Proteomics 3:2273–2288.
Mackintosh, J. A., Choi, H.-Y., Bae, S.-H., Veal, D. A., Bell, P. J., Ferrari, B. C., Van Dyk, D. D., Verrills, N. M.,
Paik, Y.-K., and Karuso, P. (2003) A fluorescent natural product for ultra sensitive detection of proteins in one-
dimensional and two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3:2273–2288.
Malmport, E., Mackintosh, J., Ji, H., Simpson, R. J., Veal, D., Karuso, P. Visualization of proteins electro-
transferred on Hybond ECL and Hybond-P using Deep Purple Total Protein Stain. Innovations Forum: Proteomics.
GE Healthcare, Life Science News 19, 13. 2005. http://www.chem.mq.edu.au/~vislab/LSN19_12.pdf
Matsudaira, P. (1990) Limited N-terminal sequence analysis. Methods Enzymol. 182:602-613.
Merril, C. R., Switzer, R. C., and Van Keuren, M. L. (1979) Trace polypeptides in cellular extracts and human
body fluids detected by two-dimensional electrophoresis and a highly sensitive silver stain. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 76:4335–4339.
Mitra, P., Pal, A. K., Basu, D., Hati, R. N. (1994) A staining procedure using Coomassie brilliant blue G-250 in
phosphoric acid for detection of protein bands with high resolution in polyacrylamide gel and nitrocellulose
membrane. Anal Biochem. 223:327-329.
Moeremans, M., Daneels, G., De Mey, J. (1985) Sensitive colloidal metal (gold or silver) staining of proteins blots
on nitrocellulose membranes. Anal. Biochem. 145:315–321.
Moeremans, M., De Raeymaeker, M., Daneels, G., De Mey, J. (1983) J. Immunol. Methods 74:353-342.
Moeremans, M., De Raeymaeker, M., Daneels, G., De Mey, J. (1986) FerriDye: colloidal iron binding followed
by Perls' reaction for the staining of proteins transferred from sodium dodecyl sulfate gels to nitrocellulose and
positively charged nylon membranes. Anal. Biochem. 153:18-22.
Moore, C. Introduction to Western Blotting. Principles, Technical Guidance, Data Analysis, Troubleshooting.
Published by MorphoSys UK Ltd. Endeavour House, Langford Business Park, Langford Lane, Kidlington, Oxford
OX5 1GE, UK, 2009. http://static.abdserotec.com/Lit-pdfs/Brochures1/westernblotbook.pdf
Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. (1988) Improved staining of proteins in polyacrylamide gels
including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-
250 and R-250. Electrophoresis. 9:255–262.
O’Farrell, P. H. (1975) High-resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250:4007-
4021.
Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. (1999) Accurate quantitation of protein expression
and site specific phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:6591–6596.
Olszewska, E., Jones, K. (1988) Vacuum blotting enhances nucleic acid transfer. Trends Gen. 4:92-94.
Patton, W. F., Lam, L., Su, Q., Lui, M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P. (1994) Metal chelates as reversible
stains for detection of electroblotted proteins: application to protein microsequencing and immunoblotting. Anal
Biochem. 220:324-335.
Pierce Protein Research Products., Thermo Fisher Scientific Inc. 2012 file:///C:/Users/user/Desktop/book/
Overview%20of%20Western%20Blotting.htm
Pluskal, M. F., Przekop, M. B., Kavonian, M. R., Vecoli, C., Hicks, D. A. (1986) Immobilon TM PVDV transfer
membrane. A new membrane substrate for Western blotting of proteins. BioTechniques. 4:272-283.
Rabilloud, T. (1992) A comparison between low background silver diammine and silver nitrate protein stains
Electrophoresis. 13:429–439.
Rabilloud, T., Strub, J.-M., Luche, S., van Dorsselaer, A., Lunardi, J. (2001) A comparison between Sypro Ruby
and ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) as fluorescent stains for protein detection in gels. Proteomics.
1:699–704.
Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. J. (1994) Silver staining of proteins in polyacrylamide gels: a
general overview. Cell. Mol. Biol. 40:57–75.
Reinhart, M., Malamud, D. (1982) Protein transfer from isoelectric focusing Gels: the native blot. Anal. Biochem.
123:229-235.
Reiser, J., Wardale, J. (1981) Immunological detection of specific proteins in total cell extracts by fractionation in
gels and transfer to diazophenylthioether paper. Eur J Biochem. 114:569-575.
Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. (1975) The use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution
for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal.Biochem. 64:509–516.
Renart, J., Sandoval, I. V. (1984) Western blots. Methods Enzymol. 104:455-460.
Root, D. D., Reisler, E. (1989) Copper iodide staining of protein blots on nitrocellulose membranes. Anal
Biochem. 181:250-253.
Root, D. D., Reisler, E. (1990) Copper iodide staining and determination of proteins adsorbed to microtiter plates.
Anal Biochem. 186:69-73.
Root, D. D., Wang, K. Kinetic Silver Staining of Proteins. The protein protocols handbook, Part I, 2nd Edition,
Edited by Walker, J. M. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2002.
