LUCRAREA DE LABORATOR N 1

TEMA: LABORATORUL MICROBIOLOGIC. MORFOLOGIA BACTERIILOR. COLORAŢIA SIMPLĂ.

EXAMEN MICROSCOPIC.

ÎNTREBĂRI PENTRU CONTROL:

1. Tipurile de laboratoare microbiologice şi sarcinile lor.
Conform materialului studiat:
-Laboratoare de parazitologie;
-Laboratoare de serologie;
-Laboratoare de bacteriologie;
-Laboratoare de virusologie.
Conform ariei de investigare:
-Lab.de microbiologie alimentară;
-Lab.de microbiologie a mediului;
-Lab.de microbiologie medicală;
-Lab.de microbiologie industrială.
Conform biosiguranței:
-de bază-nivel de biosiguranță 1(învățământ,cercetare);
-de bază-nivel de biosiguranță 2(diagnostic,cercetare);
-securizat-nivel de biosiguranță 3(învățământ,cercetare);
-înalt securizat-nivel de biosiguranță 4(agenți patogeni foarte periculoși);
Rolul esenţial al unui laborator de microbiologie medicală, dintr-un spital constă în stabilirea
diagnosticului etiologic al infecţiilor şi controlul permanent al potenţialului nosocomial în unitatea sanitară
respectivă.
Laboratorului de microbiologie al unui institut de învăţământ superior îi revine în plus, sarcina de
centralizare a datelor de rezistenţă bacteriană din zona geografică aferentă, precum şi de efectuare a testelor
de precizie referitoare la mecanismele genetice de transmitere a rezistenţei

2. Amenajarea şi utilajul laboratorului microbiologic. Locul de lucru al bacteriologului. Regimul şi

regulile de lucru în laboratorul microbiologic.
Dotare materială:
-Încăperi adecvate;
-Instalații adecvate;
-Mobilier necesar;
-Microscoape;
-Consumabile de la laborator;
-Instrumentarul de laborator;
-Aparatură din laboratorul de microbiologie;
Reguli:
1. Purtarea materialului de protecţie: halat, mănuşi, mască.
2. Repartizarea judicioasă a aparaturii şi materialelor de laborator pentru a se realiza o economie în mişcări,
prin excluderea deplasărilor inutile.
3. Prevenirea defecţiunilor sau accidentelor prin:
 • pregătirea materialului de rezervă,
• notarea corespunzătoare a tuturor produselor, recipientelor utilizate, precum şi în caietul de lucru,
etichetarea soluţiilor.
4. Manipularea corectă a materialului infectant (la recoltare, examinare, însămânţare, inoculare etc.) se
asigură prin respectarea normelor de asepsie: 5. Se va asigură controlul zilnic al funcţionării termostatului,
răcirea instalaţiilor de gaze, electricitate, fisa de temperatura pentru frigidere.
6. În încăperile unde se lucrează cu produse contaminate sau culturi microbiene nu se mănâncă, nu se
fumează.
7. Este interzisă aşezarea pe masa de lucru a hainelor, servietelor, cărţilor.
8. Sterilizarea cu ultraviolete a suprafeţelor de lucru şi a aerului din încăperi se va face cu intensitatea şi pe
durata de timp corespunzătoare normelor de randament optim al lămpii.

3. Noţiune de microorganisme. Clasificarea, categoriile taxonomice.

Particularitățile microorganismelor procariote şi eucariote.
Microorganisme / microbi – organisme microscopice, cu dimensiuni de ordinul µm (10-6 m) sau nm (10-9
m). Mi/o reunesc bacteriile şi alte tipuri de organisme: alge, ciuperci microscopice (fungi, micete),
protozoare, virusuri şi agenti subvirali, de ex. prioni.
Clasificare-fenotipică,genotipică,filogenetică.
Clasificare actuală:
I.Forme acelulare (virusuri, viroizi, prioni)
II. Forme celulare, repartizate în 3 domenii:
- Bacteria – procariote (bacterii adevărate, eubacterii). a) Bacterii cu perete celular fin, gram-negative; b)
Bacterii cu perete celular gros, gram-pozitive; c) Bacterii lipsite de perete celular (micoplasme)
- Archaea – procariote, perete celular fără peptidoglican, cu habitat în condiţii extremale
- Eukarya – eucariote. Include regnurile Fungi,Animalia.
Principalele grupe taxonomice:
Domeniu - Regn - Tip - Clasă - Ordin - Familie - Gen - Specie (unitate fundamentală);

Particularitățile microorganismelor procariote și

eucariote
4.Metodele microbiologice de diagnostic. Esenţa lor.
DIAGNOSTICUL DIRECT
Constă în detectarea agentului patogen, a componentelor lui sau a unui produs (ex. toxina) în prelevate de la bolnav
sau din mediul extern
1. Examenul microscopic - studierea mi/o în stare vie/nativă sau în frotiuri colorate. Este o metodă de orientare.
Informează despre prezenţa bacteriilor, forma lor, structura, numărul.
2. Depistarea antigenelor microbiene solubile în lichide biologice (ser sangvin, LCR, urină…)
3. Examenul bacteriologic – izolarea pe medii nutritive a culturilor pure de bacterii, care vor fi identificate şi testate
la sensibilitate faţă de antibiotice;
4.Examenul biologic (metoda experimentală) – inocularea directă a produsului patologic la animale de laborator
receptive. Mi/o se multiplică provocând maladia tipică. Din lichide biologice sau ţesuturi afectate bacteria poate fi
izolată şi identificată.
5. Identificarea ADN sau ARN microbian prin tehnici de biologie moleculară
DIAGNOSTICUL INDIRECT (imunologic)
1. Serodiagnosticul – depistarea şi titrarea anticorpilor specifici în serul bolnavului. Ei apar peste 7-10 zile de la
debutul maladiei si persistă deseori după vindecare
2. Intradermoreacţiile (metoda alergică) – întroducerea pe cale epidermică sau intradermică a alergenului
microbian şi apariţia, peste 2-4 zile, a unei reacţii celulare locale (eritem, infiltrat). Reacţia pozitivă semnifică o stare
de hipersensibilitate specifică (întâlnire repetată cu acest agent)
5.Morfologia bacteriilor (formele sferice, alungite şi încurbate).

Formele sferice (coccus)

În funcţie de planurile de diviziune şi poziţia celulelor-fiice după diviziune, cocii prezintă următoarele moduri de
grupare:
- Diplococi (Diplococcus)– perechi (neisserii -bob de cafea, pneumococi - lanceolati) (Meningococul)
- Streptococi (Streptococcus) - lanţuri
- Tetracoci (Micrococcus) – câte 4 celule
- Sarcine – (Sarcina) – pachete din 8-16-32 coci (sarcio – a lega)
- Stafilococi – (Staphylococcus) – grămezi neregulate de coci (staphyle - ciorchine)

Formele alungite, cilindrice (bastonaşe)

1. Bacterium – bastonaşe cu capetele rotunjite, nu formează spori (Mycobacterium, Corynebacterium, enterobacterii,
escheichia coli, agenții febrei tifoide,dizenteriei, tuberculozei)
2. Bacillus – bastonaşe mari cu capetele retezate, formează spori ce nu depăşesc diametrul celulei (ex.: Bacillus
anthracis (antraxul)). Posibilă aranjarea în lanţuri - streptobacili.
3. Clostridium – bastonaşe cu capetele rotunjite, formează spori ce depăşesc diametrul celulei (ex.: Clostridium
tetani, Clostridium botulinum, C. perfringens, etc)

Formele încurbate (spiralate)

1. Vibrio (de la cuv. lat. “vibrio” - tremurător) – bastonaşe încurbate (1/2 spiră, aspect de virgulă) (ex.: Vibrio
cholerae)
2. Spirillum – celule spiralate rigide - Campylobacter, Helicobacter – 2 spire, aspect de “pasăre în zbor” (ex.:
Campylobacter jejuni)
3. Spirochaeta – celule spiralate, cu 5-25 spire, flexibile (ex.: Treponema, Leptospira, Borrelia) (agenții
sifisului,tifosului).

6.Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Coloranţii utilizaţi în microbiologie. Fluorocromii. Metoda simplă de
colorare şi importanţa ei practică.
Caracter tinctorial – capacitatea bacteriilor de a fixa diferiţi coloranţi
Coloranţii bazici (violetul de genţiană sau de metil, fucsina bazică, albastrul de metilen, vezuvina, chrizoidina,
etc) au afinitate pentru structurile acide ale celulei bacteriene
Tipuri de coloraţii: simple, complexe (diferenţiale, speciale)

7.Etapele şi tehnica de pregătire a frotiurilor din culturi bacteriene, crescute pe medii lichide şi solide.
Pregătirea frotiurilor din biosubstrate: spută, puroi, sînge, a frotiurilor-amprente din fragmente de ţesuturi.
Metodele de fixare a frotiurilor.

Prepararea frotiului
1. Etalarea materialului microbian (produs patologic, cultură microbiană) în strat subţire pe suprafaţa unei lame
de sticlă degresată
2. Uscarea
3. Fixarea (termică, chimică). Omoară microbii şi mareşte afinitatea lor pentru coloranţi
4. Colorarea. Asigură contrastul dintre microbi şi fondul preparatului
5. Examinarea frotiului la microscopul optic cu imersie

Pentru pregătirea frotiurilor din spută, puroi se folosesc 2 lamele.O porțiune mică de material steril se transferă la
mijlocul lamelei,cu ansa sau acul, și se acoperă cu altă lamă in asa mod, ca sa raman libere cate ⅓ din ambele lame.
Lamele se indeparteaza in porțiuni opuse, obținînd 2 frotiuri identice.
Frotiul din sânge(in caz de septicimie si bacterimie) o picătura de sange se pune de prima lamela (bine degresată),
lama se așează pe masă; se atinge picatura de sange cu marginea altei lame (putin mai inguste), sub un unghi de 45
grade. Se extinde sangele prin miscarea de etalare. Apoi vine uscarea, fixarea,colorarea si examinarea.
 LUCRAREA DE LABORATOR N 2

TEMA: ULTRASTRUCTURA BACTERIILOR.ELEMENTELE PERMANENTE.

METODELE COMPUSE DE COLORARE: GRAM, ZIEHL-NEELSEN

ÎNTREBĂRI PENTRU CONTROL

1.Elementele permanente (obligatorii) şi nepermanente (neobligatorii) de structură ale celulei

bacteriene.

2.Structura, compoziţia chimică şi funcţiile biologice ale peretelui celular al bacteriilor. Metodele
directe de evidenţiere.
Peretele celular-reprezintă un înveliş rigid ce înconjoară protoplastul bacterian. Lipseşte la micoplasme.
Se disting 2 mari grupe de bacterii în funcţie de structura PC:
Bacterii gram-negative (G-)
Bacterii gram-pozitive (G+)
Elementul comun al ambelor grupe – peptidoglicanul (PG).
PG – structură particulară rigidă a PC bacterian.
Structura PG:Heteropolimer macromolecular reticular, constituit dintr-un component glicanic şi unul
peptidic.
Partea glicanică (polizaharidică) este constituită din catene liniare paralele în care alternează
N-acetyl-glucozamina cu acidul N-acetyl-muramic.

Partea peptidică este reprezentată de unităţi tetrapeptidice (izomeri L şi D de AA), fixate de acidul
muramic, care pot fi legate intre ele direct (formand o structură bidimensională, la bacterii G-) sau prin
punţi interpeptidice (structură tridimensională, la bacterii G+).
Funcții:
-Conferă forma bacteriilor
-Barieră osmotică şi mecanică
-Barieră de permeabilitate selectivă
 -Funcţie antigenică (Ag O şi R)
-Participă la procesele de creştere şi diviziune celulară
-Funcţie de receptor
-Responsabil de aderenţa specifică la substrate
-Componente ale peretelui celular (lipidul A, acizii lipoteichoici, fragmente de PG) contribuie la
producerea citokinelor şi activarea complementului pe cale alternativă cu manifestarea şocului septic
(endotoxinic)
-Reprezintă ţinta de atac a unor enzime şi antibiotice.
Evidenţierea peretelui celular: microscopia electronică, metode speciale de colorare, plasmoliză (în
mediu hipertonic), plasmoptiză (în mediu hipotonic).
3.Particularitatile de structură ale peretelui celular la bacteriile grampozitive şi gramnegative.
Coloraţia Gram. Mecanismul, componentele şi tehnica de colorare. Importanţa practică
PERETELE CELULAR AL BACTERIILOR GRAM-POZITIVE
-Uniform
-Grosimea 20-80 nm (până la 300 nm)
-Componentul major (40-80%) reprezintă PG
(structură reticulară tridimensională)
-Componente minore:
Acizii teichoici (polimeri de glicerol sau ribitol fosfat), fixaţi de N-AGA. Traversează PG şi creează sarcină
electrică negativă la suprafaţa bacteriei, asigură transferul de ioni şi fixarea unor proteine, adeziunea la
substrate, funcţie antigenică. Pot activa complementul pe cale alternativă şi stimula secreţia citokinelor de
către macrofage.
Acizii lipoteichoici: se fixează de MCP şi depăşesc stratul de PG.
Funcţii: identic cu acizii teichoici, intervin în adeziunea la celule şi au un efect toxic slab.
Proteine asociate peretelui celular: proteina A, coagulaza legată (“clumping factor”) şi proteina fixatoare de
fibronectină la Staphylococcus aureus, proteina M la Streptococcus pyogenes (rol în adeziune la substrate,
protecţie de fagocitoză)
La unele bacterii G+ (de exemplu: Mycobacterium, Nocardia) peretele conţine o cantitate importantă de
lipide sau ceruri, la altele (ex.: streptococi) peretele conţine multe glucide.
PERETELE CELULAR AL BACTERIILOR GRAM-NEGATIVE
-Grosimea 10-12 nm
-Neomogen, format din straturi distincte:
1.PG, stratul intern, constituie 1-10% din masa uscată a peretelui celular. Acizii teichoici lipsesc. Nu exista punţi
interpeptidice (structură bidimensională).
2.Membrana externă (ME) – dublu strat lipidic cu proteine înserate (proteine majore – 70%, minore – 30%).
-Unele proteine majore - porine, unindu-se în triplete, participă la formarea porilor, altele (nonporine) – au
funcţie de receptor pentru bacteriofagi şi pili sau asigură adeziunea la receptorii celulelor-gazde.
-Proteinele minore sunt enzime implicate în captarea unor substanţe şi transportul specific transmembranar.
ME este permeabilă pentru ioni şi mici molecule hidrofile şi impermeabilă pentru molecule hidrofobe sau
amfipatice
3.Lipoproteinele asigură legătura dintre ME şi PG
4.Lipopolizaharidul (LPZ) – stratul extern al peretelui gram-negativ. Este format din:
-Lipidul A (endotoxină), glicolipid ancorat în ME. Stimulează formarea şi secreţia citokinelor. Determină
efectul toxic al bacteriilor G- manifestat în urma lizei celulare.
-Polizaharide complexe, fixate pe lipidul A. Participă în procese de penetrare şi transport a unor substanţe,
conferă specificitate de gen (antigenul R)
La exterior, subunităţi oligozaharidice liniare sau ramificate. Creează sarcină negativă la suprafaţa bacteriei
(împiedică fagocitoza, accesul moleculelor toxice), conferă specificitate de specie sau tip (antigenul O).
Spaţiul periplasmic este regiunea dintre ME şi MCP. Conţine PG şi proteine-enzime implicate în transport,
digestia nutrienţilor, protecţia contra substanţelor toxice (ex.: beta-lactamazele, care distrug antibioticele
beta-lactamice).
La bacteriile G+ aceste enzime sunt secretate în mediul extern.
COLORAȚIA GRAM
-reprezintă coloraţia de bază în microbiologie Această coloraţie împarte bacteriile în două grupe: bacterii
Gram pozitive, colorate în violet şi bacterii Gram negative, colorate în roşu. Diferenţa de culoare se
datorează deosebirilor de structură, respectiv de permeabilitate ale peretelui celular.
Principiul coloraţiei constă în colorarea bacteriilor cu un colorant acridinic de tip cristal violet şi
mordansarea cu soluţie de lugol (soluţie iodo-iodurată de K). Ca urmare, se formează complexe insolubile cu
acidul ribonucleic celular, de culoare violet. Diferenţa dintre bacteriile Gram pozitive şi Gram negative
constă în diferenţa de permeabilitate a peretelui celular pentru aceste complexe (datorită structurii sale
diferite la Gram pozitive/negative), după decolorare cu alcool-acetonă sau alcool absolut. Bacteriile Gram
pozitive păstrează complexele violet pe când cele Gram negative le pierd, devenind incolore. Acestea se vor
recolora în roşu fie cu fuxină, fie cu safranină. Trebuie subliniat că bacteriile Gram pozitive păstrează
complexele violet numai dacă structura peretelui este intactă. Dacă celula bacteriană are peretele celular
alterat, ea va pierde aceste complexe.
Tehnica coloraţiei:
-frotiul fixat la flacără se acoperă cu soluţie de cristal violet timp de 1 minut,
-se spală lama cu lugol şi se acoperă cu lugol 2 minute (iodul serveşte ca mordant în coloraţie);
-se îndepărtează lugolul şi se decolorează câteva secunde cu alcool-acetonă sau 2 minute cu alcool absolut;
-se spală cu apă;
-se acoperă lama cu soluţie de fuxină fenicată diluată 1/10 câteva secunde;
-se spală cu apă,
-se usucă şi se examinează la microscop cu obiectivul cu imersie.
Importanța practică-Colorația Gram evidențiază prezența microorganismelor, morfologia (forma, mărime,
dispoziție caracteristică), tinctorialitatea (Gram pozitive /Gram negative), frecvenţa PMN, relația cu PMN
neutrofile (intr- / extraleucocitari). După examinarea directă microscopică a frotiurilor colorate Gram,
microbiologul poate face un raport preliminar pe care îl transmite medicului practician. Acesta va putea lua o
decizie terapeutică până la sosirea rezultatului culturii şi a antibiogramei.
4.Acidorezistenţa microorganismelor. Evidenţierea prin coloraţia Ziehl-Neelsen.
Mecanismele, reactivii şi tehnica de colorare.
Acido-alcoolo-rezistenţa este proprietatea unor bacterii din genul Mycobacterium (bacilul tuberculos şi
al leprei) şi Nocardia. Aceste bacterii se colorează la cald din cauza structurii peretelui celular care are
în stratul superficial o ceară. Odată colorate, ele nu mai pot fi decolorate nici cu alcool şi nici cu acizi.
Acest tip de coloraţie se poate efectua direct din spută, colecție purulentă sau din sediment LCR, lichid
pleural.

Tehnica:
- se fixează frotiul la flacără;
-se acoperă frotiul cu soluţie de fuxină fenicată Ziehl,
-se încălzeşte până la apariţia vaporilor, repetându-se această încălzire de 3 ori în decurs de 10 minute
(pentru încălzire se utilizează o tijă metalică care are montat un tampon de vată la unul din capete;
tamponul se umectează cu alcool şi se aprinde);
-se decolorează cu acid azotic diluat 1/3 sau acid sulfuric 1/5 până dispare culoarea roşie;
-se spală cu apă;
-se recolorează cu soluţie de albastru de metilen 1-2 minute;
-se spală cu apă, se usucă şi se examinează la microscop.
Bacilii acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR) (bacilul Koch şi bacilul leprei) sunt coloraţi în roşu pe fondul
albastru al preparatului. Restul microbilor prezenţi se colorează, de asemenea, în albastru. Aceşti bacili
 nu pierd colorantul la decolorarea cu alcool şi acid datorită prezenţei acidului micolic şi a proprietăţilor
de permeabilitate selectivă a membranei celulare.
BAAR se mai pot colora şi cu substanţe fluorescente cum este auramina sau un amestec de
auramină-rhodamină, cu decolorare consecutivă cu un amestec de alcool şi acid. BAAR reţin colorantul,
ceea ce permite evidenţierea lor la microscopul cu fluorescenţă.
5.Protoplaştii. Sferoplaştii. Formele L de bacterii. Importanţa.
A. Dacă peptidoglicanul este alterat (urmare a acțiunii antibioticelor sau a lizozimei), peretele bacterian pierde
rigiditatea și bacteria se lizează din cauza presiunii osmotice intra-citoplasmice. Bacteria poate supraviețui în
mediu hipertonic, dar căpătă o formă sferică.
În condiții de laborator, după îndepărtarea peptidoglicanului cu ajutorul lizozimei, se obţin protoplaşti în cazul
bacteriilor Gram pozitive şi sferoplaşti în cazul bacteriilor Gram negative
*Când o celulă bacteriană este deposedată totalmente de peretele celular, structura respectivă se numește
protoplast. Fiind înconjurat doar de membrana citoplasmică, un protoplast poate supraviețui în mediu izotonic
în raport cu presiunea osmotică din citoplasmă păstrând o serie de proprietăţi ale celulelor bacteriene, cum ar
fi: capacitatea de sinteză proteică şi a acizilor nucleici şi reacții ale metabolismului energetic, fiind posibil chiar
procesul de diviziune. În anumite condiţii poate avea loc procesul de regenerare a peretelui celular şi trecerea la
forma vegetativă normală.
*Sferoplastul provine din bacteria Gram-negativă lipsită de peptidoglican sub acțiunea unor factori, fiind
învelit de membrana externă și membrana citoplasmică.
*Dacă un protoplast sau sferoplast este plasat într-un mediu mai diluat decât citoplasma, apa penetrează prin
membrana citoplasmică și se produce liza osmotică.

B.

Formele “L” (descoperite la Institutul de Medicină Preventivă Lister din Londra) sunt celule sferice sau cu
contur neregulat care apar spontan la unele specii de bacterii, și pot fi induse la altele (șoc termic sau alți
stimulatori fizico-chimici). Într-un mediu adecvat se pot multiplica.
Formele “L” se pot forma în organismul uman sub influenţa antibioticelor betalactamice. Sunt instabile faţă de
variaţii osmotice şi rezistente la betalactamice. Pot fi reversibile sau ireversibile
 6.Structura, compoziţia chimică şi funcţiile biologice ale membranei citoplasmatice şi
citoplasmei. Metodele de evidenţiere.

MEMBRANA CITOPLASMATICĂ (MCP)

Prezintă o structură membranară clasică: dublu strat fosfolipidic în care sunt înserate proteine şi glicoproteine.
Lipsesc sterolii (cu excepția micoplasmelor).
La bacteriile gram-pozitive MCP formează invaginaţii, mezosomi (septali, laterali), în care se conţin enzime,
citocromi şi proteine ale sistemului transportor de electroni.
Proteinele MCP:
1.PLP (Proteine de Legare a Penicilinei) - PBP de la “penicillin-binding proteins” - (sunt inactivate de
penicilină şi antibiotice beta-lactamice). Reprezintă enzime ce catalizează legăturile dintre catenele peptidice din
PG – reacţia de transpeptidare
2.Enzime care participă la biosinteza
învelișurilor celulare, ce asigură creșterea
celulelor
3.Componente ale sistemului de transport
transmembranar (permeaze)
4.Proteine ale sistemelor de secreţie (I –
VI) (la bacteriile gram negative)
5.Proteine – receptori
6.Proteine ale lanţului respirator (ex.:
citocromi) și ATP-aze

Funcţiile membranei citoplasmatice

1.Barieră osmotică şi de permeabilitate selectivă

2.Asigură transportul activ prin intermediul
permeazelor
3.Excreţia enzimelor hidrolitice, toxinelor, etc
4.Sediul metabolismului energetic
5.Intervine în diviziunea celulară
6.Participă în sinteza PG şi a fosfolipidelor
7.Participă în chemotaxie prin receptori specifici
8.Asigură transmiterea informaţiei din mediul înconjurător spre interiorul celulei
 CITOPLASMA
-Necompartimentată
-Lipsesc organitele celulare
-Formată din apă (80%), conţine nucleoidul, ribosomi (apr. 20 000 per celulă), incluziuni, plasmide, ioni,
enzime, deşeuri, etc.
-Consistenţa densă (stare de gel) asigură permanenţa mediului intern
-pH acid
Funcţii: sediul tuturor proceselor metabolice
Evidenţierea: prin orice metodă de colorare
7.Nucleoidul. Compoziţia chimică şi funcţiile biologice. Metodele de evidenţiere.
Plasmidele bacteriene şi funcţiile lor.
A. NUCLEOIDUL BACTERIAN
-Constituit din ADN bicatenar circular, uneori liniar, plasat liber în citoplasmă. ADN este repliat în bucle şi
stabilizat prin ARN şi proteine. Fiecare buclă este hiperspiralizată sub acţiunea ADN-girazei şi
topoizomerazei IV (se întâlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sinteză (ADN - , ARN –
polimeraze)
Funcţii: dirijează activitatea celulei (procesele de sinteză, creşterea, multiplicarea, diferenţierea celulei,
replicarea proprie, etc); asigură potențialul de variabilitate și evoluție (mutații, recombinări…)
Evidenţierea:
-Microscopia electronică
-Metode speciale de colorare (ex.: Feulgen)
Feulgen: HCl….aldehida….react. Shiff….culoare rosie
B. PLASMIDELE
Elemente genetice (ADN) circulare autonome, extracromozomiale, libere în citoplasmă, care se replică
independent de cromozom. Conferă proprietăți noi celulelor bacteriene și posibilitatea adaptării rapide la
mediu. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei.

-Tipuri de plasmide:
1.F – factor de fertilitate (sinteza pililor F, cu rol în conjugare).
2.R – rezistenţă la antibiotice
3.Ent – producerea enterotoxinei
4.Hly – producerea hemolizinei
5.Col – producerea de bacteriocine, etc.
Plasmidele pot fi:
- conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezistență la
antibiotice (R-plasmide),
- neconjugative, care nu pot părăsi ele însăși bacteria de origine, ci numai prin intermediul unei alte plasmide
conjugative sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmida care codifică secreția de beta-lactamază la S.aureus)
- episomi, care se pot integra prin recombinare în cromozomul bacterian, pierzându-și astfel autonomia de
replicare (ex.: plasmida F sau factorul de fertilitate).
Plasmidele de virulență poartă determinanții genetici ai unor factori de virulență la bacterii, ca de exemplu
secreția de enterotoxină (termolabilă și termostabilă) și factorul de colonizare la Escherichia coli, hemolizina la
Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis și E.coli, exfoliantina la S. aureus, gena de invazivitate la Shigella
etc.
Plasmidele R - de rezistenta la chimioterapice (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau din
două regiuni genetice distincte: genele care codifică rezistența la antibiotice "R" (care pot fi unice sau multiple)
și genele care conferă plasmidei capacitatea de a se transfera "FTR".
Utilizarea practică a plasmidelor: în tehnologii de ADN-recombinant
 LUCRAREA DE LABORATOR Nr.3
TEMA: ULTRASTRUCTURA BACTERIILOR. ELEMENTELE
NEPERMANENTE. METODELE COMPUSE DE COLORAR ALBERT,
BURRI-GIN.

ÎNTREBĂRI PENTRU CONTROL

1. Elementele de structură nepermanente ale celulei bacteriene.

Elementele facultative (neobligatorii)
-Capsula
-Sporul
-Flagelii
-Pilii/fimbriile
-Plasmidele
-Incluziunile celulare
2. Sporii. Compoziţia chimică şi funcţiile biologice. Evidenţierea.

Reprezintă o diferenţiere celulară care asigură supravieţuirea bacteriei în condiţii nefavorabile ale mediului
extern.
Bacterii sporogene – Bacillus, Clostridium. Aceste mi/o se prezintă sau sub formă vegetativă, metabolic activă,
sau sub formă inertă metabolic – sporul.
Procesul de formare a sporului este numit sporogeneză, sporulare. Este declanşat în special de carenţe nutritive
sau condiţii nefavorabile ale mediului extern.
Stadiile sporogenezei (durata 36-72 ore)
Stadiul I – se formează filamentul axial, compus din ADN
Stadiul II – divizarea asimetrică a citoplasmei printr-un sept, formarea presporului, care conţine un filament de
ADN. MCP înglobează presporul.
Stadiul III – înglobarea completă a presporului, care este limitat de 2 membrane
Stadiul IV – formarea cortexului de PG între cele 2 membrane
Stadiile V-VI – formarea tunicii proteice la exterior şi maturarea sporului. Uneori se formează un înveliş extern
suplimentar - exosporiu
Stadiul VII – sporul matur este eliberat iar celula-mamă se dezintegrează.
Proprietăţile sporului:
Inactiv metabolic
Număr redus de enzime
Conținut mare de aminoacizi cu sulf
Conţinut scăzut de apă liberă
Conţinut mare (până la 10%) de dipicolinat de calciu
Rezistent la temperaturi (100 - 180 grade C) şi pH extreme, desicare, radiaţii, agenţi chimici şi fizici

Dimensiunile, forma sporului (sferică, ovală) şi poziţia în celulă (centrală, subterminală, terminală) sunt
caractere utile în identificarea bacteriilor.
Evidenţierea sporilor: incolori pe frotiuri colorate prin colorația simplă sau Gram.
Colorarea specială după AUJESZKY (sporul se colorează în roşu, iar citoplasma în albastru).

