Facultad de Ciencias Departamento de Biologa Laboratorio de Microscopa Electrnica

APOPTOSIS: Muerte Celular Programada

Introduccin El nombre de apoptosis fue propuesto por Kerr y Searle (1972), utilizando un concepto griego de Apo (), desde, y Ptosis (), cada o prolapso de un rgano o parte de l.La apoptosis o muerte celular programada (MCP), est referida a una forma especfica de muerte celular, proceso que ocurre en los tejidos en condiciones fisiolgicas normales. Es un fenmeno fundamental en el desarrollo embrionario (Bellairs, 1961; Saunders y Fallon, 1966; Oppenheim y cols., 1996), metamorfosis (Goldsmith, 1966; Kerr y cols., 1972), atrofia tisular y regresin tumoral (Kerr y Searle, 1973; Wyllie y cols., 1973; Ucker, 1991) tanto en animales vertebrados como invertebrados. Glcksmann (1951), fue el primero en observar la muerte de clulas durante el desarrollo. (Saunders) Desde 1972, se han publicado diferentes observaciones referidas a la muerte celular programada (Kerr y Searle, 1972; Wyllie y Currie, (1966), propuso que la muerte celular programada era un evento morfognico normal en el desarrollo de los organismos multicelulares. 1980) describiendo las caractersticas morfolgicas de clulas desintegradas en variados tipos de tejidos. Ellos desarrollaron el concepto de apoptosis para describir la ocurrencia natural de muerte celular, el cual juega un rol complementario pero opuesto a la necrsis en la regulacin de las poblaciones en clulas animales. Pero, tambin sostienen que la muerte celular puede ocurrir debido a un ambiente con perturbaciones rigurosas y no de procesos intrnsicos de la clula la cual es considerado distintamente al concepto de apoptosis, refirindose a la muerte accidental o patolgica llamada necrosis (Van Furth, et aL 1988). De este modo, la mantencin de los tipos celulares y el nmero de clulas en eucariontes multicelulares representa un balance entre los fenmenos de proliferacin celular y de muerte celular programada, representando un mecanismo eficiente de eliminacin de clulas gastadas e intiles. Si bien conocemos la ocurrencia y expresin de los procesos de muerte celular programada, los mecanismos moleculares a travs de los cuales se produce son an poco conocidos.

NECROSIS
CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS Prdida Integridad de Membrana Disgregacin de la Cromatina Edema Celular y Lisis Desintegracin de Organelos CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS Alteracin Homeostasis Celular No Dependiente de la Energa Digestin DNA azar

APOPTOSIS
Formaciones Ampulares Compactacin de la cromatina Condensacin Celular Formacin Cuerpos Appticos Proceso Altamente Regulado Dependiente de la Energa Fragmentecin DNA (180-200pb)

Diferencias entre los procesos de necrosis y Apoptosis

La muerte celular estara dada por la activacin de un programa gentico letal (Eastman, 1993), programa que sugiere la existencia de seales de sobrevivencia especficas y que selecciona aquellas clulas que se necesitan dentro de un organismo. Es posible que el problema de la sobrevivencia celular y la muerte sean aspectos controlados por iguales mecanismos. La activacin de un programa de muerte celular constituye un mecanismo eficiente para eliminar clulas indeseadas. Adems es muy importante ya que no slo ocurre durante el desarrollo embrionario o como un evento relacionado con la homeostasis de los tejidos, sino que tambin puede ocurrir bajo condiciones anormales y puede ser la causa de muchas enfermedades Clulas que mueren por Apoptosis Clulas sin funcin Clulas formadas en exceso Clulas defectuosas Clulas con defectos deletreos Clulas que han completado su ciclo de vida

