Semioquímicos Produzidos Por Bactérias Fitopatogênicas e Opiliões Brasileiros

I
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUMICA
SEMIOQUMICOS PRODUZIDOS POR BACTRIAS FITOPATOGNICAS E OPILIES BRASILEIROS
ARMANDO MATEUS POMINI
Dissertao de Mestrado
Orientadora Dra. Anita Jocelyne Marsaioli
Campinas So Paulo Fevereiro/2006
II FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUMICA DA UNICAMP
P771s
Pomini, Armando Mateus. Semioqumicos produzidos por bactrias fitopatognicas e opilies brasileiros / Armando Mateus Pomini. -- Campinas, SP: [s.n], 2005. Orientadora: Anita Jocelyne Marsaioli. Dissertao Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica. 1. Quorum-sensing. 2. Lactonas. 3. Opilies. 4. Defesa qumica. I. Marsaioli, Anita Jocelyne. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Qumica. III. Ttulo.
Ttulo em ingls: Semiochemicals produced by phytopathogenic bacteria and Brazilian opilionids Palavras-chaves em ingls: Quorum-sensing, Lactones, Harvestmen, Chemical defense rea de concentrao: Qumica Orgnica Titulao: Mestre em Qumica na rea de Qumica Orgnica Banca examinadora: Dra. Anita Jocelyne Marsaioli (Orientadora); Dra. Raquel Marques Braga (Titular); Dr. Roberto Gomes de Souza Berlinck (Titular); Dr. Paulo M. Imamura (Suplente); Dr. Lauro E. Soares Barata (Suplente); Dr. Wellington L. Arajo (Suplente) Data de defesa: 23/02/2006
DEDICATRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Armando e Shirley, minha irm Juliana e minha namorada Adriana.
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AGRADECIMENTOS Agradeo muito a Deus por iluminar meu caminho e me dar foras para perseverar. Aos meus pais Armando e Shirley e minha irm Juliana, pelo carinho e amor de toda uma vida e incentivos aos meus sonhos. minha namorada Adriana pelo companheirismo, amizade e amor que do minha vida, a cada dia, aquilo que faltava para me sentir completo. Aos seus pais Alceu e Marta e irms Valria e Priscila, o meu muito obrigado pela amizade e ateno. Profa. Anita pela orientao, compreenso e amizade ao longo destes dois anos. Muito obrigado por estar presente tanto dentro quanto fora do laboratrio, principalmente nas horas de maior necessidade. Ao meu tio Jos que sempre me acompanha e que me ajuda nas horas de dvida. Tata, Luana, Nena, Joel, Raquel, Dico, Adilson, Adriane, Rbis e todos os meus outros tios, tias, primos e primas, aos meus avs Jos (in memoriam) e Hilda, muito obrigado! Ao amigo Milton, pela amizade que se estende e pelos conhecimentos transmitidos, hoje essenciais. Aos professores da UEL Dra. Dalva, Dr. Csar e Dra. Terezinha, pelos bons tempos de convivncia, sempre lembrados. Aos colegas de laboratrio Lu Chen, Lucimar, Srgio, Isis, Marcela, Simone, Cabea, Letcia, Diego, Georgiana, Suzan, Milena e aos que j esto longe Fernando, Luiz Antnio, Luciana, Mirele, Adriana, Carla, Mariza e Eduardo. Muito obrigado pela amizade e auxlio. Agradeo tambm aos colaboradores Dr. Welington Arajo (Esalq), Dr. Gilson Manfio (Natura), Dr. Glauco Machado (IB-Unicamp) e Dra. Luzia
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Paccola-Meirelles (UEL), sem os quais este trabalho no poderia ter sido realizado. Aos colegas de outros laboratrios e instituies Tarcsio (UnB), Luiz e Luciana (USP), Marinaldo, Cntia, Umberto, Srgio, Ins, Fernando (Esalq), Mary ngela, Andr, Carlos, Lucas, Fabrcio, Liliane, Mayra, Gabriela, Regina, Philip (UEL) e Eugnia (UEL). Aos sempre amigos Dr. Ricardo Faria (UEL) e Geraldo (UEL), muito obrigado por tudo. Ao todo poderoso Instituto de Qumica, na figura de seus funcionrios e professores. Agradeo especialmente Snia, Soninha, Paula, Cludia e Daniel pela aquisio de diferentes espectros; Dona Maria, Juliana e Andria, pelos auxlios nos laboratrios e ao Everaldo pelos painis. Ao Pimpim pela ajuda com os gases, Seu Fontana e Cludio pelos servios de vidraria. Agradeo Bel pelas orientaes na CPG. Expresso minha gratido aos professores Dra. Raquel Braga, Dr. Antnio Herrera Braga, Dr. Paulo Imamura, Dr. Sebastio Fonseca, Dra. Eva Magalhes e Dr. Aderbal Magalhes, pelo conhecimento transmitido e agradvel convivncia. Agradeo Dra. Carol Collins pelas revises dos artigos. Agradeo ao Dr. Roberto Berlinck (USP So Carlos) por aceitar participar na banca de defesa desta dissertao, alm dos outros membros j citados. Agradeo Fapesp (processo 03/09357-7) pelo auxlio financeiro ao projeto e pela bolsa de estudos concedida. A todos que de uma forma ou de outra contriburam para minha formao ou que desejaram o bem em minha vida, que Deus lhes retribua em dobro.