Root, D. D., Wang, K. The Protein Protocols Handbook. 2 nd Edition, Walker, J. M. Ed., Humana Press Inc.,
Totowa, New Jersey, 2002 http://books.google.ro/books?id=d40c5nGLaK8C&pg=PA392&lpg=PA392&dq=A+high-
affinity+protein+stain+for+western+blots,+tissue+prints,+and+electrophoretic&source=bl&ots=OuoYwZmcjA&sig=
7cVtdIZqunga9Xu-LOgHpRoJORQ&hl=ro&sa=X&ei=_7uiT_HNCM_DswazrOnFBw&sqi=2&ved=0CGIQ6AEw
BA#v=onepage&q=A%20high-affinity%20protein%20stain%20for%20western%20blots%2C%20tissue%20
prints%2C%20and%20electrophoretic&f=false
Salinovich, O., Montelaro, R. C. (1986) Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to
nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 156:341-
347.
Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. (1999) Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appl
Biochem. 29:99-108.
Sasse, J., Gallagher, S. R. (2003) Detection of Proteins on Blot Transfer Membranes. Current Protocols in
Molecular Biology 10.7.1-10.7.6. John Wiley & Sons, Inc. 2003. http://www.nshtvn.org/ebook/
molbio/Current%20Protocols/CPMB/mb1007.pdf
Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins from silver
stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68:850–858.
Shojaee, N., Patton, W. F., Lim, M. J., Shepro, D. (1996) Pyrogallol red-molybdate: a reversible, metal chelate
stain for detection of proteins immobilized on membrane supports. Electrophoresis. 17:687-693.
Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K.,
Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem.
150:76-85.
Smolka, M., Zhou, H., Aebersold, R. (2002) Quantitative protein profiling using two-dimensional gel
electrophoresis,, isotope coded affinity tag labeling and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 1:19–29.
Soutar, A. K., Wade, D. P. Ligand blotting, p. 55-70. In Protein function: a practical approach. T. E. Creighton
(ed.), IRL Press, Oxford, United Kingdom, 1989.
Southern, E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.
J. Mol. Biol. 98:503-517.
Steinberg, T. H., Agnew, B. J., Gee, K. R., Leung, W.-Y., Goodman, T., Schulenberg, B., Hendrickson, J.,
Beechem, J. M., Haugland, R. P., Patton, W. F. (2003) Global quantitative phosphoprotein analysis using multiplexed
proteomics technology. Proteomics. 3:1128–1144.
Steinberg, T. H., Hangland, R. P., Singer, V. I. (1996) Applications of SYPRO Orange and SYPRO Red protein
gel stains. Anal. Biochem. 239:238–245.
Stoyanov, A., Zhukov, M., Righetti, P. G. The Proteome Revisited Theory and Practice of all Relevant
Electrophoretic Steps. Journal of Chromatography Library, Chapter 13. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) Vol. 63, Pag. 217–274, 2001.
Talent, J. M., Kong, Y., Gracy, R. W. (1998) A double stain for total and oxidized proteins from two-dimensional
fingerprints. Anal Biochem. 263:31-38.
The, T. H., Feltkemp, T. E. W. (1970) Conjugation of fluorescein isothiocyanate to antibodies. II. A reproducible
method. Immunology. 18:875-881.
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:4350–4354.
Tsang, V. C. W., Peralta, J. M., Simons, A. R. (1983) Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot techniques
(EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis. Methods Enzymol.
92:377-391.
Unlu , M., Morgan, M. E., Minden, J. S. (1997) Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting
changes in protein extracts. Electrophoresis. 18:2071–2077.
Urwin, V., Jackson, P. (1991) Labeling after IEF prior to SDS PAGE. Anal. Biochem. 195:30–37.
Urwin, V., Jackson, P. (1993) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of proteins labeled with the
fluorophore monobromobimane prior to first-dimensional isoelectric focusing: imaging of the fluorescent protein spot
patterns using a cooled charge-coupled device. Anal. Biochem. 209:57–62.
Walker, J. M. Protein Blotting by the Capillary Method, The Protein Protocols Handbook Edited by John M.
Walker Second Edition Humana Press, 2002. http://books.google.ro/books?id=xsVIM8_VOSMC&pg=RA1-
PA41&lpg=RA1-PA41&dq=by+electrophoresis,+and+these+methods+are+described+in+Chapters+39+and+40&
source=bl&ots=eHE-W8nd2h&sig=SM7uslXEjG3zvrNMJn6FSnCA_Es&hl=ro&sa=X&ei=txKUT6vHGMW6-
Aay_oi3BA&ved=0CCIQ6AEwAA#v=onepage&q=by%20electrophoresis%2C%20and%20these%20methods%20ar
e%20described%20in%20Chapters%2039%20and%2040&f=false
Weigele, M., De Bernardo, S., Leimgruber, W. (1973) Fluorescent labeling of proteins. A new methodology.
Biochem Biophys Res Commun. 54:899-906.
