APLICACIONES DE MARCADORES MOLECULARES EN LA BIODIVERSIDAD Y EL MEJORAMIENTO DE PLANTAS

Manual de Prcticas del Mdulo de Biotecnologa Aplicada Utilizacin de Marcadores Moleculares en Estudios de la Diversidad Gentica de las Plantas Cultivadas y la Seleccin Asistida con Marcadores

rea Programtica de Biotecnologa Aplicada Carrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria Escuela Agrcola Panamericana / Zamorano

ESTRUCTURA Y FUNCIONES DE LA MOLCULA DE ADN (cido desoxirribonucleico)

INTRODUCCIN A partir de la definicin de la estructura del cido desoxirribonucleico (ADN), por Watson y Crick en 1953, y principalmente durante los ltimos veinte aos, la calidad, diversidad y magnitud de los avances en las ciencias biolgicas han sido dramticas. Entre otros, el desarrollo de tcnicas para la duplicacin sinttica del ADN ha permitido el estudio minucioso de esta molcula y del genoma de organismos inferiores y superiores. Ello ha resultado en un mayor conocimiento y entendimiento de la funcin de los genes y de los mecanismos que gobiernan su expresin; y de las propiedades que han hecho posible la ingeniera gentica como la conocemos en la actualidad, desde la duplicacin completa de organismos a partir de clulas individuales hasta el desarrollo de nuevos genomas mediante la introduccin de genes. Debido a que el impacto de estos avances no se limita a laboratorios ni publicaciones cientficas, sino que forman parte de la vida diaria de cada individuo, por ejemplo en forma de cultivos alimenticios genticamente modificados (transgnicos), es de vital importancia comprender los fundamentos cientficos que han permitido alcanzar estos logros. El estudio del ADN como la molcula fundamental de la existencia resulta primordial, principalmente en pases en vas de desarrollo donde el limitado acceso a la educacin superior demanda que los profesionales de las ciencias biolgicas puedan comprender y transmitir estos conocimientos al resto de la poblacin. ADN: EL MATERIAL GENTICO En la forma ms sencilla, el ADN puede describirse como la molcula de la vida. Es acarreado por todos los organismos con la excepcin de algunos virus, que contienen en su lugar ARN. Todas las clulas lo poseen en su ncleo, del que es el mayor constituyente, aunque tambin est presente en organelos como los cloroplastos y mitocondrias. Sus funciones principales pueden resumirse en que: 1) es el material hereditario universal; 2) por su capacidad de autoduplicacin, acarrea toda la informacin gentica que es transmitida de una generacin a otra y hace posible la diversidad; y 3) mediante su composicin gentica, basada en un cdigo simple de cuatro nucletidos, es capaz de dirigir la sntesis de protenas que definen la morfologa y fisiologa de los organismos. Las dos primeras funciones estn ntimamente relacionadas. El intercambio de ADN entre organismos es comn y resulta en individuos con caractersticas transmitidas por sus padres mediante la herencia, y a la vez con una nueva combinacin de caractersticas nicas, generando diversidad y promoviendo la evolucin. Las plantas y los animales transfieren el ADN a travs de la reproduccin sexual entre miembros de la misma especie; las bacterias lo hacen a travs del proceso de conjugacin; y los virus para su reproduccin a clulas hospederas en plantas, animales y bacterias. Por su importancia la tercera funcin, conocida como el Dogma Central de la Biologa Molecular, ser explicada ms adelante.
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ESTRUCTURA DEL ADN El ADN es un polmero largo y delgado, compuesto de dos hilos o cadenas entrelazadas de polinucletidos que existen en una orientacin opuesta (antiparalela), organizadas en una estructura de doble hlice. La caracterstica estructural ms importante del ADN, esencial para todas sus funciones biolgicas, es el apareamiento especfico entre sus cuatro bases complementarias: adenina con timina y guanina con citocina. Estas bases se encuentran en las molculas bsicas del ADN, llamadas nucletidos. Cada nucletido contiene un fosfato, un azcar, y una de las cuatro bases. El grupo azcar-fosfato se ubica de forma externa a lo largo de la molcula, y las bases nitrogenadas adheridas lo hacen hacia su interior. La adenina y guanina son molculas de anillos dobles y la citocina y timina de anillos simples, similares entre s, y son llamadas purinas y pirimidinas, respectivamente. Mientras la adenina y la timina se unen mediante dos puentes de hidrgeno, la citocina y la guanina lo hacen por medio de tres, lo que sugiere una mayor estabilidad estructural en las molculas de ADN conteniendo ms del segundo par de bases. La secuencia lineal de los nuclotidos en el ADN se conoce como secuencia de bases (Figura 1). Las implicaciones de la estructura de ADN incluyen las siguientes: 1) el cdigo lineal hace posible convertir la secuencia de nuclotidos de ADN en las secuencias de aminocidos en las protenas; 2) mediante el apareo complementario de bases, la molcula puede autoduplicarse; y 3) debido a la fineza de su estructura, pueden existir mutaciones genticas debido al intercambio de bases.

