Deteco e Identificao de Bactrias de Importncia Mdica

Mdulo V

NDICE
Estafilococos, estreptococos, enterococos e outros cocos gram positivos ........................................ 1 Introduo..............................................................................................................................................1 Identificao preliminar ............................................................................................................................1 Identificao de estafilococos ....................................................................................................................3 Identificao dos staphylococcus aureus.....................................................................................................4 Identificao dos estreptococos .................................................................................................................5 2. Neisserias......................................................................................................................................... 9 Introduo..............................................................................................................................................9 Isolamento ........................................................................................................................................... 10 Transporte e semeadura do material........................................................................................................ 11 Bacterioscopia e identificao.................................................................................................................. 11 3. Enterobactrias .............................................................................................................................. 14 introduo ............................................................................................................................................ 14 tipos de testes utilizados para identificao............................................................................................... 15 etapas da identificao de enterobactrias................................................................................................ 18 identificao das enterobactrias de importncia clnica ............................................................................. 19 identificao sorolgica .......................................................................................................................... 27 4. Bastonetes no fermentadores....................................................................................................... 31 Introduo............................................................................................................................................ 31 Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao ................................................................... 31 Procedimentos para a identificao .......................................................................................................... 33 5. Bacilos curvos ou espiralados......................................................................................................... 41 Introduo............................................................................................................................................ 41 Campylobacter ...................................................................................................................................... 42 Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas........................................................................................................... 43 6. Bacilos gram positivos.................................................................................................................... 45 Introduo............................................................................................................................................ 45 Corineformes ........................................................................................................................................ 46 Bacilos gram positivo ............................................................................................................................. 50 Bacilos esporulados aerbios e anaerbios facultativos............................................................................... 52 Actinomicetos ....................................................................................................................................... 54 7. Fastidiosos ..................................................................................................................................... 56 Introduo............................................................................................................................................ 56 Bartonella............................................................................................................................................. 58 Bordetella............................................................................................................................................. 59 Brucella................................................................................................................................................ 60 Francisella tularensis.............................................................................................................................. 61 Haemophylus ........................................................................................................................................ 62 Legionella ............................................................................................................................................. 64 Pasteurella ........................................................................................................................................... 65 Actinobacillus ........................................................................................................................................ 66 Capnocytophaga.................................................................................................................................... 68 Eikenella .............................................................................................................................................. 68 Kingella................................................................................................................................................ 68 Cardiobacterium hominis ........................................................................................................................ 69 Chromobacterium violaceum................................................................................................................... 69 Streptobacillus moniliformis .................................................................................................................... 70 8. Bactrias anaerbias estritas ......................................................................................................... 71 Introduo............................................................................................................................................ 71 Coleta de material ................................................................................................................................. 73 Transporte do material........................................................................................................................... 73 Processamento do material ..................................................................................................................... 73 Identificao bacteriana ......................................................................................................................... 74 Provas de sensibilidade a antimicrobianos................................................................................................. 77 9. Interpretao de Resultados e laudos ............................................................................................ 78 Introduo............................................................................................................................................ 78 Laudo para o trato respiratrio superior ................................................................................................... 79 Laudo para escarro ................................................................................................................................ 81 Laudo para secreo endotraqueal, lavado traqueal, e lavado brnquico ...................................................... 81 Laudo para lavado brocoalveolar ou escovado brnquico ............................................................................ 82 Laudo para pleural................................................................................................................................. 84 Laudo para abscesso pulmonar ............................................................................................................... 84 Laudo para ocular.................................................................................................................................. 84 Laudo para lquido cfalo raquidiano (LCR) ............................................................................................... 85 Laudo para fezes ................................................................................................................................... 85 Laudo para pele, abscessos e feridas ....................................................................................................... 86 Laudo para genital................................................................................................................................. 88 Laudo para urina ................................................................................................................................... 89 Laudo para sangue ................................................................................................................................ 92 10. Referncias Bibliogrficas .............................................................................................................. 93 1.

1. ESTAFILOCOCOS, ESTREPTOCOCOS, ENTEROCOCOS E OUTROS COCOS GRAM POSITIVOS

INTRODUO Os Estafilococos so as bactrias no esporuladas que mais resistem no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em amostras clnicas secas, so relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma concentrao aumentada de sal. No entanto, apesar dos antimicrobianos existentes, da melhora das condies sanitrias e das medidas de controle de infeco hospitalar, este microrganismo continua a ser um dos mais importantes patgenos para o homem. Indivduos sadios so colonizados intermitentemente por Staphylococcus aureus desde a amamentao, e podem albergar o microrganismo na nasofaringe, ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir destes stios, o S. aureus pode contaminar a pele e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes por contato direto ou por aerossol, ocasionando infeces letais por conta dos fatores de virulncia ou atravs de resistncia aos antimicrobianos atualmente utilizados. J foram descritos no Brasil casos de infeces causadas por Staphylococcus aureus parcialmente resistentes aos antibiticos mais potentes como a Vancomicina, e relatos da capacidade que os Staphylococcus coagulase negativa tem de desenvolver resistncia. Assim h necessidade de uma identificao rpida e eficiente de todos os casos em que estes microrganismos se apresentam. Os estreptococos foram os maiores causadores de infeco hospitalar na era pr-antibitica, causando surtos de infeco e morte de purperas. Apesar de no serem atualmente uma importante causa de infeco hospitalar, provocam, no entanto, doenas muito graves e muitas vezes letais, mesmo em pacientes imunocompetentes, sendo importante o rpido diagnstico deste agente. J os enterococos apresentam importncia crescente como causadores de infeco hospitalar, pelo aparecimento de resistncia quase total aos antibiticos tradicionalmente utilizados para tratamento destas infeces. Os Enterococos mais comumente isolados so: Enterococcus faecalis (90% dos casos) e Enterococcus faecium, com grande capacidade de colonizao de pacientes e de contaminarem superfcies ou equipamentos utilizados em hospitais. Possuem sensibilidade ou resistncia varivel aos antibiticos chamados glicopeptdios como a vancomicina e teicoplanina. Existem, atualmente, cepas comensais naturalmente resistentes a vancomicina e que podem ser isoladas de pacientes internados, porm no sendo ainda capazes de causarem surtos, mas que devem ser corretamente identificadas. IDENTIFICAO PRELIMINAR A identificao dos estreptococos e estafilococos baseada na morfologia que apresentam em meios lquidos. Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados. A identificao presuntiva comea com a inoculao primria na placa de gar sangue de carneiro que deve ser incubada em 5% de tenso de CO (mtodo da vela ou estufa de CO2). As colnias de estafilococos so geralmente maiores, convexas, de colorao variando do branco-porcelana a amarelo podendo apresentar hemlise ou no. Note-se que o desenvolvimento da cor amarelada no S. aureus ocorre somente aps incubao prolongada (72 h), temperatura ambiente. As colnias de estreptococos tendem a serem menores (puntiformes), e com halos de hemlise total ou parcial (beta e alfa hemlise). A diferenciao entre os estreptococos e os estafilococos se d, seguramente, pela prova da catalase.

PROVA DA CATALASE
Com a ala bacteriolgica ou com um palito coleta-se o centro de uma colnia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregao uma gota de gua oxigenada a 3% e observar a formao de bolhas. Para a famlia Microccocacea (estafilococos) a prova geralmente positiva, enquanto que para a famlia Streptococcacea (estreptococos) negativa.

Mod V - 1

Diviso dos cocos Gram positivo pela prova da catalase

Catalase positivos Staphylococcus spp. Micrococcus spp. Planococcus spp. Stomatococcus spp. Catalase negativos Enterococcus spp. Streptococcus spp. Aerococcus spp. Gemella spp., Leuconostoc spp. Lactococcus spp., Stomatococcus spp.

Ao coletar a colnia, no carregar meio de cultura (gar sangue), que pode acarretar resultados falsopositivos porque o sangue do meio contm catalase. Algumas cepas de enterococos podem dar falsa reao positiva (fazer Gram e ver disposio em cadeias curtas ou aos pares). Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica
Gnero Catalase Motilidade NaCl 5% Oxidase Aerbio estrito no + varivel no no no no Ttrade

Staphylococcus Planococcus Micrococcus Enterococcus Streptococcus Aerococcus Stomatococcus * * aderente ao meio

+ + + neg neg neg varivel

neg + neg varivel neg neg neg

+ + + + varivel + neg

neg neg + neg neg neg neg

varivel varivel varivel no no + varivel

Cocos Gram positivo, Catalase negativa, Motilidade Negativa

Gnero Enterococcus Streptococcus Aerococcus Leuconostoc Pediococcus Gemella Stomatococcus
1 2 3

NaCl 6,5% + neg + varivel varivel neg neg

Vancomicina varivel sensvel sensvel resistente resistente sensvel sensvel

PYR + neg
2

Bile Esculina + neg

3

Ttrade no no varivel no varivel no varivel

varivel neg neg + +

varivel varivel + neg +

E. casseliflavus e E. gallinarum so positivos S. pyogenes positivo alguns S. viridans podem ser positivos

Mod V - 2

IDENTIFICAO DE ESTAFILOCOCOS O teste mais importante na identificao da famlia Micrococcaceae a prova da catalase, e esta famlia composta de quatro gneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e Staphylococcus. O gnero Staphylococcus apresenta 32 espcies, 14 subnegespcies, sendo que somente 15 espcies so encontradas em amostras humanas, e de uma maneira prtica, os estafilococos so divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase. Provas diferenciais dos generos Catalase positivos
Gnero Motilidade NaCl 5% Oxidase Aerbio estrito no + + no Ttrade

Staphylococcus Planococcus Micrococcus Stomatococcus

neg + neg neg

+ + + neg

neg neg + neg

varivel varivel + varivel

Identificao das espcies de Staphylococcus de maior importncia clnica

Espcie S. aureus S. epidermidis S. lugdunensis S. haemolyticus S. saprophyticus S. schleiferi S. intermedius S. hyicus DNAse + neg neg neg neg neg + + PYR neg neg + + neg + + neg Novob. sensvel sensvel sensvel sensvel resistente sensvel sensvel sensvel Uria varivel + varivel neg + neg + varivel Polimixina resistente resistente varivel sensvel sensvel sensvel sensvel resistente omitina + omitina neg isolado em urina Sacarose neg Outras pig. amarelo

Existem cerca de 31 espcies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais os mais freqentes so: Staphylococcus epidermidis - causador de infeces de cateteres e prteses e o mais freqente microrganismo encontrado em hemoculturas. Staphylococcus saprophyticus - causador de infeco urinria em mulheres jovens. Staphylococcus haemolyticus - importante devido resistncia aumentada aos antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemlise na placa de gar sangue de carneiro.

TESTE DA RESISTNCIA A NOVOBIOCINA

A cepa semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de Muller Hinton acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 g. As amostras resistentes mostram zonas de inibio de 6 a 12 mm, enquanto as susceptveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus so resistentes.

Mod V - 3

Testes da Trealose, Urease e Novobiocina

Espcies S. epidermidis S. haemolyticus S. saprophyticus Trealose Negativa Positiva Positiva Urease Positiva Negativa Positiva Novobiocina Sensvel Sensvel Resistente

IDENTIFICAO DOS STAPHYLOCOCCUS AUREUS A forma mais simples de identifica o Staphylococcus aureus a prova da coagulase que pode ser efetuada em tubo ou em lamina.

TESTE DA COAGULASE EM LMINA

A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante) clumping factor na superfcie da parede celular, que reage com o fibrinognio do plasma causando a coagulao do mesmo. Colocar 2 gotas de salina em uma lmina; Emulsionar uma colnia isolada a ser testada; Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plstico ou madeira; Observar se h aglutinao em 10 segundos; No se pode executar este teste a partir de um gar com grande concentrao de sal como gar manitol.

TESTE DA COAGULASE EM TUBO

Este teste baseia-se na presena da coagulase livre que reage com um fator plasmtico formando um complexo que atua sobre o fibrinognio formando a fibrina. O teste melhor efetuado se: Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colnia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma; Incubar por 4 horas 35C em estufa ou banho maria; A formao do cogulo observada pela inclinao suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical. Um mtodo alternativo a emulsificao desta mesma colnia suspeita em um 0,5 plasma e incubado da mesma forma. Qualquer cogulo indica uma prova positiva, porm no confundir com precipitados ou floculao. O melhor plasma a ser usado o de coelho com EDTA, no devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de sangue.

TESTE DA DNASE
Este teste consiste na inoculao de colnias em meio contendo DNA, (DNAse test agar) obtido comercialmente. Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentrao de 0,1%; o meio adquire uma colorao azul intensa; Incubar a 35C por 24 horas; Uma colorao rsea caracterstica ao redor das colnias produtoras de DNAse indica a positividade da prova.

Mod V - 4

O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que se retorne placa original onde nem sempre as colnias esto bem isoladas.

TESTE DA ENDONUCLEASE
Teste da endonuclease termoestvel efetuado no mesmo meio de DNA. Fever o caldo de cultura com a bactria suspeita por 15 minutos; Colocar ao meio de DNA gotas de caldo de cultura turvo com a colnia suspeita; Fazer pequenos orifcios no meio (em placa) utilizando canudos de refrigerante; A leitura do teste semelhante ao da DNAse. Note que este mtodo pode ser efetuado a partir de caldo de hemocultura em que foi observado o crescimento de cocos Gram positivos agrupados.

OUTRAS PROVAS QUE DIFERENCIAM O STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Aglutinao em ltex ou em hemcias de carneiro (sorologia). Estes testes geralmente detectam a coagulase livre e alguns apresentam tambm uma imunoglobulina antiprotena A presente da parede do Staphylococcus aureus. Como so disponveis comercialmente, deve-se seguir as instrues do fabricante.

TESTE DO CRESCIMENTO EM GAR MANITOL

O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5 % de cloreto de sdio, denominado gar manitol salgado ou Meio de Chapman. O indicador de pH o vermelho de fenol, que indica uma reao positiva quando o meio ao redor das colnias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado.

IDENTIFICAO DE OUTROS GNEROS

A diferenciao entre Micrococcus sp e os Staphylococcus sp se d pela colorao de Gram, em que os Micrococcus aparecem em ttrades, ou pela pigmentao de suas colnias (amarelas, rseas ou alaranjadas). Alguns no apresentam pigmentos e podem ser diferenciados pela sensibilidade a Bacitracina 0,004 UI, a mesma utilizada na identificao de Streptococcus pyogenes, mas utilizandose a inoculao em gar Mueller Hinton. IDENTIFICAO DOS ESTREPTOCOCOS Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparncia na placa de gar sangue aps incubao a 35C em presena de 5% de CO2, podendo apresentar: hemlise total (beta), parcial (alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama). A identificao de espcie de estreptococos beta hemolticos feita atravs de aglutinao com soros especficos contra os antgenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rpida, porm no acessvel a todos os laboratrios em virtude do elevado custo.

TESTE DA BACITRACINA
importante notar que as identificaes devem ser feitas em gar sangue sem tenso de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes. Semear meia placa de gar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma; Colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado; Incubar por uma noite a 35C sem CO2; Observar qualquer zona de inibio como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) assim rapidamente identificado.

Mod V - 5

TESTE DO SULFAMETOXAZOL TRIMETOPRIM (SXT)

Adicionar na mesma placa de gar sangue o disco de SXT; Incubar por uma noite a 35C sem CO2. A sensibilidade a esta droga significa, em conjunto com as outras leituras, que o estreptococo no pertence ao grupo A, B ou D de Lancefield. Colocar um disco de Bacitracina 0,004 UI direita e um de Sulfametoxazol-trimetoprim esquerda. Havendo necessidade, pode ser feito o teste de CAMP na mesma placa, conforme desenho abaixo.

1 - Disco de bacitracina 2 - Disco de sulfametoxazol trimetoprim 3 - Camp Test

Linhas verticais cepas teste Linha horizontal estria com cepa beta hemoltica de Staphylococcus aureus (ATCC 25923)

TESTE DE CAMP (NA MESMA PLACA)

Inocular uma estria nica de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina (ATCC 25923) no centro de uma placa de gar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. (Esta linhagem de S. aureus deve ser mantida continuadamente em estoque) Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ngulo reto com a linha de inoculao da amostra teste de estafilococo. As estrias no devem se tocar, ficando a 1 mm de distncia, e deste modo vrias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de gar sangue. A maneira de inocular fundamental para a observao do efeito esperado. Incubar a placa a 35-37C durante um perodo de 18-24 horas. A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), evidenciada pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha caracterstica, na rea de interseco entre as duas estrias.

TESTE DO PYR
Este teste determina a atividade do PYR tambm chamado pyrrolidonyl-aminopeptidase, uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e tambm pelo Enterococcus sp. Utilizar somente colnias puras para o teste, pois podem surgir resultados errneos. Seguir as instrues do fabricante, uma vez que se encontra disponvel comercialmente. Esse teste tecnicamente, equivalente prova da hidrlise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados na identificao clssica dos enterococos, e mais especfico que o teste da Bacitracina na caracterizao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo A, tendo a vantagem de ser mais rpido. Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos. Na impossibilidade da realizao de testes sorolgicos de confirmao, reforar o valor dos testes presuntivos clssicos de identificao do Streptococcus pyogenes.

TESTE DA BILE ESCULINA E DO NACL 6,5%

Semear as provas de Bile Esculina e do caldo de NaCl a 6,5%; Incubar da mesma forma; Teste da bile esculina positiva apresenta cor marrom escuro e o do caldo de NaCl a 6,5 % deve mostrar turvao para ser considerado positivo.

Mod V - 6

Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D no enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste da tolerncia ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos so positivos. Identificao de estreptococos beta hemolticos
Identificao Sensibilidade a Bacitracina CAMP /Hidrlise de hipurato Sensibilidade a SXT Bile Esculina e Tolerncia a NaCl 6,5% negativos

S. pyogenes

sensvel

negativo

negativo

S. agalactiae

resistente

positivo

negativo

negativos

Enterococcus sp Estreptococo No A, B ou D.

resistente resistente

negativo negativo

negativo positivo

positivos negativos

TESTE DA HIDRLISE DO HIPURATO

Os Streptococcus agalactiae (grupo B) so tambm capazes de hidrolisar o hipurato em seus componentes: glicina e cido benzico. Identificao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo A, B e D.

IDENTIFICAO DOS ESTREPTOCOCOS NO BETA HEMOLTICOS

Somente os estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) e D (Enterococcus spp. e Streptococcus bovis) podem no apresentar nenhuma hemlise, a denominada gama hemlise. Identificao de estreptococos gama hemolticos ou sem hemlise
Identificao CAMP /Hidrlise de hipurato positivo negativo negativo Bile Esculina Tolerncia a NaCl 6,5% negativo positivo negativo

Streptococcus agalactiae Enterococo S. bovis

negativo positivo positivo

IDENTIFICAO DOS ESTREPTOCOCOS ALFA HEMOLTICOS

A identificao deste grupo no deve ser feita por mtodos sorolgicos, pois a maioria no possui os antgenos de Lancefield. Identificao dos estreptococos alfa hemolticos
Identificao Optoquina e Bile solubilidade positivo negativo negativo negativo Bile esculina Tolerncia 6,5% a NaCl negativo positivo negativo negativo

Pneumococo Enterococos Grupo viridans Streptococcus bovis

negativo positivo negativo positivo

Mod V - 7

TESTE DA OPTOQUINA
Semear um quarto de uma placa de gar sangue com a cepa alfa hemoltica a ser testada; Aplicar um disco de optoquina; Incubar a 35oC em tenso aumentada de CO2 - mtodo da vela; Uma zona de inibio de 14 mm ou mais volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae.

TESTE DA BILE SOLUBILIDADE

O teste da bile solubilidade tambm identifica o Streptococcus pneumoniae. Pode ser executado em placa ou em caldo. Placa: Tomar um caldo turvo aps 3 horas de incubao a 35C; Inocular uma suspenso de desoxicolato a 10%; Clareamento da turbidez reflete a lise bacteriana e confere um resultado positivo prova.

Caldo: Inocular gotas de desoxicolato de Sdio a 2% sobre as colnias suspeitas; Incubar a 35C por 30 minutos; As colnias positivas iro desaparecer por lise bacteriana. Suspeitar da presena de variante nutricional de Streptococcus destes microrganismos quando o Gram de amostras positivas de hemocultura obtidas em meios comerciais mostram cocos em cadeias que no crescem no subcultivo em gar sangue. Semear o repique em gar sangue; Fazer estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococcus aureus, como para a identificao presuntiva de Haemophilus influenzae; Incubar a 35C em atmosfera com CO2. Identificao dos enterococos mais importantes clinicamente
Espcie Arabinos Sorbitol Crescimento Telurito 0,04% positivo negativo negativo negativo Motilidade Pigmento Vancomicina

E. faecalis E. faecium E. casseliflavus E. gallinarum

negativo positivo positivo positivo

positivo varivel varivel negativo

negativa negativa positiva positiva

negativo negativo positivo negativo

varivel (s) varivel resistente resistente

Mod V - 8

2. NEISSERIAS
INTRODUO As espcies de Neisseria tem como caracterstica morfolgica serem diplococos Gram negativos mais achatadas nas laterais, dando a forma de rins ou dois gros de feijo unidos por uma ponte. Apenas a espcie N. elongata difere desta morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo. Todas neisserias so oxidase positivas e catalase positivas, exceto Neisseria elongata e Kingella denitrificans. Todas utilizam carboidratos por via oxidativa e no fermentativa, sendo baixa a acidez, de modo que podem acontecer reaes duvidosas com o meio CTA (Cistyne Tripticase Agar) com indicador vermelho de fenol, que sempre foi muito utilizado em rotina. As diferentes espcies de neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, so analisadas junto com a Moraxella catarrhalis, Moraxella spp., Acinetobacter spp., Kingella spp e Alcaligenes spp. pelas caractersticas morfolgicas de serem cocos ou cocides ao Gram e pela possibilidade de haver confuso na sua identificao. Quanto a sua importncia clnica, a maioria das neisserias comensal vivendo em mucosas de humanos e animais. Diagnstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gram negativo
Bactria Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria spp. Moraxella catharralis Kingella spp. Moraxella spp. Acinetobacter spp. Alcaligenes faecalis Morfol. diplococo diplococo diplococo/ bacilo diplococo cocobacilo cocobacilo cocobacilo Cocobacilo / bacilo OXI + + + + + + neg + CAT + + varivel + neg + + + OF Gli no cresce no cresce varivel (oxidativo) inerte fermentador inerte varivel (oxidativo) inerte CTA Gli + + varivel neg + neg varivel neg DNAse neg neg neg + neg neg neg neg AS + neg + + + + + + MOT neg neg neg neg varivel neg neg +

OXI = oxidase CAT=catalase OFGli=OF Glicose CTAGli= utilizao da glicose em base gar cistina tripticase AS = cescimento em gar Sangue MOT = motilidade

CARACTERSTICAS DE ALGUMAS ESPCIES DE IMPORTNCIA CLNICA

sempre considerada patognica, de transmisso sexual ou pelo parto e indicativa de tratamento. No homem causa uretrite, sendo at 50% assintomtica e est relacionada a complicaes como epididimite, prostatite e estenose uretral. Na mulher causa corrimento vaginal, endocervicite, uretrite, abscesso vestibular, salpingonegooforite e doena inflamatria plvica. Pode ser isolada tambm na mucosa oral e anal, e em rcem-nascidos pode causar uma conjuntivite denominada Oftalmia neonatorum. A doena sistmica disseminada pode ocorrer em 1 a 3% dos pacientes infectados, principalmente em assintomticos e caracterizada por febre, tremores, leses cutneas, artrite de extremidades. As leses cutneas so do tipo mculo-pustulares ou hemorrgicas, com centro de necrose. Raramente ocorre artrite sptica com 50% de positividade de isolamento. Pode ocorrer meningite e endocardite. Pode causar meningite, infeco sistmica grave com coagulao intravascular disseminada (CIVD) e elevada mortalidade, podendo causar em associao outras infeces (conjuntivite, artrite, sinusite e pneumonia). Em mucosas pode ser isolada em portadores sos em 5 a 15 % dos indivduos e por perodos de semanas a meses. A transmisso se faz por vias areas.

Neisseria gonorrhoeae

Neisseria meningitidis

Mod V - 9

Moraxella (Branhamella) catarrhalis

Potencial patgeno de vias areas, principalmente em crianas e adultos jovens. Causa com maior freqencia otite, sinusite e pneumonia. Mais raramente pode causar endocardite e meningite. Em idosos, aps o Haemophylus influenzae e o Pneumococo, constitui a terceira causa de pneumonia em pacientes com doena pulmonar obstrutiva crnica. Em adultos raramente isolada em pacientes assintomticos. Cerca de 80% das cepas so produtoras de beta-lactamase, e so detectadas atravs do teste do Nitrocefin (cefalosporina cromognica). Outras espcies de Neisseria raramente so isoladas em casos de endocardite

ISOLAMENTO

NEISSERIA GONORRHOEAE
Material clnico para isolamento (escolha depende dos sintomas): Uretral Endocervical (sexualmente ativas/vaginal em meninas) Retal (colher secreo mucosa e no fezes, utilizando meio seletivo tipo Thayer Martin) Orofaringe Conjuntiva Recomenda-se: Utilizar swab com algodo atxico ou swab de Rayon ou Dacron. Semear o mais rpido possvel nos meios slidos, e usar placas aquecidas prviamente em estufa. Urina pode ser utilizada, aps centrifugao rpida e semeadura do sedimento. Em meio seletivo, deve-se, no entanto, preferir outros materiais com maior chance de isolamento. Usar frascos de hemocultura sem o anticoagulante SPS que inibidor para as N. Gonorrhoeae (Ex: Caldo BHI com 1% de gelatina). Em leses de pele preferir a bipsia que o swab. Incubar em jarra com umidade e vela. Sempre realizar bacterioscopia pelo Gram. Glndula de Bartholin Trompas Endomtrio Lquido sinovial Leses de pele Sangue

NEISSERIA MENINGITIDIS
Materiais clnicos para isolamento, de acordo com aspectos clnicos: LCR Sangue (usar frascos de hemocultura sem SPS como anticoagulante) Aspirado de petquias Sufuses hemorrgicas ou bipsias Liqudo sinovial Swab de conjuntiva Aspirado traqueal, ou transtraqueal ou escarro Swab de nasofaringe (prefervel a swab de orofaringe)

MORAXELLA (BRANHAMELLA) CATARRHALIS

Material clnico adequado para isolamento de acordo com o quadro clnico: Otite mdia Timpanocentese (miringotomia) quando indicado. Secreo colhida com swab em geral revela flora contaminante, exceto se rompimento expontneo muito recente e sem uso prvio de antimicrobianos. Aspirado de seios da face comprometidos, quando indicado. Escarro, aspirado traqueal, transtraqueal podem ser teis ou BAL, quando indicado e comparados com bacterioscopia.

Sinusite Infeces do trato respiratrio inferior/pneumonia

Mod V - 10

TRANSPORTE E SEMEADURA DO MATERIAL O ideal semear imediatamente aps a coleta em meio slido, levar para a estufa 36oC em jarra com vela ou com gerador de CO2 e umidade. O uso de meios de transporte como Stuart ou Amies deve ser considerada uma alternativa de risco. Para M. catarrhalis, os meios de transporte so adequados.

NEISSERIA GONORRHOEAE
sensvel a variaes de temperatura acima de 37oC ou abaixo de 35oC, de modo que a amostra no pode ser refrigerada. Recomenda-se gar chocolate enriquecido com suplemento com l-cistena, NAD e vitaminas (Isovitalex ou similar), embora seja possvel obter crescimento de algumas cepas em gar sangue. Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e gua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2). Secreo retal, swab de orofaringe, ou outros materiais com maior microbiota contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC).

NEISSERIA MENINGITIDIS
um pouco mais tolerante a variaes de temperatura, mas recomenda-se para transporte ambientes com CO2. Cresce bem em gar sangue, mas por precauo, deve-se semear tambm em gar chocolate. Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e agua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2). Materiais com maior flora contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC). Meios seletivos como TMM inibem crescimento de enterobactrias, a maioria das outras espcies de Neisserias (7,5 g/ml de colistina), Gram positivos (Vancomicina 3 g/ml) e fungos (13,5 g/ml de nistatina); e contm suplementos para suportar crescimento das Neisserias meningitidis e N. gonorrhoeae.

MORAXELLA CATHARRALIS
Tolera temperatura ambiente e cresce bem em gar sangue. Material estril ou com pouca microbiota (LCR, sinovial, sangue, bipsia, conjuntiva, nasofaringe). Pode usar meio no seletivo BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAO A partir das amostras genitais, LCR, bipsia, etc., deve-se sempre reservar material para a bacterioscopia, fazendo o esfregao no momento da coleta, ou colhendo dois swabs, ou material suficiente para a semeadura e bacterioscopia. Quando o swab nico, no caso das Neisserias d-se preferncia semeadura imediata e posteriormente: Ressuspender o swab em 1 ml de salina; Agitar no Vortex; Centrifugar; Fazer um esfregao do sedimento.

Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presena ou ausncia de diplococos Gram negativos com caractersticas de neisserias em: raros (+) poucos (++) moderados (+++) muitos (++++)

Descrever se os microrganismos so extra-celulares ou intra-celulares e quantidade de neutrfilos e de clulas epiteliais. Mod V - 11

 importante correlacionar a bacterioscopia com achados de cultura e dados do paciente, como quadro agudo, portador, etc. Em casos de abuso sexual fundamental o isolamento e identificao completa, considerando que neisserias saprfitas ou mesmo Acinetobacter spp. podem ser diagnosticados erroneamente como N. gonorrhoeae.

IDENTIFICAO
As N. gonorrhoeae crescem em gar chocolate formando colnias pequenas, sendo em geral menores que as de neisserias saprfitas. A cor pode variar de cinza a amarelo. A colnia da M. catarrhalis de cor cinza rseo-acinzentado, sendo comumente frivel, saindo inteira quando removida com a ala bacteriolgica. As colnias de N. meningitidis A e C capsuladas apresentam mucides. Testes imunolgicos no substituem a cultura e a bacterioscopia, e para o diagnstico da gonorria existem no comrcio recursos do tipo ELISA, sondas genticas de acido nuclico, PCR e suas variantes, de elevado custo e indicado em levantamentos epidemiolgicos, ou quando no se dispe dos recursos tradicionais. Para LCR e outros fludos estreis e mesmo urina, a caracterizao de Neisseria meningitidis pode ser feita pela tcnica de aglutinao com partculas de ltex que rpida, com boa sensibilidade, especificidade e permite a tipagem dos principais tipos prevalentes em meningites. O teste pode ser positivo nos casos de cultura negativa por uso prvio de antimicrobianos, sendo, no entanto, de custo elevado. Para o tipo B alguns produtos oferecem testes para afastar reao cruzada com E. coli. A reao negativa no exclui o diagnstico que deve ser sempre avaliado juntamente com a bacterioscopia e a cultura.

