REPRODUCCIN

SEXAJE DE EMBRIONES EN OVINO MEDIANTE PCR: APLICACIN A LA PRODUCCIN DE MACHOS MEJORANTES DEL ESQUEMA DE SELECCIN UPRA-OVIARAGN
CALVO, J.H.1.; MARTNEZ-ROYO, A.1; SNCHEZ, P.1; FOLCH, J.1 Y FANTOVA, E.2
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Unidad de Tecnologa en Produccin animal. CITA. Apdo. 727. 50080-Zaragoza. 2Carnes Oviaragn, S.C.L. Calle G, Mercazaragoza. C Cogullada s/n. 50014-Zaragoza

RESUMEN Dentro del esquema de mejora por prolificidad puesto en marcha por la UPRA- Carnes Oviaragn desde 1994, se contempla que la produccin de los machos a testar se realice a travs de un programa MOET. Con el objetivo de aumentar la eficiencia y la rentabilidad del MOET, se plante poner a punto el sexaje de los embriones previamente a su transferencia. El sexaje de embriones se realiz mediante amplificacin especfica por PCR de un fragmento de ADN del cromosoma Y (SRY gene; GenBank Acc. Z30265). Mediante cebadores especficos diseados en este locus, se amplifica un fragmento de 166 pares de bases en las muestras procedentes de animales o de embriones machos, mientras que en las muestras procedentes de hembras no se produce amplificacin, al carecer las mismas de este locus. Igualmente, y con el fin de incrementar la seguridad de la tcnica, y evitar la aparicin de falsos negativos, se ha llevado a cabo la puesta a punto de una PCR doble. Esta PCR consiste en una doble amplificacin de dos fragmentos de ADN mediante PCR, uno del gen CGN, gen estructural que se amplifica tanto en machos como en hembras, y por otra parte el fragmento especfico de ADN del cromosoma Y (SRY gene). Palabras clave: Sexaje, ovino, MOET, PCR. INTRODUCCIN La tcnica MOET consiste en superovular las hembras de alto valor gentico, inseminarlas con semen de machos adecuados y obtener los embriones, que son transferidos a otras hembras receptoras. Esta tecnologa permite explotar mejor el potencial gentico de los animales y acelerar la velocidad de seleccin (Nicholas, 1996). Por dicha razn, dentro del esquema de mejora por prolificidad puesto en marcha por la UPRA- Carnes Oviaragn desde 1994 se contempla que la produccin de machos que van a ser testados se realice a travs de un programa MOET. Desde los aos 80 se van realizando numerosos estudios para poner a punto la tcnica MOET en ovino. Sin embargo, el nmero de descendientes obtenidos en cada superovulacin sigue siendo relativamente bajo. Evidentemente, la tcnica sera ms rentable y efectiva si se pudiese conocer el sexo de los embriones obtenidos previamente a su transferencia. El presente trabajo ha sido realizado con este objetivo. MATERIAL Y MTODOS La extraccin de ADN se ha realizado a partir de diferente nmero de clulas procedentes de biopsias de mrulas y blastocistos, mediante el kit de extraccin BLOODCLEAN DNA Purification kit (Biotools). El sexaje de embriones se realiz mediante amplificacin especfica por PCR de un fragmento de ADN del cromosoma Y (SRY gene; GenBank Acc. Z30265; Griffiths y Tiwari, 1993). La amplificacin se realiz en un volumen final de 25 l conteniendo 5 pmol de cada cebador, 200 nM dNTPs, 2,2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM TrisHCl, 0,1% Triton X-100 y 0.8 U Taq polymerasa (Biotools). Se realizaron 35 ciclos de amplificacin con un paso de desnaturalizacin a 94C durante 30 s, de hibridacin a 55C durante 30 s, y de extensin a 72C durante 40 s. Previo a los ensayos con embriones se realizaron