Armando Mateus Pomini 23-02-2006
IX
Curriculum Vitae
1. Dados pessoais
Nome: Armando Mateus Pomini; Data de Nascimento: 19/06/1982; Nacionalidade: Brasileira; Cidade: Camb Estado do Paran; Filiao: Pai: Armando Pomini; Me: Shirley Cllia da Conceio Bailoni Pomini; Estado Civil: Solteiro; RG: 8257223-6 SESP PR. Endereo: Rua Planalto, 120. CEP 86191-240, Camb, Paran. armandopomini@bol.com.br 2. 2.1. Formao Acadmica Graduao em Qumica Bacharelado e Tecnolgica. Universidade Estadual de Londrina, UEL, Londrina, Paran (2000-2004). Ttulo da monografia: Sntese e teste antimicrobiano de asperfenamato, metablito isolado de Zeyhera digitalis (Bignoniaceae). Orientador: Dr. Milton Faccione. Bolsista da Coordenadoria de Pesquisa e Ps Graduao da UEL, CPG/UEL. Mestrado em Qumica Orgnica. Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Campinas, So Paulo (2004-2006). Ttulo da dissertao: Semioqumicos produzidos por bactrias fitopatognicas e opilies brasileiros. Orientadora: Dra. Anita Jocelyne Marsaioli. Bolsista da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP, 03/09357-7). Prmios e distines Lurea Acadmica, Universidade Estadual de Londrina (2004). Primeiro colocado, exame de admisso ao mestrado, Universidade Estadual de Campinas (2003). Primeiro colocado no Estado do Paran, Exame Nacional de Cursos (Qumica), MEC (2003). Artigos publicados em peridicos internacionais POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; SARIDAKIS, H. O. ; SCHIMITZ, V. O. ; BRAZ FILHO, R. A new method for asperphenamate synthesis and its antimicrobial activity evaluation. Natural Product Research, Reino Unido, 2006, no prelo. POMINI, A. M. ; ARAJO, W. L. ; MARSAIOLI, A. J. Structural elucidation and biological activity of acyl-homoserine lactones from the phytopathogen Pantoea ananatis Serrano 1928. Journal of Chemical Ecology, EUA, 2005, submetido. POMINI, A. M. ; MANFIO, G. P. ; ARAUJO, W. L. ; MARSAIOLI, A. J. Acyl-homoserine lactones from Erwinia psidii R. IBSBF 435T, a guava phytopathogen (Psidium guajava L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, EUA, v. 53, p. 6262-6265, 2005. MACHADO, G. ; POMINI, A. M. ; MARSAIOLI, A. J. ; CARRERA, P. C. Chemical defense in harvestmen (Arachnida, Opiliones): Do benzoquinone secretions deter invertebrate and vertebrate predators? Journal of Chemical Ecology, EUA, v. 31, p. 2519-2539, 2005. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZ FILHO, R. Synthesis of asperphenamate and aurantiamide benzoate for structural revision. Revista Latinoamericana de Qumica, Mxico, v. 32, p. 49-56, 2004. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZ FILHO, R. ; SOEIRA, L. S. ; ZANOLLI FILHO, L. A. . Synthesis and cytotoxicity of N-Benzoyl-S-phenylalaninol against Artemia salina and eight human tumor cell lines. Revista Latinoamericana de Qumica, Mxico, v. 32, p. 87-92, 2004. Trabalhos apresentados em eventos POMINI, A. M.; ARAJO, W. L.; MARSAIOLI, A. J. Caracterizao qumica das acilhomosserina lactonas produzidas pela bactria fitopatognica Pantoea ananatis S. CCT 6481. In: 4o Encontro Brasileiro de Ecologia Qumica, Piracicaba SP, Programao e Livro de Resumos p. 68, 2005. Painel 05.
