Pre-fermentarea mustului de whisky de malț folosind Lactobacillus

plantarum și influența acestuia asupra caracterului distilatului

Plămăzile de distilerie sunt nesterile, ceea ce permite comunităților bacteriene să

înflorească, de obicei spre sfârșitul fermentației. A fost investigat efectul începerii fermentației
bacteriene la începutul fermentației. Mustul a fost tratat timp de 48 de ore folosind o tulpină
comercială de Lactobacillus plantarum urmată de fermentare utilizând o tulpină de distilare de
Saccharomyces cerevisiae.

Plămada a arătat o creștere substanțială a acizilor lactici, acetici și succinici. Analiza

senzorială a determinat faptul că distilatul produs cu tratament bacterian a fost semnificativ
diferit (p <0,05), iar analiza chimică a demonstrat o creștere a producției de acetat de etil.

Aceste rezultate arată că tratarea prealabilă folosind specii de Lactobacillus ar putea fi

utilizată pentru a modifica calitatea distilatului nou fabricat într-o distilerie. Prin utilizarea
culturilor bacteriene prezente în împrejurimi sau materii prime, distilatoarele ar putea permite
adăugarea microflorei naturale sau disponibile în comerț, îmbunătățind astfel dezvoltarea
aromelor în timpul fermentării și producând diferite caractere spirtoase.

1. Introducere

În timpul producției de whisky de malț, nu există o etapă de fierbere în timpul producției

de must, rezultând condiții „nesterile” pentru fermentare. Prin urmare, bacteriile și alte
microflore, derivate din mediul local (praf, spălături) sau din materiile prime (malț, cereale,
drojdie), se poate dezvolta pe parcursul fermentării. Aceste microorganisme, împreună cu tulpina
dorită de drojdie Saccharomyces, influențează aroma mustului fermentat. Într-o distilerie tipică
de whisky de malț, mustul va fi distilat de două ori în distilatoare de oțel sau de cupru pentru a
produce distilatul.

În ciuda culturilor bacteriene și a drojdiilor sălbatice, de obicei asociate cu alterarea berii,

creșterea bacteriilor și fermentarea lor în plamăzi, este adesea legată anecdotic de calitatea
sporită a distilatului și toxicitatea diferitelor culturi bacteriene prezente.

Distileriile scoțiene nu încurajeză prezența unor astfel de culturi, deoarece acestea sunt permise
prin absența fierberii mustului. De asemenea, folosirea recipientelor din lemn care adăpostesc
niveluri mai ridicate de bacterii sunt o bună sursă de compromitere a plăzmăzii. Mai mult,
distilatoarele vor crește adesea timpul de fermentare pentru a încuraja o fermentație secundară,
lactică.
 În altă parte a lumii, mai precis în Statele Unite, o porție de piure uzat (cereale procesate,
cu conținut scăzut de carbohidrați) din fermentația anterioară poate fi inclusă în fermentator,
reducând pH-ul mustului, ceea ce va încuraja creșterea acidului lactic bacterii în timpul
fermentării. Deși creșterea bacteriilor poate să nu fie complet eradicată, ea este în general
menținută la niveluri scăzute, astfel încât să nu afecteze randamentul distilatului dintr-o anumită
fermentație, fie prin concurență pentru zahăr fermentabil, fie prin inițierea floculării drojdiei.

Au fost efectuate studii detaliate ale comunităților bacteriene prezente în mediul

distileriei, cu specii de Lactobacillus, considerate a fi genul dominant, datorită capacității sale de
a supraviețui alcoolului ridicat. În ciuda faptului că acest domeniu a fost bine studiat, impactul
specific pe care aceste culturi îl au asupra distilatului este puțin înțeles. Acest lucru se poate
datora mai multor factori diferiți. Este dificil să se determine diferențele dintre calitatea
distilatelor de la distilerie la distilerie, întrucât o multitudine de alți factori influențează, de
asemenea, calitatea percepută a distilatului. Aceasta include, dar nu se limitează la, regimul de
piure, viteza și tulpina de inocul (adăugare) a drojdiei, volumul fermentației, timpul și
temperatura, precum și punctele de proiectare și tăiere în timpul distilării. Mai mult, cercetătorii
au stabilit că culturile bacteriene prosperă de obicei până la sfârșitul fermentației, când greutatea
specifică (SG) este mică (sub 1.000). La sfârșitul fermentației există substanțe nutritive limitate
care trebuie metabolizate, acestea fiind de obicei derivate din autoliza celulelor moarte de
drojdie.

În mod tradițional, a fost înțeles de distilatori și confirmat de cercetări că, dacă faza de
creștere bacteriană ar avea loc prea devreme în fermentație, aceasta ar fi în detrimentul
producției de etanol și, prin urmare, a randamentului final al distilatului.Durata fermentațiilor
efectuate de mai mulți distilatori este adesea legată, în special în materialele de comercializare,
cu caracterul fructat, ester și ceros în distilat. Acest concept este susținut în mod vag de literatură
și susține că bacteriile pot crește conținutul de esteri ai distilatul. Influența specifică a speciilor
bacteriene este dificil de dovedit atât în laborator (din cauza lipsei microflorei indigene), cât și la
scară industrială (datorită diferențelor dintre producători). Prin deplasarea fermentației bacteriene
înainte de inocularea S. cerevisiae se poate determina impactul Lactobacillus asupra caracterului
distilatului.

