INTERACTIONS PROTEINE - PROTEINE

1. Introduction
Liaisons stables liaisons transitoires (cross-link) Deux protines peuvent sassocier indpendamment de tout autre partenaire de deux manires diffrentes : Liaisons stables : toute association donnant naissance un complexe que lon peut isoler Liaison transitoire : ex : liaison entre une enzyme et son substrat -> souvent des liaisons trs fugaces donnant naissance des complexes trop peu stables pour que lon puisse les isoler. Dans ce cas l, lisolement de ces complexes passera souvent par une tape prliminaire de cross-link (pontage covalent ralis par un traitement chimique ou physique). La force de la liaison (affinit) est dfinie par des paramtres dquilibre et en particulier par le Kd ou constante de dissociation. Notion de Kd
Kon A + B <====> AB Koff Kon : constante de vitesse de formation du complexe Koff : constante de vitesse de dissociation du complexe

[A] x [B]

AB

Kd = [A] [B] / [AB] = koff / kon = 1 / Ka (constante dassociation) Avec [A], [B], [AB] : respectivement concentration en A, B et AB Quelques exemples de Kd : Interaction streptavidine / biotine : 10-14 M Interaction Antigne / Anticorps : 10-8 10-10 M pour un bon anticorps, 10-6 M pour un anticorps plus faible Histone / ADN 10-11 M

 Liens molculaires Les interactions protine / protine sont possibles grce la formation de liaisons non covalente. Ces liaisons sont de diffrente nature : Liaisons ioniques - interaction qui relie deux atomes de charges opposes - la plus forte des liaisons non covalente Liaisons hydrogne - se forment chaque fois quun atome dhydrogne li un atome lectrongatif est proximit dun autre atome lectrongatif (en gnral oxygne et azote) - Lnergie de liaison est moyenne Liaisons hydrophobes - se rencontrent lorsque deux molcules hydrophobes voisines se rencontrent (par exemple deux acides amins hydrophobes) - lnergie de liaison est faible Forces de Van Der Waals interactions lectrostatiques entre deux atomes voisins Doivent tre trs proches car lnergie de cette liaison est trs faible. Bien sur, la force du type de liaison tablir va conditionner la distance laquelle les atomes concerns vont devoir tre positionns (quelques angstrm).

2. Dmarche exprimentale permettant de mettre en uvre puis de

caractriser une interaction protine protine

Sassurer que la protine appartient un complexe, dterminer la taille de ce complexe Isoler le complexe Identifier les protines de ce complexe Valider linteraction in vitro Valider linteraction in vivo Caractriser linteraction Quelle partie de la protine X interagit avec la protine Y Kd, kon, stchiomtrie de linteraction Interactions molculaires mises en jeu structure 3D conception de peptides inhibiteurs

3. Mthodes permettant sassurer que la protine appartient un

complexe et de dterminer la taille de ce complexe

Chromatographie dexclusion (encore appel gel filtration ou tamisage molculaire)

Principe de la chromatographie dexclusion : Une colonne est remplie dun gel de sephadex. Le sephadex est un gel de dextrane (polymre du glucose) auquel on fait subir une rticulation. Il se prsente sous la forme de billes poreuses dont la porosit dpend du degr de rticulation qui spare les protines selon leur taille. 1 : Dpt d'un mlange de deux molcules (des grosses et des petites) sur une colonne remplie d'un gel de Sephadex. 2 : Les petites molcules peuvent pntrer dans les billes de Sephadex car leur diamtre est infrieur celui des pores du gel. Les grosses molcules ne le peuvent pas en raison de leur grande taille; elles sont donc exclues du gel (d'o le nom de chromatographie d'exclusion). 3 : Les grosses molcules ont donc un trajet plus court parcourir pour arriver en bas de la colonne; elles sont donc lues les premires. 4 : Les petites molcules sont lues ensuite car elles ont une plus grande distance parcourir pour arriver en bas de la colonne.

D'une faon plus gnrale : -Les molcules de taille suprieure celle des pores des billes de Sephadex sont totalement exclues du gel et ne se rpartissent que dans le volume extrieur aux billes, c'est--dire dans la phase mobile (luant). Elles sortent les premires, un volume d'lution Vo appel volume mort de la colonne. -Les molcules de taille infrieure celle des pores des billes de Sephadex peuvent pntrer librement dans les billes et se rpartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide l'intrieur des billes ou phase stationnaire + volume de liquide l'extrieur des billes ou phase mobile). Elles sortent donc les dernires, un volume d'lution Vt ou volume total des liquides de la colonne.
3

-Les molcules de taille intermdiaire pntrent un peu dans les billes, en fonction de leur taille et de leur forme; elles pntrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont lues dans l'ordre des masses molaires dcroissantes. Application ltude des interactions protine/protine : tout dabord, on fait passer la protine purifie dans la colonne, ce qui nous permet de dterminer sa masse apparente. Cette masse sera compare sa masse molaire (que lon peut calculer partir de sa squence). On peut alors avoir une ide de ltat (monomrique ou mutimrique) de notre protine en solution. On peut aussi incuber la protine cible avec un extrait protique et, si une protine de lextrait interagit de manire stable avec la protine cible, le complexe sera plus gros et passera plus vite dans la colonne que la protine isole. On en dduira que notre protine appartient un complexe et on pourra estimer la taille de ce complexe. La protine cible peut tre marque (par exemple laide dun fluorophore) pour faciliter sa dtection. Cette technique est essentiellement utilise pour dire si la protine est prsente sous la forme dun monomre ou dun complexe. On peut galement ainsi sparer le complexe et analyser ses diffrents constituants. Attention ! on nest pas sr par cette technique que toutes les protines rcupres dans le complexe interagissent directement avec notre protine. Il peut y avoir des interactions indirectes ! Pour dterminer dans quelle fraction dlution la protine dintrt se trouve, elle doit tre facilement reprable : Soit on possde un anticorps -> Ac secondaire coupl une activit enzymatique Soit on peut marquer la protine radioactivement Soit elle prsente un Tag reprable (GFP ou tag permettant un test enzymatique par exemple)

(synthse en prsence de Met 35S ou phosphorylation 32P)

4. Mthodes permettant disoler un complexe protique

chromatographie daffinit Principe gnral : Le principe consiste utiliser une phase stationnaire constitue dun support (silice, polymre) sur lequel on a greff une molcule organique particulire qui prsente une affinit slective pour certains composants dun mlange dont on cherche les isoler. Ceux-ci vont tre slectivement retenus sur la colonne tandis que les autres constituants du mlange
4

sortiront juste aprs le volume mort. Un changement de la phase mobile (pH, force ionique, comptiteur) permet ensuite dluer les substances intressantes avec un trs fort facteur de purification. La chromatographie d'affinit s'utilise avec des colonnes basse pression ou des supports haute performance (HPLC).
Support solide