b. Nucletido

c. Apareo de bases complementarias a. Molcula de ADN

Figura 1. Estructura bsica de la molcula de ADN

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DUPLICACIN DE ADN La habilidad de los organismos biolgicos para reproducirse es la caracterstica que define la vida. En su nivel ms elemental, la reproduccin de los organismos vivos depende de la extraordinaria y nica capacidad de las molculas de ADN para dirigir su autoduplicacin de una forma ordenada. La definicin de la estructura de doble hlice del ADN sugiri un mecanismo para su autoduplicacin, en la que una cadena parental podra servir de patrn para la sntesis de una cadena hija. Aunque esta propuesta de duplicacin semiconservativa fue rpidamente confirmada, se requirieron muchos aos para esclarecer completamente los detalles complejos de este proceso. Durante la duplicacin del ADN, la molcula original se divide en sus dos cadenas parentales que sirven como patrn para la sntesis de una nueva cadena de ADN. Las bases en las cadenas parentales especifican el nucletido que ser incorporado a las cadenas en crecimiento por apareamiento complementario de bases, un requerimiento estricto impuesto por la estructura del ADN. Para ello, se asume que existen nuclotidos provenientes de un reservorio presente en las clulas, y que un iniciador de polimerizacin es sintetizado por enzimas especficas. El ligamiento de cada nuclotido a las cadenas en crecimiento es catalizado por la enzima ADN polimerasa. El crecimiento de una nueva cadena replicada de ADN comienza en regiones especiales del ADN llamadas orgenes de repeticin, y siempre ocurre mediante la adicin de nuevos nucletidos en la direccin de crecimiento 5 a 3 (Figura 2). La duplicacin del ADN se origina en sitios definidos de la molcula y procede de forma bidireccional, creando dos tenedores de duplicacin que se mueven en direcciones opuestas. Debido a los problemas impuestos por la orientacin antiparalela de las cadenas de ADN y la polaridad de su elongacin, el mecanismo de sntesis es diferente para las dos cadenas. La cadena principal se extiende de forma continua en la misma direccin del tenedor de duplicacin. En contraste la segunda cadena, que se elonga en direccin opuesta, es sintetizada de forma Figura 2. Modelo de autoduplicacin de discontinua en una serie de piezas pequeas que son una molcula de ADN. eventualmente ligadas.
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EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGA MOLECULAR El dogma central de la biologa molecular implica el origen, flujo y almacenamiento sistemticos de la informacin gentica en los organismos vivos. Se basa en la explicacin de cmo una secuencia de un hilo de ADN corresponde a la secuencia de aminocidos de una protena. Segn este concepto, la informacin en el ADN es transcrita al ARN, y de aqu traducida en protenas (Figura 3). Aunque esto pueda parecer un gasto innecesario de energa al pasar por un paso intermedio (ARN) en lugar de una traduccin directa de la secuencia de bases de un gen; existen varias razones que lo justifican: 1) el ADN puede conservarse puro y protegido en el ncleo, sin exponerse a los compuestos qumicos del citoplasma; 2) la informacin de los genes puede ser amplificada teniendo varias copias de ARN hechas a partir de una sola copia de ADN; y 3) la regulacin de la expresin de genes puede ser controlada especficamente en cada elemento involucrado en el proceso entre ADN y protenas. Entre ms elementos existan en este proceso, ms oportunidades habrn para controlarlos bajo diferentes circunstancias. Existen diferentes tipos de ARN con funciones especficas: ARN mensajero (mARN) Es la copia de un gen. Acta teniendo una secuencia de nucletidos complementaria a una cadena de ADN, es decir siendo idntica a la otra cadena. El mARN acarrea la informacin almacenada en el ADN nuclear al citoplasma, donde los ribosomas pueden convertirla en protenas. Constituye el 5% del ARN. ARN ribosomal (rARN) Es uno de los compuestos estructurales del ribosoma. Tiene una secuencia complementaria a regiones del mARN que permiten a ste reconocer donde ligarse al ribosoma para comenzar la sntesis de una protena. Constituye el 80% del ARN. ARN de transferencia (tARN) Es un pequeo ARN con estructuras secundarias y terciarias especficas para cada aminocido. Funciona como un adaptador

duplication

rRNA

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para acarrear los aminocidos al lugar apropiado en la sntesis de protenas, siguiendo la codificacin en el mARN. Constituye el 15% del ARN. Figura 3. Representacin del dogma central de la biologa molecular EL CDIGO GENTICO El mARN especifica las secuencias de aminocidos que conforman una protena mediante el cdigo gentico. Sera imposible que cada nucletido individual codificara para un aminocido, debido a su desproporcin (cuatro nucletidos y 20 aminocidos). De manera similar, la combinacin de dos nucletidos nicamente puede especificar para 16 aminocidos. La respuesta es que cada aminocido es especificado por una combinacin particular de tres nucletidos, llamada codn, los que adicionalmente codifican para sealar el inicio y fin de la sntesis de protenas (Figura 4). El cdigo gentico es una serie de codones que especifican los aminocidos necesarios para sintetizar protenas especficas.
Segunda Posicin C A

G U

Figura 4. Cdigo gentico para la sntesis de aminocidos a partir de secuencias de nucletidos en el ADN.
Primera Posicin

Fenilalanina
U

Tirosina Serina

Cistena Alto
2

C A G U

Leucina

Alto2

Triptofano

Histidina
C

C Arginina G A U Tercera Posicin

Leucina

Prolina Glutamina

Isoleucina
A

Asparagina Treonina

Serina

C G

Metionina1

Lisina cido Asprtico

Arginina

A U C

Valina

Alanina

cido Glutmico

Glicina

G A

1 2

Todas las protenas empiezan con metionina Seal para terminar de sintetizar una protena

GENES Y GENOMA El gen es la unidad bsica de la herencia. Es la unidad funcional del ADN, responsable de codificar para la sntesis de protenas. Consiste en una cadena de ADN que est organizada en una unidad estructural y
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gentica mucho ms grande y compleja conocida como cromosoma. A nivel de organismos, la expresin de los genes confiere sus caractersticas fenotpicas. A nivel bioqumico, cuando un gen es expresado dirige la sntesis de una molcula de ARNm que acta como horma o molde en la que la protena es sintetizada, en una funcin estricta y finamente regulada. Generalmente, cada gen dirige la sntesis de una protena. Los organismos despliegan elaborados mecanismos tanto para detener la expresin de genes cuando sus productos no son necesarios, como para encenderlos cuando sus productos son necesarios bajo condiciones especficas. Uno de los elementos claves involucrados en la expresin de genes es el promotor, una pequea secuencia de ADN que est frente a los genes que debe ser reconocida para la sntesis de protenas. La informacin gentica completa de un organismo se conoce como genoma. Esto implica que el genoma contiene la informacin necesaria para la construccin y organizacin de todas las estructuras celulares y la ejecucin de las funciones de un organismo. El tamao del genoma corresponde al nmero total de pares de bases en su ADN y es proporcional a la complejidad fenotpica del organismo. Se ha estimado que las plantas poseen entre 10,000 y 100,000 genes, segn la complejidad de la planta y que aunque estos tienen diferente longitud, la mayora posee varios miles de pares de bases. Sin embargo, menos del 15% del genoma contiene secuencias que codifican para la sntesis de protenas. Estas secuencias son llamadas exones, y entre ellos se encuentran secuencias que no contienen regiones codificantes, llamadas intrones. Algunas de estas secuencias son reguladoras, necesarias para llevar a cabo la expresin de la informacin gentica.

REFERENCIAS Y LECTURAS RECOMENDADAS CIAT. 1999. Gentica molecular para el mejoramiento y caracterizacin de la biodiversidad. 37 p. Handelsman, J.; Houser and H. Kriegel. 1998. Biology brought to life: a guide to teaching students to think like scientists. Univ. of Wisconsin Madison. 259 p. Rosas, J.C. 1999. Conceptos bsicos de gentica y biologa molecular de plantas. EAP/Zamorano. 29 p. Watson, J.D.; F.H.C. Crick. 1953. Molecular Structure of Nucleic Acids: A structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 171 (4356): 737-738.

