Sunteți pe pagina 1din 11

Cromatografia este o metoda de separare si analiza a substantelor chimice din amestecuri, care se bazeaza pe interactiunea diferentiata a doi sau

mai multi compusi de separat (numiti soluti) cu doua faze cromatografice: faza mobila si faza stationara. Izolarea substantelor chimice din amestecuri si id 525j99f entificarea componentelor a reprezentat ntotdeauna una dintre obiectivele prioritare ale chimiei. La ora actuala nu numai n chimia analitica ci si n tehnologia chimica se manifesta o cerere din ce in ce mai mare de compusi cu puritate foarte avansata. Separarea amestecurilor n componente este o operatie esentiala care permite obtinerea acestora ntr-o stare ct mai pura. Aceasta separare se poate face la scara analitica, daca ne intereseaza sa cunoastem numai compozitia amestecului sau la scara preparativa, daca vrem sa obtinem fizic componentele separate. n prezent exista un mare numar de metode de separare care si-au gasit aplicatii n chimie. Fiecare dintre aceste metode poate cuprinde mai multe tehnici de separare. Cele mai importante dintre metode de separare sunt cele bazate pe echilibrul ntre faze, care valorifica diferenta dintre proprietatile de distributie ale componentelor unui amestec ntre doua faze nemiscibile aflate n contact. Asemenea metode sunt distilarea, cristalizarea, precipitarea, sublimarea, extractia. Aceste metode, cunoscute si aplicate de multa vreme, s-au dovedit a fi insuficiente atunci cnd s-a pus problema separarii unor amestecuri foarte complexe si a fost nevoie de dezvoltarea unor noi metode, printre care s-au impus mai ales cele cromatografice. Principalele avanteje pe care le prezinta cromatografia ca metoda de separare sunt: Permite separarea, identificarea si dozarea cantitativa simultana a componentelor unui amestec. Se poate aplica unui numar foarte mare de produse, practic orice compus organic putnd fi separat printr-o metoda cromatografica Sensibilitatea metodelor cromatografice este extrem de ridicata, ceea ce nseamna ca necesita doar cantitate foarte mica de proba. n acelasi timp nsa se pot aplica si la scara preparativa. Durata analizei este redusa, comparativ cu alte metode de analiza ale amestecurilor complexe.

1.1. Istoric Cromatografia a fost initiata n 1901 de botanistul rus Tswet, care a separat niste pigmenti vegetali pe o coloana umpluta cu carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode provine de la faptul ca initial a folosit-o pentru separarea unor coloranti (chromos = culoare, graphos = scriere n limba greaca). Urmatorul pas important n dezvoltarea cromatografiei a fost facut n 1941, cnd A. Martin si R. Synge au initiat cromatografia lichida de repartitie pe coloana, pentru care au

primit ulterior Premiul Nobel pentru chimie n 1952. Ei au separat aminoacizi acilati pe o coloana ce continea silicagel saturat cu apa, iar drept faza mobila au utilizat n-butanol saturat cu apa. n 1944, au fost puse bazele cromatografiei pe hrtie, prima forma de cromatografie planara, iar cromatografia de schimb ionic este utilizata ncepnd din 1947. nceputurile cromatografiei de gaze se leaga tot de numele lui Archer J.P. Martin, care mpreuna cu A.T. James a separat acizi organici volatili pe o coloana de sticla umpluta cu Celite acoperita cu ulei siliconic, utiliznd ca faza mobila azotul. Cromatografia pe coloane cu gel a fost initiata n 1959 de Porath si Flodin, iar cea de bioafinitate se utilizeaza din 1967. Cromatografia de lichide moderna pe coloana, numita de nalta performanta sau de nalta presiune (HPLC) poate fi datata la nceputul anilor 1960 si se bazeaza pe lucrarile lui Csaba Horvth, efectuate la Univesitatea Yale.

1.2. Principiul separarii cromatografice


Principiul de baza al separarii cromatografice consta n distributia inegala a componentelor unui amestec ntre faza mobila si faza stationara. Acest amestec strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila. Distributia inegala este determinata fie de afinitatea diferita a componentelor amestecului fata de cele doua faze, fie de capacitatea diferita de a difuza n acestea. Acest principiu este ilustrat n Figura 1.1, pe un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa n strat foarte subtire pe peretii coloanei.

Figura 1.1. Principiul separarii cromatografice Moleculele celor doi compusi, 1 si 2 care se gasesc n momentul initial ametecate, ntrun volum restrns, vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila n faza stationara si invers, din cauza agitatiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara, ele vor fi mai puternic retinute n aceasta faza. Drept urmare, dupa un anumit interval de timp se va nregistra o ramnere n urma a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc n timpul deplasarii n coloana, deci este in proces dinamic.

1.3. Clasificarea metodelor cromatografice

Exista o serie de criterii pe baza carora se poate face o clasificare a metodelor cromatografice: mecanismul separarii, natura fazelor cromatografice, configuratia sistemului cromatografic, etc. 1. Clasificarea n functie de mecanismul separarii 1.1. Cromatografie de adsorbtie 1.2. Cromatografie de repartitie 1.3. Cromatografie cu faze chimic legate 1.4. Cromatografie de schimb ionic 1.5. Cromatografie de excluziune 1.6. Cromatografie de afinitate n functie de mecanismul separarii, metodele cromatografice se clasifica n: Cromatografie de adsorbtie, n care fenomenul principal care sta la baza separarri este adsorbtia, iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este n functie de coeficientii lor de adsorbtie. Cromatografie de repartitie, n care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor se face n functie de diferenta dintre coeficientii lor de repartitie ntre cele doua faze. Cromatografie cu faze chimic legate, care este intermediara ntre cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie, fiind o combinare a acestora. Cromatografia de schimb ionic, care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia, iar separarea componentelor se face n functie de sarcinile lor electrice, constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel), n care fenomenul principal este difuzia, iar separarea se face n functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. Cromatografia de bioafinitate, n care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate.

Trebuie mentionat ca n afara n practica cromatografica se ntlnesc si variante intermediare sau mixte ntre aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie, care sunt nsa mai putin uzuale.

2. Clasificarea n functie de natura fazelor cromatografice 2.1. Cromatografie de gaze 2.1. Gaz-lichid (GLC) 2.2. Gaz-solid (GSC) 2.2. Cromatografie de lichide 2.1. Lichid-lichid (LLC) 2.2. Lichid-solid (LSC) 2.3. Cromatografie cu fluide supercritice (SFC) n functie de starea de agregare a fazei mobile, avem trei tipuri de cromatografie: gazoasa, lichida si cu fluide supercritice. Fiecare dintre acestea se submparte n functie de natura fazei stationare, care poate fi solida sau lichida. n cazul cromatografiei cu fluide supercritice n denumire nu se face referire la natura fazei stationare. Mai trebuie precizat ca n cazul n care faza stationara este lichida, ea trebuie fixata pe un suport solid corespunzator, n general un material poros. 3. Clasificarea n functie de configuratia sistemului cromatografic 3.1. Cromatografie pe coloana 3.1. Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutura) 3.2. Cromatografie pe coloane capilare 3.2. Cromatografie planara 3.1. Cromatografie n strat subtire 3.2. Cromatografie pe hrtie n functie de configuratia sistemului cromatografic, avem cromatografie pe coloana si cromatografie planara. Cromatografia pe coloana cuprinde cromatografia pe coloane clasice (cu umplutura) si cromatografia pe coloane capilare (numite si coloane tubulare deschise). Cromatografia planara cuprinde la rndul ei cromatografia pe hrtie si cromatografia n strat subtire.

