MTODOS DE ESTUDO DA CLULA

A clula pode ser estudada sob o aspecto morfolgico (forma) geral e de seus componentes, sob o aspecto bioqumico e sob o aspecto de seu funcionamento fisiolgico; para cada um dos quais, se aplica um mtodo e uma tcnica especficos. O constante aperfeioamento da microscopia ptica e eletrnica permitiu estudar e observar a clula e seus componentes estruturais e moleculares. As tcnicas de anlise qumica e de biologia molecular contriburam para esclarecer o funcionamento dessas estruturas e elucidar muitos outros aspectos da biologia dos organismos. A ressonncia magntica nuclear permite determinar a estrutura de pequenas molculas em soluo e os novos microscpios confocais a laser, associados a tratamento computadorizado de V01/imagem, constituem poderosos instrumentos que nos auxiliam obter as informaes necessrias compreenso do funcionamento da clula e dos organismos.

MICROSCOPIA Conjunto de tcnicas para observao de objetos de dimenses muito reduzidas.

Limites de resoluo Olho humano Microscpio ptico Microscpio eletrnico valor 0,1mm 0,27 m 0,025 Proporo 1= padro 500 x 100.000 x

As dimenses celulares so menores que o limite de nitidez do olho humano, sendo, portanto, impossvel observ-las a olho nu. Para visualiz-las necessrio recorrer a instrumentos que aumentem nosso poder de resoluo. Poder de resoluo a capacidade visual de distinguir dois pontos ou capacidade de um sistema ptico de revelar detalhes da estrutura. No se trata, portanto, de simples ampliao da V01/imagem e sim da nitidez com que possvel diferenci-la. O poder de resoluo do olho humano de 0,1 mm. Duas linhas paralelas mais prximas entre si do que essa distncia sero visualizadas como uma nica linha, e objetos que tenham dimetro menor do que esse intervalo sero invisveis ou vistos como borro sem foco. Os microscpios so aparelhos que aumentam e resolvem nossa capacidade visual. O poder de resoluo de um microscpio limitado metade do comprimento de onda de sua fonte; luz para o microscpio ptico e eltrons acelerados para o eletrnico. Assim, mesmo com as lentes mais perfeitamente construdas, tendo a luz branca um comprimento de onda mdio de 0,55 m a melhor resoluo obtida para o microscpio ptico ser de 0,27m, o que corresponde a um aumento de resoluo para o olho humano de 500 vezes. Eltrons de alta velocidade so empregados no microscpio eletrnico ao invs de ondas de luz. Os eltrons acelerados, dentro do microscpio por uma diferena de potencial de 60.000 volts, possuem um comprimento de onda em torno de 0.05 , com poder de resoluo de 0,025 . O aumento de resoluo para o olho humano seria de 400.000 vezes, porm, devido a dificuldades de preservar os finos cortes submetidos ao bombardeio de eltrons e ao conseqente aquecimento, so empregadas resolues de at 100.000 vezes. Preparao para o uso de microscpios Fixao Incluso Cortes Colorao Para podermos observar clulas ao microscpio preciso cortes de alguns micrometros de espessura. Como as clulas so gelatinosas e moles, para serem cortadas em fatias finas, preciso endurec-las sem alterar sua estrutura. A fixao um tratamento, qumico ou fsico, efetuado sobre clulas vivas que provoca sua morte, porm, preserva suas formas com um mnimo de danos s estruturas celulares. A fixao pode ocorrer pela tcnica de congelamento, congelando as clulas, ou pelo mtodo da incluso, substituindo a gua por um outro lquido passvel de endurecimento em certas condies. Fixao por tratamento qumico A fixao por tratamento qumico realizada colocando-se as clulas em lquidos fixadores. Alguns

