TINCIONES HEMATOLGICAS

La realizacin de extensiones y tinciones es prctica habitual en el laboratorio. Pese a no realizarse a todas las muestras, al no ser considerado procedimiento de rutina, es necesario en aquellos casos en los que se detecte mediante anlisis previos alguna alteracin. La correcta realizacin, as como una buena interpretacin de lo observado, permite en muchos casos el diagnstico de hematopatas. 1. INTRODUCCIN. Las tinciones hematolgicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin de las estructuras que componen las clulas sanguneas. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las clulas sean visual izadas microscpicamente con mayor facilidad. 2. TIPOS DE TINCIONES. Las tinciones hematolgicas pueden clasificarse segn distintos criterios:
y

Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que se pretende colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales. Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el diagnstico hematolgico, se dividen en tinciones tradicionales y especiales.

2.1. TINCIONES VITALES Y NO VITALES. Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas. Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son

colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol. 2.2. TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES. Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que con frecuencia derivan de la anilina (tinciones tradicionales o clsicas). Estos colorantes se renen en 4 grupos:
y

Colorantes cidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina. Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno. Colorantes neutros: son sales de un cido y de una base coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno. Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias que tienen un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante. Uno de ellos es el Sudn III empleado para teir las grasas.

Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas. Una coloracin es panptica cuando se

utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrmica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematolgicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que l prepar. Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante cido (eosina) y de colorantes bsicos (tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilacin oxidatiya (colorantes tipo azur). Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que ms frecuentemente se emplean en el diagnstico hematolgico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinacin con la de May-Grnwald). Tambin hay tinciones panpticas rpidas que producen una coloracin fcil y rpida de las estructuras celulares. Las tinciones especiales slo se usan en circunstancias especficas. Son de dos clases:
y

Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las clulas y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiacin visible, de un color caracterstico. Los fluorocromos ms utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro. Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, ms o menos abundante, o la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos.

Sirven para reconocer clulas leucocitarias (normales o anmalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente

permite atribuir el origen de unas clulas leucocitarias inmaduras a la lnea granuloctica o a la monoctica. 3. DENOMINACIN DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS. Atendiendo a sus apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de las siguientes formas:
y

Estructuras acidfllas u oxifilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza cida.

Si el colorante cido que captan es la eosina, se dice que son eosinfilas. Con las tinciones tradicionales adquieren un color rosado.
y

Estructuras basfllas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina.

Con las tinciones tradicionales adquieren un color azulado. Si se tien de lila o prpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurfllas. 4. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES REALIZADAS A FROTIS SANGUNEOS. Si la tincin de una extensin sangunea es demasiado rosa, probablemente esto se deba a:
y y y y

Un pH bajo del colorante. Un tiempo de coloracin insuficiente. Un lavado excesivamente prolongado. Si la tincin es demasiado azul, posiblemente, esto est causado por: un grosor excesivo de la extensin, o un pH alto del colorante. Una coloracin excesivamente prolongada. Un lavado insuficiente.

y y

Si tras la tincin aparecen artefactos o/y precipitados en la extensin, probablemente esto se deba a:
y y y y y

Un empleo de portaobjetos sucios. Una falta de filtracin del colorante. Una coloracin excesivamente prolongada. Un secado del colorante durante la tincin. Un lavado insuficiente.

Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teidores automticos de las extensiones sanguneas. Actualmente, no suelen emplearse en la prctica clnica. 5. TINCIN GIEMSA. Las tinciones hematolgicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de oxidacin (azur A, azur B y azur C) como colorantes bsicos, combinndolos con la eosina como colorante cido. De este modo, obtenemos una tincin diferencial, es decir, una tincin que es capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares segn se tian stas con el colorante cido, con el bsico o con la mezcla de ambos. Segn la proporcin de azul de metileno y de eosina que compongan el colorante tendremos distintos mtodos de tincin. Entre ellos, los ms conocidos son el mtodo de Giemsa, el de Wright, el de Leishman y el pan ptico de Pappenheim.
Metdica

Es un extracto de las tcnicas de tincin hematolgicas de la casa Panreac.

Fundamento

Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa.
Material necesario
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Microscopio ptico. Portas bien limpios. Cristalizador. Puentes de tincin. Pipetas Pasteur con chupete. Frascos lavadores. Tubos de ensayo.

Reactivos
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Colorante en solucin segn Giemsa de Panreac. Solucin tampn pH 7,2 de Panreac. Metanol. Aceite de inmersin.

Muestra

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. El anticoagulante de eleccin es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sdico y el oxalato potsico pueden dar preparaciones defectuosas.
Tcnica
y

Preparamos un frotis sanguneo segn la tcnica descrita con anterioridad. Colocamos el frotis sobre el puente de tincin, en el cristalizador y en posicin horizontal.