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REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La reaccin en cadena de la polimerasa ha transformado la biologa molecular extendiendo su capacidad de identificar, manipular y reproducir el ADN. Hace abundante lo que una vez fue escaso el material gentico requerido para la investigacin. Paul Ravinow Making PCR, A Story of Biotechnology, University of Chicago Press, 1996 INTRODUCCIN Una tcnica revolucionaria desarrollada gracias al entendimiento de la molcula de ADN, fue su duplicacin mediante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, por Polymerase Chain Reaction). Las aplicaciones desarrolladas a partir de su manejo pblico son innumerables, y su contribucin a los avances en las ciencias biolgicas es invaluable. Una tcnica derivada de este procedimiento es el polimorfismo del ADN amplificado al azar (RAPD, por Random Amplified Polymorphic DNA), en la que la separacin y visualizacin de segmentos de ADN hacen posible la caracterizacin molecular de genomas individuales, y en consecuencia de grupos de individuos formando poblaciones. Esta tcnica ha servido de base para nuevas tcnicas cuya principal caracterstica es una mayor precisin, entre ellas el uso de regiones amplificadas de secuencia caracterizada (SCAR, por Sequence Characterized Amplified Regions). REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Desarrollada por Mullis en 1983, la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica para la duplicacin enzimtica in vitro de fragmentos especficos de ADN. Se basa en propiedades del ADN que hacen posible su duplicacin natural. Cuando la molcula de ADN es calentada sobre cierta temperatura, los puentes de hidrgeno que unen las cadenas complementarias se rompen para desnaturalizar la molcula en cadenas sencillas. Debido a que este proceso es reversible, cuando la solucin en que se encuentra el ADN es enfriada las cadenas complementarias se encuentran y reasocian en la molcula de doble cadena, mediante el apareo especfico de bases. La reaccin del ADN a los cambios de temperatura y la especificidad de su proceso de reacoplamiento son mecanismos necesarios para la PCR. Para efectuar la reaccin son necesarios una horma o molde original de ADN, cebadores o iniciadores de hibridacin, una enzima catalizadora y bases nitrogenadas libres, los que presentan las siguientes caractersticas y/o funciones: Horma o molde de ADN: provee la informacin gentica de inters (p.e.; secuencias ligadas a resistencia a enfermedades o a la adaptacin a condiciones ambientales adversas) que desea amplificarse para lograr su visualizacin.

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Cebadores (iniciadores o primers): fragmentos sintticos de ADN con una secuencia de bases nitrogenadas especfica y conocida, que se acoplan a segmentos complementarios en las cadenas individuales de ADN para comenzar el proceso de hibridacin de las bases nitrogenadas en el fragmento de ADN requerido. Enzima catalizadora: la Taq-polimerasa, enzima proveniente de Thermus aquaticus, elonga los cebadores. Es una polimerasa termoestable aislada de la bacteria termoflica. Bases nitrogenadas libres: bases en forma de deoxinucletidos trifosfatos (dNTPs) utilizadas para extender la nueva cadena de ADN mediante su acoplamiento a la original por accin de la Taqpolimerasa. Todos estos elementos se acoplan en el siguiente proceso (Figura 5): La molcula original o molde de ADN en una mezcla con los cebadores, la Taq-polimerasa y las bases nitrogenadas, es sometida a alta temperatura (90-95C) para su completa desnaturalizacin por la ruptura de las uniones de hidrgeno. Este paso es conocido como desnaturalizacin. Separadas las bandas, la mezcla es enfriada (55-72C) para que los cebadores se acoplen o hibridicen a la secuencia complementaria en cada una de las cadenas de ADN. Este paso se le conoce como acoplamiento. Una vez acoplados los cebadores, la mezcla se somete a un ligero incremento de la temperatura (generalmente 72 C) para que la Taq-polimerasa los extienda sobre la horma de ADN mediante la adicin de las bases nitrogenadas libres, con el fin de sintetizar la nueva cadena amplificando las regiones de ADN de inters. A este paso se le llama elongacin.

94C Cadena doble de ADN Calentar para separar cadenas de ADN

Cadenas simples de ADN Repetir ciclo

Hacer nuevamente cadena doble de ADN

66C

Acoplamiento de iniciadores

Polimerizacin ADN 72C

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Figura 5. Secuencia de los pasos en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa. La eficacia de la PCR est definida por su especificidad, eficiencia y fidelidad. Su automatizacin es posible gracias a un aparato llamado termociclador, en el que ocurren las series de calentamiento y enfriamiento sucesivos y cclicos de las temperaturas especficas requeridas por tiempos determinados, llamados perfiles o ciclos trmicos (Figura 6). Todo el conjunto permite la multiplicacin exponencial del ADN original y de cada una de las nuevas cadenas resultantes. Despus de 20 ciclos de PCR, el segmento deseado puede haber sido amplificado 1 milln de veces (Figura 7). Ciclo 1 Desnaturalizacin Ciclo 2

Figura 6. Perfil trmico en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa. Los componentes fsicos, qumicos y trmicos involucrados en la PCR pueden ser modificados para optimizar el producto deseado. Entre los ltimos, las consideraciones generales para estos cambios son las siguientes: Desnaturalizacin: la desnaturalizacin incompleta por temperatura o tiempo insuficientes, permite el reacoplamiento de las cadenas y por ende, la disminucin del producto de amplificacin. Por otro lado, pasos largos de desnaturalizacin producen prdida en la actividad de la Taq-polimerasa. Acoplamiento: probablemente la temperatura en este paso es el factor ms crtico para la optimizacin de la PCR. Si la temperatura es muy alta no hay apareamiento, y si es muy baja estos no son especficos. La temperatura y tiempo de apareamiento depende de la composicin de las bases, y de la longitud y concentracin de los cebadores. Elongacin: el tiempo de elongacin depende de la longitud de la secuencia y de la temperatura.

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Te mpe ratu ra (C )

Elongacin

Acoplamiento

Tiempo (min)

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Nmero de ciclos: cuando los otros parmetros estn optimizados, el nmero de ciclos depende de la concentracin de ADN. Un nmero muy alto puede incrementar la cantidad y complejidad de productos no especficos, y pocos ciclos puede disminuir la cantidad de producto deseado.

Figura 7. Productos de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa.

La aplicacin de la PCR se extiende a reas tan diversas como la sistemtica, ciencia forense y biologa molecular. En esta ltima, su uso incluye la deteccin de polimorfismos, secuenciacin, y anlisis de libreras genticas entre otros. La tcnica constituye la base de nuevos mtodos de anlisis molecular,
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como los RAPD (ADN polimrfico amplificado al azar), SCAR (regiones amplificadas de secuencia caracterizada), AFLP (polimorfismo del largo de los fragmentos amplificados), microsatlites (repeticiones de secuencias simples), etc.