3. Granulaţiile de volutină. Compoziţia chimică şi funcţiile biologice. Metodele de evidenţiere.

Coloraţiile Loeffler şi Albert. Importanţa practică.
Reprezintă polimeri anorganici de polimetafosfati. Servesc în calitate de rezervă de fosfaţi şi pot interveni în
metabolismul energetic.
Interesul medical: la agentul difteriei, Corynebacterium diphtheriae, granulele de volutină se localizează la
extremităţile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate neuniform în citoplasmă.
● in forma de o litra ( ”V”)
La tratarea cu unii coloranţi bazici granulele de volutină se colorează în altă culoare, de ex. în roşu-violet la
colorarea cu albastru de metilen – fenomenul metacromaziei
Evidențiere:Colorația Loeffler (cu albastru de metilen).
Colorația ALBERT
-Frotiul fixat se coloreaza cu soluția Albert A (toluidin albastru, verde de malahit, acid acetic, alcool etilic) – 5
min
-Se înlătura colorantul și fără a spăla se aplică sol Albert B (sol apoasă de I2+KI) – 2 min
-Se înlătura reactivul, se spală, se usucă și se examinează
Rezultat: Citoplasma – verde, granulațiile – albastru-închis/negru.

Colorația Neisser
1. Frotiul fixat se colorează cu soluția Neisser (albastru de metilen, cristal violet, acid acetic, alcool etilic) –
10 sec
2. Se înlatură colorantul, se spală cu apă și se aplică sol. chrisoidină de 0,4% – 30 sec
3. Se înlatură reactivul, se spală, se usucă și se examinează
Rezultat: Citoplasma – galben-oranj,
Granulațiile – brun

4. Capsula bacteriilor. Compoziţia chimică şi funcţiile biologice. Metoda negativă Burri-Gin de

evidenţiere a capsulei.
Învelişul extern neobligator al unor bacterii.
Reprezintă polimeri organici sintetizaţi în mediul natural de viaţă al bacteriilor (exemplu: în țesuturile ma/org.)
Se disting:
Capsula adevărată (peste 0,2µm), vizibilă la microscopul optic
Microcapsula, detectată la microscopul electronic
Capsula flexibilă (slime, glicocalix), o reţea laxă de fibre polizaharidice, care difuzează în mediu. Nu se
evidenţiază microscopic. Asigură formarea biofilmelor bacteriene – ansamblu structurat de celule bacteriene
înglobate într-o matrice de polimeri de origine bacteriană, care poate adera la suprafeţe inerte (ex.: cateter,
stimulator cardiac, endoproteze, sonde de intubare, etc) sau ţesuturi vii.
Compoziţia chimică a capsulei: apă şi substanţe organice (polizaharide, mucopolizaharide, peptide)
Bacillus anthracis – acid glutamic
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae – polizaharide
Streptococcus pyogenes – acid hialuronic
Funcţiile capsulei:
-Barieră de permeabilitate pentru substanţe toxice (antibiotice, ioni metalici)
-Barieră protectoare faţă de factori antiinfecţioşi (complement, fagocite), bacteriofagi, protozoare
-Rezervă nutritivă
-Asigură aderarea bacteriei la substrate – ţesuturi sau suporturi inerte (placa dentară, biofilm pe catetere,
proteze, instrumente, etc)
-Specificitate antigenică de specie sau tip (Ag K)
Evidenţierea capsulei
Coloraţia Burri-Gin (metodă negativă)
-Pe lamă se amestecă suspensia bacteriană cu tuş de China/India, se etalează, se usucă;
-Frotiul se fixează cu alcool;
-Se colorează frotiul cu fucsină apoasă;
Rezultatul: capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma bacteriilor se colorează în roşu.
Coloraţia Giemsa (capsula se colorează în roz) – coloraţie pozitivă a capsulei.
5. Flagelii. Clasificarea bacteriilor după amplasarea şi numărul flagelilor.

Compoziţia chimică şi funcţiile biologice.

-structuri filamentoase proteice, întâlnite la unele bacterii, bacili, spirili şi spirochete.
Funcţii: intervin în mobilitatea bacteriană, reprezintă Ag H al bacteriilor.
Structura:
-Filamentul, structură helicoidală tubulară constituită din fibrile proteice (flagelină) răsucite
-Corpul bazal, constituit dintr-un ax rigid şi mai multe inele ce servesc la fixarea flagelului (la nivelul MCP şi
PC).
-În jurul inelelor se atașeaza lateral molecule de proteine Mot, formând un manșon, care funcționeaza generând
rotația flagelului, pus în mișcare de forța proton motrice. Alte proteine, proteinele Fli, imprimă flagelului
direcția rotației, precum și oprirea rotației flagelului.
-Cârligul de articulaţie
-Mobilitatea bacteriei este asigurată de rotaţia flagelului (30 – 80 micrometri/sec).
Tipurile de bacterii după numărul şi poziţia flagelilor:
-Bacterii monotriche
-Bacterii lofotriche (un mănunchi de flageli la o extremitate)
-Bacterii amfitriche (câte un flagel sau un mănunchi de flageli la fiecare extremitate)
-Bacterii peritriche (flageli pe toată suprafaţa celulei)
Prezența flagelilor, numărul și aranjarea lor sunt caracteristici de specie, utile în identificare și taxonomie.
!!!La spirochete flagelii se plasează în spaţiul periplasmic – flageli interni, periplasmatici.

6. Metoda directă de evidenţiere a flagelilor. Coloraţia Loeffler, mecanismul şi tehnica de colorare.

Evidenţierea flagelilor
I - metode directe
-Microscopia electronică
-Coloraţia specială Loeffler: mordansarea cu tanină, săruri de aluminiu, Fe (pentru a mări volumul
flagelilor), apoi colorarea cu fucsină sau albastru de metilen)
II – metode indirecte (studierea mobilităţii bacteriilor)
Studierea preparatelor native “picătură suspendată” sau “între lamă şi lamelă” (microscopia cu contrast
de fază sau pe fond negru)
Colorația Loeffler:
-frotiul se fixează;
-frotiul se colorează cu albastru de metilen alcalin 3-5 min;
-se spală cu apă;
-se usucă cu hârtie de filtru;
-se examinează la microscop.
Citoplasma corinebacteriilor difterice se colorează în albastru deschis,iar granulațiile de volutină-albastru
închis.
*mordansarea cu tanină, săruri de aluminiu, Fe (pentru a mări volumul flagelilor), apoi colorarea cu
fucsină sau albastru de metilen)
7.Studierea bacteriilor vii. Metodele indirecte de evidenţiere a flagelilor. Pregătirea
preparatelor native: “picătura suspendată” şi “între lamă şi lamelă”.
II – metode indirecte (studierea mobilităţii bacteriilor)
Studierea preparatelor native “picătură suspendată” sau “între lamă şi lamelă” (microscopia cu contrast de fază
sau pe fond negru)
Preparatul nativ între lamă şi lamelă, în lumină directă este utilizat pentru evidenţierea unor celule (PMN,
eritrocite), a germenilor mobili în probe lichide (urină, LCR sau lichidul din chisturi), a protozoarelor din urină,
materii fecale etc. Este de asemenea indicat pentru examinarea grunjilor din puroiul leziunilor cu Actinomyces
sau cu Nocardia.
-În materiile fecale (suspensie în ser fiziologic steril sau Lugol) se pot observa de exemplu bacterii cu mobilitate
caracteristică “în spirală”, “în tirbușon”: Campylobacter, Helicobacter, Vibrio cholarae sau prezența elementelor
parazitare/ouă, chisturi etc.
-În secreția vaginală se poate vizualiza prezența, morfologia și mobilitatea caracteristică pentru Trichomonas
vaginalis.
Examenul în câmp întunecat se utilizează pentru decelarea Treponemei pallidum, coroborat cu datele clinice,
poate stabili etiologia infecţiei.
Microscopul cu fond întunecat - la care se examinează preparatele native, între lamă şi lamelă, efectuate direct
dintr-un produs în care se caută bacterii a căror lăţime nu depăşeşte 0,1-0,2 µm (ca, de exemplu, evidenţierea
treponemelor din şancrul sifilitic),Microscopul cu contrast de fază - se foloseşte la examinarea preparatelor
native în care microorganismele şi celulele au aspect tridimensional.

8.Microscopul cu fond negru şi cu contrast de fază. Principiul microscopiei.

Microscopia pe fond întunecat(modele ultramicroscopice)- in structura sa intra un condensator

paraboloid special, la care partea centrala a lentilei inferioare este intunecata, iar cea laterala-transparenta.Acest
condenstator retine partea centralaa a fascicolului de lumina cu raze paralele, formand un fond intunecat. Drept
sursa de lumina se foloseste - iluminatorul electric.
Utilizare: evidentiarea agentilor cauzali ai sifisului, tifosului recurent etc. / studierea mobilitatii micro-org.

Microscopia prin contrast de faza

Structura microscopului cu contrast de fază
1. Condensor special- conține o diafragmă specială inelară, care transformă raza de lumină într-un con de lumină de
intensitate mai redusă.
2. Obiectiv special- conține în planul său focal posterior un inel circular (inelul de fază), care e acoperit de un strat subțire
și translucid de Ag.
3. Ocular de centrare.
4. Lampă cu mare intensitate luminoasă.
5. Filtru verde, care favorizează observarea detaliilor.
Mecanismul
Tehnica contrastului de fază folosește un mecanism optic pentru a transforma variațiile undei luminoase, după ce a trecut
prin probă, în variații ale amplitudinii acesteia.
Variațiile de amplitudine pot fi vizualizate ca diferențe ale contrastului imaginii.
Principiu
● După ce penetrează obiectul studiat, raza de lumină se compune din lumina directă și lumina difractată ai căror
fotoni au interacționat cu obiectul de studiat.
● Lumina directă trece prin inelul de fază, iar cea difractată trece doar prin zonele mai subțiri din jurul inelului de
fază, formându-se o diferență de drum.
● Diferența între drumul parcurs de fiecare rază de lumină determină o diferență de fază între cele două raze, de
aproximativ 1/4 de lungime de undă.
Aplicaţii practice
Contrastul de fază este o metodă excelentă pentru a studia evenimente
celulare în dinamică, în special în celulele vii, nefixate, necolorate. Tehnica
microscopiei în contrast de fază este aplicată la scară largă în cercetarea
biomedical, în special în citologie şi histologie. Putem examina astfel:
- celule vii,
- ţesuturi nefixate, necolorate,
- microorganisme transparente la iluminarea pe fond luminos,
- organite celulare,
- membrane celulare,
- nuclei,
- mitocondrii,
- fusul de diviziune şi cromozomii,
- aparatul Golgi
- granulaţii citoplasmatice ale celulelor vegetale şi animale
Microscopia în contrast de fază este utilizată pentru evidenţierea celulelor
tumorale, dinamica şi comportamentul celulelor în cultură. Celulele în
cultură se examinează cu un microscop inversat cu contrast de fază.

9.Fimbriile (pilii), tipurile, funcţiile biologice.

pilii comuni– elemente proteice fine, rigide, scurte repartizate pe suprafaţa celulei bacteriene G - în special.
Sunt formate din subunităţi proteice identice (pilina), implantate în ME.
Numărul fimbriilor per celulă: zeci – sute
Funcţii: asigură adeziunea bacteriilor la suprafeţe inerte, la celule sau alte bacterii/ reprezintă antigenul F
Pilii conjugativi – structuri capiliforme de natură proteică, prezenţi în număr de 1-10 per celulă (numai la bacteriile ce
găzduiesc plasmide conjugative F).
Funcţii:
-transferul de ADN prin conjugare
-receptori pentru unii bacteriofagi
Evidenţierea pililor: microscopia electronică

10.Variabilitatea caracterelor principale ale microbilor. Variabilitatea dirijată şi importanţa

ei practică.
caractere:
1. morfologice (coci, bacili, cocobacili, spirochete)
2. tictoriale (Gram pozitive/negative).
3. caractere culturale
 4. caractere biochimice (secreţia unor enzime (coagulaza, catalaza, oxidaza, lecitinaza) care pot
fi detectate prin teste simple; capacitatea de metabolizare a zaharurilor prin mecanism
oxidativ sau fermentativ este una din posibilitățile cel mai des utilizate de identificare a
bacteriilor)
5. de patogenitate reacţii Antigen-Anticorp

11.Formele variabilităţii microorganismelor (fenotipică şi genotipică). Mutaţiile.

VARIABILITATEA BACTERIANĂ-lmodificarea comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor ei

VARIABILITATE FENOTIPICĂ
lmodificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ;
lnu se transmit ereditar;
lgenomul nu este afectat
VARIABILITATE GENOTIPICĂ
lmodificări definitive ale materialului genetic
lse transmit descendenţilor

MUTATIA-modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene → modificări ale mesajului

genetic
l apar prin:
¡substituţii la nivelul materialului genetic
¡inversii
¡inserţii, deleţii
1. mutaţia spontană:
apare în condiţii de mediu obisnuite, fără intervenţia unui factor decelabil
2. mutaţia indusă:
se produce sub acţiunea unor factori fizici sau chimici = factori mutageni
3. mutaţia punctiformă:
alterarea unui singur nucleotid, a unui singur codon
4. lmutaţia extinsă:
afectează secvenţe mai mari ale uneia sau mai multor gene, alterările depăsind limitele unui
codon
5. l mutaţia regresivă (retromutaţie):
afectează celule mutante; determină revenirea acestora la tipul iniţial restabilind secvenţa
nucleotidică originară
6. l mutaţii supresoare:
 permit exprimarea funcţiei anterioare a genei desi persistă o modificare a secvenţei bazelor
nucleotidice

12.Transferul de material genetic (transformarea, transducţia, conjugarea) şi recombinarea.

13.Importanţa geneticii microorganismelor pentru medicină. Ingineria genică, importanţa practică.
Ingineria genică poate fi definită drept ansamblu de metode şi tehnici prin care este posibilă manipularea materialului
genetic la nivel celular şi molecular pentru a obŃine pe căi netradiŃionale produşi utili omului şi genotipuri noi, având la
bază tehnologia moleculelor recombinate (hibride) de ADN.
Ingineria genetică are multe aplicații în medicină, care includ fabricarea de medicamente, crearea de animale model
care imită condițiile umane și terapia genică . Una dintre primele utilizări ale ingineriei genetice a fost producerea în
masă a insulinei umane în bacterii. Această aplicație a fost acum aplicate si pentru hormon de crestere uman ,
hormon foliculostimulant (pentru tratarea infertilității), albumină umană , anticorpi monoclonali , factori
Antihemophilic , vaccinuri si multe alte medicamente.
 LUCRAREA DE LABORATOR N 6
TEMA: ACŢIUNEA FACTORILOR MEDIULUI AMBIANT ASUPRA
MICROBILOR. STERILIZAREA. METABOLISMUL MICROBIAN
ÎNTREBĂRI PENTRU CONTROL

1. Acţiunea factorilor fizici asupra microorganismelor (căldura, temperaturi joase,

desicarea, presiunea osmotică, ultrasunetul, radiaţiile).

2. Mecanismele de acţiune a substanţelor chimice asupra microorganismelor

(fenolul, crezolul, coloranţii, oxidanţii, sărurile metalelor grele, formaldehida,
alcoolii).
3. Noţiune de dezinfecţie. Substanţe dezinfectante contemporane, utilizate în
Republica Moldova. Fierberea. Pasteurizarea.
Dezinfecția - procedura de distrugere a majorității microorganismelor patogene sau
nepatogene de pe orice suprafețe (inclusiv tegumente), utilizându-se agenți fizici și/sau
chimici;
În raport de acțiunea substanței dezinfectante, dezinfecția poate fi:
- dezinfecție de nivel înalt - realizează distrugerea bacteriilor în forma vegetativă, a
fungilor, a virusurilor, a micobacteriilor și a majorității sporilor bacterieni; această
forma de dezinfecție se poate aplica și dispozitivelor medicale reutilizabile, destinate
manevrelor invazive, și care nu suportă autoclavarea;
- dezinfecție de nivel intermediar (mediu) - realizează distrugerea bacteriilor în formă
vegetativă, a fungilor, a micobacteriilor și a virusurilor, fără acțiune asupra sporilor
bacterieni;
- dezinfecție de nivel scăzut - realizează distrugerea majorității bacteriilor în forma
vegetativă, a unor fungi și a unor virusuri, fără acțiune asupra micobacteriilor, sporilor
de orice tip, virusurilor neanvelopate și a
mucegaiurilor.
-Dezinfecția prin căldură uscată sau
flambarea este utilizată exclusiv în
laboratorul de microbiologie (pentru
flambarea anselor de nichel-crom sau a
gâtului flacoanelor
de sticla).
- Dezinfecția prin căldură umedă se
utilizează numai în cazul spălării
automatizate a
lenjeriei și a veselei, cu condiția atingerii
unei temperaturi de peste 90 grade C.
26
- Dezinfecția cu raze ultraviolete este
indicată în dezinfecția suprafețelor netede
și a aerului în boxe de laborator, săli de
operații, alte spații închise, pentru completarea măsurilor de curățare și dezinfecție chimică.
- Dezinfecția prin mijloace chimice se realizează prin utilizarea produselor biocide.
Produsele biocide utilizate pentru dezinfecție în unitățile sanitare se încadrează în grupa
principală I, tip de produs 1 și 2, conform prevederilor Regulamentului UE.
Fierberea-fierberea în apă la 1000C, abur 1000C: distruge în 10-20' formele vegetative ale
microorganismelor patogene şi unele forme sporulate mai puţin rezistente.
Se pot adăuga substanţe care ridică punctul de fierbere (carbonat de sodiu - pentru lenjerie).
Dezinfecţia prin călcare cu aburi - distruge formele vegetative în 5-10 secunde, iar sporii în 50
secunde.
Este utilizată pentru alimente, apă.
Pasteurizarea- este procesul prin care se aplică căldură pe alimente și băuturi pentru a ucide
agenții patogeni și a prelungi durata de valabilitate. De obicei, căldura este sub punctul de fierbere
al apei (100 ° C sau 212 ° F). În timp ce pasteurizarea ucide sau inactivează multe
microorganisme, nu este o formă de sterilizare, deoarece sporii bacterieni nu sunt distruși .
Pasteurizarea extinde durata de valabilitate prin inactivarea termică a enzimelor care strică
alimentele.
4. Noţiuni de aseptică şi antiseptică. Principalele substanţe antiseptice. Conservarea
chimică. Aplicarea practică.
Asepsia inseamna manipularea la adapost de microorganism.
Antisepsia înseamnă distrugerea microorganismelor de pe instrumentele de manipulare.
Germicidele sunt substanţe care distrug microorganismele, dar nu neapărat şi sporii
bacterieni. Efectul lor poate fi bactericid, bacteriostatic, sporicid, tuberculocid, fungicid şi
virucid. Ele se împart în:
- antiseptice – utilizate pentru ţesuturi vii (tegumente, mucoase, plăgi), ele fiind mai
puțin toxice pentru organismul uman;
- dezinfectante – substanţe puternic bactericide la concentraţii relativ scăzute, dar
datorită efectului toxic sau iritant asupra ţesuturilor umane, se utilizează doar pentru
obiecte și suprafețe.
Antiseptice:
Acridine
Alcooli
Biguanide și amidine
Clorură de benzalconiu
Derivați de iod.
5. Noţiuni de sterilizare, obiect steril şi nesteril.
Sterilizarea-care este un termen absolut, cuprinde ansamblul de tehnici fizice şi chimice care
elimină toţi germenii viabili (bacterii, spori, fungi, virusuri, paraziţi) de pe suprafaţa sau interiorul
unu icorp. Un obiect steril este deci lipsit de orice formă de viaţă.
Criteriul de verificare a sterilităţii constă în pierderea capacităţii de multiplicare a
microorganismelor atunci când sunt introduse într-un mediu favorabil.
Nesteril-contaminat cu anumiți germeni viabili.
6. Metode fizice de sterilizare prin: ardere, vapori sub presiune, aer cald (căldura uscată).
Sterilizarea prin radiaţii şi ultrasunet.

7. Metoda mecanică de sterilizare. Tipurile de filtre şi aplicarea practică.Sterilizarea

chimică.
Întrebarea 6,7 din tabel-Metode de sterilizare.

8. Controlul eficienţei sterilizării.

Criteriul de verificare a sterilităţii constă în pierderea capacităţii de multiplicare a
microorganismelor atunci când sunt introduse într-un mediu favorabil.
1.Metoda bacteriologică
Flora bacteriană:
* se prelevează prin ştergere cu tampon umezit pe suprafaţa delimitată (pereţi, mese, pat)
* pentru aeromicrofloră se utilizează metode sedimentării Koch în plăci Petri
După termostatarea prelevatului se determină
* numărul total de germeni
* prezenţa E.coli, proteus, Stafilococ hemolitic
În săli de operaţie, naştere, saloane de nou-născuţi, sugari, prematuri, laboratoare de soluţii
perfuzabile, biberonerii nu se admite prezenţa bacteriilor amintite, iar numărul total de germeni nu
trebuie să depăşească normele.
2.Altă metodă: supunerea unor tulpini bacteriene test operaţiei de dezinfecţie în focare de boli
infecţioase.

9. Metabolismul microbian. Particularităţile.

Metabolismul bacterian reprezintă ansamblul de reacţii biochimice care au loc în celula vie.
Catabolismul reprezintă o succesiune de reacţii biochimice implicate în degradarea nutrienţilor şi
eliberarea de energie necesară pentru funcţionarea celorlalte căi metabolice şi altor activităţi
fiziologice ale celulei.
Faza 1: macromoleculele sunt descompuse enzimatic în unităţi de bază: proteinele →AA, lipidele
→ acizi graşi şi glicerol, glucidele → monozaharide;
- are loc frecvent la exteriorul celulei bacteriene, fiind realizată de exoenzime. Din aceste reacţii
se eliberează ~1% din energia totală a macromoleculei, inaccesibilă celulei, fiind eliberată sub
formă de căldură.
Faza 2: moleculele rezultate în faza precedentă sunt degradate incomplet, eliberând 1/3 din
energia totală, cu producerea, în afară de CO2+ H2O, a unui număr mic de produşi de importanţă
esenţială în metabolism, numiţi intermediari metabolici ai căilor metabolice centrale (de ex.,
aminoacizii sunt utilizaţi pe căi diferite şi catabolismul lor conduce la formarea de acetil-CoA sau
intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici = ciclul Krebs).
Faza 3: se derulează diferit, în funcţie de tipul respirator al microorganismului (respiraţie celulară
= procesul de degradare a nutrienţilor prin reacţii de oxidoreducere biologică).
Anabolism-reprezintă totalitatea reacțiilor biochimice prin care microorganismele îşi sintetizează
din molecule simple constituenţii celulari proprii. Pot fi utilizaţi şi intermediari ai căilor metabolice
centrale.
Sinteza macromoleculelor este foarte eficientă şi se face sub acţiunea informaţiei genetice
codificată în ADN. Celula bacteriană sintetizează mai întâi monomeri (AA, baze azotate) pe care îi
aranjează ulterior într-o ordine specifică, dictată genetic, care determină structura primară a
macromoleculelor respective.
Particularităţile metabolismului bacterian:
-Natura şi diversitatea nutrienţilor folosiţi (substanțe anorganice, organice), unele chiar cunoscute
ca fiind inhibitori ai creşterii: acizi (formic, oxalic, sulfuric), lignină, chitină, celuloză, antibiotice,
fenoli, asfalt, petrol, parafine, materiale plastice.
-Plasticitatea metabolismului bacterian – se referă la capacitatea bacteriilor de a folosi surse
alternative de nutrienţi (bacteriile se adaptează rapid la tipul și cantitatea nutrienților)
-Diversitatea mecanismelor enzimatice şi a produşilor rezultați – bacteriile nu au o cale metabolică
pentru un produs, ci au căi alternative multiple pentru a se adapta condiţiilor de mediu variate.
-Intensitatea reacțiilor metabolice (viteza reacţiilor este mare).
-Este un metabolism necompartimentat, toate procesele metabolice se desfăşoară într-o singură
celulă.

10.Enzimele bacteriene. Clasificarea. Rolul în fiziologia bacteriilor.

În toate reacţiile metabolice intervin catalizatori proteici specifici - enzimele
Caractere generale:
Substanţe proteice
Active în limite largi de temperaturi (0-75°C) şi de pH (2-9)
Specificitate de substrat şi de acţiune (reacţionează cu un substrat catalizând un tip de reacţie).
Specificitatea este determinată de centrul activ al enzimei, complementar cu receptorul de pe
substrat.
Nu se modifică în cursul reacţiei
Clasificarea enzimelor bacteriene
1.Constitutive (permanente)
2.Inductibile (adaptative), se sintetizează în prezenţa substratului (ex.: lactaza în mediu cu
lactoză)
3.Represive, sinteza lor este inhibată de acumularea în exces a produsului reacţiei catalizate
-După locul de acţiune (exoenzime, endoenzime)
-După tipul reacţiei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze,
ligaze)
-După impactul asupra ma/o:
Enzime metabolice
Enzime de patogenitate, responsabile de modificări patologice ale ţesuturilor, celulelor ma/o :
hialuronidaza, colagenaza, elastaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, etc.
Importanţa practică a studierii enzimelor
-Rol în identificarea şi clasificarea bacteriilor (enzimele determină activitatea biochimică specifică
a bacteriilor)
-Unele substanţe chimice, antibiotice interferează cu activitatea unor enzime, inhibând creşterea
bacteriilor (tratament)
-Determinarea mecanismelor patogenezei infecţiilor (unele enzime sunt responsabile de
producerea leziunilor în ţesutul gazdei)
-Aplicarea industrială a enzimelor
11.Nutriţia bacteriilor. Tipurile de nutriţie şi mecanismele transportului
nutrienţilor în celula bacteriană.
Nutriţia – modalităţile prin care bacteriile asimilează din mediu substanţele necesare pentru
metabolism.
Modul (tipul) de nutriţie la bacterii este absorbtiv.
Nutrienţi – substanţe, soluţiile cărora pot traversa MCP pentru a fi antrenate în metabolismul
celulei. Se obţin din alimente prin solvire (săruri minerale, CO2, O2) sau după o digestie
prealabilă (proteine, glucide, lipide).
La bacterii digestia este extracelulară (la bacteriile G- şi în spaţiul periplasmic).
Nutrienţii servesc în calitate de material de construcţie şi sursă de energie pentru sinteza
compuşilor şi menţinerea vieţii bacteriei.
Transportul transmembranar al nutrienților
1. Difuzie simplă, pasivă (conform gradientului de concentraţie, fără consum de energie): O2,
CO2, acizi graşi, nutrienţi liposolubili.
2. Difuzie facilitată (conform gradientului de concentraţie) – permite transportul transmembranar al
moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport specifice integrate în MCP - permeaze.
3. Transport activ (contra gradientului de concentraţie, necesită energie). Participă permeazele şi
alte proteine de transport /fixare specifice. Nutrienţii nu suportă modificări.
4. Translocaţie – substratul este modificat chimic (ex.: fosforilat) în timpul transportului
membranar; necesită energie.
-Substanţele care au pătruns în citoplasmă sunt descompuse de către enzimele bacteriene
conform căilor metabolice proprii fiecărei specii bacteriene (ex.: Embden-Meyerhof,
Entner-Doudoroff, ciclul pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obţine energie şi precursori care vor
fi antrenaţi în biosinteză (anabolism).
-Excreţia metaboliţilor – difuzie, proteine de transport, liza bacteriei.

12.Clasificarea microorganismelor după sursele de energie şi carbon. Noţiune de

microorganisme saprofite şi parazite.
Clasificarea bacteriilor după sursa de carbon
Bacterii autotrofe – utilizează CO2 ca unică sursă de carbon (nepatogene)
Bacterii heterotrofe – utilizează carbonul din compuşii organici (glucide, acizi graşi, alcooli, etc) :
-Bacteriile care utilizează materia organică moartă sunt saprofite (reciclarea materiei organice)
-Bacteriile parazite (obligate, facultative) trăiesc pe contul organismelor vii, aducându-le
prejudicii
-Bacteriile patogene reprezintă parazite care afectează grav gazda, provocând maladie sau
moarte.
Clasificarea bacteriilor după sursa de energie:
Bacterii fototrofe – utilizează energia solară (fotosinteză)
Bacterii chemotrofe – folosesc energia degajată din reacţiile chimice de oxido-reducere. Ele
necesită un substrat donor de hidrogen (e- şi H+) şi un substrat acceptor de hidrogen. În transfer
participă transportori intermediari de electroni (lanţul respirator, NAD, FAD, etc.):
-Bacteriile chemolitotrofe – donorul de H este o substanţă anorganică
-Bacteriile chemoorganotrofe – donorul de H este o substanţă organică (glucoza, lipide...)
-Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe.
 (Clasificarea bacteriilor după sursele de energie şi carbon)
I.Bacterii fotoautotrofe (energie solară, CO2)
II.Bacterii fotoheterotrofe (energie solară, subst.organice)
III.Bacterii chemoautotrofe
IV.Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe)

13.Metabolismul energetic la bacterii chemoorganotrofe. Oxidarea biologică a

substratului (reactii de oxido-reducere). Tipurile oxidării biologice
(respirație,fermentație). Depozitarea şi utilizarea energiei.
Mecanismele de obţinere a energiei la chemoorganotrofe în funcţie de acceptorul final de H :
Respiraţie aerobă. Acceptorul final este oxigenul gazos (agent oxidant extern). Calea biochimică
de degradare este ciclul Krebs. Implică lanţul respirator de transport al electronilor asociat MCP.
Produse finale – CO2 și H2O, posibil H2O2

Respiraţie anaerobă. Acceptori finali – compuşi anorganici (nitrat, sulfat, S)

De ex.: bacterii denitrificatoare, SO4-reducătoare, metanogene.
Transportori specifici de electroni – ferredoxina, rubodoxina, lanțul respirator. Produse finale –
nitritul, amoniacul, sulfura (în prezenţa O2 – H2O2).
Sunt bacterii obligat anaerobe sau facultativ anaerobe (dacă pot folosi O2)

Fermentaţie. Substratul organic este metabolizat fără intervenţia unui agent oxidant extern.
Constă în procese de ox-red care realizează numai o oxidare parţială a substratului, donorul şi
acceptorul de H+ fiind substanţe organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o
moleculă mai oxidată (ex.: fermentare lactică, fermentare alcoolică, acidă mixtă, acetoinică, etc).
Fermentaţia se poate desfăşura în prezenţa O2, dar fără intervenţia acestuia.