BACTERIOLOGIA
A identificao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae pode ser feita em dois nveis: presuntivo e confirmatrio. Em servios de Sade Pblica (DST) onde a prevalncia da gonorria significativa, para fins prticos de tratamento pode-se fazer o diagnstico utilizando-se aspectos clnicos associados bacterioscopia positiva (Diplococos Gram negativos intra-celulares) em pacientes de risco. Deve-se, no entanto, sempre colher material para cultura, possibilitando a confirmao e monitoramento da resistncia destas bactrias. Na ocorrncia de surtos de meningite meningoccica, o diagnstico presuntivo para fins de tratamento, tambm pode basear-se na clnica e na bacterioscopia do LCR ou de leses (petquias e prpuras). As culturas devem sempre ser colhidas para confirmao, identificao de sorotipo e sensibilidade aos antimicrobianos atravs dos seguintes procedimentos: Fazer bacterioscopia das colonias isoladas para confirmar a presena de diplococos Gram negativos com forma de dois feijes. Fazer o teste de oxidase das colonias sugestivas. Deve-se procurar afastar outros gneros de bactrias como Acinetobacter spp., Kingella spp. e Moraxella spp. que so morfologicamente parecidos. Um recurso prtico para evitar erros de identificao de Acinetobacter spp. e Kingella spp. como Neisserias : Semear o agente suspeito em gar chocolate. Colocar um disco de penicilina de 10 ui. Aps 24h fazer um gram das colnias que crescerem prximas a zona de inibio. Se permanecerem cocides com aspecto de neisserias confirma-se o isolamento; caso tenham adquirido a forma de bacilos longos, o isolado no de Neisseria.

Outro passo importante verificar a capacidade de crescimento em meios pobres como o gar nutriente ou a necessidade de crescimento em meio rico (gar chocolate suplementado). A identificao das espcies de neisseria baseia-se na utilizao de acares: glicose, maltose, lactose, sacarose e frutose. Como as neisserias utilizam carboidratos por via oxidativa, a base gar Cistina Tripticase (CTA) adicionada de 1% de cada um dos aucares e com indicador vermelho de fenol tem sido utilizado. No entanto, reaes duvidosas podem ocorrer, por falha na deteco da acidez produzida pela bacteria, dificultando a identificao. Recomenda-se enviar a cepa isolada rapidamente ao Laboratrio de Referncia para confirmao.

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Provas de rotina para diferenciar Neisserias patognicas

Bactria AC 22oC A. Nut. 35oC neg v + + +
o

DNAse

GLI

MAL

LAC

SAC

FRU

N. gonorrhoeae N. meningitidis Outras neisserias M. catharralis Kingella spp.

neg neg + + v

neg neg neg + neg

+ + varivel neg +

neg + varivel neg neg

neg neg varivel neg neg

neg neg varivel neg neg

o

neg neg varivel neg neg

AC = crescimento em gar chocolate a 22 C GLI = glicose MAL = maltose LAC = lactose

A. Nut. = crescimento em gar nutriente a 35 C SAC = sacarose FRU = frutose

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3. ENTEROBACTRIAS
INTRODUO a maior e mais heterognea famlia de bactrias Gram negativas de importncia mdica. So considerados atualmente: 27 gneros / 102 espcies / 08 grupos indefinidos. Independente da complexidade, mais de 95% das amostras implicadas em caso clnicos so colocadas em 25 espcies, sendo possivel o isolamento de enterobactrias de qualquer amostra clnica.

CARACTERIZAO DA FAMLIA ENTEROBACTERIACEAE

So bacilos Gram negativos, no esporulados, com motilidade varivel, oxidase negativos, e que crescem em meios bsicos (caldo peptona), meios ricos (gar sangue, gar chocolate e CLED), meios seletivos (Mac Conkey, EMB). So anaerbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), fermentam a glicose com ou sem produo de gs, so catalase positivos, e reduzem nitrato a nitrito. So divididos atravs de diferentes provas em 11 principais gneros, tendo sido descritos nos ltimos anos outros 16 gneros e algumas espcies, mas ainda consideradas de pouca ou nenhuma importncia clnica.

IMPORTNCIA CLNICA
A maioria das enterobactrias encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino animal, na gua, solo e vegetais. Alguns tambm so considerados enteropatgenos por causarem preferencialmente infeces gastrointestinais como a Salmonella typhi, outras salmonellas, Shigella spp., Yersinia enterocolitica e vrios sorotipos de Escherichia coli, embora possam tambm causar infeco em outros locais. As enterobactrias representam 80% ou mais de todos os Gram negativos de importncia clnica isolados na rotina microbiolgica So responsveis por de cerca de 70% das infeces urinrias e 50% das septicemias.

INFECES HOSPITALARES E NA COMUNIDADE

Nas infeces hospitalares: As enterobactrias que atualmente predominam so: Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp. Principais gneros das enterobactrias (cerca de 99% dos isolamentos de enterobactrias de importncia clnica): Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp. As enterobactrias menos isoladas so: Edwarsiella spp., Hafnia spp., Yersinia spp. Baseado em dados de prevalncia e importncia clnica, considera-se necessrio que os laboratrios de microbiologia utilizem metodologia que permita discriminar com 80% de acerto os gneros e espcies considerados abaixo: Escherichia coli Shigella spp. Salmonella typhi Salmonella spp. Citrobacter freundii Proteus mirabilis Citrobacter koseri Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Providencia spp. Serratia spp. Proteus vulgaris Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans Yersinia enterocolitica Morganella morganii

Nas infeces da comunidade: Destacam-se: Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp.

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Principais provas para a identificao das enterobactrias de importncia clnica 1. Fermentao da glicose 2. Fermentao da lactose 3. Motilidade 4. Utilizao de citrato 5. Descarboxilao da lisina 6. Produo de sulfeto de hidrognio (H2S) 7. 8. 9. Produo de gs (CO2) Oxidase Produo de indol

10. Produo de urease 11. Produo de fenilalanina desaminase ou opo triptofanase 12. Produo de gelatinase ou opo DNAse

Provas complementares de Identificao Fermentao de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. Utilizao de aminocidos: arginina e ornitina Hidrlise da esculina, etc. ONPG Utilizao de acetato Provas teis, mas pouco utilizadas: vermelho de metila, voges-proskauer, crescimento em KCN, tartarato de jordan e lipase. Os esquemas de identificao baseiam-se na determinao dos gneros e espcies mais isolados na clnica, e nas provas mais caractersticas de cada gnero e espcie, baseado em alguns critrios como: facilidade de execuo, facilidade de interpretao, custo, rapidez para leitura, etc. TIPOS DE TESTES UTILIZADOS PARA IDENTIFICAO Podem ser utilizados testes preparados no laboratrio, desde que submetidos a controle de qualidade. Adquiridos no comrcio em testes isolados ou em kits acompanhados dos respectivos esquemas de identificao. Mtodos automatizados em geral utilizam estas mesmas provas e ampliam o nmero de testes podendo caracterizar com maior segurana e melhor poder de discriminao de gneros e espcies no comuns. Mtodos rpidos em geral utilizam substratos cromognicos para deteco de enzimas produzidas pelas bactrias e que se revelam aps 4 a 6 horas de incubao. Na rotina bacteriolgica, existem vrias alternativas e, com base em conjuntos ou sistemas simplificados de provas bioqumicas, possvel realizar a triagem e identificao presuntiva dos principais gneros de interesse clnico. Desse modo, das enterobactrias isoladas de amostras clnicas, cerca de 90%, podem ser perfeitamente identificadas atravs desses esquemas, podendo o resultado ser entregue dentro de um espao de tempo relativamente curto, geralmente, entre 48 a 72 horas.

MEIO IAL (INSTITUTO ADOLFO LUTZ)

Este meio foi elaborado para triagem de enterobactrias e consiste de 9 provas em apenas um tubo de ensaio, que consistem em: indol (tampa), fermentao da sacarose e glicose e produo de gs, fenilalanina, uria, H2S, Lisina, Motilidade. Baseado nestas provas possvel identificar as seguintes bactrias:
E. coli Shigella (indol positiva) Shigella (indol negativa) Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Klebsiella spp. (sacarose negativa) Enterobacter cloacae Providencia spp. (uria positiva) ou Morganella morganii Providencia spp. (uria negativa) Proteus mirabilis Proteus vulgaris Salmonella spp. Salmonella typhi Citrobacter freundii Serratia marcescens (provas complementares) Vibrio cholerae Vibrio spp. bactrias no fermentadoras

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Vantagens e limitaes O meio IAL tem a vantagem de ser prtico para inoculao e de baixo custo. Sua desvantagem a dificuldade de interpretao de tantas provas, exigindo muita experincia prvia com o meio. Este meio identifica os principais gneros de enterobactrias, indicando a presena de bactrias no fermentadoras e Vibrios. Para caracterizar corretamente as espcies de Enterobacter, gnero Serratia, gnero e espcies de Pseudomonas h necessidade de realizar provas complementares. Pelas limitaes do poder discriminatrio de gneros e espcies de enterobactrias no se recomenda este meio, como nica opo, na identificao de bactrias envolvidas em infeces hospitalares. Uma alternativa seria utilizar os resultados obtidos do meio IAL como triagem e adicionar os testes complementares, como Citrato e a fermentao da lactose verificada no crescimento em gar Mac Conkey. Variantes do meio IAL Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 1 2 3 4 5 meio de Rugai sem sacarose provas: fenilalanina, fermentao da glicose, gs, H2S, uria MIO (Motilidade Indol Ornitina) lisina citrato rhamnose

CONJUNTO EPM / MILI / CITRATO

Trata-se praticamente da mesma combinao de reaes do meio IAL ou Rugai & Arajo (modificado por Pessoa & Silva), separados em 2 tubos, passando a verificao do indol da tampa do IAL, para o meio MILi aps adio do reativo de Kovacs. - inocular picando at o fundo - semear na superfcie - incubar com a tampa frouxa 24hs/35oC Fermentao da glicose, produo de gs, H2S, uria, fenilalanina. - fazer picada central apenas - incubar 24hs/35oC - adicionar 3 gotas de reativo de Kovacs aps a leitura da lisina para o teste de indol Motilidade: as imveis crescem apenas na linha de picada. Descarboxilao da lisina: lisina positiva o meio torna-se roxo, na prova negativa o meio permanece amarelado nos 2/3 inferiores. Indol: a formao de um anel rosa na superfcie do meio indica positividade para o indol. - inocular a superfcie - incubar 24hs/35oC A prova positiva evidenciada pelo aparecimento de colorao azul na superfcie.

Tubo EPM

Tubo MILI

Citrato

Interpretao do Meio EPM

Produo de gs Base Produo de H2S Hidrlise da Uria Superfcie Desaminao do Triptofano Formao de bolhas ou rachaduras no meio Presena de pigmento negro de qualquer intensidade Colorao azul esverdeada (fraca) na base indica prova positiva Reao positiva verde escuro ou acastanhado Reao negativa superfcie inalterada

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MEIO TRPLICE AUCAR FERRO (TSI)

Considerado o mais clssico dos sistemas de identificao, necessita de provas adicionais, mas tem a vantagem de ser de mais fcil interpretao. Abaixo ser descrito em detalhes e ser a base da identificao de enterobactrias. Acurcia da identificao - qualquer sistema de testes existentes no comrcio, com leitura manual ou automatizada, tem limitaes no nmero de provas e de discriminao dos diferentes gneros e espcies de enterobactrias, de modo que a maioria dos esquemas trabalha com um mximo de 80% de acerto. Os esquemas de identificao de enterobactrias podem utilizar uma ampla gama de recursos, variando desde nove reaes como meio IAL ou Rugai & Arajo modificado por Pessoa & Silva, at dez testes propostos neste manual, ou sistemas como API 32E que pode identificar enterobactrias e alguns no fermentadores, utilizando 32 testes. importante destacar que nenhum sistema oferece 100% de acerto para a caracterizao das espcies de enterobactrias, mas analisam o principal comportamento descrito na literatura. A fonte de informao mais utilizada baseia-se na tabela organizada por Farmer (1991) contando com 47 provas, e os respectivos percentuais de positividade para 28 diferentes gneros e 121 espcies de enterobactrias. Os principais gneros e espcies de importncia clnica podem ser caracterizados com >95% de acerto com poucas provas. Entretanto para as espcies dos gneros Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia os testes mais utilizados apresentam baixo poder de discriminao, sendo a identificao feita pelo maior percentual de probabilidade. necessrio destacar que padres no usuais podem ocorrer e que o microbiologista deve estar atento para analisar cepas que possam ter importncia clnica e epidemiolgica ou encaminh-las a Laboratrios de Referncia. Antes, no entanto, deve certificar-se que a anlise no esta sendo feita com cultura mista de bactrias. O meio de TSI inclinado em bico de flauta, de cor vermelho-cereja e deve ser inoculado por picada central at o fundo, seguido de espalhamento na superfcie e incubao durante 18-24h a 35oC. Provas do Meio de TSI

a) Prpura/amarelo (pice prpuro e base amarela)

b) Amarelo/amarelo (pice e base amarelos) c) Presena de gs (CO2) d) H2S positivo

=
=

fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativas)

fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 acares) bolhas ou meio fragmentado presena de precipitado negro

= =

Interpretao do resultado das reaes encontradas no TSI

pice Vermelho Vermelho Base Vermelho Vermelho H2S neg neg Gs neg neg Interpretao mais provvel Sem crescimento = bactria exigente Crescimento na superfcie = No Fermentador ou Gram (+) Crescimento na superfcie = Gram (+) Enterobactria ou Aeromonas lactose e sacarose negativas Enterobactria Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter

Amarelo Vermelho

Vermelho Amarelo

neg neg

neg varivel

Amarelo Amarelo

Amarelo Amarelo

neg +

varivel varivel

Obs. A presena de H2S em bactrias lactose e sacarose negativas pode ser menos evidente, pois a precipitao de sais de ferro pelo sulfeto de hidrognio depende de meio acido (Ex: Salmonella typhi)

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ETAPAS DA IDENTIFICAO DE ENTEROBACTRIAS

ANLISE DO CRESCIMENTO NOS MEIOS RICOS E SELETIVOS

A identificao de uma enterobactria comea com a anlise do material semeado. Em geral temos os seguintes meios para interpretar: Secrees: gar sangue e Mac Conkey Lquidos nobres e bipsias: gar Chocolate e Mac Conkey Fezes: Mac Conkey e Salmonella-Shigella Urina: CLED ou gar sangue e Mac Conkey, etc. Devemos considerar que: A enterobactria sempre cresce nos meios ricos (gar sangue, chocolate e CLED), bem como nos meios seletivos: gar Mac Conkey e Salmonella-Shigella. Os Gram positivos como regra no crescem em gar Mac Conkey e Salmonella-Shigella, exceto os enterococos que podem crescer. No gar Mac Conkey e Salmonella-Shigella, alm das enterobactrias e dos enterococos, podem crescer bactrias no fermentadoras e Candida. Portanto caracteriza-se uma enterobactria quando ela esta presente em todos os meios semeados, mas ainda necessrio diferenciar de outros microrganismos no muito exigentes como no fermentadores, enterococos e Candida spp. Recomenda-se realizar: Gram da colnia isolada sempre fazer o Gram para evitar enganos de interpretao (diferenciar cocos de bacilos, Gram positivos de Gram negativoe e leveduras). Prova da oxidase indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio que tambm so fermentadores. Prova do metabolismo fermentador triagem utilizando os meios de OF glicose (quando suspeitar de no fermentador), TSI (Trplice Aucar Ferro) ou EPM (Rugai sem sacarose), para enterobactrias. Srie bioqumica complementar sempre necessria para caracterizar gnero e espcie. O nmero de provas vai permitir maior ou menor discriminao (vide a seguir o nvel de complexidade de provas). As Enterobactrias caracterizam-se por se apresentarem como: bacilos Gram negativos, fermentadores da glicose, com ou sem produo de gs, oxidase negativas, reduzem nitrato a nitrito e que crescem bem no meio de Mc Conkey ou EMB. Como modelo de triagem na identificao bacteriana tem sido utilizado o meio de TSI (Triplice Aucar Ferro), que permite avaliar a fermentao da glicose, produo de gs, fermentao de lactose e/ou sacarose e produo de H2S. O TSI constitui o meio de identificao preliminar mais utilizado no mundo, sendo necessrio, no entanto, necessrio adicionar algumas provas, para completar a identificao e classificadas em dois nveis de complexidade:

Nvel de complexidade 1

motilidade, indol, lisina, uria, fenilalanina, DNAse e oxidase.

citrato,

lactose

(Mac

Conkey),

Nvel de complexidade 2

provas do nvel 1 e ornitina, arginina, sacarose, arabinose, malonato, esculina e PYR.

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DESCRIO DAS PRINCIPAIS PROVAS BIOQUMICAS

- Semear por picada at o fundo, e incubar 24h/35oC - Aps 24h de incubao, pingar 3-4 gotas de Kovacs na superfcie do meio - Meios Motilidade/indol com resazurina (motilidade); SIM (motilidade, indol e H2S) e Mili (Motilidade, Indol e Lisina) Motilidade, H2S e Indol crescimento apenas na linha de picada = motilidade negativa crescimento difuso em todo o meio = motilidade positiva H2S positivo = meio enegrecido H2S negativo = cor inalterada do meio Indol cor prpura = indol positivo cor do reagente = indol negativo - Inocular apenas na superfcie e incubar 24h/35oC Uria de Christensen Urease positivo = cor vermelha (Proteus: reao mais intensa) Urease negativo = mantm cor amarelada do meio - Inocular na superfcie e incubar 24h/35oC Citrato de Simmons Citrato positivo = azul e/ou crescimento no meio Citrato negativo = cor verde (inalterado) - Inocular a superfcie do meio (inclinado) e incubar 24h/35oC - Aps crescimento pingar na superfcie 5 gotas do reagente cloreto frrico a 10% FA positivo = cor verde escuro na superfcie FA negativo = mantm a cor do meio inalterada

Fenilalanina

IDENTIFICAO DAS ENTEROBACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICA

CONSIDERAES
Valores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definio; para saber o real percentual de provas positivas ou negativas consultar a tabela geral. PB (padro bioqumico) = probabilidade terica da bactria em questo; apresentar o padro bioqumico analisado (os testes considerados so indicados pelo sinal #). Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relao s provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%) (multiplicar os percentuais de ocorrncia)= 92%. PB baixo significa ter outro padro mais frequente. Os padres bioqumicos pouco freqentes tero menor probabilidade de isolamento. No aplicado quando se considera gnero, pois envolve vrias espcies com diferentes padres de testes (ex: Salmonella spp.). Valores seguidos do sinal positivo (+) ou negativo (neg) significa o percentual de cepas com resultado do teste positivo ou negativo. Ex: Lisina 75%+ = 75% das cepas so lisina positiva. V = valores >20% e <80% de reaes positivas ou negativas; estas provas podem ser teis para diferenciar duas espcies ou dois gneros quando a reao s ocorre para uma delas. Ex.: uria em relao a E. coli e Citrobacter. E. coli negativa e Citrobacter varivel. Se a reao encontrada for positiva, exclui-se E. coli. Pela importncia clnica e epidemiolgica, padres no comuns de Yersinia e Salmonella spp. foram considerados, pois na prtica a motilidade pode ser duvidosa e o H2S pode ser falsonegativo. As provas destacadas com fundo cinza tm a finalidade de facilitar a busca de provas-chave na diferenciao bacteriana. Recomenda-se de rotina utilizar as provas do nvel 1 que, para a maioria das bactrias da rotina, permite uma caracterizao adequada. Quando houver necessidade usar as de nvel 2.

Mod V - 19

IDENTIFICAO BIOQUMICA SIMPLIFICADA DAS PRINCIPAIS ENTEROBACTRIAS NVEL DE COMPLEXIDADE 1

H2S (gs sulfdrico) positivo, FA (fenilalanina) positivo
Bactrias Indol + Indol neg Proteus vulgaris Proteus mirabilis PB# 92% 94%

H2S negativo , FA positivo

Bactrias Indol + Providencia spp. Morganella morganii Indol neg P. penneri Enterobacter spp. Citrato + neg neg varivel Uria varivel + + neg PB# 88% 72% 69% <16%

H2S positivo, FA negativo, Indol positivo

Bactrias Citrobacter freundii Edwarsiella tarda Citrato 78%+ neg Motilidade 89%+ + Urease varivel neg Lisina neg + Lac MC + neg PB# 25% 99%

Lac MC = lactose em Mac Conkey

H2S positivo, FA negativo, Indol negativo

Bactrias Salmonella spp. S. typhi S. gallinarum/ S. pullorum C. freundii Urease neg neg neg Citrato + neg neg Lisina + + + Motilidade + + neg Gs + neg varivel Sorotipagem + + + 97% 90% PB#

varivel

neg

neg

52%

H2S negativo , FA negativo , Indol positivo, motilidade negativa

Bactrias Y. enterocolitica Shigella spp. Klebsiella oxytoca E.coli inativa (rara)
1 2 1

Citrato neg neg + neg

Urease 75%+ neg + neg

Lisina neg neg + varivel

o

Latose neg neg + 75% neg

Gs neg neg + neg

Sorotipagem + Yersinia + Shigella no Invasora

2

PB# 50% 50% 99% 80%

- positivo temperatura ambiente e negativa 37 C - em coprocultura testar p/ E. coli invasora

Mod V - 20

H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, Motilidade positiva

Bactrias E. coli Citrobacter spp. Aeromonas spp.
1 1

Citrato neg + varivel

Urease neg varivel neg

Lisina + neg +

Lactose + varivel neg

2

Gs + + varivel

PB# 97%

- oxidase positiva (verificar Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio) Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas Dnase negativa - Aeromonas caviae: lisina negativa e lactose positiva

H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa

Bactrias Shigella spp. (colnia pequena) Klebsiella pneumoniae Yersinia enterocolitica E. agglomerans
3 1

Urease neg

Citrato neg

Lisina neg

Gs neg

Lactose neg

Comentrio sorotipagem

PB# 50%

+ 75%+ neg

+ neg varivel

+ neg neg

+ neg neg

+ neg varivel

Colnia mucide sorotipagem 15% mot neg

100% 50% 9,6%

1 - cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser uria negativas e bioquimicamente pouco ativas (citrato varivel, lisina varivel), denominadas K. ozaenae e K. rhinoscleromatis 2 - motilidade positiva temperatura ambiente 3 - pode ocorrer falsa motilidade negativa em meio semi-solido e positiva em caldo

H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato negativo

Bactrias Hafnia alvei Salmonella choleraesuis Salmonella paratyphi A E. agglomerans Lisina + + neg neg Lactose neg neg neg varivel Sorotipagem negativa + + negativa PB# 76% 37% 90% 25%

H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, DNAse e gelatinase negativas
Bactrias Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Salmonellla typhi Lisina + neg + Urease neg v neg Lactose + + neg Gs ++ ++ neg Sorotipagem neg neg + PB# 95% 95% 12%

Mod V - 21

H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, DNAse e gelatinase positivas, Serratia spp.
Bactrias Lisina Urease Lactose Gs Pigmento vermelho varivel neg varivel PB#

Serratia marcescens Serratia liquefaciens Serratia rubidae

1 1

+ + 55% +

85% neg neg neg

neg 90% neg +

55% + 75% pos 70% neg

95% 76% 85%

- raramente isolada

IDENTIFICAO BIOQUMICA SIMPLIFICADA DAS PRINCIPAIS ENTEROBACTRIAS NVEL DE COMPLEXIDADE 2

H2S positivo, FA positivo
Bactrias Indol positivos Proteus vulgaris Morganella morganii Ornitina neg + Sacarose + neg PB# 92% 20%

Bactrias Indol negativos Proteus mirabilis

Ornitina +

Citrato varivel (65%+) neg

PB# 94%

Proteus penneri

neg

30%

H2S negativo, FA positivo

Bactrias Indol negativos Proteus penneri Morganella morganii Enterobacter agglomerans Enterobacter sakazaki Urease + + neg neg Citrato neg neg + + Sacarose + neg 75%+ + Ornitina neg + neg +

Bactrias Indol positivos Morganella morganii Providencia spp.

Citrato neg +

H2S positivo, FA negativo, Indol positivo

Bactrias Citrobacter freundii Edwarsiella tarda Citrato 78%+ neg Urease 44%+ neg Lisina neg + Ornitina neg + Lactose 78%+ neg Sacarose 89%+ neg

Mod V - 22

H2S positivo, FA negativo, Indol negativo

Bactrias Salmonella spp. S. typhi S. choleraesuis S. paratyphi A S. gallinarum S. pullorum Outras Salmonellas C. freundii Uria neg neg neg neg neg neg neg Citrato + neg 25%+ neg neg neg + Lisina + + + neg + + + Ornitina + neg + + neg + + Motibil. + + + + neg neg + Arabinos + neg neg + + + + Gs + neg + + neg + + Sorotip. + + + + + + +

44%+

78%+

neg

neg

89%+

89%+

neg

Triagem rpida para principais bactrias H2S positivas

Bactrias Salmonella spp. Citrobacter spp. Proteus spp. PYR neg + neg Fenilalanina neg neg +

H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, Motilidade negativa

Bactrias Y. enterocolitica Shigella spp. Klebsiella oxytoca E. coli inativa (rara)
1 2 1

Citrato neg neg + neg

Urease 75%+ neg + neg

Lisina neg neg + 40%+

o

Ornitina + neg neg 20%+

Lactose neg neg + 25%+

Gs neg neg ++ neg

Sorotip. + + NI invasora
2

PB# 50% 50% 99% 80%

- positiva temperatura ambiente e negativa a 37 C - em coprocultura testar para E. coli invasora

H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, Motilidade positiva

Bactrias E. coli C. diversus (koseri)
1

Citrato neg +
1

Urease neg 75% + 85%+ 75%+ 20%+ neg

Lisina 90%+ neg neg neg neg +

4

Ornitina 65% + + + + neg +

Lactose + 50%+ 35%+ neg 40%+ neg

Gs + + + neg 20%+ varivel

PB# 97% 97% 97%

Citrobacter amalonaticus Yersinia enterocolitica

2

+ neg 50%+ varivel

Enterobacter agglomerans Aeromonas spp.

1 2 3

16%

- C. koseri = malonato positivo C. amalonaticus = malonato negativo - motilidade negativa a 35oC e positiva temperatura ambiente

Mod V - 23

3 4

- oxidase positiva: Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas shigelloides Dnase negativa - Aeromonas caviae lisina negativa e lactose positiva

H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa

Bactrias Shigella spp. (colnia pequena) Klebsiella pneumoniae Klebsiella spp.
1

Urease neg

Citrato neg

Lisina neg

Gs neg

Lactose neg

Comentrio Sorotipagem +

PB# >50%

+ neg v
2

+ varivel 78%+ neg varivel

+ varivel neg neg neg

+ varivel + neg neg

+ varivel 78%+ neg varivel

Colnia Mucide Mucide 11% motil. neg Sorotipagem + 15% motil. neg

100%

Citrobacter freundii Yersinia enterocoltica E. agglomerans

3

16% 50% 9,6%

75%+ neg

1 - cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser uria negativas e bioquimicamente pouco ativas (citrato v, lisina v), denominadas K. ozaenae e K. rhinoscleromatis 2 - motilidade + temperatura ambiente 3 - pode ocorrer falsa motilidade (negativa em meio semi-slido e positiva em caldo)

H2S negativo, FA negativa, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato negativo

Bactrias Hafnia alvei Salmonella typhi Y. enterocolitica S. choleraesuis S. paratyphi A E. agglomerans
1 2 1

Lisina + + neg + neg neg

Ornitina + neg + + + neg

Lactose neg neg neg neg neg 40%+

Urease neg neg 75%+ neg neg 20%+

Arabinos + neg + neg + +

Sorologia neg + + + + neg

PB# 76%

25%

- H2S pode ser positivo no TSI com 48h - motilidade negativa 35oC e positiva a 25oC

H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa, Citrato positivo, DNAse e gelatina negativas
Bactrias C. freundii E. aerogenes E. cloacae E. agglomerans E. gergoviae E. sakazakii Uria 44%+ 2%+ 65%+ 20%+ 93%+ 1%+ Fenil. 0 0 0 20%+ 0 50%+ Lisina 0 98%+ 0 0 90%+ 0 Argin. 67%+ 0 97%+ 0 0 99%+ Ornit. 0 98%+ 96%+ 0 100%+ 91%+ Malon. 11%+ 95%+ 75%+ 65%+ 96%+ 18%+ Gs 89%+ 100%+ 100%+ 20%+ 98%+ 98%+ Lactose 78%+ 95%+ 93%+ 40%+ 55%+ 99%+ Escul. 0 98%+ 30%+ 60%+ 97%+ 100%+

Mod V - 24

Verso simplificada para interpretao das provas da Lisina negativa

Bactrias Ornitina negativa Citrobacter freundii E.agglomerans Gs + neg Esculina neg varivel Arginina varivel neg

Bactrias Ornitina positiva Enterobacter cloacae Enterobacter sakazaki

Urease 65%+ neg

Fenil. neg 50%+

Malonato 75% + 18% +

Esculina 30% + +

Obs. + comum raro

Verso simplificada para interpretao das provas da Lisina positiva

Bactrias E. aerogenes Enterobacter gergoviae Urease neg + Lactose + varivel

H2S negativo, FA negativa, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo, Dnase e Gelatina positivas
Bactrias Serratia marcescens S. marcescens biog
1

Lisina 99% + 55% + 95% + 55% +

Ornitina 99% + 65% + 95% + neg

L-arabinose neg neg + +

Malonato neg neg neg +

Motibilidade + neg + +

Lactose neg neg neg +

Serratia liquefaciens Serratia rubidae

CARACTERIZAO GERAL DAS PRINCIPAIS ENTEROBACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICA (%)

Bactrias Citrobacter freundii Citrobacter diversus (koseri) Citrobacter amalonaticus Edwarsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Escherichia coli Escherichia coli inativa Indol 33 99 100 99 0 0 20 0 11 98 80 Citr. 78 99 95 1 95 100 50 99 99 1 1 H2S 78 0 5 100 0 0 0 0 0 1 1 Uria 44 75 85 0 2 65 20 93 1 1 1 Fenil. 0 0 0 0 0 0 20 0 50 0 0 Lisina 0 0 0 100 98 0 0 90 0 90 40 Argin. 67 80 85 0 0 97 0 0 99 17 3 Ornit. 0 99 95 100 98 96 0 100 91 65 20 Motil. 89 95 95 98 97 95 85 90 96 95 5

Mod V - 25

Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii grupo Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Salmonella spp. Salmonell typhi Salmonella cholerasuis Salmonella paratyphi A Salmonella gallinarum Salmonella pullorum Salmonella outras Serratia marcescens Serratia marcescens bio Serratia liquefaciens Serratia rubidae Yersinia enterocolitica

45 50 25 0 0 0 99 0 0 95 2 98 0 99 98 99 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 50

0 0 0 0 10 98 95 30 0 0 65 15 0 95 93 98 95 0 25 0 0 0 90 98 30 90 95 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 98 95 30 0 0 0 95 97 50 10 100 90 100 0 0 0 0 0

0 0 0 0 4 95 90 10 0 95 98 95 100 98 30 0 1 0 0 0 0 0 0 15 0 3 2 75

0 0 0 0 0 0 1 0 0 95 98 99 99 98 95 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 100 98 99 40 0 v 0 0 0 0 0 0 98 98 95 0 90 100 99 99 55 95 55 0

2 5 18 2 6 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 70 3 55 15 10 10 70 0 4 0 0 0

0 0 2 98 98 0 0 3 0 95 99 0 0 0 0 0 97 0 100 95 1 95 99 99 65 95 0 95

0 0 0 0 85 0 0 0 0 v 95 95 85 94 85 96 95 97 95 95 0 0 99 97 17 95 85 2

CARACTERIZAO GERAL DAS PRINCIPAIS ENTEROBACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICA (%)

Bactrias Citrobacter freundii Citrobacter diversus (koseri) Citrobacter amalonaticus Edwarsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans Gelatina 0 0 0 0 0 0 2 Malon. 11 95 1 0 95 75 65 Gs glicose 89 98 97 100 100 100 20 Lactose 78 50 35 0 95 93 40 Sacarose 89 40 9 0 100 97 75 Escul. 0 1 5 0 98 30 60 DNAase 0 0 0 0 0 0 0

Mod V - 26

Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Escherichia coli Escherichia coli inativa Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii grupo Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Salmonella spp. Salmonell typhi Salmonella cholerasuis Salmonella paratyphi A Salmonella gallinarum Salmonella pullorum Salmonella outras Serratia marcescens Serratia marcescens bio Serratia liquefaciens Serratia rubidae Yersinia enterocolitica

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90 91 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 90 30 90 90 0

96 18 0 0 0 0 0 0 50 93 98 3 95 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V 3 0 2 94 0

98 98 95 5 0 3 0 0 98 97 97 50 0 90 96 85 45 10 0 85 96 0 95 99 0 90 100 55 0 75 30 5

55 99 95 25 0 1 1 2 5 98 100 30 0 1 2 2 1 5 2 0 1 1 0 0 0 0 V 2 4 10 100 5

98 100 50 15 0 1 0 1 10 99 100 20 75 0 15 97 100 15 50 15 1 0 0 0 0 0 1 99 100 98 99 95

97 100 35 5 0 0 0 0 7 99 100 80 30 0 0 50 0 35 0 0 5 0 0 0 0 0 0 ou 15 95 96 97 94 25

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 80 40 0 10 0 2 0 0 0 10 0 1 98 82 85 99 5

IDENTIFICAO SOROLGICA Dentro da famlia Enterobacteriaceae, encontram-se conjuntos de amostras bacterianas bioquimicamente homogneas e, sorologicamente relacionadas, que constituem os gneros e, segundo alguns critrios, podem se dividir em espcies. As amostras relacionadas bioquimicamente so divididas em subgrupos ou tipos, por critrio sorolgico, de acordo com a presena dos antgenos: somtico (O), flagelar (H) e de envoltrio ou Mod V - 27

cpsula (K). Desse modo, os sorotipos so divises baseadas no relacionamento antignico, enquanto os biotipos so amostras do mesmo sorotipo que diferem em caractersticas bioqumicas. Em atividades de rotina de Bacteriologia Clnica, a identificao ou confirmao sorolgica feita apenas com germes comprovadamente patognicos e de importncia epidemiolgica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli Yersina enterocolitica e mesmo assim utilizando-se esquemas simplificados, atravs do seguinte procedimento tcnico: Preparar uma suspenso bastante densa (aspecto leitoso), da bactria a ser testada, utilizando soluo salina a 0,85%. A massa bacteriana proveniente do gar TSI usado na identificao bioqumica ou, de preferncia, em gar nutriente inclinado aps repique para obteno de massa de germes.