MARCADORES MOLECULARES Los marcadores son caracteres que se pueden usar directa o indirectamente para obtener informacin sobre la gentica de caracteres de inters de un organismo en estudio. Se pueden detectar a diferentes niveles incluyendo el morfolgico (color de la flor), bioqumico (protenas, isoenzimas) y molecular (ADN). A diferencia de los primeros, los marcadores moleculares no son afectados por el ambiente y no varan con la edad de la planta. Pueden ser regiones codificantes (exones), aunque la mayora de los polimorfismos ocurren en regiones no codificantes (intrones). La biologa molecular ha evolucionado incesantemente en el desarrollo de nuevas tcnicas para el uso de diferentes tipos de marcadores moleculares, cada vez ms complejos y especficos, en las ciencias biolgicas. En trminos generales, para el uso eficaz de los marcadores en estudios de biodiversidad y en el fitomejoramiento se debe considerar: 1) la base gentica del polimorfismo revelado; 2) los aspectos tcnicos del mtodo; y 3) las ventajas y limitaciones implcitas. Marcadores tipo RAPD Entre las primeras tcnicas moleculares generadas utilizando la PCR, se encuentra el uso de los marcadores de ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD, siglas en ingls de Ramdom Amplified Polymorphic DNA). Esta tcnica slo utiliza un cebador pequeo (6-10 pares de bases, pb), de secuencia arbitraria con 50-80% del par guanina-citocina. Se basa en que la secuencia corta del cebador tiene ms posibilidades de encontrar varios sitios complementarios en el genoma, originando la amplificacin simultnea y varios fragmentos. El nmero de fragmentos amplificados depende de la concentracin y secuencia de bases en el ADN molde, de la longitud del cebador, y de la temperatura de acoplamiento. El proceso consiste en el apareamiento aleatorio del cebador al molde de ADN en dos sitios, uno en cada cadena complementaria, y la amplificacin del fragmento entre estos sitios mediante la PCR. Los fragmentos obtenidos (bandas entre 200-3,000 pb) son identificados por su tamao, determinado por la distancia entre los dos sitios de acoplamiento. El polimorfismo entre individuos puede deberse a cambios en una sola base, en la secuencia de uno o ambos sitios de acoplamiento o de los fragmentos amplificados entre ellos. Las ventajas de estos marcadores son que 1) existe un juego universal de cebadores que puede ser usado en todas las especies; 2) no requiere de sondas, radioactividad ni del conocimiento de la secuencia del cebador; 3) el proceso puede ser automatizado; 4) requiere de pequeas cantidades del ADN original (525 ng) y 5) es una tcnica de bajo costo. Sin embargo, su mayor desventaja consiste en la baja repetibilidad de los resultados obtenidos. Las aplicaciones de estos marcadores incluyen el mapeo gentico, marcaje de genes, informacin filogentica, diversidad taxonmica y gentica.

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Marcadores tipo SCAR Los marcadores de regiones amplificadas de secuencia caracterizada (SCAR,siglas en ingls de Sequence Characterized Amplified Regions) son fragmentos de ADN amplificados mediante la PCR. Utiliza cebadores especficos de 20-30 pb diseados a partir de secuencias establecidas mediante marcadores RAPD ligados a una caracterstica de inters. Sin embargo, debido a que el cebador es ms largo, este tipo de marcador no tiene el problema de baja repetibilidad encontrado en los RAPD. Sus principales ventajas son que 1) requiere bajas cantidades del ADN original (10-100 ng por reaccin); 2) son fciles de manipular; 3) se puede identificar bandas a nivel de loci y alelos; 4) los resultados son altamente reproducibles; y 5) son factibles de ser automatizados. Su principal desventaja radica en que se requiere la secuencia de bases para la construccin del cebador. Estos marcadores han sido ampliamente utilizados en el mapeo gentico y en la seleccin asistida por marcadores (SAM). REFERENCIAS Y LECTURAS RECOMENDADAS

CIAT. 1999. Gentica molecular para el mejoramiento y caracterizacin de la biodiversidad. 37 p. Mullis, K.B. Reaccin en Cadena de la Polimerasa. 8 p.

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Diagrama de las prcticas con marcadores moleculares

RAPD
EXTRACCIN ADN
(Mtodo UW-Madison) (Prctica 1)

SCAR
EXTRACCIN ADN
(Mtodo CIAT) (Prctica 7)

CUANTIFICACIN ADNZ
(Fluormetro) (Prctica 2)

CUANTIFICACIN ADNZ
(Fluormetro) (Prctica 8)

DILUCIN ADN (30 ng/l) (Prctica 9)

AMPLIFICACIN ADN (15 l) DILUCIN ADN (4 ng/l)

(Prctica 3) (Termociclador) (Prctica 10)

AMPLIFICACIN ADN (20 l)

(Termociclador) (Prctica 4)

SEPARACIN ADNY
(Aparato electroforesis) (Prctica 5)

SEPARACIN ADNY
(Aparato electroforesis) (Prctica 11)

VISUALIZACIN ADNX
(Transiluminador) (Prctica 6)

VISUALIZACIN ADNX
(Transiluminador) (Prctica 12)

ZXY

El mtodo de cuantificacin, separacin y visualizacin de ADN es el mismo para los dos marcadores moleculares

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PRCTICA 1: Extraccin de ADN para el anlisis de RAPD (Mtodo de la Universidad de Wisconsin, UW Madison ) 1. Cosechar tejido fresco de plantas (6-8 mitades de hojas jvenes).
2.

Agregar 50 l del buffer de extraccin (PEX) en un tubo para microcentrfuga eppendorf de 1.5 ml. Macerar el tejido en el tubo usando una barra (pestle) de plexiglass de laboratorio. Agregar 450 l adicionales de buffer PEX y agitar el tubo en el vortex.

3. Lo ms pronto posible (antes de 1 hora), colocar los tubos con las muestras de tejido en bao mara a 65 C durante 30-60 min.
4.

Centrifugar la muestra durante 10 min a >14,000 RPM (alta velocidad) usando una microcentrfuga, para concentrar los residuos de tejido (pellet).

5. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5 ml limpio. Precipitar los cidos nucleicos llenando los tubos con una mezcla 6:1 de etanol:acetato de amonio 7.5 M. Mezclar invirtiendo los tubos y dejar precipitar por 30 min a temperatura ambiente. 6. Agitar los tubos manualmente para romper el precipitado. Peletear los cidos nucleicos precipitados, centrifugando las muestras a 3,000 RPM (baja velocidad) durante 10 min en una microcentrfuga.
7.

Eliminar el sobrenadante. Agregar a los tubos con los pellets 300 l de RNAasa A (concentracin de 100 g/ml) + buffer TEa 0.1X (juntas). Agitar los tubos manualmente y colocarlos a incubar en bao mara a 37 C por 1 hora.