Tag

Protine cible

Partenaire

Pour la purification dun complexe protique associ une protine X, on utilise un support solide constitu de billes dagarose ou de spharose sur lesquelles on a greff un ligand prsentant une forte affinit avec la protine X (par exemple, un anticorps dirig contre elle ou, si la protine est un facteur de transcription, on peut greffer son ADN cible). Si celle-ci ne possde pas naturellement de ligand, on utilisera une protine X tague que lon aura au pralablement prpare. Dans ce cas l, cest le ligand du tag qui sera fix sur les billes. Ces billes seront alors introduites dans une colonne. Ensuite on fait passer lextrait de protine contenant la protine X (comme pour le cas prcdent, on peut soit former le complexe in vivo, soit le former in vitro soit encore fixer dabord la protine X puis faire passer un extrait protique (extrait nuclaire par exemple). Aprs diffrents lavages, llution se fera le plus souvent laide dun comptiteur (ADN cible ou imidazole par exemple). Une autre possibilit est dutiliser une protase spcifique coupant entre le tag et la protine X (dans le cas o on a insr un tag par gnie gntique). Une dernire possibilit est dutiliser un gradient de force ionique. Dans ce dernier cas, sortiront les premires les protines faiblement associes dans le complexe (souvent par des liaisons indirectes), puis celles plus fortement lies. Une application particulire : la mthode TAP TAG La mthode TAP Cest une mthode de purification mettant en uvre une nouvelle tiquette (tag) appele TAP (do le nom de la mthode TAP Tag).

La protine de fusion sera produite chez la levure un niveau dexpression comparable son niveau naturel. Les protines qui sassocient avec la protine de fusion seront rcupres par la mthode TAP (Tandem Affinity Purification) et analyses par spectromtrie de masse. La structure du tag TAP Il sagit dune fusion en tandem du domaine de fixation des IgG de la protine A de Staphylococcus aureus et de la protine CBP (Calmoduline Binding Peptide), ces deux tag tant spars par un site de clivage la protase TEV. La squence consensus reconnue par la TEV est : Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Ser. La coupure se fait entre les rsidus conservs Gln et Ser. X peut correspondre diffrents acides-amins mais nimporte lequel ne peut pas tre tolr. NB : site de coupure de la Thrombin (Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser) coupure entre Arg et Gly. Ce tag peut-tre insr en N ou en C-terminal. Les deux parties du tag peuvent galement tre fusionnes avec deux protines diffrentes appartenant au mme complexe. La purification mthode TAP Cette mthode consiste raliser deux chromatographies daffinit. La premire en prsence de billes couples des IgG, lution grce la protase TEV et la deuxime avec des billes de calmoduline, lution en prsence dEDTA. Les protines ainsi lues seront caractrises par spectromtrie de masse.
Rigaut G, Shevchenko A, Rutz B, Wilm M, Mann M, Seraphin B. Related Articles, Links A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 1999 Oct;17(10):1030-2.

Cette technique a largement fait ces preuves chez la levure, elle semble plus dlicate mettre en uvre chez dautres organismes eucaryotes. Ceci peut-tre expliqu essentiellement par deux raisons : Dans la levure, le gne X endogne est remplac par le gne X taggu, il ny a donc pas de protine endogne qui interfre avec la protine taggue pour la formation des complexes. De plus, on est ainsi sr que le niveau dexpression de la protine taggue est exactement celui de la protine native (puisque le gne taggu est sous la dpendance du promoteur de la protine native). La protine CBP interagit de faon non spcifique avec un grand nombre de protines de mammifre.
Jeronimo C, Langelier MF, Zeghouf M, Cojocaru M, Bergeron D, Baali D, Forget D, Mnaimneh S, Davierwala AP, Pootoolal J, Chandy M, Canadien V, Beattie BK, Richards DP, Workman JL, Hughes TR, Greenblatt J, Coulombe B. Related Articles, Links RPAP1, a novel human RNA polymerase II-associated protein affinity purified with recombinant wild-type and mutated polymerase subunits. Mol Cell Biol. 2004 Aug;24(16):7043-58. 6

 Pull down Une variante de cette mthode est le pull down . La mme chromatographie daffinit sera utilise mais, au lieu de retenir les billes dans une colonne, on les sdimentera par centrifugation. Une autre variante trs utilise aujourdhui, beaucoup plus performante mais aussi plus onreuse, consiste utiliser des billes magntiques. La rcupration se fera alors par lintermdiaire dun aimant. Ex. GST pull down, billes magntiques, complexe form in vitro. GST : glutathione Sulfo Transfrase fusionn avec la protine X entre les deux un site de digestion la thrombine. On veut tester la liaison de la protine X avec la protine Y. Pour cela, on va : 1 - fusionner la protine X avec la GST et marquer la protine Y. 2 - fixer la protine X sur des billes de glutathione spharose 3 - ajouter la protine Y en prsence d une grande Fixation et lavage quantit de protines comptiteurs (par exemple un extrait protique d E. coli) 4 - lavage, sdimentation des billes puis analyse 5 - fait la manip dans lautre sens - Y-GST / X* Protine X, fusionne la GST bille de glutathione spharose Protine Y, radioactive Protines comptiteurs autoradiographie Coloration coomassie

SDS-PAGE

Si on ne veut pas marquer la protine Y, on peut la dtecter par western. La mme technique est utilise pour aller pcher des partenaires de la protine X dans un extrait protique complexe.

Penser aux tmoins : billes + extraits, billes + GST + extraits car des interactions non

spcifiques de ce type peuvent tre obtenues et ce, indpendamment de la protine X. Autres systmes utiliss : steptavidine/biotine, Ni/6xHis, maltose/MBP, Avantage de cette technique : simple et rapide
7

Inconvnients : Dans le cas des GST-pull-down, la taille importante de la GST peut entrainer un encombrement strique qui peut gner la fixation de certains membres du complexe. On peut dans ce cas l essayer de mettre le tag en C-terminal si il tait en N (ou vice-versa). On peut aussi mettre un espaceur entre le tag et notre protine. Enfin, on peut aussi esayer avec un autre tag plus petit (flag, his, ) Toujours pour les GST pull-down, peu adapts ltude des dimrisations, la GST tant connue pour dimriser Souvent des faux positifs , valider la validit de ces interactions par une autre technique, si possible in vivo . Une amlioration de plus en plus utilise pour le puu-down consiste utiliser des billes magntiques sur lesquelles on a grff le lignad. Les billes seront alors rcupres en utilisant un aimant. Co immuno-prcipitation (co IP) La co IP est en fait un cas particulier du pull down. En effet, laffinit utilise ici est une affinit Antigne/Anticorps. Lanticorps utilis sera de prfrence un anticorps polyclonal, afin dviter que lpitope soit masqu dans le complexe. Limmunoprcipitation se fera alors en utilisant de la protine A ou de la protine G, couple des billes de spharose ou dagarose. Le choix protine A / protine G dpend de lanticorps que lon va utiliser (ex. protine A pour un IgG prpar chez la souris). La protine A et la protine G sont des protines recombinantes dorigine microbienne qui prsentent la capacit de fixer les molcules dimmunoglobuline de mammifre. Ces protines sont couples de faon covalente diffrents supports (billes dagarose, de spharose, billes magntiques, ). Linteraction entre ces protines et les Ig nest pas quivalente pour toutes les catgories danticorps : Protine A Source Poids Molculaire Nombre de sites de fixation pour les Ig pH optimal dinteraction Antibody Protein A E. coli 42,000 5 8.2 Protein G
8

Protine G E. coli 22,600 2 5

Human IgG Human IgA Human IgM Human IgE Human IgD Mouse IgG Rat IgG Rabbit IgG Rabbit IgM Goat IgG Goat IgM Sheep IgG Sheep IgM Bovine IgG Horse IgG Guinea Pig IgG Hamster IgG Pig IgG Donkey IgG Dog IgG Cat IgG Rhesus Monkey IgG Chicken IgG dinteraction; non test.