Datorită intensificării procesului, înlocuirea recipientelor din lemn cu vase din oțel
inoxidabil și a practicilor de curățare mai robuste în multe distilerii de whisky în scopul
controlului produsului, creșterea bacteriană și impactul ulterior asupra calității băuturilor
spirtoase pot fi limitate. Legăturile dintre materialul recipientului de fermentat și calitatea
distilatului sunt adesea făcute, deși lipsesc dovezi științifice, s-au postulat legături între
recipientele din lemn mai poroase și conținutul mai ridicat de esteri fructiferi datorită prevalenței
bacteriilor.

Tulpinile microflorei de distilerie, care supraviețuiesc condițiilor de fermentare, pot fi

clasificate ca homofermentare (Lactococcus, Pediococcus și Streptococcus), heterofermentare
(Leuconostoc și Lactobacillus). Speciile homofermentative utilizează calea glicolitică și produc 2
mol acid lactic din 1 mol glucoză. Tulpinile de heterofermentare facultative pot metaboliza
glucoza prin calea 6- fosfogluconat / fosfocetolază (6-PG / PK) care produc fie 2 moli de acid
lactic, fie 1 moli etanol și dioxid de carbon per moli de glucoză, în funcție de condițiile
predominante.

S-a demonstrat că alte căi metabolice ale Lactobacillus formează acid succinic din acidul
lactic sau citric și joacă, de asemenea, un rol în decarboxilarea acizilor cinamici, toate acestea
putând influența caracterul distilatului.

Producerea subproduselor metabolice, în special a acizilor organici, ar putea avea un

impact substanțial asupra aromelor și caracteristicilor aromelor musturilor distilate. Datorită
prezenței alcoolilor precum etanolul și a alcoolilor superiori (butanol, alcool izoamilic) și a
condițiilor de pH scăzut, reacțiile de condensare dintre acești alcooli și acizi pot duce la
esterificare (ecuația (1)).

ROH + ROOH ROOR + H2O

Ecuația 1 - Reacție de condensare generalizată pentru producția de esteri în condiții acide.

Mai mult, s-a demonstrat că volatilitatea esterilor se aliniază bine cu profilul de distilare
al etanolului, atât în sistemele experimentale, cât și în cele modelate, crescând probabilitatea ca
acești compuși să aibă un impact asupra aromelor în micșorarea continutului de alcool a unei
distilări.

Esterii au de obicei o presiune de vapori mai mică decât alcoolii și acizii lor
corespunzători și, prin urmare, aceste produse vor fi mai ușor distilate, conducând astfel
echilibrul acestei reacții spre dreapta prin principiul lui Le Chatelier. Esterii au un impact mare
asupra calității distilatelor datorită volatilității lor scăzute și a pragurilor de aromă scăzute care
contribuie la arome fructate, uneori florale, pentru distilat. Astfel, o înțelegere a producției unor
astfel de congeneri ar putea duce la o mai bună înțelegere a modului în care comportamentul
speciilor de bacterii dintr-o distilerie de whisky de malț afectează caracterul distilatului.

Acizii organici pot fi, de asemenea, produși din ciclul acidului tricarboxilic (TCA). De
obicei, acest lucru apare devreme prin acțiunea drojdiei în timpul fazei de întârziere a
fermentației. S-au studiat modificările conținutului organic al orezului și al berii pe bază de orz
malțiat, arătând că acizii acetic, lactic și succinic cresc în mare măsură în timpul fermentației. În
general, eliberarea acizilor organici are loc numai atunci când ciclul TCA nu este finalizat și,
prin urmare, ar putea servi și ca indicator al creșterii slabe a celulelor sau a stresului crescut de
drojdie. Conținutul de acid organic al berilor a fost studiat și a arătat că nivelurile de acizi acetic,
lactic și succinic cresc în timpul fermentației cu acizi malici și fumarici rămânând stabili, totuși,
există informații limitate cu privire la acizii organici formați în timpul fermentațiilor de whisky
de malț.
 A fost dezvoltată o metodă de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) pentru
a investiga concentrația de acizi organici în mustul de fermentare. Inițial, o tulpină comercială de
Lactobacillus plantarum a fost inoculată în must. După trei tratamente bacteriene, unul de
control (CP), în care nu a avut loc niciun tratament bacterian, un tratament „steril” (SS) în care
bacteria a fost inoculată în must fiert și un tratament „nesteril” (US) unde bacteriile au fost
inoculate în must nefiert. O tulpină de distilare disponibilă din punct de vedere comercial a
Saccharomyces cerevisiae a fost apoi inoculată în must. Datele de fermentație au fost colectate și
modelate folosind o ecuație logistică cu 4 parametri pentru a determina orice diferențe în
profilurile de fermentație. Mustul fermentat fost apoi distilat mai întâi pentru a produce distilate
cu conținut scăzut de alcool și apoi pentru a produce un distilat cu conținutul de alcool conform,
care a fost supus analizei chimice și senzoriale.