Conservarea energiei
-O parte din energia eliberată se pierde sub formă de căldură sau poate fi utilizată direct sub
formă de energie electro-chimică (fpm-forță proton motrice) la nivelul MCP (ex.: rotaţia flagelilor,
transport transmembranar) sau stocată în compuşi chimici macroergici “bogaţi în energie”: ATP
(sintetizat prin fosforilare oxidativă sau fosforilare la nivelul substratului), fosfoenol-piruvat,
acetilfosfat şi acetil-CoA.
-În procesele de respiraţie se elimină mai multă energie decât din fermentaţie (în respirație aerobă
dintr-un mol de glucoză - 38 moli ATP, prin fermentaţie - 2 moli ATP).
-În procese de fermentare se formează deşeuri rejetate de către celulă.
 LUCRAREA DE LABORATOR N 7
TEMA: PRINCIPIILE DE CULTIVARE A BACTERIILOR.
MEDIILE DE CULTURĂ
ÎNTREBĂRI PENTRU CONTROL
1. Creşterea şi multiplicarea bacteriilor. Ciclul celular.
Creşterea – mărirea coordonată a masei şi volumului structurilor bacteriene ca rezultat al
proceselor de sinteză
Multiplicarea – creşterea numărului de celule pe o unitate de suprafaţă sau de volum
-Diviziune binară
-Înmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
-Autoreproducere (virusuri)
-Spori (micete)
-Fragmentare (actinomicete)
Ciclul celular – procesele care au loc de la formarea celulei pâna la următoarea diviziune
Faza C – replicarea ADN
Faza G – de latenţă, segregarea cromozomilor
Faza D – de diviziune, formarea septului
Replicarea ADN depinde de masa critică a celulei, iar separarea cromozomilor şi diviziunea
intervin în momentul când celula atinge o lungime - limită.
Perioada dintre 2 diviziuni reprezintă timpul (perioada) de generaţie (TG).
Durata TG depinde de specie şi de condiţiile de creştere (condiţii optime – viteză maximă)

2. Cultivarea bacteriilor. Condiţiile (principiile) de cultivare (substanțe nutritive,

sursă energetică, apă, temperatura potrivită, pH, oxigen, presiunea osmotică).
Creşterea bacteriilor în laborator – cultivare. Se cultivă bacteriile pentru izolarea lor din medii
naturale (prelevate patologice, alimente, apă, etc).
Izolarea bacteriilor se realizează pentru:
1.Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
2.Testarea sensibilităţii lor faţă de antibiotice
3.Obţinerea unor produşi de biosinteză (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni steroizi),
fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, eubioticelor...
Pentru creştere bacteriile au nevoie de nutrienţi şi condiţii fizico-chimice adecvate.
Condiţiile (principiile) de cultivare:
Sursă nutritivă adecvată
Sursă de energie
Apă
Temperatura potrivită
pH adecvat
Concentraţie optimă a oxigenului şi a CO2
Presiune osmotică adecvată
Temperatura de creştere
Există temperaturi minime, maxime şi optime de dezvoltare a bacteriilor. În raport cu temperatura
optimă deosebim:
-Bacterii psichrofile – tº optimă 6-20º C. Cresc şi la 0º C.
-Bacterii mezofile – optimum 30-37º C (limite 15-45º C)
-Bacterii termofile – optimum 50-60º C (până la 95º C)
-Bacterii hipertermofile (cresc la 70–110º C)
pH
-Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) – pH 6-7,5
-Bacterii acidofile – pH 2-6 (Lactobacillus)
-Bacterii alcalofile – pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)
Presiunea osmotică
-Bacterii halotolerante (osmotolerante) – cresc în concentraţii reduse de NaCl (mediu izotonic cu
mediul intern al gazdei) – mi/o patogene
-Bacterii halofile – preferă concentraţii mari de NaCl (1-30%) – stafilococi, vibrioni (Vibrio
parahaemolyticus)
Oxigenul
-Bacterii strict aerobe – cresc doar în prezenţa O2 molecular. Obţin energia prin respiraţie aerobă
-Bacterii microaerofile – necesită concentraţii reduse de O2 şi 2-10% CO2. Obţin energia prin
respiraţie sau fermentaţie (Neisseria, Brucella, Campylobacter)
-Bacterii strict anaerobe – cresc doar în absenţa O2. Obţin energia prin fermentaţie sau uneori
respiraţie anaerobă. Toxicitatea O2 – formarea H2O2,, a radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi
O22- pe care anaerobii nu le pot descompune (absenţa catalazei, superoxid dismutazei,
peroxidazei) – Clostridium, Bacteroides
-Bacterii anaerobe aerotolerante – pot creşte în prezenţa O2, obţin energia prin fermentaţie,
posedă peroxidază (Lactobacillus, streptococi)
-Bacterii facultativ anaerobe – cresc în orice condiţii, obţin energia prin respiraţie sau fermentaţie.

3. Mediile de cultură pentru bacteriile chemoheterotrofe şi cerinţele faţă de ele.

Mediile de cultură – soluţii sau substrate solide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice
necesare cultivării bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea
sensibilităţii la antibiotice, stocarea sau transportul culturilor bacteriene.
Cerinţele faţă de mediile de cultură:
-Să asigure necesităţile nutritive şi energetice ale bacteriilor
-Umiditate optimală
-pH optimal (7,2-7,4) şi constant (caracter de tampon)
-Potenţial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi – rH2>10)
-Să fie izotonice (0,5% NaCl)
-Să fie sterile şi transparente
4. Clasificarea mediilor de cultură.5. Mediile uzuale. Componenţa. Tehnica de preparare şi
sterilizare. 6. Mediile complexe, clasificarea lor. Destinaţia, componenţa, sterilizarea.

După provenienţă
1. Empirice, naturale. Au la bază produse de origine
animală sau vegetală (sânge, ser, lapte, ouă, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, peşte,
levuri, etc). Compoziţia lor chimică precisă nu poate fi controlată
2. Sintetice – includ ingrediente
chimice pure, compoziţia chimică este
cunoscută cu exactitate.
3. Semisintetice

După consistenţă
Medii lichide (bulion)– utilizate pentru obţinerea biomasei bacteriene şi a produselor lor
(antibiotice, enzime, toxine)
Medii solide – conţin 10-15% gelatină sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roşii, t°
topire 80-100°C, solidificare 42°C). Placa de geloză în cutii Petri este utilizată pentru izolarea
culturilor pure, geloza înclinată (în pantă) – pentru acumularea culturilor pure, în coloană înaltă –
pentru izolarea anaerobilor
Medii semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-agar. Se utilizează pentru studierea activităţii biochimice
sau a mobilităţii bacteriilor.

După compoziţia chimică (complexitate) şi destinaţie

A. Medii uzuale (universale, simple)

1. Apă peptonată (apă + 1% peptonă + 0,5% NaCl)
2. Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% peptonă + 0,5% NaCl)

Extrasul din carne contine creatină, xantină, hipoxantină, acid uric, acid adenilic, glicocol, uree,
glutamină ca sursă de azot, precum şi glicogen, hexozofosfaţi, acid lactic ca sursă de carbon.
1.Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar)
2. Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină)
Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la cultivare. Sterilizarea prin autoclavare:
120°C, 20 min

B. Medii complexe
I. Medii elective – formate din medii simple cu adaos de componente care permit creşterea mi/o exigente
nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloză-sânge – streptococi, neisserii; ser coagulat – corinebacterii, etc)
II. Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condiţii fizico-chimice particulare care
stimulează creşterea unor specii şi inhibă creşterea altor specii (geloza salină - stafilococi, geloza alcalină -
vibrioni, mediile Ploskirev, SS - Salmonella, Shigella, etc) – se utilizează când prelevatul este polimicrobian
și se urmărește izolarea anumitor specii de mi/o patogene.
 Mediile de îmbogăţire
reprezintă medii selective lichide, utilizate pentru îmbogăţirea florei patogene şi inhibarea florei de asociaţie
dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). Etapă premergătoare însămânţării pe medii selective solide.
-Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit ) – pentru Salmonella
-Mediul Kauffmann (mediul Muller+bilă+verde de briliant) – Salmonella
-Bulion cu selenit acid de Na – Shigella, Salmonella
-Apă peptonată alcalină (pH=9) – Vibrio cholerae
-Kitt-Tarozzi regenerat (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat) – pentru anaerobi

Medii diferenţial-diagnostice (DD)

– permit diferenţierea speciilor bacteriene în baza activităţii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice,
lipolitice, de oxido-reducere…)
Sunt construite după următoarea schemă: Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)

Studierea proprietăţilor zaharolitice

-Endo (geloză+lactoză+fucsină+hiposulfit de Na)
-Levin (geloză+lactoză+eozină+albastru metilen)
-Ploskirev / SS agar (geloză+lactoză+roşu neutru+săruri de acizi biliari+verde de briliant)

Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roşii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)

Studierea proprietăţilor de oxido-reducere

-Mediul cu sulfit de Bismut – pentru Salmonella (colonii negre – reducerea sulfitului în sulfura de Bi)
-Mediul Klauberg (geloză-sânge cu telurit de K) –pentru Corynebacterium diphtheria (colonii negre)

Studierea proprietăţilor lipolitice

Geloza cu gălbenuş de ou – bacteriile cu lecitinază formează un halou opac în jurul coloniei

Studierea proprietăţilor hemolitice

Geloza-sânge (geloza+5-15% sânge defibrinat)
În cazul hemolizei în jurul coloniilor apare o zonă clară

-Medii DD pentru identificarea finală a culturii pure

Şirul pestriţ Hiss (lichid sau semi-solid)– un şir de tuburi ce conţin soluţii 0,5% de diferite glucide şi
indicator.
Aprecierea – după modificarea culorii (acid - A) şi apariţia bulelor de gaz (acid şi gaz - AG)
 -Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminară
Medii DD multitest / politrope
Permit identificarea concomitentă a mai multor teste biochimice:
Russel – geloză+1% lactoză, 0,1% glucoză, indicator
Kligler – identic Russel+sulfat de Fe pentru detectarea producerii de H2S
Olkeniţki – identic Kligler+1% zaharoză+uree
Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la modificarea pH şi virajul culorii mediului din roşu în
galben.
În pantă se apreciază lactoza/zaharoza (oxidare), în coloană-glucoza (fermentare).
Producerea H2S – înnegrirea mediului

Mediile cromogene
•Combină caractere selective și diferențiale
•Această tehnologie se bazează pe molecule incolore solubile (numite cromogene), compuse dintr-un substrat
(care vizează o activitate enzimatică specifică) și un cromofor. Când enzima mi/organismului țintă scindează
conjugatul cromogen incolor, cromoforul este eliberat. În forma sa neconjugată, cromoforul își prezintă culoarea
distinctivă și, datorită solubilității reduse, formează un precipitat.
Mediile cromogene permit identificarea si diferentierea unor specii de microorganisme: enterobacterii (E. coli,
Proteus sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Serratia sp.), Pseudomonas sp., Enterococcus sp., Streptococcus
agalactiae, stafilococi, Candida sp.
•Mediul CPS (izolarea și diferențierea enterobacteriilor, Pseudomonas sp., enterococi, stafilococi),
•CHROMagar (gamă largă de medii pentru izolarea și diferențierea speciilor de Candida sp., enterobacterii,
vibrioni, stafilococi etc.),
•UTI și Chromogenic UTI (pentru izolarea uropatogenilor).

C. Medii speciale
– pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Löwenstein-Jensen –pentru agenţii tuberculozei, Sabouraud – fungi)
D. Medii de transport
– destinate transportării sau stocării unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior.
Menţin în viaţă bacteriile, fără a favoriza multiplicarea
-Mediul cu glicerină 30%
-Soluţie tampon-fosfat
-Soluţie NaCl 3%
-Mediul Cary-Blair
-Mediul Amies (pentru izolarea germenilor din secreții nazo-faringiene, urogenitale și din plăgi)
-Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) – pentru anaerobi, neisserii, etc
 ● Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mică de material ce conţine bacterii (inoculum) se întroduce
într-un mediu de cultură (însămânţare, inoculare), care ulterior va fi incubat în termostat (pentru
asigurarea temperaturii optime).
● În timpul incubării (18-24-48 ore…..) bacteriile cresc şi se divid, formând o cultură bacteriană
(totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis – 3-5 săptămâni
V.cholerae – 6-12 ore

7. Manifestarea creşterii şi multiplicării bacteriilor în medii lichide şi solide.

Coloniile de bacterii, metodele de studiere. Tipurile de colonii şi caracteristica lor.

● În mediu lichid
- Turbiditate uniformă
- Formarea unei pelicule la suprafaţa mediului (vibrioni, yersinia)
-Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe pereţi (streptococi, Bacillus anthracis)
● În mediu solid – formarea coloniilor
Colonie – o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau un grup de celule - UFC (Unitate
Formatoare de Colonii) pe suprafaţa unui mediu solid

*Fiecare specie bacteriană formează colonii specifice (caracter util în identificare)

Caracteristica coloniilor
Dimensiuni – colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)
Contur (margini) – neted, ondulat, zimţat, lobat,etc
Suprafaţă – plată, bombată, convexă, ombilicată,etc
Formă – punctiformă, circulară, filamentoasă,neregulată
Culoare (pigmentaţie) – albă, galbenă, aurie, etc
Densitate – opacă, transparentă, etc
Consistenţă – cremoasă, untoasă, uscată, mucoidă

Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede, lucioase, formează suspensii omogene în sol. izotonică
Colonii R (rough) – margini neregulate, suprafaţa uscată, rugoasă, formeaza grunji in sol. izot.
Colonii M (mucoase) – mari, bombate, lucioase, caracteristice bacteriilor capsulate

Studierea coloniilor

1.Studierea macroscopica in lumina directa si reflectata:

Cutia se intoarce cu fundul spre sine si se studiaza coloniile in lumina directa. Daca sint mai multe tipuri de
colonii , ele se numeroteaza si fiecare se descrie aparte.
 In lumina reflectata coloniile se studiaza din partea capacului fara a-l deschide si in protocol se fixeaza:
culoarea, suprafata, pozitia pe mediul nutritiv.
2.Examenul microscopic al coloniilor
Cutia se instaleaza cu fundul in sus pe masuta microscopului, se coboara condensatorul si cu obiectivul 8X se
studiaza coloniile, fixind in protocol strucyura lor si caracterul marginilor.

8. Noţiuni de specie, cultură pură şi mixtă, tulpină şi clonă.

A. Specie- unitatea fundamentala a evolutiei.

B. Cultura pura- este o populatie formata din bacterii de aceeasi specie (indispensabila identificarii).
C. Cultura mixta- este o populatie compusa din bacterii de specii diferite.
D. Tulpina-este o populatie microbiana constituita din descendentii unei singure izolari in cultura pura, pe
care o manipulampentru studiu.
E. Clona- populatie care rezulta din multiplicarea unei singure celule.

9. Fazele evoluţiei culturilor periodice de bacterii. Dinamica multiplicării bacteriilor în cultura

continuă şi discontinuă. Importanţa practică.

Caracterele de cultură ale bacteriilor reprezintă exigenţele nutritive (medii, temperatură, pH, aerare, etc), timpul
apariţiei culturii şi manifestarea creşterii pe medii lichide şi solide
Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi
Exista 2 tipuri principale de culturi bacteriene:
Culturi discontinue (in mediul de cultura nereinnoit) care pot fi realizate:
-asincron
-sincron
Culturi continue (in medii de cultura reinnoite continuu)
Culturile discontinue se obţin la cultivarea bacteriilor în volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obţinute
şi utilizate în laboratorul microbiologic

Fazele dezvoltarii unei culture discontinue asincrone sunt:

1. Faza de lag- faza de adaptare la conditiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc in dimensiuni, dar
nu se divid. Durata este variabila (2-4 ore) si depinde de starea bacteriei, conditiile mediului.
2. Faza logaritmica- bacteriile cresc si se divid cu viteza maximala constanta, curba evolueaza exponential. La
fiecare diviziune populația bacteriană se dublează. Bacteriile sunt foarte sensibile la agenti antimicrobieni
(culture utile pentru testarea sensibilitatii antibiotice). Durata 8-10 ore.
3. Faza stationara- rata celulelor care se multiplica scade treptat, numarul celulelor vii ramine constant mai multe
ore.Cauza- consumarea nutrientilor, acumularea metabolitilor toxici.
Morfologia bacteriilor este tipica specie, apar incluziuni, spori (culture utile pentru identificare).
Sensibilitatea la agenti antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore.
4. Faza de declin (letalitate)-bacteriile mor progresiv.
Consecinta acestor actiuni conduce, in final, la sterilizarea mediului si la moartea tutror celulelor, respective la
pierderea culturii.
Culturi discontinue sincrone- culturi in care bacteriile se divid in acelasi timp.
-Sunt selectionate din culture asincrone si contin organisme foarte asemanatoare deoarece apartin aceleiasi
categorii de virsta si/sau de dimensiuni si ca urmare se divid aproape simultan.
-Procesul de diviziune sincrona dureaza numai 2-3 generatii deoarece diferentele individuale determina procesul
de defazare in ritmul de crestere, chiar intre descendentii unei singure celule.

Tehnicile de obtinere a culturilor sincrone sunt:

-Tehnici bazate pe selectie dupa dimensiuni de virsta
-Tehnici bazate pe modificari ale mediului.

Culturi continue- se realizeaza cind mediul de cultura este continuu reinnoit si imbogatit cu oxigen cu
evacuarea unei cantitati de cultura. Se realizeaza in chemostate sau turbidostate, cultura aflindu-se permanent in
faza exponentiala.
Chemsotatele- sunt sisteme de cultivare deschise, in flux continuu, in care mediul proaspat este adaugat in mod
continuu, in timp ce o cantitate egala, reprezentind surplusul de microorganism si de mediu este indepartat.
Chemostatul asigură în mod continuu o cultură care creşte indefinit, cu o viteză constantă, în condiţii constante,
furnizând celule cu proprietăţi uniforme şi activităţi fiziologice optime.

Culturile continue se folosesc în practica industrială pentru:

– obţinerea biomasei microbiene bogate în nutrienţi;
– extragerea unor principii active de la diferite specii de microorganisme (vitamine, enzime etc.).
În intestin – culturi continue.
 LUCRAREA DE LABORATOR NR.8
TEMA: EXAMENUL BACTERIOLOGIC ÎN DIAGNOSTICUL BOLILOR INFECŢIOASE

1. Metoda bacteriologică de diagnostic al bolilor infecţioase. Esenţa. Scopul.

Examenul bacteriologic constă în inocularea (însămânţarea) prelevatelor pe medii de cultură pentru izolarea
culturilor pure de bacterii (tulpini) care vor fi ulterior identificate, testate la sensibilitate vis-a-vis de antibiotice,
eventual conservate.
Examenul bacteriologic constă din câteva etape succesive, de la prelevarea (recoltarea) probelor biologice până
la remiterea rezultatelor.
Faza pre-analitică (responsabilitatea medicului!!!)
-Prescrierea investigaţiei (în funcţie de datele examenului clinic şi paraclinic). În ordonanţă se fixează identitatea
medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestările patologice, data apariţiei, alte date: imunosupresie,
tratament cu antibiotice, graviditate, etc.
-Prelevarea probelor
Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicării sau/şi din căile de eliminare ale agentului
patogen) şi momentul prelevării (cât mai aproape de debutul bolii)

2. Prelevate (biosubstrate) de la pacienţi şi din mediul ambiant (apă, sol, aer, produse alimentare,
lavaje, etc.). Regulile de recoltare şi ambalare, condiţiile de transportare în laborator. Pregătirea
probelor pentru investigaţii de laborator.
Materiale de examinat (prelevate) de la pacienţi:
Secreţii rino-faringiene, bronşice
Spută
Puroi
Exsudate, transsudate
Sânge
LCR
Urină, secreţii genitale
Mase fecale, bilă, suc duodenal
Bioptate, punctate
Material cadaveric, etc.
Materiale de examinat din mediul extern:
Apă
Alimente
Sol
Aer
Lavaje
Vectori, etc
Modul de prelevare (recoltare)
În recipiente sterile
Respectând regulile de asepsie și de autoprotecţie
La debutul bolii
Până la administrarea antibioticelor
Cantitate suficientă
Transportarea
-Imediată sau utilizând medii de transport, cu respectarea condiţiilor speciale după necesitate
-În ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
-În fişa de însoţire să fie indicată identitatea pacientului, vârsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevării,
scopul investigaţiei, ş.a.

3. Etapele examenului bacteriologic pentru izolarea culturilor de bacterii aerobe.

Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) - orientare în diagnostic
După necesitate, probele sunt supuse pregătirii pentru investigaţie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc)
Examinarea microscopică (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Loeffler...) – prezenţa mi/o, forma, cantitatea,
G+/-.
a) Metodele de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe. Studiul caracterelor de cultură ale bacteriilor.
Tipurile de colonii izolate. Caracterele.

I Scopul izolării - de a obţine o cultură pură dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic.
O colonie separată constituie o cultură pură.
Tehnici utilizate:
-Prin epuizarea inoculului pe suprafaţa gelozei din cutia Petri (însămânţare în striuri paralele, însămânţare în
cadrane, etalarea consecutivă pe trei cutii).
-Metoda diluţiilor logaritmice a inoculului în geloză topită şi răcită la 50º C (10-1, 10-2,...), apoi turnate în cutii
Petri sau eprubete.Incubare în termostat la 37º C, 18-24 h (în funcţie de TG).

b)II Acumularea culturii pure.

-Examinarea macroscopică a coloniilor crescute (formă, culoare, dimensiuni, etc)
-Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea purităţii culturii
-Repicarea coloniilor suspecte pe geloză în pantă (înclinată) pentru acumularea culturii pure
-Termostat, 37º C, 18-24 ore

c) III Identificarea culturii pure de microorganisme aerobe în baza caracterelor morfologice, tinctoriale,
de cultură, enzimatice, etc. Evaluarea rezultatelor, formularea răspunsului.
Verificarea purităţii culturii (frotiu Gram)
Identificarea culturii pure constă în evidenţierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include
într-o familie, gen, specie, variantă
Se studiază caracterele:
Morfologice
Tinctoriale
De cultură
Biochimice
Antigenice (seroidentificarea)
De patogenitate
Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)
Sensibilitatea la antibiotice
STUDIEREA ACTIVITĂŢII BIOCHIMICE A BACTERIILOR
-Activitatea zaharolitică (şirul Hiss, coagularea laptelui, etc)
-Activitatea proteolitică
Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc)
Evidenţierea enzimelor ce intervin în degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze, desulfhidraze, etc) cu
detectarea produsele finale ale descompunerii AA: H2S, NH3, indol, etc…

Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de Fe de culoare neagră în mediile multitest – Kligler, Olkeniţki,
etc; utilizarea benzilor de hârtie de filtru îmbibate cu acetat de Pb care se prind între dopul eprubetei cu BP în
care creşte cultura studiată (formarea sulfurii de Pb înnegreşte hârtia)
Depistarea indolului (produs al hidrolizei triptofanului) – benzi de hârtie îmbibate cu acid oxalic. În prezenţa
indolului indicatorul virează în roz.
Depistarea amoniacului (ureaza) – hârtia de turnesol se colorează în albastru.
Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2)
(cultura se amestecă cu o picătură de apă oxigenată – apariţia bulelor de gaz)
Depistarea oxidazei (detectarea prezenţei citocromoxidazei din lanţul respirator)
Reactiv – di (tetra)metil-parafenilen-diamină (benzi sau rondele de hârtie îmbibate cu reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului – culoare violetă-neagră
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo- : Enterobacteriaceae
Depistarea lecitinazei – mediu cu gălbenuş de ou 10% - formarea unui halou opac în jurul coloniilor
Depistarea lipazei – mediu cu Twin 80 1%– halou opac în jurul coloniilor (precipitarea acizilor graşi)
Depistarea hemolizinei – geloză-sânge 5-10% - zonă clară în jurul coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37º C, 18-24 h

IV- etapă -EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA ȘI ELIBERAREA RĂSPUNSULUI

Compararea rezultatelor obţinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a găsi asemănări.
Exemplu de răspuns: Din proba examinată a fost izolată tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis,
tox+, sensibilă la ...., rezistentă la .....

4. Particularităţi de izolare în cultură pură a bacteriilor:

A bacteriilor sporulate: încălzirea prealabilă a prelevatului 80º C – 20 min
A bacteriilor acido-alcoolorezistente: tratarea prealabilă a prelevatului cu sol. NaOH timp de 15 min.,
neutralizată ulterior cu soluție tampon fosfat
A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: îmbogăţirea prealabilă a florei patogene utilizând medii de
îmbogăţire
A bacteriilor cu virulenţă înaltă şi pretenţioase la cultivare: inocularea prelevatului la animalele de laborator
sensibile.
5. Căile și metodele de creare a condiţiilor de anaerobioză, mediile de cultură speciale şi
aparatajul utilizat pentru cultivarea microorganismelor anaerobe.
Condiţia principală – cultivare în absenţa oxigenului
1.Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarozzi regenerat - 100º C, 20 min, răcit, acoperit cu vazelină;
însămânţarea în geloză în coloană)
2.Crearea condiţiilor de anaerobioză
Metoda fizică – utilizarea anaerostatului
Metoda chimică – în exicator se întroduc substanţe ce fixează oxigenul (ex.: pirogalol+bază); utilizarea
gas-pachetelor
Metoda biologică Fortner – cultivarea concomitentă a aerobilor şi anaerobilor
Recoltarea – cu precauţie, evitând contactul cu aerul (în seringi, utilizând medii speciale)

6. Etapele examenului bacteriologic pentru izolarea culturilor de bacterii anaerobe.

I etapă – ÎMBOGĂŢIREA ANAEROBILOR

-Însămânţarea prelevatului în 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarozzi regenerat
-Încălzirea unui tub la 80º C, 20 min – distrugerea florei nesporogene
-Incubarea la 37º C, 24-48 h (va avea loc multiplicarea anaerobilor)

II etapă - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

-Studierea caracterelor de cultură – tulburarea mediului, descompunerea bucăţilor de ficat, etc
-Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (însămânţarea a 0,1 ml din mediul K-T pe 3 cutii cu geloză-sânge
glucozată consecutiv). Incubarea în anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h

III etapă - ACUMULAREA CULTURII PURE

-Studierea macroscopică a coloniilor
-Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte
-Repicarea în mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure
-Incubarea în termostat, 24 h

IV etapă - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

-Verificarea purităţii culturii pure (frotiu Gram)
-Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiţiilor de anaerobioză)
V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA ŞI ELIBERAREA RĂSPUNSULUI
7. Studiul caracterelor de cultură ale microorganismelor anaerobe izolate.
9. Particularităţile de identificare a culturii de microorganisme anaerobe. Evaluarea rezultatelor,
formularea răspunsului.

Metode moderne de identificare a microorganismelor

Sistemul API – o galerie din plastic formată din numeroase alveole care conţin fiecare un
substrat deshidratat
(glucide, AA, etc).
Din colonia izolată se prepară o
suspensie de o anumită concentrație.
Alveolele sunt inoculate cu suspensia
bacteriană testată şi incubate. Ulterior la necesitate se adaugă reactivi pentru detectarea metaboliţilor particulari.
Lectura – peste 4-18h conform unui cod de cifre sau computerizat
Sistemul VITEK® 2 Compact are ca obiect de activitate identificarea bacteriilor şi a fungilor şi testarea
sensibilităţii bacteriilor cu efecte semnificative din punct de vedere clinic.
Sistemul include aparatul VITEK® 2 Compact, un computer (o staţie de lucru) şi o imprimantă.
Este disponibil un sistem Advanced Expert System™ (Utilizare Clinică) pentru asigurarea online a validării
sistematice a rezultatelor şi a interpretării fenotipurilor rezistente identificate în cursul testelor de sensibilitate.
Aparatul VITEK® 2 Compact este un sistem integrat care combină operaţiile de inoculare a cardului de testare, incubare a
cardului de testare şi citire a rezultatelor.
ETAPELE:
1. Izolarea culturii pure
2. Pregatirea probelor (a suspensiei bacteriene)
3. Introducerea cardurilor de testare şi a
eprubetelor cu probe în casetelor corespunzătoare.
4. Încărcarea casetei în Staţia de umplere (umplerea celulelor cardurilor de testare).
5. Transferarea casetei în staţia de încărcare a casetei
6. Procesarea cardurilor de testare (citirea codului de bare, sigilarea tubului de transfer, incubarea si citirea cardurilor de
testare)
VITEK® 2 Compact realizează analizele de identificare şi de sensibilitate prin monitorizarea continuă a creşterii şi a
activităţii microorganismelor din interiorul celulelor din cardurile de testare.
Sistemele optice de transmisie utilizează lumina vizibilă pentru măsurarea directă a creşterii microorganismelor.
Aceste sisteme optice se bazează pe o citire iniţială a luminii de la nivelul unei celule înainte de începerea unei
creşteri semnificative. Determinările transmisiei luminii la nivelul aceleiaşi celule la fiecare 15 minute măsoară
creşterea microorganismelor în funcţie de cât de mult este împiedicată lumina să traverseze celula.
7. Ejectarea cardului
Durata analizei – 2 – 10 ore
 LUCRAREA DE LABORATOR N 9
TEMA: ANTAGONISMUL MICROBIAN. ANTIBIOTICELE. BACTERIOCINELE

1. Noţiuni de biotop şi microbiocenoză. Microflora normală a organismului uman. Rolul ei în fiziologia şi patologia
umană. Relaţiile dintre microorganisme în biocenoze.