embrionario las cuales deben ser eliminadas, cerca de un 38 % de estas clulas, en los ncleos geniculados mueren por apoptosis (Williams y Rakie, 1996). En el desarrollo del pollo se observa la muerte de clulas en los esbozos de miembros, en clulas de Schwann que luego induce la degeneracin axonal en el sistema nervioso (Chu-Wang y Oppenheim, 1978). Apoptosis y mantencin tisular El grupo de Tadakuma en Tokio demostr, en 1990, que las clulas en apoptosis segregan productos de activacin del sistema inmunitario, en particular la Interleukina 2 (IL2), que favorece la evacuacin de los restos celulares. Anteriormente los trabajos de Cohen y colaboradores en Estados Unidos, en 1986, demostraron que los linfocitos T cultivados in vitro en ausencia del factor de crecimiento Interleukina 2 (IL-2) induca la apoptosis en dichas clulas. Todava no se conoce la seal que interviene en la produccin de la apoptosis, ni como se transmite a las clulas que tiene que morir. La MCP puede ser iniciada por la interaccin de las superficie de las clulas que tienen que morir con molculas, dos molculas en la superficie de los animales vertebrados muestran una relacin con la induccinde la apoptosis en las clulas estas son Fas/APOI y el Factor Receptor para Necrosis Tumoral (TNFR) (Tartaglia y cols, 1993). La unin a la superficie de estos receptores inicia la cascada de eventos intracelulares que culminan en la induccin de la apoptosis en la clula blanco. En el caso de la produccin de los linfocitos T se cree que las clulas que se .suicidan. son prelinfocitos llamados autorreactivos. Estos prelinfocitos tienen que ser eliminados ya que pueden producir reacciones autoinmunes. Al parecer la apoptosis se desencadena a partir de una seal de activacin celular incompleta que implica un flujo de calcio hacia el interior de la clula, la seal completa provoca la proliferacin de linfocitos no autorreactivos. De este modo, la apoptosis se nos presenta como un mecanismo regulador de la fisiologa de los linfocitos T al mismo nivel que la proliferacin y la diferenciacin celular. La muerte de estas clulas no se debe a la necrosis, proceso de muerte patolgica que

Apoptosis y Desarrollo En estudios de desarrollo embrionario, una de las grandes sorpresas fue el descubrimiento de que la ejecucin de un programa de desarrollo en un organismo involucra la produccin de clulas que luego se vuelven intiles y que mueren. As, en primates se ha observado la sobreproduccin de neuronas durante el desarrollo

provoca una reaccin inflamatorio. La muerte celular programada ocurre en una clula individual y es un proceso asincrnico en donde algunos pasos son an desconocidos, Una clula cuyo sistema de apoptosis ha sido activado experimenta, cambios en sus caractersticas tanto morfolgicas como bioqumicas (Cohen, 1992). Morfologia de la Apoptosis Los cambios morfolgcos que ocurren en las clulas son: agregacin de la cromatina formando ncleos picnticos, observables al microscopio ptico, condensacin tanto nuclear y citoplasmtica y particin del citoplasma en pequeas vesculas llamadas cuerpos apoptticos que contienen ribosomas, mitocondrias morfolgicarnente intactas y material nuclear. Ultrastructuralmente se pierden las uniones estrechas y otras diferenciaciones de la membrana celular. In vivo, estos cuerpos apoptticos son rpidamente reconocidos y fagoctados por macrfagos o clulas epiteliales adyacente (Savill y cols., 1993). In vitro los cuerpos apoptticos quedan como restos de clulas fragmentadas que luego se hinchan y finalmente se rompen. Esta fase terminal en las clulas In vitro es llamada necrosis secundaria. (Wyllie, 1981). Bioqumica y Bases Genticas de la Apoptosis. Los cambios bioqumicos que se producen al activarse la seal de la apoptosis, est referida a la degradacin del DNA nuclear, siendo un evento irreversible. En primer lugar ocurre un cambio en la permeabilidad de la

membrana plasmtica (pre-lisis del DNA) con una importante afluencia de iones de Ca2+ y Mg2+ , donde se activan o sintetizan unas enzimas especficas llamadas endonucleas que cortan el DNA en fragmentos regulares, en un periodo entre algunos minutos y algunas horas. Slo las partes del ADN protegido por las protenas del nucleosoma quedan intactas generando mono- y oligonucleosoma. Los fragmentos del DNA pueden ser observados bajo electroforsis formando un diseo consistente en multmeros de aproximadamente 180 a 200 bp (llamados .ADN ladder. (Wyllie y cols., 1980). La identificacin de los genes necesarios para producir la apoptosis, no es fcil, ya que las clulas que las expresan estn destinadas a morir rpidamente. Algunos genes relacionados con la muerte celular programada se han identificado por su relacin con el cncer, es decir, con un proceso de proliferacin celular. As el gen de la enzima convertasa interleukina-1 B (ICE) (Miura y cols., 1993) que incremento los niveles de expresin de la enzima ICE causa por induccin, la muerte celular en las clulas que expresan el gen y que tienen la protena activa cistena proteasa. El protooncogn Bcl-2, fue identificado en clulas malignas B y es capaz de inhibir la apoptosis, es decir ayuda a la clula a su supervivencia (Raff, 1992; Fairbairn y cols., 1993; Vaux, 1993; Reed, 1994). Sin embargo, bcl-2 no inhibe todos los tipos de muerte celular programada, su actividad es ms compleja ya que se han identificado genes que estn relacionados, bax y bcl-x (Boise y cols., 1993). El gen bax tienden a promover la