2.Materiale și metode

Toate citirile de greutate specifică au fost măsurate prin filtrarea și degazarea probei
urmată de măsurare utilizând un Anton-Paar DMA 35 (Anton-Paar, St Albans, GBR). PH-ul a
fost înregistrat folosind un contor VWR pH110 (VWR, Lutterworth, GBR) și toate probele de
fermentație (alicote de pre-distilare) au fost înghețate înainte de analiză.

2.1.Plan experimental

O schiță a procedurii experimentale este prezentată în Fig. 1.

2.2.Producția de must

Plămada cu greutate specifică 1.066 a fost făcută piure folosind o moară cu două role
( Fraser Agricultural, Inverurie, GBR). Boabele s-au măcinat și apoi s-au amestecat cu 150 L de
apă la 64 ° C timp de 1 oră înainte de separare. Stratul de cereale a fost apoi stropit continuu cu
apă pentru a obține volumul și gravitația dorite. Mustul produs a fost congelat în recipiente de 20
L pentru utilizare ulterioară. Tot mustul a fost decongelat înainte de utilizare.

Figura 1. Schiță experimentală, care arată cele trei regimuri de producere a musturilor folosite.
 2.3.Tratamentul mustului

Două tipuri de must tratat au fost produse în triplicat - un must „acru steril” (SS), produs
prin fierberea amestecului timp de 45 de minute și sifonat într-un vas de fermentare pentru a
elimina orice pauză fierbinte formată. Un must „acru nesteril” (US) care nu a fost fiert înainte de
a inocula bacteriile. Cultura bacteriană a fost o tulpină congelată uscată comercială de
Lactobacillus plantarum. Bacteriile au fost inolculate conform instrucțiunilor producătorului la o
rată de 1 g hL-1 și mustul a fost acidulat timp de 48 de ore la 35 ° C. Mustul de control utilizat
(CP) a fost tratat fără bacterii și nu a fost fiert înainte de utilizare.

2.4.Fermentaţia

O tulpină disponibilă comercial din drojdia uscată Saccharomyces cerevisiae a fost

introdusă direct în proba de control netratată (CP) și în două musturi tratate (adică un steril (US)
și nesteril (SS). Toate fermentațiile au fost inoculate cu drojdie la o rată de 1 g L-1 (aproximativ
2 x 107 celule mL − 1). Drojdia a fost inoculată direct în must la 20 ° C și a fost lăsată să
fermenteze 96 ore. Această temperatură a inhibat fermentația bacteriană suplimentară și a
încurajat dominarea S. cerevisiae. Mustul fermentat a fost filtrat și analizat folosind un Anton-
Paar DMA 4500 cuplat la un modul Alcolyzer ME (Anton-Paar, St Albans, GBR) pentru a
determina gravitația finală. și alcool în volum (% v / v etanol).

2.5.Distilarea

Mustul fermentat a fost distilat cu ajutorul unei distileri pilot ICBD. Pe parcursul tuturor
perioadelor de distilare, s-a înregistrat concentrația în etanol al distilatului pentru a se asigura
realizarea unor profile consistente pentru a evita alterarea aromelor. Distilatoarele au fost
încărcate cu 20 L (sau 18 L cu must fiert SS). Mustul a fost încălzită folosind o bobină de abur și
s-a obținut o scurgere constantă de distilat cu concentrație scăzută de alcool. Distilare a fost
oprită când nivelul de etanol al distilatului a atins 1% v / v (un punct de reducere economic).

Distilarea a fost efectuată în alambic de cupru cu capacitatea de 5 L folosind un

condensator în formă de cadă cu vierme și încălzită cu un izomant de 5 litri (electrotermic,
Staffordshire, GBR) la o temperatură constantă. La începutul acestei a doua distilări s-au colectat
frunțile (50 ml) și apoi s-a colectat cozile, permițând ca concentrația în etanol al distilatului să
scadă cu 12% înainte de a opri colectarea noului distilat.

2.6.Produse chimice

Toate substanțele chimice au fost furnizate la puritate ≥98% (Sigma-Aldrich, Dorset,

GBR). Eluantul HPLC a fost produs folosind apă distilată care a fost în continuare purificată și
degazată prin filtrare sub vid (0,45 um).
 2.7.Analiza acizilor organici

Metodele au fost adaptate pentru analiza mustului din cele găsite în literatură. Acizii
organici au fost analizați utilizând o cromatogramă Shimadzu LC-20AD echipată cu
autosamplator SIL-20A HT și un cuptor CTO-10AS pe coloană cuplat la un detector de matrice
de diode SPD-M20A. Două coloane Phenomenex Kinex 150 × 4,6 mm coloane C18 au fost
utilizate ca fază staționară și o soluție H3PO4 (5 mM, pH 2,1) a fost utilizată ca fază mobilă. Un
debit de 0,65 ml min-1 a fost atins cu o temperatură a cuptorului pe coloană de 60 ° C. S-a
injectat o probă de 10 μL și timpul de rulare a fost de 30 min. Toți compușii au fost detectați la o
lungime de undă de 210 nm.

