Biologie Celulara si Histologie

Curs 5 Tehnici de biologie moleculara si inginerie genetica

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cuprins

The Human Genome project Tehnici de genetica moleculara

Secventierea acizilor nucleici PCR Clonarea unor gene Vectori Transfectii Animale transgenice; linii knock-out

Aplicatii ale ingineriei genetice

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

The human genome project

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

The human genome project

Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 2003 Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health

Partener major: Wellcome Trust (UK) Alte contributii: Japonia, Franta, Germania, China etc

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

The Human Genome Project

Obiective
Identificarea

25000)

tuturor genelor din ADN-ul uman (in total 20-

Determinarea Crearea

intregii secvente de nucleotide din ADN-ul uman (aprox. 3 miliarde) unor baze de date cu aceste informatii de instrumente pentru analiza and tehnologiilor catre sectorul privat

Perfectionarea Transferul

Identificarea

problemelor legale si etice care pot aparea si propunerea de solutii

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Continutul informational al genomului uman

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Probleme speciale legate de identificarea si localizarea genelor

Centromerii contin secvente cu grad inalt de repetitivitate, dificil de mapat cu tehnicile actuale Telomerele contin la randul lor secvente repetitive, de multe ori sunt incomplete / se pierd partial la replicarea ADN-ului Existenta multigenelor locusuri cromozomiale care contin gene multiple, corelate functional si intricate, dificil de identificat individual Aprox. 93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent; studiul telomerelor si centromerilor ramane limitat de tehnologia actuala

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomul 1

Cel mai mare dintre cromozomii umani; contine aprox. 8% din informatia genetica Boli genetice:

Parkinson Alzheimer Charcot-Marie Tooth (neuropatie ereditara)

In cancer apar frecvent modificari ale regiunilor sale terminale

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 2 si 4

Au cea mai mica rata de recombinare dintre cromozomii umani Cromozomul 2 unic prin provenienta (fuziunea a 2 cromozomi ancestrali) Cromozomul 4:

Boala Huntington Boala polichistica

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 3, 5, 6

Cromozomul 3

Cea mai scazuta rata de duplicare segmentala Zone implicate in diferite cancere

Cromozomul 5

Redundanta informationala mare, continut genetic scazut Implicat in atrofia musculara spinala

Cromozomul 6

Contine cea mai mare secventa de codificare a ARN-t (activitate transcriptionala) Gene implicate in cancer, schizofrenie, autoimunitate
Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomii 7, 8, 9

Cromozomul 7

Gena CFTR - implicata in fibroza chistica

Cromozomul 8

Contine o gena implicata in cresterea dimensiunii creierului la primatele mari

Cromozomul 9

Gene implicate in transsexualitate spontana (reversie de sex mascul femela) Gene tumorale: leucemii, melanoame familiale etc
Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomii 10, 11, 12, 13

Cromozomul 10

Cromozomul 11

Tumori, boli neurologice

Unul dintre cei mai bogati in gene Numarul cel mai mare de gene ptr receptori olfactivi

Cromozomul 12

Cromozomul 13

Leucemii, limfoame, alte cancere 2 gene asociate diabetului Gene implicate in tulburari psihiatrice

Contine gena cancerului de san (de tip II) Contine gena asociata retinoblastomului

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 14, 15, 16, 17

Cromozomul 14

Cromozomul 15

Gene pentru ARNr in bratul scurt

Unul din cromozomii cu rata mare de duplicare segmentala

Cromozomul 16

Cromozomul 17

Duplicare segmentala mare Gene implicate in boala polichistica renala, leucemii acute

Cea mai mare diferenta de structura dintre un cromozom uman si cromozomi similari mamalieni

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 18, 19, 20, 21

Cromozomul 18

Cromozomul 19

Translocarea 14-18 este una din cele mai comune cauze genetice de cancer la oameni

Gene implicate in hipercolesterolemia familiala si diabetul insulino-rezistent

Cromozomul 20

Cromozomul 21

Contine gene prionice (boala Creutzfeld-Jacob) Implicat in diabetul zaharat de tip II, obezitate, cataracta, boala Graves