BIOTOP – spaţiu cu condiţii de viaţă particulare (sol, lacuri, oceane, paduri, sau - conjunctiva, mucoasa intestinală,
orofaringele, vaginul, tegumentul, etc), populat şi transformat de asociaţii de fiinţe vii, inclusiv microorganisme.

MICROBIOCENOZĂ (ecosistem, comunitate microbiană) – asociaţii microbiene ce populează un biotop.

*Microorganismele prezente într-un biotop particular constituie microflora (microbiota, microbiomul) acestui habitat (m/f
cutanată, intestinală, etc)
Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană ulterioară, actionând prin următoarele
mecanisme:
• competiţie pentru aceiaşi nutrienţi;
• competiţie pentru aceiaşi receptori de pe celulele gazdei;
• producere de bacteriocine, vitamine (gr B, K);
• producere de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi;
• stimularea continuă a sistemului imun;
• stimularea producerii unor factori imuni de protecţie (anticorpii naturali).

MICROBIOM – totalitatea microorganismelor, elementelor lor genetice și a interacțiunilor acestora într-un mediu (ex. în
organismul uman și pe suprafata sa).

Între microorganismele unui biotop se pot stabili relaţii (simbioză):

I. Indiferente (neutralism)
II. Favorabile (comensalism/satelitism, mutualism, sinergism)
III. Defavorabile (parazitism, antagonism)

2. Antagonismul microbian. Tipurile. Mecanismele. Metodele de studiere. Importanţa practică.

Antagonism – o specie inhibă sau omoară altă specie prin mecanisme specifice sau nespecifice
Mi/o care manifestă activitate inhibitoare – antagonist (A), mi/o care suferă – concurent (C).
Antagonism nespecific: - Antagonistul este mai activ, utilizând nutrienţii, oxigenul - Antagonistul produce metaboliţi
toxici (acizi, indol, H2 S, amoniac, peroxid, etc)
Antagonism specific – antagonistul produce substanţe cu acţiune specifică (antibiotice, bacteriocine) asupra unui sau mai
multor concurenţi.

Efectul acţiunii unui antagonist asupra concurentului poate fi bacteriostatic sau bactericid (uneori bacteriolitic).

Utilizarea practică a antagonismului microbian:

1. Pentru depistarea mi/o – producenţi de antibiotice (micete, actinomicete, bacterii)
2. Pentru obţinerea produselor biologice curative de origine microbiană (probiotice, eubiotice/sinbiotice)
3. Crearea biocenozelor favorabile organismului

Definiții la cuvinte noi

Probioticele sunt preparate ce conţin bacterii vii sau substanţe de origine microbiană care, întroduse pe cale naturală,
manifestă efecte benefice (fiziologice, biochimice şi imune) pentru organismul-gazdă prin stabilizarea şi optimizarea
funcţiilor microflorei normale.
 Prebioticele sunt preparate ce conţin un ingredient alimentar nedigerabil care stimulează selectiv creşterea şi activitatea
unui număr limitat de bacterii rezidente ale microflorei normale intestinale.
Sinbioticele/eubioticele sunt preparate obţinute în urma combinării raţionale dintre probiotice şi prebiotice.

METODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI

1. În mediu solid (metoda tranşeei) – antagonistul se însămânţează în centrul cutiei, concurenţii – perpendicular. Termostat
24h. Aprecierea – după dimensiunea zonei de inhibiţie a creşterii culturii concurentului.
2. În mediu semisolid – I strat – antagonistul, II strat – concurentul. Termostat 24h. Aprecierea – zonă clară între straturi.
3. Însămânţarea în mediu lichid (BP) a unui număr egal de A şi C. După 24 h de incubaţie se reînsămânţează 0,1 ml pe
placa cu geloză. Se compară numărul coloniilor de A şi C.

3. Antibioticele. Noţiune. Clasificarea după efectul asupra celulei bacteriene, spectrul de acţiune şi producent.

ANTIBIOTICELE (AB)– produse de origine naturală (microbiană, animală sau vegetală), derivaţi semi-sintetici
sau produse sintetice care inhibă sau omoară selectiv unele mi/o sau/şi celule tumorale, fără a exercita ca regulă
efecte toxice asupra macroorganismului.

Clasificarea AB
I. După efectul asupra celulei
- Bacteriostatice (tetraciclina, cloramfenicol…)
- Bactericide (streptomicina, polimixina)
- Bacteriolitice (peniciline, cefalosporine)

II. După spectrul de acţiune

- AB cu spectru îngust (limitat) de acţiune (AB antiG+, anti-G-, anti-tuberculoase, anti-micotice, anti-tumorale, etc)
- AB cu spectru larg de acţiune (G+ şi G-)

III. După producent (origine)

1. De origine fungică (peniciline, cefalosporine,...)
2. Din actinomicete (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc)
3. De origine bacteriană (bacitracina din Bacillus subtilis, gramicidina din Bacillus brevis, polimixina, colistina din
Paenibacillus polymyxa)
4. De origine vegetală – fitoncidele (alicina, rafanina)
5. De origine animală (lizozima – din albuşul de ou, ecmolina – din oase de peşte, eritrina – din masă eritrocitară,
splenocitina – din splină)

IV. După compoziţia chimică (beta-lactamine, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, glicopeptide, polipeptide, poliene,
sulfamide, chinolone şi fluorochinolone, nitrofurani, etc)

4. Metodele de obţinere a antibioticelor. Cerinţele faţă de antibiotice. Unităţile de acţiune.

1. Metoda biologică / 2. Metoda sintetică / 3. Metoda semi-sintetică
Etapele metodei biologice:
1. Cultivarea tulpinilor-producente de AB (ex.: Penicillium notatum, Actinomyces griseum, etc) în mediu lichid adecvat
2. Extragerea AB
3. Purificarea şi concentrarea AB
4. Controlul toxicităţii
5. Determinarea activităţii AB

Activitatea AB se măsoară în unităţi de masă (g, mg, µg) sau de acţiune (UA).
1 UA – cantitatea minimă de AB care inhibă creşterea unei tulpini de referinţă în condiţii standarde. Penicilina – 1UA =
0,6 µg de substanţă pură
 Cerinţele faţă de AB:
- Toxicitate selectivă
- Efect terapeutic cu doze minime
- Activitate de lungă durată - Spectru restrâns de acţiune
- Să fie solubile şi absorbite uşor
- Să nu provoace efecte secundare
- Să nu se dezvolte rezistenţa contra AB
- Să fie ieftine

5. Grupele principale de antibiotice, utilizate în medicina practică.

6. Mecanismele de acţiune ale antibioticelor.

1. AB CARE INHIBĂ SINTEZA PERETELUI CELULAR (!! Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar
celulele metabolic active sunt omorâte. Nu afectează celulele eucariote (lipsa PG).)

- Beta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Inhibă etapa finală a sintezei PC, fixându-se de proteinele de legare a
penicilinei (PLP) din membrana citoplasmatică, care sunt enzime ce catalizează legăturile între catenele peptidice din PG
(transpeptidaze).
- Vancomicina, teicoplanina previn incorporarea complexului dizaharidpentapeptid in catena de peptidoglican din
peretele celular, fixându-se de componentul peptidic
- Bacitracina impiedică reciclarea moleculelor lipidice de transport transmembranar – bactoprenol
- Fosfomicina blochează piruviltransferaza, implicată în sinteza acidului Nacetil muramic
- Cicloserina (analog ciclic al D-alaninei) inhibă activitatea a 2 enzime – alanin racemaza și D-alanin:D-alanin ligaza

2. AB CU ACŢIUNE ASUPRA ME Şi A MCP

- AB polipeptidice (polimixina B, colistina); daptomicina (lipopeptid). Se fixează pe fosfolipidele membranelor bacteriene
(în special ME la bacterii G-), provocând deformarea lor şi afectând permeabilitatea. Efect bactericid.

- AB polienice (nistatina, levorina, amfotericina B, ketoconazol, etc). Se fixează pe sterolii din MCP a micetelor,
perturbând respiraţia şi dezorganizând MCP (permeabilitate excesivă şi moartea celulei).
!!Aceste AB acţionează şi asupra celulelor inactive metabolic. Relativ toxice, în special nefro.
 3. AB CU ACŢIUNE ASUPRA RIBOZOMILOR (inhibarea sintezei proteice)
Se leagă de receptori specifici de pe subunităţile 30S sau 50S, perturbând sinteza proteică (inhibiţia transpeptidazei, a
translocaţiei peptidelor, etc).
Rezultă inhibiţia sintezei proteice sau sinteza proteinelor nefuncţionale.
!!Efectul este bacteriostatic (aminozidele – bactericid), doar asupra celulelor active metabolic.
- 30S (aminoglicozide: streptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline)
- 50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide - eritromicina, oleandomicina; lincosamide - clindamicina, lincomicina;
linezolid).

4. AB CU ACŢIUNE ASUPRA ACIZILOR NUCLEICI

- Rifampicina /rifamicina– inhibă ARN-polimeraza ADN-dependentă. Rezultă stoparea sintezei ARNm
- Novobiocina, Chinolonele (acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) – blochează activitatea topo-izomerazelor,
intervenind în conformaţia ADNului (inhibiţia replicării ADN).
!!!! Efect bactericid.
- Sulfamidele şi trimetoprimul perturbă sinteza acidului folic şi folaţilor (cofactori în sinteza AN). !!Activitate
bacteriostatică.

7. Sensibilitatea bacteriilor la antibiotice. Noțiune de bacterii sensibile, rezistente și intermediare.

Față de un AB dat, o specie bacteriană sau un gen bacterian poate fi:

● Fie sensibil (S) în mod obișnuit (efectul terapeutic este obţinut cu doze terapeutice uzuale)
● Fie sensibil la expunere crescută/intermediar (I) (succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari
sau la administrarea locală a AB)
● Fie rezistent (R) în mod obișnuit (efectul terapeutic nu poate fi obţinut cu doze terapeutice)

O tulpină bacteriană izolată dintr-un prelevat patologic poate fi sensibilă, rezistentă sau intermediară față de un
AB dat. Uneori, în funcție de natura AB, ea nu poate fi decât sensibilă sau rezistentă.

-sensibilă, dacă CMI este de minimum 2-4 ori mai mică decât nivelul mediu al antibioticului în focarul infecţios (sânge,
bilă, LCR etc.). Efectul terapeutic este posibil prin utilizarea unor doze uzuale dintr-un asemenea antibiotic;
-rezistentă, atunci când CMI este mai mare decât nivelul mediu al antibioticului în focar. Efectul terapeutic nu se obţine. În
acest caz antibioticul determină efecte toxice pentru pacient înainte de a atinge CMI;
-intermediară, sau moderat sensibilă, atunci când CMI este apropiat de concentraţia medie a antibioticului în focar. În acest
caz efectul terapeutic se obţine doar prin administrarea unor doze mari de antibiotic, sau prin administrare locală.
Concentrațiile critice sunt stabilite pe baza concentrațiilor serice/tisulare obținute după administrarea unei posologii
uzuale și a posologiei maximum tolerate.
• concentraţia critică inferioară (c) - concentraţia serică a antibioticului obţinută după administrarea unei posologii
uzuale
• concentraţia critică superioară (C) - concentraţia serică a antibioticului obţinută după administrarea unei posologii
maximum tolerate.
• O tulpină izolată, pentru care CMI este inferioară sau egală cu c este sensibilă la AB în cauză (efect
terapeutic posibil cu doze uzuale).
• Dacă CMI este mai mare decât C, tulpina este rezistentă (efect terapeutic imposibil).
• Dacă CMI-ul este situat între valorile c și C (c<CMI<C),tulpina este intermediară (efect terapeutic posibil cu
doze maxime).
8. Determinarea sensibilităţii microbilor la antibiotice. Metoda difuzimetrică (rondelelor).
Metode fenotipice (cantitative)
• Difuziei în mediu solid (discurilor)
• Diluțiilor în medii lichide sau solide
• E – testul
• Metode parțial automatizate
Metode genetice de testare a rezistenței (calitative)
• PCR
• RT-PCR
• Multiplex-PCR
• HAIN-test

Metoda difuzimetrică (discurilor) Kirby- Bauer. Calitativă, utilizată uzual în infecţii banale.
Condiţii: mediu standard, concentraţie standardă de mi/o, discuri/comprimate cu % standarde de AB, condiţii standarde.
Mediul este inoculat cu suspensia bacteriană. După uscare în termostat timp de 15-20 min se aplică discurile cu pensa sau
cu dispenser pentru discuri – in termostat 18-24h, 35-36°C.
În jurul discurilor se va realiza un gradient de concentratie prin difuzia locală a antibioticului (in imediata vecinatate a
discului realizindu-se o concentratie mai mare de antibiotic care descreste pe masura indepartarii de acesta).
Citirea– se măsoară diametrul zonei de inhibiţie a creşterii culturii bacteriene.
Interpretarea – Sensibil (S), Rezistent (R), Intermediar (I) în funcție de valorile din tabelele de interpretare.
Indicaţii: numai pentru bacterii cu creştere rapidă. Permite testarea mai multor antibiotice pe aceeaşi placă, dar gradul de
corelaţie reală cu CMI este de numai 70-90% .
Principiu: constă în însămânţarea tulpinii de cercetat pe suprafaţa unui mediu solid şi aplicarea de microcomprimate de
antibiotice pe suprafaţa mediului (acestea vor difuza în mediu din aproape în aproape atingând concentraţii tot mai mici pe
măsura creşterii distanţei). Bacteriile vor creşte “în pânză” pe suprafaţa mediului până în zona unde, în momentul
multiplicării lor antibioticele vor atinge o concentraţie corespunzătoare CMI. După o termostatare de 18 ore se apreciază
sensibilitatea germenului în funcţie de diametrul zonei de inhibiţie care apare în jurul comprimatului de antibiotic.
Tehnica.
Materiale necesare:
-mediu de cultură (Mueller Hinton sau Mueller Hinton suplimentat cu sânge pentru bacteriile pretenţioase nutritiv
-germenul de testat, care trebuie să fie în cultură pură de 18-24 de ore pe un mediu neselectiv (este contraindicată
efectuarea antibiogramei dint-o cultură microbiană mixtă). Mărimea inoculului în ser fiziologic steril este standardizată la
0,5 Mc Farland (aproximativ 108 germeni ml).
-substanţele antimicrobiene se prezintă sub forma unor microcomprimate, având pe ambele feţe simbolul
antibioticului şi concentraţia.
Trusele cu microcomprimatele utilizate se aleg în funcţie de germenul testat (Gram-pozitiv sau Gram-negativ), de
rezistenţa naturală a acestuia, dar şi de localizarea infecţiei.
Modul de lucru: Suspensia bacteriană standardizată, obţinută prin suspendarea în ser fiziologic steril a 2-3 colonii din
cultura de 24 ore, este depusă pe suprafața mediului cu un tampon de vată steril (tamponul se scufundă în suspensie, se
îndepărtează excesul prin presare de pereţii tubului şi se trece pe suprafaţa mediului în trei direcţii până la acoperirea
întregii suprafeţe, efectuându-se şi un striu marginal circular pentru a se obţine un inocul uniform). După inoculare, plăcile
se lasă 5 minute la temperatura camerei pentru a facilita absorbţia inoculului în mediu, după care se depun
microcomprimatele respectându-se distanţa de minim 25 mm dintre discuri şi 15 mm de marginea plăcii Petri. Plăcile
astfel pregătite se incubează timp de 24 de ore la 37ºC.
Interpretarea rezultatelor. După termostatare, citirea se efectuează prin măsurarea, cu ajutorul unei rigle, a diametrelor
zonelor de inhibiție. Corelaţia dintre diametrele zonelor de inhibiţie şi sensibilitatea germenului se face prin comparare cu
datele existente în tabelele standardelor EUCAST sau CLSI. Rezultatele se exprimă în sensibil, rezistent şi intermediar
sensibil.
9. Metoda diluţiilor succesive (în medii lichide şi solide). Noţiuni de concentraţie minimă de inhibiţie (CMI),
concentraţie minimă bactericidă (CMB). Concentratia critica (cC) şi semnificaţia ei în prescrierea antibioticelor.
Metoda diluţiilor are o utilizare mai restrânsă şi este folosită mai ales în cercetare. Ea este pretenţioasă din punct de vedere
tehnic şi necesită un consum mare de materiale care depăşeşte necesităţile unui laborator clinic. Permite, însă, stabilirea
precisă a CMI şi CMB.
Determinarea CMI -concentrație minimă inhibitoare-
Indicaţii: infecţii grave care ameninţă viaţa bolnavului (septicemii, endocardite subacute, meningite), testarea
bacteriilor cu cultivare lentă (bacilul Koch), testarea preliminară determinării CMB.
Principiu: se realizează diluţii crescânde de antibiotic în mediu lichid, care se pun în contact cu cantităţi fixe din
cultura microbiană de cercetat, se incubează 18 ore la 37°C şi se controlează apoi care este cea mai mică concentraţie de
antibiotic ce nu a permis creşterea germenilor microbieni. Aceasta va fi CMI.
– cea mai mică doză de AB care inhibă creşterea culturii după 24h de incubare (mediu clar) constituie Concentraţia
Minimă de Inhibiţie (CMI) a AB pentru tulpina testată. CMI măsoară efectul bacteriostatic.
Determinarea CMB -concentrație minimă bactericidă-
Indicaţii: infecţii grave de tipul septicemiilor, endocarditelor etc.
Principiu: după citirea CMI-ului se trece o cantitate fixă din eprubetele în care microorganismul nu a crescut pe un
mediu de cultură solid lipsit de antibiotice. Se incubează 18 ore la 37°C, după care se notează care este concentraţia la care
au crescut germenii, precum şi cea mai mică concentraţie la care aceştia nu au mai crescut (au fost iremediabil distruşi).
Această din urmă diluţie reprezintă CMB.
– cantitatea minimă de AB care omoară 99,9% din inoculum după 18h de incubare.
10.Metode moderne automatizate de testare a antibiogramei.
Testul E
Este o variantă de antibiogramă pe mediu solid, care permite stabilirea precisă a CMI.
Principiu: pe suprafaţa mediului de cultură gelificat şi însămânţat de aceeaşi manieră cu cea descrisă la metoda
difuzimetrică se aplică în locul microcomprimatelor de antibiotice fâşii de hârtie de filtru impregnate cu antibiotic în
concentraţie crescândă. La un capăt al fâşiei concentraţia este minimă, iar la celălalt este maximă. Interpretarea zonei de
inhibiţie permite aflarea CMI.
Cunoscând CMI pentru antibioticele la care un germene este sensibil, concentraţia maximă în focar care se poate realiza
şi capacitatea de difuzie a antibioticului în focarul infecţios, se va putea alege varianta optimă de tratament.
Există şi situaţii în care această metodă este singura recomandată, de CLSI sau EUCAST, pentru testarea sensibilităţii,
ca de exemplu:
-testarea sensibilităţii la Vancomicină a stafilococilor,
-testarea sensibilităţii la Ceftriaxon a pneumococilor,
-testarea sensibilităţii la Colistin a bacililor Gram-negativi,
-testarea sensibilităţii la antibiotice pentru germenii anaerobi.
Determinarea sensibilităţii la antibiotice prin metode rapide şi metode moleculare
Există în prezent analizoare automatizate şi computerizate (analizor Vitek, Sensititre, Microscan etc.) care utilizează
carduri de reacţii miniaturizate, cititoare automate şi o bază de date care permit efectuarea testelor de sensibilitate cu
stabilirea CMI şi interpretare fenotipurilor de rezistenţă.
De asemenea, dezvoltarea tehnicilor moleculare (Genexpert, PCR, RT-PCR etc.) au dus la introducerea tipizării genetice ca
practică concomitentă sau alternativă la tipizarea fenotipică sau în vederea evidenţierii genelor de rezistenţă la antibiotice:
carbapenemaze (blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaOXA-48, blaIMP-1), gene de rezistenţă la vancomicină (van A, van B), la
meticilină (mec A), sau a genei (Toxin B) pentru C.difficile.
Asocieri de antibiotice. Asocierile în terapie a două sau mai multe antibiotice au următoarele indicaţii:
-infecţii care ameninţă viaţa bolnavului, până la venirea rezultatului antibiogramei,
-infecţii mixte, pentru obţinerea unor efecte sinergice prin care se poate depăşi rezistenţa unei bacterii implicate în
infecţii grave sau pentru reducerea dozei unui antibiotic toxic,
-pentru prevenirea selecţiei de mutante rezistente pe parcursul unor infecţii cronice (tuberculoza).
Efectul antimicrobian al asociaţiilor de antibiotice poate fi:
-sinergic, atunci când efectul este semnificativ mai mare decât suma efectelor antibioticelor asociate (imaginea BLSE pe
test de sinergie),
-antagonist, atunci când efectul asociaţiei este semnificativ inferior faţă de al celui mai eficient antibiotic din asociaţie
(zona D la fenotipul MLSBi). Acest efect al asocierii antibioticelor în terapie poate fi verificat prin metoda difuzimetrică.
11.Rezistenţa bacteriilor la antibiotice. Tipurile. Mecanismele rezistenţei. Combaterea rezistenţei dobândite.
Rezistenţa la antibiotice este capacitatea naturală sau dobândită a unui microorganism de a rezista efectelor unui sau mai
multor antibiotice.
•Rezistența naturală (constitutiva):
-Caracterizează ansamblul de tulpini ale unei specii sau gen
-Purtată de cromozom
-Transmisibilă la descendenți (vertical)
-Determină fenotipurile “sălbatice” de rezistență la antibiotice
Exemple:
-lipsa ţintei – ex.: micoplasme, micete (rezistența la peniciline/cefalosporine);
-imposibilitatea de a atinge ţinta – ex.: Mycobacterium (ceara, lipidele împiedică pătrunderea AB în citoplasmă);
-bacteriile nu efectuează procesul inhibat de AB – ex.: acidul folic este preluat din mediu – rezistenţă la sulfanilamide.
• Rezistența dobândită:
-Se referă doar la o proporție de tulpini ale unei specii sau gen
-Variabilă în timp
-Există prin dobândirea unui mecanism (sau mai multe) de rezistență
-Frecvent mediată de un element genetic mobil (plasmide, transpozoni)
-Transmisibilă orizontal (uneori între specii diferite)
- Determină un anumit fenotip de rezistență, diferit de fenotipul “sălbatic”.
Rezistența dobândită depinde de acţiunea de selecţie exercitată de AB utilizate în tratament, urmată de răspândirea ei
(între bacterii, interuman, transmisie de origine animală).
Mecanismele rezistenţei dobândite:
- Diminuarea permeabilităţii membranare
- Modificarea ţintei moleculare
- Eliminarea rapidă a AB (sisteme de eflux)
- Inactivarea enzimatică a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinază, cefalosporinază) sau modificat structural
(acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc.
Rezistenţa dobândită se poate manifesta fenotipic (bacteriile în faza de repaos, formele “L” de bacterii) sau genetic
(genotipic)
Rezistenţa genetică poate fi achiziţionată în urma:
- Mutaţiilor (rezistenţă cromozomială) - 10%
Mecanisme: modificarea ţintei moleculare, diminuarea permeabilităţii membranare
- Transferului de material genetic, realizat prin transfer de gene (conjugare prin intermediul plasmidelor R (poate fi
rezistenţă multiplă), transducţie – bacteriofagi, transformare)
Mecanisme: inactivarea enzimatică, modificarea ţintei, substituţia sau supraproducţia ţintei, excreţie excesivă a AB.
Prevenirea rezistenţei:
1. Politică strictă de prescriere a AB
2. Respectarea dozelor terapeutice corecte şi a timpului de tratament necesar
3. Asocierea AB cu mecanisme de acţiune diferite
4. Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utilizând inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul,
tazobactamul). Ex.: augmentina = amoxicilina+acid clavulanic
5. Reciclarea AB 6. Producerea AB noi
7. Supravegherea epidemiologică a tulpinilor rezistente
12.Reacţiile adverse ale organismului la administrarea de antibiotice.
Efectele negative ale antibioticoterapiei
1. Efect toxic (streptomicina – surditate, cloramfenicolul – toxică pentru măduva osoasă, polipeptidele – nefrotoxice, etc)
2. Efect teratogen
3. Acţiune sensibilizantă (penicilina, etc)
4. Disbacterioză
5. Dereglarea imunogenezei
6. Selecţia tulpinilor rezistente
13.Bacteriocinele. Caracterele, spectrul, mecanismele de acţiune. Tipurile.
Bacteriocinele – substanţe proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene şi active asupra altor tulpini ale
aceeaşi specii sau asupra speciilor înrudite. Producerea bacteriocinelor este determinată plasmidic (plasmide Col).
Tipuri de bactericine:
-colicine (secretate de Escherichia coli),
-corinecine (Corynebacterium), vibriocine (Vibrio),
-piocine (Pseudomonas), etc.
Studiul sensibilităţii unei tulpini la bacteriocine (bacteriocinotipia) se utilizează în scopuri epidemiologice.
 LUCRAREA DE LABORATOR N 11
TEMA: PROCESUL INFECŢIOS. METODA BIOLOGICĂ DE DIAGNOSTIC
ÎNTREBĂRI PENTRU CONTROL

