-

TOXICOLOGIE -

METODE CROMATOGRAFICE

Lambadarie Ioana Anamaria Farmacie, An IV, gr.5

Cromatografia
Cromatografia grupeaz o variat i important grup de metode care permit separarea unor compui foarte asemntori din amestecuri complexe, bazate pe distribuia repetat a moleculelor ntre o faz mobil i una staionar. Metoda cromatografic a fost descoperit de botanistul rus Mihail Tsvet, n 1906 i a fost folosit nti pentru separarea unor substane colorate pe coloan sau ca eluate colorate. Cromatografia este una dintre cele mai frecvent utilizate metode pentru a realiza separri analitice. Aplicaiile cromatografiei cresc cu timpul, n mare parte datorit faptului c ea i gsete aplicaii n toate ramurile tiinei. Este rapid, simpl, cu costuri relativ reduse i variabilitate mare la alegerea metodei de separare. Metodele cromatografice sunt bazate pe adsorbtia amestecului de substante pe un material adsorbant (faza stationara), urmata de desorbtia succesiva (cu ajutorul unui dizolvant adecvat eluant) a componentelor din amestec. n toate separrile cromatografice proba este dizolvat ntr-o faz mobil: gaz, lichid sau fluid supercritic. Aceast faz este frecvent numit eluent, iar dup ce trece de captul coloanei se numete eluat. Faza mobila (eluentul) are rolul de a deplasa diferentiat componentele amestecului, n functie de stabilitatea lor n eluent si de afinitatea componentelor pentru faza stationara. Faza stationara (suportul) este o substanta (sau amestec de substante) solida, un film subtire sau lichid aplicat pe suprafata unui suport solid prin legaturi chimice. Faza stationara este o pulbere fina, are o porozitate si o suprafata specifica mare si se foloseste la separarea pe baza unui proces de adsorbtie diferentiat pentru diferitele componente din amestec. Coloana de adsorbant poate fi nlocuit, n unele variante cu o foaie de hrtie poroas preparat n mod special (cromatografie pe hrtie) sau cu un strat subire de adsorbant fixat pe o plac de sticl, cu ajutorul unui liant (cromatografie n strat subire). O analiz cromatografic se rezum n general la urmtoarele concepte fundamentale: proba este dizolvat n faza mobil; faza mobil este trecut peste faza staionar nemiscibil; aceasta se numete eluie; spalati de eluent, o parte din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara. Efectul, este numit retentie si aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata, adica moleculele migreaza in grupuri, in fiecare grup existand doar molecule de acelasi fel.
2

 Aceasta face posibila sesizarea componentilor pe rand, la parasirea coloanei, de catre un instrument, in grupurile respective denumite uneori zone. Instrumentul este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (in mod ideal la oricare) dintre componentii ce ies din coloana. Acest analizor, denumit detector este capabil sa dea un semnal proportional cu masa sau concentratia solutiei de component in faza mobila, semnal ce poate fi inregistrat in functie de timp. In consecinta, dispozitivul marcheaza trecerea fiecarei din substantele ce formeaza initial proba. Diagrama semnal, functie de timp sau de volumul de eluent se numeste cromatograma. Pe cromatograma distingem o serie de maxime, numite picuri. Cromatografia poate fi utilizata pentru determinari analitice calitative si cantitative ale speciilor separate. - Analiza calitativa cromatografica furnizeaza informatii asupra timpului de retentie al componentelor analizate si pozitia acestora pe faza stationara dupa un timp de elutie specific. - Analiza cantitativa cromatografica furnizeaza informatii asupra cantitatii tuturor componentelor analizate, pe baza relatiei existente ntre naltimea sau suprafata picurilor cromatografice si cantitatea de substanta analizata. Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor asemntoare. Ea poate fi de asemenea utilizat pentru determinri cantitative i calitative ale speciilor separate, n termeni de informaie calitativ, o cromatogram furnizeaz timpul de retenie al speciilor sau poziiile acestora pe faza staionar dup un timp de eluie specific. Cromatografia poate fi extrem de util pentru recunoaterea prezenei sau absenei unor componeni n amestec ce conine un numr limitat de specii cunoscute. Confirmarea identitii servete i pentru alte investigaii, i nu n ultimul rnd cromatografia servete ca precursor pentru alte analize chimice calitative sau pentru analize spectroscopice.