Colocar a salina sobre o crescimento bacteriano ocorrido na superfcie inclinada do meio; Agitar o tubo aps alguns minutos de modo a obter a suspenso bacteriana; Bactrias em fase rugosa tendem a se auto-aglutinar, e no devem ser utilizadas na classificao sorolgica.

Sobre uma lmina limpa misturar uma gota do anti-soro conhecido e da suspenso bacteriana a ser testada, e, com movimentos circulares, tornar a mistura bastante homognea continuando o movimento durante um ou no mximo dois minutos. O aparecimento de aglutinao, nesse intervalo de tempo, indica positividade da reao. Algumas vezes, necessrio o aquecimento da suspenso bacteriana em banho-maria fervente, durante 15 minutos, com finalidade de eliminar estruturas mais externas da clula que tm ao interferente na reao. Aps o resfriamento da suspenso, repetir o teste. Caso ocorra a aglutinao, confirmar a prova.

IDENTIFICAO DE SALMONELLA
No gnero Salmonella existe uma grande quantidade de sorotipos, que no so mais considerados como espcies, e sua identificao sorolgica completa e detalhada uma tarefa restrita aos denominados Laboratrios de Referncia. Para identificao rotineira no laboratrio clnico utilizam-se basicamente trs antisoros: a) Anti-Salmonella polivalente somtico (Grupos A,B,C,D,E) b) Anti-Salmonella somtico, Grupo D (S. typhi) c) Anti-Salmonella, anti Vi Quando o denominado antgeno de virulncia (Vi) est presente, poder bloquear a aglutinao do antgeno somtico do grupo D (Salmonella typhi). Desse modo, a suspenso dever ser aquecida em banho-maria fervente e testada novamente com os trs anti-soros citados, dando o resultado abaixo no caso de Salmonella typhi. A partir de uma reao positiva feita apenas com o antgeno somtico polivalente, existe condio de confirmar a amostra como sendo do gnero Salmonella, sem especificar o sorotipo ou sorovar. Antisoros Anti-soro poli somtico Grupo D somtico Anti Vi Antgeno vivo + neg + Antgeno aquecido + + neg

Aps a identificao bioqumica e aglutinao com soro polivalente, as amostras podero ser testadas com os soros A,B,C,D,E monovalentes. A bactria pertencer ao sorogrupo em cujo soro houver aglutinao. Se a reao for negativa deve-se aquecer a metade da suspenso em banho-maria fervente e repetir o teste. A metade no aquecida dever ser utilizada para determinao de antgenos flagelares. A identificao at sorotipos poder ser feita com auxlio dos soros flagelares (a,b,c,d,i,1,2,5), e atravs de sua utilizao possvel identificar as seguintes amostras:

Mod V - 28

Grupo Sorolgico Grupo O2 (A) Grupo O4 (B) Grupo O7 (C1) Grupo O5 (D1)

Espcie Bacteriana Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B e S. typhimurium Salmonella paratyphi C e S. cholerae suis Salmonella typhi

IDENTIFICAO DE SHIGELLA
O gnero Shigella est constitudo de apenas quatro sorogrupos, que so identificados sorologicamente, de maneira simplificada, com a utilizao de anti-soros polivalentes. Excepcionalmente, utiliza-se apenas o antisoro monovalente de Shigella dysenteriae tipo 1 (bacilo de Shiga), por ser o mais patognico. Grupo Sorolgico Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Espcie Bacteriana Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Sorotipos 13 sorotipos 06 sorotipos 18 sorotipos 01 sorotipo

As culturas suspeitas devero ser testadas primeiramente com os soros contra Shigella flexneri e Shigella sonnei, que representam mais de 95% das amostras de Shigella isoladas em nosso meio. Caso no haja aglutinao, prosseguir com os outros soros. No ocorrendo aglutinao, possvel que a cultura seja rica em antgenos de superfcie que geralmente impedem o contato do soro com o antgeno somtico O. Estes antgenos devem ser destrudos pelo aquecimento da suspenso bacteriana por 15 minutos em banho-maria fervente, procedimento que pode ser adotado como de rotina na sorologia desse gnero.

IDENTIFICAO DE ESCHERICHIA COLI

As amostras de Escherichia coli que causam diarria pertencem a trs grupos principais: Enteropatognicas (EPEC) Enterotoxignicas (ETEC) Enteroinvasoras (EIEC) No existe nenhuma prova bioqumica que possa, seguramente, distingu-las entre si ou de outros tipos de E. coli pertencentes flora normal do intestino. As amostras EPEC e EIEC so identificadas por provas de sorotipificao rotineira, enquanto as amostras ETEC so identificadas apenas mediante provas especiais de produo de toxinas, realizadas somente em laboratrios de referncia ou de pesquisa. Soro Anti E. coli Enteropatognica Clssica (EPEC) Polivalente A Polivalente B Polivalente C anti 026, 055, 0111, 0119 anti 0114, 0125, 0142,0158 anti 086, 0126, 0127, 0128

A sorotipificao pode ser feita, utilizando-se a mesma tcnica descrita para outras enterobactrias. Um melhor resultado obtido, repicando cerca de cinco colnias caractersticas a partir do gar BEM ou Mac Conkey, para um tubo contendo gar Nutriente Inclinado, com finalidade de obter massa de

Mod V - 29

germes. feita ento uma suspenso bacteriana em soluo salina, a qual ser testada utilizando anti-soros polivalentes, abrangendo os sorotipos mais prevalentes na populao. Soro Anti E. coli Enteroinvasora (EIEC) Polivalente A Polivalente B anti 028ac, 029, 0136, 0144, 0152 anti 0112ac, 0124, 0143, 0164, 0167

Soro Anti E. coli O 157 (EHEC) Utilizar o soro para O157:H7

Observaes importantes: Bactrias isoladas com o mesmo padro de provas de materiais nobres em surtos de infeco hospitalar, ou isoladas de infeces da comunidade que possam suspeitar de um surto, ou pela gravidade da doena, ou por um padro no esperado de resistncia, devem ser remetidas ao Laboratrio de Referncia (LACEN/Adolfo Lutz) para melhor caracterizao. Bactrias que no se enquadram nos padres definidos acima, recorrer a testes suplementares ou usar kits com maior nmero de provas ou em caso de importncia clnica (descritos acima) enviar ao Laboratrio de Referncia.

Mod V - 30

4. BASTONETES NO FERMENTADORES
INTRODUO Os bacilos Gram negativos classificados como no fermentadores (BNFs) so microrganismos aerbios, no esporulados, que se caracterizam pelo fato de serem incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia atravs de fermentao, degradando-os pela via oxidativa. A identificao dos BNFs sempre foi um desafio para os laboratrios de rotina em microbiologia, considerando que a maioria deles no realiza este tipo de identificao, ou o faz de maneira elementar em virtude da pouca incidncia em amostras ambulatoriais, assim como pela complexidade e elevado custo dos esquemas completos de identificao. A caracterizao deste grupo de bactrias de grande importncia nos casos de infeco hospitalar. Embora a sua incidncia, mesmo em hospitais, seja pequena quando comparada a outros agentes etiolgicos, geralmente eles apresentam resistncia elevada a vrios antibiticos e so capazes de causar infeces graves. Estas bactrias colonizam e causam infeces, em especial, em pacientes graves oriundos de CTI e submetidos procedimentos invasivos, sendo importante classific-los at o nvel de gnero e espcie. O nmero de bactrias no fermentadoras conhecidas muito grande. Foram selecionadas aquelas consideradas na atualidade de maior importncia clnica (*) e as demais para diagnstico diferencial entre si. BNFs de importncia clnica consideradas neste captulo*: Acinetobacter spp.* Achromobacter spp. Burkholderia cepacia * Methylobacterium spp. Pseudomonas aeruginosa * Pseudomonas luteola Pseudomanas putida Pseudomanas pseudomallei * Stenotrophomonas spp.* Sphingobacterium spp. Alcaligenes spp.* Bordetella bronchyseptica Chryseobacterium (Flavobacterium) spp.* Moraxella spp.* Pseudomanas fluorescens Pseudomanas oryzihabitans Pseudomonas stutzeri Roseomonas spp. Shewanella spp. Sphingomonas paucimobilis

Testes necessrios para a identificao de rotina dos BNFs Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo de OFglicose (com vaselina) de OFglicose (sem vaselina) com lisina controle de aminocidos gar citrato gar uria com gar esculina com TSI com gelatina com caldo NaCl 6,5% Disco de oxidase Disco de PYR Tubo com arginina Caldo TSB para motilidade em lmina Caldo TSB crescimento 42oc Tubo de caldo indol Disco de polimixina Placa de Mac Conkey Placa de DNAse

SEMEADURA, LEITURA E INTERPRETAO DAS PROVAS DE IDENTIFICAO A partir de colnias isoladas em cultura pura com 24 horas de crescimento, nos meios de inoculao primria, deve-se proceder a realizao das tcnicas de identificao e diferenciao dos BNFs:

PROVAS
Disco de oxidase

SEMEADURAS
- Retirar 2-3 colnias com ala. - Esfregar sobre a fita ou disco teste; pode umedecer o papel com 1 gota de salina estril.

LEITURA E INTERPRETAO
- A leitura feita em 15 a 20 segundos. - A cor violeta forte aparece rapidamente. Aps este intervalo, cores violeta-plido so falso positivos. A Burkholderia cepacia pode dar reao fraca.

Mod V - 31

Tubo de OF glicose (com e sem vaselina)

- Picar com agulha at o fundo do tubo.

- Fermentador: dois tubos ficam amarelos (cido) - Oxidativo: tubo sem vaselina amarelo tubo com vaselina verde - Inerte ou alcalino: dois tubos no mudam de cor (inerte) ou o tubo sem vaselina fica azulado (alcalino). Aguardar, no mnimo, 72h para definir como inerte, pois pode ocorre a oxidao tardia ou lenta. - Incubar 30oC, se negativo, aguardar no mnimo 72h. Se positivo, ocorre precipitado cinza no fundo do tubo. - Adicionar cido clordrico e aguardar 5 minutos. - Observar a presena de halo transparente em volta do inoculo positivo enquanto o restante do meio fica leitoso. - Se negativo, repetir o teste com leitura em 72h. - Comparar os tubos testes dos aminocidos com o controle negativo. - tubo controle negativo deve ficar azul esverdeado plido e as provas positivas ficam de cor prpura. - Se negativo, aguardar at 5 dias. - A cor rosa forte aparece em todo o meio aps 24 a 72 h de incubao; uma ligeira mudana de cor rsea no pice, que no progride com maior tempo de incubao, considerado negativo. - Bordetella bronchiseptica: reao positiva em 4 h. - A cor azul forte aparece no pico, e com maior incubao estende-se a todo o meio. - Ocorre turbidez no meio ou ntido o aumento da densidade bacteriana. - Ideal comparar com controle mantido a temperatura ambiente. - Agitar o tubo e com uma pipeta com ponteira estril ou ala bacteriolgica estril. - retirar uma gota e depositar sobre uma lmina. - Cobrir a gota com uma lamnula e levar ao microscpio. Observar com aumento de 400 vezes (ocular 10x e objetiva 40). - A presena de bactrias cruzando o campo em diferentes direes significativo de motilidade positiva; movimentos vibratrios fracos = negativo (movimento browniano). Quando o movimento de todas as bactrias numa mesma direo, provavelmente o movimento do lquido entre a lmina e a lamnula. - Verificar a motilidade em temperaturas de 37oC e 20oC (ambiente). - A presena de turbidez e mudana de cor indicam crescimento - Ocorre precipitado negro intenso nas provas positivas a partir de 6 horas de incubao at 48 h - Cor castanho escuro prova negativa. - Colocar 5 gotas de xilol e agitar bem o tubo. - Adicionar 5 gotas do reagente de Erlich ou Kovacs. - Observar a presena de anel prpura-plido ou intenso que revelam prova positiva. - Qualquer halo em torno do disco significa sensibilidade.

Tubo com pedao de filme e gelatina

- Inocular 2-3 colnias na salina. - Deixar o fragmento imerso.

Placa de DNAse

- Semear 2 a 3 colnias em spot (crculo de 1 cm de dimetro).

Tubo com lisina, arginina, controle de aminocidos

- Usar inculo denso; pode adicionar 2 ml de vaselina lquida no tubo com lisina.

Uria

- Semear com agulha inculo denso na superfcie do meio.

Citrato

- Semear com agulha na superfcie do meio. - Semear 2 colnias no caldo.

Caldo TSB crescimento 42oC

- Semear 2 colnias no caldo.

Caldo TSB motilidade

Tubo com caldo NaCl 6,5% Tubo com gar esculina

- Semear 2 a 3 colnias no caldo. - Semear 2 a 3 colnias na superfcie do meio.

Tubo de caldo indol

- Inocular 2 colnias no caldo.

Disco de polimixina

- Fazer antibiograma em Mueller Hinton. - Colocar o disco.

Mod V - 32

Disco de PYR

- Colocar o disco sobre colnias de crescimento recente ou fazer suspenso densa. - Depositar 3 a 4 gotas sobre o disco de PYR. - Incubar durante 4 horas numa placa vazia com umidade.

- Colocar o disco teste em contato com o crescimento bacteriano. - Coloc-lo sobre uma lmina. - Depositar uma gota do reagente que acompanha o teste. - A presena de cor alaranjada prova positiva; mantendo a cor amarela prova negativa. - Recomenda-se testar controles positivo e negativo. - Crescimento deve ocorrer entre 1 a 3 dias.

Placa de Mac Conkey

- Semear com ala 1 colnia isolada. - Semear com agulha picando at o fundo do tubo e na superfcie do gar inclinado.

TSI

- Fermentador: presena de cor amarela apenas na base ou no pice e na base - Com ou sem H2S e gs: precipitado preto e bolhas. - No fermentador: permanece vermelho (alcalino) no pice e na base.

PROCEDIMENTOS PARA A IDENTIFICAO No caso de isolar uma bactria que no foi ainda comprovada como no fermentadora da glicose, seguir as seguintes etapas com a colnia isolada: Gram e Oxidase: observar se h pigmento da colnia crescida (amarelo, rseo, cor metlica).

RESULTADO DO GRAM E OXIDASE

Gram Positivo: Procurar a identificao de cocos e bacilos Gram positivos Gram negativo: Coco Gram negativo, oxidase positivo, identificar como Neisseria spp. ou seguir para a Tabela 2 Coco Gram negativo, oxidase negativo, seguir para Tabela 1 Bacilo Gram negativo, oxidase negativo: Semear Fenilalanina, Citrato, Uria (ou EPM MILI ou IAL) Semear OF glicose e Caldo motilidade seguir Resultado OF 1 Bacilo Gram negativo, oxidase positivo: Semear OF Glicose e Caldo motilidade seguir Resultado OF 2

RESULTADO DO OF
1. Bacilo (cocobacilo) Gram negativo oxidase negativo OF Glicose fermentador: Fazer a identificao com as provas realizadas, visto ser uma enterobactria. Vide captulo enterobactrias para interpretao dos resultados. OF no fermentador: motilidade negativa: Tabela 1 motilidade positiva: Tabela 3 2. Bacilo Gram negativo oxidase positiva: OF Glicose fermentador: pesquisar Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio OF Glicose no fermentador: se pigmento rosa, seguir Tabela 7 motilidade negativa e pigmento amarelo, seguir Tabela 4 motilidade positiva: se TSI com H2S segue Tabela 5a e 5b; se OF glicose Oxidativo segue Tabela 5; se OF glicose Inerte, seguir Tabela 6

Mod V - 33

TABELAS DE IDENTIFICAO DOS BNFS

Tabela 1. Coco-bacilos ou cocos Gram negativo, Oxidase negativa e Motilidade negativa

Microrganismos A. baumannii A. calcoaceticus A. haemolyticus A. lwoffii OF-glicose O O Inerte/oxidativo inerte Cresc. 42C + neg neg neg Citrato + + + neg Gelatina neg neg + neg

Prova opcional
Microrganismos A. baumannii A. calcoaceticus A. haemolyticus A. lwoffii * hemlise em gar sangue Hemlise * neg neg + neg

Tabela 2. Cocos Gram negativo, Oxidase positivo, Motilidade negativa, OF-Gli inerte
Microrganismos Moraxella(B) catarrhalis Moraxella canis M. fenilpiruvica/ureolytica Moraxella lacunata Moraxella spp. * Urease neg neg + neg neg Gelatina neg neg neg + neg DNAse + + neg neg neg Mac Conkey neg + + neg varivel

* Moraxella spp.: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis

Tabela 3. Bacilos Gram negativo, Oxidase negativa, Motilidade positiva, OF-Gli oxidativo ou inerte
Microrganismos Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans B. cepacia S. maltophilia Arginina + neg (14+) neg neg DNAse neg neg neg + Lisina neg neg 80%+ 93%+ Polimixina * sensvel sensvel resistente resistente

* Fazer antibiograma com polimixina

Mod V - 34

Provas opcionais
Microrganismos Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans B. cepacia S. maltophilia * Fazer antibiograma com Imipenem Esculina + neg varivel varivel PYR + + neg neg Imipenem * sensvel sensvel varivel resistente

Tabela 4. Oxidase positiva, Motilidade negativa e OFG Oxidativo, Bacilos com pigmento amarelo e Crescimento em MC varivel
Microrganismos Chryseobacterium meningosepticum C. indologenes Sphingomonas paucimobilis Sphingobacterium spp. * * S. multivorum, S. spiritivorum Indol + + neg neg DNAse + neg neg varivel Polimixina resistente resistente sensvel resistente Uria neg neg neg +

Tabela 5a. Bacilos Gram negativo, Oxidase positiva, Motilidade positiva, OF GLI oxidativo vide fluxograma para facilitar interpretao
Microrganismos Polimixina Lisina Arginina NaCl 6,5% neg Gelatina 42C Caracterstica

A. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri B. pseudomallei B. cepacia S. paucimobilis * Shewanella spp.

sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel resitente resistente sensvel sensvel

neg neg neg neg neg neg 80%+ neg neg

neg + + + neg + neg neg neg

neg 82 + neg

+ 86 + neg neg varivel + 83%+ neg varivel pigm. amarelo seca pigmento

neg +79% 20%+ +

varivel

varivel

* Mot positiva = Temperatura ambiente

Provas complementares
Microrganismos A. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri

1, 2

Esculina * neg neg neg neg neg

PYR * + varivel varivel neg neg

Microrganismos B. pseudomallei B. cepacia S. paucimobilis* Shewanella spp.

Esculina * varivel varivel + neg

PYR * neg neg 25+ +

* provas da esculina e PYR teis apenas para diferenciar as bactrias lisina e arginina negativas

Mod V - 35

Tabela 5b. Bacilos Gram negativos no fermentadores, Oxidase positiva, Motilidade positiva, com H2S no TSI, OF Glicose varivel, DNAse positiva
Bactria Shewanella putrefaciens Shewanella alga Cresc. 42oC neg + NaCl 6,5% neg +

Fluxograma Auxiliar para Tabela 5

Lisina

positiva

Burkholderia cepacia Polimixina R

negativa

negativa

arginina

positiva

polimixina

polimixina

B. cepacia

esculina

B. pseudomallei

crescimento a 42oC

positiva

negativa

positivo

negativo

S. paucimobilis

NaCl 6,5%

P. aeruginosa

gelatina

positivo

negativo

positiva

negativa

DNAse

P.stutzeri

P. putida

P. fluorescens

positivo

negativo

S. putrefaciens

A. Xylosoxidans

Mod V - 36

Tabela 6. Bacilos Oxidase positiva, Motilidade positivo, OF-Gli alcalino - incubar 72 h.

Microrganismos A. denitrificans Alcaligenes faecalis B. bronchiseptica S. malthophilia * Uria varivel neg ++ neg NaCl 6,5% neg + neg 78% neg DNAse neg neg neg +

*raramente pode ser oxidase positiva Prova complementar 2

Microrganismos A. denitrificans Alcaligenes faecalis B. bronchiseptica S. malthophilia PYR + neg neg neg

Tabela 7. Bacilos e coco-bacilos Gram negativos no fermentadores, Oxidase positiva, OF Glicose varivel, com pigmento rseo (1)
Microrganismos Motilidade Morfologia Urease Mac Conkey neg Cresc. 42oC neg Obs.

Methylobacterium spp.

bacilos

colnia seca coral colnias mucides rosadas

Roseomonas spp.

varivel

Coco-bacilos

TABELAS DE CONSULTA PARA IDENTIFICAO DE NO FERMENTADORES

Oxidase e motilidade negativos

Microrganismos OXI MOT Morf. OF-G Cresc. a 42C + neg neg CIT MAL GEL HEM

A. baumannii A. calcoaceticus A. haemolyticus

neg neg neg

neg neg neg

coco coco coco

O O Inerte/ oxidativo inerte Inerte/ oxidativo

+ + +

+ + neg

neg neg +

neg neg +

A. lwoffii Acinetobacter spp.

neg neg

neg neg

coco coco

neg neg

neg +

neg varivel

neg varivel

neg varivel

OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson

CIT = citrato MALO = malonato HEM = hemlise em gar sangue

GEL = gelatina

Mod V - 37

Oxidase negativo e Motilidade positiva

Microrganismos P. luteola P.oryzihabitans S. maltophilia B. cepacia Oxidase neg neg neg 14% neg Motilidade + + + + Morfologia bacilo bacilo bacilo bacilo OF-Glicose oxidativo oxidativo 85% oxid. oxidativo Imipenem sensvel sensvel resistente resistente

Microrganismos P. luteola P.oryzihabitans S. maltophilia B. cepacia

Esculina + neg 39%+ 63%+

Dnase neg neg + neg

Lisina neg neg + 80%+

Argina + 14%+ neg neg

Mac Conkey + + + +

42oC 94%+ 33%+ 48%+ 83%+

Oxidase positiva, Motilidade negativa, OF-Glicose oxidativo

Microrganismos C. meningosepticum OXI + MOT neg Morf bacilo OF-G oxidativo lento oxidativo lento oxidativo oxidativo Uria neg Indol + DNAse + MC varivel Poli resistente

C. indologenes

neg

bacilo

neg

neg

varivel

resistente

S. paucimobilis

+ +

Neg neg

bacilo bacilo

neg var

neg neg

neg varivel

varivel varivel

sensvel resistente

Sphingobacterium spp.

OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson 1 pode ser motilidade positiva a 20oC 2 a 37oC

MC = Mac Conkey

Poli = polimixina

Oxidase positiva, Motilidade negativa, OF-Glicose inerte e cocide

Microrganismos M. catarrhalis M. canis M. fenilpiruvica / ureolytica M. lacunata Moraxella spp. * raras OXI + + + + + MOT neg neg neg neg neg Morf coco coco coco coco coco OF-G inerte inerte inerte inerte inerte Uria neg neg + neg neg GEL neg neg neg + neg DNAse + + neg neg neg MC neg + + neg varivel

OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson

MC = Mac Conkey

GEL = gelatina

* Moraxella spp.: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis

Mod V - 38

Oxidase positiva, Motilidade positiva e OF-Glicose inerte ou alcalino

Microrganismos OXI MOT Morf OF-G MC Uria CIT Nat\ ito + + neg + + varivel varivel + + 54+ Nit\ gs + neg + neg neg neg neg varivel + neg Cresc. 42oC

A. denitrificans A. piechaudii Alcaligenes faecalis B. bronchiseptica Comamonas spp. P.pseudoalcaligenes P. alcaligenes

+ + + + + + +

+ + + + + + +

bacilo bacilo bacilo cocobacilo bacilo bacilo bacilo

alcalina alcalina alcalina alcalina inerte inerte inerte

+ + + + + + +

nt neg neg ++ neg neg neg

OXI = oxidase MOT = motilidade Morf = morfologia OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson nt= no testado (no citado na literatura)

MC = Mac Conkey

CIT = citrato

Oxidase positiva, Motilidade positiva e OF-Glicose oxidativo

Microrganismos A. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. mendocina (rara) P. putida P. stutzeri S. paucimobilis B. cepacia B pseudomallei S. putrefaciens Oxidase + + + + + + + 86% + + + Motilidade + + + + + + + + + + Morfologia bacilo bacilo bacilo bacilo bacilo bacilo bacilo bacilo bacilo bacilo OF-Gli oxidativo oxidativo oxidativo oxidativo oxidativo oxidativo oxidativo oxidativo oxidativo oxidativo Cresc. 42oC nt + neg + neg 69 nt 83% + + V

nt= no testado (no citado na literatura) Microrganismos A. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. mendocina (rara) P. putida P. stutzeri S. paucimobilis B. cepacia B pseudomallei S. putrefaciens Gelatina nt 82% + + neg neg neg nt 20% + 79% + varivel Esculina neg neg neg neg neg neg + 63% + 59% + neg Polimixina sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel resistente resistente sensvel Mac Conkey + + + + + + varivel + + + Lisina nt neg neg neg neg neg nt 80% + neg neg Arginina varivel + + + + neg neg neg + neg

nt= no testado (no citado na literatura)

Mod V - 39

Bactrias no fermentadoras com pigmento rosa

Microrganismos OXI MOT Morf OF-Gli Uria Mac Conkey neg Cresc. 42oC neg Obs.

Methylobacterium spp.

bacilo

varivel

Colnia seca coral, bacilos com vacolos Colnias mucides rosadas cocobacilos

Roseomonas spp.

varivel

cocobacilo

varivel

OXI = oxidase

MOT = motilidade

Morf = morfologia

Mod V - 40

5. BACILOS CURVOS OU ESPIRALADOS

INTRODUO Este captulo apresenta os principais bacilos curvos ou espiralados de importncia clnica, relacionados s principais patologias, fontes de infeco e recursos diagnsticos para sua caracterizao. Por se tratar de agentes raros, com exceo dos Campylobacter spp., no sero abordados em profundidade, devendo o microbiologista encaminhar a cepa isolada para Laboratrio de Referncia ou consult-lo sobre recursos disponveis para tentativa de isolamento.

PRINCIPAIS BACTRIAS CURVAS OU ESPIRALADAS

Agente Arcobacter spp. Borrelia burgdoferi Borrelia recurrentis Doena Bacteremia gastroenterite Doena de Lime Febre recorrente epidmica Gastroenterite Reservatrio Gado, humanos Roedores Humanos Transmisso Alimentos
1

Carrapatos Sarna (P.humanus)

Campylobacter coli/ jejuni Campylobacter fetus

Alimentos contaminados

Alimentos

Bacteremia, infeco extranegintestinal Gastrite, lcera pptica Gastroenterite, bacteremia, etc. Leptospirose Sfilis Gastroenterite

Humanos

Fecal-oral

Helicobacter pylori Helicobacter spp.

Humanos, macacos, gatos Animais domsticos

Fecal-oral Fecal-oral, alimentos

Leptospira spp. Treponema pallidum Vibrio spp.

1 2

Ces, gatos, porcos, ratos Humanos Alimentos, gua

Alimentos-gua Sexual Alimentos

1

- Ingesto de alimentos e gua contaminados - Alimentos ou gua contaminados com urina de animal infectado

RECURSOS DIAGNSTICOS
Agente Arcobacter spp. Borrelia burgdorferi (doena de Lyme) Borrelia spp. Campylobacter coli e C. jejuni Campylobacter fetus Testes * Microscopia: bacilos Gram negativos curvos ou helicoidais Cultura: cresce entre 15 a 30oC em ambiente especfico de combinao de gases em CAMPY-CVA. Sorologia: No disponvel Microscopia: espiroquetas coradas por colorao de prata de Warthinneg Starry ou anticorpos marcados por fluorescena em tecidos Cultura: meio BSK II em microaerofilia entre 30-37oC por 6 semanas Sorologia; Imunofluorescncia e ELISA Microscopia: espiroquetas coradas pelo Giemsa, Wright de amostras de sangue Cultura igual de B. burgdorferi Microscopia: bacilo fino e curvo, Gram negativo, mas mal corado pelo Gram. Cultura: cresce a 37 e 42oC em em ambiente especfico de cambinao de gases em Campy-CVA Microscopia:bacilo fino e curvo, Gram negativo, mas mal corado pelo Gram Cultura: cresce em gar sangue a 37oC, mas no a 42oC em ambiente especfico de cambinao de gases

Mod V - 41

Helicobacter pylori

Microscopia: bipsia gstrica corada por H&E, Giemsa ou colorao pela prata de Warthin-Starry. Recurso rpido; teste da urease em bipsia gstrica (sensibilidade>90%) Cultura: cresce em meios seletivos ou no em microaerofilia a 37oC por 5-7dias Sorologia: til para determinar doena ativa por Enzima-Imunoensaio Pesquisa no sangue, LCR e urina:microscopia em campo escuro (baixa sensibilidade) ou por imunofluorescncia direta Cultura: primeiros 10 dias de doena - LCR e sangue colhido com heparina em meio de Fletcher incubado temperatura ambiente por 2 a 16 semanas. Cultura do sedimento urinrio alcalinizado aps a 1 semana da doena. Sorologia: aglutinao ou ELISA so sensveis e especficos

Leptospira spp.

Treponema pallidum -

Linfa de leses observadas em campo escuro ou colorao pela prata (Fontana); presena de espiroquetas. Imunofluorescncia direta mais sensvel Sorologia: VDRL ou FTA-abs so muito teis para diagnstico * Recursos no citados: no teis ou no disponveis BSK II = meio de Barbour Stoenner-Kelly Campy-CVA= Meio seletivo para Campylobacter com cefoperazona, vancomicina e anfotericina.

CAMPYLOBACTER

MATERIAL
Em caso de gastroenterite colher fezes e enviar rapidamente ao laboratrio ou em meio de transporte de Cary-Blair semi-slido. Em amostras de sangue colhidas em meios convencionais, estas podem suportar o crescimento do C. fetus que a espcie que causa com maior freqncia infeces extraintestinais.

MICROSCOPIA
A colorao de Gram deve usar no lugar da safranina a carbol-fucsina ou fucsina bsica a 0,1% durante 2 minutos. Exame de fezes costuma revelar presena de leuccitos, mas a ausncia no contra-indica a cultura ou a suspeita diagnstica. O Gram das fezes tem sensibilidade entre 70 a 90% e elevada especificidade. Principais espcies de Campylobacter e Arcobacter
Bactria Catalase H2S-TSI Cresc. 15oC neg Cresc. 25oC neg Cresc. 42oC + Mac Conkey + cido Nalidixico sensvel ou resistente sensvel sensvel ou resistente sensvel ou resistente sensvel Cefalotina

C. jejuni

neg

resistente

C. coli C. fetus

+ +

neg neg

neg neg

neg +

+ neg

+ +

resistente sensvel

Campylobacter spp. Arcobacter * C. lari = resistente

varivel

neg

neg

varivel

sensvel *

neg

varivel

varivel

varivel

ISOLAMENTO
A maioria das espcies de Campilobacter exige microaerofilia contendo cerca de 5% de CO2, 10% de CO2 e 85% de N2 (microaerofilia), obtidos com geradores especficos e no apenas com vela. Para aumentar a chance de isolamento em fezes recomenda-se a filtrao das fezes em filtro de acetato de celulose >0,45 m. Vrios so os meios de cultura especficos para coprocultura por serem seletivos, sendo na atualidade os mais recomendados o gar carvo desoxicolato cefoperazona, o meio Campy CVA (Cefoperazona , Vancomicina e Anfotericina) e o meio de Karmali (base de Columbia gar, carvo ativado e suplemento de antibiticos). Mod V - 42

Amostras de hemocultura devem ser repicadas em meios no seletivos com geradores para microaerofilia. Fazer o teste de crescimento a 25, 37 e 42oC (todos crescem a 37oC). No exame direto em gota direto no microscpio entre lmina e lamnula pode-se observar a motilidade tipo hlice em movimento. As provas de crescimento devem ser feitas em gar Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro em microaerofilia. O teste de sensibilidade ao cido nalidxico e cefalotina pode ser feito em qualquer meio no seletivo e ser considerado sensvel a presena de qualquer tamanho de halo. VIBRIOS, AEROMONAS E PLESIOMONAS A suspeita da presena de Vibrio, Aeromonas e Plesiomonas evidenciada pelo: Isolamento de bactria Gram negativa fermentadora da glicose (TSI fermentador) e oxidase positiva. Materiais clnicos que podem, eventualmente, ser associados com maior frequncia de isolamentos de Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas. Principais bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva e sua associao com diferentes quadros clnicos:
Bactria Diarria Infeces partes moles pouco comum Sepse Outros

Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Plesiomonas shigeloides Aeromonas hydrophila Aeromaonas caviae Aeromonas veronii

freqente

raro

raro

freqente freqente freqente freqente

raro frequente raro raro

freqente * freqente freqente freqente

raro freqente freqente freqente

* associado meningite em recm-nascidos

VIBRIO
As espcies do Gnero Vibrio so bacilos curvos ou s vezes retos, longos, anaerbios facultativos, mveis, fermentadores da glicose, em geral sem produzir gs, e oxidase positivas. Alm do Vibrio cholerae, existem mais de 10 espcies patognicas para o ser humano. Algumas espcies podem causar gastroenterite, outras infeces cutneas e bacteremias. A clera, causada pelo V. cholerae produtor de toxina (dois biotipos: clssica e El Tor), responsvel por diarria secretria disseminada por via fecal-oral (gua e alimentos contaminados) em surtos e epidemias associadas falta de condies sanitrias adequadas. O quadro clnico pode variar de assintomtico a diarria aguda com morte em 5 horas por desidratao e distrbio eletroltico. Casos espordicos podem ocorrer por ingesto de ostras e outros pescados crus ou mal cozidos. A coleta do material quando for fecal dever ser feita utilizando o meio de transporte de Cary & Blair, e as cepas suspeitas ou confirmadas de Vibrio devero ser encaminhadas a Laboratrio de Referncia, para registro epidemiolgico. Algumas outras espcies de Vibrios alm do V. cholerae necessitam de NaCl para crescimento. gar sangue e Mac Conkey permitem o crescimento da maioria das espcies, e neste ltimo meio as colnias so semelhantes a de bastonetes no fermentadores. A diferena que no TSI, EPM ou IAL h fermentao da glicose, como ocorre tambm com Aeromonas e Plesiomonas. So oxidase positivas, a maioria esculina negativa, DNAse positivo e quase todos crescem em caldo com NaCl 6%.

Mod V - 43

AEROMONAS E PLESIOMONAS
Vivem em ambientes aquticos em todas as partes do mundo. Podem ser encontradas em gua de fonte, gua de lagos, guas poludas, etc. Plesiomonas preferem guas tropicais e no marinhas, sendo a Aeromonas mais tolerante s diferentes condies. Aeromonas tm sido isoladas em carnes, meio ambiente aqutico e produtos do mar, e suas diferentes espcies causam doenas no s no homem como em animais, peixes, rpteis, cobras e pssaros. Em nossa experincia comum o isolamento de Aeromonas em abscesso ps-picada de cobra, lquido biliar em pacientes com colicistite, diarria, sepse (em pacientes com doena heptica crnica) e abscessos cutneos ps-acidentes (corto-contusos) em lagos, tanques, etc. A chance de detectar Aeromonas e Plesiomonas depende da adoo do procedimento em se fazer o teste da oxidase em bactrias com caractersticas de Escherichia coli lactose negativa. As principais caractersticas das Aeromonas so: lactose negativa, H2S negativo, fenilalanina negativa, indol positivo, motilidade positiva, e crescem bem em meios ricos e seletivos (Mac Conkey e Salmonella-Shigella). Principais provas diferenciais entre Aeromonas spp., E.coli e Citrobacter spp.
Bactrias E. coli Citrobacter spp. Aeromonas spp.
1

Citrato neg + varivel

Uria neg varivel neg

Lisina + neg +

H2S neg varivel neg

Lactose + varivel neg

1

Gs + + varivel

- Aeromonas caviae: lisina negativa e lactose positiva

Provas diferenciais para bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva: Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio
Provas V. cholerae Outros vibrios neg + + +
2

Aeromonas spp.

Plesiomonas spp.

Cresce sem NaCl

+
1

+ neg + +

+ neg + neg

Cresce com 6% NaCl Oxidase DNAse

1 2

+ + +

- crescimento em caldo nutriente - exceto V. mimicus

Provas para diferenciar as principais espcies de Aeromonas e Plesiomonas

Bactrias A. hydrophila A. caviae A. sobria A. veronii A. jandaei A. schubertii Plesiomonas shigelloides Indol + + + + + neg + LIS + neg + + + + + ARG + + + neg + + + ORN neg neg neg + neg neg + ARA + + neg neg neg neg neg LAC neg + neg neg neg neg neg LAC = lactose SAC + + + + neg neg neg ESC + + neg + neg neg neg HEM * + neg + + + Varivel neg

LIS = lisina ARG = arginina ORN = orninina ARA = arabinose ESC = esculina HEM * = hemlise / sangue carneiro

SAC = sacarose

Mod V - 44

6. BACILOS GRAM POSITIVOS

INTRODUO Este captulo aborda os aspectos prticos para identificao dos principais bacilos Gram positivos de importncia clnica. Bactrias consideradas: Corineformes Arcanobacterium spp., Corynebacterium spp., G. vaginalis, Oerskovia spp., Rhotia spp. Erisipelotrix spp., Listeria spp., Kurthia spp.

Bacilos Gram positivos regulares Esporulados Bacilos ramificados (Actinomycetos)

Bacillus spp. Nocardia spp., Rhodococcus spp., Streptomyces spp.

Bactrias Gram positivas que so citadas no texto para fins de diagnstico diferencial, mas que foram abordadas em outros captulos so: Outros anaerbios: Mobiluncus spp. Actinomyces spp. (anaerbios) Propionibacterium spp. Clostridium spp. (anaerbios) Eubacterium Lactobacillus spp. (anaerbios) Bifidobacterium spp. Mycobacterium spp. (micobactrias) Os Actinomyces spp. e alguns Propionibacterium spp. embora anaerbios, podem ser aerotolerantes, e crescer em aerobiose.
ORIENTAO GERAL NA IDENTIFICAO DE BGPS

Para triagem inicial dos Bacilos/cocobacilos Gram positivos, algumas observaes e provas so fundamentais: Colher material com antissepsia rigorosa para evitar contaminao. Mesmo em lquidos estreis h risco de contaminao, por isso pede-se a coleta de no mnimo duas hemoculturas. No LCR o resultado do Gram do sedimento e a presena de neutrofilia reforam a hiptese de ser agente infeccioso. Valorizar o achado em pacientes imunocomprometidos. Procurar sempre ter bacterioscopia do material clnico onde foi isolado o Bacilo Gram Positivo (BGP) e verificar se h predomnio do agente em questo; relevante o achado dentro de macrfagos / neutrfilos. Valorizar materiais nobres (sangue, LCR, pericrdico, etc.), bipsias, aspirados de abscessos, LBA, etc., desde que a bacterioscopia e o quadro clnico sejam compatveis. Cuidado com contaminao por bactrias da flora de mucosas. Em caso de abscessos interessante fazer semeadura quantitativa (com ala calibrada), sendo sugestivo o isolamento de >104 UFC/ml. Em urina sugestivo quando isolado como nico agente, bacterioscopia concordante, leucocitria, sintomas de infeco urinria e contagem >105 UFC/ml. Observar caractersticas da colnia: cor, tamanho, cheiro, consistncia, hemlise, etc. Testar em quais meios cresce o BGP e suas condies de incubao. Para observar esporos e hifas areas algumas vezes necessrio deixar a colnia envelhecer ou crescer em meios pobres.

Mod V - 45

 sempre interessante semear em meio slido e em caldo para observar variao morfolgica; observar ramificaes em diferentes condies e meios de cultivo. Fazer colorao de Ziehl ou de Kinyoum para pesquisa de lcool-cido resistente. Lembrar que este grupo de bactrias pode variar muito nas caractersticas morfolgicas quando observado no material clnico culturas jovens, culturas velhas, meios slido ou lquido, meio rico ou pobre, etc., sem que represente contaminao ou cultura mista. No entanto, algumas destas bactrias so habitantes de mucosas e podem causar infeco mista associada ou no com anaerbios estritos. CORINEFORMES So classificados como corineformes as seguintes bactrias: Corynebacterium spp. Arthrobacter spp. Brevibacterium spp. Curtobacterium spp. Exiguobacterium spp. Arcanobacterium spp. Microbacterium spp. Aureobacterium spp. Turicella spp. Dermabacter spp. Gardnerella spp. Rothia spp. Cellulomonas spp.

Entre os corineformes foram selecionados aqueles de maior importncia clnica, sendo recomendvel a caracterizao e provas diferenciais apenas dos gneros: Corynebacterium spp. Arcanobacterium spp. Gardnerella spp. Rothia spp.

PRINCIPAIS DOENAS ASSOCIADAS AOS BACILOS GRAM POSITIVOS

Bactria Actinomyces spp., A. israelii, A. naeslundii, A. viscosus, A. odontolyticus e outros Arcanobacterium spp., A. nhaemolyticum Bacillus sp, B. anthracis, B. cereus Quadro clnico Actinomicose, doena granulomatosa predominante cervico-facial faringite, infeco de partes moles, endocardite, etc Antraz, intoxio alimentar, sepse e pneumonia em imunossuprimidos e neutropnicos difteria endocardite, bacteremia Zoonose, linfadenite e abscessos celulite em veterinrios e zona rural vaginose, endometrite, ps-parto flora oro-intestinal e vaginal, rarssimo patgeno meningite, sepses, aborto abscesso cerebral, abscesso pulmonar, etc. em imunocomprometidos bacteremia, infeco associada a corpo estranho pneumonia, abscessos, etc. em imunocomprometidos endocardite, bacteremia, infeces respiratrias Oportunista, infeces de partes moles, etc.

C. diphtheriae, C. ulcerans C. jeikeium C. pseudotuberculosis Erysipelotrix sp Gardnerella spp. Lactobacillus spp. Listeria spp. Nocardia spp.

Oerskovia spp. Rhodococcus spp. Rothia spp., R. dentocariosa Streptomyces spp.

Mod V - 46

Triagem inicial para Bacilos e Cocobacilos Gram positivos

Bactria Actinomyces spp. Arcanobacterium spp. Bacillus spp. Clostridium spp. Corinebacterium spp. Erisipelotrix rhustiopathie Gardnerella vaginalis Lactobacillus spp. Mobiluncus spp. Listeria spp. Mycobacterium spp. Nocardia spp. Oerskovia spp. Ppropionibacterium spp. Rhodococcus spp. Rhotia dentocariosa Streptomyces spp. Esporo neg neg + + neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg Anaer. + neg neg + neg neg neg + + neg neg neg neg + neg neg neg AAR * neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg + + neg neg varivel neg neg Ramif. neg raro /curto neg neg neg neg neg neg neg neg varivel + varivel + varivel + + Hemlise neg beta varivel varivel neg alfa beta /coelho neg neg beta neg neg neg neg neg neg neg Catalase V neg + neg varivel neg neg varivel neg + + + + varivel + + + col. coral Pleomrfico raro, hifas mvel mvel cresc. lento col. laranja col. amarela paliada H2S + Gram lbil Pleomrfico Obs.

* AAR = alcool-cido resistente

importante destacar que os corineformes correspondem a um grupo no homogneo de bactrias com poucas caractersticas em comum sendo tambm morfologicamente muito distintos:

CORYNEBACTERIUM SPP
O gnero Corynebacterium compreende cerca de 50 espcies, sendo cerca de 30 de algum interesse mdico. Estas espcies podem ser diferenciadas por provas como: OF glicose reduo de nitrato urease utilizao de diferentes carboidratos reao de CAMP Principais caractersticas: no se ramificam no so alcool-cido resistentes catalase positivas imveis esculina e gelatina negativas

MORFOLOGIA
Variam muito na morfologia das diferentes espcies, e mesmo mesmas culturas em diferentes condies de cultivo. So bacilos Gram positivos, retos ou ligeiramente curvos, com extremidades em geral arredondadas, com a forma de clava, podendo apresentar arranjos caractersticos em paliada ou letras chinesas, podendo ou no apresentar grnulos metacromticos, que so melhores visualizados atravs da colorao de Albert-Laybourn, e que caracterizam as bactrias conhecidas como difterides. As corinebactrias de maior importncia clnica so catalase positivas, imveis podendo ser fermentadoras ou no. So muitas as corinebactrias que se pode isolar em material clnico, entretanto, de pouco interesse aprofundar na caracterizao destas espcies, exceto para fins de pesquisa ou epidemiolgicos.

Mod V - 47

CORINEBACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICA

Considera-se fundamental o laboratrio de microbiologia poder caracterizar ou afastar a possibilidade de isolamento das espcies de C. diphtheriae e C. ulcerans que podem pproduzir a toxina diftrica. Outra espcie de importncia em infeces hospitalares e frequentemente isolada em material clnico a C. jeikeium. Difteria Em virtude da vainao compulsria, a difteria na atualidade uma doena rara em pacientes imunizados, mas de importncia epidemiolgica quando detectada. A infeco caracteriza-se por processo infeccioso localizado no trato respiratrio e manifestaes txicas no corao e nervos perifricos.
Quadro clnico Coleta de material Processamento do material Semear em meios no especficos como gar sangue e gar chocolate para pesquisa do Streptococcus pyogenes e outros patgenos eventuais, e encaminhar outro swab em meio de transporte para o laboratrio de referncia. Os meios especficos para a pesquisa de bacilo diftrico so os meios de enriquecimento de Loeffler e o meio seletivo e diferencial gar sanguecistina-telurito. Bacterioscopia

Ocorre dor de garganta, dificuldade de deglutio, presena de pseudomembrana purulenta, dor no corpo, cefalia, nuseas e febre. A morte pode ocorrer por obstruo respiratria ou por miocardite. Pode ocorrer difteria cutnea com leses necrticas e, eventualmente, presena de pseudomembrana.

O material de orofaringe ou nasofaringe deve ser colhido das bordas, abaixo da pseudomembrana purulenta.

A bacterioscopia do esfregado do material, bem como do crescimento no meio de Loeffler, aps colorao de Gram pode ser sugestiva caso sejam visualizados bacilos difterides, melhor caracterizados pela colorao de AlbertLaybourn. A identificao bioqumica das Corynebactrias potencialmente produtoras de toxina difcil em laboratrio no especializado. Recomenda-se, nestes casos, encaminhar o material ou contactar o Laboratrio de Referncia para orientao.

PROVAS DIFERENCIAIS PARA OS CORINEFORMES

Bactria Catalase O/F
1

Motilidade

Uria

Esculina

CAMP Reverso + neg neg +

Hemlise

Arcanobacterium spp. C. diphteriae C. jeikeium C.ulcerans /Pseudotuberculosis Corinebacterium spp. Gardnerella vaginalis Oerskovia spp. Rhotia spp.
1 2

neg + + +

F F O F

neg neg neg neg

neg neg neg +

neg neg neg neg

beta neg neg neg

+ neg + varivel

F F F F

varivel neg varivel neg

varivel neg neg neg

neg neg + +

neg neg neg neg

neg beta neg neg

2

Base CTA (cystine tripticase gar) O = oxidativo e F = fermentador gar sangue de coelho

Mod V - 48

C. PSEUDOTUBERCULOSIS
Importncia clnica Deve ser lembrado nos casos de veterinrios ou trabalhadores de zona rural com quadro de linfadenite, linfangite ulcerativa ou abscesso relacionado a manuseio de aborto de gado. Esta espcie pode ser produtora de toxina diftrica. As colnias so pequenas, branco-amareladas, urease positiva, CAMP reverso positivo (inibe a beta-hemlise do S. aureus em gar sangue com hemcias de carneiro).

Isolamento e Identificao

C. JEIKEIUM
Caractersticas gerais Importncia clnica Colnia pequena cinza ou translcida, a bacterioscopia um pequeno coco-bacilo gram positivo, resistente a vrios antibiticos (beta-lactmicos, gentamicina, etc). Associada a septicemia, endocardite, infeces de pele e tecido subcutneo. Infeces mais severas podem ocorrer em imunossuprimidos, como meningite, pneumonia e peritonite ou associada a prteses e procedimentos invasivos. Cresce em BHI com 1% de Tween 80, sendo lipoflica e no em caldo BHI sem Tween 80. Apresenta metabolismo oxidativo na base CTA, enquanto a maioria das Corynebacterium spp. de importncia clnica so fermentadoras. Oxida a glicose, uria negativa, esculina negativa, PYR positiva.

Isolamento e Identificao

ROTHIA * DENTICARIOSA
Caractersticas gerais Importncia clnica Isolamento e Identificao So bacilos Gram positivo retos, sendo alguns ramificados.

Pertence microbiota da cavidade oral, e est raramente associada endocardite.

As colnias so brancas salientes e s vezes rugosas. So fermentadores da glicose e esculina positiva.

* Rhotia spp.: So pleomrficos podendo apresentar-se tanto na forma cocide como de bacilos. So catalase positiva, imvel e fermentador.

ARCANOBACTERIUM SPP.
Caractersticas gerais Importncia clnica So bacilos delicados e curvos e alguns apresentam dilatao terminal e ramificaes rudimentares. Arcanobacterium haemolyticum tem sido considerado juntamente com S. pyogenes como agentes patognicos em orofaringe, identificados e relatados com a finalidade de tratamento. Est associado com infeces de partes moles, faringite em jovens e raros casos de septicemia, endocardite e osteomielite. Crescem em 24-48h como colnias pequenas e hemolticas. Colnias mais velhas tendem a adquirir a forma de coco-bacilo, que pode ser confundido com estreptococos. Em caldo tendem a formar ramificaes e em anaerobiose filamentos. So bacilos Gram positivos irregulares, catalase negativa, imveis e fermentadores. Espcies A. haemolyticum, A. pyogenes e A. bernardiae so hemolticas, tm a hemlise melhor visualizada em sangue de coelho, e crescem melhores em CO2. Pode se apresentar como dois tipos de colnias no mesmo cultivo: lisas, mucides e brancas ou secas e cinza. Produz a prova de CAMP reverso (inibio da hemlise).

Isolamento e Identificao

GARDNERELLA SPP.

Mod V - 49

Caractersticas gerais

So pequenos bacilos ou coco-bacilos irregulares, que se coram irregularmente pela violeta. A principal espcie a Gardnerella vaginalis, que tem uma classificao taxonmica incerta, e portanto para fins didticos, estudada com os coryneformes. Faz parte da microbiota vaginal de cerca de 70% das mulheres em idade reprodutiva, mas est associada vaginose bacteriana, quando predomina na flora vaginal em substituio ao Lactobacillus de Doderlein. A vaginose bacteriana e a presena de Gardnerella esto associadas tambm ao parto prematuro, ruptura prematura de membranas e corioamnionite. Esta bactria comumente isolada em hemoculturas de pacientes com febre puerperal e ps-aborto. Pode causar sepse em recm-nascidos e raramente infeco urinria em adultos. Crescem no gar sangue humano e de coelho produzindo hemlise beta, mas sem hemlise no gar sangue de carneiro. So visualizadas e caracterizadas no exame citolgico e/ou no Gram pela presena das clue cells, que so clulas epiteliais abarrotadas de pequenos bacilos Gram lbeis, de modo a perder sua definio morfolgica. pleomrfica, Gram varivel (ora Gram negativa ora parcialmente e fracamente Gram positiva), imvel, sem cpsula. um anaerbio facultativo, fermentador lento, catalase e oxidase negativas.

Importncia clnica

Isolamento e Identificao

OERSKOVIA SPP.
Caractersticas gerais So microrganismos cocides ou na forma de bacilos resultantes da quebra de miclios, apresentam ramificao, hifas vegetativas, sem hifas areas e penetrao no gar. Oerskovia turbata e O. xanthineolytica so bactrias do meio ambiente ou solo, com pouca importncia clinica, com raros casos de bacteremia e infeces em implantes de prteses. Isolamento e Identificao Cresce bem em gar sangue de carneiro e no gar chocolate. Cresce mal no meio de Sabouraud dextrose. O crescimento, quando ocorre, visvel aps 24-48h em anaerobiose ou 5% CO2. Apresentam colnias amareladas, catalase positiva em aerobiose, oxidase negativa. Fermentador da glicose, sacarose e lactose, hidrolisa gelatina, amido e esculina; motilidade varivel.

BACILOS GRAM POSITIVO

LISTERIA
Caractersticas gerais So bacilos uniformes, no ramificados, apresentando-se s ou em pequenas cadeias. A nica espcie importante para o homem entre as sete espcies conhecidas a L. monocytogenes. Mvel a temperatura ambiente (25 a 28oC) e imvel a 37oC. Encontrada na natureza no solo, em matria orgnica em decomposio, gua, leite e derivados, carne, etc. Sendo encontrada como microbiota de diversos mamferos, aves, peixes, e insetos. Tem importncia clnica particularmente para idosos e imunocomprometidos causando meningite, encefalite ou septicemia. Na grvida a infeco pode causar amnionite, infeco do feto com aborto, parto prematuro, meningite neonatal e sepse neonatal. Pode ocorrer em surtos, em geral relacionados a contaminao de alimentos. Crescem em gar sangue, gar Chocolate, CLED, gar nutriente, TSA e gar Mueller Hinton, mas no em Mac Conkey. As colnias so pequenas, crescendo melhor entre 30 a 37oC, e crescem tambm temperatura ambiente e a 4oC em trs a quatro dias. A partir de hemoculturas, LCR, placenta, alimentos, gua, etc., semear em gar sangue de carneiro, coelho ou cavalo, com base TSA, embora cresa tambm com outras bases (Mueller Hinton, Columbia, Brucella, BHIA, etc). Existem meios seletivos indicados em investigaes epidemiolgicas. Bacilo Gram positivo anaerbio facultativo, catalase positiva, oxidase negativa, que produz cido de glicose. Hemlise beta em gar sangue de carneiro, CAMP positivo, motilidade positiva temperatura ambiente, hidrlise da esculina positiva e NaCl 6,5% positiva. Alm disso, verificada prova da esculina rapidamente positiva, assim como uria, gelatina, indol e H2S negativas.

Importncia clnica

Isolamento e Identificao

Mod V - 50

ERYSIPELOTRIX RHUSIOPATHIAE
Caractersticas gerais Bacilo Gram positivo curto, de extremidades arredondadas, anaerbio facultativo, no esporulado, no alcool-cido resistente, ocorre s em cadeias curtas ou longas, sem ramificar. Existe na natureza, em matria orgnica, urina, fezes e carcaa de animais. Vive em animais, peixes e pssaros e causa erisipela em porcos. No homem causa uma zoonose (doena ocupacional de veterinrios e manuseadores de carne e animais) caracterizada por celulite que aparece no local da inoculao aps 2 a 7 dias. A leso costuma ser violcea e com muita dor, acompanhada de edema endurado, sem supurao e bem delineado nas bordas. Ocorre linfangite regional e artrite adjacente. Disseminao da doena e endocardite podem ocorrer, particularmente em imunossuprimidos, cujo prognstico grave. Cicatrizao pode ocorrer em 2 a 4 semanas ou mses, com possibilidade de recada. Material ideal para isolamento a bipsia colhida de maneira assptica. Swab da leso em geral negativa, pois o agente encontra-se na profundidade da borda endurecida. Cresce em gar sangue, gar chocolate, caldo tripticase soja, a 35oC aerobiose ou 5% de CO2. Cresce entre 5 a 42oC e em caldo NaCL 6,5%. No gar sangue cresce em 24 a 72h, como colnias minsculas, lisas e transparentes, mas o outro tipo de colnia, maior, rugosa e chata pode aparecer, bem como uma hemlise esverdeada em baixo da colnia no gar sangue. As colnias lisas so bacilos ou coco-bacilos Gram positivos, s vezes corando-se mal pelo Gram Catalase negativa, imvel, esculina negativa, fermenta lentamente a glicose sem produzir gs, uria e indol negativos, mas caracteriza-se por crescer no TSI produzindo H2S; lactose positiva e sacarose negativa.

Importncia clnica

Coleta do material Isolamento e Identificao

KURTHIA
Caractersticas gerais So bacilos Gram positivos grandes em cadeias ou em paralelo, ou filamentos no ramificados e em culturas velhas tendem a ficar cocides ou bacilos curtos. Vivem no meio ambiente, na gua, solo, animais, sua carne e seus derivados. Seu papel clnico questionado, pois no h relatos recentes de isolamento em casos significativos. Crescem em gar sangue como colnias de cor creme no hemolticas, podendo ser confundidas com Bacillus spp. So aerbios estritos, no esporulados, no lcool-cido resistentes; so mveis, catalase positiva e no fermentadores.