Westermeier, R. Electrophoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein
Separations. Fourth, revised and enlarged Edition. in collaboration with Gronau, S., Becket, P., Bulles, J., Schickle,
H.,Theßeling, G. ISBN 3-527-30354-5. http://filetram.com/download/file/307704860/electrophoresis-in-practice-4th-
ed-westermeier-r-pdf-rar?
Westermeier, R., Marouga, E. M., Burk, R. R. (1982) Experimentally improved reliability of ultrasensitive silver
staining of protein in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 125:96–99.
 Westermeier, R., Marouga, R. (2005) Protein Detection Methods in Proteomics Research. Biosci. Reports:25, 19-
32.
Wilson, C. M. (1983) Staining of proteins on gels: Comparisons of dyes and procedures. Methods Enzymol.
91:236-247.
Wirth, P. J., Romano, A. (1995) Staining methods in gel electrophoresis, including the use of multiple detection
methods. J. Chromatog. A, 698:123-143.
Zacharius, R. M., Zell, T. E., Morrison, J. H., Woodlock, J. J. (1969) Glycoprotein staining following
electrophoresis on acrylamide gels. Anal. Biochem. 30:148–152.
Zhu, S. Western Blot Protocol (8/19/2002). med.stanford.edu/...west/Protocols/Western.
 Glosar de termeni

%C – vezi Concentrație agent de reticulare

%T – vezi Concentrație monomer
Acrilamidă – Monomerul utilizat împreună cu un agent de reticulare pentru a forma o matrice, folosită la
separarea proteinelor sau a moleculelor mici de ADN.
Agaroză – Un compus derivat de la alge, folosit la formarea gelurilor de electroforeză utilizate la separarea ADN
sau a proteinelor foarte mari. (Este un polizaharid liniar alcătuit din galactoză si 3,6 anhidrogalactoză.)
Agent caotropic – Un compus chimic care perturbă legăturile inter- si intra-moleculare. Detergenții și
concentrațiile ridicate de săruri sunt exemple de agenți caotropici.
Agent de reticulare – O moleculă folosită pentru a lega moleculele monomerice împreună, în timpul
polimerizării, pentru a forma un gel cu o structură reticulată. Ochiurile rețelei sunt numite pori, iar mărimea porilor
este determinată în parte de concentrația agentului de reticulare. Porii pot sa nu să cearnă macromoleculele. Bis este
un agent de reticulare utilizat în mod obișnuit.
Amfoliți – Molecule mici care au o mare capacitate de buffering, la punctul lor izoelectric(pI). Amfoliții sunt
folosiți pentru a crea și a menține un gradient de pH în focalizarea izoelectrică
Amperi – O măsură a curentului. In aplicațiile de electroforeză, curentul este măsurat, de obicei, în miliamperi
(mA).
Anion – Un ion încărcat negativ.
Anod – Un electrod încărcat pozitiv care atrage ioni negativi (anioni). În mod obișnuit, anodul este marcat cu roșu
sau cu semnul ‘+’.
Anolit - Electrolitul de la anodul unei celule electroforetice.
APS – vezi Persulfat de amoniu.
BAC – (N, N’-bis-acrililcistamină) Un agent de reticulare folosit cu acrilamida. Are o legătură disulfurică, astfel
încât gelul poate fi solubilizat folosind agenți reducători ai legăturilor disulfurice.
Bandă – Într-un gel placă cu godeuri, colecția de molecule care se mișcă împreună, formând o linie orizontală,
scurtă. Proba migrează în afara godeului, într-un culoar și se separă în benzi.
Bis sau Bis-acrilamida – (N, N’-metilen-bis-acrilamida) Un agent de reticulare comun folosit cu acrilamida
pentru a forma o matrice suport.
Bloc de gel (eng. Plug) – În electroforeza ADN în câmp pulsatoriu, blocul de agaroză, în care sunt pregătite
probele de ADN. Pregătirea ADN într-un bloc de agaroză reduce riscul de rupere a ADN în bucăți mai mici.
Blotting – Transferul unei biomolecule de pe un gel de electroforeză pe o membrană sintetică care leagă acea
biomoleculă. Biomoleculele legate sunt analizate cât timp sunt dispuse pe suprafețele membranelor. Northern blotting
se referă la blotting cu ARN, Southern blotting se referă la blotting cu ADN, și Western blotting se referă la blotting
cu proteine; oricare din metodele în care moleculele probei sunt analizate cât timp se află pe suprafața unor membrane
sintetice.
BME – (2-mercaptoetanol, beta-mercaptoetanol) Un reactiv folosit pentru reducerea legăturilor disulfurice. Când
este folosit în tamponul probei, reacția de reducere care folosește BME va atinge echilibrul (BME nu va fi consumat).
Este folosit în exces (de obicei, la o concentrație de 5%), astfel încât proteinele sunt reduse complet. BME trebuie
folosit proaspăt. Vezi DTT
Cation – Un ion încărcat pozitiv.
Catod – Un electrod încărcat negativ, care atrage ioni pozitivi(cationi). În mod obișnuit, catodul este marcat cu
negru sau semnul ‘-’.