8. Centrifugar las muestras a >14,000 RPM por 1 min (3 min si se desean muestras ms limpias), para peletizar los residuos de tejidos remanentes. 9. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio de microcentrfuga de 1.5 ml. 10. Precipitar el ADN llenando los tubos con una mezcla 10:1 de etanol:acetato de sodio 3 M. Mezclar invirtiendo los tubos y permitir que se precipiten a temperatura ambiente por un tiempo no mayor a 30 min. 11. Agitar bien los tubos manualmente para romper el precipitado, antes de proceder a peletearlo. Centrifugar las muestras por 5 min a 3,000 RPM para peletizar el ADN.

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12.

Vaciar el etanol/acetato de sodiob y lavar los pellets llenando los tubos con 70% etanol; agitar manualmente.

13. Colectar los pellets centrifugando por 15 segundos a 14,000 RPM. 14. Vaciar el etanol y secar los pellets invirtiendo los tubos sobre papel toalla (2-3 horas o de un da para el otro).
15.

Rehidratar los pellets agregando 100-200 l de buffer TE 0.1X (dependiendo de su tamao). Ayudar a disolverlos colocando los tubos en bao mara a 65 C durante 15 minutos. Almacenar las muestras de ADN en un congelador a -20 C. A partir de este paso es necesario medir la concentracin de ADN (ng/ml), con el fin de preparar las diluciones necesarias para efectuar las reacciones para su amplificacin.

16.

_________________
a b

Buffer TE (TRIS HCl 1 M, pH=7.5 ; EDTA 0.5 M, pH=8.0) Usar acetato de sodio 3H2O (pH 5.2, usando cido actico glacial).

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PRCTICA 2: Cuantificacin de ADN- Instrucciones para el uso del fluormetro Hoefer Pharmacia Biotech Inc. (ver Anexo 1)
1.

Colocar 2 ml de buffer de cuantificacin en un recipiente cbico (cuvette) limpio y calibrar el fluormetro a cero. Agregar 2 l de muestra de ADN al buffer cuantificador.

2.

3. Mover ligeramente el cubo para mezclar la muestra. 4. Colocar el cubo en la celda del fluormetro y leer la concentracin de ADN en ng/ml. 5. Vaciar el cubo, enjuagarlo con agua destilada, y airearlo un poco, antes de colocar la siguiente muestra. ______________ * Fluormetro: (Hoefer) TKO-100, ex + 365 nm, em + 460 nm * Buffer de cuantificacin: 10 l solucin para tincin concentrada + 100 ml buffer TNE 1X (pH=7.4)

PRCTICA 3: Dilucin de ADN (4 ng/ml) por el mtodo de la UW (ver Anexo 2)

1.

Agregar 100 l de buffer TE 0.1 X + Tartrazine en tubos eppendorf de 1.5 ml.

2. Agregar el volumen inicial de la muestra de ADN extrado de tejido, estimado mediante la frmula Vi= 400 / Ci - 4.
3.

Diluir las muestras en platos de 96 celdas con fondo redondeado (Microplate TM96, Polypropylene, MJ Research, INC.). Cubrir las celdas del plato con tapa selladora, y almacenarlo en el congelador (o refrigerador si se va a usar en los siguientes das). Guardar el resto de ADN en el congelador.

PRCTICA 4. Amplificacin de ADN mediante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando cebadores tipo RAPD 1. Descongelar el ADN a temperatura ambiente del plato con las muestras diluidas de ADN (4 ng/ l) guardados en el refrigerador. 2. Preparar la mezcla maestra de acuerdo a los volmenes de agua, buffer 5X, cebador (primer), dNTPs y Taq polimerasa especificados en el cuadro anexo. 3. Colocar 10 l de la mezcla maestra por cada celda en platos con fondo V. Agregar 10 l de ADN de cada muestra. 4. Colocar el plato en el termociclador y sellarlo con papel plstico para platos de 96 celdas (Microseal TM A Film) antes de cerrar la tapa. 5. Realizar la amplificacin usando el perfil trmico para RAPD (UW-Madison). 6. Una vez finalizadas las reacciones PCR, guardar los platos con las muestras en el refrigerador hasta proceder a la electroforesis.

Mezcla de reaccin para amplificar marcadores moleculares tipo RAPDs. Componente Agua Buffer (5 X) dNTPs (10 mM c/u) + Mg Cl2 Cebador (10 M) Taq-polimerasa (5U/ l) ADN (4ng/ml) Volumen final 1 reaccin ( l) 4.44 4.40 0.80 0.80 0.70 10.00 20.00 X reacciones ( l)

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PRCTICA 5: Protocolo para la amplificacin de ADN usando marcadores tipo RAPD (Mtodo de la UW) Perfil trmico para la PCR usando marcadores tipo RAPD N 1 Paso Desnaturalizacin (denaturation) Acoplamiento (annealing) Elongacin (polimerization) Desnaturalizacin Acoplamiento Elongacin Elongacin final Temperatura (C) 91 42 72 91 42 72 72 Tiempo 60 seg 15 seg 70 seg 15 seg 15 seg 70 seg 4 min Ciclos 2 2 2 38 38 38 1

Perfil de programacin del termociclador para la PCR de marcadores tipo RAPD N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Paso (step) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Temperatura (C) 91 42 72 91 42 72 72 4 final Tiempo (hh:mm:ss)/ciclo 00:01:00 00:00:15 00:01:10 1 vez al Paso 1 00:00:15 00:00:15 00:01:10 37 veces al Paso 5 00:04:00 00:00:00

PRCTICA 6: Electroforesis de ADN Preparacin de geles (gelatinas) al 1% de agarosa 1. Agregar 170 ml de buffer TBE 0.5X + 1.7 g de agarosa en un Erlenmeyer, para bandejas de 22 orificios; 320 ml de buffer TBE 0.5X + 3.2 g de agarosa, para bandejas de 44 orificios.
2.

Colocar el Erlenmeyer (con uno ms pequeo invertido en su boca) en un horno microondas por 3 min. Retirar el erlenmeyer, agitarlo levemente y colocarlo de nuevo en el horno microondas por 1 min. (usar guantes resistentes al calor).

3. Retirar el Erlenmeyer del microondas y colocarlo en una bandeja con agua para enfriar la mezcla de agarosa/TBE buffer. Verificar la temperatura introduciendo un termmetro en el erlenmeyer. Cuando la temperatura baje a 60 C, agregar 2 l de bromuro de etidio (170 ml para 22 orificios 320 ml para 44 orificios), y vaciar la solucin de agarosa y buffer TBE en una bandeja de electroforesis para correr muestras. Colocar los peines de inmediato y dejar solidificar por 30-40 minutos. __________________________
4.

* Agarosa de pureza normal gelatinisa a 36-42 C. * Buffer TBE (Trisborate), ver gua de preparacin de reactivos y enzimas. * Para detalles del porcentaje de agarosa, revisar manuales; ste vara de acuerdo a las caractersticas de las muestras (ADN, protenas, etc.), el tamao del gel, el equipo de electroforesis y otros factores.

