Lp 6.

Metode de izolare si identificare a acizilor nucleici si a componentelor lor structurale

ACIZI NUCLEICI
Consideraţii generale
1. Sunt biomacromolecule cu rol fundamental în păstrarea, transmiterea şi exprimarea caracterelor
ereditare.
2. Constituie purtătorii informaţiei genetice ce se trasmite din generaţie în generaţie.
3. Constituie baza moleculară a biosintezei proteinelor şi enzimelor, substanţe fundamentale ale materiei vii.

Componentele structurale ale acizilor nucleici

1. Baze azotate
Bazele azotate majore se clasifică în:
1. Baze purinice :
Purina Adenina (A, Ade) Guanina (G, Gua)
6-aminopurina 2-amino-6-oxopurina
N NH 2 O
N 1
6
5 7
8
2 4 9 N N
3
N HN
N N
H
N H2N N N
N H
H
2. Baze pirimidinice
Pirimidina Uracil (U, Ura) Timina (T, Thi) Citozina (C, Cit)
2,4-dioxipirimidina 5-metiluracil 2-oxo-4-aminopirimidina
O O NH 2
N 3
4
5

2 CH 3
1 6
HN HN N
N
O N O N O N
H H H
2. Pentoze
-Riboza (R) -2-deoxiriboza (dR)
CH 2 -OH OH CH 2-OH OH
O O
H H H H
H H H H
OH OH OH H

3. radicalul acidului fosforic -PO3H2 (fosforil)

- formează legături ester în poziţiile 2, 3, 5 ale ribozei şi 3, 5 ale deoxiribozei
- poate lega nuleotidele prin formarea legăturilor fosfodiester între
-OH din poziţia 3’ a pentozei dintr- un nucleotid si
-OH din poziţia 5’ din următorul nucleotid

NUCLEOZIDE = bază azotată + pentoză

• sunt considerate produşi ai hidrolizei parţiale a nucleotidelor
• ribonucleozidele există libere în cantităţi mici;
• deoxiribonucleozidele nu există libere.
În funcţie de natura pentozei din structură, ele pot fi:

 NUCLEOTIDE = Bază azotată + pentoză + radical fosforic

 sunt unităţile structurale de bază ale acizilor nucleici;
 rezultă prin hidroliza parţială a acizilor nucleici sub acţiunea nucleazelor;
 sunt esteri fosforici ai nucleozidelor
Gruparea fosfat apare în poziţiile 2’, 3’, 5’ din riboză şi 3’, 5’ din deoxiriboză.

 Rolul biochimic al nucleotidelor

• au rol de coenzime: UDP-Glucoza, CDP-Colina
• intră in structura unor coenzime (NAD+, FAD, CoA-SH)
• sunt mesageri secunzi ai acţiunii hormonilor (3’5’-AMPc, 3’5’-GMPc)
• trinucleotidele sunt precursori ai biosintezei acizilor nucleici
• participă la unele reacţii enzimatice din cadrul unor procese metabolice:
1
 – CTP în biosinteza fosfolipidelor
– UTP în biosinteza şi conversia glucidelor
• ATP este compusul universal macroergic al organismelor vii

 POLINUCLEOTIDE = ACIZI NUCLEICI

• Sunt macromolecule rezultate prin policondensarea unui număr mare de mononucleotide; între
mononucleotidele adiacente se stabilesc legături covalente 3’-5’ (3’,5’ fosfodiester).
• Pot fi:
– Polideoxiribonucleotide = Acidul deoxiribonucleic (ADN)
– Poliribonucleotide = Acidul ribonucleic (ARN)

• Proprietăţi:
ADN ARN
Baze azotate: A, G, C, T A, G, C, U
Pentoze: dR R
Numar nucleotide DNA > RNA
Lungimea lanţului (catenei)DNA > (exceptie unii virusi)
Structura dublu helix (2 catene) 1 catena

• Datorită caracterului acid, acizii nucleici se găsesc adesea legati cu proteine bazice sau neutre, constituind
ribonucleoproteide sau deoxiribonucleoproteide

 Funcţiile biologice ale ADN:

 reprezintă baza moleculară a conservarii şi transmiterii informaţiei genetice;
 asigură si controlează biosinteza proteinelor (enzimelor);
 în ADN, se află inscris programul genetic al dezvoltării, menţinerii şi perpetuării oricărui organism;
 asigură diferenţierea şi reglarea celulară şi constanţa replicării celulare;
 reprezintă baza moleculară a mutaţiilor genetice naturale sau induse.