1. Noţiune de infecţie, proces infecţios şi boală infecţioasă. Particularităţile bolii infecţioase. Factorii implicaţi în
procesul infecţios.
INFECŢIE (lat. Inficere = a otrăvi, a deteriora)
- capacitatea agentului patogen de a se localiza şi multiplica în organismul-gazdă prin colonizare tranzitorie sau pe termen
lung şi de a se transmite cu succes la o gazdă nouă sensibilă
- totalitatea proceselor biologice care se produc în ma/o în urma penetrării mi/o patogene sau potenţial patogene
PROCES INFECŢIOS – interacţiunea dintre mi/o şi ma/o în diverse condiţii ale mediului ambiant. Manifestarea lui poate
fi inaparentă / asimptomatică (stare de portaj sănătos, eliminarea rapidă a mi/o) sau simptomatică
MALADIE/BOALĂ INFECŢIOASĂ – manifestarea supremă a procesului infecţios. Se caracterizează prin diferite
simptome, determinate de efectele metaboliţilor microbieni (toxine, enzime, etc) sau de reacţia imună a gazdei la prezenţa
bacteriei.
Particularităţile bolii infecţioase
-Este provocată de agenţi patogeni
-Contagiozitate (capacitatea de a se transmite de la o sursă la o persoană receptivă)
-Specificitate (un agent provoacă o infecţie, ex.: Clostridium tetani este agentul tetanosului, etc.)
-Evoluţie clinică stadială
-Imunitate la reinfecţie (durată variabilă)
!!!Apariţia maladiei depinde de multipli factori, în special de capacitatea agentului cauzal de a provoca maladia şi de
gradul de rezistenţă a gazdei la această invazie, dar şi de influenţa factorilor externi.
Factori:-agent cauzal;
-factori de mediu;
-gazda.
2. Rolul microorganismului în procesul infecţios. Patogenitatea şi virulenţa. Unităţile de virulenţă. Aprecierea.
Relaţiile dintre mi/o şi ma/o gazdă:
Mutualism
Comensalism
Parazitism (prezenţa mi/o este dăunătoare pentru ma/o)
Orice mi/o “parazit” capabil să provoace o infecţie (în condiţii adecvate) este considerat p a t o g e n.
Există 2 tipuri de mi/o patogene:
1.Obligat (cert) patogene, care infectează persoane imunocompetente cu doze mici
2.Potenţial patogene (oportuniste), care pot cauza infecţie numai cu doze mari sau la persoane imunocompromise (deseori
fac parte din flora normală a organismului)
Mi/o patogene pot fi găzduite uneori fără a provoca maladia, astfel de persoane sunt numite purtători sănătoşi de germeni.
Microorganismele patogene se caracterizează prin:
Patogenitate – capacitatea potenţială a bacteriilor de a declanşa infecţia. Este un caracter de specie determinat genetic
(cromosom, plasmide, bacteriofagi).
În cadrul unei specii patogene pot exista tulpini cu manifestare variată a patogenităţii – de la absenţa totală până la foarte
înaltă.
Patogenitatea implică existenţa unor proprietăţi esenţiale:
-Capacitatea de a pătrunde şi a se localiza în organismul-gazdă
-Multiplicarea în ţesuturile acestuia şi/sau invazia lor
-Capacitatea de a rezista mecanismelor de apărare ale gazdei sau de a impiedica declanşarea lor (persistenţa)
-Producerea de leziuni
-Aceste capacităţi sunt asigurate de factorii de patogenitate.
Virulenţă – gradul de patogenitate al unei tulpini (măsură cantitativă a patogenităţii). Se apreciază experimental prin
infectarea animalelor de laborator cu cantităţi diferite de mi/o.
Unităţile de virulenţă:
DLM (dosis letalis minima)– numărul de bacterii necesar pentru a ucide 80% din animalele infectate
DL50 – 50% letalitate
DCL (dosis certae letalis)– 100% letalitate
DI50/DI (dosis infectiosis)– provoacă boala la
50%/80% animale
Modificarea virulenţei:
Amplificarea prin transfer de gene şi recombinare genetică, condiţii optime pentru creştere
Reducerea (atenuarea) prin menţinerea bacteriilor în condiţii nefavorabile (t, factori chimici, etc), mutaţii
3. Factorii de patogenitate ai bacteriilor: structurali, enzimele de patogenitate, toxinele
şi caracteristica lor.
FACTORII DE PATOGENITATE AI BACTERIILOR
I.Factori structurali (somatici):
1.Adezine - fimbriile, glicocalixul, proteine de adeziune ale peretelui celular. Asigură aderarea bacteriilor la receptorii de
pe suprafaţa celulelor-ţintă sau la proteine matriciale extracelulare (colagen, fibronectină, laminină, elastină, etc)
2.Sisteme de secreţie (tipuri I-VI)
3.Capsula – antifagocitar, anti-complement
4.Glicocalixul – adeziune, formarea biofilmelor
5.Antigenul O - antifagocitar
6.Peptidoglicanul (agresie tisulară - efect artritogen, pirogenitate, stimularea producerii de citokine - şoc)
7.Acizii teichoici/lipoteichoici (adeziune, toxicitate)
8.Proteina A la stafilococi (acţiune antifagocitară prin fixarea Fc a IgG)
9.Proteina M la streptococi (adeziune, a/fagocitar)
II. Enzime de patogenitate (responsabile de persistenţa mi/o, diseminare şi producerea leziunilor)
-Plasmocoagulaza (formarea trombilor septici - efect antifagocitar, propagare în organism)
-Fibrinolizina (eliberarea bacteriilor din trombi)
-Hialuronidaza (diseminare, leziuni tisulare)
-Colagenaza (diseminare, leziuni tisulare)
-Neuraminidaza (lichefierea mucusului)
-Proteaze (ex.: distrugerea Ig A secretorii)
-ADNaza
-Dezaminaze
-Decarboxilaze
-Fosfataza, etc.
III. Toxine bacteriene (responsabile de leziuni)
- Exotoxine (proteice, secretate în mediul extracelular)
- Endotoxina (LPZ, legată de celula bacteriană gramnegativă, efectul se manifestă în urma lizei celulei)
1.EXOTOXINE
Caracteristica exotoxinelor:
-Proteine produse de bacterii G+/G-
-Pot fi secretate în mediul extracelular sau injectate direct în celula-ţintă prin sisteme de secreţie
-Termolabile (excepţie – enterotoxina stafilococică şi toxina termostabilă (TS) a E. coli)
-Hidrosolubile şi acţionează la distanţă
-Efectul se instalează după o perioadă de latenţă
-Manifestă tropism (specificitate de acţiune, selectivitate)
-Toxicitate înaltă (DLM de ordinul ng/kg)
1 mg de toxină botulinică de tip A conţine 1 200 000 DLM pentru 1 kg/corp cobai (poate să omoare
1 200 tone de cobai sau 2 mln de şoareci)
100-200 g de toxină botulinică sau tetanică ar putea omorî întreaga populaţie a globului
DL50 pentru om a toxinei botulinice = 1.3-2.1 ng/kg i/v sau i/m, 10-13 ng/kg inhalată
2.5 ng/kg de toxină tetanică este fatală pentru om
-Exotoxinele sunt imunogene (induc sinteza anticorpilor - antitoxine)
-Antitoxinele neutralizează activitatea exotoxinei (faza de fixare pe receptorii celulari)
-Exotoxinele tratate cu formol 0,4% şi menţinute la 39-40°C timp de 3-4 săptămâni se transformă în anatoxine. Ele sunt
lipsite de toxicitate, dar păstrează imunogenitatea (utilizate în calitate de vaccin).
!!!Suportul genetic al exotoxinelor: cromozom (toxina dizenterică, botulinică), plasmide (toxina antraxului, toxinele
produse de E.coli), profagi (toxina difterică, holerică).
Tipurile de exotoxine:
1.Toxine citolitice
Dereglează membranele celulare prin acţiune enzimatică (fosfolipaza /lecitinaza, sfingomielinaza) sau prin formarea
porilor (streptolizina O, α-toxina/hemolizina S.aureus, leucocidina).
Responsabile de liză hematiilor, leucocitelor, trombocitelor, leziuni tisulare si necroză
2.Toxine citotoxice, de tip A-B (acţionează în interiorul celulei).
Ex.: toxina difterică, botulinică, tetanică, holerică, etc
Au structură bipartită: fracţia polipeptidică B (cell binding) este responsabilă de legarea de receptorii specifici din
membrana celulei-ţintă, fracţia polipeptidică A (active) pătrunde în celulă (prin endocitoză sau translocare) şi determină
activitatea toxică.
Fiecare citotoxină acţionează strict specific:
– toxina difterică – inhibă sinteza proteinelor,
-toxinele botulinică şi tetanică sunt neurotoxine, inhibă eliberarea mediatorilor sinaptici (neurotransmiţătorilor)
-toxinele holerică şi pertusică – activează adenilat-ciclaza membranară, etc
2.ENDOTOXINE
Caracteristici:
-Reprezintă complexe LPZ din peretele celular G- (cel mai toxic component este lipidul A).
-Este eliberată în urma lizei bacteriilor (sub influenţa sistemului imun al gazdei sau a unor AB).
-Termostabilă
-Ne-imunogenă (slab imunogenă)
-Nu poate fi transformată în anatoxină
-DLM de ordinul μg/kg
-Efectul se manifestă imediat
-Determină efecte generale, indiferent de provenienţă
Mecanismul de acţiune al endotoxinei:
-LPZ induce secreţia unor substanţe biologic active (citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α) de către
macrofage şi alte celule (monocite, celule dendritice, limfocite B).
-Iniţial LPZ se leagă de o proteină serică (LPS-binding protein), ulterior acest complex interacţionează cu un receptor de
pe membrana macrofagului, CD14. Există şi molecule solubile de CD14, astfel endotoxina poate să acţioneze asupra altor
celule, de ex.: celulele epiteliale.
-Un alt receptor macrofagic poate interacţiona cu LPZ – receptorul toll-like 4 (TLR4) (descoperit de Bruce Beutler,
imunolog american, 2011 premiul Nobel în medicină).
În doze mari citokinele pot provoca şocul endotoxinic (septic), comun pentru toate bacteriile G-:
-Febră (eliberarea pirogenilor IL-1, TNF de către celulele care au captat endotoxina)
-Leucopenie, urmată de leucocitoză
-Activarea complementului (inflamație)
-Creşterea permeabilităţii vasculare
-Tulburări de coagulare (activarea factorului XII – formarea fibrinei şi obstrucţia capilarelor sanguine – coagulare
intravenoasă diseminată)
-Hemoragii (consumarea factorilor de coagulare) în diverse organe (rinichi, suprarenale, plămâni, creier)
-Vasodilatare, urmată de colaps vascular (sechestrarea periferică a sângelui, hipovolemie, acidoză metabolică, scăderea
bruscă a presiunii sanguine).
notă:În consecinţă au loc leziuni hemoragice şi necroză în diverse organe (rinichi, suprarenale, plămâni, creier...).
Pronosticul este foarte sever.
IV.Moduline şi invazine
-Injectate la suprafaţa sau direct în interiorul celulei-ţintă
-Induc penetrarea (internalizarea) şi propagarea intracelulară a bacteriilor ( Yersinia, Shigella, Salmonella, Escherichia)

V. Factori ce asigură persistenţa mi/o:

-Variaţii antigenice (sinteza succesivă a unui număr mare de diferite variante ale moleculelor sau structurilor de suprafaţă,
pentru a se proteja de răspunsul imun al gazdei)
-Mimicria antigenică
4. Rolul factorilor de patogenitate în evoluţia procesului infecţios.
-Strategia unui parazit nu este neapărat de a nimici gazda, ci de a o exploata.
-Relațiile gazdă-patogen sunt dinamice și prevăd posibilități permanente de adaptare la noile condiții/situații
-O lume fără patogeni este practic imposibilă! Este mai rezonabil să ne adaptăm, reducând impactul, decât să le eradicăm.
Factorii de patogenitatea asigură dezvoltarea procesului infecțios.
5. Dinamica evoluției bolii infecţioase. Pătrunderea și răspândirea microbilor în organism.
Dinamica evoluţiei bolii infecţioase
I. Perioada de incubaţie (de la penetrarea mi/o până la apariţia primelor simptome). Durata variabilă (ore – ani). Microbul
se adaptează, se multiplică, produce toxine, enzime, etc.
II. Perioada de invazie (prodromală, de debut). Apar primele semne clinice, nespecifice (febră, frison, inapetenţă, astenie,
etc). Durata – 2-3 zile.
III. Perioada de stare (a manifestărilor clinice specifice). Durata variabilă.
IV. Perioada terminală (convalescenţă şi vindecare, sau cronicizare, sau stare de portaj, sau deces)

Există diferite clase de agenți infecțioși și diferite strategii de infecție.

Pătrunderea şi răspândirea mi/o în ma/o
Sursa de infecţie: omul bolnav, reconvalescent, purtător sănătos (infecţii antroponoze) sau animalele (infecţii
zooantroponoze).
Mecanismele de transmitere
1. Prin contact (direct, indirect)
2. Fecal-oral (alimentar, hidric, etc)
3. Aerogen (aer-praf, aer-picături)
4. Transmisiv (prin intermediul vectorilor)
5. Vertical (transplacentar)
-Microbii penetrează prin tegument, mucoase sau direct în sânge (porţi de intrare). Un microb poate avea una sau mai
multe porţi de intrare.
-Doza infecţioasă – ex.: dizenterie – 102 mi/o, febră tifoidă – 105 , holeră – 109 .
-La poarta de intrare bacteria aderă la celule (adeziunea) şi se multiplică local (colonizarea), formând focarul primar de
infecţie.
-Infecţia poate rămâne localizată sau poate să se răspândească (invazia) pe cale limfatică, sanguină, pe calea nervilor sau
prin continuitate (din aproape în aproape).
-În ţesutul afectat mi/o se multiplică şi provoacă leziuni direct prin intermediul enzimelor sau toxinelor sau indirect, via
mecanisme imune.
-Mi/o se elimină cu diferite secreții sau excreții ale ma/o, prin care are loc contaminarea altor gazde sau obiecte.
6. Criteriile de apreciere a rolului etiologic al agentului cauzal.
1.Bacteria (mi/o) trebuie să fie prezentă la toate persoanele bolnave;
2.Bacteria (mi/o) trebuie să fie izolată de la bolnav şi menţinută în cultură pură;
3.Cultura pură inoculată la un voluntar sau la un animal experimental trebuie să reproducă simptomele bolii
4.Aceeaşi bacterie (mi/o) trebuie să fie reizolată de la voluntarul sau animalul infectat;
Actualmente se insistă pe genomul bacterian (prezenţa genelor de patogenitate.
Rolul mediului ambiant şi social în infecţie (condiţiile economice, condiţiile de viaţă, catastrofe ecologice sau naturale,
progresul în igiena publică, etc).
Maladii sociale: tuberculoza, pediculoza (tifosul exantematic), sifilisul, legioneloza, etc.
Rolul macroorganismului în procesul infecţios. Mecanismele de apărare contra infecțiilor
-Strategia de evitare (ansamblu de comportamente și atitudini care limitează riscul infecției - măsuri igienice, alimente
sigure, apă potabilă, evitarea contactului cu un bolnav...)
-Strategia de rezistență/adaptare/flexibilitate (mecanisme ce întăresc capacitatea gazdei de a supraviețui infecției fără a
afecta patogenul)
-Răspunsul imun al gazdei (mecanisme de recunoaștere, limitare și eliminare a agentului patogen)

7. Formele de manifestare a infecţiei (infecție acută, cronică, secundară, endogenă, reinfecție, suprainfecție,
recidivă). Persistenţa microorganismelor. Stare de purtător de germeni patogeni.

Infecția acută – debut inopinat și evoluție erelativ scurtă ( gripa , rujeola , scarlatina, tifos exantematic , etc.). Infecțiile
virale sunt însoțite de acumularea vurusurilor și moartea celulelor invadate .

Infecția cronică – evolu ia îndelungată cu persisten a agentului în cellule , esuturi , organe (febra palustră, turbeculoza,
sifilusu , bruceloza, etc.)

Infecția secundară – organismul care a suportat o infeție devine mai sensibil față de îmbolnăvire cu alte afecțiuni (după o
gripă se instalează o inflamație pulmonară , după o variolă – o infecțe stafilococică ) .

Infecție endogenă – (autoinfecțiile) apar în urma ativizării microorganismilor proprii : microflora pielii , mucoaselor
tubului digestive , căilor respiratorii , căilor urinare , conjunctivelor ochilor ; de pe urma tulburărilor echilibrului mediului
intern al macroorganismului. De exemplu : hipotermia microflorei căilor respiratorii superioare provoacă diferite procese
inflamatorii ; în caz de răcire menstruație , regim alimentar inadecvat se activează virusului herpesului . Din autoinfecții
fac parte rinofaringita , angina , apendicita , conjunctivita , otita , colicistita , ect.

Reinfecție – o infecție repetată cu aceeaș specie de microorganisme ce a provocat afecțiunea ce s-a terminat prin
reconvalescență ( sifilis , etc. )

Suprainfecție – o reinfectare a organismului , la care boala de fond nu a ajuns la reconvalescență .

Recidiva – o revenire a simptomelor aceleiași afecțiuni . Se atestă în caz de nivelul scăzut al activității imunologice a
organismului în perioada de boală și reconvalescență (tifos abdominal , febră tifoindă recurentă , etc.)

Persistența microorganismelor
Persistența se caracterizează prin existența îndelungată a agentului patogen în organismul omului ( virusul hepatitei B ,
herpesului , rubeolei , etc.). De pe urma persistenței îndelungate a virusurilor se elaborează anticorpi contra anumitor
agenți cu
care omul se reinfectează sau se infectează multiplu fără a face boală . Persistența duce la : variabilitatea tulpinilor de
angenți ,
forme grave de îmblonăvire a SNC . Persistența ține de insuficiența imunității .

Factori ce asigură persistenţa mi/o:

- Variaţii antigenice (sinteza succesivă a unui număr mare de diferite variante ale moleculelor sau structurilor de suprafaţă,
pentru a se proteja de răspunsul imun al gazdei)
- Mimicria antigenică

Stare de purtător de germeni patogeni

Starea de purtător de se consideră ca o formă a toleranței imunologice a organismului , este o formă de corelație dintre
agentul patogen și marcroorganismul fără manifestare a bolii . Se instalează la organismele cu nivel scăzut al imunității
postinfecțioase .
Purtătorii de angenți sunt tratați prin administrarea preparatelor ce stimulează elaborarea imunității . Starea de puurtător cu
o durată de pînă la 3 luni se coonsideră acută iar de durată mai lungă – cronică .( tifos abdominal , febre paratifoide ,
dezinterie , holera , meningita, scarlatina , etc. )

8. Rolul mediului ambiant şi social în infecţie.

Rolul mediului ambiant şi social în infecţie (condiţiile economice, condiţiile de viaţă, catastrofe ecologice sau naturale,
progresul în igiena publică, etc).
Maladii sociale: tuberculoza, pediculoza (tifosul exantematic), sifilisul, legioneloza, etc.
Rolul macroorganismului în procesul infecţios. Rezistenţa nespecifică a ma/o. Pentru menţinerea coerenţei
celulelor şi ţesuturilor şi păstrarea integrităţii sale ma/o pune în joc 2 categorii de procese apărute succesiv în cursul
evoluţiei:
- Imunitatea (rezistenţa) naturală, înnăscută, nespecifică – dezvoltată filogenetic, asigurată de factori constituţionali.
Răspuns maxim imediat, nespecific, antigen-independent. Asigură protecţie contra microorganismelor în general.
- Imunitatea achiziţionată, dobandita, specifică – s-a dezvoltat ontogenetic, antigen-dependentă şi antigen-specifică
(contra unui mi/o particular), răspuns maxim peste câteva zile de la agresie, se caracterizează prin memorie imunologică.
Declanșarea procesului infecțios depinde de : reactivitatea organismului uman , de cantitatea și calitatea agenților
patogeni , de prezența materiilor necesare agentului pathogen , de starea imunității, de influența ambianții și factorilor
sociali . În funcție de coraporturi acestor factori procesul infecțios se poate solda cu moartea agentului patogen , cu
moartea gazdei sau instituirea unor relații de adaptare mutuală între gazdă și parazit . Reactivitatea organismului uman ,
capacitatea lui imunobiologică de a inactiva mi-o patogen se află în func ie directă de ambian ă de ț ț condițiile ecologice și
sociale de caracterul muncii și alimentării , de starea sanitaro igienică , etc.
Menstruația , sarcina și nașterea duc la mărirea sensibilității organismului femeii la bolile infecțioase
Subalimentația duce la acutizarea tuberculozei , dezinteriei etc. Deficitul de proteine , glucide, lipide duce la diminuarea
sintezezi aticorpilor . Hipovitaminoza duce la inhibiția fagcitozei , apariția cataractei , dezvoltarea leziunilor cutanate ,
afecțiunilor streptococice , etc. Surmenajul fizic și intelectual duce la slăbirea mecanismelor de apărare contra multor boli
infecțioase . Hipertermia duce la slăbirea org și scăderea imunității . Răcirea contribuie la apariția pneumoniilor și altor
boli . Factorii nocivi fizici , chimici, biologici de poluare a mediului ambiant subminează sistemele de protecție a
organismului . Radiațiile ionizante reduc capacitatea de protecție a mucoaselor a sîngelui a sistemului limfoido
macrofagic . Condițiile sanitaro-igienice proaste de muncă și trai duc la afecțiunea căilor respiratorii , afecțiuni alergice ,
afecțiuni ale pielii , etc.

9. Infecţia experimentală, etapele şi importanţa practică. Tehnica necropsiei.

Se foolosesc : șoarecele , cobaiul , iepurele. Metoda biologică de examinare constă în infectarea animalelor pentru
obținerea (izolarea) culturilor de microorganisme , agenți cauzali ai bolilor cu studierea ulterioară a patogenității și
virulenții lor . Pregătirea animalelor către infectare include următoarele etape :
1. Alegerea animalelor – animale se aleg , animale sănătoase cu blana netedă și lucioase , active , cu alimentație bună ,
de aceeași vîrstă , sex și greutate .
2. Marcarea animalelor mici ( șoarecelor , șobolanilor ) – colorarea diverelor sectoare ale blănii sau prin aplicarea
semnelor de marcare la urechi . Pregătirea locului de inoculare – se tunde părul apoi pielea se spală apoi se
dezinfectează cu alcool și tinctură de iod
3. Fixarea animalelor – cu dispozitive speciale , masăde fixare , cutii.
4.Instrumentele necesare pentru inocularea animalelor ( seringi demontate , ace , pensete ș.a.) se fierb 30 min .
Materialul patologic sau suspensia de microorganisme sînt prelevate în seringă.
Metodele de inoculare (depinde de tropismul agentului față de anumite țesuturi ale organismului )
Incocularea per os se efectuează prin adăugarea materialului de infecție în alimente sau apă potabilă
Infectarea subcutanată – la iepuri și cobai pe spate și abdomen 3.0 – 5.0 ml la șoareci pe spate sau rădăcina cozei 0.5 ml
. Se folosește pentru testarea toxinelor .
Injectarea intracutanată – tegumentul depilat spălat cu apă și uns cu glicerină se injectează cu 0.1-0.2 ml de produs. Se
folosește pentru testarea toxinelor dermonecrotice sau edematogene și testarea sensibilizărilor .
Inocularea percutană – cu vîrful unui bisturiu se fac zgîrîeturi în piele pînă la apariția limfei fără a provoca sîngerări ,
materialul de examinat se fricționează cu o baghetă de sticlă în pielea intactă sau scarificată.
Injectarea intraperitoneală – 1 ml la șoareci și cîțiva ml la cubai , în regiunea inferioară din stînga a abdomenului.
Injectarea intravenoasă . La iepurași se puncționează vena marginalăa urechii , 2-5 ml . La șoareci se puncționează una
din cele patru vene ale cozii - 0,5 ml
Injectarea intramusculară . La cobai în masa musculară a coapsei , la iepurași în muschii cefei
Inoculări oculare – în sacul conjunctial sau intracornean
Injectarea intracerebrală – craniul se puncționează la jumătatea distanței dintre unghiul extern al ochiului și inserția
pavilionului urechii , acul pătrunde 3-6 mm , 0,03 ml
5. Supravegherea animalelor inoculate : se înregistrează starea generală , respirația, temperatura , greutatea , tulburări
nervoase , leziuni la locul de inoculare . Examenul unor prelevate intravitan , de ex. Sînge , examen anatomopatologice i
microbiologice , necroptice .

Tehnica necropsiei - sacrificarea prin ruperea măduvei spinale în regiunea cervicală , prin comprimarea puternică și
bruscă a gătului la șoareci și cobai , prin embolizarea venoasă la iepurași , prin metode chimice : cloroform , amital sodic.
Animalele sunt necropsiate după maxim o oră după sacrificare :
1. Fixarea animalului pe o planșetă de lemn
2. Dezinfectarea animalului
3. Se face o incizie tegumentară submentopubioană și care se prelungește spre rădăcina fiecărui membru , se decolează
pielea .
4. Se inspectează țesutul celular subcutanat , masele musculare , ganglionii limfatici .
5. se deschide cavitatea peritoneală și cavitatea toracică
6.Se puncționează cordul pentru hemocultură
7.se prelevă pentru examinare splina , ficatul , rinichii , plămînii
8. Se examinează macroscopic , se însemînțează pe medii adecvate și se efectuează amprente pentru microscopie
9. se incinerează animalul
10. Se dezinfectează instrumentarul

10.Noţiune de imunitate antiinfecţioasă. Tipurile.

11.Imunitatea naturală (înnăscută). Mecanismele imunităţii naturale. Factorii de barieră. Rolul microflorei
normale (indigene).

Mecanisme
1.Recunoașterea modelelor moleculare asociate cu agentul patogen/străin PAMPs (Pathogen-Associated Molecular
Patterns) de către receptorii de recunoaștere a modelelor (PRR) de pe celulele gazdei
2.Recunoașterea semnalelor de pericol produse de țesuturile lezate (proteine de stres, prezența actinei
extracelulare...)
3.Recunoașterea agentului străin prin lipsa unui marker self (ex.: molecule CMH)

12.Factorii celulari ai imunităţii naturale. Celulele fagocitare. Fagocitoza. Determinarea numărului fagocitar. Rolul
fagocitozei în imunitatea dobândită.
Factorii celulari ai imunităţii înnăscute:
-Fagocitele (leucocite, monocite, macrofage)
-Celulele dendritice
-Celulele NK (killeri naturali)
-Celulele NKT (killeri naturali tisulari)
 Factorii imunității înnăscute
Imunitatea înnăscută este asigurată de factori tisulari (de barieră), factori umorali și celulari.
Factori tisulari (de barieră)
-Tegumentul (barieră mecanică - integritatea, descuamarea stratului cornos; barieră biologică - flora normală,
chimică – secrețiile glandelor sebacee şi sudoripare, pH acid al tegumentului)
-Mucoasele (barieră mecanică - integritatea, mişcarea cililor, mucusul, scurgerea secrețiilor; chimică -secreţiile
digestive, acidul gastric, pH acid al urinei; biologică - flora normală; barieră enzimatică – enzimele din secreţiile
mucoaselor, ex.: lizozimul; defensinele din tractul gastrointestinal şi respirator; lactoferina

FAZELE FAGOCITOZEI
I. Chemotaxisul (atractanţi – fracțiile C3a și C5a, provenite din activarea complementului, peptide
bacteriene cu un rest de formil-metionil, chemokine, etc)
II. Recunoașterea și adeziunea mi/o la fagocit
Se poate realiza prin 2 moduri - direct și indirect.
Recunoașterea directă - prin interacțiunea dintre PAMPs de pe microb și PRR de pe fagocite (TLR,
receptorii pentru glucide bacteriene (lectine), receptorul de manoză, etc).

13.Factorii umorali ai imunităţii naturale (lizozimul, lizinele, interferonii, etc.).

Complementul. Natura, proprietăţile, căile de activare.
Lizozimul (muramidaza) este o enzimă bacteriolitică cu greutate moleculară de 14,4 kiloDaltoni (kDa). Are capacitatea
de a distruge peretele celular al bacteriilor Gram-pozitive (în special), prin hidrolizarea legăturii glicozidice beta-1,4 dintre
acidul N-acetilmuramic (NAM) şi N-acetilglucozamina (NAG) (carbohidraţi prezenţi în peretele bacterian). Se găseşte în
cantitate mare în secreţii, cum ar fi: lacrimi, salivă şi mucus, în citoplasmă neutrofilelor polimorfonucleare (PMN), dar cea
mai mare cantitate de lizozim se întâlneşte în albuşul de ou.
Lizozimul seric provine din distrucția celulelor liniei granulocitare şi monocitare, care conţin aceasta enzimă în lizozomi.
Concentraţia serică creşte proporţional cu gradul de reînnoire celulară, fapt care explică creşterea constantă a nivelului în
sindroamele mieloproliferative (leucemie mieloida cronică(LMC) şi în anumite sindroame mielodisplazice care au o
componentă monocitară, de exemplu leucemia mielomonocitară cronică (LMMC).

Lizine, care dizolvă corpii bacterieni

 LUCRAREA DE LABORATOR N 12
TEMA: IMUNITATEA.TIPURILE. SISTEMUL IMUN. CELULELE
IMUNOCOMPETENTE. COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE.
ANTIGENELE. ANTICORPII. RĂSPUNSUL IMUN
ÎNTREBĂRI PENTRU CONTROL
1. Imunitatea dobândită (achiziţionată, adaptativă). Tipurile imunităţii dobândite (umorală şi celulară, naturală,
artificială, etc).
Imunitatea Dobândită (achizitionata)
Activă
- Naturală (postinfecţioasă)
- Artificială (în urma vaccinării)
Pasivă
- Naturală (transplacentară, prin laptele matern)
- Artificială (administrarea Ac / seruri imune sau a limfocitelor)
Imunitatea dobândită se caracterizează prin:
-Dezvoltare lenta si manifestare tardiva (câteva zile, săptămâni dupa contactul cu un antigen)
-Specificitate faţă de antigen (capacitatea de a recunoaste si răspunde specific la numeroase substanțe străine, inclusiv
agenti infectiosi)
-Diversitatea răspunsurilor imune elaborate
-Expansiunea clonală a limfocitelor activate de antigene
-Memorie imunologică (capacitatea de a elabora răspuns mai rapid, mai intens si eficace la intalniri repetate cu un antigen)
-Lipsa reactivităţii (toleranţă) faţă de antigenele proprii

Imunitatea dobândită poate fi:

I. Antibacteriană, antivirală, antimicotică, antitoxică, antitumorală, etc.

II. În funcţie de mecanismele reacţiilor imune

-Imunitate umorală, exercitată prin intermediul unor proteine numite anticorpi (Ac, Ig), produse de limfocitele B. Fiind
secretate in sange si lichide biologice neutralizeaza si elimina microbii extracelulari si toxinele lor.
-Imunitate celulară, eficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale. Este exercitată prin intermediul
limfocitelor T (citotoxicitate directa, activarea macrofagelor)
- Imunitate sterilă – se menține după eliminarea agenţilor patogeni din organism (ex.: rujeolă)
- Imunitate nesterilă – nereceptivitatea se păstrează doar în perioada aflării mi/o în organism (tuberculoză, sifilis).
2. Sistemul imun (SI). Organele centrale şi periferice ale SI. Celulele SI.
Sistemul Imun reprezinta un ansamblu de celule, molecule şi tesuturi (organe) distribuite în tot organismul, care participă
la instaurarea imunitatii.
Funcțiile Sistemului Imun:
1.Prevenirea infecțiilor şi eradicarea infecţiilor declanşate
2.Recunoașterea țesuturilor și proteinelor străine și răspunsul la ele
3.Protecție contra tumorilor
Organele centrale (primare) ale SI – măduva osoasă şi timusul la vertebrate (ficatul în perioada embrionară).
Apar primele în timpul vieţii embrionare.
Rolul – sursa celulelor-stem, “instruirea”, maturizarea şi selectia celulelor imunocompetente (limfocitele T şi B).
În măduva osoasă se află celulele-stem, precursori ai T şi B-limfocitelor. Pre-T limfocitele migrează ulterior în timus,
unde va avea loc instruirea şi maturizarea lor, devenind celule imunocompetente, capabile să recunoască specific un singur
Ag (prin achiziţionarea unor receptori specifici).
Instruirea si maturizarea B-limfocitelor are loc în măduva osoasă.
Aceste procese sunt independente de orice stimulare antigenică a organismului.
După părăsirea organelor centrale limfocitele nu mai revin aici, ele se stabilesc în organele limfoide secundare, recirculând
prin sânge, limfă.
Organele periferice (secundare) ale SI
În ele se realizează contactul dintre antigen, celulele prezentatoare de antigen ( CPA) şi celulele imuno-competente, cu
inducerea unui raspuns imun.
-Ganglionii limfatici (raspuns imun contra Ag ce penetrează prin tegument / mucoase și sunt transportate cu limfa)
-Splina (raspuns imun contra Ag transportate cu sângele)
-Formaţiunile limfoide ale mucoaselor digestive şi respiratorii (amigdale, plăci Peyer, apendice)
CELULELE SISTEMULUI IMUN:
-Limfocitele (celule imunocompetente, recunoașterea Ag)
-Celulele prezentatoare de Ag (CPA) (captarea, procesarea și prezentarea Ag microbiene)
-Celulele efectoare (eliminarea microbilor)
3. Limfocitele B şi T. Originea, maturizarea, rolul biologic. Complexul major de histocompatibilitate (MHC).
LIMFOCITELE
Toate limfocitele provin din celule-stem ale maduvei osoase roșii, cu o etapa ulterioara de maturizare și selecție.
Limfocitele T si B sunt unicele celule ce poarta receptori specifici de Ag (celule imuno-competente), fiind mediatorii
principali ai imunitatii dobandite.
1)Maturizarea limfocitelor B constă în exprimarea unor receptori și are loc în măduva osoasă prin intermediul
interacţiunii directe cu celulele stromei, iar în stadiile tardive sub acţiunea citokinelor secretate de celulele stromale (în
special IL-7).