Electroforesis Colocar 20 l de cada muestra de ADN amplificado en cada orificio del gel. Dejar correr las muestras en el aparato de electroforesis por una hora a 140 V 3. Transferir la gelatina al transiluminador, usando guantes de latex desechables. 4. Revisar el nivel de tincin de las bandas en el transiluminador de luz UV. 5. Fotografiar las gelatinas.
1. 2.

_______________________
* El bromuro de etidio es altamente cancergeno. * Proteger los ojos y piel de los rayos UV, usando el equipo apropiado al visualizar y fotografiar la gel en el transiluminador. * Para detalles del voltaje y tiempo de la electroforesis, revisar manuales. Estos varan de acuerdo al tamao del gel, el equipo de electroforesis, la estabilidad del voltaje y otros factores.

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PRCTICA 7: Extraccin de ADN para el anlisis de SCAR (Mtodo del Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT) 1. Cosechar tejido fresco de plantas (hojas jvenes) para la extraccin del ADN.
2.

Agregar 40 l de hidrxido de sodio (NaOH 0.25 M) en un tubo eppendorf de 1.5 ml. Calentar a bao mara las muestras a 100 C por 30 segundos. Macerar el tejido suavemente en el tubo usando una barra (pestle) de plexiglass de laboratorio. Agregar 40 l de cido clorhdrico (HCl 0.25 M) y 20 l Tris cido clorhdrico (Tris HCl 0.5 M).

3. 4.

5. Colocar los tubos con muestras de tejido en bao mara a 100 C por 2 min. 6. Diluir las muestras extradas de ADN en agua destilada estril, usando una relacin de 1:1. 7. Medir las concentraciones de ADN (ng/ml); si es necesario, diluir previo a su amplificacin. 8. Almacenar las muestras de ADN en un congelador a -20 C.

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PRCTICA 8: Cuantificacin de ADN (instrucciones para el uso del fluormetro Hoefer Pharmacia Biotech Inc.)
6.

Colocar 2 ml de buffer de cuantificacin en una cubeta (cuvette) limpia y calibrar el fluormetro a cero. Agregar 2 l de muestra de ADN al buffer cuantificador.

7.

8. Mover ligeramente el cubo para mezclar la muestra. 9. Colocar el cubo en la celda del fluormetro y leer la concentracin de ADN en ng/ml. 10. Vaciar el cubo, enjuagarlo con agua destilada, y airearlo un poco, antes de colocar la siguiente muestra. ______________ * Fluormetro: (Hoefer) TKO-100, ex + 365 nm, em + 460 nm * Buffer de cuantificacin: 10 l solucin para tincin concentrada + 100 ml buffer TNE 1X (pH=7.4)

PRCTICA 9: Dilucin de ADN (20 ng/ml) por el mtodo de la UW

1. 2.

Agregar 100 l de buffer TE 0.1 X + Tartrazine en tubos eppendorf de 1.5 ml. Agregar el volumen inicial de la muestra de ADN extrado de tejido, estimado mediante la frmula Vi= 2000 / Ci - 20. Diluir las muestras en platos de 96 celdas con fondo redondeado (Microplate TM96, Polypropylene, MJ Research, INC.). Cubrir las celdas del plato tapa selladora, y almacenarlo en el congelador (o refrigerador si se va a usar en los siguientes das). Guardar el resto de ADN en el congelador.

3.

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PRCTICA 10: Amplificacin de ADN mediante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando cebadores tipo SCAR 1. Descongelar el ADN a temperatura ambiente del plato con las muestras diluidas de ADN guardados en el refrigerador.
2.

Realizar los clculos pertinentes para preparar la mezcla de reaccin, segn el cuadro anexo.

3. Preparar la mezcla de reaccin sin incluir las muestras de ADN.

4.

Colocar 13 l de la mezcla de reaccin a cada celda del plato, luego agregar 2 l de muestra de ADN. Tapar con papel plstico (Microseal TM A) la caja de reaccin (platos de 96 celdas).

5.

6. Colocar el plato en el termociclador y amplificar con el perfil trmico para SCAR (Universidad de Puerto Rico). 7. Una vez finalizada la amplificacin, guardar los platos con las muestras en el refrigerador hasta proceder a la electroforesis Mezcla de reaccin para la amplificacin del marcador SCAR para el gen bgm-1. Componente Agua Buffer (5 X) dNTPs (4 mM c/u) + Mg Cl2 Cebador DOR 21 A (10 M) Cebador DOR 21 B (10 M) Taq-polimerasa (5 U/ l) ADN (20 ng/ml) Volumen final 1 reaccin ( l) 9.0 2.0 0.7 0.3 0.3 0.7 2.0 15.0 X reacciones ( l)

PRCTICA 11: Protocolo para la amplificacin de ADN usando el marcador SCAR para el gen bgm-1 (Mtodo Universidad de Puerto Rico1) Perfil trmico para la PCR del SCAR bgm-1 N 1 2 Paso Desnaturalizacin (denaturation) Desnaturalizacin (denaturation) Acoplamiento (annealing) Elongacin (polimerization) Elongacin final Temperatura (C) 94 94 60 72 72 Tiempo 30 seg 1 min 1 min 3 min 5 min Ciclos 1 35 35 35 1

Perfil de programacin del termociclador para la PCR del SCAR bgm-1 N 1 2 3 4 5 6 7 8 Paso (step) 1 2 3 4 5 6 7 8 Temperatura (C) 94 94 60 72 72 4 Final Tiempo (hh:mm:ss)/ciclo 00:00:30 00:01:00 00:01:00 00:03:00 34 veces al Paso 1 00:05:00 00:00:00

BEAVER, J. 1999. SCARs. Puerto Rico, Universidad de Puerto Rico (Comunicacin personal).

PRCTICA 12: Electroforesis de ADN Preparacin de geles (gelatinas) al 1% de agarosa 5. Agregar 170 ml de buffer TBE 0.5X + 1.7 g de agarosa en un Erlenmeyer, para bandejas de 22 orificios; 320 ml de buffer TBE 0.5X + 3.2 g de agarosa, para bandejas de 44 orificios.
6.

Colocar el Erlenmeyer (con uno ms pequeo invertido en su boca) en un horno microondas por 3 min. Retirar el Erlenmeyer, agitarlo levemente y colocarlo de nuevo en el horno microondas por 1 min. (usar guantes resistentes al calor).

7. Retirar el erlenmeyer del microondas y colocarlo en una bandeja con agua para enfriar la mezcla de agarosa/TBE buffer. Verificar la temperatura introduciendo un termmetro en el erlenmeyer. Cuando la temperatura baje a 60 C, agregar 2 l de bromuro de etidio (170 ml para 22 orificios 320 ml para 44 orificios), y vaciar la solucin de agarosa y buffer TBE en una bandeja de electroforesis para correr muestras. Colocar los peines de inmediato y dejar solidificar por 30-40 minutos. __________________________
8.