Importncia clnica Isolamento e Identificao

Principais diferenas entre bacilos e coco-bacilos Gram positivos

Bactria Listeria monocytogenes Enterococcus spp. Streptococcus beta hemolticos Lactobacillus spp. Kurthia spp.
2

Gram bacilo curto ou coco-bacilo regular e largo cocos ou coco-bacilos em cadeias cocos em cadeias coco-bacilos e cadeias longas bacilo grande, cadeias, cocide em cultura velha bacilos e coco-bacilos pleomrficos coco-bacilo ou filamentos longos

Catalase + neg neg neg + + neg

2

Motil. 25oC + neg neg neg + neg neg

Hemlise beta Alfa, beta gama beta no no varivel alfa

3

CAMP test + neg neg

1

NaCl 6,5% Esculina +/+ +/+ neg / neg neg / neg neg / neg varivel / neg neg / neg

neg neg neg neg

Corynebacterium spp. Erysipelotrix rhusiopathiae

1 3

- S S. agalactiae (beta do grupo B) positiva

- No usa glicose

- H2S positivo

Mod V - 51

Bacilos Gram positivos anaerbios que devem ser diferenciados: Lactobacillus spp. - flora da boca, intestino e flora vaginal (Bacilo de Doderlein). So anerbios estritos mas crescem em gar sangue e gar chocolate como colnias muito pequenas. So imveis e catalase negativa. Sem valor patognico. Mobilluncus - bacilos Gram positivos anaerbios estritos, curvos, mveis que vivem na trato genital humano e reto. Encontra-se aumentado nos casos de vaginose, juntamente com a Gardnerella. Propionibacterium spp., Eubacterium spp. e Bifidobacterium spp. anaerbios estritos que so analisados juntamente com os demais anaerbios. BACILOS ESPORULADOS AERBIOS E ANAERBIOS FACULTATIVOS Gnero Bacillus compreende cerca de 50 espcies de bacilos anaerbios facultativos que podem exibir a forma esporulada, corando-se mal pela violeta, quando em colnia mais velhas. As formas vegetativas so retas largas, podendo ser grandes, isolados ou em cadeias. A forma e localizao dos endosporos so teis para sua classificao: podem ser cilndricos, ovais, redondos, e eventualmente com forma de feijo posio central, sub-terminal, terminal dilatando ou no a clula me Todos so mveis, exceto o B. anthracis e B. mycoides e a maioria catalase positiva. Na presena de on bicarbonato (HCO3 -) e em anaerobiose ou CO2 os B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis e B. megaterium apresentam cpsula polipeptdica. Habitat e importncia clnica - Os Bacillus spp. encontram-se basicamente no solo, gua, matria orgnica animal e vegetal nas condies mais variadas de temperatura, umidade, pH, etc. As duas espcies mais importantes e que devem ser reconhecidas pelo laboratrio de microbiologia so o B. antrhacis e B. cereus. Principais espcies de Bacillus relacionadas infeco
Espcie de Bacillus Antrhacis Quadro clnico Frequncia de relatos

Antrhax cutneo Anthrax intestinal Anthrax pulmonar Necrose ou gangrena em partes moles Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar Infeces pulmonares, endocardite, meningite, osteomielite e endoftalmite Infeces de partes moles, abscessos, bacteremia e sepse Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar

Bastante frequente Raro Raro Bastante frequente Frequente Muito frequente Frequente

Cereus

Circulans

Frequente

Licheniformis

Pouco frequente Frequente

Subtilis

Intoxicao alimentar Bacteremia, sepse, endocardite e infeces respiratrias

Muito frequente Raro

Bacillus cereus Pode apresentar dois tipos de intoxicao: Mod V - 52

Caracterizado por diarria, dor abdominal, que aparecem 8 a 16 h aps a ingesto do alimento contaminado (carnes, vegetais, leite, molhos, massas, doces, bolos). Caracterizado por nuseas e vmitos que aparecem 1 a 5 horas aps a ingesto do alimento contaminado, principalmente arroz, mas pode ser os mesmos alimentos acima. Bacillus anthracis

Caractersticas gerais

No passado era causa importante de mortalidade no gado, sendo os herbvoros altamente suscetveis, sendo reduzida pela vacinao e melhores condies de higiene. O homem pode adquirir a doena em contato com animais doentes (trabalhadores rea rural e veterinrios), no manuseio industrial de ossos, l, crina, e outros produtos animais e de forma eventual, sendo a forma cutnea quase a totalidade dos casos, com raros episdios intestinais pela ingesto de carne contaminada. Potencial risco elevado na comunidade quando usado como arma biolgica. A forma cutnea no tratada pode ser fatal (menos de 20% dos casos), principalmente quando a leso prxima a cabea ou pescoo. As formas pulmonares e intestinais so mais graves pela dificuldade de diagnstico. No local de inoculao da forma cutnea aparece aps 2 a 3 dias uma pequena mancha ou ppula, seguida no dia seguinte de um anel de vesculas em torno da ppula, que ulcera, seca, escurece formando uma escara caracterstica que cresce, fica mais espessa e aderente aos planos profundos. O edema pode ser importante, mas tem a caracterstica de ser indolor e sem pus. A forma intestinal semelhante forma cutnea atingindo a mucosa com leses e eventualmente gastroenterite. No antraz pulmonar o esporo inalado transportado pelos macrfagos do pulmo para o sistema linftico onde os esporos germinam e causam septicemia que fatal. Ateno ao fato de que evoluo nos casos fatais inicialmente caracterizada por sintomas leves como fadiga, mal-estar e febre baixa, ou s vezes at sem sintomas, quando repentinamente se instala dispnia, cianose, febre elevada, desorientao, falncia circulatria, choque, coma e morte em poucas horas. Em geral a bacteremia importante.

Quadro clnico

Coleta de material

Swab do exudato de leses podem ser teis; na escara, remover a crosta e colher material com swab ou com tubo capilar, usando luvas. Na forma intestinal, fezes podem ser colhidas. Ps-mortem, sangue venoso ou de sangramento de mucosas (sangue no coagula) pode evidenciar o bacilo na bacterioscopia. No antraz pulmonar a hemocultura til nos casos graves, mas o material pulmonar oferece menor chance de isolamento. Em casos clnicos os Bacillus esto na forma vegetativa, mas em alimentos, produtos secos de animais (ossos, crina, pelo) o Bacillus dever estar em forma esporulada e haver necessidade de ativ-los a 62,5oC por 15 minutos (choque trmico). Os Bacillus crescem com facilidade em meios pobres ou ricos. Dependendo do material (ex: fezes) poder haver necessidade de usar meio seletivo com adio de polimixina (100.000U/L). Colnias grandes de cor creme crescem no gar sangue.

Isolamento e Identificao

Diferenas entre Bacillus spp. e Clostridium spp. Bacillus spp. Clostridium spp.

Endosporos em aerobiose Catalase positivos

Endosporos em anaerobiose Catalase negativos

Diferenas entre B. cereus, B. anthracis e espcies relacionadas

Espcies B. cereus B. anthracis B. thurigiensis B. cereus subsp. mycoides Colnia no AS * esverdeado claro branco acinzentado esverdeado claro rizides / espalhando Motilidade + neg + neg Hemlise + neg + fraco + Penicilina resistente sem resistente resistente Citrato + varivel varivel + Lecitinase + fraco + + +

* gar sangue de carneiro

Mod V - 53

O B. antrhacis virulento pode ser testado para produo de cpsula semeando-se em gar nutriente com 0,7% de bicarbonato de sdio em jarra com vela. O crescimento ser mucide e a cpsula poder ser evidenciada com a tinta da china. ACTINOMICETOS Grupo de bactrias Gram positivo que apresentam como caractersticas em comum a produo de filamentos ou hifas vegetativas, sendo que alguns tambm apresentam hifas areas, semelhanas de composio de parede e padro de cidos graxos celulares. Neste grupo sero abordados os seguintes gneros: Nocardia spp. Rhodococcus spp. Streptomyces spp. O gnero Oerskovia, embora apresente hifas vegetativas, analisado juntamente com os corineformes. Outros actinomicetos raros ou de menor importncia clnica no considerados so: Gordona spp., Tsukamurella spp., Actinomadura spp., Nocardiopsis spp. Informaes importantes sobre Actinomicetos Para a adequada caracterizao dos Actinomicetos, que apresentam alguma semelhana morfolgica com os fungos, importante considerar: A origem do material, valorizando os abscessos. A quantidade de microrganismos isolados e correlao com a bacterioscopia do material. Possibilidade de contaminao com bactrias da mucosa oral. Pigmento da colnia. Anlise morfolgica da bactria pelo microcultivo em lmina idntico ao utilizado na seco de Micologia, empregando gar fub sem dextrose a 25oC. Identificao presuntiva de actinomicetos
Gnero Nocardia Rhodococcus Oerskovia Rhotia Miclio areo + neg neg neg neg neg neg Condio Metabolismo glicose oxidativo oxidativo fermentativo fermentativo

NOCARDIA SPP.
Caractersticas gerais So bacilos Gram positivo ramificados e filamentosos, aerbios estritos, catalase positivo, imveis, que se fragmenta em bacilos e cocos irregulares. Produz hifas areas medida que o cultivo envelhece. Existem 12 espcies sendo as mais importantes N. asteroides e N. brasiliensis. Importncia clnica Est associada ao solo e vegetais. As formas clnicas podem ser bem distintas: pulmonar (abscessos), extra-pulmonar localizada, sistmica, sistema nervoso central (abscessos), partes moles e micetoma. considerada uma bactria oportunista, pois a maioria dos casos no cutneos e micetomas ocorrem em pacientes imunocomprometidos. Quando colhido o material por puno, bipsia ou mesmo swab da leso profunda, deve ser processado rapidamente; existe uma caracterstica do material descrita como grnulos de enxofre, especialmente nos micetomas.

Coleta de material

Mod V - 54

Isolamento e Identificao

No bactria exigente, crescendo em gar sangue, gar chocolate, gar Sabouraud dextrose, gar seletivo para Legionella e Lowenstein Jensen. Cresce entre 72h a 14 dias. Com exceo da N. asteroides, a maioria das nocardias apresentam beta-hemlise em gar sangue de carneiro. Crescem em meio de parafina (como fonte nica de carbono), juntamente com Rhodococcus e algumas micobactrias. Em microcultivo possvel visualizar as hifas ramificando-se em angulo reto, podendo apresentar ramificaes secundrias, bem como hifas areas. Em cultura mais velhas em gar tornam-se visveis as hifas areas nas colnias rugosas. As micobactrias de crescimento rpido podem apresentar ramificaes bem curtas em ngulo agudo e sem ramificaes secundrias. Uma caracterstica importante a cor das colnias em Sabourad dextrose gar ou mesmo em outros meios: salmo ou laranja claro N. asteroides laranja escuro N. brasiliensis

A Nocardia brasiliensis uria positivo, citrato positivo e gelatina positiva. A Nocardia asteroides uria positivo, citrato varivel e gelatina negativa.

Bacterioscopia e Histologia

A bacterioscopia pode revelar bacilos irregulares com ramificaes e parcialmente ou fracamente lcool-cido resistentes pelo Ziehl ou colorao de Kinyoun. Cortes histolgicos corados pela hematoxilina-eosina caracterizam os grnulos, mas no os filamentos da bactria. O Gram ou a colorao de metenamina prata de Gomori so teis.

RHODOCOCCUS SPP.
Caractersticas gerais O R. equi uma bactria oportunista, causando pneumonia em imunocomprometidos, apresentando uma evoluo lenta e granulomatosa, com infiltrados que evoluem para cavitao. Pode causar tambm abscessos no sistema nervoso central, tecido subcutneo, linfadenite, etc. Diagnstico clnico diferencial deve ser feito com micobactrias, fungos, nocardia e actinomyces. Hemoculturas com elevada frequncia podem ser positivas. Coleta de Material Lavado bronco-alveolar (LBA), bipsias, hemocultura e mesmo escarro. Em material clnico o Rhodococcus pode ser visualizado no interior de macrfagos e extra-celular, na forma de cocos ou coco-bacilos. Em hemoculturas, LBA e escarro eventualmente pode ser observado na forma filamentosa. Em microcultivo o R. equi cresce de forma tpica como coco-bacilo ou bacilo em zig-zag. Em Heart Infusion gar (HIA) cresce em 6 horas a 35oC como bacilo Gram positivo e em 24 horas apresenta-se cocide. A forma de ramificaes rudimentares a partir dos filamentos pode ocorrer em culturas jovens em meio lquido. Em HIA cresce entre 28 e 35oC, entre 2 a 4 dias, mas no a 45oC. Pode crescer na forma de colnias rugosas (com hifas areas) ou lisas ou mucides. Pode apresentar a cor coral ou rosa plido que so mais freqentes, mas pode ser amarela ou incolor. A colorao pelo Ziehl ou Kinyoun pode revelar a fraca alcool-cido resistncia.

Isolamento e Identificao

STREPTOMYCES SPP.
Caractersticas gerais Alguns milhares de espcies de Streptomyces j foram caracterizados, sendo na quase totalidade saprfitas. O Streptomyces somaliensis responsvel pelo micetoma de cabea e pescoo. Outras espcies foram identificadas em casos de pericardite crnica e infeces de partes moles ps-traumticas (S. griseus). O abscesso pode revelar a presena de grnulos duros. O Gram vai revelar uma massa de bacilos Gram positivo finos. No fastidioso, cresce em Sabouraud dextrose melhor incubado a temperatura ambiente entre 4 a 10 dias. Pode-se visualizar no microcultivo hifas finas e longas com ramificaes, hifas areas e condios (via assexuada de propagao com forma arredondada). No alcool-cido resistente, e apenas os condios podem apresentar esta propriedade; metaboliza a glicose por oxidao e cresce a 50oC. As colnias so mais secas com, diferentes pigmentos (creme, marron, preto, etc) e presena ou no de hifas areas. Uma caracterstica importante das colnias o cheiro de terra molhada.

Isolamento e Identificao

Mod V - 55

7. FASTIDIOSOS
INTRODUO

CARACTERSTICAS GERAIS DOS FASTIDIOSOS

Este grupo heterogneo de bactrias apresenta como caracterstica comum exigncias especiais de condies de cultivo, em relao as enterobactrias e a maioria dos no fermentadores. Estas condies variam para cada microrganismo, podendo ser a necessidade de CO2, crescimento lento com a necessidade de at 30 dias de incubao (Brucella), adio de fatores especiais de crescimento, etc. Pontos-chave para classificao So bactrias Gram negativas ou Gram lbeis (coram-se de forma tnue pela safranina). Muitos, mas no todos so coco-bacilos e oxidase positivos; no crescem em Mac Conkey. Para teste de fermentao de carboidratos exigem uma base mais rica como o CTA (vide captulo meios de cultura). O inculo deve ser bem denso e muitas vezes necessrio a adio de 2 ou 3 gotas de soro de coelho ou cavalo para permitir o crescimento nos meios utilizados para provas bioqumicos. Exceto as Capnocytophaga spp. que crescem formando colnias grandes e com aparncia de vu em torno da colnia, os demais fastidiosos crescem lentamente e exigem 48 a 72 horas para as colnias ficarem bem visveis, embora diminutas. Alguns destes potenciais patgenos esto associados a sndromes clnicas bem definidas, embora no frequentes como a brucelose, tularemia, etc. importante nestes casos obter informaes adicionais com o mdico assistente ou o paciente/familiares para facilitar o processo de identificao microbiolgica. Sempre valorizar isolados de hemocultura, principalmente se ocorrer em mais de uma amostra, ou materiais de bom valor preditivo de infeco como o LCR, lquido pleural, pericrdico, sinovial, BAL, etc. Cabe destacar que alguns fastidiosos podem positivar sistemas automatizados de hemoculturas e a bacterioscopia pode ser aparentemente negativa tanto pelo pequeno tamanho da bactria como pela m colorao pela safranina. A topografia da fonte de isolamento uma pista importante, pois diferentes espcies de Neisseria, Haemophilus, Bordetella, Capnocytophaga, Actinobacillus, Eikenella, Kingella, Cardiobacterium podem ser encontrados em pele e mucosas, a Gardnerella e Cardiobacterium no trato genital, etc. Como a alguns exigem tratamento com drogas no habituais, extremamente importante chegar a definio de gnero ou encaminhar a Laboratrio de Referncia. Outro motivo relevante para a correta identificao a importncia epidemiolgica que o agente possa ter em surtos ou mesmo em casos isolados, como o caso da brucelose, legionelose e Bordetella pertussis. A Pasteurella spp. embora includa neste grupo, cresce com facilidade em gar Sangue, gar Chocolate, comportando-se no TSI como fermentador, mas no cresce em Mac Conkey . oxidase positiva. Alguns dos fastidiosos esto relacionados a contato com saliva, sangue, fezes, atravs de acidente perfuro-cortante ou mordida de animais domsticos ou silvestres (Pasteurella, Bartonella, Francisella e Brucella). Destaca-se ainda a necessidade de precaues especiais no manuseio de alguns destes agentes pelo potencial patognico (Brucella e Francisella). Com base na importncia clnica e epidemiolgica, este grupo de bactrias ser dividido em dois grupos: Grupo A: maior interesse clnico e epidemiolgico Grupo B: casos clnicos espordicos / microbiota oral humana

Mod V - 56

GRUPO A - MAIOR INTERESSE CLNICO E EPIDEMIOLGICO

Bactria Bordetella pertussis /parapertussis Bartonella spp. Hospedeiro principal Homem Via de transmisso Secrees de vias areas

Gatos, humanos infectados, outros desconhecidos Mamferos domsticos

Mordida ou arranho de gato; picada de piolho infectado Leite e derivados, carne, sangue, secrees de animais doentes Picada de carrapato ou mosquito infectado em zona endmica Secrees de vias areas Inalao de gua contaminada Mordida e secrees de animais domsticos e silvestres

Brucella spp.

Francisella spp.

Animais silvestres

Haemophilus spp. Legionella spp. Pasteurella spp.

Homem Meio ambiente/gua Animais domsticos/silvestres

GRUPO B - CASOS CLNICOS ESPORDICOS

Bactria Actinobacillus actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis Capnocytophaga spp. Chromobacterium violaceum Eikenella corrodens Kingella spp. Streptobacillus spp. Fonte Cavidade Oral humana Cavidade oral humana Cavidade oral humana gua e solo Cavidade oral humana Cavidade oral humana Boca de roedores

As caractersticas deste grupo heterogeneo so: Dificuldade ou ausncia de crescimento em meios ricos como gar Sangue e gar Chocolate. Exigncia de incubao em diferentes tenses de CO2. Dificuldade em caracteriz-los, pois exigem meios enriquecidos. Crescimento lento e pouca importncia clnica, talvez pela dificuldade do seu isolamento e caracterizao. Os gneros Actinobacillus, Capnocytophaga e Eikenella tem em comum o fato de pertencerem microbiota da cavidade oral humana e estarem relacionados doenas gengivais e, a partir deste foco, doenas sistmicas. Kingella e Cardiobacterium esto associadas ao trato respiratrio humano. Diferem deste grupo a Chromobacterium que encontrada na natureza em gua e solo e Streptobacillus na orofaringe e nasofaringe de camundongos selvagens e de laboratrio.

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PRINCIPAIS FASTIDIOSOS E DIAGNSTICO

Bactria Bordetella pertussis Bartonella spp. Material clnico Swab nasofaringe Sangue, gnglios, bipsias Meio especfico Meio de Bordet & Gengou gar chocolate, gar sangue carneiro Rotina de hemocultura ou meio de Castaeda gar chocolate enriquecido gar chocolate de cavalo Meio especfico BCYE * Incubao 7 dias 5 a 15 dias

Brucella spp.

Sangue, aspirado de medula Gnglios, bipsias Sangue, LCR, etc. Secrees ou aspirados de trato respiratrio inferior Sangue, LCR, leses

At 30 dias

Francisella spp. Haemophilus spp. Legionella spp.

7 dias 48-72 h at 7 dias 7 a 14 dias

Pasteurella spp.

gar sangue, gar chocolate

24 a 72 h

* gar extrato de levedura, carvo, com pirofosfato frrico e alfa-cetoglutarato.

PRINCIPAIS PROVAS DIFERENCIAIS ENTRE OS FASTIDIOSOS

Bactrias Actinobacillus actinomycetemcomitans Bartonella spp. Bordetella pertussis Brucella spp. Capnocytophaga spp. Cardiobacterium hominis Chromobacterium spp. Eikenella corrodens Francisella tularensis Haemophylus influenzae Kingella spp. Legionella spp. Pasteurella spp. Streptobacillus spp. Oxidase neg /+ fraco Catalase + Motilidade neg gar Sangue + gar Chocolate +

neg + + neg + V + neg + fraco + + fraco + neg

neg varivel + neg neg + neg + fraco + neg + fraco + neg

varivel neg neg neg neg + neg neg neg neg + fraco neg neg

+ neg + + + + + neg neg + neg +

+ neg + + + + + + + + neg +

BARTONELLA A classificao taxonmica dos membros do gnero Bartonella ainda no definitiva e agrupa as espcies B. bacilliformis, B. quintana, B. henselea, B. elizabethae e Afipia felis.

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B. bacilliformis - o agente etiolgico da verruga peruana (febre de Oroya), doena restrita aos Andes, caracterizada por profunda anemia, trombocitopenia, adenopatia, mialgia, delrio, coma e alta mortalidade. B quintana - causa de doena febril que atacou soldados na I Guerra Mundial, conhecida como febre das trincheiras e relacionado a picada de piolhos e baixa higiene. Caracterizada por febre e bacteremia com durao varivel e ainda no bem conhecida. Casos associados infeco por HIV foram relatados. B. henselea - pode apresentar quadro de bacteremia principalmente em imunossuprimidos bem como relacionada doena da arranhadura do gato. O quadro de bacteremia caracteriza-se de forma insidiosa por fadiga, dores no corpo, perda de peso e com febre progressiva. A doena da arranhadura do gato manifesta-se inicialmente com uma ppula ou pstula cerca de uma semana no local de contato com animal (gato ou co novo que arranha ou morde). Aps 1 a 7 semanas aparece adenopatia regional e 1/3 dos pacientes apresentam febre e em 1/6 ocorre supurao do gnglio, sendo que a maioria evolui sem outros sintomas. A cura espontnea ocorre entre 2 a 4 meses. B. quintanae e B. henselae podem causar quadro de angiomatose bacilar caracterizado por proliferao neovascular envolvendo pele, gnglios e fgado. B. elizabethae ainda pouco conhecida. Afipia felis - foi considerada h alguns anos como o agente etiolgico da doena da arranhadura do gato, que hoje atribuida B. henselae. Seu papel patognico no est bem esclarecido. Isolamento
As bartonellas podem ser isoladas de hemoculturas, leses cutneas bipsias e gnglios. O SPS (polianetol sulfonato) que o anticoagulante usado nas hemoculturas inibidor das bartonellas, por sso deve-se usar outro anticoagulante. Quando h suspeita clinica, deve-se incubar por pelo menos sete dias, at 40 dias. Vrios meios enriquecidos podem permitir o crescimento das bartonellas. O caldo infuso corao de preparo recente, com 5-10% de sangue desfibrinado de coelho ou cavalo so adequados, como tambm o gar chocolate. No Bactec pode crescer, mas no aciona o alarme de CO2. Exigem umidade a 35-37oC por 3 a 4 semanas. B. bacilliformis e Afipia fellis crescem melhor entre 25 a 30oC.

Identificao

Colnias podem crescer rugosas ou lisas, de um mesmo material. So bacilos Gram negativos pequenos, s vezes curvos. As espcies quintana e henselae, que so mais isoladas, so caracterizados pelas seguintes provas: catalase e oxidase negativas, motilidade em lmina presente e que no devida a flagelos (no tem), mas a fmbrias, percebendo-se a agitao da clula. O perodo de incubao longo (> que sete dias) e a B. henselae bem aderente ao meio.

Provas para diferenciao de espcies de Bartonella e de A. felis

Espcies B. baciliformis B. quitanae B. henselae B. elizabetae A. felis * Motilidade por fmbrias neg Catalase + neg neg neg + Oxidase neg Uria neg neg neg neg + Flagelo + neg neg neg + Motilidade + +* +* neg +

BORDETELLA

Caractersticas gerais

O gnero Bordetella compreende as espcies B. pertussis, responsvel pela coqueluche ou tosse comprida, e B. parapertussis, com quadro clnico semelhante a coqueluche, mas em geral menos severo. Ambas so patgenos exclusivos dos humanos. A B. bronchiseptica e B. avium so bactrias comensais de mamferos e aves, causando infeces em ces (tosse dos

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canis) e a B. avium rinotraquete em perus. So patgenos oportunistas para humanos que entram em contato com estes animais. Foram classificadas mais recentemente para o gnero bordetella as espcies holmesii e hinzii. Importncia clnica A Bordetella pertussis causa a coqueluche em crianas no vacinadas, com clnica bastante caracterstica: Perodo prodrmico, que inicia 5 a 10 dias aps a aquisio do agente, com sintomas semelhantes a um resfriado ou gripe. Fase altamente contagiosa e com sintomas inespecficos. Segue-se o perodo paroxstico com quadro de tosse convulsiva, persistente e caracterstica seguida de inspirao ruidosa. Podem ser acompanhadas de cianose e vmito e vrias complicaes como convulses, insuficincia respiratria, encefalopatia, infeces secundrias, etc. A convalescena ocorre cerca de quatro semanas aps inicio dos primeiros sintomas. So adequados o swab ou aspirado de nasofaringe e semeadura imediata em meios especficos e em gar sangue para afastar B. pertussis. Na atualidade no se justifica dispor de meio de Bordet & Gengou ou outro, mas em caso de suspeita solicitar auxlio de Laboratrio de Referncia. Para frmula de meios de cultura vide manuais de fabricantes de meios de cultura. A prova de imunofluorescncia deve ser utilizada em material de nasofaringe juntamente com a cultura que mais especfica. So, cocobacilos Gram negativos pequenos e aerbios estritos. A safranina deve ser corada pelo Gram durante 2 minutos para melhorar a colorao. Para B. pertussis e parapertussis os Laboratrios de Referncia devem dispor de identificao sorolgica para acelerar a identificao.

Material clnico e Semeadura

Isolamento e Identificao

Provas diferenciais para espcies de Bordetella

Espcies Oxidase Motilidade Uria gar Sangue B & G ou Salmonella e Chocolate Regan-Lowe -Shigella neg + 3-6 dias neg + + 2-3 dias neg + + 1-2 dias + + + 1-2 dias + + + 1-2 dias + + + 1-2 dias + batata + glicerol + sangue de carneiro) ou Regan

B. pertussis 1 + neg neg B. para pertussis neg neg + em 24h B. bronchiseptica + + + em 4h B. avium + +2 neg B. holmesii neg neg neg B. hinzii + + varivel 1 - necessita de meio especfico: Bordet & Gengou (infuso de Lowe. 2 - mais evidente a 25oC

BRUCELLA A brucelose uma doena de sintomas vagos, que cursa de forma insidiosa com febre baixa, calafrios, sudorese noturna, cefalia, mialgia e artralgia. Pode ser acompanhada na forma crnica de alteraes hematolgicas importantes como leucopenia, pancitopenia, trombocitopenia, anemia hemoltica, etc.
Importncia clnica Est associado ingesto de leite e derivados e carne de mamferos, veterinrios, aougueiros ou trabalhadores rurais que manipulam carne e sangue destes animais e acidentes em laboratrios. A hemocultura exige tempo superior de 5-7 dias de incubao. importante a informao mdica de suspeita clnica para orientar o laboratrio na pesquisa e caracterizao do agente. Sangue, aspirado de medula, aspirado e bipsia de gnglios, fgado, bao, LCR, etc. A partir do segundo dia de febre as hemoculturas podem ser positivas, ocorrendo tambm hemoculturas positivas em pacientes afebris. Outro recurso utilizado para facilitar o isolamento o mtodo de lise-centrifugao: Colher 5 a 10mL de sangue em tubo de 50mL com 1,5mL de citrato de sdio a 4% Adicionar cerca de 40mL de gua destilada estril Centrifugar 2.000g por 30 minutos Transferir 0,5mL do sedimento para uma placa de gar sangue e semear. Pode-se fazer o mesmo com LCR e aspirado de medula. - Incubar 35oC em estufa entre 5 a 10% de CO2 (com gerador de CO2 ou estufa apropriada). Isolamento e Identificao As brucellas crescem bem em gar sangue, gar chocolate, Tripticase Soy gar e Brucella gar. O crescimento visvel com 48 a 72 horas. Colnias so pequenas, brancas a creme, e ao Gram visualizam-se coco-bacilos bem finos e pequenos. So aerbios OF oxidativos, crescem nos frascos de hemocultura, meio de Thayer Martin, gar sangue, gar chocolate,

Material clnico e Semeadura

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mas no no Mc Conkey. Espcies mais importantes so: - melitensis, abortus, suis e canis. - Uria positivos: B. suis (1 a 30 minutos), B. canis (1 a 30 minutos) e B. abortus (1 a 2 h) no meio uria de Christensen. - H2S com tira de acetato positivo: B.abortus e de B.suis (biotipo 1). - CO2 para crescimento: biotipos de B. abortus e B. ovis.

Provas diferenciais entre coco-bacilos Gram negativos

Bactria Brucella spp. Bordetella bronchiseptica Acinetobacter spp. Moraxella phenylpyruvica Pasteurella spp. * Haemophilus influenzae Oxidase + + neg + + + Motilidade neg + neg neg neg neg Uria + + varivel + varivel varivel gar Sangue + + + + + neg Mac Conkey neg neg + + neg neg

* cresce no TSI como fermentador acidificando pice e base sem gs.

Considerando que a Brucella de dificil caracterizao em laboratrio no especializado, encaminhar a laboratrio de referncia para confirmao. Suspeitar quando houver quadro clnico sugestivo, obtendo-se isolado de sangue ou medula, crescimento de coco-bacilos finos pouco corados, oxidase e catalase positivas, que crescem lentamente em gar sangue ou chocolate. Soroaglutinao til como elemento da caracterizao. FRANCISELLA TULARENSIS um coco-bacilo pequeno, Gram negativo, imvel e pleomrfico, aerbio estrito e capsulado. Apresenta grande resistncia no meio ambiente, sobrevivendo semanas em meios midos, carcaas de animais, gua, lama, etc. Constitui o agente da tularemia, uma doena de animais selvagens e com vrios vetores hematfagos. transmitida principalmente por carrapatos, mas tambm por mosquitos. Nos Estados Unidos prevalece o biovar A, mais grave, enquanto que no hemisfrio sul prevalece o biovar B que apresenta a forma clnica mais leve, sendo pouco diagnosticada principalmente por desconhecimento do agente.
Fontes de transmisso Centenas de animais silvestres, incluindo alguns domsticos (incluindo ces, gatos e pssaros), podem ser portadores deste agente. Cerca de uma dezena de diferentes insetos servem de vetores. A transmisso pode ocorrer tambm em contato direto com animais pela mordida, sangue, carne contaminada e eventualmente gua e inalao de aerossis. extremamente infectante, devendo ser manipulado em cabine de segurana nivel 2 para material clnico e nvel 3 para culturas positivas. Bastam 10 microrganismos injetados por via subcutnea ou 25 inaladas para causar a doena. Logo aps a penetrao do agente, em geral pela pele, aparecem sintomas semelhantes da gripe: febre, tremores, cefalia e dor generalizada. Aps perodo de incubao de 2 a 10 dias forma-se uma lcera no local de penetrao, que pode durar meses. Os gnglios regionais aumentam e ocorre necrose. Se ocorrer invaso sangunea, o quadro de endotoxemia tpico se manifesta. Estes casos so pouco frequentes e ocorrem quando h grande inoculao ou paciente imunocomprometido. A mortalidade alcana 60%, ocorrendo toxemia, cefalia intensa, febre elevada e contnua, com delrios, prostrao e choque. A forma lcero-ganglionar ocorre em cerca de 80% dos casos relatados. A lcera endurada, eritematosa, que no cicatriza. Outras formas relatadas so oculo-ganglionar, em orofaringe, ganglionar sem lcera, pleuropulmonar e gastrointestinal.

Quadro clnico

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Material clnico e Semeadura

Os materiais que oferecem maior chance de positividade so a partir de raspados de lceras, biopsias e escarro. A Francisella cresce em gar chocolate suplementado com Isovitalex . Laboratrio de Referncia deve ser consultado sobre recursos disponveis ou encaminhamento de cepas suspeitas. A bacterioscopia de material clnico de leses ou bipsias raramente ajuda, pois o microrganismo muito pequeno e cora mal pelo mtodo de Gram. Este agente deve ser lembrado sempre que houver doena associada a picada de carrapato e formao de lcera com comprometimento ganglionar. Entretanto, o diagnstico microbiolgico difcil, sendo na maioria das vezes feito com base em testes de aglutinao em amostras pareadas colhidas com intervalo de 2 a 3 semanas e congeladas a - 20oC.

