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TALLER SUBREGIONAL

SOBRE ASEGURAMIENTO DE CALIDAD Y VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS


Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

VALIDACIN

Es la confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica prevista
VERIFICACIN

Es la confirmacin mediante el aporte de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

VALIDACION DEL METODO


Es el proceso para establecer las caractersticas de funcionamiento y limitaciones del mtodo y la identificacin de influencias que pueden cambiar estas caractersticas y hasta que punto; cuando el mtodo se desarrolla sin un problema particular previsto
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Definicin de la aplicacin, propsito y alcance del mtodo Sustancias y matrices

Protocolo evaluado y autorizado por el Supervisor Materiales, patrones y reactivos especificados Caractersticas de equipos Diseo de experimentos
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DISEO VALIDACION

Cualitativo o cuantitativo, LD, LC, rango lineal, precisin y exactitud Parmetros de rendimiento y criterio de aceptacin

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Experimentos de pre-validacin Ajustar parmetros del mtodo

Mtodo aprobado incluirlo en el Manual de Procedimientos Analticos

EJECUCION
POE para ejecutar el mtodo en la rutina

Ajustar criterios de aceptacin Realizar experimentos de validacin interna en forma completa

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Criterios para aceptacin datos y revalidacin. Requisitos seguridad. Conclusiones Experimentos y resultados Objetivo y alcance (aplicabilidad, tipo) Sustancias y matriz Drogas, reactivos, patrones y controles Lista equipos y requisitos funcionamientos y rendimiento Control calidad, Curva de calibracin, Incertidumbre

INFORME

Preparacin muestra, estadstica y clculos Parmetros del mtodo y crticos Controles de calidad patrones y drogas
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FORMATO PROCEDIMIENTO DE VALIDACION En todas las hojas en el encabezado o al pie de pgina debe constar los siguientes datos:
Organismo Laboratorio Ttulo: Validacin de..... Cdigo: PP (Procedimiento particular nmero) Pgina 1 de Versin: 1 Fecha de entrada en vigencia:

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FORMATO PROCEDIMIENTO DE VALIDACION CONTENIDO Objetivo Alcance Areas afectadas Responsabilidades Relaciones Desarrollo Registro y Archivo Anexos Histrico Referencias

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SUSTANCIAS que se pueden determinar MATRICES y en la presencia de qu interferencias CONDICIONES NIVELES DE PRECISIN y EXACTITUD que se pueden lograr Proceso para verificar que un mtodo es ADECUADO para ese PROPSITO
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VALIDACIN DE INSTRUMENTAL

Proceso para establecer que un instrumento opera segn la especificacin Se logra mediante calibracin o control del funcionamiento
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ADECUADO PARA EL PROPSITO

Proceso de medicin que le permiten al usuario tomar decisiones tcnica y administrativamente correctas para un propsito preestablecido
BUENOS RESULTADOS ANALTICOS

Pueden identificarse 6 principios de la prctica analtica, los cuales cuando se implementan simultneamente, conducen a una buena prctica
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1. Mediciones analticas deben satisfacer requisito acordado

2. Utilizar mtodos y equipos probados que aseguren son aptos para un determinado propsito 3. Personal que realiza las mediciones competente y calificado 4. Verificacin externa y peridica de la competencia tcnica del laboratorio 5. Mediciones analticas realizadas en un laboratorio consistentes con las que se realizan en otro 6. Quienes efectan mediciones analticas deben tener POE de control de calidad y de aseguramiento de la calidad
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Razones para validar un mtodo


Si el resultado de un ensayo no es confiable, no es til y es mejor no realizarlo El cliente recurre a un laboratorio porque necesita resolver un problema y confiar en los resultados
El analista tiene que garantizar que los resultados son adecuados para el uso destinado, para resolver el problema del cliente y expresados de manera que l pueda entenderlos y utilizarlos para tomar decisiones
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Razones para validar un mtodo cont.


La validacin del mtodo demuestra que el mtodo utilizado es adecuado para el propsito

Implica que se conoce el comportamiento del mtodo, que se evala la incertidumbre, de modo que el usuario est seguro del grado de confianza que puede tener el resultado
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Acciones para validar un mtodo


1. Conjunto de pruebas utilizadas para establecer que un

mtodo es apropiado para un determinado propsito

equipos que cumplen con las especificaciones, que funcionan y que estn calibrados correctamente; que el operador est capacitado para tomar decisiones apropiadas durante los estudios

2. Est implcito que los estudios se realizan utilizando

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Criterios segn categora de mtodo


Categora I: cuantificacin de materia prima o principio activo en producto terminado Categora II: determinar impurezas en materia prima o compuestos de degradacin en producto terminado y anlisis de residuos en material biolgico o alimentos Categora III: determinar las caractersticas funcionamiento como disolucin o liberacin de droga de

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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS CRITERIOS SEGUN CATEGORIA

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Criterios segn tipo de mtodo


Mtodo Normalizado Modificacin de Mtodo Normalizado Comprobar que el Laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente Mtodo Interno

Comprobar que el Laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente Exactitud Repetibilidad Incertidumbre Lmite de Deteccin (si la Norma lo indica)

Comprobar que el Laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente Exactitud Repetibilidad Reproducibilidad Son suficientes para el objetivo de aplicacin