S-au folosit ca standarde externe acidul formic, malic, lactic, acetic, fumaric și succinic.
Acidul galic (10 g L − 1) a fost utilizat ca standard intern prin adăugarea a 10 μL la 1 ml de
probă, dând o concentrație de lucru de 100 mg L − 1 și a fost nedetectabil în probe reprezentative
de must. Cu toate acestea, compusul poate fi găsit în cantități mici (mult sub limita de detectare a
instrumentelor) în bere, posibil datorită adăugării de stabilizatori care ajută la precipitarea
polifenolilor și proteinelor. Standardele au fost realizate în intervale specifice concentrației lor
tipice găsite în must și au reflectat cantitatea găsită în probele de bere pe baza rapoartelor de
evaluare inter pares. Toate curbele standard au avut un coeficient de determinare (r2) ≥ 0,999 și
repetabilitate în must, și bere cu abatere standard relativă <10%.

Probele au fost centrifugate la 4500 rpm timp de 15 min și 1 ml de mediu centrifugat a

fost transferat într-un flacon de probă conținând 100 μL de acid intern galic standard.

2.8.Analiza GC-FID

Alcoolii superiori au fost analizați folosind un Agilent 7820 A care funcționează în

modul de injectare a lichidului (Agilent, California, SUA). Separarea a fost realizată folosind o
coloană Agilent DB-WAX 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm.Temperatura cuptorul la început a fost de
35 ° C cu o reținere de 6 minute, temperatura a fost crescută până la 60 ° C cu o rată de 5 ° C
min-1 cu o reținere de 2 minute urmată de o rampă la 210 ° C cu o viteză de 20 ° C min − 1 și o
rampă finală la 250 ° C la o rată de 70 ° C min − 1 cu o reținere de 1 min. Compușii au fost
detectați folosind un detector FID la 270 ° C.

Un recipient de probă de 1 ml a fost adăugată într-un flacon, urmată de 100 pl de pentan-

1-ol pentru a da o concentrație finală în flacon de 500 mg L-1. Din acest flacon, 1 uL a fost
injectat pe coloana GC. Congenenții analizați au fost acetaldehidă, acetat de etil, acetal, metanol,
n-propanol, izobutanol, acetat de isoamil, n-butanol, alcool izoamilic și furfural. Intervalele de
calibrare au fost cuprinse între 5 - 1250 mg L-1, cu excepția alcoolului izoamilic care a fost
măsurat într-un interval de 10-2500 mg L-1. Toate calibrările au avut r2> 0,99.
 2.9.Analiza GC – MS

Analiza esterului a fost efectuată pe un Shimdadzu QP2010 Ultra GC / MS cu

autosampler AOC 5000 (Shimdazu, Tokyo, JPN) utilizând o fibră de microextracție în fază
solidă (SPME) PDMS / DVB de 65 μm (Supleco, Pennsylvania, SUA). O probă (1 ml) a fost
adăugată într-un balon cotat și amestecat cu apă distilată (5 ml). Heptanoat de metil (10 μL, 25
mg L-1) a fost utilizat ca standard intern. Proba a fost incubată timp de 5 minute, urmată de 5
minute de adsorbție a analitului prin expunerea fibrei la spațiul principal al flaconului probei.
Proba a fost apoi desorbită pe o coloană GC timp de 1 min la 200 ° C.

Separarea a fost realizată pe o coloană DB-WAX 30 m × 0,25 mm × 0,25 μm (Agilent,

California, SUA) programul cuptorului a început de la temperatura de 40 ° C timp de 3 minute,
urmat de o urcare inițială la 100 ° C la 10 ° C min− 1 și a doua urcare la 160 ° C la 4 ° C min - 1.
Temperatura finală cupatorului a fost de 220 ° C la o rată de 10 ° C min-1 și a fost menținută
timp de 10 min. Spectrometrul de masă a fost operat atât în modul SIM, cât și în modul SCAN.
Ionii SIM utilizează au fost m / z 45, 55, 74, 88, 101, 104, 129. Modul SCAN a variat de la m / z
42 – 400.

Figura 2. A. (stânga) Tendința greutății specifice în timpul fermentației modelată de funcția

logistică cu 4 parametri (coeficienți în 2 suplimentar). B (Dreapta) Tendința pH-ului în timpul
fermentației.