1.4. Schema de principiu a cromatografului


Este prezentata n Figura 1.2. Faza mobila care se gaseste ntr-un rezervor de faza mobila 1 trece printr-un dispozitiv de masurare si reglare a debitului 2, apoi ajunge n dispozitivul pentru introducerea probei 3. Aici are loc preluarea probei de catre faza mobila, peoba fiind n continuare transportata prin coloana cromatografica 4, unde are loc separarea componentelor. Coloana 4 se gaseste n mod uzual ntr-o incinta termostatata (cuptor n cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza sa se desfasoare la o temperatura stabilita. Componentele separate ajung n detectorul 5, unde fiecare componenta este pusa n evidenta sub forma unui semnal distinct. Aceste semnale sunt nregistrate de un nregistrator 6 sau reprezinta semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor. 1 - rezervor faza mobila 2 - dispozitiv de reglare si masurare a debitului 3 - dispozitiv de introducere a probei 4 - coloana cromatografica 5 - detector 6 - nregistrator sau integrator

Prob p Figura 1.2. Schema de principiu a cromatografului Diagrama care reprezinta rezultatul analizei cromatografice se numeste cromatograma. Ea este nregistrata n general ca o functie a intensitatii semnalului detectorului n raport cu timpul. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare n cromatograma se numeste pic cromatografic, iar aria picului este proportionala cu concentratia componentei respective. n cazul cromatografiei planare, cromatograma este chiar placa sau hrtia pe care a avut loc

analiza, iar componentele sunt evidentiate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatograma este data n Figura 1.3.

Figura 1.3. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. Fiecare pic cromatografic reprezinta cte o componenta separata.

Cromatografia grupeaz o variat i important grup de metode care permit cercet torului s separe compu i foarte asem n tori din amestecuri complexe. n toate separ rile cromatografice proba este dizolvat ntr-o faz mobil : gaz, lichid sau fluid supercritic. Aceast faz este frecvent numit eluent, iar dup ce trece de cap tul coloanei se nume te eluat. Metoda cromatografic a fost descoperit de botanistul rus Mihail Tsvet, n 1906 i a fost folosit nti pentru separarea unor substan e colorate pe coloan sau ca eluate colorate. Dac substan ele sunt incolore, prezen a lor pe coloan sau n eluate se recunoa te prin alte metode. Metodele cromatografice sunt bazate pe adsorb ia amestecului de substan e (solidlichid;lichid-lichid; gaz-lichid) pe un material adsorbant, urmat de desorb ia succesiv (cu ajutorul unui dizolvant adecvat eluant) a componentelor din amestec. Coloana de adsorbant poate fi nlocuit , n unele variante cu o foaie de hrtie poroas preparat n mod special (cromatografie pe hrtie) sau cu un strat sub ire de adsorbant fixat pe o plac de sticl , cu ajutorul unui liant (cromatografie n strat sub ire).

Separarea compusului de analizat de poten ialele interferen e este unul din pa ii esen iali n analiza chimic . Cromatografia este una dintre cele mai frecvent utilizate metode pentru a realiza aceste separ ri analitice. Aplica iile cromatografiei cresc exponen ial cu timpul, n mare parte datorit faptului c ea i g se te aplica ii n toate ramurile tiin ei. Este rapid , simpl , cu costuri relativ reduse i variabilitate mare relativ la alegerea metodei de separare. O analiz cromatografic se rezum n general la urm toarele concepte fundamentale: proba este dizolvat n faza mobil ; faza sta ionar este cel mai frecvent un lichid adsorbit la suprafa a unor particule de solid utilizate pentru a mpacheta coloana; faza mobil este trecut peste faza sta ionar nemiscibil ; aceasta se nume te elu ie; solutul care are o mare afinitate fa foarte ncet; de faza mobil se va mi ca prin coloan