Exactitud Repetibilidad Reproducibilidad No difieren del original

mtodo

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Mtodo Normalizado Determinar: Intervalo de trabajo Linealidad Recuperacin Robustez Selectividad Estabilidad Reproducibilidad Modificacin de Mtodo Normalizado Determinar: Intervalo de trabajo Linealidad Recuperacin Robustez Selectividad Estabilidad Reproducibilidad Mtodo Interno

Determinar: Selectividad Linealidad Exactitud Intervalo de trabajo Repetibilidad Reproducibilidad Estabilidad Lmite deteccin Lmite cuantificacin Recuperacin Robustez Sensibilidad Incertidumbre

S E G U N M E T O D O

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En todos los casos Realizar Carta de control con los resultados de materiales de referencia Controles Intralaboratorios Participar en ensayos interlaboratorios
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EXACTITUD Es la cantidad que se refiere a las diferencias entre la media de una serie de resultados o un resultado individual y el valor que se acepta como verdadero o valor correcto, para la cantidad medida
[IUPAC Compendium of Chemical Technology, 1985]]]

Proximidad entre el resultado de una medicin y el valor verdadero Grado de concordancia entre el resultado de ensayo y el valor de referencia. Se obtiene determinando la veracidad y la precisin
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VERACIDAD (SESGO) Grado de concordancia entre el VALOR MEDIO OBTENIDO de una serie de mediciones y el valor de referencia. Se expresa como sesgo

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Analizar un MRC con matriz igual a la muestra Si no hay MRC realizar ensayo de recuperacin, mnimo 10 repeticiones del ensayo 3 das consecutivos Comparar el promedio de los valores obtenidos (X) con el valor de referencia certificado, considerar la incertidumbre del material. La diferencia da el sesgo del mtodo: s = X - MRC

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VALOR Valor aceptado que sirve como referencia de comparacin previamente acordado y el cual deriva de: A. Establecido o terico, basado en principios cientficos B. Asignado o certificado, basado en el trabajo experimental de organizaciones nacionales e internacionales C. Consensuado o certificado, basado en trabajo experimental colaborativo D. Cuando a), b) y c) no es posible, la medicin de una cantidad [ISO Nora Angelini Dra. 3534-]
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VALOR VERDADERO Es el consistente con la definicin de una cantidad particular dada


[VIM 1993]

VALOR VERDADERO CONVENCIONAL Atribuido a la cantidad particular y aceptada, algunas veces por convencin, que tiene una incertidumbre adecuada para el propsito dado
[VIM 1993]
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PRECISION Es la proximidad entre resultados de anlisis independientes obtenidos bajo condiciones estipuladas Depende slo de la distribucin de los errores aleatorios y no se relaciona con el valor verdadero o valor especificado. Se computa como desviacin estndar de los resultados de [ISO 3534-1] los anlisis

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VERACIDAD (SESGO) Y PRECISION VALOR VERDADERO


X X X X X X MAS VERAZ MENOR SESGO MENOS PRECISO XXXXXX MENOS VERAZ MAYOR SESGO MAS PRECISO

CONCENTRACION (X)
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DESVIACION ESTANDAR Es la medida de cmo se dispersan los valores alrededor de la media en la distribucin de valores: La desviacin estndar W para toda la poblacin de valores n En la prctica usualmente se analiza una muestra y no la poblacin, la desviacin estandar de la muestra esta dada por

s DS: { ( (xi x )2 /n-1}1/2

donde i: 1 a n
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LINEALIDAD Define la capacidad del mtodo para obtener los resultados de los anlisis proporcionales a la concentracin de la sustancia El Rango Lineal es por inferencia del rango de concentraciones de la sustancia en el cual el mtodo da resultados del anlisis proporcional a la concentracin de la sustancia [AOAC-PVMC] Se verifica mediante la obtencin de coeficientes de correlacin mayores o iguales a 0,995
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RANGO (cont.) Determinar el intervalo de concentracin de analito en el cual el mtodo es aplicable Dentro del intervalo de trabajo puede haber un intervalo en el que la respuesta del sistema de deteccin es lineal. Interesa conocerlo para determinar el modo de calibracin Cuando se utiliza algn tipo de instrumentacin es til considerar la sensibilidad y el umbral de discriminacin
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INTERVALO DE TRABAJO Es el intervalo entre el nivel ms bajo y ms alto de concentracin que ha sido demostrado que puede ser determinado con la precisin y la exactitud requeridas para una determinada matriz CURVA DE CALIBRACION Es la representacin grfica de la seal de medida como una funcin de cantidad de la sustancia [AOAC-PVMC]

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Para ello
a) Preparar un blanco y 4 -6

concentraciones diferentes del analito o 4 -6 muestras fortificadas

b) Representar

seal la obtenida en funcin de la concentracin y determinar el mbito lineal y los extremos superior e inferior del intervalo de trabajo

c) Repetir los pasos a) y b) dentro del mbito lineal y efectuar un estudio estadstico de los resultados obtenidos
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LINEALIDAD TETRACICLINAS
900 800 700 600 500 400 300 00 00 0 0
42 95 1 98 290 390 780

Ce ietecrrec n0 9 o ic n o lai ,99

00

00

300

k

400

500

C ON C E N T R A C I ON

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COEFICIENTE DE CORRELACIN Es un parmetro cualitativo, adimensional, da una idea primaria sobre la bondad del modelo lineal Para tener una idea ms confiable se deben realizar anlisis grficos de residuos CRITERIOS Mtodos Cuantitativos Respuesta lineal 0.99, DS de residuales 0.1 Respuesta no lineal 0.98 Mtodos Criba o Screening Respuesta lineal 0.98, DS de residuales 0.2 Respuesta no lineal 0.95