S W W M NB S W S NB W NB W NB W W S M S M S S S NB

S NB NB NB NB S M S NB S NB S NB S S S W S W W S NB

W = interaction faible; M = interaction moyenne; S = interaction forte; NB = pas Si les Ig dont nous disposons pour faire limmunoprcipitation ne se fixent ni sur la protine A, ni sur la protine G, il est toujours possible de faire un sandwich : Ex. : Si mon Ac a t ralis chez la chvre et quil est essentiellement compos dIgM, il faudra rajouter des IgG anti chvre ralises chez lne (donkey) et utiliser alors de la protine G. Pratiquement, on va dans un premier temps raliser linteraction extrait nuclaire/protineA ou G fixe sur les billes. Cette tape va nous dliminer toutes les protines de lextrait qui se fixent sur les billes de faon non spcifique (clearing).

On va alors centrifuger (ou passer sur le portoir magntique) et rcuprer le surnageant. Puis on va ajouter lanticorps dirig contre notre protine puis, enfin, un nouveau lot de billes protine A/ G. On va nouveau centrifuger (ou passer sur le portoir magntique) et rcuprer les billes que lon va laver afin de se dbarrasser de toutes les interactions non spcifiques.

Bille de spharose

Anticorps

Protine A

Protine cible

Partenaire

Enfin, il faudra luer les complexes des billes. Diffrentes techniques sont alors possibles en fonction du type danalyse que lon veut raliser sur les co-immunoprcipitats (reprendre dans du tampon SDS/DTT et chauffer si on veut faire une sparation sur gel polyacrylamide dnaturant, lution par la force ionique si on ne veut pas rcuprer notre protine, lution par un peptide comptiteur, ) Les avantages de la Co IP sont nombreux : Le complexe est form in vivo avec de la protine native (et non une protine laquelle on a ajout un Tag). Laffinit Ag/Ac est trs forte (en gnral, attention aux mauvais Ac), on peut donc utiliser des lavages forte force ionique pour ne rcuprer que les protines partenaires fortement lies, on ne risque pas de dissocier la liaison Ag /Ac. La liaison Ag/Ac est trs spcifique. Mais il y a aussi un inconvnient majeur, avoir un Ac immunoprcipitant (bonne affinit), cependant ce problme peut-tre dtourn en utilisant des billes magntiques sur lesquelles on a fix lAc. L aussi, des contrles doivent tre raliss : billes/protine A, billes/protine A/Ac. Dans le cas de complexes de tailles importantes, le/les pitopes peuvent tre masqus, on ne pourra pas alors utiliser cette mthode (les tag, eux, sont positionns sur une extrmit de la protine, souvent avec un espaceur => posent moins de problme ce niveau-l) . On peut perdre notre protine lors du clearing si elle se fixe sur les billes/protine A ou G de faon non spcifique. Dans ce cas l, essayer un autre support !
10

Cross-linking (association par des agents pontants)

On lutilisera en complment dune des techniques dcrites ci-dessus chaque fois que lon voudra stabiliser une interaction. Le principe consiste associer de faon covalente la protine tester avec son partenaire puis disoler le complexe, par exemple par SDS-PAGE ou gel filtration (les techniques de sparation en milieu dnaturant sont alors utilisables puisque lon a rendu les interactions covalentes). Cette technique nous permet de rvler des complexes prsentant des interactions de faible affinit. Elle peut aussi se raliser in vivo, condition que les agents cross-linkant utiliss traversent les membranes de la cellule. Enfin, en utilisant un ensemble dagents pontants qui agissent des distances variables, on pourra positionner les diffrents constituants au sein dun complexe multimolculaire. Les agents cross-linkant chimiques : Il existe un trs grand nombre dagents cross-linkant chimiques. Ils se distinguent : Par la nature du rsidu impliqu dans le cross-link (-NH2 : amine, -SH : sulfhydryls, carbohydrates, non slectifs photoactivables), - COOH : carboxyls, OH : hydroxyls Par la distance entre les deux espces cross-linker (de 1,5 plus de 30 A) Par la possibilit de rverser le cross-link (certains ne sont pas rversibles, dautres le sont en prsence de thiols, dun milieu basique, de priodate ou dhydroxylamine Le milieu dans lequel ils sont solubles (on choisira de prfrence ceux qui le sont en milieu aqueux pour un cross-link in vivo) Leur capacit traverser les membranes de la cellule (indispensable pour un crosslink in vivo) Le nombre de partenaires (deux ou trois) quils peuvent assembler,

La socit Pierce en commercialise un trs grand nombre, toutes leurs caractristiques sont rpertories dans leur catalogue. Leur site sur le web www.piercenet.com permet mme un guide de slection de lagent cross-linkant en fonction de lexprience que lon veut raliser. Exemple dagents cross-linkant trs utiliss : 2-iminothiolane hydrochloride (ITL) agent qui permet les cross-link trs longue distance (14.5 A) permet dassocier un complexe dans son intgralit. Lacide amin concern par le cross-link est la lysine
11

Dithiobis[succinimidyl propionate] (DSP) ou ractif de Lomants distance de crosslink : 12 A soluble dans leau, rversible (DTT) ne traverse pas les membranes. Le groupement ractif est le groupement amine des chanes latrales des acides amins. Autres agents : UV, glutaradhyde, formaldhyde Cette technique ne peut tre utilise de faon indpendante si on travaille avec plus de deux protines. En effet, elle ne nous permet pas daffirmer quil y a interaction directe ou seulement une proximit dans lespace qui peut tre due une interaction indirecte.

5. Identification des protines du complexe

Sparation de ces protines Gel 1D (dnaturant, de type SDS-PAGE) Cest bien sur la faon la plus simple de procder, mais on peut tre limit par la qualit de la rsolution (bandes trop proches sur le gel pour pouvoir tre dcoupes). Pour amliorer la rsolution du gel, on peut jouer : Sur le % en acrylamide, ventuellement en gradient Sur le tampon de migration (tris tricine par exemple) Sur la taille du gel Gel 2D Si le complexe protique est difficilement sparable sur gel 1D (grand nombre de protines ou protines de masses proches), on peut faire un gel en deux dimensions (isolectrofocalisation (IEF) dans une premire dimension les protines seront spares en fonction de leurs points isolectriques, puis SDS PAGE dans la deuxime). Chromatographie Des systmes de chromatographie trs rsolutifs en haute pression (type HPLC) peuvent galement tre utiliss pour la sparation des diffrents constituants du mlange. Des systmes coupls HPLC/spectro de masse sont dailleurs disponibles sur le march. Une fois les protines spares, il faut pouvoir les identifier.