componen ii probei se vor separa n benzi discrete vizibile la detector, i rezult cromatograma. Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor asem n toare. Ea poate fi de asemenea utilizat pentru determin ri cantitative i calitative ale speciilor separate, n termeni de informa ie calitativ , o cromatogram furnizeaz timpul de reten ie al speciilor sau pozi iile acestora pe faza sta ionar dup un timp de elu ie specific. Cromatografia poate fi extrem de util pentru recunoa terea prezen ei sau absen ei unor componen i n amestec ce con ine un num r limitat de specii cunoscute. Confirmarea identit ii serve te i pentru alte investiga ii, i nu n ultimul rnd cromatografia serve te ca precursor pentru alte analize chimice calitative sau pentru analize spectroscopice. Informa ia cantitativ este principalul motiv pentru care cromatografia are o att de larg folosin . Ea se bazeaz pe compararea mai multor n l imi sau suprafe e ale picurilor analitice cu etaloane. Analiza bazat pe aria picurilor, care este independent de efectele de deformare este mult mai precis i de aceea mult mai comun . Oricum, toate datele cantitative sunt dependente de prepararea

standardelor i calibr rile succesive ale coloanei folosind aceste standarde. F r exactitate i calibrare precis a datelor, nici o dat cromatografic nu poate fi considerat exact . Sunt 5 categorii de cromatografii: de adsorb ie; de parti ie; cu schimb de ioni; prin excluziune molecular ; de afinitate. Metodele de cromatografie pot fi de asemenea clasificate n dou moduri: cromatografia planar i cromatografia pe coloan . Ele sunt bazate pe interac iunea fizic , ceea ce nseamn c faza sta ionar i faza mobil sunt n contact. n cromatografia pe coloan , faza sta ionar este introdus n interiorul unui tub ngust i faza mobil este introdus n tub cu ajutorul presiunii sau a greut ii proprii. n contrast, cromatografia plan folose te o faz sta ionar care este depus pe o suprafa plan sau n hrtie. Faza mobil se deplaseaz prin faza sta ionar datorit ac iunii capilare sau a greut ii. Cromatografia de lichide, gaze i de fluide supercritice sunt 3 clase generale bazate att pe tipurile de faze mobile i sta ionare ct i tipurile de echilibre implicate n transferul solutului ntre faze. Fazele mobile sunt gaze, lichide i fluide supercritice. Fazele sta ionare variaz i tipul de echilibru este dependent de alegerea acestei faze. Cromatografia de adsorb ie utilizeaz o faz sta ionar solid i o faz mobil care este un lichid sau un gaz. Solutul poate fi adsorbit la suprafa a particulelor solide, unde echilibrul dintre starea adsorbit i solu ie produce separarea moleculelor solutului. n cromatografia de parti ie faza sta ionar este un film sub ire pe suprafa a unui suport solid. Solutul stabile te un echilibru ntre lichidul sta ionar i faza mobil (lichid sau gazoas ). n cromatografia de schimb ionic anionii sau cationii sunt lega i covalent de o faz sta ionar solid , frecvent o r in sau o faz solid tare i amorf . O faz mobil lichid este utilizat . Ionii solutului de sarcin opus sunt atra i de faza sta ionar datorit for elor electrostatice. Cromatografia de excluziune molecular este mai comun denumit de gel permeabil sau de filtrare cu gel. Aceast tehnic separ moleculele dup m rime i moleculele mari trec cu o vitez mai mare dect moleculele mici. Nu exist interac iuni atractive. n loc, faza mobil gazoas sau lichid este trecut printr-un gel poros, care exclude moleculele mari, dar nu i pe cele mici.