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DISCRIMINACION Es la capacidad de un instrumento de medicin para responder a pequeos cambios en el valor del estmulo Puede depender del ruido (interno o externo), friccin, amortiguamiento , inercia, etc

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SENSIBILIDAD Es el cambio en la respuesta del instrumento de medicin dividido por el cambio correspondiente en el estmulo El estmulo puede ser cantidad de analizado presente Tambin se aplica al mtodo analtico globalmente, teniendo en cuenta otros factores tales como el efecto de los pasos de extraccin y purificacin
[VIM 1984 y IUPAC Orange Boo

AREA = 1
ng/g
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BLANCO El valor obtenido cuando el analito no est presente en la muestra durante la medicin. Si existe una seal o valor medido para el componente se debe a factores ajenos y debe ser descontado del valor de la medicin cuando sta se realiza con el analito presente

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CONFIRMACIN DE LA IDENTIDAD Establecer que la respuesta del instrumento se atribuya slo al analito en estudio y no a la presencia de interferencias. Usar tcnicas distintas Se aplica al anlisis cualitativo y cuantitativo Analizar muestras, patrones y materiales de referencia por el mtodo en estudio y otros mtodos independientes Usar los resultados de las tcnicas complementarias para evaluar la capacidad del mtodo en confirmar la identidad del analito
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SELECTIVIDAD El grado en que otras sustancias interfieren con la determinacin de una sustancia de acuerdo con un procedimiento dado
[IUPAC Compendium of Chemical] T

Trmino recomendado en qumica analtica para expresar el grado en que un mtodo puede determinar un analito en presencia de interferencias de otros componentes Se desaconseja el empleo del trmino especificidad para el mismo concepto, dado induce a confusin
Codex Alimentarius, ALINORM 04/23]
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Para ello Analizar blancos de al menos 20 matrices diferentes Analizar varias interferencias probables en presencia del analito de inters Examinar el efecto de interferencias, ver si incrementa o inhibe la deteccin o cuantificacin del analito Si ocurre esto, es necesario trabajar ms en el desarrollo del mtodo
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LIMITE DE DETECCION Es el contenido ms bajo que se puede medir con seguridad estadstica razonable
[AOAC- PVMC]

Es necesario slo para decisiones cualitativas, si la sustancia est presente o no a) 3 veces la dispersin (DS) del Blanco

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LD cont. b) 2,5 a 5 veces la relacin seal/ruido del equipo de medida que utiliza c) la concentracin cL o la cantidad qL, es la medida ms pequea xL que se puede detectar con seguridad razonable

xL = x bl +

S bl

x bl media de las medidas de las muestras blanco (MB) S bl desviacin estndar de las medidas de la MB k factor numrico de acuerdo al nivel de confianza de trabajo
[IUPAC, 1985]
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FALSOS NEGATIVOS/ POSITIVOS Para mtodos cualitativos, se puede determinar la proporcin de falsos positivos/negativos Comparar con mtodo confirmatorio, si es aplicable a las mismas matrices y al mismo rango de concentracin FALSO POSITIVO Probabilidad que la concentracin real de una sustancia en la muestra de laboratorio sea menor que el valor lmite aceptado, mientras que las medidas realizadas en una (1) o ms porciones de muestra, indican que la concentracin excede ese valor. Valores aceptados para esta probabilidad estn entre uno (1) a cinco (5) por ciento (%) [Codex Alimentarius, ALINORM 01/24A] Dra. Nora Angelini
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FALSO NEGATIVO Probabilidad que la concentracin real de una sustancia en la muestra de laboratorio sea mayor que el valor lmite aceptado mientras que las medidas realizadas en UNA (1) o ms porciones de muestra, indican que la concentracin no excede ese valor. Los valores aceptados para esta probabilidad estn en el rango de uno (1) a cinco (5) por ciento (%)
[Codex Alimentarius, ALINORM]

En ausencia de un mtodo para realizar la comparacin, se deben analizar las poblaciones de muestras negativas o positivas fortificadas
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Se pueden determinar los falsos positivos/negativos como sigue a continuacin:


Proporcin falso positivo (%)= falso positivo x 100

total negativos
Proporcin falso negativo (%)= falso negativo x 100

total positivos
[AOAC Research-Institute - Performance tested Methods Programme] Procedure Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

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LIMITE DE CUANTIFICACION Los lmites de cuantificacin son las caractersticas de realizacin que marcan la capacidad de un proceso de medidas qumico para cuantificar la sustancia en forma adecuada
[IUPAC Orange book]

Puede establecerse como 6 10 veces la DS del blanco o 3 veces el LD

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LC (cont.) LQ =
Q x

WQ, donde

LQ es el lmite de cuantificacin WQ es la desviacin estndar en ese punto k


Q

es el factor cuya inversa multiplicada por el RSD iguala

al cuantificando seleccionado El valor por defecto que expresa para k Q es 10


[IUPAC Orange book]
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MATERIAL DE REFERENCIA (MR)

Es el material o sustancia en el cual Uno(1) o ms valores de sus propiedades son homogneos y estn bien definidos para permitir utilizarlos para la calibracin de un instrumento, la evaluacin de un mtodo de medicin o la asignacin de valores
[ISO/IEC Guide 30-1992, 2.1]

MR CERTIFICADO (MRC)

Es el MR cuyas propiedades estn certificadas con rasteabilidad a la unidad en la que se expresan y se acompaa de la incertidumbre, con la indicacin de un nivel de confianza

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RECUPERACION Es la fraccin de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del anlisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar, el porcentaje de recuperacin (%R) se calcula %R = [(CF-CU)/CA] x 1 CF concentracin de la sustancia medida en la muestra fortificada CU concentracin de la sustancia medida en la muestra sin fortificar CA es la concentracin de la sustancia agregada (valor terico) en la muestra fortificada
[AOAC-PVMC]]

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RECUPERACION (cont.) CF concentracin de la sustancia medida en la muestra fortificada: 170 ng/kg CU concentracin de la sustancia medida en la muestra en la muestra sin fortificar: 10 ng/kg CA es la concentracin de la sustancia en la muestra fortificada (valor terico): 200 ng/kg %R = [(1 - 1 )/ 2 ]x1 = [(1 )/ 2 ]x1 =

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REPETIBILIDAD Es la precisin bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, los resultados de anlisis independientes se obtienen con el mismo mtodo en muestras idnticas en el mismo laboratorio por el mismo operador utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo
[ISO 3534-1]
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REPETIBILIDAD (cont.)
CONCENTRACION ug/ g REPLICADOS
SEMANA 1 RECUPERACIONES SEMANA 2 RECUPERACIONES SEMANA RECUPERACIONES

2 80 90 92 106 85 99 92,0 9,4 ,1 2 1 85 90 97 100 89 93 92,3 5,5 ,

1 98 90 96 97 100 89 95,0 4,5 ,

1 96 87 96 100 89 96 94,0 4,9 ,

2 95 90 103 97 107 89 96,8 7,1 ,

1 2 1 2 1 2 PROMEDIO D. S RDS (CV= DS/R) CV %

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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

REPETIBILIDAD (precisin de las repeticiones internas)


RECOMENDADO 10 REPLICADOS DE LA MISMA

MUESTRA

INCLUR TODOS LOS PASOS DEL PROCEDIMIENTO:

toma de muestra si corresponde, preparacin de

muestra, calibracin, extraccin, concentracin

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VALIDACION ANALISIS FISICOQUIMICOS

ROTULO
1 2 3 4 5 6 7 8 7 8

MUESTRA
BR1 P1 . C

ESQUEMA 1
Blanco de reactivos Solucin patrn Solucin patrn Solucin patrn Solucin patrn Muestra agua natural o Matriz de inters M1 + Solucin patrn . C

P2 . C P P . C . C M1 M2 M M

M1 + Solucin patrn . C M1 + Solucin patrn . C M1 + Solucin patrn . C Seis replicados

M C: Lmite Superior del Parmetro

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VALIDACION ANALISIS FISICOQUIMICOS

ROTULO
1 2 3 4 5 6 7 8 7 8

MUESTRA
BR1 P1 . C P2 . C P 1. C P 1.2 C M1 M2 M M

ESQUEMA 2
Blanco de reactivos Solucin patrn Solucin patrn Solucin patrn Solucin patrn Matriz de inters M1 + Solucin patrn . C M1 + Solucin patrn . C M1 + Solucin patrn 1. C M1 + Solucin patrn 1.2 C Cinco -Seis replicados

M C: Lmite Superior del Parmetro

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REPRODUCIBILIDAD Es la precisin bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, los resultados de anlisis independientes se obtienen con el mismo mtodo en muestras idnticas en distintos laboratorios con diferentes operadores, usando distintos equipos Se requiere la especificacin de las condiciones cambiadas, se puede expresar en forma cuantitativa en trminos de dispersin de los resultados
[ISO 3534-1]
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CONCENTRACIN

REPETIBILIDAD

RANGO RECUPERACIN PROMEDIO %

100% 10% 1% 0.1%

< 1.3% < 1.8% < 2.7% < 3.7%

98- 102 98- 102 97- 103 95- 105

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CONCENTRACIN Qg/kg
REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD RANGO RECUPERACIN PROMEDIO %

> 1000 g/kg > 100 g/kg e1000 g/kg > 10 g/kg e 100 g/kg > 1 g/kg e 10 g/kg e 1 g/kg

< 14% < 18% < 22% < 32% < 36%

< 19% < 25% < 34% < 46% < 54%

70- 110 70- 110 70- 120 60- 120 50- 120
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Intervalo de Confianza (IC) A partir de los estimadores obtenidos en un mtodo se puede establecer entre qu lmites se encontrar el verdadero parmetro con una probabilidad preestablecida
Estimador s DS del estimador comn para todos los estimadores IC de la Media: . - raz(DS2/n) < < .+ raz(DS2/n)

95%

5%

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RASTREABILIDAD Es la propiedad de un resultado de una medida o valor de un estndar por el cual se puede relacionar, con la incertidumbre establecida, a referencias establecidas, normas nacionales e internacionales (una cadena ininterrumpida de comparaciones) Pruebas de significacin para el aseguramiento Test de t (distribucin de la t de Student) Depende de los grados de libertad (relacionados con n) y P (nivel de confianza)
= X t DS/ (n)1/2
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Test de F (de Fisher) Se utiliza para comprobar homogeneidad de varianzas, se recomienda empezar por el test de la F Fexp = DS1 2 DS2 2

Si Fexp < que Fcrtico no hay diferencias estadsticamente significativas entre las varianzas de los dos conjuntos de datos
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Test de t

texp =

X -x DS/ (n)1/2

Grados de libertad: n1+ n2 - 2

los resutados medios son Si texp < que tcrtico estadsticamente equivalentes para el nivel de confianza elegido Se puede comparar Media con valor de Equivalencia entre analistas Referencia (legislacin) Interlaboratorios Dos medias Dos conjuntos de datos Dra. Nora Angelini
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CARTA DE CONTROL Mtodo de eleccin para el control interno de rutina de mtodos. No se aplica en mtodos que se utilicen menos de 3 veces/mes Analizar muestra control (M incurrida o MR certificado o no) con las muestras, el resultado se registra en la carta de control Las variantes ms importantes son:
Carta de control de un slo valor Carta de control del blanco Carta de control para recuperacin

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TIPO DE GRAFICO Grfico de X CALCULOS Valor medio y DS, lmites de advertencia (LA) y de control (LC) DETECTA ANALISIS NECESARIOS Anlisis de la MCl a intervalos regulares de tiempo

Grficos de Rango Grfico de Recuperacin Grfico de control de blancos Grfico de CUSUM

Errores de mayor magnitud (DS de la media. Errores sistemticos (tendencias, cambios de la media). Errores aleatorios (dispersin de valores individuales). Generalmente para control de la precisin Rango medio, DS y Incertidumbre Mnimo 2 anlisis en LC muestras reales Recuperacin Errores sistemticos proporcionales Mnimo un anlisis media, DS, LA y LC de c/ MC o muestra real Media y DS, LA y LC Control de los valores blancos, errores en Al menos 2 blancos medidas instrumentales y desviaciones debidas a los reactivos Valor de referencia y Falta de exactitud, derivas Anlisis deMC DS, distancias del vrtice y ngulo. Clculo de sumas acumulativas

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INCERTIDUMBRE Parmetro asociado con el resultado de una medida, que caracteriza la dispersin de los valores que se pueden atribuir razonablemente al analizado Puede ser una desviacin estndar (o mltiplo dado de ella) o la amplitud de un intervalo de confianza
[VIM 1993]

Imprescindible para lograr la acreditacin segn Norma ISO 17025


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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

INCERTIDUMBRE (cont.) Incluye los errores sistemticos y aleatorios Para su determinacin existen varias posibilidades: Indicacin acerca de la repetibilidad  Resultados de las cartas de control  Resultado de intercomparaciones Evaluacin por miembros del personal experimentados, competentes y, por lo tanto, autorizados
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Fuentes de incertidumbre a) definicin incompleta de la sustancia a medir b) realizacin imperfecta de la definicin de la sustancia c) muestreo no representativo d) efectos no conocidos de las condiciones ambientales e) desviaciones personales en la lectura de instrumentos f) lmites en la discriminacin o resolucin del instrumento g) valores inexactos de los patrones y MR h) variaciones en mediciones de la sustancia realizadas en Dra. Nora Angelini condiciones aparentemente idnticas
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Fuentes de incertidumbre (cont.)


i) Condiciones de almacenamiento

j) Efectos atribuibles a los instrumentos de medicin, incluyendo funcin de calibrado, nmero de cifras significativas, redondeo de cifras relevantes k) Pureza de los reactivos l) Condiciones de medicin ll) Efectos de la muestra (matriz) m) Correccin por blanco n) Efectos atribuibles al operador o) Efectos aleatorios Dra. Nora Angelini p) software
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS Fuentes de incertidumbre (cont.) p) Mediciones trmicas q) Pesadas y calibracin de  Termmetros de balanzas referencia Calibracin y estabilidad de Instrumentos elctricos pesas de referencia Resolucin Incertidumbre de la Inestabilidad, gradientes pesada: repetibilidad, trmicos linealidad, excentricidad Correccin de una escala Empuje del aire o tabla de referencia Condiciones ambientales Contribuciones del Dra. Nora Angelini termmetro a calibrar

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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Distribuciones de Probabilidad de los componentes de Incertidumbre Indican la probabilidad de que un resultado de medicin tome uno u otro valor Depende de la naturaleza de cada componente promedio son los ms probables (X s 2 DS) Distribucin rectangular: todos los resultados son igualmente probables (DS = a/ 3 1 / 2 )
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Distribucin normal: los resultados centrales, cerca del

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Componentes con distribucin normal

Distribucin Normal se aplica:


A. Cuando los desvos menores son ms probables

que los mayores B. Cuando est explcita o implcitamente declarada (certificado de calibracin) C. La relacin entre incertidumbre estndar y expandida es 1: 2

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Componentes con distribucin rectangular

Se aplica cuando no hay motivos para suponer que el valor central es ms probable que los extremos
A.Resolucin de lecturas B.Variaciones de temperatura C.Exactitud declarada de equipos D.Pureza de materiales de referencia E.Cuando no se tiene informacin sobre la naturaleza del

componente

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE Determinacin de Cadmio en Alimento Alcance: se determina Cadmio en alimento en el rango de 0.5- 5 mg /kg Descripcin Resumen: Se toma 0.5 g 0.1 mg de alimento, se adiciona 2.5 ml de cido ntrico, despus de la mineralizacin la solucin se transfiere cuantitativamente a un frasco o redoma de 100 ml y se analiza por Absorcin Atmica usando horno de grafito. La curva de calibracin se realiza con patrones comerciales disponibles Dra. Nora Angelini
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despus de hogeneizar y m

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Preparacin de la muestra Pesada Mineralizacin AA

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Preparacin de la Curva de calibracin con patrones

Calibracin del AA Resultados


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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

m Cd

c 0 v VS ! m

c0 = cantidad de Cadmio en g/l anlisis por AA VS = volumen de muestra en litro m = cantidad de muestra
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Identificar y analizar las fuentes de incertidumbre

 Pesada de la Muestra (Up)  Volumen (Uv)  Solucin concentrada o stock para calibracin (Ucstock)  Funcin de Calibracin
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

0.15mg U(p) ! ! 0.09mg Certificado de calibracin de la 3


Pesada de la Muestra (Up)

balanza 0.15 mg para linalidad Esta contribucin puede ser contada dos veces, una para la tara y otra para el peso, porque cada una es una observacin independiente. Esto da una incertidumbre estandard de

U(p) ! 2 v (0.09)

U(p) ! 0.13mg
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)


 Volumen (Uv) 0.5 g son transferidos despus de la digestin a una redoma de 100 ml

Efecto del volumen: el certificado del proveedor expresa 100 ml 0.1 ml para la incertidumbre

U (V)

0.1 ml ! 3

U(V) ! 0.06 ml
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Efecto de paralaje: se realizan 10 mediciones y la DS es 0.05 100.2 100.0 100.0 99.9 : : 100.0 DS = 0.05 N = 10

u (Par)

0.05 ! 10

u (Par) ! 0.02 ml
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Efecto de Temperatura: Temperatura ambiente 20 C 3 C Coeficiente de expansin del volumen para el agua 2.1 x 10-4 / C 4

u (T)

100 ml v 2.1v10 v 3 rC ! 3rC

u (T) ! 0.035 ml
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Incertidumbre estandard de la redoma de 100 ml

s( 100ml ! u u )
DS(
2
100ml )

2 ( )

2 ( ar)

u
2

2 (T)
2

! 0.06  0.02  0.035

DS 100ml) ! 0.07ml (

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Incertidumbre del Patrn de Calibracin Certificado del proveedor 1000 5 mg/l

u (Cstock )

5 mg ! 3l
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u (Cstock ) ! 2.89 mg/l

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Curva de Calibracin Patrn(ug/L) 0.5 1 2 3 4 Muestra 1 0.058 0.104 0.197 0.284 0.363 0.07 2 0.057 0.104 0.194 0.279 0.349 0.068 3 0.061 0.104 0.194 0.285 0.367 0.069
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS


Patrn ug/kg 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 3.0 3.0 3.0 4.0 4.0 4.0 y 0.058 0.057 0.061 0.104 0.104 0.104 0.197 0.194 0.194 0.284 0.279 0.285 0.363 0.349 0.367 x(ci) 0.47 0.46 0.51 1.01 1.01 1.01 2.08 2.05 2.05 3.09 0.03 3.10 4.00 3.84 4.05 (ci-cort) -1.83 -1.84 -1.79 -1.29 -1.29 -1.29 -0.22 -0.25 -0.25 0.79 0.73 0.80 1.70 1.54 1.75 (ci-cort)2 3.33 3.38 3.21 1.67 1.67 1.67 0.05 0.06 0.06 0.62 0.53 0.64 2.89 2.37 3.05

Resultado de la muestra: 0.6 g/l

2.

Sxx

2 .22

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)


Coeficiente de correlacin r = 0.9997 Desviacin estandar de la calibracin: 0.0040 a = 0.00017 ordenada al origen S b = 0.0865 pendiente u(c ) !
S B1 p n c0 c Sxx i j
0

: DS residual B1 : pendiente n : nmero de medidas para determinar c0 Sxx ! (ci  c) 2 : nmero de medidas para la calibracin : Concentracin de Cadmio determinada i !1 : valor promedio de los diferentes patrones de calibracin : Suma de cuadrados de las diferencias entre concentraciones y concentracin media de patrones : ndice para el nmero de patrones de calibracin : ndice para el nmero de medidas para obtener Dra. Nora Angelini la curva de calibracin

1 1 (c0  c)   p n xx

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

n i !1

Sxx ! (ci  c ) ! 25.22


0.0040 1 1 (0.60  2.3)   ! 0.033 g/l u(c 0 ) ! 0.0865 3 15 25.22
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Incertidumbre combinada uC(Cd) ! c(Cd)


uC(Cd) 0.13 0.07 0.033 !   c(Cd) 0.5 100 0.6
2 2 2

u C

u  C

uC0  CC 0

uCstock  C Cstock

UCstock= (2.89/1000)2 = (0.00289)2 = 0.000008352

u C (Cd) ! 0 . 06 c(Cd)

u C (Cd) ! 0.026 2  0.0007 2  0.055 2 c(Cd)


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INCERTIDUMBRE (cont.)

c0 v V 0.6 v 0.1 m! m! ! 0.12 mg/kg P 0.5

U c (Cd) ! 0.06 v 0.12 ! 0.007 } 0.01

Cd ! 0.12 s 0.01 mg/kg


Informe de resultados Incertidumbre expandida: Cd = .12 . 2 mg/ g k = factor de cobertura k = 2 (95 % intervalo de confianza) Dra. Nora Angelini
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ROBUSTEZ La robustez de un procedimiento analtico es una medida de su capacidad para permanecer inalterado por variaciones pequeas pero deliberadas en parmetros del mtodo y brinda una indicacin de su confiabilidad
[ICH Q2A, CPMP/ICH/ 381/95]

El objetivo es optimizar el mtodo y las condiciones para obtener resultados exactos con alta seguridad, que funcione despus de intervalos largos de tiempo y en otros laboratorios Un mtodo es ms robusto cuanto menos dependan los resultados de una modificacin en sus condiciones
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

ROBUSTEZ (cont.) Condiciones que afectan el mtodo de medicin: Laboratorio Lugar de la medicin Personal Aparatos Estabilidad de Muestras, Reactivos, Solventes y Patrones Caudal de las fase mvil (en HPLC) pH de la fase mvil (en HPLC) Gradiente de temperatura (en GC)
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

ROBUSTEZ (cont.) Estabilidad de muestras, patrones y reactivos (condiciones de almacenamiento y ensayo) Parmetros: Sensibilidad a la temperatura Sensibilidad a la luz Hidrlisis (por la humedad del aire) Facilidad de oxidacin  Descomposicin qumica Efectos catalticos (por las paredes del contenedor) Adsorcin (durante la filtracin de soluciones con residuos)  Precipitacin (al dejar mucho tiempo una solucin)
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Realizar variaciones Identificar las variables sistemticas en los que afectan el mtodo factores sospechosos observar variacin del resultado Analizar MR o Disear experimentos muestras de para monitorear el composicin Diseo factorial efecto de cambios conocida de experimentos sistemticos en las variables Clasificar variables segn magnitud efecto producido Disear control de calidad para el control de variables crticas
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

El efecto de cada una de las variables se calcula haciendo la media de los 4 anlisis que contienen la variable en su valor ms alto (maysculas) y aqullos que corresponden al valor ms bajo (minsculas). El efecto de cambio del Factor A a a se mide por la diferencia: (s+t+u+v)/ - (w+x+y+z)/ Con las 7 comparaciones (A-a,...G-g) se conoce el efecto de cada variable; cuanto > sea la diferencia > influencia tendr La diferencia entre la media de subgrupos de 4 > que (2)1/2 DS, indica que el mtodo es sensible a los cambios de esa variable
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Test de Robustez de Youden para un mtodo analtico


VALOR DE LAS VARIABLES A, a B, b C, c D, d E, e F, f G, g Resultados ANALISIS 1 A B C D E F G s 2 A B c D e f g t A b C d E f g u A b c d e F G v a B C d e F g w a B c d E f G x a b C D e f G y a b c D E F g z

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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

INTERCOMPARACIONES
Dan informacin valiosa slo si las muestras se

manejan de la misma manera que las muestras de un anlisis de rutina


Se realizan en intervalos de tiempo largos; por ello no

son suficientes para el aseguramiento de calidad rutinario, sino que funcionan como complemento
Cuanto ms distintas son las matrices de las muestras

de intercomparacin y las del anlisis, menor informacin del anlisis rutinario


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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

INTERCOMPARACIONES (cont.)

el mayor cuidado, especialmente en el caso de resultados aberrantes o desviaciones, para obtener las mayores posibilidades de mejora
Si no hay disponibles en el mercado de organismos

La interpretacin de los resultados debe realizarse con

oficiales o proveedores reconocidos se pueden realizar comparaciones con otros laboratorios


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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS


PARAMETROS A EVALUAR
PROCEDIMIENTO

NUMERO DE DETERMINACIONES Patrones 5 niveles + blanco reactivos 3 replicados Inmunoanlisis 6 niveles + blanco reactivos 2 replicados 5 niveles + blanco reactivos + blanco muestras 6 replicados Inmunoanlisis 5 niveles + blanco reactivos 6 replicados + 20 blancos de matriz

LINEALIDAD

Anlisis de patrones

RANGO EXACTITUDSESGO (desviacin o error sistemtico) SELECTIVIDAD (interferencias) EFECTO MATRIZ LD/ LC RECUPERACIONES INCERTIDUMBRE

Materiales de referencia o muestras fortificadas

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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS


PARAMETROS A EVALUAR PRECISION (repetibilidad) PRECISION INTERMEDIA (repetibilidad)
PROCEDIMIENTO

NUMERO DE DETERMINACIONES Mnimo 2 replicados por da y 2 das diferentes Analistas distintos, 4 a 6 tandas, distribuidas en 2 semanas consecutivas o un lapso mayor Replicados realizados por distintos analistas, diferentes laboratorios, utilizando diferentes equipos Al menos 8 muestras, Test de Youden y Steiner

Replicados de muestras Anlisis de muestras naturales o fortificadas y materiales de referencia Distintos analistas, usualmente, no exclusivamente ensayos interlaboratorios Muestras naturales o fortificadas y materiales de referencia

REPRODUCIBILIDAD

ROBUSTEZ

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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS


PARAMETROS NIVELES NUMERO DE MUESTRAS CUANTITATIVOS CRIBA

METODO DESARROLLADO EN EL LABORATORIO ESTABILIDAD DE ANALITOS EN SOLUCIONES PATRONES Y SOLUCIONES DE EXTRACCION A NA O LC 5 REPLICADOS DE CADA PUNTO + CERO DE CADA ANALITO /ALIMENTO REPRESENTATIVO FORTIFICAR MUESTRAS BLANCO COMPARAR CONCENTRACION CON SOLUCIONES PATRONES RECIEN PREPARADAS Y CONSERVADAS VIEJAS 5 REPLICADOS DE MUESTRAS REPRESENTATIVAS, HALLAR EL CV% NO TIENE QUE HABER CAMBIOS SIGNFICATIVOS EN LA CONCENTRACION DEL ANALITO EN SOLUCIONES PATRONES Y EXTRACTOS CONSERVADOS AL FINAL DEL PERIODO DE CONSERVACION LOS RESIDUOS AGREGADOS AL NIVEL LC SON DETECTADOS

HOMOGENEIDAD

DE LA MUESTRA

AL NA O LC

CV % 10

CV % 15

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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS OTROS CRITERIOS

Lmite Mnimo de Performance Requerido (LMPR) Concentracin Nominal de Referencia (CNR) relacionada al LMPR GC-MS y GC-MS-MS, HPLC-MS y HPLC-MS-MS Sustancias Prohibidas: CINCO (5) niveles de concentracin y Blanco de Muestra separados a intervalos regulares a partir de una concentracin igual o inferior al LMPR; por ejemplo: CNR, 1.5CNR, 2CNR, 4CNR, 6CNR. CNR = MRPL (o inferior) 6 replicados
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS CRITERIOS DE ACEPTACION CONCENTRACIN Qg/kg


REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD

RANGO REC. PROMEDIO %

> 1000 g/kg > 100 g/kg e1000 g/kg > 10 g/kg e 100 g/kg > 1 g/kg e 10 g/kg e 1 g/kg

< 14% < 18% < 22% < 32% < 36%

< 19% < 25% < 34% < 46% < 54%

70- 110 70- 110 70- 120 60- 120 50- 120
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS OTROS CRITERIOS DE ACEPTACION CONCENTRACIN Qg/kg REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD

> 1000 g/kg > 100 g/kg e1000 g/kg > 10 g/kg e 100 g/kg > 1 g/kg e 10 g/kg e1 g/kg

< 12% < 15% < 20% < 25% < 30%

< 17% < 20% < 25% < 30% < 35%
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS OTROS CRITERIOS DE ACEPTACION CONCENTRACIN Qg/kg MUESTRAS INTRALABORATORIO MUESTRAS INTERLABORATORIO

> 100 g/kg e 100 g/kg e10 g/kg e1 g/kg

15% 20% 25% 30%

20 % 25% 30 % 35 %
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

OTROS CRITERIOS DE CONFIRMACION TIEMPOS DE RETENCION (con respecto a los patrones) 1 % (GC) 5 % (HPLC) TIEMPOS DE RETENCION RELATIVO AL PATRON INTERNO (con respecto a los patrones) 0.5 % (GC) 2.5 % (HPLC)
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

OTROS CRITERIOS DE CONFIRMACION GC-MS, HPLC-MS Cuatro (4) iones para sustancias prohibidas Tres (3) iones para sustancias con LMR GC-MS-MS, HPLC-MS-MS: un in precursor y 2 iones hijos
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

OTROS CRITERIOS DE CONFIRMACION RELACION DE ABUNDANCIAS (R) entre IONES: Intervalo de aceptacin definido a partir de los patrones

Relacin de Abundancias R > 50 % 20 % < R < 50 % 10 % < R < 20 % R < 10 %

GC-MS

GC-MS-MS/HPLC-MS/HPLC-MS-MS

10 % 15 % 20 % 50 %

20 % 25 % 30 % 50 %
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

OTROS PARAMETROS Lmite de Decisin CCE: Lmite en el cual y a partir del cual se puede concluir con una probabilidad de error E que una muestra no es conforme. Error E: es la probabilidad de que la muestra analizada sea realmente conforme aunque se haya obtenido una medicin no conforme. Sustancias prohibidas, CCE es el nivel de concentracin ms bajo al cual un mtodo puede discriminar si el analito identificado est presente con una probabilidad estadstica de (1-E).
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Mtodos de criba (screening) cuantitativos se puede determinar como el Valor Promedio + 3 Desvos Standard del anlisis de veinte (20) muestras blanco. CC (para sustancias prohibidas) para Mtodos de Confirmacin: Se determina en base al grfico de Respuesta en funcin de Concentracin Nominal obtenido en condiciones de reproducibilidad interna Se calcula como la interseccin al eje y (ordenada al origen: a + 2. DS (desvo estndar de la ordenada al origen)
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OTROS PARAMETROS CC (para sustancias con LMR): Es la concentracin por encima de la cual se puede decidir que el contenido del analito identificado est por encima del LMR con una probabilidad estadstica de 1-E. LMR + 1. DS (desvo estndar de la Reproducibilidad intralaboratorio)

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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

Capacidad de deteccin CC : contenido mnimo de la sustancia que puede ser detectado, identificado o cuantificado en una muestra con una probabilidad de error . Error : es la probabilidad de que la muestra analizada sea realmente no conforme, aunque se haya obtenido una medicin conforme. CC (para sustancias prohibidas) para mtodos de confirmacin: CC + 1. DS (desvo standard de la Reproducibilidad Intralaboratorio al nivel del CC )
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VALIDACIN DE METODOLOGA PARA ANLISIS QUMICOS

CC (para sustancias con LMR): CC + 1. DS (desvo standard de la Reproducibilidad intralaboratorio al nivel del CC ) CC (para mtodos de screening cuantitativos): CC + 1. DS (desvo standard de la Reproducibilidad Intralaboratorio al nivel del CC )

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Alimentos representativos Muestras para validacin residuos de pesticidas Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

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