2.10.Analiza senzorială

Un grup de analiști neantrenați (n = 12) a fost folosit pentru a evalua aspectele olfactive
ale probelor distilatelor produse. Toate probele au fost prezentate orb în fața grupurilor de
comisie după diluarea la 20% v / v etanol.
 A fost utilizat un test triunghiular pentru a determina dacă a existat o diferență statistică
semnificativă între distilatele produse. Trei seturi diferite constând din diverse combinații de
probe de distilat au fost prezentate membrilor comisiei. Fiecare set conținea două distilate - două
din același eșantion de marcă nouă și unul diferit. Candidaților li s-a cerut să aleagă eșantionul pe
care îl consideră diferit. Testul a fost efectuat conform indicațiilor din BS EN ISO 4120 (British
Standard, 2004). Din rezultate, intervalul de încredere statistică a fost determinat pentru a
demonstra că o diferență între probe ar putea fi determinată de către grup.

Zece caracteristici senzoriale au fost selectate folosind roata de aromă a whisky-ului

scotch revizuit care a fost considerată adecvată pentru distilatul noului brand și a fost
recunoscută de Scotch Whisky Research Institute atât pentru testarea instruită a grupului, cât și
pentru testele consumatorilor. Analiștilor li s-a cerut să clasifice fiecare componentă aromatică
pe o scară de la 0 la 5, unde 0 nu a fost detectat și 5 a fost puternic detectabil. În cele din urmă,
candidaților li s-au prezentat trei mostre anonime și li s-a cerut să își clasifice preferința.

2.11.Analiza datelor

Pentru a îmbunătăți înțelegerea plămezilor produse, greutatea specifică (SG) a fost

modelată în RStudio (RStudio, Boston, SUA) folosind ecuația logistică cu 4 parametri (ecuația
(2)), deoarece s-a demonstrat că modelează eficient plămezile în bere pentru a preveni flocularea
prematură a drojdiei.

Pi−P e
P(t )=P e +
1+ exp ⁡(−B ( t−M ))

Ecuația 2 - Ecuațiile logistice cu 4 parametri folosite pentru modelarea declinului de

greutate specifică în timpul fermentării

Unde: P (t) este greutatea specifică la un moment dat t,

Pi este gravitația asimptotică inițială,

Pe este gravitația asimptotică finală (FG),

B este o funcție a gradientului la punctul de inflexiune,

M este punctul de inflexiune în raport cu timpul.

Analiza datelor a fost efectuată în Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, SUA) și
OriginPro (Originlab, MA, SUA). Toate semnificațiile testate au fost efectuate în RStudio
(RStudio, Boston, MA, SUA, 2019) cu semnificația determinată la intervalul de încredere de
95%.
 3.Rezultate si discutii

3.1.Date de fermentare

Profilurile de fermentație sunt prezentate în Fig. 2, iar coeficienții funcțiilor logistice

aplicate demonstrează că fiecare fermentație a urmat un model sigmoidal consistent. Fermentarea
mustului nesteril pare să aibă o fază de întârziere scurtată, cu un efect foarte mic observat în ceea
ce privește modificarea greutății specifice la înclinarea S. cerevisiae, cu toate acestea, rata
generală a fazei exponențiale a fost cea mai mică (B = 0,049 ± 0,005 ). Ambele musturi tratate
nu s-au atenuat complet (Fig. 2a), mustul fermentat steril asimilând 84,4 ± 2,0% din greutate
(carbohidrați), comparativ cu mustul controlat și mustul fermentat tratat nesteril la 94,4 ± 2,3%
din mustul martor. O parte din această pierdere va fi prin formarea de biomasă și consumul de
carbohidrați de către populația bacteriană, care era de așteptat.

Utilizarea limitată a tuturor nutrienților din must este probabil ca urmare a condițiilor
predominante la sfârșitul fermentației. PH-ul final mediu măsurat în SS și US a fost de 3,35 ±
0,22 și respectiv 3,34 ± 0,13. Este normal ca tulpinile de drojdie de distilerie să aibă o toleranță a
pH-ului până la cca. 3.5 și astfel este probabil ca limita de pH a drojdiei să fi fost atinsă. Deși
tratamentul a adus pH-ul sub această valoare pentru o mare parte din fermentație, este probabil
ca o pierdere a viabilității celulare, cauzată de combinația de niveluri crescute de alcool și pH
scăzut, să facă drojdia să înceteze activitatea.

Concentrații mai mari de etanol vor crește reintrarea protonilor în membrana celulară,
reducând pH-ul din citoplasmă și inhibând funcția membranei. S-a raportat că S. cerevisiae are
diverse mecanisme de adaptare la stresul acid acid, cu toate acestea, este probabil ca acumularea
unor astfel de acizi să depășească toleranța acestei tulpini. O scădere a viabilității drojdiei este
frecvent observată și se poate datora, de asemenea, creșterii numărului de bacterii spre sfârșitul
fermentației, cum ar fi Lactobacillus delbreuckii și Lactobacillus paracasei.
 Figura 3. Concentrațiile măsurate de acizi organici înainte de tratament (pre acru), în must
(începe fermentarea) și must fermentat. Acizii organici analizați au fost A) malic, B) lactic, C)
acetic, D) succinic și E) fumaric. Barele de eroare indică abaterea standard pe n = 3 eșantioane.