Catolit - Electrolitul de la catodul unei celule electroforetice.
Colorant de urmărire – Un colorant folosit pentru urmărirea deplasării moleculelor printr-un gel. Albastrul de
bromfenol și xilen cianol FF sunt coloranți de urmărire folosiți în mod obișnuit.
Concentrația agentului de reticulare (%C) – Procentul de monomer care este agent de reticulare. (De exemplu,
în geluri de bis/acrilamidă, numarul de grame de bis, împărțit la numărul total de grame de bis plus grame de
acrilamidă). Pentru o concentrație dată de monomer, există o concentrație optimă a agentului de reticulare, care dă
porii cei mai mici, și creșterea sau scăderea concentrației față de cea optimă va rezulta în pori cu mărime mai mare.
Atât concentrația agentului de reticulare(%C), cât și concentrația monomerului(%T) sunt necesare pentru specificarea
mărimii porilor unui gel.
Concentrație monomer (%T) – Procentul m/V al monomerului în gel. (De exemplu, în gelurile acrilamidă/bis,
%T este egal cu numărul de grame de acrilamidă plus numărul de grame de bis împărțite la volumul total de gel în
ml). De obicei, cu cât concentrația de monomer este mai mare, cu atât mărimea porilor este mai mică. Atât
concentrația agentului de reticulare(%C), cât și concentrația monomerului(%T) sunt necesare pentru specificarea
proprietăților unui gel.
Cromatografie electrocinetică micelară (MEKC) - Un tip de electroforeză capilară în care analiți neîncărcați
electric devin separabili deoarece sunt prinși în miceliile unui detergent ionic.
Culoar – Într-un gel placă cu godeuri, porțiunea de gel cu benzi de la o singură probă. Traseul proteinelor care
migrează în gel pentru a forma benzi este numit culoar.
 Curent – Măsură a fluxului de ioni într-un circuit electric (celula de electroforeză și sursa de curent). Curentul
este măsurat în amperi(A) sau miliamperi(mA) și este reprezentat, de obicei, prin ‘I.’
Degazare – Îndepărtarea gazelor dizolvate dintr-un lichid deoarece oxigenul dizolvat va inhiba polimerizarea
acrilamidei.. În cazul electroforezei, acest proces este realizat prin sucțiunea gazelor din amestecul de polimerizare
într-un sistem de vidare.
Denaturat – Care nu se găsește în conformația complet pliată întâlnită în stare nativă. Termenul este aplicat în
mod obișnuit macromoleculelor, în special proteinelor și acizilor nucleici.
Detergent – Un reactiv care face moleculele hidrofobe(grăsimi etc) solubile în apă. De obicei, detergenții au o
parte hidrofobă și una hidrofilă. Sunt folosiți, de obicei, în electroforeza proteinelor pentru solubilizarea probelor
proteice.
Difuzie – Mișcarea întâmplătoare a moleculelor dintr-o regiune de concentrație ridicată într-o regiune de
concentrație scăzută. Difuzia va cauza o scădere a rezoluției și crește odată cu creșterea temperaturii.
Distribuție Poisson - O funcție de densitate de probabilitate care este o aproximare a unei distribuții binomiale.
Are ca și caracteristică faptul că media ei este egală cu varianța ei. Stelele în spațiu, bacteriile într-o placă Petri,
dezintegrările radioactive pe unitate de timp, orice mărime a porilor unui gel, sunt toate distribuite în concordanță cu
distribuția Poisson.
DTT – (Ditiotreitol) Un reactiv comun utilizat pentru reducerea legăturilor disulfurice. Când este folosit în
tamponul probei, reacția de reducere care folosește DTT va fi completă (DTT va fi consumat). Este folosit în exces
(de obicei, 5-15mM). Vezi BME.
Ecuația Poisson - Ecuația diferențială care asociază potențialul electrostatic în orice punct din spațiu unei
distribuții a sarcinii electrice. Problema fundamentală în electrostatică este determinarea soluțiilor ecuației lui Poisson,
corespunzătoare unei distribuții de sarcină, pentru a afla potențialul electrostatic rezultat.
Efect Joule - Încălzirea unui conductor electric la trecerea unui curent electric prin acesta. Efectul Joule este
denumit și încălzire ohmică.
Electroeluție – Folosirea electroforezei pentru a deplasa moleculele în afara gelului. Este folosită în mod obișnuit
ca o metodă de recoltare a proteinelor după o separare electroforetică.
Electroendosmoză – Mișcarea în masă a apei împotriva direcției de mișcare a moleculelor care sunt separate prin
electroforeză.
Electroforeză – O metodă de separare a biomoleculelor pe baza diferențelor de mobilitate relativă, într-un câmp
electric; mișcarea particulelor încărcate într-un câmp electric. Mișcarea are loc datorită forțelor Coulomb stabilite între
particule și câmp.
Electroforeză 2-D – O tehnică de electroforeză în care probele sunt separate atât prin focalizare izoelectrică, cât și
prin SDS-PAGE
Electroforeză capilară (CE) - Electroforeză realizată în tuburi capilare, în care proba migrează în josul axei
tubului.