Estados Morfolgicos durante la Apoptosis

muerte celular si forma heterodmeros con bcl-2, pero si forma homodmeros estos promueven la inhibicin de la apoptosis. As las concentraciones relativas de homodmeros de cada molcula determina que la clula muera o sobreviva. Si los niveles de bcl-2 exceden a los de bax la muerte celular programada es inhibida. Es decir, la proliferacin celular est relacionada con la MCP, pero la supresin de la proliferacin celular no es signoesencial para entrar a la va de la apoptosis. La expresin de los protooncognes c-myc y p53, conocidos por estar relacionados con la proliferacin celular, tienen un rol de induccin de la muerte celular programada (Lotem y Sachs, 1993; Williams y Smith, 1993; White, 1993). La expresin gen c-myc es inhibida en situaciones de crecimiento celular y no as cuando existe ausencia de nutrientes induciendo apoptosis en las clulas. La expresin del gen c-myc no es

necesaria en todas las clulas para entrar a la va de MCP y la capacidad de inducir apoptosis es inhibida por la actividad del gen bcl-2 (Bissonnette y cols., 1992; Fanidi y cols., 1992). El gen p-53, supresor de los tumores, tambin muestra la capacidad de producir apoptosis especialmente cuando el ADN es daado por agentes externos (Clarke y cols., 1993; Lowe y cols., 1993). El control molecular de la MCP durante el desarrrollo ha sido definido claramente en los estudios en Caenorhabditis elegans y donde estan las evidencias ms directas de que la apoptosis es causada por la activacin de programas genticos letales. Mitocondrias y Apoptosis Estudios de evolucin celular permiten sugerir que el metabolismo aerbico asociado al origen endosimbitico de las mitocondrias, constituyen un paso importante en la evolucin de mecanismos de muerte

celular, principalmente del tipo apoptosis como se observa en metazoos. Eventos claves de la apoptosis estn relacionados con las mitocondrias. La liberacin de activadores de caspasas, cambios en el transporte de electrones, perdida de potenciales mitocondriales transmembrana, alteraciones en actividades de oxidoreduccin celular y la participacin de antiapoptticos como Bcl-2, son algunas de las diferentes seales que convergen en la mitocondria para inhibir o gatillar el proceso de MCP. Si, las mitocondrias pueden juegar un rol clave en la regulacin de la vida y muerte celular, cmo este organelo se relaciona con la apoptosis?. A lo menos tres mecanismos han sido sugeridos: 1.- Alteracin del transporte de electrones, fosforilacin oxidativa y produccin de ATP. Una alteracin en el transporte de electrones se relaciona con una disminucin en la produccin de ATP. Distintos procesos son capaces de alterar el transporte de electrones, probablemente a nivel de citocromo bc1/citocromo c. 2.- Liberacin de protenas que activan caspasas. Se ha observado que la inhibicin de Bcl-2 sobre la condensacin y fragmentacin del DNA nuclear es dependiente de la presencia de mitocondrias. La presencia de Bcl-2 a nivel de mitocondria es capaz de inhibir la salida de citocromo c desde la mitocondria. La liberacin de citocromo c permite la activacin de proteasas (Caspasas) que clivan sitios Asp-x de protenas. Las caspasas constituyen una familia de

proteasas citoslicas estructuralmente relacionadas con productos gnicos de ced3 y de la enzima convertidor de la Interleukina 1 (ICE). 3.- Alteracin de potenciales de oxidoreduccin. La mitocondria es la principal fuente de produccin de radicales superoxido a nivel celular. Durante el transporte de electrones hasta el oxgeno molecular, a lo menos 1-5% de los electrones participan el la formacin de O2=. As, una alteracin en el transporte de electrones aumenta la produccin de radicales. Durante la apoptosis se observa un incremento de superxidos y peroxidaciones. La decisin vida o muerte, apoptosis o necrosis, parece estar relacionada con el estado de la membrana mitocondrial. De esta forma la mitocondrias son organelos fundamentales en la activacin de los procesos de muerte celular. Caracterizacin del Programa Gentico de Muerte Celular Programada en Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans es un nemtodo hermafrodita de no ms de 1 mm de largo y el linaje de cada clula ha sido reconstruido. Su simplicidad anatmica se relaciona con un genoma de 3000 genes (unas 20 veces mayor que el E. Coli). Durante el desarrollo Caenorhabditis elegans se originan unas 1090 clulas somticas, de las cuales 131 mueren por apoptosis, fenmeno que puede ser evidenciado tanto en microscopia ptica y electrnica, (Ellis y Horvitz, 1986; Driscoll, 1992; Williams y Smith, 1993-,Hengartener y Horvtz, 1994) En C. Elegans la actividad de