* Agarosa de pureza normal gelatinisa a 36-42 C. * Buffer TBE (Trisborate), ver gua de preparacin de reactivos y enzimas (Anexo 11). * Para detalles del porcentaje de agarosa, revisar manuales; ste vara de acuerdo a las caractersticas de las muestras (ADN, protenas, etc.), el tamao del gel, el equipo de electroforesis y otros factores.

Electroforesis Colocar 15 l de cada muestra de ADN amplificado en cada orificio del gel. Dejar correr la electroforesis por una hora a 140 V 8. Transferir la gelatina al transiluminador, usando guantes de latex desechables. 9. Fotografiar las gelatinas.
6. 7.

_______________________
* El bromuro de etidio es altamente cancergeno. * Proteger los ojos y piel de los rayos UV, usando el equipo apropiado al visualizar y fotografiar la gel en el transiluminador. * Para detalles del voltaje y tiempo de la electroforesis, revisar manuales. Estos varan de acuerdo al tamao del gel, el equipo de electroforesis, la estabilidad del voltaje y otros factores.

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GUA PARA PREPARAR REACTIVOS Y ENZIMAS (ver Anexo 3) 1 Extraccin de ADN (UW-Madison) EDTA 0.5 M (pH 8.0), (100 ml)

Pesar 18.612 g. de EDTA-Na2.2H2O (cido Etilendiaminotetractico Disdico) en un beaker de 150 ml, agregar con una probeta 80 ml de agua destilada, disolver completamente. Regular el pH a 8.0 usando el potencimetro, agregando gotas de NaOH 10N y mezclando perfectamente despus de cada adicin. Transferir la solucin a un frasco volumtrico de 100 ml y completar el volumen con agua destilada. Agitar y transferir nuevamente al beaker, y verificar el pH deseado. Transferir la solucin a un frasco color mbar (opaco) y guardar en el refrigerador.

BUFFER PEX (250 ml) 50 ml de TRIS HCl 1 M (pH 7.5) 10 ml de EDTA 0.5 M (pH 8.0), 20.44 g de NaCl (Cloruro de Sodio) 25 g de PEX (Etil xantogenato de potasio) ... ml de agua (18 Megohm) ---------------------------------------250 ml volumen final Preparacin: Pesar los reactivos slidos en beakers de vidrio de 100 ml, disolverlos con la cantidad necesaria de agua pura (18 Megohm). Transferirlos a un frasco volumtrico de 250 ml. Agregar los reactivos lquidos a la mezcla anterior, usando pipetas volumtricas. Completar el volumen final con agua (18 Megohm). Mezclar bien, transferir a un frasco de vidrio mbar y guardarlo en el refrigerador. ETANOL : ACETATO DE AMONIO 7.5 M (6:1), (490 ml) Medir 420 ml de etanol en una probeta graduada de 500 ml. Medir 70 ml de acetato de amonio 7.5 M, en una probeta graduada de 100 ml. Mezclar en un frasco mbar y guardarlos en el refrigerador. ETANOL : ACETATO DE SODIO TRIHIDRATADO 3 M (10:1), (495 ml) (pH 5.2, con cido actico glacial) Medir 450 ml de etanol en una probeta graduada de 500 ml. Medir 45 ml de 3M acetato de sodio trihidratado, pH 5.2. Mezclarlos en un frasco mbar y guardarlos en el refrigerador. _______________________________ 1 NOTA: Al momento de medir los volmenes de las soluciones que han estado refrigeradas, stas deben estar a temperatura ambiente.
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BUFFER TE 0.1X (1L) TRIS HCl 1 M (pH 7.5) y EDTA 0.5 M (pH 8.0) Preparacin:

Mezclar en un frasco volumtrico de 1L, 1 ml (1000 L) de TRIS Cl 1 M (pH 7.5) + 0.2 ml (200 L) de EDTA 0.5 M (pH 8.0) Completar el volumen con agua destilada, agitar y guardar en frasco mbar en refrigeracin.

RNAasa A + BUFFER TE 0.1X (100 g de RNAasa A/ml de buffer) (500 ml)

Disolver 0.5 g. de ribonucleasa A (RNAasa) en 500 ml de buffer TE 0.1X en un frasco volumtrico (1000 g de RNAasa A/ml de buffer). En un frasco volumtrico, diluir 50 ml de la solucin (concentrada de 1000 g/ml) con buffer TE 0.1X hasta la marcade 500 ml. Guardar en un frasco mbar en refrigeracin.

Extraccin de ADN (CIAT) Hidrxido de Sodio (NaOH), 0.25 M (100 ml) Medir con una pipeta volumtrica 2.5 ml de NaOH (10 M). Transferir a un frasco volumtrico de 100 ml, completar el volumen con agua destilada, y agitar para mezclar bien. Transferir la solucin a un frasco color mbar y guardar en el refrigerador.

Acido Clorhdrico (HCl), 0.25 M (100 ml) Medir con una pipeta volumtrica 25 ml de H Cl (1M). Transferir a un frasco volumtrico de 100 ml, completar el volumen con agua destilada, y agitar para mezclar bien. Transferir la solucin a un frasco color mbar y guardar en el refrigerador.

TRIS cido clorhdrico (TRIS HCl), 0.5 M (100 ml) Medir con una probeta 50 ml de Tris H Cl (1 M). Transferir a un frasco volumtrico de 100 ml, completar el volumen con agua destilada, y agitar para mezclar bien. Transferir la solucin a un frasco color mbar y guardar en el refrigerador.

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Cuantificacin de ADN (UW-Madison) BUFFER TNE 10X, pH 7.4 (1000 ml)

Pesar 12.1 g de TRIS Base, 3.7 g de EDTA-Na2 y 58.4 g de NaCl. Disolver en 800 ml de agua destilada en un beaker de 1 litro. Regular el pH a 7.4 usando el potencimetro, adicionando HCl concentrado y mezclando bien despus de cada adicin. Transferir la solucin a un frasco volumtrico y completar el volumen con agua destilada hasta la marca de 1 litro. Transferir nuevamente el beaker y corroborar el pH; agregar HCl si fuera necesario. Guardar la solucin en un frasco mbar en refrigeracin.

BUFFER TNE 1X, pH 7.4 (500 ml) Medir 50 ml de buffer TNE 10X con una pipeta volumtrica. Transferirlo a un frasco volumtrico y completar el volumen con agua destilada hasta la marca de 500 ml.

SOLUCIN CONCENTRADA DE TINTURA (dye) (100 ml) Disolver 100 mg de tintura (dye) (Hoechst 33258, Pharmacia) en 100 ml de agua destilada, usando un frasco volumtrico. Guardar en un frasco mbar en refrigeracin.