Electroforeză capilară în gel (CGE) - Electroforeză capilară realizată în capilare umplute cu gel.
Electroforeză capilară zonală (CZE) - Cea mai simplă formă de electroforeză capilară, în care un singur tampon
omogen este folosit în întregul sistem.
Electroforeză în câmp pulsatoriu – O metodă de electroforeză a ADN care implică schimbări periodice ale
direcției și tăriei câmpului electric aplicat, folosită de obicei pentru molecule de ADN mai mari de 20 kilobaze.
Electroforeză în gel de poliacrilamidă (PAGE) - O metodă electroforetică în care moleculele migrează printr-o
sită moleculară (gelul), creată de poliacrilamida polimerizată și înrețelată.
Eluție – A deplasa moleculele în afara gelului.
FIGE – (Gel electroforeza în câmp inversat) Un tip de electroforeză folosit pentru separarea unor fragmente mari
de ADN, prin schimbarea periodică a direcției câmpului electric. FIGE este potrivită pentru fragmente de până la 200
kpb. Vezi Gel electroforeza în câmp inversat (FIGE).
Fixarea gelului – Precipitarea moleculelor în gel pentru a preveni difuzia și scăderea rezoluției.
Flux electroosmotic (EOF) - Fluxul de lichid într-un sistem de electroforeză, rezultat din grupările încărcate de
pe pereții aparatului.
Focalizare izoelectrică – O tehnică de electroforeză în care componentele proteice ale unei probe sunt separate
de-a lungul unui gradient de pH, în funcție de punctele lor izoelectrice (pI). Amfoliții sunt folosiți pentru crearea și
menținerea unui gradient de pH în focalizarea izoelectrică.
Front ionic – Un grup de ioni deplasându-se împreună în timpul electroforezei. Datorită mărimii mici, ei nu sunt
reținuți de matrița de sitare și se mișca împreună, în principal datorită sarcinii lor. Frontul ionic marchează mișcarea
soluției tampon dinspre sursa superioară de soluție tampon.
Gel – Mediul folosit pentru a separa și a stabiliza separarea biomoleculelor în electroforeză. În SDS-PAGE, gelul
servește ca matriță de cernere.
Gel de concentrare – Un gel în care porii rețelei sunt foarte mari și servesc, în principal, ca un mediu
anticonvectiv în faza inițială a unei electroforeze discontinue, în timpul procesului de concentrare; parte a unui gel de
electroforeză în sistem discontinuu care concentrează componentele unei probe pentru a crea o zonă de start foarte
îngustă. Benzile sunt apoi separate una de cealaltă în gelul de migrare.
 Gel de migrare – Un gel în care porii sunt suficient de mici astfel încât să aibă o acțiune de sitare moleculară,
care servește la separarea moleculelor probă; partea unui gel de electroforeză în sistem dicontinuu care separă
diferitele benzi între ele.
Gel de secvențiere – Un gel de electroforeză folosit în determinarea secvenței de acizi nucleici a unui fragment de
ADN.
Gel electroforeza în câmp inversat (FIGE) - Un tip de electroforeză în câmp pulsatoriu cu câmpuri electrice
alternante, orientate la 180o unul față de celălalt.
Gel electroforeză în câmp electric pulsatoriu omogen fixat (CHEF) - Un aranjament al electrozilor pentru
generarea unor câmpuri electrice omogene alternante, orientate la 120 o unul față de celălalt.
Gel electroforeză în câmp pulsatoriu (PFGE) - Metode pentru separarea moleculelor foarte mari de ADN,
folosind câmpuri electrice ale căror direcții alternează.
Gel electroforeză în câmp pulsatoriu cu electrod programabil controlat autonom (PACE) - Un aranjament al
electrozilor controlat pe computer pentru generarea de câmpuri alternante cu magnitudini și orientări variabile.
Gel în gradient – Un gel cu concentrația monomerului modificată treptat (%T) în direcția migrării. În SDS-
PAGE, gradientele sunt folosite pentru separarea moleculelor în domenii mai largi de masă moleculară decât pot fi
separate cu geluri omogene.
Glicerol – O moleculă mică, neionică. În gel electroforeza verticală, glicerolul este folosit pentru creșterea
densității tamponului probei, astfel încât acesta se fixează pe fundul godeului. Este folosit, de asemenea, pentru
menținerea proteinelor în stare solubilă, în special în focalizarea izoelectrică.
Godeu – Depresiunea dintr-un gel în care este încărcată proba pentru electroforeză. Proba migrează în afara
godeului până în gel, unde se separă în benzi individuale.
Imunoelectroforeză – Oricare din metodele în care antigenii sunt detectați folosind anticorpi, după o gel
electroforeză; o familie de metode bazate pe electroforeza proteinelor antigenice într-un gel conținând anticorpi, care
au ca rezultat precipitarea complexelor antigen-anticorp. Metodele obișnuite includ imunoelectroforeza tip rachetă,
imunoelectroforeza tip rachetă de fuziune, imunoelectroforeza 2-D, și imunoelectroforeza încrucișată.