Cel mai mic cromozom O copie suplimentara (trisomie) determina sindromul Down

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 22, X, Y

Cromozomul 22

Implicat in schizofrenie, alte boli psihiatrice

Cromozomul X

Cromozomul sexual feminin

Cromozomul Y

Cromozomul sexual masculin

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Exemplu cromozomul 21

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Baze de date

NCBI Human Genome Sequencing Progress

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/

University of California (Santa Cruz)

http://genome.ucsc.edu/

Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute & EMBL-European Bioinformatics Institute

http://www.ensembl.org/

EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's Nucleotide Sequence Database)

http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Aplicatii, beneficii din urma HGP

Medicina moleculara:

Diagnostic timpuriu al bolilor / predispozitiilor la o boala Design rational de medicamente Terapie genica Farmacogenomica

Aplicatii energetice si de ingineria mediului

Aplicatii de genomica microbiana pentru a obtine biocombustibili, sisteme de detectare a poluantilor, tehnici de purificare a mediului

Bioarheologie si antropologie Medicina legala Agricultura

Genetically modified foods (GMF)

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Patentarea genelor, secventelor genetice

Se poate face atunci cand:

Este identificata o noua secventa genetica Este specificat produsul (proteina) secventei genetice respective Este specificata functia produsului respectiv Este dezvoltata o metoda de valorificare a produsului genei, care poate fi utilizata de specialisti din domeniu

Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani Patentarea prespune si punerea la dispozitie a intregii informatii referitoare la produsul patentat Informatii suplimentare (argumente pro/contra, situatia legala in USA etc):
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Tehnici de genetica moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Secventierea ADN

Reprezinta succesiunea de proceduri utilizate pentru identificarea secventei de nucleotide intr-un lant de and Metode de baza:

Secventierea chimica (Maxam Gilbert)

Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea lantului la nivelula cestor modificari Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADNproteine etc)

Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)

Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer (secventa de ADN care serveste ca punct de plecare a polimerizarii), ADN-polimeraza si nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate prin electroforeza pe gel si autoradiografie / fotografie UV
Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Alte metode de secventiere

Electroforeza capilara

Dye-termination method
DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Clonare in vectori bacterieni

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Secventierea ADN
Metoda shotgun

Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici Fiecare fragment este folosit ca matrita pentru crearea unor fragmente noi, care difera de original printr-o singura baza (care urmeaza a fi identificata intr-o etapa ulterioara) Fragmentele dintr-un set sunt separate prin electroforeza pe gel Markeri fluorescenti de generatie noua permit separarea fragmentelor din cadrul aceleiasi benzi de migrare in gel Se identifica ultima baza azotata din fiecare fragment se recreaza astfel secventa originala de A T C G pentru fiecare fragment Rezultatele sunt analizate de sisteme de secventiere automate, obtinandu-se o cromatograma in 4 culori, cu varfuri corespunzatoare celor patru baze azotate Dupa citirea bazelor, secventele scurte sunt reconstituite pe calculator si este analizata structura lor din punctul de vedere al tipului de informatie genetica stocata.

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Exemplu (principiu de baza)

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

PCR = polymerase chain reaction

Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN Necesita:

Fragmentul de ADN-ul care se doreste a fi amplificat Primeri = secvente de nucleotide complementare celor doua capete ale lantului de ADN ADN-polimeraza Nucleotide Buffer, ioni divalenti

Utilizare:

Secventializarea ADN-ului (citirea informatiei genetice) Clonari Scopuri diagnostice Crearea de plasmide, vectori pentru utilizarea in ingineria genetica Scopuri criminalistice

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

PCR

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Clonari de gene

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Clonari de gene

Clonare moleculara = izolarea unei anumite portiuni de ADN si realizarea de copii multiple ale acesteia

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf
DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Vectori
Sunt

molecule de ADN utilizate pentru transferarea de material genetic strain intr-o celula de vectori:

Tipuri

Plasmide Bacteriofagi, alte virusuri Cromozomi artificiali

Transferul

de material genetic intr-o celula = Transfectie

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Plasmide

Fragmente de ADN dublu spiralat, de obicei circulare Capabile de autoreplicare Se pot integra sau nu in genomul celulei gazda Origine bacteriana / sinteza in vitro Utilizare in transfectii, terapie genica
Wikimedia Commons

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf
DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Vectori virali

