METODE DE TESTARE A

SENSIBILITATII BACTERIILOR LA
ANTIBIOTICE
 Metode
Testul Kirby-Bauer

• Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI), Performance Standards for

Antimicrobial Susceptibility Testing
(https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/)
• https://www.youtube.com/watch?v=Il9vcYZlVs8
• https://www.youtube.com/watch?v=-TZn3ie-iFk&t=42s
• https://www.youtube.com/watch?v=Np87w5kCL-4
• https://www.youtube.com/watch?v=XhyMUHVbrlI

Metoda dilutiilor seriale

• Determinarea CMI (concentratie minima inhibitorie)

Metoda E-test (Epsilometer test)

 Metoda difuzimetrica Kirby-Bauer
– Metoda de testare in vitro a sensibilitatii bacteriilor bazata pe depunerea unor discuri,
impregnate cu antibiotic, pe mediu solidificat insamantat cu o cultura de bacterii
– In timpul incubarii, antibioticele vor difuza in mediu si vor inhiba cresterea bacteriilor
– Se realizeaza un gradient de antibiotic
– Difuzia antibioticului depinde de distanta fata de discul cu antibiotic
– Se vor evidentia 2 zone
■ O zona de inhibitie a cresterii
■ O zona de crestere
– Cu cat zona de inhibitie este mai mare cu atat este mai susceptibil la antibioticul testat
si CMI este mai mica
– In functie de diametrul critic se clasifica bacteriile in sensibile (S), rezistente (R) si
Intermediar sensibila (I) (tabele cu puncte critice standardizate)
 Metoda difuzimetrica Kirby-Bauer

– Categoria S = probabilitatea ca un antibiotic

(la doze uzuale) sa elimine infectia; CMI net
inferioara concentratiilor uzuale in vivo
– Categoria I = probabilitatea ca un antibiotic
sa fie eficient la administrare locala sau
sistemica la concentratii ridicate
– Categoria R = probabilitatea ca un antibiotic
sa nu produca eliminarea infectiei

Eficienta antibioticului este evidentiata in

diametrul zonelor de inhibitie
 Metoda difuzimetrica Kirby-Bauer

■ Rezultatele antibiogramei pot fi influentate de:

– Specia utilizata
– inoculare
– Densitatea inoculului (densitate mai mare > diametru de inhibitie
redus)
– Mediul de cultura: pH 7.2-7.4, compozitie, grosimea stratului – 4 mm
– Dispunerea discurilor (6 discuri in placi cu diametrul de 100 mm; 12
discuri in placi cu diametrul de 150 mm)
■ Se dispun discurile la 24 mm (pentru a Evita suprapunerea zonelor de
inhibitie)
■ Nu se dispun la marginea placii (cel putin 15 mm)
 Metoda difuzimetrica Kirby-Bauer
■ Pregatirea inoculului
– In mediu lichid
■ 3-5 colonii (obtinute dupa incubare timp de 18-24 ore)
■ Se introduc in mediu lichid, incubare la 35°C (2-6 ore) pana la obtinerea turbiditatii
echivalente standardului 0.5 McFarland (densitate optica de 0.125 la 550 nm)
– Resuspendarea coloniilor in ser fiziologic
■ Se repica coloniile (obtinute dupa incubare timp de 18 ore)
■ Se resuspenda in ser fiziologic pana la obtinerea turbiditatii echivalente standardului 0.5
McFarland (densitate optica de 0.125 la 550 nm); se ajusteaza turbiditatea cu o solutie de
NaCl
■ Pregatirea standardului 0.5 McFarland
– Se pastreaza la intuneric