12

 Identification de ces protines Western blot Si on prsume de la prsence dune protine P dj connue, on peut faire un western blot laide dun anticops anti-P. Si les protines ont t rcupres par co-immunoprcipitation, on peut, dans certains cas, rencontrer un autre problme : la protine que lon veux dtecter migre la mme vitesse que les chanes lourdes ou lgres des anticorps qui nous ont servi immunoprcipiter. Dans ce cas l, deux solutions sont possibles : La mthode TrueBlot commercialise par eBioscience : Cette mthode a t mise au point pour des protocoles mettant en uvre des immunodtections de protines immunoprcipites. En effet, cette technique permet de dtecter prfrentiellement la forme native (avec les ponts disulfide) des immunoglobulines, permettant ainsi de ne pas rvler les anticorps qui ont permis de raliser limmunoprcipitation. La technique TrueBlot permet donc de rduire les interfrences entre la chane lourde (~55 kDa) et la chane lgre (~23 kDa) des immunoglobulines et nos protines lors de la rvlation du western blot.

Une deuxime possibilit consiste utiliser pour le western blot un anticorps ralis dans une espce diffrente de celle qui a t utilise pour fabriquer lanticops utilis en immunoprcipitation. Micro Squenage Dans un premier temps, il faut transfrer le gel sur une membrane de nitrocellulose (ne pas colorer le gel cette tape l). La coloration de la membrane est ensuite ralise au bleu collodal. Cette technique, bien que plus sensible que celle au bleu de coomassie, ne donne quune sensibilit moyenne (quelques dizaines de ng dtects et est donc parfois insuffisante pour dtecter des protines peu reprsentes ou de petites tailles).
13

On dcoupe ensuite la bande qui correspond notre protine. La protine est alors squence par dgradation dEdman. La squence des seuls premiers acides amins est alors ralisable (15 20). Cependant, dans de nombreux cas, cela suffit identifier une protine. Des vrifications de la validit de linteraction sont bien sur indispensables. Si lextrmit N terminale est bloque (formyle en particulier), le microsquenage nest pas possible. Il faut alors digrer la protine sur la membrane (en gnral, digestion la trypsine coupe aprs R et K digestion totale), luer les peptides obtenus, les sparer sur gel rsolutif, retransfrer sur membrane etc. Le rendement est alors largement diminu puisquun grand nombre dtapes sont rajoutes et on arrive souvent trop peu de protines pour pouvoir avoir des rsultats interprtables. Cette technique nest quasiment plus utilise et a t remplace par la suivante, beaucoup plus efficace et plus sensible (10x moins de matriel sans compter pertes au transfert). Digestion trypsique / Spectroscopie de Masse Maldi-ToF La premire tape consiste dcouper la bande dacrylamide qui les contient. Pour cela, il faut colorer le gel. Le bleu de coomassie est un colorant compatible avec la technique prsente ci-dessous, mais sa sensibilit de dtection est trop souvent limitante. Le bleu collodal est lui aussi utilis, il prsente une sensibilit un peu plus importante que celle du bleu de coomassie. Les colorations largent, peu recommandes, sont utilisables, bien que donnant des rsultats moins bons. En fait, la coloration largent ralisant des pontages covalents, elle est irrversible et donc thoriquement non utilisable pour le microsquenage ou la masse. Cependant, seules les protines en surface du gel sont affectes et une petite quantit de protines (non modifies) restent utilisables. De plus, on utilise une coloration largent sans fixation la glutaraldhyde dite maldi compatible . Cependant, cette technique de coloration tant de loin la plus sensible, elle est dans certains cas la seule utilisable. Enfin, de nouveaux colorants, visibles aux ultraviolets ou laide de scanners fluorescence comme tous ceux de la famille du sypro (sypro orange, sypro rubis) donnent dexcellents rsultats trs sensibles et quantitatifs mais dont lutilisation est beaucoup plus onreuse. La bande dcoupe est alors digre la trypsine (ou toute autre protase spcifique). La masse prcise de lensemble des peptides obtenus (au 1/100me de PM) est alors dtermine par spectromtrie Maldi ToF (ou autre spectrophotomtre de masse prsentant ce type dionisation). La comparaison avec des banques de donnes nous permet didentifier la protine recherche.

14

Moteurs de recherche d'empreinte peptidique... ProFound : Sans aucun doute le moteur le plus rapide actuellement. Il n'y manque que trois choses: l'affichage du recouvrement de squence sur la page rsume des candidats trouvs, et la possibilit de se faire envoyer les rsultats par Email, ou de sauvegarder ces rsultats dans un format permettant de re-soumettre la recherche 6 mois plus tard sans rentrer nouveau tous les paramtres. A part a on apprcie beaucoup la possibilit de rechercher un mlange de plusieurs protines, et de rechercher d'autres protines avec les masses qui n'ont pas coll avec le premier rsultat. Le Must: la page de rsultats dtaills de chacune des protines candidates est admirablement lisible et des graphiques permettent de se faire une ide instantane sur la plausibilit de l'identification! Peptident: bas sur "Swiss prot", une srieuse banque de donnes non redondantes hberge par ExPASy(Expert Protein Analysis System). Le site est trs riche d'outils scientifiques grce l'Institut Suisse de Bioinformatique (SIB). Juste un peu lent et difficile dchiffrer Mais il permet de recevoir le rsultat par Email, ou de sauvegarder la page localement. La recherche est immdiatement renouvelable d'un simple clic! Mascot: mis disposition par Matrixscience. Le moteur est bas sur les algorithmes de Mowse hberg par l'Imperial Cancer Research Fund Londres. Assez rapide, ce moteur ne demande pas d'information de pI, et l'entre de la masse molculaire est indicative, elle n'exclut pas de candidats, ce qui peut-tre avantageux dans le cas de protines tronques. Les rsultats sont envoys par Email si vous n'avez pas la patience de les attendre. Enfin il intgre les modifications telles que celles apportes par la technologie ICAT. Les informations sont un peu trop brivement rsumes mais sils ne sont pas sauvegards sur votre disque dur, ils sont toujours accessibles sur celui du moteur ( condition d'enregistrer l'adresse). Msfit: est un moteur mis la disposition des chercheurs avec d'autres outils par l'universit de Californie San Francisco (UCSF Mass Spectrometry Facility) sous la forme de "protein prospector". Il intgre les modifications telles que celles apportes par la technologie ICAT. D'autres moteurs y sont indiqus. Si des ambiguts restent lever, un squenage par LC/MS/MS est possible, il nous permettra dobtenir la squence de 5 10 acides amins. La digestion trypsique est alors toujours une digestion totale et la sparation des peptides est ralise grce un systme de chromatographie en phase liquide (LC) qui est coupl au Spectro de Masse (en tandem). Le premier tage de MS sert slectionner un ion, et le second analysera les ions issus de la fragmentation de celui-ci. La fragmentation se ralise par coupure au niveau des liaisons peptidiques principalement (et ce partir des deux extrmits). Il est alors possible de dduire de l'ensemble des ions obtenus la squence peptidique lue simultanment dans les deux sens.

15

Quelle que soit la technique utilise, les interactions doivent ensuite tre vrifies in vitro et mme de prfrence in vivo afin de Sassurer de la validit de linteraction Vrifier si cette interaction est directe ou indirecte.