Prezența bacteriilor va reduce, de asemenea, oportunitatea creșterii celulelor de drojdie la

începutul fermentării prin consumul atât de O2 dizolvat, cât și de substanțe nutritive din must
înainte de adăugarea drojdiei. Pe măsură ce drojdia uscată a fost utilizată, impactul epuizării
nutrienților va fi mai mic, totuși, deoarece drojdia va avea viabilitate redusă în forma sa uscată,
aceasta poate avea o creștere a celulei redusă după inoculare. S-a arătat anterior că formatul
drojdiei are un impact asupra capacității drojdiilor de a face față condițiilor stresante. Acest lucru
va crește probabilitatea de fermentații blocate care nu se atenuează complet. S-a dovedit că
bacteriile (în special L. plantarum) măresc cantitatea de floculare care apare în primele etape ale
fermentației, când atât bacteriile cât și drojdia sunt asezate împreună în condiții de laborator.

Tabelul 1
Nivelurile de acid lactic, acetic și succinic în must și post tratament cu Lactobacillus și
diferențele în probele SS și, respectiv, din US.
 Plămăzile cu un pH scăzut pot fi limitate în continuare din cauza scăderii activității
enzimatice. S-a demonstrat că enzimele continuă să descompună zaharurile complexe din must
pe parcursul fermentării în plămăzile de whisky. În eșantionul steril (SS), enzimele de piure vor
fi fost complet denaturate în etapa de fierbere. În timp ce, din fermentația acră nesterilă (US),
modificarea pH-ului în timpul fermentației (Fig. 2b) poate avea ca rezultat inactivarea enzimelor
de degradare a dextrinei, încetând producerea zahărului din mustul descompus, rezultând
greutatea finală seminificativ mai mare.

3.2.Date analitice – fermentare

Profilul acidului organic atât în timpul tratamentului cât și al fermentației este consecvent
între loturile similare de must. Diferențe mari, în special în timpul tratamentului, arată că
nivelurile de acizi lactici, acetici și succinici cresc în concentrație de până la cinci ori (Fig. 3,
Tabelul 1). Acidul acetic a avut cea mai mare creștere procentuală atât în mustul steril, cât și în
cel nesteril, dar acidul lactic a avut cea mai mare concentrație finală a acizilor măsurați (Fig. 3).
Aceste concentrații de acizi organici sunt apoi transportate mai departe în plămada ulterioară cu
S. Cerevisiae. Cu toate acestea, nivelurile de acetic s-au dovedit a fi reduse la începutul
fermentației cu drojdie, în special cele din eșantionul US - unde o picătură de aproximativ 1000
mg/L-1 s-a observat în primele 24 de ore de fermentare. S. cerevisiae are capacitatea de a
metaboliza acidul acetic. Acesta poate fi preluat de celulă, reacționând cu acetil-CoA unde ar
putea forma metaboliți secundari, contribuind la caracterul distilatului, cum ar fi alcooli
superiori, esteri, acizi grași și alte lipide.

Tendința acizilor organici pe parcursul tratamentului și fermentației a arătat că acidul

acetic scade rapid în primele 40 de ore de fermentație, când drojdia produce etanol și alți alcooli
superiori care ar putea reacționa cu acidul acetic. S-a observat că nivelurile de acid acetic cresc
până la sfârșitul fermentației SS (după 30 de ore), totuși, se sugerează că acest lucru se datorează
autolizei drojdiei și secreției de compuși celulari și acizi organici în must.

Nivelul atât al acidului lactic, cât și al acidului succinic este în mod constant mai ridicat
în fermentația SS datorită unei faze de întârziere reduse în fermentația bacteriană, rezultat al
fierberii mustului. Mustul fiert va avea, de asemenea, o reducere semnificativă a bacteriilor
concurente (cu siguranță majoritatea, dacă nu toate bacteriile vegetative vor fi eliminate) și, prin
urmare, L. plantarum înclinat poate fi de așteptat să domine această fază de fermentare.

3.3.Date despre distilare

Mustul fermentat a fost apoi distilat de două ori, prima distilare într-un hibrid (cupru și
sticlă) încă pentru a produce distilate cu conținut scăzut de alcool și apoi distilat într-un cazan de
cupru încă pentru a produce distilatul final.

Distilatele cu conținutul scăzut în alcool au demonstrat o scădere semnificativă (p <0,05)

a litrilor de alcool pur (LPA) între probele martor și cele tratate, variind de la 1,79 LPA (martor)
la 1,46 LPA în mustul US. Acest lucru demonstrează că, în timpul fermentației, a fost produs mai
puțin alcool din toate probele de must cu bacterii, în principal din cauza lipsei de zaharuri
fermentabile. LPA nu au prezentat nicio diferență semnificativă (p> 0,05) între fermentații.
Acest lucru sugerează că s-a realizat o rectificare adecvată la toate probele de distilare, cu toate
acestea, s-a observat o reducere a randamentului spirtoase (LPA per kg de malț) din fermentațiile
folosind musturile tratate (SS și US). Acest rezultat nu a fost neașteptat, deoarece consumul de
zahăr de către bacterii va duce la o reducere a alcoolului pe moleculă de zahăr consumat.