Isolamento e Identificao

HAEMOPHYLUS Diferentes espcies pertencentes ao gnero Haemophilus podem ser encontradas como flora normal da nasofaringe e orofaringe, chegando a 50% da populao, geralmente cepas no capsuladas, embora tambm cepas do H. influenzae b possam apenas representar colonizao (rara nos adultos e cerca de 5% nas crianas). Para considerar o isolamento de Haemophilus fundamental associar o papel patognico ao da clnica. Vrias so as infeces causadas por H. influenzae, sendo H. influenzae do tipo b as cepas mais virulentas. Entretanto a partir da dcada passada, com a disponibilidade de vacinao, houve uma drstica reduo na importncia desta bactria nas populaes vacinadas. Doenas causadas pelo H. influenzae b principalmente na infncia: Meningite, Epiglotite, Pericardite, Pneumonia, Artrite sptica, Osteomielite, Celulite facial. Mais raramente: peritonite e infeco urinria em crianas menores que cinco anos. Doenas causadas por cepas no b e no tipveis (em maiores de 9 anos e adultos associados a doena de base predisponente como neoplasia, AIDS, alcoolismo, DPOC, etc.): Traqueobronquite e pneumonia, Bacteremia, Conjuntivite, Ootite (segunda causa depois do pneumococo), Sinusite.

HAEMOPHILUS APHROPHILUS
Microbiota do trato respiratrio superior, especialmente em placas dentrias e sulco gengival; endocardite e abscesso cerebral e mais raramente meningite, pneumonia e bacteremia esto associados a este agente, particularmente em pacientes com comprometimento imunolgico. A endocardite no est necessariamente relacionada leso valvular prvia, mas a associao com embolia arterial freqente nestes casos. Existem relatos tambm de isolamento em otites, sinusites e epiglotites, etc. Crescem bem em gar chocolate no isolamento primrio e em gar sangue de carneiro nos subcultivos sem exigncia de fatores X e V, mas as colnias so muito pequenas de cor amarelada, cheiro de cola e necessitam de 48 a 72h para boa visualizao. Em caldo tem a caracterstica de aderir as paredes do tubo, como o Actinobacillus actinomycetemcomitans. No crescem em Mac Conkey. Para todos os hemfilos fazer o teste da beta-lactamase para verificar a resistncia penicilina

HAEMOPHILUS DUCREY
o agente do cancro mole, sendo na atualidade raramente isolado, pela menor incidncia da doena, da contaminao das leses com flora genital e pelo frequente uso prvio de antibiticos. Colhido de lceras genitais removendo-se previamente a secreo superficial ou lavando com salina estril e utilizando um swab. Recomenda-se semear imediatamente e fazer esfregao a ser corado pelo Gram. Em geral de difcil cultivo. Emprega-se gar chocolate de cavalo com base GC ou Mueller Hinton. A colocao de um disco de vancomicina pode ajudar a inibir bactrias Gram positivas. Na bacterioscopia aparecem coco-bacilos Gram lbeis agrupados e em cadeias como cardumes.

ISOLAMENTO

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No isolamento primrio no gar chocolate as colnias costumam ser pequenas de cor beje claro, com odor caracterstico. No gar sangue ocasionalmente pode-se detectar o crescimento em torno de colnias de Staphylococcus aureus , que produz o fator V e utilizada como prova alternativa utilizao dos discos e denominada prova do satelitismo.

IDENTIFICAO DE ESPCIES DE HAEMOPHILUS

Anaerbio facultativo. No crescem no TSI e no OF-glicose. Melhor meio de cultura para haemophilus influenzae o gar chocolate com sangue de cavalo. A base GC usada para Neisserias indicada, embora os hemfilos cresam com outras bases como Columbia e Mueller Hinton. H necessidade de umidade e CO2 entre 3 a 5% para o H. influenzae e H. aphrophilus. O gar chocolate suporta muito bem o crescimento dos haemophilus, mas para outros fastidiosos recomenda-se adicionar suplemento de crescimento (vitox, isovitalex ). As diferentes espcies de haemfilos podem dar reao de oxidase positiva fraca e demorada (cerca de 25 a 20 segundos). Em amostras de LCR pode ser til a aglutinao com partculas de ltex, mas a confirmao bioqumica e sorolgica em laboratrio de referncia necessria. Antibiograma realizado em meio padronizado HTM (vide cap. meios de cultura).

PRINCIPAIS PROVAS PARA DIFERENCIAR ALGUMAS ESPCIES DE HAEMOPHILUS

Espcies Fator X + + neg + neg Fator V + + + neg neg Hemlise * Uria Indol GLI SAC LAC Catalase

H. influenzae H. haemolyticus H. parainfluenzae H. ducrey H. aphrophilus

neg + neg fraca neg

varivel + varivel neg neg

varivel varivel varivel neg neg

neg + + neg +

neg neg + neg +

neg neg neg neg +

+ + varivel neg neg

* Verificar hemlise em gar sangue de cavalo GLI = glicose SAC = sacarose LAC = lactose Obs.: Fermentao de aucares com base CTA e 1% de acar adicionado de fator X e V (vide cap. meios de cultura); vide leitura de fatores X e V

Tcnica para testar fatores X e V: Usar meio gar tripticase soja ou BHI gar. Discos comerciais impregnados com os fatores X=hemina/hematina e V=NAD ou coenzima I. Semear a bactria como se fosse fazer um antibiograma e colocar os discos com pina a uma distncia de 1,5 cm um disco do outro. Flambar a pina antes e aps a retirada de cada disco. Aps 24h de incubao em jarra com vela e umidade a 35oC, verificar crescimento prximo aos discos: Haemophilus influenzae: Crescimento entre os discos (exige X e V)

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Prova do satelitismo Semear com swab uma suspenso em salina cerca de 1 a 2 da escala Mac Farland no centro de uma placa de gar sangue de carneiro. Semear em uma nica estria um repique de S. aureus hemoltico (ATCC 23922). Incubar 18 a 24h em jarra com vela e umidade ou CO2. Verificar crescimento de colnias pequenas prximas a zona de hemlise do estafilococo. Encaminhar cepas isoladas de lquidos nobres (sangue, LCR, pleural, pericrdico) a Laboratrios de Referncia para confirmao e sorotipagem. LEGIONELLA

IMPORTNCIA CLNICA
Pneumonia com ou sem sepsis a manifestao clinica mais importante, podendo ocorrer infeces de partes moles e sinusite. Est em geral associada a surtos cuja fonte a gua contaminada com este agente. Largamente distribuda na natureza em ambiente mido e gua potvel e ocasionalmente em chuveiros. Est associada a presena de outras bactrias e amebas de vida livre na gua. A presena de bactrias do gnero Legionella em material clnico humano est invariavelmente associada doena clnica.

ESPCIES E MANIFESTAES CLNICAS

Existem algumas dezenas de espcies de Legionella sendo a espcie mais importante a L. pneumophila, sorogrupos 1 e 6. A doena pode ser sub-clnica, forma no pulmonar, pneumonia e doena extra-pulmonar. A forma no pulmonar tem perodo de incubao curto (horas a dias), sendo auto-limitada e sem evidncias radiolgicas de comprometimento pulmonar. Os sintomas so febre, mal-estar, mialgia e tosse. A pneumonia a forma mais frequente de manifestao da doena, acompanhada dos mesmos sintomas acima descritos para a forma no pulmonar e em geral com tosse no produtiva. A doena apresenta rpida progresso e nos casos graves, a formao de abscessos so sugestivos da legionelose. Bacteremia comum e o comprometimento dos mais variados orgos e tecidos j foi descrito.

MATERIAIS RECOMENDADOS
Escarro Aspirado traqueal e outros que neste caso especfico esto indicados como teis Lavado/escovado bronco-alveolar. Bipsia pulmonar ou outros tecidos e aqueles obtidos em autpsia. LCR e outros lquidos de derrame. Urina (pesquisa de antgenos) conservar a - 20oC. Para transporte: usar frasco estril com gua destilada estril, mas no salina que pode inibir o cultivo. Sempre que possvel concentrar os materiais por centrifugao, evitando formar aerossis.

RECURSOS DIAGNSTICOS MAIS UTILIZADOS

Sensibilidade e especificidade de recursos diagnsticos para legionelose
Teste Cultura Aglutinao pelo ltex Imunofluorescncia indireta Sensibilidade 70% 55-90% 70-80% Especificidade 100% 85-99% >95% til com cultura ou fins epidemiolgicos Observao Mtodo de escolha

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Cultura em meio enriquecido

Cresce em meio suplementado com extrato de levedura, l-cisteina, sais de ferro e alfacetoglutarato em meio denominado BCYEa ou BCYE, e seu crescimento favorecido pela incubao em 5% de CO2. Para materiais com microbiota, como para secreo traqueal e escarro, acidificar o meio por 15 minutos a pH 2,0 com tampo cido (0,2M HCl e 0,2M KCl) e em seguida neutralizao a pH 7,0 com KOH 0,1N. Recomenda-se uso de meio seletivo, adicionando ao meio BCYE os antibiticos: polimixina B, cefamandol e anisomicina ou vancomicina, polimixina B e anfotericina B. Colnias azuladas ou esverdeadas Adicionado de glicina, vancomicina, prpura de bromocresol e azul de bromotimol apresenta as seguintes caractersticas: L. pneumophila (branco esverdeado), L. micdadei (colnias azul claro ou acinzentadas), outras legionelas (colnias verde bem claro). Crescem bem no frasco utilizado pelo BACTEC.

Cultura em meio seletivo

Cultura em meio diferencial BCYE

IDENTIFICAO
So bacilos Gram negativos finos que se coram fracamente pela fucsina e safranina do Gram. Em repiques tornam-se filamentosos.

PROVAS
Aerbio estrito No primo isolamento a l-cystena imprescindvel. No meio BCYEa o crescimento pode ser observado a partir do 3 ao 5 dia a 35oC. Semear o material em gar sangue como controle, pois a Legionella no dever crescer. Aguardar 14 dias para descartar as culturas quando negativas.

CARACTERSTICAS DA L. PNEUMOPHILA
oxidase positiva fraca catalase positiva no sacaroltico (no oxida nem fermenta os acares) motilidade positiva A identificao com base em testes difcil. O suspeita deve ser baseada na clnica, no aspecto da colnia, crescimento em meio BCYEa, dependncia da l-cysteina, ausncia de crescimento em gar sangue e gar chocolate no suplementados. A imunofluorescncia direta, com amostras clnicas utilizadas para cultura, um mtodo complementar para diagnstico da legionelose. Encaminhar cepas suspeitas a Laboratrio de referncia para confirmao. PASTEURELLA A infeco pela Pasteurella constitui uma zoonose, pois se trata de bactria microbiota de boca e trato respiratrio superior de mamferos e aves. As diferentes espcies esto associadas a infeces humanas relacionadas a mordida dos animais descritos abaixo ou outros tipos de contato com sangue, carne, carcaa, etc. A P. multocida a espcie mais comumente isolada em material clnico humano, em geral associada a mordida ou arranhadura de ces e gatos. Caracteriza-se pela formao de abscessos ou celulite e eventualmente osteomielite. Infeces respiratrias podem ocorrer, incluindo pneumonia lobar, com ou sem derrame e empiema. Em pacientes imunocomprometidos, com cirrose, neoplasias, podem apresentar bacteremia e septicemia. gelatinase positiva hidrlise do hipurato positivo sensvel a macroldeos, rifampicina, sulfatrim e quinolonas

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Principais espcies de Pasteurella e doenas relacionadas

Bactria P. multocida Doenas Relacionadas Microbiota do trato respiratrio de mamferos e aves (domsticos e silvestres, encontrado na boca de cerca de 50% dos ces e gatos). Pode causar infeces em mamferos e diarria em aves. P. pneumotropica P. haemolytica P. aerogenes P. dagmatis (n. sp1) Trato respiratrio de roedores, ces, gatos, etc Infeces pulmonares em bovinos, mastite em ovelhas, sepse em ovinos e caprinos. Microbiota do trato intestinal de sunos Trato respiratrio de ces e gatos

DIAGNSTICO DE ZOONOSES
Para facilitar o isolamento e identificao da Pasteurella muito importante a descrio clnica, pois na suspeita de zoonoses importante lembrar de: brucelose, pasteurella, micobacterioses, tularemia, leptospirose, yersiniose, etc. Caracterizao microbiolgica Coco-bacilo Gram negativo ou bacilos podem ser capsulados Anaerbio facultativo (fermentador) TSI cido/cido Oxidase positiva em colnias isoladas em gar sangue ou gar chocolate Catalase positiva Motilidade negativa Indol positivo Sacarose positiva Muitas espcies so ornitina positivas Provas diferenciais das espcies de Pasteurella spp. de importncia clnica
Espcie * P. multocida P. pneumotropica Hemlise neg neg Mac Conkey neg varivel Indol + + Uria neg + Ornitina + + OF Glicose F sem gs F gs varivel F sem gs F sem gs F com gs

P. haemolitica P. aerogenes P. dagmatis

+ 72% neg neg

varivel + neg

neg neg +

neg + +

varivel varivel +

* Todas so oxidase positiva, catalase positiva e fermentadoras da glicose Obs.: a P. multocida cresce bem em gar sangue de carneiro e gar chocolate, formando pequenas colnias acinzentadas. No cresce em gar Mac Conkey. Tem odor forte caracterstico e podem ser diferenciadas entre si por poucas provas (vide tabela acima), mas dependendo do animal-fonte, outras espcies menos frequentes podem estar envolvidas. ACTINOBACILLUS So habitantes das mucosas do trato respiratrio e urinrio de humanos e animais. As trs espcies mais importantes so: A. actinomycetemcomitans, A. urea e A. hominis.

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O primeiro est relacionado doena periodontal e particularmente periodontite juvenil localizada, bem como com endocardite e abscesso cerebral, oriundos da boca. A doena periodontal est associada endocardite pelos seguintes agentes: A. actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis E. corrodens Kingella spp.

As outras espcies de Actinobacillus so patgenos oportunistas e causam raramente infeces do trato respiratrio e bacteremia.

PRINCIPAIS CARACTERSTICAS PARA DIAGNSTICO

So coco-bacilos Gram negativos ou pequenos bacilos que crescem em aerobiose, umidade e 5 a 10% de CO2 ou anaerobiose em gar sangue e gar chocolate. Recomenda-se adicionar suplementos com vitaminas e sangue lisado de carneiro ou cavalo ao gar chocolate. As colnias ficam bem visveis com 48 a 72 h de incubao, so brancas acinzentadas, com um pregueamento no centro, fortemente aderentes ao meio e pegajosas no primo isolamento. Principais caractersticas das bactrias fastidiosas analisadas
Bactrias Actinobacilus Caractersticas Principais Cocobacilus a bacilos longos, anaerbios facultativos, colnias cinza, aderentes ao meio, com centro da colnia enrugado Bacilos que podem apresentar formas semelhantes gota dgua Cocobacilos com extremidades arredondadas, cheiro de gua clorada, colnias podem corroer o meio Pequenos cocobacilos Fusiforme e curvo, colnias crescem espalhadas Filamentos longos Pode ter forte pigmento violeta, cresce em Mac Conkey

Cardiobacterium Eikenella

Kingella Capnocytophaga Streptobacillus Chromobacterium

Provas diferenciais entre os principais fastidiosos

Bactrias Oxidase Catalase CO2 Mac Conkey varivel Uria Indol Glic. TSI Motil.

Actinobacilus

neg ou + fraco + + + neg

2

neg

neg

ac / ac

neg

Cardiobacterium Eikenella Kingella Capnocytophaga Streptobacillus Chromobacterium

neg neg neg neg

2

+ + + + + neg

neg neg neg neg neg +

neg neg neg neg neg neg

+ neg neg neg neg neg

+ neg + + + +

ac / ac alcalino alcalino n cresc.

3

neg neg neg neg neg +

neg varivel

neg +

n cresce alc / ac

positivo ou neg = 80% ou mais das provas positivas ou negativas ac= cido 1 - A. actinomycetemcomitans 2 - origem humana. As de origem animal so oxidade e catalase positivas. 3 - pode acidificar lentamente

alc = alcalino

Mod V - 67

CAPNOCYTOPHAGA As espcies de Capnocytophaga gingivalis, granulosa, haemolitica, ochracea e sputigena fazem parte da microbiota da cavidade oral humana, enquanto outras espcies podem ser encontradas na boca de animais domsticos. O isolamento de Capnocytophaga ocorre com maior freqncia em bacteremias nos pacientes neutropnicos com mucosite, mas esto tambm implicadas na doena periodontal juvenil (gengivalis e ochracea), periodontite em adultos (sputigena) e isoladas em placas dentais supragengivais em adultos (granulosa e haemolytica). As doenas localizadas (ceratites, abscessos e endoftalmites), bem como doenas sistmicas (septicemia, endocardite, osteomielite, etc.) ocorrem em pacientes imunocomprometidos ou no.

MORFOLOGIA E CULTIVO
A morfologia da Capnocytophaga bem caracterstica, facilitando a sua suspeita, pois lembra um Fusobacterium aerotolerante. Tem as extremidades afiladas e o centro mais largo, podendo ser encurvada e eventualmente cocide. Para cultivo, crescem melhores com 5 a 10% de CO2 e em anaerobiose, o que pode confundir com o anaerbio estrito, se no for feita a prova de crescimento em aerobiose com CO2. Chama a ateno o fato de crescer melhor em gar sangue de carneiro que no gar chocolate sem suplemento de vitaminas. No crescem em Mac Conkey. O crescimento pode ocorrer com 24 a 72 h. A colnia chata e sua borda irregular; com maior incubao nota-se o espalhamento em torno da colnia, semelhante ao Proteus, mas em escala muito reduzida, cerca de 2 a 4 mm de dimetro. A espcie haemolytica apresenta hemlise discreta, e a espcie ochracea tem cheiro de amndoas.

IDENTIFICAO
Capnocytophaga de origem humana so oxidase e catalase negativas, produzem cido a partir da glicose em caldo enriquecido com soro de coelho e inculo denso. Motilidade negativa; indol negativo; lisina, ornitina e arginina negativas. A maioria esculina positiva (gengivalis varivel e granulosa negativa). A diferenciao das espcies dificil. As amostras de origem animal (C. canimorsus e cynodegmi) so oxidase, catalase e arginina positivas. EIKENELLA Tambm bactria da microbiota da cavidade oral humana e atribuinegse participao em infeces periodontais, sendo encontrada na placa bacteriana subgengival em adultos com periodontite. Isolada em material de trato respiratrio inferior, abscessos de partes moles, sangue e fludos estreis infectados em casos de infeces pleuronegpulmonares, infeces psnegcirrgicas de parede, artrite, meningite, endocardite e septicemia.

CULTIVO, BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAO

anaerbio facultativo, mas cresce melhor com 5% de CO2, em gar sangue e chocolate, mas no em Mac Conkey. O crescimento lento, necessitando de 2 a 4 dias para boa visualizao das colnias. Em cerca da metade das cepas pode-se observar a corroso do gar, que sua caracterstica marcante. Produz um pigmento amarelo claro e tem odor de hipoclorito no gar sangue e gar chocolate. Na bacterioscopia so observados bacilos delgados ou coco-bacilos gram negativos com extremidades arredondadas. E, bioquimicamente, caracteriza-se por ser oxidase positiva, catalase negativa, motilidade negativa e ornitina positiva; provas negativas de utilizao de carboidratos, uria, indol e esculina. KINGELLA Espcies de Kingella fazem parte do trato respiratrio e genito-urinrio humanos. K. kingae a espcie mais importante e um patgeno oportunista responsvel por casos graves de endocardite, osteomielite, septicemia, com provvel porta de entrada em leses da mucosa da orofaringe. A doena valvular pode estar ou no associada a doena cardaca prvia. A osteomielite ocorre com

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maior frequncia em crianas menores de 5 anos. Os quadros spticos podem ser semelhantes doena meningoccica.

CULTIVO, BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAO

A K. kingae cresce em gar sangue incubao, mas no em Mac Conkey. carneiro, mas sem hemlise intensa. lisas e convexas ou fazendo corroso, e gar chocolate com 5% de CO2, aps pelo menos 48 h de Tem como caracterstica ser beta-hemoltica no gar sangue de Pode crescer numa mesma placa de isolamento como colnias ou colnias espalhadas como se fossem mveis.

So coco-bacilos que ocorrem aos pares ou cadeias curtas, podendo ser confundida com Neisseria spp. e, bioquimicamente, so oxidase positiva, motilidade e catalase negativas, e acidificam a glicose lentamente. Provas diferenciais entre os fastidiosos oxidase positivas e catalase negativas: Fastidiosos oxidase positivas e catalase, uria e esculina negativas
Bactrias C. hominis E. corrodens K. kingae Hemlise neg neg + Indol + neg neg Ornitina neg + neg Glicose + neg +

CARDIOBACTERIUM HOMINIS Cardiobacterium flora do trato respiratrio humano e ocasionalmente do trato urogenital. Est associado quase exclusivamente a quadros de endocardite, precedidos de manipulao dentria.

CULTIVO, BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAO

Cresce em 3 a 5 dias em hemoculturas, mas no causa alteraes no meio (turvao, hemlise, pelcula, grumos, etc.). Cresce em 3 a 5 dias em 5 a 7% de CO2, em gar sangue e gar chocolate, mas no em Mac Conkey. As colnias so branco-amareladas e podem manifestar um pequeno espraiamento da colnia simulando motilidade no gar como o Proteus e eventualmente a corroso do gar. So bacilos Gram negativos, podendo apresentar pleomorfismo com extremidades dilatadas como bulbos que podem reter corante violeta e com arranjos caractersticos em agrupamentos de rosetas e formas isoladas como gota dgua ou alteres. Deve-se observar estas caractersticas para no confundir com bacilos Gram positivos. Uma prova fundamental a produo de indol, que deve ser feita em caldo triptona, com inculo denso, incubao de 48 h, e extrao com xilol e uso do reagente de Ehrlich. CHROMOBACTERIUM VIOLACEUM Encontrada na natureza no solo e na gua, a infeco em geral est relacionada a leses cutneas com estes elementos. Leses localizadas ou formas septicmicas graves com mltiplos abscessos tm sido esporadicamente relatadas. Mais raramente diarria e infeco urinria.

CULTIVO E BACTERIOSCOPIA
Bacilo Gram negativo anaerbio facultativo, reto ou ligeiramente curvo, com extremidades arredondadas, isolados ou em arranjos aos pares ou em cadeias curtas. Diferente da maioria dos fastidiosos, cresce alm do gar sangue e chocolate, tambm em Mac Conkey. Caracterstica de colnia convexa, lisa e de cor violeta forte, embora algumas variantes sem cor possam ocorrer. Algumas cepas podem ser levemente hemolticas no gar sangue.

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STREPTOBACILLUS MONILIFORMIS Encontrado na nasofaringe e orofaringe de ratos, camundongos e outros roedores domsticos como a cobaia. As infeces esto relacionadas a mordida destes roedores ou ingesto de leite ou alimentos contaminados. A febre por mordedura do rato apresenta quadro clnico bem definido com perodo de incubao de cerca de 10 dias, incio abrupto com febre elevada, tremores, cefalia intensa, vmitos e artralgia migratria. Rash semelhante ao sarampo com erupes maculopapulares podendo ser pustulosa, com petquias ou prpuras nas extremidades, incluindo regio palmar e plantar. Complicaes graves podem ocorrer como endocardite, pericardite, septicemia, abscesso cerebral, etc. Sem tratamento pode evoluir favoravelmente em 2 semanas ou pode se tornar crnica; a mortalidade chega a 10%.

CULTIVO, BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAO

um bacilo Gram negativo muito pleomrfico, podendo ter em culturas mais velhas de 1 a 150 m de comprimento (habitualmente bactrias tem de 1 a 3 m), com eventuais dilataes como um colar de prolas, sem apresentar ramificaes, quebrando em formas coco-bacilares. Em culturas jovens pode ter morfologia mais uniforme. O isolamento feito de hemocultura, aspirado de derrames (devem ser centrifugados para concentr-los) e abscessos. Meios de cultivo Colher sangue para hemocultura com citrato. No se deve usar hemoculturas com SPS que inibidor do S. moniliformis. Cultivar em meio bifsico TSA/TSB ou gar infuso corao ou caldo infuso corao, suplementados com 10% de soro de cavalo ou 15% de soro de coelho, e 0,5% de extrato de levedura. Incubar em jarra de anaerobiose ou 10% CO2 a 35-36oC e umidade. Aps cerca de trs dias crescem colnias cinzas de 1-2 mm de dimetro, consistncia butirosa podendo surgir colnias variantes com aparncia de ovo frito como micoplasmas. Em caldo de cultura crescem em 2 a 3 dias com aparncia de bolas de plo. As provas bioqumicas exigem a adio de soro de cavalo ou coelho para suportar o crescimento. So oxidase, catalase, indol e uria negativos; e positivos para esculina, H2S com a prova da tira de acetato de chumbo e hidrlise da arginina. Acidificam lentamente a glicose em base CTA com 0,5% de soro de cavalo.

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8. BACTRIAS ANAERBIAS ESTRITAS

INTRODUO Existe um grupo de bactrias, que produz patologia no ser humano, e que no tem capacidade de multiplicar-se em presena do oxignio atmosfrico. E mais, para muitas espcies destas bactrias o oxignio deletrio. Estas bactrias so chamadas de anaerbios estritos, para diferenciar dos chamados anaerbios facultativos, que tm a capacidade de desenvolver seus processos metablicos, tanto em presena como na ausncia do oxignio. A maior parte das bactrias patognicas do ser humano so anaerbios facultativos e as famlias Micrococaceae, Streptococaceae, Corynebacteriaceae, Enterobacteriaceae, so exemplos destes microrganismos. Os anaerbios estritos esto constitudos por numerosas famlias, gneros e espcies com caracteres morfolgicos como H2O2 que se formam em presena de oxignio e que podem ser txicos, bioqumicos e antignicos muito diferentes. So estudados em captulo separado porque a metodologia para seu isolamento e identificao laboratorial prpria deste grupo, e porque produzem alguns tipos especiais de processos patolgicos no ser humano. Existem vrias teorias que tentam explicar esta susceptibilidade dos anaerbios estritos ao oxignio. Entre elas, as seguintes: Oxignio seria um txico direto para a bactria anaerbia. As bactrias anaerbias estritas no tm a enzima catalase que impede a formao de grandes quantidades de perxidos. Oxignio altera enzimas bacterianas importantes no metabolismo (oxida, por exemplo, enzimas que contm sh). As bactrias anaerbias estritas no possuem a enzima superxido dismutase, capaz de transformar o radical, o que altamente txico para a bactria. Existem vrios argumentos a favor ou contra estas teorias. Provavelmente mais de um destes fatores seja importante para explicar a ao deletria do oxignio nestas bactrias. Esta labilidade dos anaerbios estritos ao oxignio explica a dificuldade existente nos laboratrios para seu isolamento e estudo. Por este motivo tambm, boa parte das infeces provocadas por estes microrganismos no eram diagnosticadas at a dcada de 1970, quando foram desenvolvidos procedimentos prticos de laboratrios para criar atmosferas de anaerobiose. Assim, as infeces provocadas pelos microrganismos mais resistentes dentro deste grupo, os esporulados do gnero Clostridium, eram diagnosticadas com maior freqncia. Hoje sabemos que as infeces por Clostridium so menos freqentes que as infeces provocadas por outros gneros de bactrias anaerbias. Um fato que tambm merece ser destacado, para explicar a freqncia com que estas bactrias provocam infeco, que os anaerbios estritos so habitantes normais do organismo humano, ultrapassando em nmero os aerbios e anaerbios facultativos. Assim, os anaerbios estritos esto em propores 5 a 1000 vezes maiores que os anaerbios facultativos na microbiota normal do tubo digestivo, pele, trato respiratrio superior e genital feminino. Quando existem fatores predisponentes estas bactrias provocam processos patolgicos em diferentes rgos e sistemas. Por este motivo, a maior parte das infeces provocadas pelas bactrias anaerbias estritas so infeces chamadas endgenas. a prpria microbiota bacteriana do doente que em determinado momento provoca o processo infeccioso, sendo este tipo de infeco pouco ou no contagioso. As infeces provocadas pelo gnero Clostridium so fundamentalmente adquiridas a partir do meio ambiente externo e por este motivo so chamadas de infeces exgenas. Nas mucosas, onde os anaerbios estritos formam parte da flora normal, existem condies locais de anaerobiose. Estas condies so provocadas por compostos orgnicos, enzimas, restos celulares e bactrias anaerbias facultativas que baixam o potencial redox nestes locais. Neste sentido devemos assinalar que estas bactrias toleram pequenas quantidades de oxignio. As mais estritas crescem em atmosferas com 0,5% de oxignio, muitas crescem em atmosferas ao redor de 3% e algumas podem crescer ainda em concentraes de at 8% de oxignio.

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Como as bactrias anaerbias facultativas e aerbias favorecem a mutiplicao dos anaerbios, por consumirem o oxignio existente no local e talvez por produzirem alguns fatores de crescimento como substncias secundrias do seu metabolismo, a maior parte das infeces por bactrias anaerbias estritas so infeces mistas. Assim, so freqentes as infeces conjuntas com Enterobactrias, Pseudomonas e Staphylococcus aureus. Alguns aspectos clnicos fazem suspeitar uma infeco com envolvimento de bactrias anaerbias, sendo os principais estes abaixo relacionados: Secreo ftida Infeco nas proximidades de superfcie mucosa Tecido necrtico Presena de gs em tecidos ou secrees Tromboflebite sptica Colorao negra em secreo com sangue Infeco decorrente de mordida humana ou de animal Presena de grnulos de enxofre nas secrees Teraputica prvia com aminoglicosdeos Gangrena gasosa Uma leso com aspecto de um micetoma e a observao de grnulos de enxofre no pus obtido so caracterstica de uma infeco por Actinomyces. A infeco por anaerbios secundria a uma mordida de animal ou do ser humano explicada pela existncia de um grande nmero destas bactrias na cavidade oral destes hospedeiros. Associados a estes elementos clnicos, existem alguns outros, laboratoriais, que sedimentam ainda mais a suspeita de uma infeco por anaerbios estritos: Ocorrncia de formas pleomrficas na colorao de Gram (como regra geral, os anaerbios so mais pleomrficos que os aerbios e anaerbios facultativos). Observao no material, de bacilos gram positivos esporulados que fazem pensar em Clostridium. Presena de bactrias no Gram direto, que no crescem nos meios mantidos em atmosferas de aerobiose. Crescimento de bactrias somente na parte inferior de tubos com meios de cultura lquido ou semi-slido.