6. Vrification de la validit de linteraction in vitro

Les mmes techniques de pull down, co immunoprcipitation (coIP dcrit plus loin), peuvent tre utilises mais, auparavant il faudra produire la protine Y tester, de prfrence avec un Tag. Si on possde des Ac contre cette protine, cette tape ne sera pas ncessaire, il suffira de faire des IP croises. On a lanticorps correspondant la protine Y CoIP avec Ac anti Y sur extraits protiques totaux ou fractionns (on ne sait toujours pas si linteraction est directe ou pas) On na pas dAc anti Y On purifie lADNc (RT PCR partir dARNm extraits de la cellule dont on a isol la protine Y) ou gne synthtique On le clone dans un vecteur dexpression puis on produit la protine (in vitro, chez coli ou autre systme de production (cellules dont on a isol la protine Y en particulier) On purifie la protine Y (grce son Tag que lon aura pris soin de lui rajouter) pas besoin de purifier si traduction in vitro puis CoIP (anti X), pull down, ou chromatographie daffinit avec protine X purifie -> interaction directe ou pas ou pull down avec des extraits protiques raliss avec les cellules dont on a isol la protine Y (l, on ne peut pas savoir si linteraction est directe ou pas) On peut aussi faire un far western : (overlay assay) Far western : Les protines cibles potentielles sont tout dabord spares sur un gel dnaturant (SDSPAGE) ou sur un gel en conditions non dnaturantes (gel natif). Pour plus de rsolution, on peut aussi utiliser un gel 2D. Les protines sont transfres sur une membrane de nitrocellulose. On va alors rnaturer (au moins partiellement) les protines fixes sur la membrane. Si on a utilis un gel natif ou si on a directement spott la protine purifie sur la membrane, cette tape nest pas ncessaire. Les protines sont alors sondes avec la protine dintrt.
16

Il y a plusieurs mthodes pour rvler la protine cible lie la membrane via une protine : La protine est marque laide dun isotope radioactif, La protine est rvle laide dun anticorps (cette technique prend souvent le nom de blot overlay . La protine cible a t biotinyle au pralable et sa prsence est rvle laide de streptavidine, elle-mme lie une activit enzymatique.

7. Vrification de linteraction in vivo

FRET Microscopie de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Le FRET est une technique qui permet de dtecter la proximit de deux molcules. Chacune de ces molcules porte un groupement fluorescent et la technique repose sur le transfert, par rsonance, de lexcitation de lun de ces groupements (le donneur) lautre (laccepteur) sans mission dun photon. Le receveur excit peut librer un photon qui est dtect et indique que le donneur et le receveur ont t proximit lun de lautre car lefficacit du FRET est proportionnelle linverse de la puissance 6 de la distance entre ces deux molcules. Les expriences de " FRET " nous permettent donc de visualiser directement linteraction entre deux molcules par un transfert dnergie de fluorescence. Pour cela, les deux partenaires de linteraction (protine A et B) doivent tre conjugus avec un couple de fluorophores de couleurs diffrentes (donneur et accepteur). Quand linteraction entre A et B amne les colorants fluorescents faible distance lun de lautre, un signal de fluorescence nouveau est dvelopp. La prsence de ce signal confirme la faible distance et donc linteraction entre A et B. Ces interactions peuvent tre suivies en temps rel grce une camra jointe au microscope fluorescence. Pour raliser le transfert dnergie de fluorescence, les deux molcules doivent tre spares par 10 100 Angstroms, les spectres dabsorption de la premire molcule fluorescente (le donneur) et de la deuxime molcule fluorescente (laccepteur) doivent se superposer et les orientations des diples du donneur et de laccepteur doivent tre peu prs parallles. De plus, la longueur donde dmission de fluorescence du donneur doit tre plus faible que la longueur donde dexcitation de laccepteur. La distance laquelle le transfert est efficace 50% est appele distance de Frster et varie selon les agents fluorescents utiliss.

17

Donneur
Fluorescine IAEDANS EDANS Fluorescine

Accepteur
Tetramethylrhodamine Fluorecine Dabcyl QSY7 et QSY9

Distance de Frster (RO) Angstrm

55 46 33 61

La famille des GFP (green fluorescent protein) offre diffrentes paires de mutants utilisables pour des expriences de FRET. Par exemple, le mutant appel EGFP (Enhanced GFP) et le mutant appel BFP (Blue Fluorescent Protein).

Une variation de cette technique est la scintillation proximity assay ou SPA. La protine partenaire est radioactive, marque au 35S et la protine cible est reconnue par un anticorps li une bille de scintillant. Le rapprochement de la protine radioactive et du scintillant converti la radioactivit en nergie lumineuse.

18

8. Mthodes permettant didentifier un partenaire protique tout en isolant son ADNc

Criblage en interaction sur colonies ou sur plages de lyses Il sagit dutiliser dans un premier temps la trs classique technique de criblage dune banque dexpression, la seule diffrence repose sur le fait que le criblage ne fait pas avec un anticorps mais avec un oligonuclotide double brin marqu radioactivement. Les clones exprimant la protine interagissant avec cet ADN seront donc reprs aprs autoradiographie du filtre. La banque peut-tre faite dans un plasmide ou dans un phage (lamda par exemple). Lavantage du phage sur le plasmide est quil vite ltape de lyse des bactries pour accder aux protines. Banque ADNc Promoteur

Ligation, transformation chez E. coli

Plages de lyse

Criblage avec la protine de fusion phosphoryle en prsence d ATP*

GST P prot. appt

Clones + autoradiographie

Rcupre et squence les clones + (ADNc bleu et orange) Pour marquer la protine appt, soit on la traduit in vitro en prsence de mthionine 35S, soit on ralise une fusion traductionnelle avec un site consensus de phosphorylation avec une protine kinase (par exemple la PKA protine kinase A site reconnu : RRASV, avec phosphorylation de la serine). De nombreux vecteurs dexpression proposent ce type de construction (par exemple fusion GST site PKA protine tester.

19

Phage display

Une alternative cette technique consiste faire du phage display, on peut alors faire un enrichissement en phages positifs en milieu liquide, ce qui permet damliorer le nombre de clones que lon pourra tester. Cette technique consiste faire exprimer la protine cible la surface dun bactriophage non lytique. Ces phages seront utiliss pour infecter des bactries E. coli. Le bactriophage utilis ici est le bactriophage filamenteux M13. Pour faire exprimer nos protines cibles en surface de ce bactriophage, leur ADNc est clon en fusion avec le gne III qui code pour une protine mineure de la capside qui est exprim la surface du phage. Le site de clonage se trouve en N terminal de la protine du gne III afin que le motif protique variable soit tourn vers lextrieur, donc accessible une slection et afin quil puisse adopter un repliement indpendant de celui de la protine "hte". Une banque dADNc (prpare par une des deux techniques qui fabriquent des ADNc incomplets dans leur partie aval ) est insre au niveau du site de clonage.