fixadores atuam como coagulantes das protenas como o cido actico diludo, o lcool etlico, as solues aquosas de cido pcrico ou cloreto de mercrio. Para a conservao e a consolidao das ultra-estruturas, s so empregados os fixadores no-coagulantes. O mais usado o tetrxido de smio, em soluo a 1% num tampo salino de pH prximo da neutralidade, que na microscopia eletrnica atua, tambm, como contraste. Outros fixadores so o permanganato de potssio em soluo aquosa a 1%, o aldedo frmico em soluo aquosa a 40% (formol) e o glutaraldedo em soluo tampo a pH 7,2. Cada um dos fixadores apresenta vantagens e desvantagens, de forma que se recorre a misturas de fixadores para melhores resultados. Fixao por tratamento fsico O tratamento fsico mais comumente usado para a fixao o congelamento. A pea a ser fixada resfriada rapidamente, seja por imerso num lquido de baixa temperatura como nitrognio liquido, -196 o C, propano, -196 ou o hlio - 272 seja por descarga de gs carbnico comprimido (-60 Podemos C, C, C). igualmente fixar as clulas aquecendo-as rapidamente, tratamento que tem por fim coagular as protenas celulares, em microscopia ptica. Esse ltimo mtodo, muito rpido, usado freqentemente em hematologia, para fixao das clulas sangneas espalhadas em esfregaos. Incluso O endurecimento das amostras feito substituindo-se a gua das clulas por um lquido de incluso que posteriormente solidificado. O endurecimento por incluso obtido pela substituio da gua das clulas por parafina quente, que endurece pelo resfriamento. Essa substituio no possvel de ser feita diretamente. Primeiro a gua das clulas fixadas substituda por lcool etlico e depois por tolueno, que pode misturar-se com a parafina lquida. Na microscopia eletrnica, os cortes so muito menores e os meios de incluso devem ser muito mais duros que a parafina. Utilizam-se resinas plsticas do tipo epxi, como Araldite e Epon. As clulas so fixadas em lcool etlico, no qual a resina solvel, em seguida, na presena de um catalisador e sob calor, a resina endurece. Os blocos obtidos de parafina, de gelo ou de resinas, so submetidos cortes finos em aparelhos especializados, designados de micrtomos. Na microscopia ptica os cortes, com espessura de 1 a 6 m so feitos com uma lmina cortante de ao. Na microscopia eletrnica, esses cortes so feitos com lminas de vidro ou diamante e a espessura de 0,02 a 0,1 m. Colorao Os cortes preparados so normalmente difanos, porque a maioria das organelas e incluses celulares so transparentes luz e incolores. Para aumentar o contraste e melhorar a visualizao so empregadas tcnicas de colorao. Na microscopia eletrnica, esse contraste possvel porque algumas estruturas podem ser tornadas mais densas aos eltrons com o emprego de substncias que contenham metais pesados, tais como o smio, urnio, chumbo, bismuto, e mangans. Na microscopia ptica so conhecidos muitos processos de colorao. Os chamados corantes vitais so empregados para observao de clulas vivas, como o verde Janus, azul de metileno, vermelho neutro e outros. Os corantes podem ser ortocromticos, quando no alteram a cor que as clulas apresentam ou metacromticos, quando a alteram. Quanto afinidade qumica os corantes podem ser cidos, bsicos e neutros. Os corantes cidos, como o cido smico, eosina, fucsina cida, orange G, p.a.s. (periodic acid schiff), coram estruturas bsicas, que so designadas de acidfilas (amigas de cidos). Os corantes bsicos como o azul de metileno, azul de toluidina, hematoxilina, lugol, orcena, verde Janus, violeta-de-genciana, coram estruturas cidas designadas de basfilas (amigas de bases). O corante neutro mais empregado o vermelho neutro. Normalmente, vrios corantes so empregados para melhores resultados, como a dupla hematoxilina eosina. Microscpio ptico composto

O microscpio ptico e formado por uma parte mecnica de suporte e de um sistema de lentes, em um tubo telescpico. A aproximao e o afastamento do sistema de lentes ao objeto observado, ajustando a melhor focalizao

visual obtida por dois botes reguladores: o macromtrico, de definies maiores e o micromtrico de ajustes finos. O charriot um sistema que permite a movimentao horizontal da lamnula. O sistema de lentes composto pelas lentes: condensadora, objetiva e ocular. O aumento da V01/imagem o resultado do aumento fornecido pela lente ocular multiplicado pelo aumento fornecido pela lente objetiva. A resoluo da V01/imagem depende exclusivamente do poder de resoluo da lente objetiva, porque a lente projetora, a ocular, pode aumentar somente o que a objetiva j resolveu. A lente condensadora faz incidir um cone de luz sobre o objeto. A luz passa atravs do objeto, aumentada e resolvida pela lente objetiva e , mais uma vez, ampliada pela lente ocular. Se a resoluo da objetiva for de 0,5m e aumento de 40x e a ocular aumentar 15x, significa que s poderemos observar espcimes de dimenses maiores que este limite com ampliao de 600x. A lente objetiva de imerso a leo a de melhor resoluo.