 Izolarea ADN
Toate metodele existente pentru izolarea ADN din materiale biologice presupun liza celulei, urmatã de
deproteinizarea şi recuperarea ADN-ului; diferențele dintre ele sunt date de gradul de deproteinizare şi de masa molarã a
ADN-ului obținut. Ţesutul mãrunțit şi ĩnghețat ĩn azot lichid pentru obținerea unor fragmente ce pot fi digerate enzimatic
rapid, este introdus ĩntr-o soluție de proteinkinazã K şi dodecilsulfat de sodiu pânã când majoritatea proteinelor celulare
sunt degradate. Digeratul obținut este deproteinizat prin extracții succesive cu diferiți solvenți (fenol, cloroform, alcool
izoamilic), dupã care, ADN-ul este recuperat prin precipitare cu etanol, uscat şi resuspendat ĩn tampon.

 Identificarea ADN-ului
Principiul metodei: prin tratarea ADN-ului cu difenilaminã ĩn mediu acid, se formeazã un compus de culoare
albastrã, ce are un maxim de absorbție la 595nm. Ĩn mediu acid, deoxiriboza (ĩn formã aciclicã) este convertitã la beta-
levulin aldehidã care, cu difenilamina, formeazã un compus colorat. De menționat cã numai deoxiriboza nucleotidelor
purinice poate da aceastã reacție, concentrația produsului obținut reprezentând doar jumãtate din cantitatea de ADN din
probã.

Mod de lucru:
Ĩntr-o eprubetã, se mãsoarã 1ml soluție ADN şi 2ml soluție de difenilaminã. Amestecul se ĩncãlzeşte pe baie de
apã la fierbere, timp de 10 minute.
Prezența ADN se evidențiazã prin apariția unei colorații albastre, intensitatea culorii fiind proporționalã cu
concentrația de ADN din proba analizatã.

 Identificarea componentelor structurale ale acizilor nucleici

Produşii finali ai hidrolizei enzimatice a acizilor nucleici sunt bazele azotate purinice şi pirimidinice componente
şi pentozele corespunzãtoare – riboza din ARN şi deoxiriboza din ADN, conform schemei de mai jos:

2
 acizi nucleici (ADN, ARN)
H2O →  nucleaze (ribo- si deoxiribo nucleaza)
mononucleotide
H2O →  nucleotidaze
nucleozide + H3PO4
H2O →  nucleozidazele
baze azotate + pentoze
   
A G U T C riboza, deoxiriboza
Enzimele implicate fac parte din clasa hidrolaze; nucleazele sunt fosfodiesteraze, deoarece ele catalizeazã
scindarea hidroliticã a legãturilor 3’,5’ fosfodiester.
Ĩn laborator, hidroliza acizilor nucleici are loc ĩn mediu acid şi rezultã componentele lor structurale care pot fi
identificate prin reacții specifice.

 Identificarea bazelor azotate purinice

Principiul metodei: ĩn prezența ionilor de argint, bazele azotate purinice precipitã ca sãruri de argint, de culoare
brunã.
Mod de lucru:
Ĩntr-o eprubetã, se mãsoarã 1-2ml hidrolizat şi 0,5-1ml soluție azotat de argint. Apariția precipitatului brun indicã
prezența bazelor azotate purinice adenina şi guanina.

 Identificarea pentozelor
Reacția Bial diferențiazã pentozele de hexoze, reacția find specificã pentru pentoze. Ĩntr-o primã etapã a reacției,
pentozele, sub acțiunea HCl şi la cald, se deshidrateazã, transformându-se ĩn furfural. Apoi, acesta condenseazã cu
orcinolul, ĩn prezența ionilor Fe (III), rezultând un compus colorat ĩn albastru–verde.
 Rezultate: Ĩn prezența pentozei, reacția este pozitivã, rezultând o colorație verde. In prezența hexozei, reacția este
negativã. Aceastã reacție este utilizatã pentru dozarea colorimetricã a pentozelor dintr-un produs biologic şi pentru
dozarea pentozelor din acizii nucleici sau chiar a acizilor nucleici.
 Mod de lucru: 1ml soluție pentozã (riboza sau deoxiriboza) + 1ml HCl +1ml orcinol şi 1ml FeCl3; prezența pentozei
se evidențiazã prin apariția culorii verzi.

 Identificarea acidului fosforic

Principiul metodei: acidul fosforic reactioneaza cu molibdatul de amoniu in prezenta hidroxilaminei, cu formarea
unui compus numit fosfomolibdat de amoniu, de culoare albastra.
Mod de lucru:
La 0,5-1 ml hidrolizat de acizi nucleici se adaugâ 1 ml hidroxilaminã şi 0,5 ml de molibdat de amoniu (ĩn acid sulfuric).
Amestecul se omogenizeazã bine sau se ĩncãlzeşte şi, dupã 2-3 minute, se adaugã 0,5 ml soluție NaOH 16%. Apariția
culorii albastre indicã prezența acidului ortofosforic.