Les phages sont obtenus par transformation de bactries E. coli (electroporation) avec en thorie un phage donc un motif peptidique par bactrie. Les phages sont rcuprs dans le surnageant de culture et slectionns par rapport la protine voulue. La slection peut se faire de diffrentes faons en fonction des caractristiques de la protine appt : Fixation directement sur un support activ Colonne daffinit si la protine est tague ou biotinyle, Les clones slectionns sont utiliss pour rinfecter des souches bactriennes, les surnageants sont rcuprs et reslectionns contre la protine. En rptant cette tape de slection plusieurs fois, on enrichit notre population en clones les plus spcifiques de lappt. Ces candidats sont alors clons et squencs et on peut ventuellement dduire une squence consensus entre toutes les squences obtenues.

20

Particules virales exprimant des fragments d ADNc

Fixation sur une protine cible

Amplifications (infection d E. coli)

34X

lavages

lutions
(augmente conc. en NaCl par ex.)

talement sur boite de ptri Amplification des clones individuels Squenage de ces clones

Cette technique est plus rapide que le double hybride, mais moins sensible. Elle permet de cribler trs rapidement une grande quantit de clones. Des variantes de cette technique ont t mises au point par diffrentes boites de biotechnologie, et en particulier par invitrogen qui commercialise un systme chez coli qui fait exprimer la protine de fusion au niveau des pili (cela vite de passer par des phages) et un systme qui fait exprimer la protine de fusion la surface de cellules eucaryotes (levure ou mammifre). Complmentation Cette mthode permet de voir les interactions protineprotine lintrieur des cellules vivantes. Les deux partenaires sont fusionnes avec deux parties dune protine qui se complmentent comme par exemple les peptides et de la -galactosidase (Rossi et al., 1997). Lactivit de la -galactosidase provient de linteraction entre les deux protines. Dautres protines peuvent tre utilises : la lucifrase (Paulmurugan et Gambhir, 2003), Lubiquitine (Johnsson et Alexander, 1994), elle est reconstitue et elle active un facteur de transcription. La guanine exchange factor (GEF). La
GFP Protine A Intine (N term) +

Protine B Intine (C term) GFP (C term)

N C

GFP (N term)

21

complmentation amne le domaine catalytique proximit du domaine de liaison la membrane ce qui permet de complmenter des mutants de GEF thermosensibles de levure (Aronheim et al., 1997). La reconstitution peut tre mesure soit par une activit enzymatique comme dans le cas de la lucifrase soit par le phnotype comme dans le cas de la GEF. Linteraction des deux protines peut fonctionnaliser une intine en rapprochant les sites dpissage N et C terminaux. Lpissage libre alors une GFP fonctionnelle (Ozawa et al., 2000).

22

 Double hybride ou pige interaction . La mthode de double hybride est une mthode qui permet dtudier les interactions in vivo. Cependant, pour le moment, la technique qui fonctionne trs bien chez la levure, pose encore beaucoup de problme chez leucaryote suprieur. Il ne sagit donc pas dun vrai in vivo, mais plutt dune technique qui utilise un organisme vivant, la levure, comme tube essai. Cependant, cette technique, trs performante, permet de tester avec un trs grand rendement, les interactions directes protine / protine. Elle permet de plus de rcuprer directement lADNc correspondant aux protines ainsi identifies, ce qui simplifie fortement les tapes ultrieures. Cette technique est base sur la capacit des domaines de liaison lADN (BD) et dactivation de la transcription (AD) du facteur de transcription Gal4 fonctionner de manire indpendante. Dans le systme du double hybride, ces deux domaines sont spars et chacun est fusionn aux protines dintrt (X et Y). Ainsi, cest linteraction entre les deux protines X et Y qui permettra de reconstituer un facteur de transcription actif. Il y aura alors transcription de gnes rapporteurs. Gne rapporteur : gne non prsent dans la souche de levure utilise et dont lexpression est facilement reprable. Ex : lacZ : gne dE. coli, non prsent chez S. cerevisiae facile reprer grce son activit enzymatique. Autres rapporteurs utiliss : gnes dauxotrophie : HIS, ADE, URA. Ces gnes sont des gnes de levure. Il faudra donc utiliser des souches dficientes pour ces gnes pour raliser ces
expriences ces levures devront galement tre Gal4 .

La squence codant la protine X (lappt) sera fusionne la squence codant pour le domaine de liaison lADN de Gal4 -> clone dans un plasmide La proie (protine Y) correspondra soit lADNc de la protine dont on veut tester son interaction avec la protine X, soit une banque dADNc si aucune exprience prliminaire na encore t ralise. Sa squence sera fusionne avec le domaine dactivation de la transcription de Gal4. -> clone dans un plasmide Le gne rapporteur, prcd du promoteur portant les sites de liaison de Gal 4 (rpts 6x), est insr dans le gnome de la levure. Les deux plasmides sont co-transforms dans la souche de levure approprie (gne rapporteur et dficiente pour les gnes dauxotrophie utiliss comme rapporteurs.
23

Les protines X et Y ninteragissent pas.

Y X
Gal 4 BD

Gal 4

AD

Pas dexpression
ARN Pol II

Gne rapporteur

Sites de liaison de Gal 4

Les protines X et Y interagissent.

Y
Gal 4

X
Gal 4

AD

Expression
ARN Pol II

Gne rapporteur

BD

Sites de liaison de Gal 4

Si les gnes rapporteurs sont leu2 et LacZ, les colonies positives seront capables de pousser sur milieu galactose en labsence de Leucine. Le dosage de lactivit galactosidase peut nous donner une ide de la force de linteraction. Les limites de la mthode : les faux positifs et les faux ngatifs. 1 Faux positifs (signaux positifs artfactuels en double hybride). Pour limiter le nombre de faux positifs, il est ncessaire, en pralable ou suite au criblage, deffectuer de nombreux contrles et dutiliser comme marqueur dinteraction plusieurs gnes rapporteurs diffrents par la squence de leur promoteur. Une interaction est juge potentiellement positive sil y a transcription de tous les gnes rapporteurs.

24

Faux positifs les plus frquemment rencontrs : Transactivateurs : Cest la capacit de X ou Y activer spontanment la transcription des gnes rapporteurs lorsquils sont fusionns BD ou AD. 1er cas : lappt X est transactivateur, la transactivation peut tre directe (a) ou se faire via une interaction avec une protine rsidente de la levure (b)
Leu (a) Appt transactivateur , la protine appt a une activit activatrice de transcription X Leu Leu2 (b) La protine appt X lie une protine de la levure capable dactiver la transcription Y AD X Z

BD

BD

Contrles: expression indpendante de la protine de fusion BD-X dans S. cerevisiae (tmoin ngatif) 2me cas : la proie Y est transactivatrice. Ceci a lieu quand la protine AD-Y est recrute au promoteur Gal de manire indpendante de la proie. Il y a 2 cas classiques : 1. 2. liaison directe de Y au promoteur (a) liaison des protines (b) de lhte complexes au promoteur (ex : TATA Binding Protine)
(a) Y AD (b)

AD

TB

Contrles effectuer : expression de AD-Y seul (tmoin ngatif) Faux positifs dus une affinit artfactuelle des protines proies et appt par les domaines BD et AD 2 cas classiques : 1. La protine proie reconnat BD

AD

BD

Contrle (tmoins ngatifs): combinaison AD-Y + BD et/ou AD-Y + BD-lamine (protine non relie)

25

2.