Receptori LB:
-Receptorul pentru antigen (BCR)
-CD79, CD19 – asociați BCR (coreceptori)
-Receptorul pentru fragmentul Fc al IgG
-Receptor pentru fracţiunea C3d a complementului (CR2 sau CD21)
-Receptori pentru interleukine (IL)
-Proteine ale Complexului Major de Histocompatibilitate (CMH/MHC)
-TLR.
!!!LB sunt supuse unei selecții negative contra recunoașterii puternice a antigenelor proprii.
În organele limfoide secundare limfocitele B se localizează în foliculii cortexului extern din ganglionii limfatici, foliculii
din plãcile Peyer şi foliculii zonei periferice din pulpa albã a splinei (arii timo-independente).
Receptorul pentru Ag (BCR). Este reprezentat de molecule de imunoglobuline – monomeri de Ig M şi Ig D (forma
membranară de anticorpi), asociate cu doua proteine Igα si Igβ (CD79). BCR interacţionează cu molecule
antigenice/epitopi din soluţii sau fixate pe membrane celulare (macromolecule native – proteine, lipide, glucide, acizi
nucleici, grupări chimice mici).
Organismul contine 107-109 clone diferite de BL (limfocite naive), fiecare cu BCR unic, format prin recombinare
somatică. BCR recunoaşte antigenele (solubile sau corpusculare) după configuraţia lor. BL stimulate de Ag se
multiplică şi se diferenţiază în celule efectoare - plasmocite secretoare de Ig (Ac) şi în celule B-memorie.

2)Precursorii limfocitelor T migrează în timus, unde sub influenţa celulelor stromale (IL-7) şi a corpusculilor Hassal se
diferenţiază în limfocite T mature. Migraţia TL din cortex spre medulara timică este însoţită de achiziţia unor proteine de
suprafaţă specifice (receptori: TCR, CD2, CD3, CD4, CD8, etc).
La o etapa precoce de selectie doar limfocitele cu TCR funcțional vor supraviețui.
Dezvoltarea ulterioară a TL este caracterizată printr-o selecţie pozitivă (supravieţuiesc TL care prin TCR recunosc
moleculele Complexului Major de Histocompatibilitate (CMH) propriu). Aceste molecule sunt prezente pe suprafața
celulelor epiteliale, dendritice și a macrofagelor din timus și sunt molecule specializate în prezentarea peptidelor.
Limfocitele T care au trecut selecţia pozitivă, dar care sunt capabile să recunoască cu afinitate înaltă peptide proprii
asociate cu CMH suportă o selecţie negativă (moarte programată prin apoptoză).
Limfocitele T care sunt capabile sa recunoasca peptide în asociatie cu moleculele CMH I pierd receptorul CD4 (devenind
celule TCD8+), iar cele ce recunosc complexe peptid-CMH II pierd receptorul CD8 (devenind celule TCD4+)
Selecţia constã în eliminarea clonelor de limfocite potenţial autoreactive (potenţial reactive faţã de moleculele
proprii).
“Timusul selecţionează utilul, ignoră inutilul şi distruge nocivul.” ( Von Boehmer ).
Receptorii TL:
-TCR, receptorul pentru Ag - format din 2 catene polipeptidice α şi β (90%) sau γ şi δ. TCR poate recunoaşte doar peptide
antigenice asociate cu molecule ale CMH, localizate pe suprafaţa unei Celule Prezentatoare de Antigen - CPA. Nu
interacţionează cu Ag solubile.
TCR recunoaste simultan peptidul antigenic si unele reziduuri ale moleculei CMH.
-CD3 (Cluster Differentiation 3) – asociat TCR, ajută la transmiterea în celulă a semnalului de recunoaştere a Ag si de
activare a limfocitului
-CD2– prezent la toate TL, fixează hematii, poate fi depistat prin testul de formare a rozetelor.
Unii markeri (receptori) de suprafaţă definesc 2 varietăţi principale de LT: limfocitele T CD4+ şi TCD8+
- CD4 – exprimat pe 60% din TL. Recunosc antigenele peptidice asociate cu moleculele CMH clasa II (exprimate pe
celule dendritice, macrofage şi LB).
Limfocitele TCD4 (T4) au funcţia de coordonator central al răspunsului imun (participa in stimularea raspunsul imun
umoral si celular) şi la activare se diferenţiază în subpopulaţia de Thelper (Th, limfocite T auxiliare).
Th acţionează prin producerea citokinelor. În funcţie de profilul de citokine elaborate se disting mai multe
subpopulatii/clone de Th, principalele fiind Th1 şi Th2.
Diferenţierea în Th1 este favorizată de IL-12 produsă de macrofage si celule dendritice.
-Citokinele secretate de Th1 (IFN-γ, IL-2, TNF) stimulează răspunsul imun celular şi hipersensibilitatea tardivă
(activarea macrofagelor si stimularea functiilor microbicide ale fagocitelor, stimularea proliferarii şi diferenţierii
limfocitelor T citotoxice (Tc), activarea procesului inflamator).
-De asemenea Th1 stimulează producerea Ac opsonizanţi si fixatori de complement – IgG1, IgG3 (anticorpi ce
favorizeaza fagocitoza)
Diferenţierea în Th2 este favorizată de IL-4.
-Th2 recunosc Ag prezentate în special de B-limfocite.
Secretă IL-4, IL-5, IL-10 şi IL-13.
-IL-4 stimulează producerea Ac Ig E, iar IL-5 activează eozinofilele (rol in reactiile de hipersensibilitate
imediate/anafilactice si in eliminarea helmintilor).
De asemenea Th2 determina sinteza anticorpilor neutralizanti IgG.
Există o competiţie între cele două tipuri de Th: IFN-γ inhibă diferenţierea şi proliferarea Th2, iar IL-4, IL-10 şi IL-13
inhibă activitatea Th1.

-Tfh (f-Th) – stimulează diferenţierea BL în plasmocite cu sinteza Ig din toate clasele cu excepţia IgE. Produc IL-21.Se
intâlnesc in foliculii din ganglionii limfatici.
-Th17 – asigură protecţia suprafeţelor (tegument, mucoase) contra bacteriilor extracelulare. Produc IL-17 şi IL-22.
-Treg – imunosupresie, acţiune antiinflamatoare.
-CD8 – exprimat pe 40% LT. Recunosc antigenele peptidice asociate cu moleculele CMH clasa I (exprimate pe toate
celulele nucleate). La activare se diferenţiază în limfocite T citotoxice (Tc) şi T- reglatoare (Treg).

-Tc pot produce citokine, dar în special manifestă activitate citotoxica - distrug celulele infectate cu virus, cu bacterii
intracelulare sau celulele canceroase, intervin în respingerea grefelor.
Mecanisme: secreția porinelor, inducerea fragmentarii ADN-ului și a morții prin apoptoză a celulelor.
-T-memorie asigură memoria imunologică

Limfocitele B şi T naive sunt celulele care încă nu s-au întâlnit cu un Ag. Au funcția de recunoaștere a Ag. Populează
organele limfoide periferice și recirculă prin ele în căutarea Ag specifice.
-După interacţiunea cu Ag urmeaza activarea lor, proliferarea şi diferenţierea în celule efectoare (LB – în plasmocite
producătoare de Ac, LT în Th, Tc).
-Celulele (Th, Tc) si moleculele (Ac) efectoare migreaza spre locul infecției unde vor elimina microbii sau neutraliza
toxinele lor prin diferite mecanisme.
-Celulele efectoare au o durata de viata scurtă și mor prin apoptoză după eliminarea Ag.

-LB reprezintă 10-15% din populaţia limfocitară, cu o durată de viaţă scurtă, de 3-5 zile, iar LT constituie 70% cu o durată
de viaţă lungă (luni, ani).
Raportul limfocitelor CD4/CD8 este de 1,5.

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

Moleculele CMH reprezintă un ansamblu unic de proteine exprimate pe suprafaţa celulelor organismului, care sunt
veritabili markeri / antigene de identitate ai/ale fiecărui individ.
Rolul moleculelor CMH:
-Participă la prezentarea antigenelor peptidice limfocitelor T;
-Determină acceptarea sau respingerea grefelor tisulare.

1.CMH este transmis genetic. Genele CMH sunt situate pe cromozomul 6 la om, locus numit HLA (Human Leukocyte
Antigen).
2.Moleculele CMH sunt formate din 2 catene polipeptidice, constituite din domenii extracelulare, un fragment
transmembranar şi o regiune intracitoplasmatică.
3.Structura tridimensională a moleculei duce la formarea unei cavităţi, la fundul căreia se află receptorii care vor
interacţiona cu peptide antigenice proprii sau străine. Alţi receptori ai CMH interacţionează cu moleculele CD4 sau CD8
de pe TL.
4.Se disting molecule (antigene) CMH de clasa I şi de clasa II, sintetizate în reticulul endoplasmatic celular.
I.Moleculele CMH de clasa I sunt exprimate pe toate celulele nucleate ale organismului (inclusiv CPA “profesioniste”).
CMH I participă la prezentarea peptidelor antigenice scurte (9 AA) provenite din proteine citoplasmatice produse de
virusuri ce paraziteaza celula, de bacterii facultativ intracelulare care au reușit sa paraseasca fagosoma sau de gene celulare
mutate sau alterate (ex. in cazul tumorilor) – calea endogenă de prezentare a Ag.
Peptidele sunt obţinute în cursul degradării în citoplasma (de către proteasome) a proteinelor menționate mai sus (antigene
endogene).
CMH I recunoaste si interacţionează cu receptorul CD8 de pe T-limfocite.
-Complexul peptid/CMH I de pe suprafaţa Celulelor Prezentatoare de Antigen “profesioniste” (macrofage, celule
dendritice, BL) poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 complementar de pe limfocite T CD8 naive (rezultă activarea
limfocitelor, diferenţierea lor în limfocite Tc - iniţierea răspunsului imun celular)
-Complexul TCR/CD8 complementar de pe limfocitele efectoare Tc poate recunoaste complexul peptid /CMH I de pe
suprafaţa celulelor infectate sau a celulelor tumorale (CPA “neprofesioniste”) - rezultă distrugerea celulelor ce conţin
antigenul endogen.
II.Moleculele CMH de clasa II sunt exprimate doar pe CPA “profesioniste”, specializate în prezentarea Ag limfocitelor
TCD4: limfocite B, celule dendritice, monocite, macrofage. Ele pot prezenta peptide din 12-30 AA derivate din degradarea
în fagolizosome a Ag exogene (bacterii, protozoare, fungi, virioni liberi) – calea exogenă de prezentare a Ag.
-Complexul peptid/CMH II de pe celulele prezentatoare de Ag interacţionează cu complexul TCR/CD4 de pe limfocitele
TCD4 naive, determinand activarea și diferențierea limfocitelor TCD4 în Th.
-Complexul TCR/CD4 de pe celulele efectoare (Th1, Th2, etc) va interactiona cu complexul peptid/CMH II de pe limf B
activat de același Ag, determinand transformarea limf B în plasmocite secretoare de anticorpi.

Prezentarea încrucișată a Ag –prezentarea Ag exogene de către celulele dendritice prin intermediul moleculelor CMH I
pentru activarea limfocitelor TCD8 (în urma captării celulelor infectate cu virus)

LUCRAREA DE LABORATOR N 13

TEMA: ANTIGENELE. ANTICORPII. RĂSPUNSUL IMUN

1. Antigenele şi caracteristica lor. Antigene complete şi incomplete (haptene). Tipurile de epitopi şi valenţa
antigenelor. Antigene T-dependente şi T- independente. Structura antigenică a bacteriilor şi virusurilor.
ANTIGENE – substanţe străine (non-self) de natură endo- sau exogenă capabile să declanşeze un răspuns imun.
Se disting:
-Ag de origine infecţioasă (bacterii, virusuri, fungi, protozoare, etc)
-Ag de origine neinfecţioasă (alimente, medicamente, polen, substanţe chimice, cosmetice)
Proprietăţile de bază ale Ag:
-Imunogenitatea – capacitatea Ag de a fi recunoscut ca străin şi de a induce răspuns imun specific
-Antigenitatea (specificitatea) – capacitatea Ag de a interacţiona specific cu Ac sau cu receptorul pentru Ag complementar
al limfocitelor sensibilizate.
I.Antigenele care posedă ambele caractere sunt Ag complete.
Cerinţele faţă de Ag complete:
- Să fie substanţe străine
- Să fie formate din gruparea carrier (purtător) şi epitopi (determinante antigenice)
-Să aibă o greutate moleculară de peste 10 kDa
-Să aibă structură chimică complexă (proteine, polizaharide, LPZ, etc)
II.Antigenele incomplete (haptenele):
-Au masă moleculară mică
-Posedă antigenitate dar sunt lipsite de imunogenitate
-Pot deveni imunogene combinându-se cu macromolecule purtătoare (proteine sau polizaharide)
-Exemple de haptene: săruri ale metalelor grele (Cr, Ni), substanţe de origine vegetală, medicamente, coloranţi,
oligonucleotide, etc.
III.Superantigene – molecule proteice particulare (enterotoxinele stafilococice, toxina şocului toxic stafilococic, toxina
exfoliativă a stafilococilor, nucleocapsida virusului rabic), capabile să stimuleze un număr mare de limfocite T (10-40%).
N – 0.01%. SuperAg provoacă reacţii imunopatologice.

Se disting arbitrar:
-Ag solubile: proteine plasmatice, toxine, enzime, hormoni, etc
-Ag figurate (celulare, corpusculare): celule, bacterii, paraziţi, etc.

În funcţie de provenienţă se deosebesc:

- Ag heterofile – Ag comune mai multor specii animale. Ex.: Ag polizaharidice Forssman, prezente în hematiile de cal,
câine, oaie, cobai; sistemul Rh al eritrocitelor se întâlneşte la om şi maimuţele Macaccus rhesus, etc
-Ag heteroloage (xeno-Ag, hetero-Ag) – Ag provenite din organismul altei specii
-Izo-Ag (alo-Ag) – Ag de grup în cadrul unei specii (sistemul AB0 şi Rh, clasele de Ig)
-Idioantigene – antigenele specifice unui individ. Corespund moleculelor CMH
-Autoantigene – Ag proprii unui organism, devenite imunogene în anumite condiţii (spermatozoizii, tiroglobulina, insulina,
cristalinul, ţesutul nervos, etc)
-Exoantigene (provenite din compartimentul extracelular - bacterii, fungi, protozoare fagocitate)
-Endoantigene (provenite din citoplasma celulelor, reprezintă proteine proprii modificate sau proteine virale sintetizate de
celulele macroorganismului).
Structura antigenică a celulei bacteriene:
-Ag structurale: Ag O/R – somatice (ger. Ohne Hauch, without film), LPZ, termostabile; Ag H (ger. Hauch, film) –
flagelar, proteic, termolabil; Ag K – capsular, termovariabil; Ag F – fimbrial
-Ag solubile: enzime de patogenitate, exotoxine
-Antigene virale: proteine/GP de invelis, nucleoproteine, enzime.

Imunogenitatea este o caracteristică a întregii macromolecule Ag.

Antigenitatea (specificitatea) este determinată de anumite secvenţe ale Ag.
Suprafeţe limitate din macromolecula Ag apte să se combine cu Ac specifici sau cu receptorii de pe limfocitele T / B
se numesc epitopi sau determinante antigenice.

I.La glucide epitopul este format din 4-6 monozaharide. Polizaharidele sunt formate dintr-un epitop repetat sau dintr-un
număr redus de epitopi diferiţi.
Polizaharidele sunt Ag T-independente, pot induce sinteza Ac fără intervenţia limf. T.

II.Epitopul proteic este constituit din câţiva aminoacizi (AA).

-Epitopii liniari (secvenţiali) sunt determinaţi de structura primară a moleculei proteice (8-30 AA). Nu se modifică la
denaturarea proteinei.
-Epitopii conformaţionali sunt determinaţi de structura secundară sau terţiară a moleculei proteice (juxtapoziţia în spaţiu a
AA situaţi la distanţă). Se modifică la denaturarea proteinei.
-Fiecare moleculă proteică reprezintă un mozaic de epitopi, fie diferiţi, fie identici.
Proteinele sunt Ag T-dependente, deoarece ele induc sinteza Ac doar prin cooperarea dintre T şi B limfocite.
-Numărul de epitopi identici de pe o moleculă imunogenă reprezintă valenţa Ag.
-Un Ag polivalent conține multipli epitopi identici în compoziția sa (polizaharide, LPZ, acizi nucleici).

2. Celulele prezentatoare de antigen (CPA).

CELULELE PREZENTATOARE DE ANTIGEN (CPA)
-BL recunosc direct prin intermediul BCR epitopi antigenici conformaţionali solubili sau fixaţi pe membrane celulare.
-TL pot recunoaşte numai epitopi proteici liniari asociaţi cu molecule ale CMH (restricţie CMH) expuşi pe suprafaţa unor
celule specializate – CPA.
CPA “profesioniste” includ celulele dendritice foliculare şi tisulare, monocitele / macrofagele şi limfocitele B. Ele se
întâlnesc la posibilele porți de intrare ale agenților patogeni și pot prezenta pe membrană proteine ale CMH I si CMH II.
Toate celulele nucleate ale macroorganismului de asemenea sunt capabile sa prezinte peptide antigenice în asociație doar
cu moleculele CMH de clasa I (CPA “neprofesioniste”).
Funcţiile CPA
1. Captarea, fragmentarea și procesarea (processing-ul) Ag proteice cu expunerea pe suprafaţa sa a peptidelor antigenice
(epitopi liniari) asociate cu moleculele CMH.
2. Transportarea acestor complexe spre tesutul limfoid periferic, unde complexul CMH-peptid va fi prezentat TL naiv cu
TCR specific, declanşând activarea lui.
CPA care exprimă peptide asociate cu CMH I vor interactiona cu limfocite TCD8, iar CPA care exprima peptide in
asociatie cu CMH II – cu TCD4
3. Producerea semnalelor secundare de activare a LT (secreţia unor citokine, expresia unor molecule de co-stimulare)
Prezentarea Ag poate avea loc în diferite contexte:
-De către celulele dendritice pentru activarea limfocitelor T naive;
-De către limfocitele B pentru interacțiunea cu limfocitele T activate de același Ag;
-De către macrofage pentru a fi activate de către limfocitele Th1;
-De către orice celulă infectată sau malignizată a organismului pentru a fi eliminate de către limfocitele Tc.
Celulele dendritice sunt unicele CPA profesioniste capabile de a activa limfocitele T naive.
Celulele dendritice din țesuturi sunt imature și joacă rolul de santinelă – au capacitate înaltă de captare a antigenelor, dar
manifestă capacitate redusă de prezentare a Ag.
Celulele dendritice devin mature în urma captării Ag și migrării spre ganglionii limfatici. Ele au capacitatea de a prezenta
Ag și de activare a limfocitelor T, dar pierd capacitatea de captare a Ag.

3. Anticorpii (imunoglobulinele), structura lor. Clasele de imunoglobuline. Funcţiile lor biologice. Anticorpii
compleţi şi incompleţi. Anticorpii-caracteristici generale
-Ig prezintă glicoproteine din fracţia γ-globulinelor. Se disting Ig membranare (BCR) şi Ig solubile (secretate) – Ac ca
atare.
-Ac (Ig) sunt molecule glicoproteice produse de plasmocitele derivate din limfocitele B activate de Ag.
-Ac circulă în sânge şi pătrund în ţesuturi. Sunt eficienţi contra bacteriilor, toxinelor microbiene, helminților şi virusurilor
în poziţie extracelulară.
-Ac au proprietatea de a recunoaşte şi a se combina cu Ag complementar, atât in vivo, cât şi in vitro.

STRUCTURA
Unitatea de structură a Ig (monomerul) este constituită din 2 lanţuri glicoproteice (catene) identice
uşoare L (Light) şi 2 lanţuri grele H (Heavy), legate între ele prin punţi disulfidice.
Există 2 tipuri de lanţuri L – κ şi λ, identice într-o moleculă de Ig.
Se disting 5 tipuri de lanţuri H: γ, α, µ, δ, ε, ce corespund celor 5 clase (izotipuri) de Ig: IgG, IgA, IgM,
IgD, IgE.
În componenţa lanţurilor se disting regiuni variabile V (aminoterminale) şi regiuni constante C
(carboxilterminale). Catena L este constituită dintr-un domeniu V și unul C, iar catena H conține un domeniu V
și 3-4 domenii C.

Regiunile variabileale catenelor L şi H formează o cavitate tridimensională - centrul activ

(paratopul) al moleculei de Ig, care va reacţiona specific cu determinanta antigenică (epitopul)
Ag corespunzător, constituit din 5-7 AA sau 3-4 reziduuri glucidice. Regiunea variabilă
constituie fragmentul Fab (antigen binding) al moleculei de Ig.

Regiunea constantă corespunde fragmentului Fc (constant, cristalizabil). Este purtător

de receptori şi responsabil de activitatea biologică a Ig:

1. Transportul transplacentar al unor Ig (Ig G)

2. Fixarea pe diferite celule (mastocite, bazofile, fagocite, limfocite, etc.)
3. Capacitatea de a fixa complementul
4. Capacitatea de fixare a prot. A a stafilococilor
5. Defineşte clasele şi subclasele de Ig (specificitatea antigenică a catenei H)

PROPRIETĂŢILE IMUNOGLOBULINELOR
IgG (4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) Reprezintă 75% din ansamblul Ig serice. Constanta de sedimentare
-7S, greutatea moleculară-150kDa.
Sunt unicele Ig capabile să traverseze bariera placentară.
Fc al IgG are centre de fixare a complementului (activarea C pe cale clasică), a macrofagelor şi neutrofilelor (rol
în opsonizare), a proteinei A a stafilococilor.
Perioada de semi-viaţă 21 zile.
Manifestă activitate opsonizantă, neutralizantă, fixatoare de complement.

Ig M – 5-6% din totalul Ig. Pentamer. Constanta de sedimentare - 19S, greutatea moleculară -
900kDa.
-Se distrug sub acţiunea mercapto-etanolului sau cisteinei.
-Semi-viaţa – 5 zile.
-Fixează si activează complementul pe cale clasică.
-Nu traversează placenta, prezenţa Ig M la nou-născut denotă infecţie intrauterină.
-Sunt primele care apar după un stimul antigenic primar şi indică un proces infecţios acut.

Ig A – 15% din totalul Ig. CS -7S, GM – 160 kDa. Bogate în glucide. Se disting 2 subclase: IgA1
(80-90%) şi IgA2 (10-20%). Semi-viaţa – 6 zile, nu traversează placenta, nu activează complementul
pe cale clasică.
-Ig A serice (monomeri) – 6% din totalul Ig serice. Agregate de IgA pot activa complementul pe cale
alternativă.
-Ig A secretoare (sIg A) – salivă, lacrimi, colostrum, lapte, secreţii gastro-intestinale, nazale, bronhice.
Dimer. Asigură protecţia mucoaselor, blocând ataşarea bacteriilor şi virusurilor de receptorii
mucoaselor.

Ig D – 0,2% din totalul Ig. CS – 6,5S, GM – 170 kDa.

Semi-viaţa – 3 zile.
Rolul – receptor pentru Ag (BCR) pe LB; posibil participă la eliminarea limfocitelor B care produc autoAc
(Ac autoreactivi)

Ig E – 0,002 - 0,01%, CS – 7,9S, GM – 185 kDa. Semi-viaţa – 2-3 zile. Nu traversează placenta, nu fixează
complementul. Termolabile (inactivate la 56°C în 30 min).
Se pot fixa pe suprafaţa mastocitelor şi bazofilelor, determinând degranularea lor cu eliberarea unor
amine vazo-active (consecinţa - şoc anafilactic, dereglări alergice). Eficiente în afecţiuni parazitare
(opsonizarea helminţilor şi protozoarelor, efect chimiotactic pozitiv pentru eozinofile).
4. Răspunsul imun umoral şi celular. Interacţiunea dintre T şi B limfocite şi CPA în răspunsul imun.
Răspunsul imun primar şi secundar.

Răspunsul imun umoral

Raspunsul umoral asigura eliminarea Ag exogene si se caracterizeaza prin productia crescuta de Ig specifice
pentru Ag (epitopii) care au declansat generarea de Ig.

Fazele răspunsului imun umoral

I.Intâlnirea Ag cu CPA. Are loc la poarta de intrare (celule dendritice, macrofage) și în organele limfoide secundare
(limfocit B).
Va urma întâlnirea Ag cu celule imunocompetente (LT, LB)
-Dacă Ag patrunde direct în sânge, întâlnirea are loc în splină
-Dacă Ag penetrează prin tractul respirator – în amigdale şi ţesutul limfoid asociat bronhilor şi mucoaselor
-Dacă Ag penetrează în tractul intestinal – plăcile Peyer, foliculii solitari
-Dacă Ag patrunde prin tegument – intâlnirea are loc în ţesutul limfoid asociat tegumentului.

II. Recunoaşterea epitopilor unui Ag de către receptorul specific (BCR) de pe suprafaţa B limfocitelor naive
(selecţia clonala) şi activarea lor.

Consecințele activării LB

1. Expansiunea clonală (proliferarea) a LB

2. Diferențierea în plasmocite

3. Secreția de Ig

III. Proliferarea limfocitelor B activate si

diferentierea lor

După activarea limf B de un Ag T-independent

urmeaza proliferarea lui intr-o clona de celule
identice (expansiunea clonala) şi diferenţierea în
plasmocite, care vor sintetiza și secreta Ac din
clasa (izotipul) Ig M de afinitate redusă.

Celule B-memorie nu se produc.

Dacă limfocitul B a fost activat de un Ag
T-dependent (proteine)

1. Dacă limfocitul B a fost activat de un Ag T-dependent

(proteine), stimularea proliferării se va produce
numai prin interacţiunea dintre limfocitul B și limfocitul Th activate de acelaşi Ag.
2. Limf B şi limf T au aceeaşi specificitate antigenică, doar ca LB recunoaşte epitopi nativi (conformationali), iar L
Th recunoaşte fragmente peptidice ale acestui Ag, prezentate de CPA (cellule prezentatoare de antigen).
3. Th migrează spre foliculii limfoizi, la bordura cărora are loc întâlnirea lor cu limf B activat de același Ag.
 4. Complexul TCR/CD4 de pe limf Th recunoaşte complexul peptid/CMH II de pe limf B activat.
5. Ulterior se formează alte legături co-stimulatoare. Astfel limfocitele Th stimulate devin capabile să secrete
citokine, care vor acționa asupra limfocitului B activat de Ag (semnal activator secundar).

Aceste citokine induc proliferarea limfocitelor B activate, stimuleaza diferentierea lor in plasmocite secretoare
de Ac Ig M (diferențierea extrafoliculară) (100-2000 anticorpi/sec sintetizați de un plasmocit).

Unele LB revin în foliculi și sub influenţa citokinelor produse de limf Th se diferenţiază în plasmocite secretoare
de Ig din alte clase (comutaţie izotipică) cu diferențierea foliculară: Se formează LB-memorie.

Limf B memorie nu secretă Ac, ele circulă prin sânge şi supravieţuiesc mai multe luni sau ani fiind gata sa
reacţioneze la o pătrundere repetată a Ag.

IV. Efectul interacţiunii dintre Ag şi Ac in vivo- Depinde de natura Ag şi de tipul de Ac şi se poate manifesta
prin:
-Aglutinarea bacteriilor (IgM, IgG)
-Activarea complementului pe cale clasică
-Neutralizare - blocarea atașării toxinelor/enzimelor, adeziunii bacteriilor, virusurilor la receptorii celulari (IgM, IgG, IgA)
Citotoxicitatea mediată celular anticorp-dependentă – ADCC - (Ac se leagă de patogeni sau celulele infectate, inducând
degranularea celulelor citotoxice:
- IgG stimulează degranularea celulelor NK (consecință - distrugerea celulelor infectate cu virus sau tumorale)
- IgE stimulează degranularea eozinofilelor (distrugerea helminților)

Raspunsul imun primar

-Apare la primul contact al individului cu Ag
-Reprezinta intervalul dintre primul contact cu Ag si aparitia primelor Ig secretate
-Este generat exclusiv de celulele B de repaus, care sintetizeaza Ig cu afinitate relativ scazuta

I fază – de latenţă – durează 4-7 zile, până la apariţia Ac. In acest timp are loc recunoaşterea, procesarea
Ag, diferenţierea T,B limfocitelor
II fază – logaritmică – Titrul Ac creşte, atingând max în a 10-15 zi. Iniţial are loc producerea Ig M, peste
4-5 zile - IgG sau alte izotipuri de Ig (prin comutatie de clasa sub influenta citokinelor produse de Th).
III fază – de producere maximă a Ac – Durata variază în funcţie de Ag
IV fază – de diminuare a titrului de Ac (declin)– În cazul Ag proteice dureaza săptămâni, Ag
polizaharidice – luni, Ag virale – ani)
Raspunsul imun primar induce formarea celulelor B memorie.

Răspunsul umoral secundar

•La un contact repetat cu acelaşi Ag.