Inițiator – Un reactiv care inițiază o reacție. (APS este folosit ca inițiator în polimerizarea acrilamidei). Vezi
Riboflavină, riboflavin-5’-fosfat
Legătură disulfurică – O legătură chimică care leagă 2 atomi de sulf în cadrul unei molecule mari. Reducerea
unei legături disulfurice duce la ruperea ei. Legăturile disulfurice sunt întâlnite în mod obișnuit în proteine și
contribuie la structura lor secundară și terțiară.
Legea lui Ohm – Relația dintre tensiune (V), curent (I) și rezistență (R), V=IR.
Matrice – Orice mediu folosit la separarea moleculelor. (Termenul este mai general decât gel. Vezi Gel).
Membrană – Suprafață sintetică, subțire, asemănătoare hârtiei, pe care sunt transferate biomoleculele în blotting.
Mobilitate - Viteza electroforetică de echilibru a unei particule încărcate pe unitate de câmp electric. /~ = v/E =
q/f, în cm2/V-sec, unde q este sarcina și f este coeficientul de frecare.
Monomer – O unitate care alcătuiește un polimer. (Acrilamida este un monomer care polimerizează în
poliacrilamidă).
Nativ – Natural. Neredus, nedenaturat.
Northern Blotting – vezi Blotting.
Ohm – O unitate de măsură a rezistenței.
PAGE nativ – (Electroforeză pe gel de poliacrilamidă nativă) Un tip de electroforeză a proteinelor, în care
proteinele se găsesc în starea lor nativă, nedenaturată, î n timpul separării. Utilizată de obicei pentru biomoleculele
care își vor pierde activitatea dacă sunt denaturate.
PDA – (Diacrilamidă piperazină) Un agent de reticulare folosit cu acrilamida. Conferă gelului mai multă
rezistență mecanică decât alți agenți de reticulare, produce un fundal mai mic la colorarea cu argint și previne
formarea cristalelor de uree când gelurile conținând uree sunt răcite.
Persulfat de amoniu (APS) – Un inițiator care generează radicali liberi, folosiți în polimerizarea acrilamidei.
pI – vezi Punct izoelectric
Pieptene – Un obiect folosit pentru a forma godeuri într-un gel de agaroză sau acrilamidă. Pieptenii cu dinți
pătrați sunt inserați în gel, înainte de polimerizare, pentru a forma godeuri cu fund pătrat. Pieptenii cu dinți ascuțiți au
dinți triunghiulari și sunt plasați deasupra gelului după polimerizare. Vârfurile dinților pieptenului separă probele
unele de celelalte. Pieptenii cu dinți ascuțiti sunt folosiți de obicei în gelurile pentru secvențiere.
Polimer – O moleculă alcătuită, în principal, din subunități repetitive.
Polimerizare – O reacție chimică în care molecule mici se combină pentru a forma molecule mai mari, care
conțin unități structurale repetitive, alcătuite din moleculele originale.
Punct izoelectric (pI) – Valoarea de pH la care o biomoleculă, o moleculă amfoterică, are sarcina netă zero.
Putere – Lucrul efectuat de un curent electric per unitate de timp (P=W/t). Este egală cu tensiunea înmulțită cu
curentul (P=VI), și este măsurată în watti. Puterea afectează generarea de căldură într-un sistem de electroforeză.
Radical liber – O moleculă reactivă cu un electron liber. Radicalii liberi sunt necesari în polimerizarea
acrilamidei.
Reacție endotermă – O reacție chimică care absoarbe căldură. (De exemplu, dizolvarea ureei în apă este o reacție
endotermă).
 Reacție exotermă – O reacție chimică care eliberează căldură. (De exemplu, polimerizarea acrilamidei este o
reacție exotermă).
Rezistență – Gradul la care un conductor, de exemplu un cablu sau un tampon de electroforeză, rezistă la fluxul
de curent. Rezistența se măsoară în ohmi și se reprezintă, de obicei, prin ‘R.’
Rezoluție - În electroforeză și cromatografie, rezoluția este definită ca (distanța dintre centrele a două benzi) /
(suma lățimii benzilor). Vezi Separare, vezi, de asemenea, textul pentru discuția despre distincția dintre rezoluție și
separare.
Riboflavină, riboflavin-5’-fosfat – Inițiatori în polimerizarea acrilamidei, care sunt activați în prezența luminii.
Sunt folosiți în geluri cu pH scăzut, cum sunt gelurile pentru focalizarea izoelectrică, având în vedere eficiența lor în
soluții acide. Riboflavin-5’-fosfatul este preferat riboflavinei datorită solubilității sale superioare.
Sarcină – Sarcina unei biomolecule este suma totală a tuturor sarcinilor sale pozitive și negative și este afectată de
diferența dintre pI a proteinei și valoarea pH a mediului său. Dacă valoarea pH este mai mică decât pI al moleculei,
atunci molecula are o sarcină pozitivă și este un cation ( și se va deplasa către catod). Dacă valoarea pH este mai mare
decât pI al moleculei, atunci molecula are o sarcină negativă si este un anion (si se va deplasa către anod).