Clasificarea metodelor cromatografice

S-au realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele in primul rand prin natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se disting: a. Cromatografia de lichide (LC)- cand faza mobila este un lichid in cadrul careia se distinge: o Cromatografia de lichide pe coloana deschisa o Cromatografia de lichida pe coloana inchisa b. Cromatografia de gaze (GC) cand faza mobila este un gaz c. Cromatografia cu fluide supracritice - la care faza mobila este un lichid aflat peste temperatura critica.
3

In cadrul cromatografiei de lichide (LC) se disting mai multe variante, in functie de mecanismele de separare: 1. Cromatografia de schimb ionic n cromatografia de schimb ionic moleculele sunt separate pe baza sarcinii lor nete. Faza staionar este o rin schimbtoare de ioni (un polimer reticulat cu multe grupri funcionale ncrcate electric) iar faza mobil este o soluie apoas. Moleculele sunt ntrziate n micarea lor de-a lungul coloanei, depinznd de semnul i mrimea sarcinii lor. Are loc repetat legarea electrostatic a moleculelor la gruprile cu sarcini opuse ale rinii schimbtoare de ioni i ruperea acestor legturi. Ideal, proba este aplicat pe coloan la un pH la care moleculele au sarcina opus celei a gruprilor rinilor, astfel nct moleculele se leag la coloan. pH-ul tamponului de eluie este apoi schimbat, astfel schimbndu-se i sarcina net a moleculelor. Cnd moleculele i gruprile funcionale ale rinii poart sarcin de acelai semn, moleculele sunt respinse de gruprile rinii i sunt eluate de pe coloan. Moleculele pot fi, de asemenea, eluate de pe schimbtorul de ioni prin creterea triei ionice a eluentului. Schimbtorii de ioni pot fi cationici sau anionici, depinznd de ionul pe care l schimb. O rin care are grefate grupri negative i schimb ioni pozitivi este un cationit i vice versa pentru un anionit. Fiecare schimbtor este clasificat ca puternic sau slab, n funcie de tria ionizrii gruprilor funcionale. Un schimbtor cu o grupare aminic cuaternar este un schimbtor anionic bazic puternic, n timp ce grupri aminice secundare alifatice sau aromatice duc la un schimbtor anionic bazic slab. Un cationit acidic puternic conine grupri acidice sulfonice. Denumire Grupare funcional Matrice Clas Schimbtori anionici AG 1 Tetrametlamoniu Polistiren Puternic AG 3 Amin teriar Polistiren Slab DEAE-celuloz Dietilaminoetil Celuloza Slab PEI-celuloz Polietilenimin Celuloza Slab DEAE-Sephadex Dietilaminoetil Dextran Slab QAE-Sephadex Dietil-(2-hidroxipropil)Dextran Puternic aminoetil Schimbtori cationici AG 50 Sulfonil Polistiren Puternic Bio-Rex 70 Carboxil Acrilic Slab CM-celuloz Carboximetil Celuloz Slab P-celuloz Fosfat Celuloz Intermedi ar
4

CM-Sephadex SP-Sephadex

Carboximetil sulfopropil

Dextran Dextran

Slab Puternic

Abilitatea unui schimbtor de ioni de a adsorbi contraioni este definit cantitativ de capacitate. Capacitatea total a unui schimbtor de ioni este cantitatea de grupri ncrcate sau potenial ncrcate per unitate de mas de material uscat. Capacitatea unui schimbtor ionic este funcie i de porozitatea rinii. Porozitatea rinii depinde de gradul ei de reticulare. Rinile pur sintetice

(polistirenice sau acrilice) au o reticulare ntre 2 i 16%, cu 8% fiind cele mai bune n acest scop.

2. Cromatografia de afinitate Metoda se bazeaz pe interaciuni specifice, n general de natur biologic, ntre molecule diferite, adic pe afinitatea pentru un ligand. Liganzii pot fi, de exemplu, anticorpii specifici unei proteine, hormonii pentru receptorii lor, substrate, inhibitori competitivi, coenzime (sau structuri conformaionale foarte apropiate) pentru enzime, etc. Ligandul este imobilizat (legat covalent) pe o matrice insolubil (derivai de dextrani, celuloz, agaroz, silicai, etc.) apoi ansamblul este introdus ntr-o coloan cromatografic. Soluia proteica se aplic pe coloan i se formeaz agregate protein-ligand specifice; celelalte proteine, nelegate se elueaz de asemenea specific (introducnd n eluent un compus pentru care proteina are afinitate mai mare), sau labiliznd legtura protein-ligand prin modificarea forei ionice, a pH-ului, a temperaturii, etc.