Cubrimos el frotis con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis. Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno segn Giemsa con 2 ml de solucin tampn pH 7,2. Es importante realizar esta dilucin en el momento de la tincin, ya que el colorante precipita y no es vlido para otro da. Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frotis con la dilucin de colorante, dejndolo actuar durante 25 minutos. Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampn pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posicin vertical.

Lectura de resultados

Una vez seca la tincin, echamos una gota de aceite de inmersin y examinamos al microscopio ptico con el objetivo de 100 x. Los eritrocitos se tien de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta. Los neutrfilos presentan el ncleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulacin de un color violeta rojizo. 6. TINCIN DE WRIGHT.
Metdica

Extracto de las tcnicas de tincin hematolgica de la casa Panreac.

Fundamento

El colorante utilizado es una solucin de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10 al 25%) junto con otros derivados del alcohol metlico. Dada la presencia de metanol en la composicin del colorante, no es necesario un paso previo de fijacin antes de la coloracin. Slo si se van a guardar las extensiones sin teir de un da para otro precederemos a su fijacin para evitar el deterioro del frotis.
Material necesario
y y y y y y y

Microscopio ptico. Cristalizador. Puentes de tincin. Pipetas Pasteur con chupete. Frasco lavador. Guantes. Tubos de ensayo.

Reactivos
y y y

Solucin de eosina-azul de metileno segn Wright. Solucin tampn pH 7,2. Aceite de inmersin.

Muestra

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes ms adecuados son la heparina y el EDTA.
Tcnica

y y

Realizar un frotis sanguneo muy fino. Dejar secar al aire. Sobre la extensin colocada horizontalmente en el puente de tincin verter 1 ml de eosina-azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solucin tampn pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posicin vertical. Inmediatamente antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solucin tampn pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con esta dilucin la extensin. Teimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua del grifo. Volvemos a lavar con solucin tampn pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posicin vertical.

Lectura de resultados

Depositamos una gota de aceite de inmersin y observamos con el objetivo de 100 x. Las clulas se observan coloreadas de la misma manera que con la tincin de Giemsa. 7. TINCIN PANPTICO RPIDO.
Metdica

Extracto de la tcnica Panptico rpido de la casa QCA.

Fundamento

Este mtodo de tincin diferencial es un sistema que ana la policroma y la calidad que proporcionan los mtodos clsicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecucin (15 segundos solamente). Frente a las tcnicas de tincin descritas anteriormente, donde el colorante se extenda sobre el frotis, sta presenta la peculiaridad de ser un mtodo de inmersin, donde el frotis se sumerge en la solucin colorante durante un tiempo determinado.

Material necesario
y y y

Cubetas de Wertheim o similares. Cestillo para portas. Frasco lavador.

Reactivos
y y y y

Solucin n 1: Solucin alcohlica de triarilmetano. Solucin n 2: Solucin tamponada de xanteno. Solucin n 3: Solucin tamponada de tiazina. Agua destilada.

Muestra

Frotis sanguneo preparado recientemente y que se ha dejado secar al aire.

Tcnica

En tres cubetas de Wertheim o similares se disponen los colorantes solucin n 1, n 2 y n 3.

y

Colocamos los frotis en el cestillo para portas y lo sumergimos en la cubeta con la solucin n 1 durante 1 segundo. Repetimos la inmersin cuatro veces (en total 5 segundos). Dejamos escurrir. Sumergimos a continuacin otras cinco veces, cada una de un segundo de duracin, en la cubeta con la solucin n 2. Dejamos escurrir. Finalmente, sumergimos otras cinco veces de un segundo cada una en la cubeta con la solucin n 3. Lavamos con agua destilada y dejamos secar.

Lectura de resultados

Depositamos una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100 x. Las coloraciones obtenidas en las clulas sanguneas son similares a las de la tincin de Wright y Giemsa. Sin embargo, podemos variar la intensidad de la tincin modificando el nmero de inmersiones en los colorantes n 2 y n 3, segn se desee destacar las tonalidades rosas o las azules.
Notas sobre el mtodo
y

Las cubetas con las soluciones colorantes, especialmente la del n 1, debern guardarse siempre bien tapadas, con el fin de evitar una evaporacin excesiva que podra inducir a desviaciones de color respecto a las tinciones habituales. Antes de agotar el contenido de una cubeta, debemos ir adicionando una nueva cantidad de solucin colorante para mantener, da a da, un nivel apropiado del mismo. De vez en cuando se debe renovar todo el contenido de la cubeta. En aquellos laboratorios con pequeo nmero de frmulas hemticas, las cubetas de Wertheim pueden ser sustituidas ventajosamente por pequeos frascos de cristal con tapn a rosca.