La protine appt reconnat AD

Y X AD

Contrle : combinaison BD-X + AD

BD

Intervention dune troisime protine Z adaptatrice :

AD

Contrle avec techniques in vitro (ex : GST-pull-down, co-immunoprcipitation)

BD

Dans tous les cas, la spcificit dune interaction doit tre contrle par des tests en double hybride avec des protines appts distinctes de la protine dintrt (contrle de la spcificit de linteraction vis--vis de lappt utilis) 2 - Faux ngatifs (incapacit en double hybride mettre en vidence des interactions quon sait exister in vivo). Certaines modifications post-traductionnelles (ex : phosphorylation des tyrosines) essentielles linteraction ne sont pas ralises efficacement dans la levure Toxicit pour la levure des protines chimriques. Protines chimriques mal replies contrle : tester une proie connue pour interagir avec lappt Les protines ne sont pas dans leur environnement naturel pas dinteraction possible dans un environnement artificiel La protine nentre pas dans le noyau Il faut travailler dans des souches de levure gal4- afin dviter une activation par Gal4 endogne, or, ces souches poussent et se transforment moins bien que les souches sauvages.

26

Conclusion La mthode du double hybride permet de montrer que 2 protines sont capables dinteragir de faon binaire lorsquelles coexistent dans le noyau de la levure. La technique nest pas suffisante en soi pour valider linteraction. Le rsultat doit tre valid par dautres types dexpriences complmentaires (coimmunoprcipitation, pull-down) Ncessit dune validation biologique : les deux protines coexistent-elles dans lorganisme ? Peut-elle avoir une signification biologique ?

De nombreuses variations de la technique du double hybride ont t introduites, permettant son application des protines activatrices de transcription ou la recherche de protines liant des appts non protiques (ADN, ARN, ligands cf. rfrences). Encore aujourdhui, la plupart des systmes commercialiss sont des systmes levure, cependant, certains ont galement t dvelopps chez les mammifres (Clontech, Invitrogen). Dans le cas de la recherche dinteractions trimolculaires, un three hybrid system a galement t mis au point. Rfrences Rainer K., Brachmann and Jef D. Boeke (1997) Current opinion in biotechnology 8: 561568 Vidal M. and Legrain P. (1999) Nucleic Acids Research 27, n 4, 919-929 Fashena et al. (2000) Gene 250, 1-14

9. Caractrisation de linteraction
Quelle partie de la protine X interagit avec la protine Y Beaucoup de protines, en particulier des protines eucaryotes, prsentent une structure avec diffrents domaines structuraux indpendants. Dans ce cas, la protine peut tre dcoupe en diffrents morceaux capables de se structurer dans lespace indpendamment les uns des autres. Dans ce cas l (et dans ce cas l uniquement), on peut rechercher le ou les domaines impliqus dans linteraction protine/protine. dfinition des domaines structuralement indpendants
27

il est ncessaire de connatre la structure de la protine soit directement (RMN ou cristallographie), soit parce quelle appartient une famille dont la structure est connue, soit parce quelle prsente des domaines structuralement identifis. Ex : 1 squence protique pour X bioinfo (voir TP bioinfo)-> 1 domaine POU (lui-mme constitu de deux sous domaines POUh et POUs), 1 domaine GLU, 1 domaine ring. Pour Y, pas de domaines structuraux dfinis
POU
GLU RING

Clonage de ces sous domaines clonage dans un vecteur dexpression, production, ventuellement purification (pas oblig) PCR

Etude de leur interaction (far western, coIP, pull down) avec Y reprable (marquage par exemple).

28

 Kd, Kon, stchiomtrie de linteraction, dtermination des paramtres de tampon, Ultracentrifugation analytique L'ultracentrifugation analytique (UCA) est une mthode de choix pour l'tude des interactions en solution. En effet, elle permet de dterminer les stchiomtries, les processus d'association, l'agencement spatial des sous-units dans des complexes, l'influence des paramtres du solvant (pH, sel, temprature). Il existe deux types principaux dexpriences de sdimentation : vitesse de sdimentation quilibre de sdimentation La plus utilise pour tudier les interactions protine/protine est la deuxime. Pratiquement, on va mesurer prcisment la masse des particules prsentes dans des solutions prsentant des concentrations croissantes en protine A, protine B, et protine A + protine B. On pourra ainsi en dduire si la protine A est prsente en solution sous forme dun monomre ou dun multimre idem pour la protine B si les protines A et B sassocient. Si cela est le cas, la stchiomtrie de linteraction sera dduite de la masse du complexe. Des expriences de diffusion de lumire (DLS Dynamic Light scattering) peuvent nous apporter en plus une information sur la forme du complexe, information qui peut nous aider proposer un modle dinteraction pour ce complexe. Biacore La fonction de cet appareil est dj suggre par son appellation : "BIA" signifie Biospecific Interaction Analysis et "core", au cur de. En effet, le BIAcore est un automate qui permet de mesurer en temps rel toute interaction biologique sans marquage de molcules. L'intrt majeur de cette mesure en temps rel est de pouvoir visualiser, sur l'cran, la cintique de l'interaction et d'en dgager ses caractristiques propres. On peut ainsi mesurer les vitesses d'association et de dissociation et en dduire la constante d'affinit et la constante de dissociation Son principe de fonctionnement est d'enregistrer, en continu, la surface d'une lamelle ractive (appele "sensor chip") la modification de rsonance induite par toute interaction molculaire [rsonance plasmonique de surface ( S P R ) ] . Cette modification est directement proportionnelle la masse de molcule lie et sa quantit fixe sur le chip.
29

Le systme de mesure est compos de trois lments : 1. Le sensor chip Il comprend une lamelle de verre sur laquelle est dpose une fine pellicule d'or ellemme recouverte d'une couche de dextran carboxymthyl sur lequel on couple de faon covalente la premire molcule implique dans la raction que l'on veut tudier. Le couplage peut se faire par les groupements amines, par les sucres ou par les groupements thiols selon des procds de chimie classique. 2. La micro-plaquette fluidique Elle contrle l'injection (de 5 300 microlitres) et le dbit (de 1 100 microlitres/mn) des ractifs la surface du sensor chip. 3. L'unit optique Une lumire polarise est envoye sur un prisme de verre, en contact direct avec la lamelle de verre du sensor chip. Lappareil mesure et enregistre les changements de lindice de rfraction gnrs par un faisceau de lumire polarise dirige vers la face oppose de la feuille dor lors du processus dassociation et de dissociation de A et B. Le faisceau rflchi, qui est analys en temps rel par un ensemble de diodes, montre une extinction partielle pour un angle prcis dincidence, qui dpend de lindice de rfraction au voisinage de la feuille dor. Les signaux obtenus, mesurs en units arbitraires (units de rsonance ou RU) sont proportionnels la masse de B adsorbe la surface (pour les protines, 1 RU approximativement gal 1 pg.mm-2). Les courbes obtenues sont alors traites par le logiciel BIAevaluation -> constante dquilibre linterface Kd. L'interaction peut tre analyse rapidement en quelques minutes et ncessite de trs petits volumes de ractifs (80 microlitres en moyenne). En pratique, une protine ligand (A) est immobilise sur un support (chip). On distingue alors trois phases : 1 - Phase dadsorption : un tampon circule en flux continu sa surface. Dans ce tampon se trouve la protine (B) qui interagit avec la protine (A). 2 - Phase de dsorption : un tampon nincluant pas B est inject, conduisant une dissociation progressive des complexes AB forms.