3. Cromatografia de gel-filtrare (de excludere, sit molecular)

n acest tip de cromatografie faza staionar const din particule sferice de gel cu mrime i porozitate controlat (polimeri reticulai) i este in general folosit sub form de coloan. Faza mobil este lichidul trecut prin coloan. Moleculele sunt fracionate pe baza mrimii i formei lor. Aceti doi parametri determin i viteza i extinderea difuziunii moleculelor. Moleculele mai mici difuzeaz mai uor n porii particulelor de gel dect cele cu dimensiuni mari, avnd aceeai form general. Cu ct penetrarea n pori este mai mare, cu att mai ntrziat va fi micarea moleculelor prin coloan. Micarea n interiorul i n afara particulelor de gel are loc repetat pe msur ce materialul se mic prin coloan. Moleculele care sunt mai mari dect porii particulelor de gel sunt excluse din gel i se mic mai rapid prin spaiul dintre particulele de gel. Astfel, pentru moleculele care au aproximativ aceeai form, cu ct este mai mic masa lor molecular, cu att micarea lor este mai nceat de-a lungul coloanei i necesit un volum
7

de eluie mai mare. Principalul factor de separare n gel-filtrare este masa molecular a particulelor.

Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un gel spre a putea fi utilizat n cromatografia de gel-filtrare sunt: matricea gelului s fie inert chimic gelurile trebuie s fie stabile fizico-chimic trebuie s prezinte un coninut mic n grupri ionice pentru a evita efectele de schimb ionic s aib grad de umectare mare s poat fi realizabil obinerea unei game largi de tipuri de gel cu aceeai constituie chimic, dar cu porozitate i mrime a particulelor diferit pentru a acoperi diferite domenii de fracionare
8

mrimea particulelor i distribuia pe mrimi a particulelor s fie riguros controlat granulele gelului s fie rigide, stratul cromatografic s nu se compacteze i s opun rezisten la eluie

4. Cromatografia de adsorbtie Este utilizata pentru separarea substantelor organice cu molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti atat prin cromatografie pe coloana cat si pe hartie. Metoda utilizeaz o faz staionar solid i o faz mobil care este un lichid (sau un gaz). Ca faza stationara cel mai des utilizate sunt silicagelul, alumina, iar ca faza mobile diferite amestecuri de solvent organici. Acest tip de cromatografie se bazeaz pe partitia substanelor dizolvate ntre faza de adsorbant fix si faza lichida mobila. Fiecare din substanele dizolvate este supusa la o for de retenie (adsorbie) i o for de respingere n faza mobil. Echilibrul rezultat duce la o migrare difereniat a substanelor dizolvate din eantion, permind separarea lor. Adsorbtia moleculelor la suprafata fazei stationare se datoreaza stabilirii unor legaturi secundare de tip dipol-ion, dipol-dipol, forte van der Waals.

5. Cromatografia de partitie lichid-lichid Aceasta metoda cromatografica se bazeaza pe repartitia diferentiata a fiecarei molecule intre doua lichide nemiscibile, dintre care unul reprezinta faza stationara (imobilizata pe un suport solid, intr-o coloana; aici suportul solid este inert fata de componentele din proba) si unul faza mobila. O molecula foarte solubila in faza stationara va migra incet, forta de retentie fiind mai puternica decat cea de respingere. Invers, o molecula solubila in faza mobila va migra repede. Este utilizata in principal ca metoda calitativa.

6. Cromatografia pe coloana deschisa sau cromatografia planara (PC) In aceasta metoda cromatografica faza mobila circula printr-un material poros dispus intr-un plan si formand un strat relativ subtire, dar de compozitie asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe coloana. Se disting: a. Cromatografia pe hartie tehnica in care faza stationara este o hartie poroasa din celuloza (initial o hartie de filtru) care este irigata de solvent prin forte capilare. b. Cromatografie pe strat subtire (TLC) - in care faza stationara pulverulenta este fixata de suportul plan (sticla, aluminiu, material plastic) cu un liant, formand un strat subtire (0.1 0.5 mm) de asemenea irigata prin capilaritate.

10

11