dos genes ced-3 y ced-4 producen en las clulas la muerte celular programada (genes homlogos al gen de la enzima de la Interleukina-1). El DNA de estos dos genes han sido secuenciados; ced-3 y ced-4 codifica una protena con dos dominios para unir Ca2+. Mutaciones que inactivan estos genes han demostrado que la mayor parte de las clulas programadas para morir durante el desarrollo de C. Elegans pueden sobrevivir, (Driscoll, 1992). Tambin existe el gen ced-9 que inhibe la expresin de los genes ced-3 y ced-4 (Hengartner y cols., 1992). De esta forma la expresin del gen ced- 9 acta produciendo la proteccin de las clulas a morir por apoptosis (homologa a la funcin del gen Bcl-2 en humano). La determinacin de que la clula muera o que se activen las vas de MCP esta controlada por dos genes, ces-1 y ces-2 que muestran efectos opuestos para que la clula entre en las vas de MCP (Ellis el al., 1991). La expresin de ces-2, especfica a la clula a entrar en la va de MCP y ces-1 tiene una actividad opuesta a ces-2 con lo cual previene la entrada de las clulas a una MCP. En total se han encontrado cerca de siete genes que eventualmente dirigen la MCP en Caenorhabditis elegans. Estos siete genes estn segregados en dos grupos con funciones que se sobreponen. Un grupo que consiste en los genes ced-2, ced-5 y ced-10 y otro grupo con los genes ced-1, ced-6, ced7 y ced-8 (Ellis y cols., 1991). Adems de un gen asociado con la degradacin del ADN, el cual sintetiza la enzima nucleasa llamado Nuc-I (Helvelone y Hartman, 1988). Apoptosis y Patologas Asociadas Es posible que muchas patologas humanas caracterizadas por muerte celular (enfermedades neurodegenerativas, infartos e injurias cerebrales traumticas), pueden estar causadas por procesos que inactivan genes como ced-9. Zychlinsky y colaboradores demostraron, en 1992, que el mecanismo empleado por S. Flexneri (causante de la disenteria celular) para matar a los macrfagos es la apoptosis y descubrieron que el gen ipa B de la bacteria produca una molcula que pone en marcha el mecanismo que conduce a la muerte celular. De este modo, existen algunas bacterias que pueden provocar la apoptosis en clulas humanas, por ejemplo: la Bordetella pertusis, agente de la tos ferina,

destruye los macrofagos produciendo una enzima la adelinato-ciclasa que estimula la formacin de adenosin ciclasa 3.:5.monofosfatasa (AMP cclico) a partir de ATP, desencadenando la apoptosis el rol del AMP cclico es an desconocido pero se piensa que actuara como un segundo mensajero en la produccin de enzima nucleasa (ChoChung, 1979). Ciertos patgenos bacterianos causan lesiones mediante la secrecin de toxinas que actan a distancias, estas toxinas tienen una doble actividad: es un inhibidor de la biosntesis de las protenas y es tambin una enzima nucleasa capaz de fragmentar los cidos nucleicos (Lessnick y cols., 1992). La induccin de la apoptosis mediante molculas de activacin se nos muestra como un importante medio que permite a algunas bacterias ser patgenas. Es tambin interesante sealar que la apoptosis parece intervenir en otras situaciones patolgicas, Dreyer y Lipton, en 1990, descubrieron que las protenas virales gp 120 se unan a la superficie de la membrana plasmtica de las neuronas, induciendo su muerte despus de la entrada de Ca2+. De esta manera se podra explicar tambin la muerte masiva de las linfocitos T4 en la infeccin del HIV, este virus desprende con facilidad la protena gp 120 que se unira al receptor CD4 y podra perturbar el trayecto de las seales moleculares de activacin de los linfocitos T, por lo tanto, la apoptosis pasa a ocupar un lugar entre los mecanismos susceptibles de explicar el desarrollo del SIDA (Terai y cols., 1991). El reconocimiento de que la muerte celular fisiolgica no se debe slo a causas intrnsecas de las clulas ayudar a comprender los mecanismos bsicos de la apoptosis. De este modo, es necesaria la definicin de las bases moleculares y celulares de la apoptosis que aportar una nueva luz a la biologa de los procesos de suicidio celular y tambin al desarrollo de nuevas drogas para el tratamiento de diferentes enfermedades tales como cncer, enfermedades neurodegenerativas, SIDA, y enfermedades autoinmunes entre otras, con el cual se pueda llegar a nuevos enfoques en el tratamiento de estas enfermedades. LV/EC/01