Moleculele mari curg peste f r a intra n gel, i ele elueaz primele. Cromatografia de afinitate este bazat pe interac iunea ntre un tip de molecule de solut i un al doilea tip, acestea legate covalent de faza sta ionar . Cnd un amestec este trecut prin coloan , doar un tip de molecule de solut reac ioneaz cu moleculele legate i formeaz leg turi la r in . Moleculele de solut dorite sunt dislocate apoi de moleculele legate variind pH-ul sau t ria ionic a solventului . n cromatografia de gaze (GC) lichidul volatil este injectat cu ajutorul unei pompe de cauciuc ntr-un port injector, care vaporizeaz proba. Probele gazoase pot fi injectate folosind osiring adecvat . Un gaz inert purt tor poart proba prin coloana ce con ine faza sta ionar . Gazul purt tor serve te ca faz mobil . Dup traversarea coloanei, particulele separate de solut intr ntr-un detector. R spunsul este afi at pe un calculator ca func ie de timp. n cromatografia pe strat sub ire (TLC), un spot de prob este aplicat peste o bucat de hrtie sau sticl avnd faza sta ionar impregnat . Cap tul suprafe ei de hrtie sau sticl este apoi scufundat ntr-o cantitate de solvent, care serve te ca faz mobil . Solventul migreaz de-a lungul fazei sta ionare, separnd componen ii probei n lungul drumului s u. Cnd solventul ajunge n vecin tatea p r ii superioare, este nl turat cantitatea suplimentar de solvent i este l sat s se usuce. C iva dintre componen ii probei sunt vizibili n acest moment.Alte m sur tori sunt n mod curent efectuate pentru a detecta to i componen ii probei . Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) refer noile proceduri de

cromatografie de lichide bazate pe o instrumenta ie sofisticat . Acestea sunt cele mai mult folosite dintre toate metodele de separare . Detec ie Foarte multe detectoare sunt angajate n separ rile cromatografice. Detec ia absorban ei moleculare UV-VIS este cea mai comun . Detectorul ideal este necesar

s aib : sensibilitate adecvat ; bun stabilitate i reproductibilitate; timp de r spuns scurt; r spuns liniar la diferite ordine de concentra ie; stabilitate pe un larg domeniu de temperatur ; durat lung de via i u urin n utilizare. Monocromatorul este adesea o component a instrumentului UV-VIS. El permite scan ri spectrale, ceea ce nseamn capacitatea de a varia lungimea de und a radia iei n mod continuu ntr-un domeniu larg. Fantele monocromatorului joac un rol important. Fanta de intrare serve te ca surs de radia ie. Fantele largi sunt tipic utilizate pentru determin ri cantitative n care detaliulspectral este important, n compara ie cu analiza calitativ . Metode de prelucrare a informa iei cromatografice Metoda standardului intern furnizeaz cea mai mare precizie pentru cromatografia cantitativ deoarece ea elimin incertitudinile introduse de simpla injec ie. n aceast metod , o cantitate exact m surat de substan este ad ugat fiec rui standard sau probe. Standardul intern trebuie s fie ales astfel nct el s se separe foarte bine de celelalte picuri componente ale probei. De asemenea, picul standard trebuie s fie aproape de picul analitic. Cantitatea de substan din picul de standard intern serve te apoi ca parametru analitic. Metoda normaliz rii ariilor este o alt aproximare utilizat pentru eliminarea incertitudinilor asociate cu simpla injec ie. n aceast metod , aria tuturor picurilor complet eluate este calculat . Concentra ia analitic este g sit ca raport al ariei de pic la aria total a tuturor picurilor. L rgimea benzii n cromatografie O cromatogram : ilustreaz r spunsul detectorului la un compus de analizat din prob la ie irea acestuia din coloan ca func ie de timp sau de volum de faz mobil ad ugat ; este util att pentru determin rile cantitative ct i calitative; furnizeaz o serie de picuri, unde aria de sub picuri furnizeaz informa ia cantitativ despre cantitatea de component iar pozi ia picului serve te pentru identificarea compusului din prob ;

Cteva forme de band pe cromatogram este posibil s depind de concentra ia compusului de analizat n fazele mobil i sta ionar i de comportamentul fiec rui compus n parte