Analiza chimică mustului fementat distilat a arătat o creștere a concentrației de acetat de

etil, semnificativ (p <0,05) în eșantionul US, comparativ cu martorul (103 ± 23 mg L − 1 și 63 ±
13 mg L − 1 ), cu o creștere a probei de SS observată, de asemenea (79 ± 22 mg L − 1). Mai
mult, alcoolii superiori propanol, izobutanol și alcool izoamilic au fost detectați la concentrații
mai scăzute în probele de distilat cu conținut scăzut de aciditate decât în martor. Analiza chimică
de la a doua distilare (Fig. 4) a constatat că niveluri scăzute de butanol au fost detectate numai în
proba martor la concentrații medii de 35,8 mg L − 1 și 28,4 mg L − 1 în previziuni. Propanolul a
fost detectat la o concentrație de 124,1 mg L − 1 în proba de distilat din US (Fig. 4).

În ambele regimuri de fermentație acidulată, nivelurile de acetaldehidă și acetat de etil au

fost îmbunătățite substanțial în comparație cu cele ale probei martor. Acetaldehida, asociată cu o
aromă eterică nu este percepută, în general, ca un atribut pozitiv al distilatului. Nivelurile
crescute de acetat de etil în ambele probe acre sunt prezentate ar putea fi rezultatul acidului
acetic produs inițial (de Lactobacillus) care ulterior este metabolizat de drojdie sau se poate
forma prin esterificare în timpul uneia dintre etapele de distilare. De obicei, esterii acetatului
conferă note fructate în distilat.

Reducerea observată la alcoolii superiori poate sugera că acizii organici produși în timpul
tratamentului de acidificare elimină acești alcooli superiori sub formă de esteri, îndepărtând
astfel de analiți din probele produse. Prin schimbarea condițiilor în timpul fermentației, se
sugerează că calea metabolică a drojdiei s-a schimbat și acest lucru a condus la o reducere a
alcoolilor superiori formați în timpul plămezilor tratate. Mai mult, nivelurile reduse de
aminoacizi (în principal datorită metabolismului de către bacterii) prezente în must pot fi
influențat cantitatea de ceto-acizi produși în celula de drojdie. Acest lucru ar inhiba formarea
aldehidei, făcând astfel producerea mai mică a produsului redus corespunzător. Acest lucru ar fi
avut o influență pozitivă asupra aromei distilatului.

Analiza esterului de urmărire a fracției tăiate principal a fost, de asemenea, efectuată

utilizând SPME-GC / MS. Din rezultatele GC / MS, nivelurile tuturor esterilor etilici - excluzând
lactatul de etil și dodecanoatul de etil - au fost mai mari la control în comparație cu ambele probe
acide.

Această discrepanță este oarecum în dezacord cu literatura de specialitate pe acest

subiect, cu toate acestea, există mai multe aspecte ale structurii experimentale care ar putea
explica diferența. Prin acțiunea de pre-acidificare a mustului înainte de fermentarea cu drojdie,
drojdia va produce ambii mai puțină biomasă din cauza lipsei de nutrienți disponibili și, de
asemenea, din cauza mediului stresant prezent de la niveluri ridicate de acizi organici. Astfel,
nivelurile de esteri ai acizilor grași precum octanoatul de etil și decanoatul de etil - derivați din
subprodusele sintezei lipidelor și alcoolilor vor fi reduse în distilatul final. Nivelurile de etanol
sunt, de asemenea, mai mari în eșantionul de control, deși este puțin probabil ca acest lucru să
aibă un impact atât de mare pe măsură ce etanolul este solventul cel mai abundent din toate
probele.

Nivelurile de lactat de etil au fost semnificativ mai mari (p <0,05) în probele tratate
datorită esterificării acidului lactic produs cu etanol cu niveluri în martor, probele SS și US fiind
de 3, 20 și respectiv 21 µg L − 1. În mod similar, s-a demonstrat că acetatul de feniletil prezintă
concentrații semnificativ mai mari (p <0,05), prin reacții similare cu alcoolul feniletilic, acest
ester conferă distilatului caracterul dulce, floral și fructat. Lactatul de etil conferă o aromă de
ceară, cu toate acestea, nu s-a văzut că are un impact semnificativ asupra calității distilatului.

Figura 5. Diagrama păianjen care prezintă rezultatul mediu din QDA a eșantioanelor de distilate
produse noi, candidații au clasat fiecare componentă 0-5 pe o scară arbitrară, n = 12.

Mustul fiert va avea un nivel redus de proteine și alți nutrienți ai mustului datorită
îndepărtării lor în timpul formării pauzei fierbinți (proteine precipitate și alte materiale). Studiile
au arătat că nivelurile reduse ale acestor constituenți de must cresc nivelul de esteri și
promovează calitatea distilatului ulterior. Mai mult, producția de esteri și alți metaboliți derivați
din drojdie va fi redusă în probele tratate datorită reducerii zahărului fermentabil în comparație
cu proba martor. Astfel, este de așteptat scăderea multor niveluri de esteri. Fierbând mustul,
zaharurile din must devin mai concentrate și gravitația (adică densitatea) crește. Măsurătorile
gravitaționale în eșantionul SS la sfârșitul tratamentului - t = 0 (Fig. 2a) - sunt mai asemănătoare
cu gravitatea inițială a fermentației perobei de control. Ca rezultat, profilul ester al probei de
control și al probei SS sunt distribuite în mod similar.