Microscpio de contraste de fase As diferentes estruturas celulares tm maior ou menor quantidade de matria ou densidade. Quanto maior a densidade maior ser o atraso da luz ao atravess-lo e menor o ndice de refrao. Isto provoca diferenas de fase da luz emergente, que atravs de um sistema ptico especial, transformado em diferentes intensidades de luz, na formao da V01/imagem. Este microscpio excelente para observao de clulas vivas, em suas diferentes fases, sem a necessidade de corantes. Microscpio confocal O microscpio confocal utiliza um fino feixe de raio laser que corre pelo corte iluminando apenas um plano de observao. A V01/imagem formada pelas estruturas que esto no plano iluminado e as estruturas situadas acima ou abaixo deste plano no contribuem para a formao da V01/imagem. Assim como na topografia computadorizada, as imagens so processadas em um computador e podem ser montadas tridimensionalmente no monitor, alm de ter seus dados biomtricos quantificados. Microscpio de polarizao O microscpio de polarizao semelhante ao microscpio ptico, sendo que no lugar da lente condensadora existe um polarizador que emite um feixe de luz polarizada sobre o objeto. Na lente ocular existe um analisador. Se um feixe de luz polarizada no desviado, ele ser totalmente absorvido pelo analisador e no formar V01/imagem. Com o uso de um feixe de luz polarizada podemos evidenciar as regies anisotrpicas ou birrefringentes das clulas, aquelas que desviam a luz polarizada em dois feixes perpendiculares, sendo que, um deles passar pelo analisador e formar a V01/imagem. Como a birrefringncia est ligada presena de partculas ou de molculas assimtricas dispostas regularmente, alongadas e paralelas, que dividem o feixe polarizado em dois planos perpendiculares, possvel ter-se uma idia da organizao de certas estruturas nesse nvel. As estruturas que no apresentam a organizao acima no modificam o plano de luz polarizado, so chamadas isotrpicas, e no so observadas nas imagens que emergem deste microscpio. As estruturas contrteis das clulas musculares foram evidenciadas pelo uso deste tipo de aparelho. Microscpio eletrnico

Consiste em um tubo blindado acoplado a uma bomba de vcuo. Os eltrons so emitidos por um filamento de tungstnio aquecido vcuo. O filamento emissor representa o ctodo. So acelerados por uma diferena de potencial de 60.000 a 100.000 volts, entre o ctodo e o nodo. O nodo uma placa perfurada que deixa passar apenas um feixe de eltrons. Este feixe passa por uma lente magntica condensadora que o dirige diretamente ao objeto. medida que esses eltrons passam atravs do objeto, parte do espcime absorve ou espalha os eltrons diferencialmente. Os eltrons que passam pelo objeto atravessam o campo magntico de outra bobina, a lente magntica objetiva, ocorrendo aqui uma primeira ampliao do feixe, que projetado para um segundo campo magntico da lente projetora que dirige este feixe ampliado, mais uma vez, a uma placa revestida de sulfeto de zinco (ZnS), o gran; tela fluorescente que produz a V01/imagem. A V01/imagem obtida corresponde aos eltrons que passaram pelo objeto e incidiram sobre a placa. Os eltrons absorvidos ou desviados por partes do objeto no contribuem para a formao da V01/imagem, aparecendo como estruturas escuras. Como o olho humano no estimulado por eltrons, existe a necessidade de chapas ou anteparos. Selecionadas as imagens, o gran retirado, fazendo incidir os eltrons sobre uma chapa fotogrfica. O filme revelado e ampliado at 4 vezes. A V01/imagem assim obtida chamada de micrografia.

Microscpio eletrnico de varredura Similar ao microscpio eletrnico comum ou de transmisso, funciona com um feixe de eltrons e suas lentes magnticas. O feixe de eltrons pode ter seu dimetro modificado e direcionado, por um novo par de lentes magnticas defletoras, que fazem o feixe de eltrons percorrer a superfcie do objeto ponto a ponto em linhas paralelas (varredura). Os eltrons desviados diferencialmente pela superfcie varrida so colhidos por um coletor, passam por um sistema ampliador e a V01/imagem gerada em um monitor. As micrografias so obtidas diretamente do monitor. A resoluo menor que a do microscpio eletrnico comum, mas objetos bem maiores, de at de um centmetro, podem ser observados. O contraste realizado aps a fixao emprega uma pulverizao de ouro ou platina.