BUFFER DE CUANTIFICACIN (100 ml)

Mezclar 10 L de la solucin concetrada de tintura y 100 ml de buffer TNE 1X, usando un frasco mbar. Guardar en refrigeracin. Dilucin de ADN (UW-Madison)

(BUFFER TE 0.1X + TARTRAZINE) (500 ml) A 500 ml de buffer TE 0.1X, agregar con la punta de una varilla de vidrio una pequea cantidad de tartrazine para obtener un color amarillo tenue. Mezclar bien y guardar en un frasco mbar en el refrigerador.

Reaccin para PCR- mezcla maestra (UW-Madison) BUFFER 5X (100 ml)

Medir con pipetas volumtricas, 25 ml de TRIS, 1 M (pH 8.5); 10 ml de KCl, 1 M; y 500 l de MgCl2, 1 M. Pesar en beaker de 100 ml, 0.25 g de BSA; 7.5 g de Ficoll 400; y 0.05 g de Xylene Cyanole.

Procedimiento: Disolver los slidos agregndoles las soluciones lquidas y cantidades muy pequeas de agua destilada. Usando un embudo, transferir a un frasco volumtrico de 100 ml de la solucin, lavando los beakers sobre este con agua destilada y teniendo cuidado de no sobrepasar el volumen. Completar con agua destilada hasta la marca de 100 ml. Guardar en frasco mbar en refrigeracin.

Nucletidos (dNTPs + Mg Cl2, 10 mM) (1000 L)

Mezclar en un tubo de microcentrfuga 875 l de agua destilada (18 megohm); 25 L de MgCl2, 1 M; y 100 L de dNTPs, 100 mM (4x25 L de c/u). Guardar en refrigeracin.

Para 100 reacciones de PCR, agregar (Skroch y Nienhuis, 1998): 228.8 l de agua destilada (18 megohm) 220.0 L de buffer 5X 44.0 L de (dNTPs+MgCl2), 10 mM 44.0 L de primer @ 10 M 13.2 L de Taq DNA polimerasa Electroforesis (UW-Madison) TBE BUFFER 5X (5 Litros) Pesar 24 g de TRIS Base y 13.75 g de Acido Brico. Medir 10 ml de EDTA, O.5 M (pH 8.0), con pipeta volumtrica. Preparacin: Pesar los slidos en beakers de 150 ml, disolverlos y transferirlos a un frasco volumtrico de 1 litro. Agregar los 10 ml de EDTA, completar el volumen a 1 litro mezclando bien y transferir a un recipiente ms grande (5 L). Agregar 4 litros de agua destilada, medidos con frascos volumtricos grandes. Mezclar bien y guardar en refrigeracin.

Agarosa (ultra pura) 1% (100 ml) (se prepara al momento de usarse)

Pesar 1 g de agarosa y transferir a un frasco volumtrico de 100 ml. Agregar buffer TBE 0.5X hasta la marca y mezclar. Tintura de rastreo 6X (10 ml) Pesar 1.500 g de Ficoll 400; 0.025 g de Azul de Bromofenol; y 0.025 g. de Xylene Cyanole FF. Colocar todos los slidos en un beaker de 100 ml, y agregar 10 ml de agua destilada usando una pipeta volumtrica. Disolver y guardar en el refrigerador en tubos de microcentrfuga (eppendorf) de 1.5 ml.

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ANEXO 1: CUANTIFICACIN DE ADN Buffer de Cuantificacin (Buffer TNE + tintura)

356 nm

492 nm

Espectro de excitacin

Espectro de emisin

Buffer de Cuantificacin (Buffer TNE + tintura) + ADN

365 nm

458 nm

Espectro de excitacin

Espectro de emisin Solo deja luz de 460 15 nm 445 475 nm

Filtro de emisin Fotodetector La medicin de la fluorescencia es un indicador de la concentracin de ADN

ANEXO 2: DILUCIN DE ADN

Masa = Masa Ci * Vi = Cf * Vf Ci * Vi = Cf ( VTE + Vi ) Ci * Vi = Cf * VTE + Cf * Vi Ci * Vi - Cf * Vi = Cf * VTE Vi ( Ci - Cf ) = Cf * VTE Frmula general de dilucin ADN Vi = ( Cf * VTE ) / ( Ci - Cf ) Vi = ( 4 * 1000 ) / ( Ci - 4 ) Frmula dilucin ADN (4 ng/ l) Vi = 4000 / ( Ci - 4 )

Vi = Volumen del ADN Stock para adicionar a 1000 l de buffer TE para hacer una solucin a 4 ng/l Ci = concentracin inicial (ng/ml) Vi = volumen inicial (l) Cf = concentracin final (ng/ml) Vf = volumen final (l) VTE = volumen de buffer TE (l) Nota: Para diluir el ADN usar buffer TE 0.1X ms tartrazine.

ANEXO 3: Caractersticas y funciones de los reactivos para marcadores moleculares

REACTIVO 1. TRIS (Hidroximetil amino metano) 2. EDTA (Etileno diamino tetra actico) 3. Acetato de Sodio 4. Acetato de Potasio 5. Fenol 6. Cloroformo

CARACTERSTICA Tampn Biolgico Agente Quelante Sal Sal Solvente Orgnico Solvente Orgnico

FUNCIN -Mantener estable el pH de la solucin (7.0-8.0) -Toma iones Mg++ -Precipita el ADN -Precipita protenas -Desnaturaliza protenas -Remueve lpidos -Desnaturaliza protenas -Solubiliza al fenol y lo elimina de la solucin -Solubiliza protenas, tejidos y membranas -Solubiliza polisacridos -Inhibe hexoquinasas -Semejante a la actividad del SDS -Disuelve componentes de tejidos y membranas -Evita color pardo -Escinde puentes disulfuro -Reduce grupos sulfuros de protenas -A baja concentracin permite actividad enzimtica -Agentes antioxidantes -Disminuye formacin de interfases -Elimina compuestos fenlicos que pueden inhibir actividad enzimtica -Precipitan cidos nucleicos (a bajas temperaturas) -Elimina ARN -Equilibran las fuerzas inicas

7. SDS (Sodio dodecil sulfato) 8. CTAB (Hexadecil trimetil bromuro de amonio) 9. Sarkosil (Lauryl sarcosina) 10. Triton X-100 11. -Mercaptoetanol 12. DTT (Ditriotreitol)

Detergente Aninico Detergente Catinico Detergente Aninico Detergente polar Antioxidante Antioxidante

13. Octanol-alcohol isoamlico

Alcohol

14. PVP (Polivinil pirrolidona)

Detergente

15. Etanol-Isopropanol 16. RNAsa 17. NaCl, KCl

Alcoholes Enzima Sales

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