Bacteriofagi virusuri care infecteaza bacterii Retrovirusuri se integreaza in genom, se replica o data cu celula gazda Lentivirusuri (subclasa a Retrovirusurilor) Adenovirusuri nu se integreaza in genom, nu se replica o data cu celula gazda (utilizare limitata; genereaza un raspuns imun puternic utilizare in crearea de vaccinuri)

CONDITII DE UTILIZARE: Nepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene Toxicitate redusa pentru celulele pe care le infecteaza Stabilitate sa nu prezinte mutatii frecvente Specificitate pentru o anumita linie celulara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Vectori virali
Bacteriofag

Vector lentiviral
Wikimedia Commons Wikimedia Commons

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomi artificiali
Cromozomi Cromozomi Cromozomi

de drojdie (YAC yeast artificial chromosome) bacterieni (BAC) umani (HAC) functioneaza ca un cromozom suplimentar (47), sunt multiplicati la diviziunea celulara; pot fi utilizati pentru introducerea in celula de gene noi

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Transfectii

Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu ajutorul unui vector Metode:

Utilizarea unor plasmide + a unei modalitati de destabilizare temporara a membranei celulare, pentru a permite intrarea ADN-ului plasmidic in celula

Metoda fosfatului de calciu (istorica; functioneaza!) Utilizare de lipozomi in care este inclus plasmidul, si care fuzioneaza cu membranele celulare Utilizare de polimeri cationici de care se ataseaza ADN-ul, care ulterior sunt introdusi in celule prin endocitoza Electroporare, ultrasonoporare, magnetoporare, soc termic etc.

Utilizarea de vectori virali:

Transfer mai simplu; are loc infectia celulelor care vin in contact cu virusul modificat genetic, infectie care se propaga rapid in toata cultura de celule

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Animale transgenice

Crearea, in scopuri de cercetare, a unor linii de animale de laborator (soareci, sobolani etc), ce prezinta o anumita mutatie a unei gene Utilitate:

Modele pentru anumite boli Studierea implicarii anumitor gene in anumite lanturi de control, in aparitia anumitor maladii

Expert Reviews in Molecular Medicine, Vol. 5; 7 April 2003 Generation of YAC-transgenic mice Kenneth R. Peterson

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Linii knock-out

Linii de organisme modificate genetic (de obicei soareci), la care una sau mai multe gene au fost blocate de la expresie Utilizate in studiul patogeniei unor boli

Wikimedia Commons

Wikimedia Commons Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Aplicatii ale ingineriei genetice

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Aplicatii ale ingineriei genetice

Screening genetic Vaccinuri Sinteza de proteine in vitro (ex: insulina!) Terapie genica GMF/O

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Screening genetic

Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane Aplicatii:

Screening al purtatorilor (identificarea persoanelor care poseda o gena din doua necesare transmiterii unei boli genetice) Diagnostic prenatal Teste in perioada presimptomatica la persoanele cu risc pentru boli genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de san, etc) Medicina legala

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Terapie genica

Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa inlocuiasca gena cu defect cauzatoare a unei boli genetice Cum se introduce gena?

Vectori:

Retrovirusuri Adenovirusuri Virusuri herpes simplex

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Terapia genica

Probleme actuale de rezolvat:

Durata scurta a efectului in prezent, integrarea genei in genom este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie Controlul raspunsului imun declansat de prima sedinta de terapie, accentuat la repetarea sedintei Probleme speciale legate de vectorii virali efecte adverse nedorite (raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun, posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul gazdei) Bolile multigenice dificultati in identificarea tuturor genelor implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea tuturor regiunilor de genom implicate

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Terapia genica

Rezultate semnificative in prezent:

2008: UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital NIHR Biomedical Research Centre ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de cecitate 2007: University of Texas M. D. Anderson Cancer Center and the University of Texas Southwestern Medical Center - un studiu pe soareci, cu o combinatie de terapie genica + tehnici nanotehnologice de introducere a genelor au indus scaderea semnificativa a volumului unor tumori pulmonare 2006: National Cancer Institute (NCI) au obtinut limfocite modificate genetic care ataca cu succes celule tumorale de melanom malign 2006: tratarea cu succes prin terapie genica a unor pacienti suferind de sindroame mieloide 2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare Alte rezultate promitatoare deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Farmacogenomica

Studiul felului in care bagajul genetic al unui individ afecteaza raspunsul organismului la medicamente

http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm

Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica