Analiza legumelor şi a fructelor: determinarea acidului ascorbic şi a carotenelor totale.

Metode de analiză
Pentru determinarea acidului ascorbic din diferite tipuri de probe, au fost sugerate multe
tehnici analitice,toate bazându- se pe caracterul reducător al analitului.
Cromatografia lichidă de înaltă performanță(HPLC), metode spectrofotometrice, instrumente
de electroforeză capilară,metode titrimetrice bazate pe titrare cu soluție oxidată (diclorofenol
indofenol, iodat de potasiu sau bromat de potasiu) , metode biologice, electrochimice,
fluorimetrice sau amperometrice, bazate pe biosenzori, toate utilizate pentru determinarea
vitaminei C.
Cu toate acestea, majoritatea prezintă limitări în utilizare (unele sunt costisitoare, unele
necesită o pregătire specială sau nu sunt suficient de sensibile și selective). Este dificil să
alegi o singură metodă pentru a determina conținutul total al vitaminei C din produse
alimentare, probe biologice și farmaceutice,deoarece fiecare probă are propriile ei
caracteristici și proprietăți specifice. Anumite metode sunt disponibile pentru a determina
acidul ascoribic, dar foarte puține din acestea sunt folosite pentru determinarea ambelor
forme: acid ascorbic și acid dehidroascorbic. Acest lucru se datorează faptului că cele
formlele vitaminei C ,acidul ascorbic și forma sa oxidată ( acidul dehidroascorbic) posedă
proprietăți chimice, optice și electrochimice diferite. Cea mai cunoscută metodă pentru
determinarea conținutului total de vitamina C din probele de alimente, este 2,4- dinitrofenil
hidrazina (DNPH) (Riemschneider și colab., 1976). Aceasta este o metodă simplificată pentru
determinarea simultană a acidului ascorbic si a acidului dehiroascorbic; reacția de cuplare a
colorantului 2,4-dinitrofenil hidrazina cu vitamina C, urmată apoi de determinarea
spectrofotometrică.
Detecția electrochimică reprezintă o metodă alternativă atractivă pentru detecția speciilor
electroactive, datorita faptului că prezintă o serie de avantaje, cum ar fi: usurință în
manipulare, miniaturizare, prezintă o sensibilitate ridicată si un cost scăzut. Detecția
electrochimică poate fi cuplată cu cromatografia lichidă de înaltă performanță pentru a asigura
o sensibilitate mare a speciilor electroactive.
Determinarea vitaminei C din sucurile de fructe prin cromatografia lichidă de înaltă
performanță ( HPLC )
:
În special, metodele cromatografice sunt foarte eficiente în determinarea acidului ascorbic
prin analiza cantitativă a materialelor complexe,cum ar fi sucurile de fructe, legume și
băuturile. Prin această metodă se pot separa,identifica și cuantifica majoritatea acizilor
organici din sucurile naturale de fructe folosind HPLC ,care va identifica compușii, nu doar
cu timpii lor de retenție, ci și cu spectrele lor individuale.
Materiale și metode
Sucul de citrice se centrifughează la 3000 de rotații timp de 10 minute ,iar supernantantul se
diluează în raport 1:50 pentru determinarea acidului citric și în raport 1:5 pentru alți acizi.
Diluțiile sunt filtrate printr- o membrană înainte de injectare.
Se analizează 2 eșantioane în duplicat. Se prepară o soluție standard mixtă ce conține
1000mg/l acid citric, 2000mg/l acid malic, 300mg/l acid oxalic si acid ascorbic, 700mg/l acid
tartric și 400mg/l acid lactic.
Soluția standard si diluțiile corespunzatoare sunt preparate cu apă distilată și sunt păstrate în
locuri întunecoase , la temperatură joasă (+4oC).
Analiza HPLC
Acizii organici din probe sunt separați prin cromatografie cu fază inversă ,și determinați cu
ajutorul absorbanței,apoi cuantificați cu graficele de calibrare externe.Pentru detectarea
simultană a 6 probe,detectorul este setat la lungimea de undă λ=254.
Timpii de retenție, gradul de concentrație si limita de detecție pentru acizi organici standard:
Determinările se fac la 10ºC folosind o fază mobilă formată din soluție de fosfat (se dizolvă
6,8g dihidrogenofosfat de potasiu în 900ml apă; pH-ul se ajustează cu acid fosforic până la
pH=2,8 apoi se completează cu apă până la 1000 ml),ce se filtrează printr -o membrană de
poliamidă și este introdusă la vid.
Rata de curgere a fazei mobile este de 0,7ml/min pentru toate separările cromatografice.
Coloana de separare este echilibrată cu faza mobilă înainte ca linia de bază să se stabilizeze.
La acest nivel se fac pipetări cu volume de 5 μl pentru fiecare probă preparată sau soluție
standard.
Valorile abaterilor standard relative variază de la 0,154 la 3,18% indicând că această metodă
este precisă ,cu un grad mare de repetabilitate ,în special pentru acidul citric, ascorbic, lactic și
oxalic .Recuperarea acizilor organici din sucurile de citrice variază între 95,8 si 102,1%
confirmând precizia de separare si condițiile de analiză. Această metodă contribuie la
dezvoltarea procedurii HPLC, fiind rapidă și precisă, pentru determinarea cantitativă a acizilor
organici din sucurile de fructe, în condițiile de fază inversă.
Aciziioxalic,tartric,malic,lactic,citric și ascorbic sunt determinați simultan și luate din
coloană în timp de 20 de minute.
Având în vedere ușurința și concizia de pregătire a probei,această metodă poate fi considerată
eficientă,precisă și rapidă pentru determinarea acizilor organici.Se mai pot folosi și alte
metode de determinare a vitaminei C, însă au anumite dezavantaje,consumă mult timp și au
reproductibilitate mai mică.

Determinarea vitaminei C prin metoda spectrofotometrică UV

Acidul ascorbic mai poate fi analizat prin metoda spectrofotometrică UV. Spre deosebire de
metoda HPCL ( care are avantajul unei specificități avansate, dar implică operații relativ
laborioase) spectrofotometria UV, prezintă avantajul unei execuții simple,directe și extrem de
sensibile. Ca orice metoda, aceasta prezintă și dezavantaje cum ar fi interferența
ingredienților. Instrumente-spectrofotometru Shimadzu(model UV- 1601)+o pereche de
celule de cuarț de 1 cm
Reacticvi:
acid acetic 5%; metafosforic 10%; soluție de tiouree 10%; soluție2,4-Dinitrohidrazină; acid
sulfuric 85%; soluție standard vitamina C ( acid ascorbic)
Pregătirea probei:
10g probă este omogenizată cu aproximativ 50ml de solutie de acid metafosforic 5% și acid
acetic 10%, apoi este transferată într-un balon de sticlă de 100 ml, se agită ușor până la
omogenizare.
Se diluează până la semn cu soluție de acid acetic 10% si acid metafosforic 5%
Soluția se filtrează și filtratul obținut se colectează pentru determinarea vitaminei C din
această probă.
Estimarea vitaminei C- procedură:
Peste filtratul cu proba se adaugă apă de brom pentru a oxida acidul ascorbic in acid
dehidroascorbic
Se adaugă cateva picături de tiouree pentru a elimina excesul de brom, obținându -se astfel o
soluție limpede.
Se introduce soluția standard de acid ascorbic și apoi 1 ml de 2,4- DNPH. Amestecul obținut
este menținut timp de 3 ore la o temperatură de 37 º C într -o baie de apă.
După incubare ,amestecul este răcit într -o baie de gheață și este tratat cu 5 ml H2SO4 85 % și
se agită constant.
Se obține o soluție colorată.
Reacții:
Acidul ascorbic este oxidat la acid dehidroascorbic prin acțiunea apei de brom
 Acidul L-dihidroascorbic reacționează cu 2,4-difenilhidrazina și produce o osazonă care,
tratată cu H2SO4
Formează o soluție de culoare roșie.
Curba de calibrare: -este construită prin reprezentarea grafică a concentrației față de absorbția
corespunzătoare.

DOZAREA VITAMINEI C DIN ALIMENTE

GENERALITATI
Vitamina C, acidul ascorbic, este un acid organic cu proprietăţi antioxidante, implicat într-o
serie de procese care se desfăşoară în celulele vii. În organismul uman vitamina C deţine un
rol complex şi important; protejează compuşii biologic activi de degradări oxidative, întăreşte
sistemul imunitar, stimulează procesele de biosinteză a colagenului, hormonilor steroidici şi a
unor neurotransmiţători. Doza de 10 mg/zi previne avitaminoza C, însă raţia zilnică
recomandată pentru un adult este de 60 mg. Lipsa vitaminei C din organism conduce la
scorbut, denumită şi boala marinarilor, caracterizată prin gingivite (gingii cavernoase şi
inflamate), paradontoze, pierderea dinţilor, vase de sânge fragile, neelastice, inflamarea
articulaţiilor şi anemie.

PRINCIPIUL METODEI
Metodele chimice de dozare a vitaminei C se bazează pe proprietăţile sale reducătoare.
Acidul ascorbic se transformă prin oxidare în acid dehidroascorbic. Se pot utiliza diverşi
agenţi oxidanţi. Erorile care pot interveni în determinare de datoreaza faptului că în produsele
vegetale se găsesc şi alte substanţe oxidabile (agenţi reducători). Un alt neajuns este oxidarea
rapida a vitaminei C, care poate avea loc chiar în decursul pregătirii materialului pentru
analiză. De aceea dozarea trebuie să se facă rapid.
Metoda iodometrică- are la bază oxidarea acidului ascorbic cu iod în exces, conform reacţiei:
Ca si oxidant poate fi utilizat iodul generat in situ prin reactia iodatului cu iodura de K
conform reactiei:

PARTEA EXPERIMENTALA
Reactivi:
- acid clorhidric soluţie apoasă 2%
- soluţie apoasă KIO3 de concentraţie 0,0008 M
- soluţie apoasă de amidon 0,2 % ca indicator
- soluţie apoasă 1 % KI
Prepararea reactivilor
1. Soluţia de acid clorhidric 2%: Într-un balon cotat de 500 ml se introduc 22,7 ml soluţie
de HCl concentrată (aprox. 37%) si se aduce la semn cu apă distilată.
2. Soluţia de KIO3 0,0008 M se prepară prin dizolvarea a 4,277 g iodat de potasiu in 20-
30 ml apă distilată într-un balon cotat de 100 ml. După solvirea completă se aduce la semn cu
apă distilată.
3. Soluţia apoasă de KI 1 %: se dizolva 1 g de KI în 20-30 ml apă distilată într-un balon
cotat de 100 ml. După solvirea completă se aduce la semn cu apă distilată.
Mod de lucru pentru determinarea vitaminei C in fructe si legume
• Se cântăresc 15 g de material de analizat (de exemplu ceapă, ardei gras, măr,
portocală, lamaie, kiwi etc.) cu o perecizie de 0,01 g.
• Materialul de analizat cântărit se mojarează energic cu circa 10 cm3 soluţie HCl 2% şi
2,5 g nisip de cuarţ sau praf de sticlă, timp de 10 minute.
• Se trece cantitativ amestecul obtinut într-un balon cotat de 50 ml şi se aduce la semn
cu HCl 2 %.
• Se filtrează printr-un filtru creţ într-un într-un vas uscat sau se centrifughează
suspensia.
• Se pipetează 10 cm3 filtrat într-un balon Erlenmeyer de 100 ml, se adaugă 30 ml apă
distilată, 5 ml KI, 5 ml HCl şi 1,5 ml solutie de amidon.
• Se titrează cu o soluţie de KIO3 până la culoarea albastră. La adăugarea iodatului de
potasiu peste amestecul care conţine şi iodură de potasiu, se generează iod care oxidează
vitamina C prezentă. După ce vitamina C a fost complet oxidată, iodul generat va forma cu
amidonul prezent un complex de incluziune colorat albastru intens. Culoarea trebuie să
persiste 30 secunde.
• Analiza se repetă de 2 ori, se calculează valoarea medie a titrărilor (V in ml)
Calculul rezultatelor.
Pe baza ecuatiilor reactiilor chimice, se observa ca un mol de iodat de potasiu
genereaza 3 moli de iod, care oxideaza 3 moli de vitamina C.
• Numarul de moli de iodat de potasiu este: V*0.0008/1000
• Numarul de moli de acid ascorbic oxidat in proba analizata prin titrare este atunci
3*V*0.0008/1000
• Deoarece la titrare au fost introdusi doar 10 ml (din cei 50 ml suspensie din balonul
cotat), acesta trebuie multiplicata cu 5
• Cu masa moleculara a vitaminei C, de 176, se obtine prin multiplicare cantitatea de
vitamina C din materialul analizat (G g material cantarit initial pentru a fi folosit la extractia
vitaminei C prin mojarare): V*0.0008/1000*5*176
• Continutul in vitamina C se calculeaza in general in mg/100 g material, adica:
 Vitamina C mg%= V*0.0008/1000*5*176/G*100*1000
 Vitamina C mg%=V*0.0008*5*176/G*100= V*70.4/G
unde:
V = nr. ml KIO3 0.0008 M folosiţi la titrare;
G = Masa in g de material luat în analiză.
Mod de lucru pentru determinarea vitaminei C din sucuri de fructe
Se diluează 5-10 ml suc de fructe la 100 ml cu soluţie de amidon-HCl (0,3 g amidon se fierbe
5 minute cu 200 ml apă distilată. Se răceşte, se adaugă 12 ml HCl concentrat şi se aduce la
semn cu apă distilată. Din soluţia diluată se iau 10 ml într-un flacon Erlenmeyer şi se titrează
cu soluţie de iod 0.01 N până la apariţia unei coloraţii albastre persistente. Analiza se repetă
de 2 ori, se calculează valoarea medie a titrărilor (V in ml). Continutul in vitamina C al
sucului se calculeaza similar metodei prezentate mai sus.

Macesul,Afinele si ardeiul gras ,sunt mult mai bogata in vitamina C decat

clasicelecitrice(lamai,portocale) . Macesele au ,pe suta de grame,de 20 de ori mai multa
vitamina C decatlamaile.Visinile sunt si ele foarte bogata in vitamina C. Dupa care urmeaza
Papaia,Guava siKiwi. Dintre legume foarte bogat in vit.C este ardeiul gras.
Materiale şi metode de cercetare
Materiale folositeMateriale: • Soluţie HCl 2%;• Soluţie de iod 0.01N;• Soluţie amidon/HCl; •
Fructe de măceş uscate la etuvă, timp de 24 ore;• Fructe de măceş proaspăte conservate prin
congelare.
Metode de cercetare - Principiul metodei - Constă în extracţia vitaminei C din
materiale vegetale şi evidenţierea acesteia atâtcalitativ cât şi cantitativ prin diferite
metode.
Extracţia vitaminei C din materialul vegetal• 5-10 g material vegetal proaspăt se mojarează
împreună cu puţină sticlă pisată. Astfel mărunţit, materialul vegetal se introduce într-un flacon
Erlenmeyer de 250 ml şi se adaugă 100 ml soluţie 2% HCl.
Conţinutul flaconului se amestecă cu ajutorul unui agitator magnetic timp de 30 minute, se
filtrează spălându-se pe filtru cu 30 ml soluţie2% HC1. Volumul extractului se completează la
150 ml cu soluţie 2% HCl.Pentru determinarea conţinutului de vitamina C se folosesc mai
multe metode:
 Metoda iodometrică
 metoda cu reactivul 2,6-diclorfenolindofenol
 extracţie cu extractorul Soxhlet
Metoda iodometrică
Mod de lucru - Din extractul obţinut se iau 10 ml şi se introduc într-un balon cotat de 100
cm3, adăugându-se şi completându-se până la semn, o soluţie de amidon/HCl. Din acest
amestec se iau din nou 10ml şi se titrează cu o soluţie de iod 0.01N. Soluţia de iod se adaugă
în picături sub agitarecontinuă până la apariţia unei coloraţii albastre persistente. Titrarea se
repetă cu alte două probesimilare. Dacă între titrări, eroarea depăşeşte 3% atunci se reface
titrarea.
Conţinutul de vitaminaC (mg) în 100 g produs se calculează cu ajutorul relaţiei: Cvitamina
C= 1.321x104 (VT/Mp), mg/100 g material vegetal
Unde:
VT - volumul soluţiei 0,01N de iod folosit la titrarea probei de analizat, ml;
MP - cantitatea de material vegetal supus extracţiei, g.
Soluţia amidon/HCl se prepară astfel: se dizolvă 0.3 g amidon în 200 ml apă distilată
prinfierbere 5 minute. Se răceşte şi apoi se introduce într-un flacon cotat de 1 l, se adaugă 12
ml HCl concentrat şi se aduce la semn cu apă distilată.