Sarcină netă – Suma totală a sarcinilor pozitive și negative ale unei biomolecule.
SDS – (Dodecil sulfat de sodiu) Un detergent comun utilizat în electroforeză. Se leagă la proteine la intervale
regulate, conferindu-le raporturi sarcină:masă uniforme (negative).
SDS-PAGE – (Electroforeză pe gel de poliacrilamidă, în prezență de SDS) Un tip de electroforeză folosit la
separarea proteinelor pe baza masei moleculare. Proteinele sunt reduse și denaturate, iar SDS este folosit pentru a
conferi proteinelor un raport sarcină:masă uniform.
Separare - În cromatografie, distanța dintre centrele benzilor este definită ca separarea lor.
Sistem tampon continuu – Un sistem de gel electroforeză care folosește un singur tampon pe parcursul
sistemului pentru separarea probei, în opoziție cu un sistem discontinuu, care folosește tampoane diferite și uneori
geluri cu compoziții diferite în părți diferite ale sistemului, pentru a concentra si a separa componentele unei probe.
Într-un gel continuu, lățimea benzilor va fi proporțională cu concentrația probei din godeu.
Sistem tampon discontinuu – Un sistem de gel electroforeză care folosește soluții tampon diferite și uneori geluri
cu compoziții diferite, în părți diferite ale sistemului, pentru concentrarea și separarea componentelor unei probe.
Sistemele discontinue vor concentra proteinele în benzi mai înguste decât în cazul sistemelor continue, permițând
încărcarea unor cantități mai mari de proteină. Totuși, nivelul ridicat al concentrării poate cauza precipitarea din
soluție a proteinelor în sisteme native. Sistem de electroforeză în care diferiți ioni tampon sunt prezenți în părți diferite
ale sistemului. Uneori este numit și sistem multifazic.
Southern Blotting – Vezi Blotting.
Spațiatori – Setul de blocuri mici dintre cele doua plăci de sticlă, aflate de o parte și de alta a casetei gelului, care
creează un spațiu între plăcile de sticlă, în care se toarnă soluția de monomer pentru gelul placă.
Standard – O colecție de molecule cu proprietăți cunoscute, cum ar fi masa moleculară sau punctul izoelectric.
Standardele sunt folosite adesea pentru realizarea unor curbe standard, din care se poate determina masa moleculară
sau punctul izoelectric al unui compus necunoscut.
Stivă - Regiunea dintr-o electroforeză discontinuă în care ionii probei sunt concentrați electrochimic între
fronturile ionice conducătoare și urmăritoare.
Tampon de acoperire – O soluție tampon pusă deasuprea probei, în godeu. Se referă de asemenea la o soluție
tampon folosită deasupra acrilamidei, în timpul polimerizării.
Tamponul de migrare – Soluția tampon care asigură ionii pentru curentul electric, într-o electroforeză. Poate
conține, de asemenea, agenți denaturanți. Tamponul de migrare asigură ionii de urmărire într-o electroforeză
discontinuă.
Tamponul probei – Soluția tampon în care proba este suspendată înaintea încărcării. Tamponul probei în cazul
SDS-PAGE conține, de obicei, agenți denaturanți (incluzând agenți reducători și SDS), colorant de urmărire și
glicerol.
Tărie ionică – O măsură a concentrației ionice a unei soluții. Tăria ionică a unei soluții afectează rezistența sa
electrică.
TEMED – (N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamină) Un catalizator folosit pentru a activa APS în polimerizarea
acrilamidei.
Tensiune – Diferența de potențial electric între anod și catod. Tensiunea se măsoară în volți, și se reprezintă, de
obicei, prin ‘V.’
Valoarea Rf – Distanța relativă parcursă de o proteină, în comparație cu distanța parcursă de frontul ionic.
Valoarea Rf este folosită la compararea proteinelor din rânduri diferite și chiar din geluri diferite. Poate fi folosită cu
standarde pentru generarea de curbe standard, din care se poate determina masa moleculară sau pI a unei proteine
necunoscute.
Volt – O unitate de măsură pentru tensiune.
Watt – O unitate de măsură pentru puterea electrică.
Western Blotting – Vezi Blotting.
 Bibliografie generală

 Heftmann, E. Fundamentals and Techniques, Părţile 1-2.