30

3 Phase de rgnration : la dissociation est brutalement acclre, aboutissant une surface vierge de B, comme au dbut de lexprience.

Microcalorimtrie [Microcalorimtrie isotherme titration (ITC)] 1) Principe et mthode Afin de mesurer linteraction entre deux molcules et les paramtres thermodynamiques qui en dcoulent, il est ncessaire de mesurer les changes thermiques dus aux associations entre ces molcules. Le principe est le suivant : une macromolcule est place dans la cellule de mesure dun calorimtre isotherme puis est progressivement sature par injection laide dune seringue de petits volumes de la deuxime molcule. Linteraction entre 2 molcules peut saccompagner dun change de chaleur (absorption ou mission). Le suivi des interactions va se faire indirectement par suivi des changes thermiques. Prenons lexemple dun ligand se fixant sur une protine :

Ligand + protine = complexe + H

31

En fonction de la quantit de complexe forme, on obtient des signaux thermiques proportionnels qui seront visualisables sous forme de pics grce un logiciel (Origin). La mesure du signal thermique permet donc de mesurer la quantit de complexe form, et ainsi de mesurer les paramtres thermodynamiques de linteraction. Ainsi, la microcalorimtrie isotherme titration permet de mettre en vidence et de quantifier les interactions entre diverses familles de protines et leurs ligands potentiels et les modifications structurales qui en dcoulent. Interactions molculaires structure 3D

Une protine se replie et acquiert une conformation particulire dans l'espace. C'est cette structure tridimensionnelle qui dtermine la fonction que va jouer la protine dans la cellule. Connatre cette structure est donc une tape-cl si l'on veut comprendre le dtail des mcanismes de la cellule, par exemple pour concevoir des mdicaments. Pour tudier la structure tridimensionnelle des protines, mais aussi des complexes protine/protine, il y a plusieurs approches possibles : La RMN (Resonnance Magntique Nuclaire) On excite les atomes de la molcule tudie. Chaque atome rsonne une frquence qui lui est propre et qui dpend de son environnement magntique. L'atome rmet un signal cette frquence. La superposition des signaux provenant de tous les atomes est enregistre puis analyse. En jouant sur les diffrents types d'atomes et en utilisant des squences d'excitation particulires, on peut faire apparatre de faon slective certaines proprits gomtriques comme la proximit de deux atomes travers l'espace ou leur proximit dans le squelette de la molcule. Contrairement la cristallographie, l'analyse des spectres de RMN ne donne pas accs immdiatement la structure tridimensionnelle. Il faut d'abord attribuer chaque frquence de rsonance l'atome correspondant dans la molcule, puis utiliser les donnes gomtriques observes pour calculer la structure tridimensionnelle globale. Aujourd'hui, la RMN est limite par la rsolution des spectres, qui dpend directement de la puissance des champs magntiques utiliss pour exciter les atomes.
32

La RMN en phase liquide est la seule mthode amenant la structure atomique de macromolcules en solution. Elle comporte cependant des contraintes significatives sur la taille des molcules tudies (30 - 40 kDa au plus) comme sur leurs proprits de solubilit. La RMN du solide ouvre quant elle des possibilits intressantes, mais encore peu exploites, pour ltude de macromolcules sous forme de poudre (donc non cristallisable) et pour les protines membranaires. Cristallographie et diffraction aux rayons X En envoyant des rayons X sur un cristal de protines, on observe un spectre de diffraction. Grce une transformation mathmatique simple, il est possible d'accder rapidement la structure tridimensionnelle des protines dans le cristal. L'tape limitante de cette mthode est la production d'un cristal pur (un monocristal). Elle peut tre plus ou moins difficile, de faon plutt imprvisible. Amlioration de la technique : le rayonnement synchrotron. Le rayonnement synchrotron permet la production dun rayonnement X intense, stable, de longueur donde variable et de grande qualit optique. Ils offrent des donnes exploitables pour des cristaux de macromolcules que des mthodes classiques ne permettaient pas dtudier : mailles plus grandes (et donc molcules ou complexes plus grands), cristaux plus petits voire imparfaits. Dautre part, le rayonnement synchrotron a considrablement acclr la vitesse dacquisition des donnes, rduisant celle-ci quelques heures au lieu de quelques semaines. La trs grande majorit des tudes cristallographiques contemporaines reposent sur lutilisation de donnes collectes partir dun synchrotron. In silico Il est possible de prdire in silico la structure tridimensionnelle d'une protine X par homologie par rapport une autre protine, de structure connue et prsentant des homologies structurales avec la protine X. La prdiction ab-initio du repliement, sans autre information que la seule squence de la protine, reste encore largement hors de porte, sauf cas exceptionnels. La mthode ab-initio ncessite des puissances de calcul importantes. Toute molcule dessine doit tre minimise, cest dire que sa conformation doit tre amene une position stable. Cette procdure appele minimisation est un processus itratif dans lequel

33

les coordonnes des atomes sont constamment ajustes jusqu' amener la molcule une nergie minimale. La conformation ayant la plus basse nergie est considre comme la plus stable. Le docking est l'tude des interactions entre molcules. Dautre part, diffrents programmes ou serveurs permettent soit de prdire les rgions protiques permettant ventuellement une protine dinteragir avec une autre, soit de retrouver une interaction dj mise en vidence dans le pass. Quelques exemples de ce type de sites : banques dinteraction protine/protine DIP : Database of Interacting Proteins : http://dip.doe-mbi.ucla.edu Cette banque de donne catalogue les interactions (dtermines exprimentalement) entre protines. Ce site prsente un accs libre sur Internet et est suppos aider ceux qui tudient les interactions protine/protine, les voix de signalisation les interactions multiples et les systmes complexes. prdiction de surfaces potentielles dinteraction Protein protein Interaction server : http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server Ce serveur nous fourni un moyen de calculer une srie de paramtres descriptifs sur linterface entre deux chanes polypeptidiques dans une structure protique tridimensionnelle. En comparant ces rsultats avec des rsultats obtenus avec des protines connues pour interagir les unes avec les autres, on peut estimer la validit de linterface prdite entre nos deux protines. Inconvnient : ce programme ne fonctionne actuellement que sous Unix et ncessite une bonne connaissance en biologie structurale et en bioinformatique.

Applications conception de peptides inhibiteurs Lorsqu'un compos actif de base (LEAD) a t identifi (exprimentalement ou in silico) et sa structure chimique dtermine, on peut amliorer l'activit et/ou rduire les effets secondaires en modifiant sa structure chimique de base. Les peptides sont subsquemment optimiss par des modifications apportes aux chanes latrales ou au squelette de base. On peut ainsi concevoir des peptides avec des affinits suprieures la cible (par rapport la molcule de dpart). Mais le plus grand dfi qui reste surmonter dans le cas des inhibiteurs peptidomimtiques est de modifier ceux-ci pour qu'ils puissent tre absorbs oralement et qu'ils ne se dcomposent pas rapidement dans lorganisme. Il faut alors trouver des inhibiteurs de type nonpeptidique.
34