FATORES PREDISPONENTES
Uma variedade de condies predispe um indivduo a desenvolver infeco por anaerbios. Podemos generalizar dizendo que todos os fatores que fazem diminuir a quantidade de oxignio nos tecidos, e, portanto, o potencial de oxi-reduo dos mesmos, favorecem a infeco por anaerbios estritos. Entre estes fatores podemos assinalar como mais frequentes os seguintes: Diminuio do fluxo sangneo. Presena de reas necrticas. Corpos estranhos. Acmulo de sais endgenos (por exemplo, pontos de calcificao). Infeco por bactrias aerbias ou anaerbias facultativas. Manipulaes cirrgicas. Esterilizao intestinal pr-operatria. Tumores, processos orgnicos ou caseosos. Um baixo potencial de oxi-reduo facilita o crescimento de bactrias anaerbias e a causa clnica mais comum de diminuio do potencial redox a anxia dos tecidos resultante de leso vascular, compresso, hipotermia, choque, edema e outras condies levando m perfuso. Quanto s doenas sistmicas ou condies gerais como corticoterapia, teraputica de tumores, leucopenia, hipergamaglobulinemia, colagenoses, diabetes, esplenectomias, embora relacionadas

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como predisponentes, no h evidncia concreta de que realmente estejam associadas maior incidncia de infeco por anaerbios. COLETA DE MATERIAL As amostras devem ser colhidas de forma que no entrem em contato com oxignio e no se contaminem com bactrias anaerbias da flora normal. Por este motivo devem ser aspiradas com seringa, da qual eliminado o ar imediatamente aps a obteno da amostra. O material no pode ser colhido com zaragatoa (swab). Para evitar a contaminao pelos anaerbios da flora normal, no devem ser semeados escarro, secreo farngea ou nasal, secrees vaginais, fezes ou material de colostomia, pois estes materiais sempre tm bactrias anaerbias. Idealmente, as bactrias anaerbias estritas so pesquisadas em lquidos aspirados de cavidades fechadas, material obtido por aspirao profunda de feridas, puno de traquia ou pulmonar e sangue para hemocultura. Em resumo, serve qualquer material que no esteja normalmente contaminado com as bactrias anaerbias da flora normal. TRANSPORTE DO MATERIAL O transporte pode ser feito com a mesma seringa com que foi colhido o material. Obviamente que este transporte deve ser o mais rpido possvel. O melhor que a mesmo profissional que colheu leve imediatamente a seringa ao laboratrio. Tambm pode ser empregado, com este fim, um vidro do tipo de penicilina, que contm meio de tioglicolato de sdio ( 7 ml). O tioglicolato um sal redutor, de forma que no interior do meio existem condies de anaerobiose. A este meio lquido pode acrescentar uma pequena quantidade de gar (0,5%) para transform-lo em um meio mais espesso, o que dificulta a difuso de oxignio. O meio tem um indicador de oxigenao que a rezarsurina, de modo que se por algum motivo existe oxigenao do mesmo, o indicador adquire cor rosa. O material aspirado inoculado no interior do meio de cultura, atravs da tampa de borracha. Especial cuidado deve ter-se para no agitar o meio, antes e depois da inoculao, para evitar sua oxigenao. As amostras colhidas neste meio podem ser encaminhadas ao laboratrio vrias horas aps sua inoculao (at 24 horas). PROCESSAMENTO DO MATERIAL Sempre feita uma colorao de Gram e de esporos, quando necessrio, da amostra recebida, o que pode orientar o clnico para o diagnstico e a teraputica precoce. Por exemplo, a observao num processo com aspecto de gangrena gasosa de bacilos gram positivos, grandes esporulados, quase confirmao do diagnstico de Clostridium e de gangrena gasosa. A existncia de poucas ou muitas bactrias na amostra permite orientar o bacteriologista se ele deve enriquecer previamente a amostra em um caldo ou fazer diretamente a semeadura em placa. Quando o material vem numa seringa, a semeadura feita em tioglicolato e em placa. Quando o material j vem no meio de tioglicolato, feita, a partir deste, a semeadura em placa, e incubados ambos os meios.

PRODUO DE ANAEROBIOSE
Existem vrios procedimentos para conseguir no laboratrio uma atmosfera de anaerobiose adequada multiplicao das bactrias anaerbias produtoras de patologia no ser humano. Por exemplo: Uso de tubos com meios slidos pr-reduzidos.

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Cmaras anaerbias (glove box), nas quais o manipulador introduz somente as mos, sendo o ar eliminado, colocando-se uma mistura de gazes (H2, CO2, N2); nestas cmaras existem todos os elementos necessrios para o trabalho bacteriolgico, incluindo estufas de incubao. Sistema mais empregado o sistema das jarras de anaerobiose com geradores qumicos que permitem obter uma atmosfera adequada para a multiplicao destas bactrias. Existem diversos tipos de geradores. Os mais utilizados so os que provocam um consumo do oxignio com substncias redutoras como ferro reduzido ou cido ascrbico.
Dentro da jarra colocado, alm dos geradores qumicos, uma fita de papel filtro impregnada de azul de metileno, que um indicador de anaerobiose. Quando a atmosfera do interior da jarra tem condies adequadas de anaerobiose, o azul de metileno altera para uma cor branca. Numa jarra de tamanho mdio 2,5 litros, coloca-se aproximadamente 10 placas e muitos tubos. Com estes sistemas o contedo de O2 da jarra cai a 0.4%, em aproximadamente 1 hora e meia, de forma que as condies anaerbias esto presentes bem antes da transformao do azul de metileno, que acontece por volta de 4-6 horas. Observar uma jarra com placas semeadas, um gerador de anaerobiose sobre a ltima placa, e o indicador de anaerobiose reduzido de cor branca. Comparar esta cor com a cor azul do indicador nos geradores localizados fora da jarra em sua parte inferior.

Os mtodos citados acima do resultados semelhantes quanto eficcia do isolamento de bactrias anaerbias em amostras clnicas, porm, o sistema das jarras o mais prtico e menos complicado.

SEMEADURA EM PLACA
As amostras so semeadas em trs placas de gar sangue preparadas com gar Brucella, adicionadas com 10% de sangue de carneiro. Uma das placas incubada a 37C em atmosfera aerbia, e uma segunda incubada a 37C em uma atmosfera com 5% de CO2 para bactrias microaerfilas. Para este fim colocamos a placa em uma jarra com um gerador de CO2, produzindo aproximadamente 5% de CO2. A terceira placa a que se inocula em atmosfera de anaerobiose. O meio de cultura desta terceira placa enriquecido com hemina (5mg/ml), vitamina K (10 mg/ml) e extrato de levedura (0,5%). Neste meio acrescenta-se tambm um antibitico aminoglicosdeo (geralmente amicacina, 100 mcg/ml). A adio do antibitico cria um meio seletivo porque os anaerbios estritos so resistentes a estes antimicrobianos e a maior parte das cepas de aerbios e anaerbios facultativos sensvel. Como a maior parte das infeces provocadas pelos anaerbios estritos so infeces mistas, este meio seletivo ajuda o isolamento bacteriano. No se justifica o uso de mais uma placa sem antibitico porque aumentam os custos sem aumentar o isolamento de anaerbios. Estas placas so incubadas dentro da jarra a 37C de temperatura durante 48 horas. Quando se suspeita, pelo quadro clnico ou pela colorao de Gram da amostra, que estamos em presena de uma infeco por Clostridium, que so de crescimento mais rpido, as jarras podem ser abertas aps 18 a 24 horas de incubao. Por outro lado, bactrias de crescimento mais lento, como os actinomices, podem demorar sete dias ou mais para formar colnias visveis. IDENTIFICAO BACTERIANA

COMPROVAO DE ANAEROBIOSE ESTRITA

Aps a incubao, as placas so examinadas e agora o passo mais importante a comprovao de que as bactrias desenvolvidas nas placas de anaerobiose so anaerbios estritos. Para este fim, so feitas coloraes de Gram, de todos os diferentes tipos de colnias observadas nas trs placas e comparada a morfologia bacteriana. Ao mesmo tempo, semea-se as diversas bactrias obtidas, novamente em anaerobiose e aerobiose.

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S feito o diagnstico de anaerbio estrito quando, aps 24 a 48 horas da nova incubao, a bactria apenas crescer na placa de anaerobiose. O Gram das colnias j orienta para uma identificao preliminar do grupo de anaerbio isolado. Agrupamento das bactrias anaerbias estritas, de importncia em patologia humana de acordo com sua morfologia na colorao de Gram Cocos Gram positivos Staphylococcus Peptostreptococcus Streptococcus Propionibacterium Bifidobacterium Actinomyces Eubacterium Lactobacillus Bacterides Fusobacterium Prevotella Porphyromonas Cocos Gram negativos Veillonella Acidaminococcus Megasphaera Clostridium

Bacilos Gram positivos no esporulados

Bacilos Gram positivos esporulados

Bacilos Gram negativos

IDENTIFICAO BACTERIANA PRESUNTIVA

Das colnias de anaerbios estritos, deve ser feita colorao de Gram. J nesta etapa o laboratrio presta uma grande ajuda ao clnico, informando que o paciente tem uma infeco por uma bactria anaerbia estrita que pertence a determinado grupo morfolgico. O diagnstico de gnero e espcie feito utilizando: Provas bioqumicas: utilizao de acares, produo de indol, reduo de nitratos, urease, crescimento em presena de bile, liquefao da gelatina, hidrlise de esculina etc. Produo de pigmentos Hemlise Aprofundamento no gar Susceptibilidade a antimicrobianos Formao de cidos detectados por cromatografia lquida Inoculao experimental Sorologia As seguintes consideraes prticas so teis para a orientao do clnico para uma conduta adequada, sem a necessidade de aparelhos ou metodologias caras por parte do laboratrio: Na presena de cocos Gram positivos, o laboratrio deve fazer o diagnstico presuntivo de Peptostreptococcus que so os mais freqentemente isolados neste grupo morfolgico. Diagnstico diferencial com Streptococcus e Staphylococcus anaerbios como das espcies de Peptostreptococcus deve ser feita com ajuda da cromatografia para detectar a produo de diferentes cidos graxos. Na presena de cocos Gram negativos, o laboratrio deve fazer o diagnstico presuntivo de Veillonella, gnero mais freqente neste grupo. Para o diagnstico diferencial com os outros gneros de cocos Gram negativos tambm recomendada a cromatografia lquida, para pesquisar cidos graxos. Na presena de bacilos Gram positivos esporulados, o laboratrio deve fazer o diagnstico de Clostridium. Na dvida no diagnstico de bacilo esporulado, recomenda-se o tratamento com lcool etlico a 95%, durante 1 hora temperatura ambiente e ressemeadura posterior. Alm disso, a suspenso bacteriana pode ser aquecida a 80C durante 10 minutos, esfriada e feita resemeadura. Aps um ou outro destes procedimentos, s sobrevivem bactrias esporuladas. Se o Clostridium produzir um duplo halo de hemlise pode ser feito o diagnstico presuntivo de Clostridium perfringens. Esta espcie a mais freqentemente isolada dentro deste grupo bacteriano.

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Para o diagnstico diferencial das outras espcies de Clostridium devem ser feitas provas bioqumicas como hidrlise da gelatina, fermentao da glicose, lecitinase, lipase, produo de indol, uria, nitratos, e motilidade. Na presena de bacilos Gram positivos no esporulados recomendamos fazer a prova de catalase, reduo de nitratos, hidrlise de esculina, urease, e produo de pigmento. Para o diagnstico definitivo, deve ser feita a pesquisa da produo de cidos graxos. Se a colorao de Gram mostrar bacilos Gram negativos, recomendamos semear a colnia em gar sangue (Brucella gar), colocando um disco de Rifampicina (15 mcg) e um disco de Kanamicina (1.000 mcg); a bactria deve tambm ser semeada num meio que contm bile a 20%, e num meio rico em triptofano para determinar a produo de indol, com as placas incubadas por 48 horas a 37C. Estas provas junto com a produo de pigmento permitem fazer o diagnstico presuntivo de Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas e Fusobacterium. Frente aos discos de antibiticos, a bactria considerada sensvel se o halo de inibio de 12 mm ou maior; considerada resistente com halos menores de 12 mm. Como inculo para a semeadura utiliza-se uma suspenso com turvao semelhante ao nmero 3 de escala de MC Farland ou uma turvao semelhante aps incubao em meio de tioglicolato. A prova da bile considerada positiva, se existir crescimento bacteriano no quadrante respectivo. Para a produo de pigmento, recomendamos a observao direta das colnias, e, em caso de no existir pigmento evidente, iluminar a placa com luz ultravioleta ( 360 nm de comprimento de onda). Colnias de Prevotella melaninogenicus aparecem de cor tijolo avermelhado. Para a prova de indol, recomendamos passar uma colnia, a partir do meio com triptofano, com ajuda de uma ala de platina num papel filtro impregnado em 1% de paradimetilaminocinamaldeido (em cido clordrico 10%). Uma reao positiva produz imediatamente uma cor azul. O diagnstico presuntivo feito de acordo seguinte tabela: Bacilos Gram negativos anaerbios estritos
Bactrias Rifampicin a 15 mcg sensvel sensvel sensvel sensvel Kanamicin a 1.000 mcg resistente resistente resistente sensvelresistente sensvel sensvel sensvel Bile 20% Indol Pigmento

Bacteroides grupo fragilis Prevotella sp Porphyromonas sp Bacterides sp

+ neg neg neg

+/neg +/neg + neg

neg + + neg

F.mortiferum F.varium Fusobacterium spp.

resistente resistente sensvel

+ + neg

neg + +

neg neg neg

Para Rifampicina e Kanamicina: Sensvel = halo de inibio com 12 mm ou mais de dimetro Resistente = ausncia de halo ou menor que 12 mm de dimetro.

A diferenciao dos gneros Prevotella e Porphyromonas realizada atravs da capacidade de fermentar glicose que positiva para o primeiro gnero e negativa para o segundo. Alguns sistemas comerciais manuais ou automatizados permitem fazer o diagnstico das diferentes espcies de anaerbios utilizando numerosas provas bioqumicas. Algns utilizando a ao de enzimas bacterianas pr-formadas podem fazer este diagnstico aps 4 horas de incubao. Destes os mais freqentemente utilizados so:

API, Vitek e Microscan. Estes sistemas mais caros no so fundamentais para o diagnstico dos grupos bacterianos e para uma orientao teraputica adequada. Mod V - 76

Em algumas infeces importante, para o diagnstico, determinar a presena de toxinas como acontece nas infeces intestinais por Clostridium difficile. Esta determinao feita com provas sorolgicas disponveis comercialmente. PROVAS DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS O estudo da sensibilidade destas bactrias importante pelo aumento permanente de sua resistncia frente aos diferentes antimicrobianos. Esta resistncia mais comum nos gneros Bacteroides e Prevotella, mas pode estar presente tambm nos gneros Clostridium, Porphyromonas e Fusobacterium. Mtodo do Disco O mtodo do disco difuso no adequado para estudar a sensibilidade das bactrias anaerbias estritas. O NCCLS (National Committee for Clinical Laboratories Standards) dos EUA recomenda um mtodo de diluio em gar: as concentraes de antimicrobianos so incorporadas no meio de Wilkins-Chalgren. Cada placa tem uma concentrao de um antimicrobiano. As bactrias so semeadas utilizando o inoculador mltiplo de Steers e as placas colocadas em jarras com gerador de anaerobiose. A leitura feita aps 48 horas de incubao na estufa, determinando-se a CIM (concentrao inibitria mnima). Mtodo da Fita Um mtodo alternativo mais prtico a determinao da sensibilidade utilizando fitas de plstico impregnadas com um gradiente de concentrao de antimicrobianos como no mtodo do E test. As bactrias so semeadas em forma similar empregada no mtodo do disco para aerbios. So colocados duas fitas cada uma com um antibitico diferente em cada placa de 9 cm de dimetro. Em geral necessrio testar 6 antibiticos (3 placas). Os antimicrobianos com maior atividade in vitro e in vivo frente aos anaerbios estritos so: cloranfenicol, clindamicina, cefoxitina, metronidazol, penicilina e amoxicilinanegcido clavulnico. As placas so incubadas dentro de jarra com gerador a 37 graus de temperatura. A leitura feita aps 48 horas de incubao, e a sensibilidade interpretada nos dois mtodos seguindo as tabelas publicadas pelo NCCLS. Salientamos que existe uma boa correlao nos resultados obtidos com as duas metodologias descritas.

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9. INTERPRETAO DE RESULTADOS E LAUDOS

INTRODUO O microbiologista ao elaborar possibilidade do clnico no determinado nome de bactria, associadas disponibilidade do de antimicrobianos. os relatrios de exames microbiolgicos deve ter em mente a saber interpret-lo adequadamente, tanto por desconhecer um como seu potencial patognico e porque muitas vezes estas dvidas antibiograma possam ser um fator determinante do uso inadequado

Cabe ao microbiologista elaborar um laudo claro e objetivo, facilitando a comunicao: Diretamente (telefone ou pessoalmente), indo ao encontro do clnico ou encorajando-o a procurar o laboratrio para discutir casos ou participar de reunies, visitas de enfermaria, etc. Elaborando manuais de coleta, informes sobre perfil de bactrias mais isoladas e padres de sensibilidade (por exemplo em hemoculturas, em urina, ferida cirrgica por especialidade, etc.). Esclarecendo novos padres de relatrios, novos agentes, seu potencial patognico, mudanas de padres (p. Ex. de antibiograma), disponibilidade de recursos diagnstico e orientao teraputica (ex. E-test, testes rpidos com ltex para pesquisa de antgenos, etc.). Microbiologista deve ter em mente os principais agentes etiolgicos correspondentes a cada material enviado, bem como da respectiva flora normal, para adequada interpretao do resultado. Cabe ao microbiologista como membro nato da Comisso de controle de infeco hospitalar: Tomar iniciativa de procurar o mdico ou o paciente para esclarecer dvidas sobre exames e materiais. Estimular e envolver a enfermeira e o infectologista da CCIH ou clnico para a comunicao rpida dos resultados de bactrias resistentes, dos exames relacionados com diagnstico de infeco hospitalar, dos exames de urgncia como de LCR, hemocultura, etc., do diagnstico de doenas de notificao compulsria ou que exijam isolamento, etc. Em resumo, mais do que um retrato do crescimento nas placas de Petri, o laudo microbiolgico deve ser o resultado de uma leitura interpretativa e crtica utilizado como um instrumento de comunicao e interao entre o laboratrio de microbiologia e o mdico.

ANLISE MICROBIOLGICA

O microbiologista na sua rotina diria para decidir a importncia das bactrias ou fungos isolados deve considerar o potencial patognico do agente, a bacterioscopia e o pedido mdico. Bactrias como S. pyogenes, Neisseria gonorrhoeae e Mycobacterium tuberculosis, independente do material que foram isoladas so de importncia clinica e epidemiolgica. Bactrias como Neisseria meningitidis e Haemophilus influenzae, se forem isolado no LCR ou sangue so de importncia indiscutvel, mas quando isolados em mucosas costumam representar flora e seu relato discutvel.

ALGUMAS SUGESTES IMPORTANTES

Como norma, no se deve identificar e fazer antibiograma de bactrias da microbiota de pele e mucosas. No entanto, sempre conveniente entender as sugestes que se seguem como sujeitas a revises conceituais e atualizaes: Conversar com o mdico do paciente ou com o mdico da CCIH ou mesmo com o paciente se indicado. Quando no for possvel a comunicao, relatar os achados da bacterioscopia, se realizada, com identificao sumria (bacilos ou coco-bacilos no fermentadores), ou ao nvel de gnero (enterobactrias e alguns Gram positivos), se o estafilococo aureus ou coagulase negativo, etc. Conservar a bactria por um prazo de 7 a 10 dias deixando a possibilidade de prosseguir nos testes caso necessrio. Mod V - 78

Estudos quantitativos so sempre que possvel mais teis que exames qualitativos, usando ou diluio do material ou semeando com ala calibrada Relatrio quantitativo de bacterioscopia: nmero mdio de bactrias anotadas no mnimo em 10 campos observados. Relatrio qualitativo de bacterioscopia quantificando a presena de: do esfregao corado pelo Gram, descrevendo e

grupos morfolgicos de bactrias (cocos/bacilos/ Gram positivos ou negativos) e predomnio; quando o microbiologista for experiente recomenda-se adicionar o comentrio sugestivo de pneumococo ou haemophilus, etc. bactrias intracelulares (neutrfilos ou fagcitos) fungos leveduriformes em brotamento e hifas, etc.

Finalmente a discusso sobre os materiais provenientes de tecido cutneo-mucosos, o que devemos relatar com antibiograma e o que entender como flora so muito relativos, no havendo unnimidade para padres definitivos de relatrios. sempre conveniente entender que as sugestes que se seguem esto sujeitas a revises conceituais, atualizaes e pequenas adaptaes locais. Como microbiologia uma soma de evidncias (microbiolgicas, clnicas, epidemiolgicas), torna-se impossvel esgotar todas as possibilidades. O que pode e deve ser feito buscar traar linhas mestras para a orientao do raciocnio, deixando que cada caso seja analisado como um exerccio constante do bom senso e cientificamente embasado. Relatrio quantitativo de exame microscpico pela colorao de Gram
Descritivo Classificao nmerica 0 + ++ +++ ++++ Nr. mdio de bactrias, clulas epiteliais, leveduras, neutrfilos /campo 1.000x 0 1-5 6-15 16-30 >30

Ausente Raros Frequentes Numerosos Incontveis

LAUDO PARA O TRATO RESPIRATRIO SUPERIOR

OROFARINGE
importante relatar os achados de bacterioscopia do esfregao corado pelo Gram, descrevendo e quantificando a presena de: Clulas epiteliais Polimorfonucleares (neutrfilos) e/ou mononucleares (linfcitos) Principais grupos morfolgicos de bactrias Presena de bactrias intracelulares (neutrfilos ou fagcitos) Presena de fungos leveduriformes / hifas Associao fuso-espirilar, quando presente Patgenos a serem relatados em isolados de cultura: Streptococcus pyogenes (beta hemoltico do grupo A) Arcanobacterium haemolyticum Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae

Mod V - 79

No caso da Corynebacterium diphtheriae quando solicitado, realizar ou encaminhar para Laboratrio de Referncia: Resultado sem patgenos: Presena de bactrias da microbiota da orofaringe No caso de paciente imunossuprimido, quando solicitado, cultura de vigilncia e se houver predominncia de bactria ou fungo, relatar predomnio de: P. aerginosa, Candida spp., S. aureus, Enterococcus spp., etc.; nestes casos o antibiograma ser feito apenas quando solicitado pela CCIH. Obs: Embora seja um tema polmico na literatura e na prtica microbiolgica, relatar o isolamento de pneumococo, Haemophilus, N. meningitidis, Moraxella catarrhalis em orofaringe, nos casos em que: a bacterioscopia revelar predomnio de neutrfilos (ressalva em imunossuprimidos), presena do agente em neutrfilos/macrfagos e crescimento abundante (ntido predomnio) em relao ao restante da microbiota. a pedido mdico, colocar a seguinte observao: A(s) bactria(s) isolada(s) fazem parte da microbita da orofaringe, no sendo recomendvel uso de antimicrobianos. Consultar infectologista para orientao.

SWAB NASAL
O swab nasal ou de nasofaringe no tem valor diagnstico para sinusite, otite ou infeces do trato respiratrio inferior, no devendo ser processada para estes fins. Pode ser til apenas para pesquisar portadores de S. aureus e Streptococcus pyogenes (beta hemolitico do grupo A).

EPIGLOTE/NASOFARINGE
No caso de epiglotite, no material de nasofaringe ou do local, podem ser isolados o Haemophilus influenzae, o pneumococo e o Streptococcus pyogenes e mais raramente o S. aureus como agente etiolgico. No caso de coqueluche deve-se pesquisar a Bordetella pertussis. Relatar o resultado positivo ou negativo para Haemophilus influenzae, pneumococo, Streptococcus pyogenes, S. aureus e Bordetella pertussis quando pesquisados.

SEIOS DA FACE
Culturas de aspirados intra-operatrios ou obtidas por puno devem ser relatadas: Bacterioscopia - relato quantitativo de bactrias, fungos, neutrfilos e clulas epiteliais. Cultura dos agentes isolados e se houver predomnio de algum (so esperados o pneumococo, H. influenzae, M. catarrhalis, Streptococcus pyogenes e mais raramente o S. aureus). Caso seja sugestivo de contaminao com secreo de nasofaringe (muitas clulas epiteliais, poucos neutrfilos) relatar: sugestivo de contaminao com microbiota de nasofaringe. aconselhavel em sinusite subaguda e crnica a cultura para anaerbios. Quando realizada relatar o resultado. Quando no realizada, comparar a bacterioscopia com o resultado da cultura e relatar sobre a possibilidade de participao de bactrias anaerbias (observadas no Gram, mas que no crescem em aerobiose). A rino-sinusite infecciosa aguda e no complicada na maioria das vezes de etiologia viral. Ressaltando-se os seguintes casos: Em imunossuprimidos e diabticos valorizar o achado de fungos filamentosos do tipo Aspergillus spp. Em pacientes com entubao nasotraqueal ou nasogstrica > que 48h, o material pode revelar presena de enterobactrias, bactrias no fermentadoras, S. aureus, leveduras e polimicrobiana. Devem ser relatados, mas para serem valorizados deve haver clnica ou evidncia radiolgica e material representativo.

OUVIDO
Otite externa: relatar o resultado da bacterioscopia e fazer identificao e antibiograma caso a bacterioscopia de respaldo (abundantes neutrfilos e predomnio do tipo morfolgico isolado na cultura de potencial patgeno) ao isolamento de uma enterobactria ou Pseudomonas ou eventualmente fungo. Mod V - 80

Otite mdia:

Culturas de materiais obtidos por timpanocentese (miringotomia) so ideais, mas raros e devem ser relatados os achados de bacterioscopia e cultura. Swabs, ou aspirados de conduto auditivo em membranas previamente rompidas tem pouco ou nenhum valor diagnstico. Sugerir no coletar este tipo de material. Quando realizada a cultura, havendo crescimento de bactrias da microbiota (Gram positivos, Neisserias, enterobactrias, etc.) relatar: presena de bactrias da flora do conduto externo. No caso da bacterioscopia revelar predomnio de um tipo morfolgico, com abundantes neutrfilos e predomnio na cultura de um agente, relatar: microscopia do esfregao corado pelo Gram com relatrio quantitativo dos elementos celulares (clulas, bactrias e neutrfilos) e qualitativa. Resultado da cultura, quando o agente isolado for Haemophilus, Pneumococo ou M. catarrhalis, relatar o agente isolado e o antibiograma Quando o agente for uma enterobacteria ou Pseudomonas relatar que a bactria isolada sugestiva de contaminao, exceto se for em paciente com entubao nasotraqueal h mais de 48h. A pedido mdico fazer antibiograma. No caso de mastoidite a indicao obteno cirrgica de fragmentos sseos para cultivo e no cultura de secreo de ouvido externo/mdio. Poder se relatado o cultivo deste material quando a bacterioscopia for concordante e a bactria isolada for: Aguda: Haemophilus, pneumococo, S. pyogenes e S. aureus fazer antibiograma Crnica: Enterobactrias, Pseudomonas, S. aureus. Quando isolar Staphylococus coagulase negativa, S. viridans, Corynebactrias, etc, em flora mista, relatar: presena de bactrias da flora do conduto auditivo externo e no fazer antibiograma.

LAUDO PARA ESCARRO O escarro til para diagnstico de tuberculose e para os agentes de algumas micoses pulmonares (blastomicose sul-americana, histoplasmose, criptococose). Pode ser valorizado o agente isolado quando houver correspondncia na bacterioscopia e quando houver poucas clulas epiteliais e numerosos leuccitos. Quando a bacterioscopia revelar mais de 10 clulas epiteliais por campo de pequeno aumento (objetiva de 10x), havendo predomnio sobre leuccitos e sem um tipo morfolgico predominante, relatar: material com sugestiva contaminao de flora de orofaringe. Exame de valor diagnstico prejudicado. No processar o material e solicitar nova amostra. Processar o material que revele menos de 10 clulas epiteliais, quando houver predomnio de leuccitos e predomnio de um tipo morfolgico de bactria. Este critrio mais rigoroso, pois o anterior, para mais de 25 clulas epiteliais, revelou ser mais fidedigno. Os agentes bacterianos esperados em pneumonia aguda da comunidade so: S. pneumoniae, M. catarrhalis, H. influenzae e S. aureus. LAUDO PARA SECREO ENDOTRAQUEAL, LAVADO TRAQUEAL, E LAVADO BRNQUICO

ROTINA PARA LAVADO BRNQUICO, ESCARRO E SECREO TRAQUEAL

Homogeneizar muito bem a amostra, por pelo menos 1 minuto. Fluidificar as secrees traqueais muito espessas com 1,0 ml de soluo salina estril ou com Nacetil-cistena. Pode-se tambm utilizar prolas de vidro estreis na homogeneizao do material. Confeccionar lmina para colorao de Gram. Centrifugar 7 ml e corar o sedimento, quando processar lavado brnquico. Corar o material direto, sem centrifugar, quando processar escarro e secreo traqueal. Fixar cuidadosamente o esfregao seco sobre a chama.

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Observar ao Gram (imerso) a presena de bactrias intracelulares que devem ser reportadas caso ultrapassem 7%. Verificar a presena de clulas estratificadas epiteliais. Mais de 1 clula para cada 10 leuccitos ou mais de 10 clulas em campo de pequeno aumento contra indicam a realizao de cultura, e portanto reportar como Material Inadequado. Confeccionar tambm lminas para colorao de BAAR e pesquisa de fungos, quando necessrio. Plaquear volume de 1 l (ala calibrada) em meios de Mac Conkey, MN, gar Sangue e gar Chocolate (atmosfera CO2). Incubar todas as placas por 24 horas a 35 + 1 C e realizar a primeira leitura quantitativa. Reincubar por mais 24 horas nos casos de difcil diferenciao macroscpica entre colnias. Multiplicar o nmero de cada tipo de colnia identificada pelo fator 103. Interpretar como significativo as contagens > 105 UFC do lavado brnquico, escarro ou secreo traqueal. Realizar antibiograma somente para as colnias com contagens significativas. Liberar apenas a identificao, sem TSA, para microrganismos em contagens inferiores a 105 UFC.

RELATRIO
Quando usar tcnica qualitativa: Quando o material for adequado, mas mais de trs bactrias isoladas, sem predomnio, relatar microbiota mista, presena de (nmero) Gram positivos e (nmero) de Gram negativos. No fazer antibiograma e guardar a placa por sete dias. Quando houver predomnio de uma bactria relatar: predomnio do agente e antibiograma. Presena de outros microrganismos: Gram positivos e/ou Gram negativos, no mximo identificados a nvel de gnero, sem antibiograma. Quando usar tcnica quantitativa: Se houver contagem significativa, com predomnio de um microrganismo e eventualmente 2, relatar o(s) agente(s) isolado(s) e fazer antibiograma. Se a contagem no for significativa ou vrias bactrias da microbiota do trato respiratrio superior foram isoladas relatar: presena de bactrias da flora do trato respiratrio superior sem valor diagnstico. No identificar nem fazer antibiograma. LAUDO PARA LAVADO BROCOALVEOLAR OU ESCOVADO BRNQUICO So considerados junto com a bipsia pulmonar os materiais de melhor valor preditivo de isolamento do agente patognico. imprescindvel a semeadura quantitativa para posterior contagem do nmero de colnias.