•Este asigurat de LB-memorie
•Perioadă de latenţă scurtă (ore)
•Ascensiune rapidă a titrului Ac
•Titru maxim de Ac menţinut o durată mai mare
•Afinitate crescută a Ac faţă de Ag
•Producerea anticorpilor Ig G.
 IMUNITATEA CELULARĂ - IC / (RASPUNSUL IMUN CELULAR )
Rolul IC este de a elimina microbii care pot supravieţui în vacuole fagocitare (facultativ intracelulari) sau
în citoplasma celulelor infectate (obligat intracelulari). Acest tip de imunitate este asigurat de limfocitele
T.
Exista 2 tipuri de reacții imune celulare, concepute pentru eliminarea microbilor intracelulari:
1.Limfocitele T CD4 (Th1) prin intermediul citokinelor activeaza fagocitele pentru ca ele să distrugă microbii ce
se afla în fagosome (mi/o facultativ-intacelulare)
2.Limfocitele T CD8 (Tc) prin contact direct distrug orice celulă ce contine microorganisme (bacterii, virusuri) în
citoplasmă (mi/o obligat intracelulare), eliminând astfel rezervorul infectiei sau celule tumorale.
RĂSPUNSUL IMUN CELULAR
I etapa – Captarea şi procesarea Ag proteice. Procesul are loc la porţile de intrare ale Ag.
lCPA profesioniste (macrofage, celule dendritice) capteaza Ag (ex.: celule infectate cu virus sau cu bacterii
intracelulare aflate în vezicule fagocitare).
lDupa fragmentarea şi procesarea antigenelor proteice în fagosome sau/şi de proteasome, peptidele vor fi
asociate cu moleculele CMH şi expuse pe suprafata CPA (peste 250.000 complexe per celula). Aceeaşi CPA
poate prezenta concomitent peptide antigenice provenite din citoplasma (în complex cu CMH I) sau din
vacuole fagocitare (în complex cu CMH II)
CPA cu limfa sunt transportate in ganglionii limfatici, unde ele vor fi capabile sa prezinte Ag limfocitelor T
naive.
 II etapă – Recunoașterea epitopilor Ag de către TCR al LT naiv și activarea lui

TCR și coreceptorii CD4 și CD8 de pe limfocitele T naïve recunosc complexul format din antigene peptidice și
CMH de pe suprafata CPA (ex. CPA care au captat celule infectate cu virus). Această recunoaștere constituie
primul semnal de activare a limfocitelor T.

Activarea completă a limfocitelor T depinde de recunoașterea moleculelor de costimulare de pe CPA

“profesioniste” de către receptorii de pe limfocitele T (ex. B7/CD28, CD40/CD40L).

III etapă – Proliferarea limfocitelor T (expansiunea clonală) și diferențierea lor

Dupa activare, limfocitele T, în particular T CD4, secretă rapid (2h) mai multe citokine (în special IL-2) și
exprimă receptori pentru IL-2. In consecință, IL-2 produsă de un TL se leagă de receptorul aceluiași TL,
stimulând proliferarea lui.

Proliferarea începe la 2 zile de la activarea limfocitelor și se produce rapid (peste o săptămână după infectare
până la 10-20% din toate limfocitele din organele limfoide periferice pot fi specifice pentru un Ag (N – 1:106 ).

Paralel cu proliferarea are loc și diferențierea limfocitelor T activate în limfocite/celule efectoare, cu funcția de
eradicare a infectiei.
-Limfocitele T CD8 activate se diferențiază în celule efectoare Tc, capabile să omoare celulele infectate sau
celulele tumorale care exprimă antigenul.
-Limfocitele T CD4 activate, sub influența IL-12 produsă de CPA, se diferențiază în limfocite efectoare Th1,
producătoare de citokine.

Celulele efectoare părăsesc organele limfoide periferice şi migrează spre tesutul infectat, unde, recunoscând
Ag, vor fi capabile să elimine infecţia.
Unele limfocite T se diferenţiază în limfocite T memorie, cu durată de viaţă lungă, inactive funcţional, dar gata
să reacţioneze rapid la o nouă expoziţie la acelasi microb (răspuns celular secundar)

IV. Mecanismele efectoare ale imunității celulare (realizarea efectului IC)

1. Limfocitele efectoare Tc acționeaza distrugând direct celulele infectate. Citotoxicitatea este rezultatul
contactului specific direct dintre clona de LTc şi ţinta lor (celule infectate cu virus sau bacterii intracelulare,
celule tumorale). Celulele infectate prezintă pe suprafaţa sa peptide antigenice asociate cu moleculele CMH I,
fiind recunoscute de către TCR şi CD8 de pe limfocitele Tc.

Reacţia citotoxică începe printr-un contact membranar dintre Tc şi celula-ţintă. Apoi limfocitele Tc eliberează
perforine care se înserează în membrana celulei-ţintă, formând pori. În același timp, limfocitele Tc secretă
enzime (granzime) care penetrează în citoplasma celulei prin pori, inducând apoptoza ei.
Limfocitele Th1 stimulează inglobarea și distrugerea microbilor de către fagocite, un element esențial
al imunității celulare.
Mecanisme:
1.Th1 produc citokine, în special IFN-γ, care este un activator puternic al macrofagelor, stimulând capacitatea
lor de a distruge patogeni intracelulari.
2.Macrofagele activate secretă citokine (TNF și IL-1) și chimiokine, care recrutează neutrofilele, monocitele și
limfocitele T efectoare în locul infecției
3.De asemenea, IFN-γ activează limfocitele B, stimulând producerea opsoninelor, care favorizează ingestia
microbilor de către fagocite.
5. Memoria imunologică. Toleranţa imunologică. Paralizia imunologică.

Memorie imunologică – Capacitatea sistemului imun de a elabora răspuns mai rapid, mai intens și mai
eficace la întâlniri repetate cu același Ag.

Toleranța – absența răspunsului imun la antigene proprii (self). Este determinată de inactivarea și eliminarea
limfocitelor autoreactive în procesul de maturizare a limfocitelor T si B.

O cantitate prea mare de antigen, produce “inundarea” organismului cu substanţe nonself şi rãspunsul este
paradoxal. In loc de stimularea rãspunsului imun se obţine efectul invers, denumit paralizie imunologicã.

Paralizia imunologicã este o reacţie de protecţie a organismului, faţã de dozele mari de antigen. Organismul
îşi blocheazã toate mecanismele de rãspuns imun. Fenomenul areactivitãţii imunitare poate surveni atât dupã
injectarea unei cantitãţi prea mari de antigen uşor metabolizabil, cât şi dupã injectarea unei cantitãţi moderate a
unui antigen care se metabolizeazã greu. La fiecare specie de organisme, pentru fiecare antigen, pare sã
existe un echilibru controlat genetic, între doza stimulatoare a rãspunsului imun şi cea care produce paralizia
imunologicã.

6. Particularităţile imunităţii antivirale, antitoxice, antitumorale şi antitransplant

Exista 2 ramuri ale apararii antivirale pe care il mobilizeaza un organism infectat cu virus.

In primul rand, exista un RI nespecific (RINS) – nu este diferentiat impotriva unui anumit tip de agent infectios (adica unui
anumit tip de virus, in acest caz) sau unui subtip viral/tulpini particulare de virus si nu se modifica la expuneri repetate cu
acelasi agent infectios. In alte cuvinte, organismul este expus la o infectie virala cu un anumit virus, o data sau de cateva
ori in cursul vietii, iar mecanismele imunitatii nespecifice raman neschimbate. Avantajul acestui tip de RI este mobilizarea
foarte rapida, astfel incat la cateva ore de la infectie mecanismele sunt deja mobilizate si gata sa puna o prima bariera in
calea virusului, insa se epuizeaza la fel de rapid, sunt autolimitante si dispar in 2-3 zile de la debutul infectiei virale.

In al doilea rand, exista un RI specific (RIS), directionat impotriva unui anumit virus si care se matureaza progresiv,
devenind din ce in ce mai capabil sa blocheze o tulpina particulara si sa neutralizeze actiunea virusului. Calitatea majora a
RI specific este memoria imunologica, ceea ce inseamna ca RIS isi aminteste orice fel de intalnire cu un agent infectios si,
la expuneri ulterioare la acelasi tip de virus, va raspunde printr-un mecanism care va fi

- si calitativ (afinitatea pentru si recunoasterea specifica a antigenului viral),

- si cantitativ (dpdv al concentratiei titrului efectorilor mobilizati) superior celui initial.

In ambele cazuri, si pentru RINS, si pentru RIS exista doua tipuri de efectori:

- efectori umorali – solubili, care actioneaza in fluidele corporale;

- efectori celulari – capabili sa atace virusul la nivel tisular sau la nivelul organelor-tinta.

RINS: efectorii umorali cei mai importanti in viroze sunt IFN, care fac parte din familia citokinelor, iar in cadrul
efectorilor celulari importanti pentru viroze sunt celulele NK (natural killer).

RIS: Pentru RIS, efectorii umorali sunt Ac specifici antivirali, iar efectorii celulari sunt LT, care nu actioneaza insa
singure, ci numai impreuna cu celulele APC.
7. Hipersensibilitatea. Factorii determinanţi şi mecanismele reacţiilor de tipul I și IV. Intradermoreacțiile.

1.Răspuns alergic primar

(a)prezentare Ag
1.Alergenul traversează bariera epitelială preluare+procesare a fragmentelor alergenice de către celulele
dendritice (CD)
2.Activarea LTh naive prin recunoașterea complexului Ag-MHC clasa II de pe suprafața CD LTh2 activate
3.LTh2 activate sinteza IL4/IL13
(b)sinteza de IgE+sensibilizarea mastocitelor
4.LTh2 stimulează LB cu orientarea izotipului spre sinteza IgE
5.IgE difuzează local la nivelul tisular IgE se leagă de receptorii specifici de înaltă afinitate pentru IgE (FcεRI)
de pe mastocite → Sensibilizarea mastocitelor, pentru a răspunde la o nouă expunere la alergen.
2.Răspuns alergic secundar
Debut: la 10 min după reexpunerea la alergene
Nivel maxim: la 30 min
Durează 1-3 h
(c)faza precoce
Alergenele străbat bariera epitelială
Legarea alergenelor de complexele IgE-FcεRI pe suprafața membranei mastocitelor (mc)
↓
Determină activare + degranulare mastocite
↓
Eliberare de mediatori preformați și de novo
↓
Efecte: contracție mușchi neted, vasodilatație, crește permeabi-litatea vasculare, hipotensiune, secreție de
mucus, prurit
(d)faza tardivă
Debut: la câteva ore de la contactul cu alergenul (2-8 ore)
Amplifică răspunsul inflamator precoce
Cauza: acțiunea factorilor chemotactici și a mediato-rilor inflamatori: IL-4, IL-5, IL-13, TNF-α
Efect: infiltrat inflamator cu LTh2, eozinofile, neutrofile, bazofile și monocite → perpetuarea răspunsului
inflamator și producerea de leziuni tisulare
elastaza neutrofilică → degradare colagen tip III
proteina bazică eozinofi-lică→lezare celule epiteliale
Răspuns imediat: Răspuns tardiv:
Histamina – vasodilataţie IL-4, TNF-α LTC4 – adeziune endotelială
PGD2 – bronhoconstricţie PAF, IL-5, ECF – migrare leucocitară
LTC4 – secreţie de mucus IL-4, IL-5 – activare leucocitară
Inflamație alergică cronică
Se dezvoltă prin expunere repetitivă/persistentă la alergene
Se caracterizează prin:
-acumularea tisulară de eozinofile, bazofile, neutrofile, monocite, LTh2
-creșterea numărului de mastocite în țesuturi → expresie crescută de FcεRI, care leagă IgE
-Interacțiuni complexe între celulele recrutate, rezidente și structurale
Inflamația alergică cronică → lezare epiteli-ală, exacerbată de expu-nerea la patogeni și fac-tori de mediu →
Activare răspunsului reparator:
îngroșarea peretelui căilor respiratorii
 depunerii de proteine în matricea extracelulară (fibronectină, colagen I,III,V)
hiperplazia celulelor mucoase → producției de mucus

Hipersensibilitate – răspunsuri imune excesive sau anormale, capabile să provoace leziuni tisulare și maladii.
Aceste reacţii se pot dezvolta în cadrul mecanismelor de apărare faţă de un microb patogen. În acelaşi timp,
reacţii similare pot fi dirijate contra substanţelor de origine neinfectioasa.
Particularităţile RHS:
1.RHS sunt specifice fata de Ag /alergen
2.RHS sunt induse de un contact primar cu Ag/alergenul care provoacă răspunsul imun specific (umoral,
celular)
3.RHS sunt declanşate la contacte ulterioare repetate cu acelaşi Ag/alergen

Clasificarea RHS după mecanismele imunologice (Gell, Coombs)

I.Hipersensibilitatea de tipul I (reacţii imediate, anafilactice)
II.Hipersensibilitatea de tipul II (citolitică-citotoxică)
III.Hipersensibilitatea de tipul III (prin complexe imune)
IV.Hipersensibilitatea de tipul IV (mediată celular, tardivă)
RHS de tipul I (anafilactice, imediate)
RHS imediate mai sunt numite “alergie” sau “atopie”. Persoanele predispuse la astfel de reactii sunt numite
“atopice”.
Antigenele care declanseaza o hipersensibilitate imediata sunt calificate ca “alergeni”.
Manifestările patologice survin timp de 15-30 min după reîntroducerea alergenului în organismul sensibilizat.
În reacţiile anafilactice participă IgE.
La persoanele predispuse la reactii anafilactice intalnirea cu unele Ag determina activarea limf Th2 si a
limfocitelor B cu producerea Ac IgE. Fiind sintetizate în timpul primului contact cu alergenul, IgE se fixează pe
receptori ai mastocitelor (în special din ţesutul conjunctiv sau din mucoase) și bazofilelor, persistând mai multe
luni.
La pătrunderea repetată (percutan, prin mucoase, intravenos) antigenul omolog leagă încrucişat fragmentele Fab
ale IgE vecine de pe mastocite. Aceasta duce la eliberarea din celule a unor mediatori, substanţe biologic active
(histamină, serotonină, Factorul de Necroză al Tumorilor (TNF), prostaglandine, leucotriene, proteaze). Ele se
fixează pe receptori celulari inducând contracţia musculaturii netede (bronşice, intestinale, uterine), vasodilataţie,
creşterea permeabilităţii vasculare cu edem, reacţie urticariană în tegument şi hipersecreţie de mucus la nivelul
bronşic. Aceste reactii survin la cateva minute de la reintroducerea Ag.
Anafilaxia generală (şocul anafilactic)
Este cea mai brutală şi gravă reacţie declanşată de un Ag/alergen. Se manifestă în câteva secunde după
administrarea parenterală a dozelor mari de Ag/alergen cu semne clinice sistemice: urticarie, asfixie,
colaps circulator şi şoc. Poate duce la deces subit.
Alergeni responsabili de şocul anafilactic: medicamente (analgezice, anestetice, AB, seruri sangvine
de animale, enzime), venin de viespi, de albine, alimente.
Anafilaxia locală (alergenul administrat în doză foarte mică sau aplicat local)
-La nivelul mucoaselor: conjunctivita alergică, rinita, astmul şi traheita spasmodică (alergeni: polenuri, dejecte de
acarieni din praful de casă)
-Forme cutanate: dermatita atopică şi urticaria
-Alergia alimentară: manifestări extradigestive (urticarie, edem Quincke, astm) şi digestive (diaree, vome)
Depistarea RHS tipul I:
-Teste cutanate prin aplicarea cutanată sau administrarea intradermică a alergenilor.
Reacţie pozitivă – peste 15 min local apare o reacţie eritemo-papuloasă.
-Teste de provocare – se efectuează la astmatici, prin administrarea alergenului în aerosol (pe cale nazală, orală)
şi măsurând modificările imediate şi tardive ale volumului maxim de aer expirat.
-Dozarea imunoenzimatică sau radioimună a Ig E
Principii de tratament
-Evitarea alergenului
-Desensibilizarea prin administrarea repetata a dozelor mici de Ag, care induce sinteza Ac IgG
-Tratament simptomatic (inhibitori ai degranulării mastocitelor, anti-histaminice, etc)

RHS de tipul IV (mediate celular, tardive, întârziate)

Sunt determinate de limfocite T CD8 (Tc) sau TCD4 (Th1) activate la contactul secundar cu Ag sensibilizant.
Sunt cunoscute 3 modele de hipersensibilitate tardivă:
1.Hipersensibilitatea tuberculinică
2.Reacţia granulomatoasă
3.Dermatitele de contact
Hipersensibilitatea tuberculinică este indusă de infecţii bacteriene, virale, fungice sau parazitare, prin vaccinare cu
vaccinuri vii atenuate sau cu proteine fixate pe un adjuvant complet.
Pătrunderea repetată a Ag activează limfocitele Th1 specifice de acest Ag, ducând la eliberarea unor citokine (in
special IFN-γ), responsabile de activarea macrofagelor si acumularea locală a celulelor mononucleate cu apariţia
eritemului şi formarea unui infiltrat – inducerea unui raspuns inflamator, în unele cazuri chiar şi necroză. Leziunea
apare peste 48 ore şi dispare în 3-5 zile.

Hipersensibilitatea granulomatoasă apare în cursul sensibilizării cu substanţe insolubile sau greu digerabile
(constituienţii unor paraziţi, compuşi lipoidici ai micobacteriilor, brucelelor, etc). În aceste cazuri RHS se
prelungeşte şi se manifestă prin formarea, în câteva săptămâni sau luni, a unui granulom.
În componenţa granulomului se disting 3 zone: centrală, din celule epitelioide, celule gigante Langhans,
intermediară – din limfocite şi fibroblaste şi periferică – din leucocite PMN, limfocite B şi plasmocite. Granulomul
poate fi supus fibrozei şi calcifierii, persistând mai mulţi ani.

Hipersensibilitatea de contact este determinată de haptene (metale grele - Ni, Cr; substanţe chimice – cauciuc,
clei; pesticide, vopsele, produse cosmetice, medicamente).
Aplicate percutan se combină cu proteinele tegumentului sau cu molecule de pe membrana CPA, în special a
celulelor Langerhans din epidermă. Aceasta duce la expansiunea clonală a limfocitelor T CD4 si T CD8.
Citokinele eliberate de limfocitele activate determină infiltrarea celulară a glandelor sudoripare, sebacee, a
foliculilor piloşi, a epidermei. Peste 48-72 ore local se observă eritem, edem şi formarea veziculelor.
 Explorarea hipersensibilităţii tardive
T e s t e c u t a n a t e (in vivo)
-Dermatitele de contact se depistează prin aplicarea cutanată a haptenelor şi examinarea eritemului, infiltratului
cutanat şi a veziculelor apărute peste 48 ore.
-Hipersensibilitatea tuberculinică se explorează prin introducerea intradermică a alergenilor microbieni:
tuberculina (derivat proteic al unei culturi de Mycobacterium tuberculosis), brucelina, tularina, antraxina,
dizenterina, etc.
Peste 48 ore se măsoară diametrul eritemului şi induraţiei.
Reacţia pozitivă denotă că organismul a fost în contact cu alergenul (infecţie anterioară sau actuală, vaccinare)
şi că acesta persistă în macrofagele organismului. Pentru confirmarea maladiei sunt necesare investigaţii
suplimentare.

Teste in vitro
-Testul de transformare limfoblastică (limfocitele unei persoane cu hipersensibilitate tardivă cultivate in vitro în
prezenţa Ag /alergenului suportă o transformare blastică cu proliferare ulterioară).
-Testul de inhibiţie a migrării leucocitelor (activarea limfocitelor T de către Ag specifice duce la secreţia citokinelor
care inhibă migrarea leucocitelor)
 LUCRAREA DE LABORATOR N 14

TEMA: METODA IMUNOLOGICĂ DE DIAGNOSTIC. REACŢIILE SEROLOGICE: REACŢIILE DE

AGLUTINARE DIRECTĂ ŞI INDIRECTE, REACŢIILE DE PRECIPITARE, REACŢIA DE NEUTRALIZARE

1. Metoda imunologică (serologică) de diagnostic. Reacţiile serologice. Noţiuni de serodiagnostic şi seroidentificare.

Mecanismul reacţiilor antigen-anticorp in vitro.
REACŢIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACŢIILE SEROLOGICE)
-Reacţia Ag-Ac este determinată de interacţiunea specifică dintre epitopii Antigenului şi paratopii Anticorpilor. În acest
-proces intervin patru tipuri de legături: legături de hidrogen, legături electrostatice, forţele Van der Waals şi legături
hidrofobe.
-Legătura Ag-Ac are trei caracteristici: este exotermică, specifică şi reversibilă.
Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific caracterizează intensitatea forţelor de legătură a complexului Ag-Ac. Ea depinde
de complementaritatea sterică dintre paratop şi epitop.
Aviditatea unui Ac pentru un Ag specific reprezintă rapiditatea apariţiei manifestării reacţiei Ag-Ac (precipitare,
aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valenţa Ac, de numărul de epitopi, de temperatură, de pH, de forţa
ionică a mediului.
Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit “specific”. Astfel, dacă este cunoscut unul din elementele
reacţiei - Ag sau Ac, poate fi identificat celălalt.
Reacţiile Ac-Ac (reacţiile serologice) au două direcţii de aplicare practică:
I.Seroidentificare: Detectarea şi dozarea Ag (element necunoscut – mi/o prezente in prelevat sau tulpini microbiene
izolate din diferite prelevate) cu ajutorul Ac specifici cunoscuţi.
Pot fi utilizate două surse de Ac: Ac monoclonali, absolut omogeni, dar care recunosc doar un singur epitop şi Ac
policlonali, ce se conţin în seruri imune (antiseruri), care permit legături de aviditate înaltă cu Ag.
II. Serodiagnostic: Detectarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor (component necunoscut) faţă de un Ag specific cunoscut
(conţinut în diagnosticuri / antigene).
Diagnosticurile se obțin din culturi microbiene izolate în laborator.

Unele reacţii Ag-Ac se manifestă direct şi pot fi observate de experimentator: de exemplu precipitarea sau aglutinarea
complexelor Ag-Ac, liza unor celule purtătoare de Ag pe membrana lor (hemoliză, bacterioliză, etc).

Alte reacţii Ag-Ac nu se vizualizează “spontan” in vitro. În acest caz se va recurge la nişte artificii experimentale, cum ar
fi utilizarea Ac “marcaţi”:
- Ac marcaţi cu un fluorocrom: imunofluorescenţa.
- Ac marcaţi cu o enzimă: analiza imunoenzimatică.

INTERACŢIUNEA ANTIGEN-ANTICORP
Faza specifică: are loc interacţiunea dintre Ag şi Ac specific corespunzător. Este un fenomen rapid, invizibil, comun
pentru toate reacţiile Ag-Ac. Decurge la temperatura de 37 C, în prezenţa unui electrolit (sol. fiziologică).
Faza nespecifică, vizibilă a uniunii Ag-Ac, se manifestă prin precipitare, aglutinare, liză, etc - fenomene determinate de
anumite condiţii (valenţa Ac, dimensiunile Ag, etc).
2. Reacţia de aglutinare. Componentele. Serurile aglutinante neadsorbite (native) şi absorbite. Diagnosticurile.
Obţinerea lor.
-Reacţia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci când determinantele antigenice sunt purtate de particule figurate
(Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt compleţi (cel puţin bivalenţi).
-Aglutinarea este determinată de formarea unei reţele între Ag şi Ac, ce permite apropierea unui număr suficient de
particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi potenţiali aglutinează mai
activ decât Ac IgG.
Clasificarea reacţiilor de aglutinare
1.Aglutinare “activă” sau “directă”, în care particula figurată (Ag corpuscular) este el însuşi purtător de determinante
antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, bacterii)
2.Aglutinare “pasivă” sau “indirectă”, în care particula serveşte doar de suport pentru un determinant antigenic solubil
fixat artificial pe suprafaţa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de
colesterol.
3. RA pe lamă. Componentele, tehnica efectuării, evaluarea şi interpretarea rezultatelor.
Reactii de aglutinare activa (directa)
Aspect calitativ
Reactia poate fi efectuata pe lama de sticla sau in tuburi.
Reactia pe lama
Se amesteca o picatura de ser (Ac) si o picatura de suspensie bacteriana (Ag). Lectura se face la
microscop sau cu ochiul liber. In caz de reactie pozitiva apar conglomerate, iar lichidul se
clarifica;
in caz de reactie negativa,lichidul ramane tulbure.

4.Reacţia de aglutinare (RA) în tuburi. Tehnica efectuării. Evaluarea şi interpretarea rezultatelor.

Reactia in tuburi
In eprubeta se amesteca serul si Ag figurate (hematii, bacterii).
Reactia pozitiva se manifesta prin formarea unui sediment cu aspect de umbrela inversata la fundul tuburilor (peste
20-24 ore) şi clarificarea lichidului. Aprecierea intensitaţii reacţiei se efectueaza dupa sistema de 4 plusuri (++++).
Celulele neaglutinate se sedimenteaza la fundul tuburilor sub forma de buton sau inel (reactie negativa). Lectura se face
cu ochiul liber sau folosind oglinda concava a microscopului.
5.Reacţiile de aglutinare indirectă. Reacţia de hemaglutinare indirectă (RHAI). Componentele. Evaluarea şi
interpretarea rezultatelor.
Reactia de hemaglutinare indirecta (pasiva) – RHAI / RHAP
Unele antigene de origine polizaharidica se fixeaza practic spontan, dupa o scurta incubatie, pe suprafata hematiilor.
Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire prealabila a hematiilor (de ex.: tratarea cu tanina, formol).
RHAI se efectuează in godeurile unei placi din polistiren.
Reactia pozitiva se manifesta prin aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna la fundul
godeurilor).
6. Reacţia de latex-aglutinare. Componentele. Avantajele.
În reacţia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixaţi pe particule de latex. Reacţia se efectuează pe lama de sticlă sau carton.
Reacţia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi suspecti de poliartrita reumatoida,
în bacteriologie pentru identificarea rapidă a mi/o sau Ag lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea
pentru serodiagnosticul unor infecţii.

7.Reacţia de precipitare (RP). Componentele şi obţinerea lor. Cerinţele faţă de componentele reacţiei. Titrul serului
precipitant
Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubil este amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi
observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar
putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi.
Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este
determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin
Ac.

Condiţiile de formare a reţelei de precipitare:

-Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi)
-Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate)
-Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalenţă, unde Ac si
Ag sunt in raport optimal de concentraţie, ce permite precipitarea
tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator. În exces de Ag sau de
Ac precipitatul nu se formează.
 -Utilizare: în medicina legala (determinarea apartenenţei de specie a diferitor proteine: sânge, spermă, etc), în
igiena alimentară (depistarea falsificării alimentelor), în diagnosticul maladiilor infectioase, etc

8.Tehnica efectuării RP inelară. Mecanismul şi aplicarea practică.

PRECIPITAREA IN MEDIU LICHID
Reactia de precipitare inelara
Intr-un tub cu diametrul de cinci millimetri se introduce serul imun; eprubeta se inclina si pe peretii ei se lasa sa
se prelinga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul. Daca Ac din ser corespund cu Ag, in zona de
separare a celor doua lichide se formeaza un inel alb, ceea ce semnifica precipitarea
complexului Ag-Ac.
Avantajul metodei – rapiditatea si simplicitatea.
Utilizarea practica: identificarea petelor de sange,
depistarea falsificarilor produselor alimentare,
depistarea antigenului polizaharidic al agentului
antraxului in omogenat de organe (reactia Ascoli).

9.Reacţia de precipitare în gel. Mecanismul şi aplicarea practică.

PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL)
În aceste reacţii Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză şi în zona de concentraţie optimă a acestor două
reactive se produce precipitarea sub formă de linii albe-cenuşii. Dacă există mai multe sisteme Ag-Ac, se vor
forma linii de precipitare distincte.
Poate fi utilizată în analiza calitativă a unui amestec de Ag într-o soluţie.

Imunodifuzia simplă radială (tehnica Mancini)

Se efectuează pe o placă acoperită cu geloză, în care sunt încorporaţi Ac specifici. Ag este depus în godeurile
din stratul de geloză. Ag difuzează radial în geloză pe parcursul a 48 ore. Dacă Ag corespunde Ac, atunci are loc
formarea de discuri de precipitare, cu suprafaţa proporţională concentraţiei Ag din godeu.
Se utilizeză pentru depistarea şi cuantificarea Ig, hormonilor, enzimelor, etc.
Imunodifuzie dublă (tehnicile Ouchterlony şi Elek)
Se acoperă cu geloză o placă de sticlă sau se toarnă geloza în cutia Petri.
lÎn tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzează din godeurile situate la o distanţă de 15 mm unul de altul.
lÎn tehnica Elek cele 2 reactive difuzează din benzile de hârtie plasate pe suprafaţa gelozei.
lMoleculele difuzează în gel în funcţie de greutatea lor şi formează linii de precipitare pentru fiecare sistem
Ag-Ac ce corespund în zona lor de echivalenţă. Dacă două Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dacă sunt
diferite – se intersectează.
Utilizarea – determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice
10.Imunoelectroforeza. Tehnica efectuării şi aplicarea practică.

Reacția de imunoelectroforeză (R.I.E.F.) permite efectuarea analizei și identificării unor antigene în sistemul
policomponent .
R.I.E.F. se bazează pe fracționarea electroforetică a antigenelor în gel și precipitarea lor ulterioară cu anticorpii serului
imun.
- Pentru efectuarea R.I.E.F. se folosesc plastine din sticlă, pe care se depune un strat de agar.
-La început antigenele întroduse în centrul plastinei se fracționează în cîmpul electric.
- Apoi, în canalul din gel, aranjat paralel cu liniile de fracționare a antigenelor, se adaugă ser imun.
- Difuzînd unul spre altul, antigenele și anticorpii formează arcuri de precipitare în locul interacțiunii.
Reacția de contraimunoelectroforeză (R.C.I.E.F.)
contradifuzia în cîmp electric a antigenelor şi anticorpilor cu apariția în gelul transparent al precipitatului vizibil.
In gel-agar sau gel-agaros se fac godeuri de 2-3 mm în diametru, distanța dintre godeuri pentru seruri și antigen
atinge 5-6 mm.
Godeurile sînt dispuse în perechi (unul pentru antigen, altul pentru ser) sau cîte trei (unul pentru antigen, altul pentru serul
examinat și al treilea pentru serul martor).
Godeurile pentru ser sînt situate mai aproape de anod, iar pentru antigen spre catod. În timpul electroforezei Ag,
încărcat negativ, migrează spre polul pozitiv, întâlnind Ac care migrează spre catod. La interacţiunea Ag şi Ac omologi are
loc formarea liniei de precipitare.