3.4.Date senzoriale

Fig. 5 prezintă rezultatele medii ale analizei descriptive cantitative (QDA) efectuate de
același grup.

Rezultatele senzoriale au arătat că toate cele trei distilate au prezentat dovezi ușoare ale
diferențelor aparente între probe atunci când au fost evaluate de BS EN ISO 4120 (CI ≥ 90%,
suplimentar 11) (British Standard, 2004). Mai mult, s-au observat dovezi ale unei diferențe
aparente moderate între proba martor și SS.

Alte dovezi ale diferențelor de distilat sunt prezentate de analiza descriptivă cantitativă
(Fig. 5). Grupul de analiști a detectat mai multe arome fructate, florale și dulci din ambele probe
- atribute asociate în general cu caracter pozitiv al distilatului - cu ambele probe acidulate.

De obicei, membrii grupului au clasat eșantionul SS mai mare în aceste categorii,

comparativ cu distilatul din US. Studiile care au implicat L. plantarum au arătat anterior că atât
notele fructate, cât și florale au fost îmbunătățite în distilat cu includerea acestei specii în timpul
fermentației. Caracteristicile mai grele, cum ar fi senzațiile de esteri, uleioase și sulfuroase, au
fost în general asociate cu proba de control.

În urma testării senzoriale, 67% dintre membrii comisiei au preferat proba sterilă, alți
25% alegând proba nesterilă iar un procent mic (8%) alegând proba de control. Deși testul de
preferință este subiectiv, deoarece nu s-a dat nicio instrucțiune pe ce să își bazeze opinia, acesta
demonstrează că preferința s-a corelat cu atributele pozitive menționate.

4.Concluzie

Prin utilizarea unei etape de tratament pre-fermentare pentru a scădea pH-ul (acrarea),
utilizând o tulpină comercială de L. plantarum, a fost influențat profilul acidului organic al unui
must fermentat tipic de distilare de whisky scoțian. Specia bacteriană a produs acizi lactici,
acetici și succinici ale căror concentrații au rămas ridicate prin fermentarea ulterioară folosind o
tulpină cunoscută de S. cerevisiae. Acidifierea a redus semnificativ pH-ul mediilor de fermentare
și astfel, fermentabilitatea mustului a fost redusă. Deși randamentele de alcool sunt semnificativ
mai mici în probele acide, ar putea fi utilizată o perioadă mai scurtă de acriere sau un timp mai
devreme de inoculare a drojdiei, care are potențialul de a reduce pH-ul final și de a permite
drojdia să rămână viabilă și activă până la finalizarea fermentației.

Distilatul probelor acidulate a prezentat niveluri mai ridicate de esteri de acetat, în special
acetat de etil și acetat de feniletil. Lactatul de etil - produs prin reacția etanolului și acidului lactic
- a fost, de asemenea, detectat la concentrații ridicate în distilatele tratate, prezentând că acizii
organici produși de speciile bacteriene pot crește concentrația esterului în distilat. Nivelurile de
alcooli superiori au fost, de asemenea, reduse comparativ cu proba de control fără acid.

Un grup senzorial a stabilit că cele trei regimuri utilizate au dat un distilat care a fost
statistic diferit prin utilizarea unui test triunghiular. Probele acidulate au produs distilatului
caracteristici dulci, florale și fructate.

Acizii organici produși în timpul fermentării pot limita producția de astfel de esteri în
timpul distilării. Prin încorporarea tulpinilor de drojdie sau bacteriene sau a condițiilor de
fermentare care încurajează producerea unor astfel de acizi (cum ar fi aceticul) se poate produce
distilat de o calitate crescută care este percepută ca având note fructate și dulci. Este probabil că
contribuția senzorială pe care o are bacteriile asupra distilatului este unul dintre efectele primare
prin metabolism și, de asemenea, efecte secundare asupra fermentării drojdiei.

Deși fișierul tehnic al whisky-ului scotch nu permite adăugarea specifică a speciilor

bacteriene să se amestece direct, acest proces poate fi utilizat pe alte piețe în care nu se aplică
astfel de restricții (CAN, IND, JPN sau SUA), oferind astfel o îmbunătățire control asupra
bacteriilor care le pot inocula producția de whisky de malț. Mai mult, drojdiile producătoare de
acid organic devin din ce în ce mai populare în rândul fabricanților de bere artizanală, ca
alternativă la bacteriile standard. Întrucât reglementările referitoare la whisky-ul scotch nu
specifică ce tulpină de drojdie trebuie utilizată pentru a produce whisky, această lucrare arată că
tulpinile de drojdie cu capacitatea de a produce acizi organici pot fi benefice pentru calitatea de
whisky-ului.