http://books.google.ro/books?id=Eabm0QdI0t4C&pg=SL1-PA515&lpg=SL1-PA515&dq=Uriel+Berges+1966+
C+R+Acad+Sci&source=bl&ots=o2oh8XPcqI&sig=x-GaRgtZ7Zf0RtEj0BJIObFCe38&hl=ro&ei=UOMmTZaBIo6
gOru0yMsC&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=9&ved=0CF4Q6AEwCDge#v=onepage&q=Uriel%20Berge
s%201966%20C%20R%20Acad%20Sci&f=false
 Holloway, C. J., Trautschold I. Principles of isotachophoresis Fresenius' Journal of Analytical Chemistry 311:
81-93. http://www.wiley-vch.de/publish/en/books/ISBN3-527-31181-5
 Hrkal, Z. J. Chromatography Library Vol. 18, Electrophoresis: a survey of techniques and application, Part A,
techniques., Deyl, Z. ed, Everaerts, F. M., Prusík, Z., Svendsen P. J., coeds. Elsevier Scientific Publishing Company,
1979 http://books.google.ro/books?id=NsvzQ7Lqo8kC&pg=PA299&lpg=PA299&dq=preparative +electrophoresis
&source=bl&ots=_EX2T8s0ed&sig=3qRkREJyf5lj6-hZZda63YmXaoM&hl=ro&ei=SCA CTK__OJmXOKvo6NYE
&sa=X&oi=book_ result&ct=result&resnum=4&ved=0CC4Q6AEwAzgU#v=onepa ge&q=preparative%20
electrophoresis&f=false
 Menter, P. Acrylamide Polymerization-A Practical Approach. Bio-Rad Laboratories,
http://www.biocompare.com/Articles/ApplicationNote/1089/Acrylamide-Polymerization-%E2%80%94-A-Practical-
Approach.html
 Popescu, O. Electroforeza proteinelor in geluri de poliacrilamida. Popescu, O. V. Editor, Editura Tehnica, 1990.
 Popescu, O. Electroforeza, Editura Tehnică, Bucureşti, 1988.
 Walker, J. M. The protein protocols handbook. http://books.google.ro/books?id=ukWBDg7PtXwC&pg=P
A222&lpg=PA222&dq=Sheer+dg+BioTechniques+1990&source=bl&ots=4oyVEu8t_b&sig=KXlrM5ima9S1U0rA6
XT6ejEizsw&hl=ro&ei=cYQ9TeO8NpDvsgab7djzBg&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=2&ved=0CCAQ6
AEwAQ#v=onepage&q=Sheer%20dg%20BioTechniques%201990&f=false

Fig. 42: Schematic diagram of enhanced chemiluminescence plus biotin-streptavidin complexes, which
afford the highest detection sensitivity.
Vezi
Wirth&Romano

Burnette(2011): http://www.clinchem.org/content/57/1/132.full.pdf+html
Buxbaum, E. Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins.
Vezi și Enhanced Digital Imaging of Diaminobenzidene-Stained Immunoblots
Bibliografie finală
Alshawabkeh, A.N., Acar, Y.B. (1996) Electrokinetic Remediation. II: Theoretical Model. J. Geotechnical
Engineering 122:186–196.
Brubacher, M. G. (2008) The New Face of Electrophoresis: Modernization of a Workhorse Technology.
BioTechniques 44:568-570.
Bustin, S. A., Nolan, T. (2004). Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction.
J. Biomol. Tech. 15:155-166.
Casagrande, L. (1949) Electro-osmosis in soils. Géotechnique 1:159–177.
Cherblanc, F., Boscus, J., Bénet, J.-C. (2008) Electro-osmosis in gels: Application to Agar-Agar. C. R. Mecanique
336:782–787.
 Davis, B. J. (1964) Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad.
Sci. 121:404-427.
Devor, E. J. (2005) I D Tutorial: Gel Electrophoresis Integrated DNA Technologies.
www.idtdna.com/Support/Technical/.../Gel_Electrophoresis.pdf
Gingrich, J., Rubio, T., Kanlak, C. (2006) Effect of RNA degradation on data quality in quantitative PCR and
microarray experiments. Bio-Rad Bulletin 5452.
Hardy, W. B. (1899) On the coagulation of protein by electricity. J. Physiol. 24:288-304.
Hardy, W. B. (1905) Colloidal solution. The globulins. J. Physiol. 33:251-337.
Jacobasch, H.-J., Simon, F., Weidenhammer, P. (1998) Adsorption of ions onto polymer surfaces and its influence
on zeta potential and adhesion phenomena. Colloid Polym. Sci. 276:434-442.
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227:680-685.
Ornstein, L. (1964) Disc electrophoresis. I. Background and theory. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121:321-349.
Overbeek, J. T. G. (1977) Recent developments in the understanding of colloid stability. In M. Kerker, A. C.
Zettlemoyer, & R. L. Rowell (Eds.), Colloid and interface science (pp. 431–445) New York: Academic Press.
Pertsov, A.V., Zaitseva (Baum), E.A. (2008) Discovery of electrokinetic phenomena in Moscow University.
www.icc2008.ru/en/conference/plenary_en.pdf
Tiselius, A. (1937) A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. Trans. Faraday. Soc.
33:524.
Virkutyte, J. Sillanpää, M. Latostenmaa, P. (2002) Electrokinetic soil remediation—Critical overview. Sci. Total
Environ. 289:97–121.
Weber K., Osborn, M. (1969) The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 244:4406-4412.

http://xa.yimg.com/kq/groups/23271892/216370812/name/Curs_tehnici_2010.pdf