Reacția se efectuează cu cîteva diluții de antigen, durata electroforezei - 90 min. Rezultatele reacției se citesc imediat după
terminarea electroforezei, apreciind numărul și localizarea de precipitare în comparație cu liniile test -sistemului de
control.
CIEF serveşte la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urină, ser sangvin, lichid pleural, ascită, etc.

11.Reacţia de neutralizare (RN) a exotoxinelor bacteriene (in vivo). Destinaţia. Componentele. Tehnica
efectuării,citirea şi interpretarea rezultatelor.

Reacția de neutralizare
La baza acestei reacții se află capacitatea serului antitoxic specific de a neutraliza exotoxina.
Pentru efectuarea reacției materialul de examinat în care se presupune prezența exotoxinei se amestecă cu ser antitoxic, se
păstrează în termostat și se inoculează animalelor (cobai, şoarece).
Animalelor de control li se injectează filtratul materialului de examinat neprelucrat cu ser.
In caz că are loc neutralizarea exotoxinei de către serul antitoxic, animalele din grupul de experiență supraviețuiesc.
Animalele de control pier în urma acțiunii exotoxinei.

LUCRAREA DE LABORATOR N 15

TEMA: REACŢIILE SEROLOGICE: REACŢIA DE HEMOLIZĂ, REACŢIA DE FIXARE A

COMPLEMENTULUI, REACŢIA DE IMUNOFLUORESCENŢĂ, ANALIZA RADIOIMUNĂ, REACŢIA
IMUNOENZIMATICĂ, REACŢIA DE IMOBILIZARE

1. Lizinele şi proprietăţile lor. Reacţiile de liză imună.

REACŢII DE CITOLIZĂ IMUNĂ (cu participarea complementului)

Activarea fracţiilor complementului (C) duce la liza particulei purtătoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...)
Activarea complementului
-Calea clasică
-Calea alternativă
-Calea lectinică

Componentele reacţiilor de liză:

-Ag (celule bacteriene, hematii, etc)

-Ac (lizine - IgG şi IgM)

-Complement– ser proaspăt de cobai sau ser de cobai liofilizat

Reacţia de bacterioliză (RBL)

- Ag – suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...)

- Ac – serul imun sau serul bolnavului

- Complement

Activarea C pe cale clasică

Activatorul îl constituie complexe Ag-Ac (IgG, IgM)

Consecutivitatea activării C: Ag-Ac fixează fracţia C1qrs, care capătă ulterior activitate esterazică (în prezenţa obligatorie
a Ca++). C1 activează C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul
C4bC2a devenind convertază ce acţionează asupra C3. Urmează clivarea C3 în C3a (anafilotoxină) şi C3b, care se uneşte
de complex (AgAcC1C4bC2aC3b), formând C5-convertaza, care clivează C5 în C5a şi C5b. C5b se leagă de membrana
celulei-ţintă. Urmează fixarea simultană a C,6,7. La final se fixează C8, apoi C9, formând “complexul de atac
membranar”. Fixarea lor produce leziuni ireversibile – liza celulei.

Calea alternativă de activare a C

Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus, levuri, paraziţi, venin de cobră, agregate de IgA sau IgE. C1,4 şi 2 nu
intervin şi reacţia începe cu C3. Properdina, factorul B şi ionii de Mg++ sunt obligatorii în procesul de activare pe cale
alternativă.

Calea lectinică de activare a C este determinată de legarea unor lectine pe unele grupări de manoză, carbohidrat prezent în
componenţa multor mi/o şi absentă la ma/o. Lectina este echivalentă fracţiei C1q. Alte 2 molecule se asociază, formând o
enzimă similară C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza) Componentele reacţiilor de liză: Ag
(celule bacteriene, hematii, etc). Ac (lizine - IgG şi IgM); Complement– ser proaspăt de cobai sau ser de cobai liofilizat

Reacţia de bacterioliză (RBL). Ag – suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...); Ac – serul imun sau serul
bolnavului; Complement

RBL in vitro: Se efectuează diluţia succesivă a serului; Se adaugă suspensie microbiană vie; Se adaogă complement
(martor: Ag+ser fiziologic+C); Incubare 2 h la 37°C; Reînsămânţare pe cutii cu geloză câte 0,1 ml din fiecare diluţie (24h
– 37° C). Lectura – se compară nr coloniilor crescute din martor şi probele studiate. Titrul – cea mai mare diluţie a serului
în care au fost lizate cel puţin 50% din celule

RBL in vivo: Amestecul dintre Ag şi Ac se inoculează intra-peritoneal la animale de laborator (ex.: şoareci albi); Peste
fiecare 10 min, timp de o oră, se extrage lichidul peritoneal, se pregăteşte un preparat nativ şi se examinează pe fond negru
sau cu contrast de fază. Rezultat pozitiv – numărul bacteriilor scade treptat până la dispariţie. Utilizarea RBL –
diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL)
2. Reacţia de hemoliză (RH). Componentele şi obţinerea lor. Efectuarea, citirea şi interpretarea reacţiei.
Utilizarea.
Reacţia de hemoliză (RHL)
-Ag – hematii de berbec, suspensie de 3%
-Ac – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic)
-Complement
Principiul reacţiei: complexele Ag-Ac formate fixează C şi-l activează pe cale clasică,
provocând hemoliza.
Intensitatea hemolizei se apreciază vizual (++++) sau prin măsurarea densităţii optice a
hemoglobinei eliberate.
Utilizarea practică a RHL: pentru dozarea C, precum şi în montarea reacţiei de fixare a
complementului.

3. Reacţia de fixare a complementului (RFC). Componentele reacţiei şi mecanismul ei. Tehnica efectuării
reacţiei de fixare a complementului. Lectura şi interpretarea rezultatelor RFC.
REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC)
Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C.
În RFC participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG.
RFC se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc
Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în prealabil pentru aprecierea
dozelor de lucru.
Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor

Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme.

I etapă – Sistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1
(serul bolnavului sau serul imun) şi complement în doza de lucru. Amestecul este incubat 1h
la 37° C sau menţinut 16-18 ore la 4° C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi
fixarea C (efect frecvent invizibil).

II etapă – la sistemul de bază se adaugă sistemul indicator (hemolitic), constituit din

hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici – serul hemolitic (Ac2). Peste 1h incubare
la 37° C reacţia este terminată.
Evaluarea rezultatelor – dacă complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu
se observă (rezultat pozitiv). Dacă Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rămâne
disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocând hemoliza (rezultat
negativ)
4.Determinarea titrului complementului în serul sangvin. Importanţa practică.
Titrarea complementului. Anterior de efectuarea experienţei de bază soluţia iniţială a complementului (1:10) este
repartizată în tuburi de la 0,05 ml pînă la 0,5 ml şi în fiecare tub volumul se completează cu soluţie izotonică NaCl pînă la
1,5 ml. Eprubetele se includ în termostat la temperatura 37°C pentru 45 min, apoi în tuburi se adaugă sistemul hemolitic şi
din nou se menţine în termostat 30 min, după ce se apreciază titrul complementului.

Titrul complementului reprezintă cea mai mică cantitate a acestuia, la adăugarea căreia în sistemul hemolititc, se
înregistrează hemoliza completă în decurs de 1 oră, la 37C. În reacţie se foloseşte doza de lucru a complementului, care se
ia următoarea mai mare după titru deoarece în experienţă activitatea complementului poate să cadă pe contul adsorbţiei
nespecifice a acestuia de către alţi componenţi ai reacţiei.
5.Reacţia de imobilizare a bacteriilor (RIB). Componentele. Tehnica reacţiei. Citirea şi interpretarea.
Utilizarea celulelor microbiene imobilizate în scopul efectuării reacţiilor de sinteză, biotransformare sau descompunere a
compușilor organici rămâne una din cele mai intens investigate tehnologii a ultimilor ani.
Avantajele imobilizării microorganismelor active pe suporturi solide sunt numeroase: eficacitatea mai mare în raport cu
suspensiile celulare, posibilitatea menţinerii unei concentraţii importante de biomasă microbiană activă pe un suport,
protecţia celulelor microbiene de acţiunea toxică a compușilor organici supuși bioconversiei, facilitatea de operare a
biomasei active, incluse în suporturi, pe parcursul procesului tehnologic de degradare și a.

6. Reacţia de imunofluorescenţă Coons (RIF directă şi indirectă). Componentele. Tehnica. Interpretarea

reacţiei.
Reacţia de imunofluorescenţă (RIF, reacţia COONS)
Metoda directă (numai în scop de seroidentificare). Din materialul ce conţine Ag (material nativ, cultură
pură, biopsie tisulară) se prepară un frotiu, peste care se aplică serul imun specific cu Ac marcaţi cu
fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o cameră umedă preparatul este studiat la microscopul
luminiscent. În caz de reacţie pozitivă se observă luminiscenţă locală.
Dezavantaj – necesitatea de a avea seruri
imune marcate specifice pentru fiecare Ag.

Metoda indirectă. Poate fi utilizată pentru sero-identificare şi sero-diagnostic.

Pe frotiul ce conţine Ag se aplică Ac corespunzători nemarcaţi. Peste 20 min se spală minuţios preparatul,
apoi se adaugă anti-Ig fluorescentă, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat
în numeroase reacţii.
Anti-Ig se obţine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig umane.

RIF se utilizează pentru identificarea rapidă a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic
 7. Reacţia imunoenzimatică (ELISA, ELFA) directă şi indirectă. Citirea şi interpretarea rezultatelor.
Western-blot. Aplicarea practică.

Reacții imuno-enzimatice (RIE)

In functie de substratul clivat enzimatic utilizat se disting:
1.RIE colorimetrice - Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): utilizeaza substraturi cromogene,
cum ar fi ABTS (sarea diamoniu a 2,2`-azino-di (3-etil-benzotiazolin-6-sulfonat) care formeaza cu H2O2 sub
actiunea peroxidazei culoarea verde sau p-nitrofenil fosfat care formeaza culoarea galbena sub actiunea
fosfatazei alcaline. Un spectrofotometru masoara densitatea optica a cromogenului rezultat.
Utilizare – patologie infecțioasă, determinarea de testosteron liber, 17-OH progesteron, Ac anti-LKM1, Ac
anticardiolipinici IgG, Ac antispermatozoizi, serologie paraziti, etc.).

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

-RIE directă (metoda sandwich). Utilizată doar în sero-identificarea Ag. În godeurile din placa de polistiren în
care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se toarnă soluţia de Ag necunoscut. Se incubează 1h. După o spălare minuţioasă
a godeurilor se adaugă Ac marcaţi cu enzime, care se fixează pe epitopii liberi ai Ag polivalent. După incubare
de 30 min-1h se spală iarăşi godeurile.
-Prezenţa complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depistează cu ajutorul substratului cromogen (substanţă iniţial
incoloră, dar care se colorează sub acţiunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).

-RIE indirectă. Utilizată în serodiagnostic.

Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se întroduce în godeu, după 1h se spală totul
şi se adaugă ligandul marcat cu enzimă (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzimă). Acest ligand se
fixează pe Fc al Ac testaţi. Se adaugă apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se măsoară după
densitatea optică a lichidului din godeuri.

2. RIE cu fluorescenta - tehnica ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay): utilizeaza substraturi fluorescente,
in urma reactiei enzimatice fiind generat un fluorofor, care emite lumina de o lungime de unda caracteristica in
urma excitatiei sale luminoase optime. Instrumentul utilizat (fluorometru) necesita o sursa de lumina si un tub
fotomultiplicator pentru detectia emisiei fluorescente.
Comparativ cu RIE colorimetrice testele fluorescente genereaza o intensitate a semnalului mai mare cu cel putin
un ordin de marime.
Metoda ELFA este folosita pentru determinarea IgE specifice pentru diversi alergeni, a markerilor pentru afectiuni
reumatismale, Ac anti-Toxoplasma IgG cantitativ, anti-Citomegalovirus IgM precum si a aviditatii anticorpilor
anti-Toxoplasma IgG.

Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea proteinelor antigenice dintr-un amestec.
I etapă – electroforeza în gel a probei de Ag
II etapă – transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloză
III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Ac dirijaţi contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzimă, care
permite depistarea Ac fixaţi. După o spălare se adaugă substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formează
zone colorate distincte.
 Utilizare: depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali…

8. Analiza radio-imună (ARI). Importanţa practică.

Analiza radioimună (ARI)

Principiul este identic cu cel al RIE
Ag se fixează la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaugă Ac testaţi care se vor combina cu Ag omolog. După
spălarea godeurilor, se adaugă un ligand radiomarcat (anti-Ig). După eliminarea excesului de izotopi prin spălare, se
măsoară radio-activitatea: ea este proporţională cu concentraţia Ac dozaţi.

LUCRAREA DE LABORATOR N 16
TEMA: IMUNOPROFILAXIA ŞI IMUNOTERAPIA BOLILOR INFECŢIOASE. VACCINURILE. SERURILE
IMUNE

1.Imunitatea artificială dobândită activă şi pasivă.

Imunizare activă – prin administrarea în organism a unor Ag microbiene (vaccinuri)
Imunizare pasivă – bazată pe întroducerea în organism a unor preparate ce conţin Ac specifici
2.Vaccinurile şi clasificarea lor. Noţiune de vaccinoprofilaxie şi vaccinoterapie.
Calendarul vaccinărilor.
Vaccinurile sunt produse biologice cu proprietăţi de imunogen, constituite din microorganisme vii sau omorâte, din
componentele lor sau din toxine modificate. Fiind administrate la om sau animale induc o imunitate artificială activă –
IAA - (umorală, celulară, mixtă) fără să provoace efecte nocive.
Imunitatea postvaccinală (IAA) se instaurează relativ lent, la 15-20 zile de la ultima inoculare, şi durează timp variabil
(luni-ani-toată viaţa).
Vaccin – de la virusul vacciniei, utilizat de Edward Jenner pentru imunizarea copiilor contra varicelei (1796)
Imunoprofilaxia – o metodă specifică de prevenire colectivă sau individuală a maladiilor infecţioase, ce are la bază
crearea imunităţii artificiale specifice.
Imunoterapia – metode specifice de tratament prin intermediul vaccinurilor, serurilor imune, etc.
Vaccinarea primară (de bază) conferă organismului memorie imunologică.
Vaccinările de rapel (revaccinarea) se utilizează pentru stimularea unui răspuns imun secundar, mai rapid si mai intens
Calităţile unui vaccin ideal:
-Imunogenitate înaltă
-Lipsit de efecte secundare
-Uşor disponibil
-Stabil
-Ieftin
-Simplu la administrare şi eficace (să creeze imunitate stabilă de lungă durată)

Clasificarea vaccinurilor
-T R A D I Ţ I O N A L E (clasice)
Corpusculare (vii atenuate, inactivate)
Subunitare (vaccinuri acelulare, polizaharidice, recombinante, anatoxine)

-Vaccinuri NOI / E X P E R I M E N T A L E
Vaccinuri sintetice
Vaccinuri chimerice
Vaccinuri cu vectori (nereplicativi, replicativi)
Vaccinuri bazate pe nanoparticule
Vaccinuri pe bază de azici nucleici (ADN, ARNm)

Calendarul vaccinării

3.Vaccinurile vii, inactivate, subunitare, anatoxinele, autovaccinurile. Principiile de obţinere. Metodele de

administrare în organism. Avantaje şi dezavantaje.
-Vaccinurile vii atenuate reprezintă tulpini de bacterii sau virusuri vii cu virulenţa redusă, dar cu capacitate imunogenă
păstrată.
1.Căile de obţinere
A. Selecţia tulpinilor naturale cu virulenţa redusă
-Vaccinul E (contra tifosului exantematic)
-Vaccinul EV (antipestos)
-Vaccinul Brucella N19 (antibrucelos)
B. Utilizarea mi/o înrudite genetic, avirulente pentru specia umană
(ex.: virusul vacciniei utilizat în profilaxia variolei)
C. Atenuarea dirijată a virulenţei prin:
Factori fizici: cultivarea la t° neadecvate – vaccinul anti-antrax (42° C), vaccinul anti-pestos (16° C)
Cultivarea în prezenţa unor compuşi chimici nefavorabili (ex.: BCG – obţinut de Calmette şi Guerin prin cultivarea tulpinii
de Mycobacterium bovis timp de 13 ani pe medii cu bilă)
Prin factori biologici – pasaje multiple pe animale sau pe culturi celulare (Pasteur a efectuat 133 pasaje a suspensiei de
creier de la câine turbat intracerebral iepurilor, obţinând un virus atenuat)
- Prin inginerie genetica (inactivarea genelor de patogenitate - mutaţii la nivelul genelor de patogenitate.
2.Avantaje:
-Imunogenitate înaltă, o inoculare unică induce imunitate solidă şi de lungă durată
-Se administrează pe cale naturală (intranazal, per os, percutan, etc)
-Induce imunitate locală şi generală
3.Dezavantaje
-Pot provoca complicaţii postvaccinale (accidente alergice, efect teratogen)
-Revenirea la forma virulentă cu riscul bolii infecţioase induse (ex.: poliomielită paralitică, etc)
-Pericol de inducere a maladiei la persoane cu imunodeficienţe (BCG-ita, etc)
-Multiple contraindicaţii
-Durată de păstrare limitată.
Alte vaccinuri vii atenuate: anti-tularemic, anti-poliomielitic, anti-gripal, anti-rujeolos, anti-rubeolic, anti-parotidită
epidemică, anti-varicelă, anti-rotavirus, etc.
-Vaccinurile inactivate (omorâte) constau din culturi bacteriene sau virale înalt virulente inactivate prin căldură (60° C –
1 oră), prin agenţi chimici (formaldehidă, fenol, acetonă), radiaţii, ultrasunet, etc.
Exemple de vaccinuri inactivate: anti-febra tifoida, anti-dizenteric, anti-choleric, anti-pertusic, anti-stafilococic,
anti-gripal, anti-poliomielitic, anti-hepatita A, anti-rabic, etc.
Avantajele:
-Exclud riscul infecţiei post-vaccinale
-Stabile la păstrare
Dezavantaje:
-Imunogenitate redusă (sunt necesare inoculări repetate)
-Durată limitată a imunităţii 6 – 12 luni
-Eficacitate variabilă
-Necesitatea unei concentraţii mari de Ag
-Administrarea prin injecţii (stimulează slab sau deloc imunitatea locală)

-Autovaccinul este un vaccin inactivat preparat din tulpina microbiană izolată de la un bolnav şi inoculat aceluiaşi bolnav
pentru stimularea imunităţii specifice.
Autovaccinul este indicat pacienţilor care suferă de procese cronice: stafilodermii, streptodermii, candidoze, dizenterie
cronica, etc.

-Vaccinurile subunitare constau din componente antigenice majore, capabile să inducă un răspuns imun protector. Pentru
a crește imunogenitatea acestor vaccinuri, deseori sunt asociate cu un adjuvant.
1. Vaccinul acelular antipertussis conține componente purificate din B.pertussis.
2. Vaccinuri polizaharidice, constituite din polizaharide capsulare bacteriene.
Ex.: vaccinul anti-pneumococic, anti-meningococic, anti-Haemophilus influenza tip b (Hib) etc.
3. Vaccinuri recombinante (vaccinuri moleculare): gene ce codifică polipeptide imunogene sunt integrate prin
intermediul unor vectori (plasmide, fagi moderaţi) în cromosomul unor levuri, bacterii sau celule animale, care vor
produce polipeptidul vaccinant (ex.: vaccinul anti-hepatită B, anti-gripal)
O varianta a vaccinurilor recombinante reprezintă utilizarea anvelopelor virale vide (goale) pentru delivrarea Ag straine si
prezentarea lor celulelor imunocompetente (VLP – virus like particules) - sisteme de delivrare si prezentare a antigenelor.
Aceste sisteme nu se multiplică in organism (vectori ne-replicativi), fiind inofensive și in același timp foarte imunogene.
Ex.: vaccinul anti-HPV (anti-chikungunya – în curs de testare clinică)
4. Anatoxinele sunt vaccinuri subunitare obţinute din exotoxine bacteriene.
Etapele de obţinere a anatoxinelor:
-Cultivarea tulpinii toxigene în mediu lichid
-Separarea exotoxinei prin filtrare
-Tratarea cu formol 0,3-0,4 % timp de 3-4 săptămâni la 39-40° C. Toxinele pierd toxicitatea, dar îşi păstrează capacitatea
imunogenă
-Purificarea anatoxinei (salinizare cu săruri de amoniu, precipitare cu alcool...)
-Concentrarea
-Determinarea puterii anatoxinei în RN (floculare) cu seruri antitoxice specifice.
!!!Anatoxinele se utilizează în profilaxia specifică a infecţiilor cauzate de mi/o toxigene stimulând producerea
antitoxinelor.
Exemple de anatoxine: difterică, tetanică, gangrenoasă, holerică, stafilococică, etc.

Avantajele vaccinurilor subunitare:

– sunt lipsite de efecte secundare
- stabilitate la păstrare
Dezavantaje – imunogenitate redusă, necesitatea inoculărilor repetate

Pentru sporirea imunogenităţii și efectivității vaccinurilor subunitare se utilizează substanţe speciale - adjuvanţi.
Adjuvanţii minerali (hidroxidul de Al, fosfatul de Ca, emulsii uleioase) generează o reacţie inflamatoare care reţine
eliminarea Ag şi favorizează prezentarea lui limfocitelor T
Adjuvanţii biologici (unele bacterii: Bordetella pertussis, Corynebacterium parvum, Mycobacterium tuberculosis, sau
componente bacteriene – ex. ribosomi bacterieni ) induc expresia moleculelor de co-stimulare pe suprafața CPA,
determinand aceste celule să secrete citokine care vor activa limfocitele T.

4.Vaccinurile asociate şi deponente. Vaccinurile noi şi de perspectivă.

I.Vaccinuri sintetice: se obţin prin sinteza polipeptidelor ce reprezintă epitopii liniari (ex.: toxina cholerică, virusul
poliomielitic). Sunt lipsite de efecte secundare. Dezavantaje: dificil de identificat epitopii, imunogenitate foarte redusă.
II.Vaccinuri chimerice: conțin informații genetice și prezintă proprietăți biologice ale diferitor virusuri (vaccin chimeric
viu atenuat compus din genomul virusului Dengue și proteine superficiale ale virusului Zika)
III.Vaccinuri bazate pe nanoparticule: vaccin experimental care conține proteina feritină, care se poate autoasambla în
unități microscopice numite nanoparticule care prezintă un antigen proteic. În curs de testare la om – vaccinul antigripal. În
perspectivă - antiMERS, antiRSV, antiEBV.
IV. Vaccinuri cu vectori virali utilizează o versiune modificată nereplicativă a unui virus pentru întroducerea materialului
genetic al unui patogen în celulele organismului imunizat.
Vectori – virusul gripal, adenovirusuri, virusul respirator sincițial (RSV)
Ex.: vaccinurile anti Covid-19 Vaxzevria, Janssen, Sputnik V utilizează vectorul adenoviral în genomul căruia este inserată
gena ce codifică proteina S (Spike) a SARS-CoV-2.
Vaccinuri ani-gripal, anti-Zika, anti-HIV – în studiu
V. Vaccinuri constituite din vectori infecţioşi recombinanţi (vaccinuri hibride). Se obţin prin inserţia unor gene ce
codifică Ag vaccinante (epitopi) în genomul unui vector viral sau bacterian, care ulterior se inoculează la persoanele
imunizate.
Vectorii nu sunt virulenți, dar sunt capabili să se multiplice un timp îndelungat în organism, inducând un răspuns imun
mixt (umoral si celular) contra produsului genei inserate şi contra vectorului.
Ex.: vaccinuri contra hepatitei B, rujeolei, infecţiei herpetice tip1, anti-Ebola, anti-Zika, anti-HIV (vectori – virusul
vacciniei, adenovirusuri).
VI. Imunizarea genetică, bazată pe utilizarea ADN sau ARN microbian (vaccinuri nucleotidice).
1. Constă în imunizarea persoanelor cu ADN ce codifică proteine microbiane înserat intr-o plasmidă bacteriană. Plasmida
este captată de CPA ale gazdei, Ag este produs şi ulterior procesat în interiorul CPA cu stimularea ulterioara a limf T și
inducerea imunității celulare.
2. Gena ce codifică Ag vaccinant este introdusă în unele celule ale organismului (ex.: celule musculare). Administrarea se
face i/m sau prin “bombardarea” cu particule a tegumentului. ADN patrunde in celula musculara care va sintetiza ulterior
Ag. Se induce un răspuns imun umoral şi celular puternic și de lungă durată.
Se află în testare vaccinuri contra HIV şi gripei, contra hepatitei B cronice.
Avantaje: ieftine, eficace, lipsite de riscuri post-vaccinale
Temeri: mutaţii oncogene, răspuns imun anti-ADN

5.Preparate serice omoloage şi heteroloage, utilizate în profilaxia şi terapia bolilor infecţioase. Obţinerea. Modul de
administrare în organism.
Imunizarea artificială pasivă se realizează cu preparate biologice ce conţin Ac (seruri imune, Ig, gamma-globuline,
anticorpi monoclonali), utilizate cu scop de seroterapie sau seroprofilaxie.
Imunitatea artificială pasivă se instaurează imediat după administrarea preparatului, fiind limitată în timp (max. 3
săptămâni).
Din momentul în care Ac exogeni sunt eliminaţi, organismul redevine receptiv la infecţie.
Serurile imune sunt preparate biologice ce conţin Ac specifici faţă de diferiţi agenţi patogeni şi produse ale acestora.
După provenienţă există:
1. Seruri imune omoloage
De la convalescenţi
De la voluntari imunizaţi activ (seruri hiperimune, specifice)
Din sângele donatorilor şi sânge placentar (seruri standarde, normale)
Avantajele serurilor omoloage:
-Nu provoacă sensibilizarea organismului
-Asigură o protecţie de durată maximă (aprox. 30 zile)
Dezavantaje:
-Pericolul transmiterii virusurilor hepatice, HIV, etc
-Titruri variabile de Ac
-Volum limitat
2. Seruri imune heteroloage, obţinute prin hiperimunizarea animalelor (cai, cămile, lame)
Avantaje: titru dozat de Ac, lipsa pericolului de infectare cu HIV, virusuri hepatice, etc
Dezavantaje:
-Sunt eliminate mai rapid (aprox. 7 zile)
-Conţinând proteine străine (albumine), produc sensibilizarea organismului
6.Serurile imune antitoxice. Obţinerea şi determinarea activităţii (UI, UA).
Seruri antitoxice (anti-difteric, anti-tetanic, anti-botulinic, etc). Neutralizează exotoxinele bacteriene (blochează fixarea
de receptorii celulari). Activitatea lor este apreciată prin titrare şi măsurată în UA (UI).

7.Serurile imune antibacteriene şi antivirale (imunoglobulinele). Obţinerea şi aplicarea practică.

-Seruri antibacteriene (anti-meningococic, anti-antrax), ridică sensibilitatea bacteriilor la acţiunea fagocitelor şi
complementului. Se dozează în ml (seruri netitrate)
-Seruri antivirale (ex.: ser anti-rabic). Neutralizează infecţiozitatea virusurilor.

Anticorpi monoclonali
-Anticorpii monoclonali reprezintă Ig cu structură și funcție identică.
-Provin din hibridoame de origine murină, umană sau chimerică
-Pot fi utilizați în diagnosticul și tratamentul unor maladii.
Căile de administrare – intramuscular, intravenos.
Modul de administrare:
-Serurile imune omoloage, Ig se administrează în doză unică fără precauţii
-Serurile heteroloage, administrate parenteral, pot provoca reacţii adverse (reacţii anafilactice, boala serului, febră).
Cauza: albuminele se comportă ca un alergen.
Combaterea reacţiilor serice:
1.Utilizarea serurilor imune purificate şi concentrate
2.Utilizarea Ig (gamma-globulinelor)
3.Anamneza pentru recunoaşterea unei eventuale stări de sensibilizare
4.Efectuarea testării pentru depistarea sensibilităţii la serul heterolog. În acest scop se utilizează testul intradermic cu 0,1
ml din diluţia 1:100 a serului prescris.
Dacă testul este negativ (peste 20-30 minute reacţie locală până la 9 mm) se întroduce subcutan a doua doză de 0,1-0,5 ml
de ser nediluat. Peste 30-60 minute în lipsa reacţiei se recurge la întroducerea întregii doze curative.
Dacă testul este pozitiv (reacţie locală peste 10 mm) există pericolul reacţiilor alergice.
În acest caz se recurge la metoda de desensibilizare acută, propusă de Besredca. Ea constă în administrarea repetată, la
interval de 20 min., a dozelor crescânde din serul respectiv, la început diluat 1:100 subcutan, trecându-se treptat la ser
nediluat intramuscular.
Mecanismul: la întroducerea dozelor mici de ser se evită acumularea cantităţilor mari de substanţe biologic-active
(histamină, serotonină, bradikinină, etc), responsabile de declanşarea anafilaxiei.

În caz de necesitate administrarea serului va fi însoţită de administrarea preparatelor anti-histaminice sau serul va fi
administrat sub narcoză (scoaterea din funcţie a scoarţei cerebrale).
Cerinţele faţă de preparatele biologice ce conţin Ac:
Sterilitate
Inofensivitate
Apirogenitate
Aviditate înaltă
Activitate de lungă durată
 METODE DE STERILIZARE

/
MEDIILE DE CULTURĂ
TIPURI DE COLONII