https://microbenotes.com/mcfarland-standards/ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/E1041#/E1041
 Metoda difuzimetrica Kirby-Bauer
■ Inocularea placilor
– In minim 15 minute
– Cu un tampon steril se insamanteaza suspensia calibrata prin tehnica in “panza”
– Se aleg antibioticele recomandate de CSLI (ultima editie)
– Discurile cu antibiotic se dispun la temperature camerei
– Se distribuie pe placa cu o penseta sterila (presiune usoara) sau cu un dispenser
– Dupa 15 minute, placile se introduc in thermostat (35°C, timp de 16-18 ore sau 24
ore pentru a evidentia stafilococii rezistenti la meticilina-colonii foarte mici)
– Cu o rigla se masoara diametrele zonelor de inhibitie
– Apar colonii rezistente in zonele de inhibitie
■ Mutante rezistente
■ Culturi mixte
■ Contaminare
 Metoda difuzimetrica Kirby-Bauer
■ Controlul de calitate
– Utilizarea unor tulpini standard
– Se mentin la -70 °C
– Nu se dezgheata
– Se insamanteaza in mediu lichid
– Incubare la 35 °C, 18-20 ore
– Pasaj
– Testare antibiotic
– Diametrele zonelor de inhibitie se raporteaza la tabelele CLSI
 Diametrul zonei de inhibitie a cresterii si concentratia
minima inhibitorie pentru Staphylococcus spp.
■ Metoda difuzimetrica
– agar Mueller-Hinton (MHA)
– (MHA + 2% NaCl pentru oxacilina)
■ Mediu lichid
– cation-adjusted Mueller-Hinton broth
■ Pregatirea inoculului prin resuspendarea coloniilor in ser fiziologic cu obtinerea turbiditatii
echivalente standardului 0.5 McFarland (densitate optica de 0.125 la 550 nm)
■ Incubare la 35 ° C ± 2 ° C, pentru metoda difuzimetrica 16-18 ore sau 24 de ore, metoda in
mediu lichid 16 - 20 de ore; 24 de ore pentru oxacilina si vancomicina
■ Testarea la temperaturi peste 35 ° C poate sa nu detecteze stafilococi rezistenti la meticilina
(MRS)
■ Pentru controlul pozitiv:
– Staphylococcus aureus ATCC® 25923 (metoda difuzimetrica)
– Staphylococcus aureus ATCC® 29213 (MIC)
Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing
(https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/)
 Diametrul zonei de inhibitie a cresterii si concentratia
minima inhibitorie pentru Staphylococcus spp.

Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing (https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/)
 Metoda dilutiilor seriale
■ Testare cantitativa
– Masurarea activitatii antimicrobiene
– Se determina C.M.I. (Concentratia minima a unui agent
chimic ce inhiba cresterea)
– Se realizeaza initial dilutii ale solutiei stoc de antibiotic
– Se introduce suspensia bacteriana cu densitate 0.5
McFarland (1:5)
– Martor pozitiv (mediu de cultura si suspensie microbiana)
– Martor negativ (mediu de cultura)
– Incubare la 37 °C, timp de 24 ore
– Se determina CMI (µg/ml) (tubul fara crestere
microbiana)
– In tubul martor de crestere se observa cresterea
bacteriilor
– In tubul control de sterilitate nu se dezvolta cultura
– Se poate determina C.M.B = concentratia de antibiotic
care distruge 99.9 – 100 % bacterii
 Metoda E-test (Epsilometer test)
■ Benzi cu antibiotic la diferite concentratii
– Zona de inhibitie a cresterii apare sub forma de elipsa cu o suprafata dependenta de gradientul de
concentratie al antibioticului
– Zona de inhibitie va intersecta banda la o anumita concentratie si astfel se determina CMI

Figure 3. Agar gradient diffusion (Etest) analysis of

Staphylococcus aureus showing results for vancomycin (VA)
and teicoplainin (TP), two glycopeptides drugs. The MICs are
read off of the strip where the bottom portion of the ellipse
intersects with the strip (see white arrows). (VA MIC = 1 μg
ml−1, TP MIC = 1.5 μg ml−1)

https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-
molecular-biology/epsilometer-test