ROTINA DE SEMEADURA E INTERPRETAO PARA ESCOVADO PROTEGIDO E BAL

Passar assepticamente a escova para um tubo contendo 1,0ml de soluo salina estril. Homogeneizar muito bem em vrtex por pelo menos 1 minuto. Confeccionar lmina para Gram com pipetor de 10 l ou ala calibrada de mesmo volume. Deixar a lmina secar por 30 minutos dentro da estufa. Completar a fixao do esfregao cuidadosamente sobre a chama. Confeccionar tambm lminas para colorao de BAAR e pesquisa de fungos, quando necessrio. Plaquear 10 l (ala calibrada ou pipetor) em Mac Conkey, MN, gar Sangue e gar Chocolate (CO2). Plaquear 1 l (ala calibrada) em Mac Conkey, MN, gar Sangue e gar Chocolate (CO2) Incubar todas as placas por 24 horas a 35 + 1 C e realizar a primeira leitura quantitativa. Mod V - 82

Reincubar por mais 24 horas nos casos de difcil diferenciao macroscpica entre colnias. Multiplicar a contagem dos tipos de colnias identificadas pelo fator, de acordo com o volume plaqueado. Multiplicar pelo fator 102 quando o volume plaqueado foi 10 l. Multiplicar pelo fator 103 quando o volume plaqueado foi 1l. Quando for conhecido o valor de soluo fisiolgica utilizado na tcnica do BAL, deve-se consideralo como mais um fator de correo. Por exemplo: se forem utilizados 10, 20 ou 100 ml; multiplicar por 10, 20 ou 100, respectivamente. Interpretar como significativo para o diagnstico de pneumonia contagens: 301 UFC para Escovado Brnquico Protegido 401 UFC para BAL Realizar antibiograma somente para as colnias com contagens significativas. Liberar apenas a identificao, sem TSA, para os microrganismos em contagens inferiores significativa. Exemplo de clculo: Cultura quantitativa de BAL, colhido com 10 ml de soluo fisiolgica estril, apresentou crescimento de 80 colonias de Pseudomonas aeruginosa com a ala de 10 L e 8 com a ala de 1 L, alm de 5 colonias de Streptococcus viridans apenas na semeadura com 10 L. Clculo: Pseudomonas aeruginosa

10 (sol. Fisiolgica) x 80 (no de colnias) x 100 (ala de 10L) = 80.000 (ou 8.104 UFC/ml) 10 (sol. Fisiolgica) x 8 (no de col.) x 1000 (ala de 1L)= 80.000 (ou 8.104 UFC/ml)

Streptococcus viridans

10 (sol. Fisiolgica) x 5 (no de col.) x 100 (ala de 10 L) = 5.000 (ou 5.103 UFC/ml)

Relatar: Pseudomonas aeruginosa - 8.104 UFC/ml / com antibiograma Streptococcus viridans - 5.103 UFC/ml / sem antibiograma

RELATRIO DA BACTERIOSCOPIA
Descrever os achados da bacterioscopia do centrifugado, lembrando que ser melhor quando feita em citocentrfuga. Relatar: Relao clulas epiteliais/neutrfilos. Descrever presena de bactrias e, particularmente, se houver presena de microrganismos fagocitados, quanto ao seu padro morfo-tintorial (forma e reao ao gram) e se h predomnio de algum tipo.

RELATRIO DA CULTURA
Culturas quantitativas de amostras do trato respiratrio inferior, relatar: Contagem final do(s) microrganismo(s) isolado(s) Quando isolar um ou at dois microrganismos em contagens significativas (vide parmetros), fazer antibiograma Comentar: contagem bacteriana significativa bom valor preditivo de infeco se a clnica for concordante.

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Quando as contagens no forem significativas ou mais de dois microrganismos isolados e bacterioscopia com predomnio de clulas epiteliais sobre os leuccitos, relatar: Presena de bactrias do trato respiratrio superior - sem valor diagnstico. Contagens bacterianas consideradas significativas Escarro, aspirado endotraqueal, lavado brnquico Escovado brnquico protegido Lavado broncoalveolar (BAL) = = = 105 106 Ufc/ml 103 Ufc/ml 104 Ufc/ml

CANDIDA EM SECREES RESPIRATRIAS

A Pneumonia causada por Candida spp. considerada uma raridade e o diagnstico s pode ser definido por bipsia pulmonar que revele invaso tecidual e no por cultura. muito freqente a presena qualitativa de Candida spp. em todos os materiais obtidos de pacientes com cnula orotraqueal ou traqueostomia. O relato de isolamento de Candida costuma induzir a teraputica desnecessria, com custo elevado, com efeitos colaterais e seleo de cepas resistentes. Mesmo contagens significativas de leveduras devem ser consideradas com cautela, pois pode apenas representar colonizao. Exceo deve ser feita aos recm-natos pr-termo e de baixo peso. Nestes, a mortalidade por candida apresenta nveis bastante elevados e a possibilidade de infeco invasiva deve ser considerada. Outros fungos como Histoplasma, Cryptococcus spp. e mesmo Aspergillus spp. (particularmente em imunossuprimidos) devem ser identificados e relatados. LAUDO PARA PLEURAL Todo o cuidado deve ser tomado para evitar contaminao deste material. A bacterioscopia do sedimento centrifugado muito til para avaliar a presena de bactrias, micobactria e eventualmente fungos, bem como as caractersticas da celularidade. Alguns patgenos encontram-se em pequena concentrao (Haemophilus, pneumococo, Streptococcus pyogenes, S. aureus) ou mais raramente podem ser Anaerbios , fastidiosos ou fungos. Relatar o isolamento de bactrias potencialmente patognicas (acima relacionadas). No caso de Staphylococcus coagulase negativo, Corynebacterium spp., Streptococcus viridans e outras bactrias da flora cutneomucosa, conveniente comparar com os achados da bacterioscopia e na dvida contatar o clnico e solicitar nova coleta com anti-sepsia rigorosa. LAUDO PARA ABSCESSO PULMONAR Os mesmos potenciais patgenos do derrame pleural podem estar presentes, incluindo os anaerbios e fungos e somados s Nocardias, Micobactrias, Bacillus anthracis, etc. O exame microscpico da amostra do material deve ser processado pela microbiologia e pelas tcnicas histolgicas. As coloraes de Gram e Ziehl, exame direto com azul de algodo e se possvel o Giemsa sero muito teis na busca do agente etiolgico e na sugesto de meios de cultura para semeadura, para orientar tempo de incubao, etc. Relatar o isolado se potencialmente patognico. Cautela na liberao de resultados de cultura se exames microscpicos forem negativos e a cultura revelar bactrias potenciais contaminantes de pele. Outras causas de abscesso devem ser consideradas (neoplasia, infarto, etc.). LAUDO PARA OCULAR Os potenciais patgenos devem ser distinguidos dos potenciais contaminantes de mucosas, sendo o recurso mais simples a bacterioscopia do material, quando necessrio concentrado fazendo-se Mod V - 84

uma suspenso do swab em salina e centrifugado em cito-centrfuga. No entanto comum a bacterioscopia ser inconclusiva, tanto pela dificuldade de caracterizar a bactria como pelas outras etiologias (viral, Chlamydia trachomatis, alrgica, qumica, uso prvio de colrios com antibiticos, etc.). Infeces de glndula lacrimal, ordolo e blefarite podem involver amostras de S. aureus. Conjuntivite bacteriana pode ser atribuda N. gonorrhoeae em recm-nascidos. A presena de S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus so outras possibilidades etiolgicas. Isolamento de bactrias como S. aureus ou os outros agentes relacionados, concordantes ou no com a bacterioscopia, desde que no descrito como rarssimas colnias, deve ser relatado e realizado o antibiograma. lcera de crnea pode envolver P. aeruginosa e outros oportunistas inclusive protozorios (Acanthamoeba). Cautela no caso de isolamento de Neisserias saprofitas, Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus viridans, Corynebacterium spp. e outros potenciais habitantes de mucosas. Comparar sempre o resultado da bacterioscopia, com a quantidade de bactrias isoladas, se houve crescimento puro ou quase puro. Relatar: cultura positiva para bactria da microbiota de mucosas sem valor diagnstico. Sugerir nova coleta. Endoftalmite envolve bactrias potencialmente patognicas como S. aureus, P. aeruginosa, pneumococo, Haemophilus spp., N. meningitidis, e outros agentes relacionados a fatores predisponentes como imunossupresso, diabetes, trauma, cirurgia, endocardite, bacteremia, etc. O material dever ser obtido por puno e evitar contaminao. Eventualmente anaerbios e fungos podem estar presentes. O exame microscpico poder ajudar a evidenciar o agente e orientar o meio de cultura mais adequado ou apenas o resultado da cultura poder revelar o agente, que poder ser um dos listados acima. No caso de potenciais contaminantes que crescem em pequena quantidade, sem respaldo da bacterioscopia, identificar o agente e relatar: bacteria da flora de mucosas, papel patognico duvidoso. Guardar a bactria por sete dias para eventual teste de sensibilidade. LAUDO PARA LQUIDO CFALO RAQUIDIANO (LCR) Os agentes clssicos das meningites devem ser relatados bem o antibiograma. A bacterioscopia pode ser relatada sem resultado positivo de cultura quando o microbiologista sentir confiana no diagnstico. No caso de isolamento na cultura de potenciais contaminantes de pele, em caso de meningite bacteriana sem fator predisponente (imunossupresso, cirurgia, etc) e bacterioscopia discordante ou negativa, relatar: O agente isolado com o comentrio: potencial contaminante de coleta. O antibiograma ser realizado apenas a pedido mdico. No cultivar LCR em caldo de cultura, pois aumenta muito a chance de isolamento de contaminantes. LCR obtido pelo shunt: a maioria das infeces em pacientes com shunts, ou derivaes so bactrias da flora cutnea como Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus viridans, Corynebacterium spp. , Neisserias saprofitas e Acinetobacter spp. Neste caso devem ser considerados e relatados. Eventualmente Propionibacterium spp. podem estar envolvidos. Na dvida solicitar novo material para confirmao. Bactria que cresce no caldo e no cresce no gar, se no for fastidioso ou anaerbio em geral contaminante. LAUDO PARA FEZES Os potenciais agentes de diarria so muitos. laboratrio deve listar apenas os agentes pesquisados na sua rotina ou quando especificado pelo clnico relatar o resultado sobre os agentes solicitados. Relatar: Cultura negativa para os seguintes enteropatgenos pesquisados: E. coli clssica, E. coli invasora, E. coli O 147 EHEC, Shigella spp., Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Aeromonas spp. (opcional), Plesiomonas shigelloides (opcional).

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Relatar pesquisa de leuccitos quando realizada pois d suporte a infeces por Salmonella, Shigella e Campylobacter. No caso de realizar cultura para Campylobacter de rotina, inclu-lo no relatrio. Lembrar que diarria/enterocolite em pacientes com mais de 3 dias de hospitalizao e fazendo uso de antimicrobianos pode ser Clostridium difficile, devendo pesquisar a toxina com kits especficos. Diarria com mais de 7 dias de durao em imunocomprometidos pode ser por parasitas (Giardia, Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora belli e em paciente com HIV, complexo do Mycobacterium avium. LAUDO PARA PELE, ABSCESSOS E FERIDAS Abscesso tecido subcutneo Abscesso cerebral Abscesso intranegabdominal Embora sejam os trs materiais abscesso, o microbiologista deve ter em mente expectativa de isolamento de diferentes agentes. Os abscessos fechado e puncionados com tcnica assptica so considerados materiais de bom valor preditivo diagnstico quando revelam bactrias ou fungos. Deve-se, portanto, orientar o mdico para obter material nas melhores condies de assepsia possvel. Encaminhar rapidamente o material para o laboratrio. Para abscessos considerar a possvel participao de anaerbios estritos ou microaerfilos. Quando disponvel fornecer meio de transporte adequado ou orientar para enviar o material na seringa sem agulha. Fazer lmina para bacterioscopia, e, se indicado, exame direto com KOH 10% para pesquisa de fungos, asssim como pesquisa de BAAR para micobactrias. Nos abscessos de tecido subcutneo e cerebral a bacterioscopia pode dar orientao til para escolha dos meios de semeadura ou ajudar no resultado. S. aureus a causa mais importante em abcesso subcutneo, mas em caso de associao com mordida, os fastidiosos devem ser lembrados. No caso de abscesso cerebral, o diagnstico correto e rpido de extrema valia. O exame microscpico pode ser muito til se revelar algum agente. Pode haver participao dos mais variados agentes como bactrias comuns, fastidiosos, fungos, nocardia, micobactrias, etc. Devese procurar semear no maior nmero de meios diferentes, inclusive em caldo tioglicolato. No caso de abscesso abdominal a associao de enterobactrias com anaerbios esperada. Dependendo da histria clnica lembrar de Salmonella e Yersinia. No caso de abscesso de tecido subcutneo o resultado ideal quando concordante com a bacterioscopia e revelando agente potencialmente patognico. O S. aureus e Streptococcus beta hemolticos causam mais celulite, mas podem ser isolados em abscessos, sendo as enterobactrias raras. No caso da cultura revelar bactrias da microbiota, mas concordante com a bacterioscopia (S. viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Coryneformes, etc,); liberar o resultado com o antibiograma. No caso de bacterioscopia negativa ou discordante e, principalmente em abscesso drenando h alguns dias, liberar o resultado fazendo restries sobre a possibilidade de contaminao; a bactria isolada possivelmente representa contaminao pela microbiota da pele, assim, guardar a bactria por sete dias e no fazer o antibiograma. No caso de abscesso cerebral se o exame microscpico revelar possvel agente, o clnico deve ser imediatamente comunicado e informado do andamento dos exames de cultura. Tanto bactrias potencialmente patognicas como possveis contaminantes de pele ou mucosas podem ser isoladas, mas o clnico deve estar informado e o teste de sensibilidade poder ser feito de qualquer destas bactrias.

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Os abscessos abdominais polimicrobianos da comunidade em geral respondem teraputica emprica e no exigem a identificao de todas as bactrias anerbias facultativas e anaerbias estritas. Importante relatar quando isolar enterococcus ou enteropatgenos ou bactrias no comuns ou nos casos de insucesso teraputico; indica-se identificar os agentes isolados e fazer o antibiograma.

FERIDA / LESO CUTNEA

Em geral estes materiais so feridas de origem na comunidade. O relatrio de cultura de ferida aberta ou leso depende muito de saber se a coleta foi adequada removendo secrees superficiais ou no. Relatar quando isolar S. pyogenes, S. aureus e fastidiosos em condies clnicas concordantes (mordida, acidente com gua, terra, etc). Enterobactrias e Pseudomonas podem ser contaminantes ou patognicos. Deve-se relatar o achado, mas colocar como ressalva a possibilidade de contaminao. Streptococcus contaminao viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Coryneformes, etc., sugerem

D respaldo a possibilidade de isolamento de agente patognico quando so atendidos os seguintes requisitos: Coleta bem feita. Bacterioscopia concordante com a cultura e Ocorrem muitas colnias de uma mesma bactria, isoladas em cultura pura ou em ntido predomnio.

FERIDA CIRRGICA
So esperadas bactrias endgenas ou tipicamente de origem hospitalar (Enterobacterias, S. aureus, Pseudomonas, etc). Para o relatrio de cultura e indicao de antibiograma deve-se contar com coleta bem feita, e os resultados devem ser comunicados a CCIH. Neste caso infeces polimicrobianas so comuns, devendo-se considerar os gneros predominantes. Deve-se guardar as cepas isoladas por perodo maior (mnimo 30 dias) para eventual investigao de surto e fazer antibiograma com ateno para pesquisa de bactrias multiresistentes.

DRENO / FSTULA
So materiais que no deveriam ser coletados, pois na maioria das vezes representam colonizao dos drenos. Mesmo fstulas de osteomielite no so adequadas. Nos casos em que a bactria encontrada j tenha sido isolada de procedimento com menor risco de contaminao (bipsia, puno, etc.) e persiste, relatar o achado e fazer antibiograma. Para os demais casos relatar os gneros que predominaram na cultura, sem antibiograma e que representam possvel contaminao. Guardar as bactrias por sete dias. Considerar que fstulas expontneas podem revelar presena de micobacteriose, micoses, actinomicose, etc.

BIPSIA
As bipsias devem seguir critrios cirrgicos de antissepsia. Assim representam material de bom valor preditivo diagnstico. O material dever em condies asspticas ser triturado em gral e semeado qualitativa e quantitativamente para posterior clculo aproximado do contedo bacteriano por grama de material. Utilizam-se as seguintes amostras: tecido, material de queimadura, material sseo. Condies que do segurana para liberao do resultado e antibiograma:

Condies adequadas de coleta, transporte e processamento preliminar. Bacterioscopia concordante com achados de cultura. Cultura pura ou predomnio de algum germe em particular. Contagens >104 UFC/g tecido

Para os demais casos:

Bacterioscopia negativa ou discordante

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Culturas polimicrobianas Isolamento de bactrias da flora cutneo-mucosa (Streptococcus viridans, Staphylococcus coagulase negativo, corineformes, Neisseria spp., etc) Baixas contagens < 104 UFC/g de tecido; relatar o(s) agente(s) isolado(s), sua contagem sem antibiograma e guardar a(s) bactria(s) por sete dias.

GNGLIO
O gnglio quando infectado pode revelar agentes importantes de doenas localizadas ou sistmicas, de origem: bacteriana (incluindo os fastidiosos), raramente anaerbios; e micobacteriose, fungos, protozorios e vrus. Cabe ao laboratrio aproveitar ao mximo. Uma parte ser enviada para estudo histolgico e o restante do material dever ser triturado e realizado exame microscpico (Gram, direto com KOH 10%, Giemsa) e culturas para bactrias (em meios ricos), fungos e micobactrias; caldo BHI com suplemento (pode ser o balo de hemocultura) e tioglicolato com suplemento. Procurar identificar o gnero e espcie com segurana e na dvida encaminhar a laboratrio de referncia. No caso de isolamento de bactrias da flora cutneo-mucosa e sem correlao com a bacterioscopia relatar o achado sem antibiograma e guardar a bactria por sete dias. Contactar o clnico e o patologista, e se persistir a suspeita de etiologia bacteriana, quando possvel, solicitar nova amostra. LAUDO PARA GENITAL

URETRAL
Os principais agentes etiolgicos das uretrites esto bem estabelecidos: Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma spp. Ureaplasma spp. Herpes simplex (vrus) Colher sempre lmina para bacterioscopia: Trichomonas: colher urina e centrifugar para fazer pesquisa no sedimento imediatamente aps a coleta. Chlamydia: o diagnstico melhor imunolgico (Imunofluorescncia) Mycoplasma e Ureaplasma: existem meios especficos e kits muito prticos com cultura semiquantitativa por avaliao visual de mudana de cor. No resultado da cultura importante comparar com a bacterioscopia e estar alerta para no dar falsos resultados de N. gonorrhoeae confundindo com Neisserias saprfitas e Acinetobacter. Quando isolar Staphylococcus coagulase negativo ou outras bactrias da flora genital relatar: Presena de bactrias da flora genital, no fazer antibiograma. Sugerir, quando no realizado, a pesquisa de Chlamydia e Micoplasma. Quando isolar enterobactrias, Enterococcus em cultura pura ou em grande quantidade e for concordante com a bacterioscopia, relatar o isolamento com antibiograma e concluir: Bacteria raramente isolada como agente de uretrite; sugerimos investigar outras causas como Chlamydia, Micoplasmas, Trichomonas etc. Mais raramente: Trichomonas vaginalis Haemophilus spp. outros

VAGINAL
As principais causas de vaginite so: vaginose, Candida spp. e Trichomonas vaginalis. Em meninas e pacientes na menopausa ou deficientes hormonais, enterobactrias, S. aureus e mesmo bactrias da flora podem eventualmente estar relacionadas com a sintomatologia. A bacterioscopia sempre til para observar: Mod V - 88

presena de leveduras presena e quantidade de neutrfilos presena e predomnio de bactrias presena de Gardnerella spp. e Mobiluncus spp., e outros anaerbios que caracterizam a vaginose, associados s clue cells (clulas caractersticas do epitlio vaginal abarrotadas de bactrias). A bacterioscopia tambm til: Quando isolar Candida spp. e for caso de doena recidivante interessante (quando disponvel) a identificao de espcie, podendo ser necessrio tambm o teste de sensibilidade (mais fidedigno e prtico) Quando isolar Streptococcus beta hemoltico do grupo A, Streptococcus agalactiae , enterococos, Listeria spp. Quando a bacterioscopia for normal, com raros neutrfilos, presena de clulas epitelias e bacilos de Doderlein, e houver crescimento de raros Gram positivos e/ou raras enterobactria, relatar: Presena de bactrias da flora vaginal normal Se isolar numerosas colnias de enterobactrias ou S. aureus e a bacteriocopia sugerir alterao de flora, relatar: Presena de bactrias da flora vaginal com predomnio de: por exemplo, E. coli, Enterococcus spp, S. aureus, etc.

ENDOCERVICAL
A cultura de secreo endocervical pode ser til para isolamento de N. gonorrhoeae quando houver suspeita. Deve-se recomendar a pesquisa de Chlamydia trachomatis nos casos de cervicite. O isolamento de enterobactrias, enterococcus, etc. pode significar alterao de microbiota por diferentes causas, mas o achado deve ser relatado, para considerao do mdico. No caso da bacterioscopia revelar presena de freqentes, numerosos ou incontveis neutrfilos (++ a ++++) e presena de bactrias com a morfologia e Gram concordantes com as bactrias encontradas na cultura, relatar: Alterao da flora endocervical/vaginal com a presena das bactrias isoladas com antibiograma - lembrando que outras causas devem ser investigadas e/ou afastadas antes de iniciar o tratamento especfico No caso de material endometrial e amnitico, fazer cultura para anaerbios e bacterioscopia. No caso de no realizar cultura para anaerbios, relatar a bacterioscopia e o resultado da cultura. Destacar a possibilidade de anaerbios se visualizar bactrias no Gram sem correspondente crescimento.

ESPERMA E/OU FLUDO PROSTTICO

aconselhavel para elaborar um laudo adequado : Fazer bacterioscopia do esperma e da secreo prosttica Verificar contagem de leuccitos Semear com ala calibrada de 10 L e fazer contagem de colnias Relatar os achados de bacterioscopia, contagem de leuccitos e bactria isolada em contagens = 103 Ufc/ml. No caso de enterobactrias, enterococos e Pseudomonas fazer antibiograma. No caso de isolamento de estafilococos, Streptococcus spp., Corynebacterium spp. e outras bactrias da flora uretral, principalmente em prostatite crnica, sugerir a pesquisa de outros agentes (Chlamydia, Micoplasma, Trichomonas, virus, etc.), sem liberar antibiograma. LAUDO PARA URINA Para a interpretao da urocultura, algumas informaes so consideradas teis: Se o paciente apresenta sintomas de infeco urinaria, Leucocitria Gestante, Idade/sexo Tipo de coleta: jato mdio, coletor, puno de sonda vesical em sistema fechado, puno supranegpbica, etc. Uso prvio de antibiticos coleta da presente amostra, etc.

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URINAS COLETADAS POR JATO MDIO

Quando estas urinas so submetidas a cultura sem informao clnica especfica sugere-se que contagens de colnias < 105 UFC/ml possam tambm causar infeco, somente se um nico microrganismo e potencial patgeno for isolado. Provveis contaminantes so: difterides, Streptococcus viridans, Lactobacilos, estafilococos coagulase negativa e outros que no sejam classificados como Staphylococcus saprophyticus. Contagem de colnias 105 UFC/ml:
Um provvel patgeno Definitivamente identificar ao nvel de espcie e realizar o teste de sensibilidade (antibiograma). No caso de paciente assintomtico solicitar nova amostra, pois se trata de provvel bacteriria assintomtica. No caso da presena de outras espcies em contagens < 104 UFC/ml, relatar nmero de microrganismo(s) presente. Um provvel contaminante (difterides, S. viridans, lactobacilos, estafilococos coagulase negativa e outros que no sejam Staphylococcus saprophyticus.) Realizar uma identificao limitada: por exemplo distinguir entre S. saprophyticus de outros estafilococos coagulase negativa, ou Streptococcus agalactiae (grupo B) de Streptococcus viridans . No fazer antibiograma e sugerir nova coleta. raro, mas no impossvel, ocorrer infeco urinria por bactrias da microbiota da uretra ou vagina. Para caracterizar ITU h necessidade de confirmar o achado com nova urocultura, e que esteja associada a sintomas. Sintomas e leucocitria podem tornar muito provvel o diagnstico. Sem sintomas pode ser bacteriria assintomtica ou falha grosseira na coleta. Enumerar outras espcies eventualmente presentes em < 104 UFC/ml. Dois provveis patgenos (com um diagnstico deinfeco do trato urinrio crnica ou recorrente) Dois provveis patgenos (com sintomas de ITU) Definitivamente identificar ao nvel de espcie. Realizar o teste de sensibilidade (antibiograma).

Identificar ao nvel de espcie. Realizar o teste de sensibilidade (antibiograma). Solicitar nova amostra para confirmao.

Mais que dois microrganismos

Reportar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura.

Contagem de colnias 105 UFC/ml:

Um provvel patgeno Para pacientes sob antibioticoterapia, grvidas, recm-nascidos, com infeco urinria de repetio, realizar identificao e teste de sensibilidade. Um potencial patgeno presente em > 102 UFC/ml em mulheres sintomticas e >103 UFC/ml em homens sintomticos, fazer identificao e antibiograma. Um provvel contaminante Leuccitos normais: descritivamente identifique o isolado. Leuccitos aumentados: solicite nova amostra.

Mais que dois microrganismos Sem informao clnica

Relatar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura.

Descreva o microrganismo presente entre 104 e 105 UFC/ml, com base na morfologia. Entre em contato com o paciente e/ou mdico. Solicite informaes e/ou a coleta de nova amostra. Caso o contato no seja possvel, mantenha a cultura a temperatura ambiente por 3 dias para possvel retomada de identificao, se requerido pelo mdico do paciente.

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URINAS COLETADAS POR CATETERIZAO

Contagem de colnias 104 UFC/ml:
Dois ou mais provveis patgenos Um ou dois provveis contaminantes Realize a identificao e teste de sensibilidade de ambos os isolados. Descritivamente identifique as espcies presentes em <104 UFC/ml. Reportar o(s) microrganismo(s) presente(s) com descrio do tipo(s) morfolgico(s), exemplo, difterides, Streptococcus do grupo viridans. Reportar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura. Identificar o provvel patgeno e fazer antibiograma. Fornecer o tipo morfolgico do provvel contaminante.

Um provvel patgeno e um provvel contaminante Trs ou mais microrganismos

Fornecer uma descrio dos tipos morfolgicos. Reportar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura.

Contagem de colnias <104 UFC/ml: Para pacientes sob antibioticoterapia, mulheres sintomticas, homens sintomticos, realizar identificao e teste de sensibilidade. Para todos os outros pacientes, fornea uma descrio do(s) tipo(s) morfolgico(s) presente(s) e requeira nova amostra. Mantenha a cultura a temperatura ambiente por 3 dias para se necessrio retomar o processamento de identificao se requerido pelo mdico do paciente. Obs.: Uroculturas com candida provenientes de pacientes sondados so utilizadas como critrio para a troca da sonda. Sugere-se nova coleta de urocultura aps 24 horas. Caso o isolamento de Candida seja mantido, deve-se relatar, pois poder haver necessidade de instituir terapia especfica.

URINAS COLETADAS POR PUNO SUPRAPBICA

Um ou dois patgenos presentes Trs ou mais patgenos presentes Sem crescimento Identifique ao nvel de espcie. Realize o teste de sensibilidade do provvel agente patognico. Identifique. Mantenha a cultura por trs dias para possvel consulta. Examine em at 48 horas de incubao. Reporte Sem crescimento, teste com sensibilidade de > 102 UFC/ml em 48 h - (para semeadura de 10l).

OBSERVAES
No realizar cultura de ponta de sonda vesical. Critrio de positividade pode ser aplicado sempre que isolar 105 UFC/ml de um s agente, devendo a presena de sintomas caracterizar a infeco do trato urinrio e a ausncia como bacteriria assintomtica. Realize pesquisa para anaerbios somente em punes supra-pbicas, quando solicitado. No realize de rotina o teste de sensibilidade diretamente da amostra de urina, embora em situaes de urgncia da disponibilidade do antibiograma isto possa ser feito. Em caso de dvida na interpretao da urocultura, se possvel, entre em contato com o paciente e/ou mdico para maiores informaes, conferindo as condies de coleta. Isto no sendo possvel, relate o numero de diferentes microrganismos encontrados e sua contagem e solicite nova amostra. Mod V - 91

LAUDO PARA SANGUE Em caso de bacteremia, septicemia, ou febre a esclarecer, deve-se sempre que possvel colher duas amostras de sangue venoso (perifrico) de locais diferentes. Se o paciente tiver cateter, colher mais uma amostra obtida do cateter. Bactrias isoladas no sangue perifrico do tipo S. aureus, Streptococcus pneumoniae, enterobactrias, P. aeruginosa e Candida albicans, tem elevado valor preditivo de infeco. Enterococos tem significncia clnica em 80% dos casos Streptococcus viridans entre 40 a 60%:

1 cultura positiva em duas obtidas muito provvel uma contaminao 2 ou mais culturas positivas muito provvel a infeco 1 colhida e positiva. Colher nova amostra 2 amostras colhidas e positivas verificar se so da mesma espcie ou se tem mesmo antibiograma. Se diferirem na espcie e/ou nitidamente no antibiograma provvel que houve contaminao de coleta. No liberar antibiograma. 2 amostras colhidas e 1 positiva solicitar nova amostra provvel contaminao. No fazer antibiograma. 2 amostras colhidas e identificadas como da mesma espcie e com mesmo antibiograma Liberar resultado da cultura e antibiograma e destacar: Bactria da flora cutnea. Instituir tratamento especfico se evidncias clnicas de infeco. Se o paciente estiver com cateter, possvel colonizao.

Staphylococcus coagulase negativa entre 20 a 40%:

Outras bactrias isoladas de em uma nica amostra e sugestivas de contaminao: Micrococcus spp., corineformes, Propionibacterium spp., Bacillus spp. Hemoculturas positivas e repetidas para bactrias potencialmente contaminantes podem ser consideradas patognicas quando afastada a contaminao por cateter. Considerar a hiptese de endocardite. Quando houver suspeita de fastidiosos ou fungos ou micobactrias conservar as hemoculturas por 30 a 40 dias. Relao entre idade e volume ideal de sangue a ser coletado
Idade < 1 ms 1 ms a 2 anos > 2 anos a 10 anos Adolescente Adulto volume 1-2 ml 2-3 ml 3-5 ml 10-20 ml 40 ml

PONTA DE CATETER
Fazer cultura qualitativa no se justifica para diagnstico de bacteremia. Deve-se relatar o nmero de colnias isoladas e a(s) bactrias isolada(s) pela tcnica semi-quantitativa de Maki. Quando maior que 15 colnias, identificar, mas no fazer antibiograma. Se a hemocultura for positiva fazer antibiograma da hemocultura. No caso de bacteremia, a remoo do cateter e envio da ponta para cultura se justifica quando a amostra de hemocultura for colhida no prazo de 24 h. Considerando que a colonizao de cateter muito comum, se no houver bacteremia no se se justifica identificar bactrias do cateter e fazer antibiograma, exceto se houver indicao de monitoramento dos cateteres pela CCIH. Caso a hemocultura seja negativa, no se justifica trabalhar com bactrias do cateter. As tcnicas de investigao de contaminao da luz do cateter justificam-se quando se deseja descobrir fonte de bacteremia, fungemia, abscessos em mltiplos orgos, etc.

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10. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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