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pruebas de sensibilidad mediante dilucin a partir de ADN genmico extrado de clulas sanguneas. Las diluciones utilizadas contenan 20 ng, 2 ng, y 200, 20, 2, 0,2 pg. Igualmente, con el fin de incrementar la seguridad y sensibilidad de la tcnica, se ha llevado a cabo la puesta a punto de una PCR doble en dos etapas. Esta PCR consiste en una doble amplificacin de dos fragmentos de ADN mediante PCR, uno del gen CGN (GenBank Acc. AY785290), gen estructural que se amplifica tanto en machos como en hembras, y por otra parte el fragmento especfico de ADN del cromosoma Y (SRY gene). La amplificacin se realiz en un volumen final de 20 l conteniendo 5 pmol de cada cebador, 200 nM dNTPs, 2,2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100 y 1,2 U Taq polymerasa (Biotools). Se realizaron 20 ciclos de amplificacin con un paso de desnaturalizacin a 94C durante 30 s, de hibridacin a 55C durante 25 s, y de extensin a 72C durante 45 s. La segunda etapa consisti en una reamplificacin del producto PCR resultante usando las mismas condiciones de amplificacin, con excepcin de que se realizaron 15 ciclos de amplificacin en un volumen final de 40 l. Como en el caso de la PCR simple se realizaron estudios de sensibilidad en las mismas condiciones que los descritos con anterioridad. RESULTADOS Y DISCUSIN Con la metodologa descrita se amplific un fragmento de 166 pares de bases en las biopsias procedentes de embriones machos, mientras que en las muestras procedentes de hembras no se produce amplificacin, al carecer las mismas de este locus. Los estudios de sensibilidad a partir de ADN genmico extrado de sangre mostraron un lmite mnimo de deteccin de 20 pg de ADN. En ensayos con diferente nmero de clulas procedentes de una biopsia de embriones se encontr que se puede detectar un embrin macho a partir de 5 clulas. A partir de una cantidad menor de clulas existe cierta probabilidad de aparicin de falsos negativos. Asimismo, para evitar la aparicin de falsos negativos y aumentar la sensibilidad de la tcnica se realiz la puesta a punto de una PCR doble, de forma que en muestras procedentes de hembras aparece una nica banda de 243 pb, mientras que en las muestras procedentes de machos aparecen dos bandas de 166 y 243 pb. Los estudios de sensibilidad a partir de ADN genmico extrado de sangre mostraron un lmite mnimo de deteccin de 0,2 pg de ADN, cantidad inferior al ADN contenido en una clula. CONCLUSIONES Nuestros resultados indican que es posible realizar el sexaje de embriones a partir de una clula, produciendo un dao mnimo al embrin, y en un tiempo de 5 horas, lo que permite mantener los embriones en cultivo y transferirlos frescos, sin necesidad de congelacin. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado a travs del proyecto CEDETI (pr 2004-611). REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS GRIFFITHS, R.; TIWARI, B. 1993. Primers for the differential amplification of the sexdetermining region Y gene in a range of mammal species. Molecular Ecology, 2(6), 405-406. NICHOLAS, F.W. 1996. Genetic improvement through reproductive technology. Animal Reproduction Science, 42, 205-214

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SEX DETERMINATION IN OVINE EMBRYOS BY PCR: PRODUCTION OF GENETIC IMPROVEMENT RAMS FOR THE SHEEP BREEDING IMPROVEMENT PROGRAMME OF UPRA-OVIARAGON SUMMARY An accurate, sensitive, and quick method for determining the sex of ovine embryos was developed using polymerase chain reaction (PCR) primers derived from an ovine-specific Ychromosome (SRY gene; GenBank Acc. Z30265), amplifying a 166 bp DNA fragment in male samples. To increase the sensibility and specificity of the technique a duplex PCR was carried out, using one pair of ovine-specific primers (CGN gene) and one pair of Y-chromosome-specific primers. CGN fragment provides an internal positive control for amplification. Key words: Sex determination, sheep, MOET, PCR.

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