2.2.
3. 3.1. 3.2. 3.3. 4. 4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.
4.6.
5. 5.1.
X
POMINI, A. M. ; MANFIO, G. P. ; ARAUJO, W. L. ; MARSAIOLI, A. J. Acil-homosserina lactonas: A qumica da comunicao bacteriana em Erwinia psidii IBSBF 435, um fitopatgeno da goiabeira. In: 28 Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, 2005, Poos de Caldas. 28a Reunio Anual da SBQ - Livro de Resumos, 2005. 5.3. POMINI, A. M. ; MACHADO, G. ; MARSAIOLI, A. J. Defesa qumica no opilio Goniosoma longipes (Arachnida: Opiliones). In: 28 Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, 2005, Poos de Caldas. 28a Reunio Anual da SBQ - Livro de Resumos, 2005. 5.4. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZ FILHO, R. Synthesis of asperphenamate and aurantiamide benzoate for structural revision. In: II Workshop de Biocatlise BIOCAT II, 2004, Campinas. BIOCAT II, 2004. 5.5. POMINI, A. M. Acil-homosserina lactonas: A qumica da comunicao bacteriana em Erwinia psidii, um fitopatgeno da goiabeira. In: 28a Reunio Anual da SBQ, 2005, Poos de Caldas. Exposio oral do trabalho na seo coordenada de Produtos Naturais "Raimundo Braz-Filho", 2005. 5.6. POMINI, A. M. ; FERREIRA, D. T. ; SARIDAKIS, H. O. ; BRAZ FILHO, R. ; SCHIMITZ, V. O. ; ISHIKAWA, N. K. ; FACCIONE, M. Sntese e teste antimicrobiano de asperfenamato, metablito isolado de Zeyhera digitalis (Bignoniaceae). In: 27 Reunio anual da SBQ e XXVI Congresso Latinoamericano de Qumica, 2004, Salvador. Livro de Resumos - Congresso Latinoamericano de Qumica, 2004. p. QO115. 5.7. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZ FILHO, R. ; SARIDAKIS, H. O. ; SCHIMITZ, V. O. Sntese e teste antimicrobiano de asperfenamato, metablito isolado de Zeyhera digitalis. In: Encontro Anual de Iniciao Cientfica, 2003, Foz do Iguau. EAIC 2003 Resumos, 2003. 5.8. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZFILHO, R. . Synthesis of (S)-Nbenzoylphenylalaninyl-(S)-phenylalaninol benzoate and its isomer (S)-N-benzoylphenilalanine(S)-2-benzamide-3-phenylpropyl ester - revised structure of natural product isolated from Zeyhera digitalis. In: X Encontro de Qumica da regio Sul, 2002, Joinville. Livro de Resumos - X SBQ Sul., 2002. 5.9. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. ; FERREIRA, D. T. ; BRAZFILHO, R. . Synthesis of (S)-Nbenzoylphenylalaninyl-(S)-phenylalaninol benzoate and its isomer (S)-N-benzoylphenilalanine(S)-2-benzamido-3-phenylpropyl ester - revised structure of natural product isolated from Zeyhera digitalis. In: 17 th Internacional symposium on Medicinal Chemistry, 2002, Barcelona. Prous Science, Adici-Adici., 2002. 5.10. POMINI, A. M. ; FACCIONE, M. Sntese de asperphenamate isolado de Zeyhera digitalis. In: XI EAIC - Encontro anual de iniciao cientfica, 2002, Maring. Publicado em CD/Room., 2002. 6. 6.1. Produto tecnolgico com registro Produo do hbrido entre as orqudeas Miltonia regnellii x Oncidium crispum. Registro na Royal Horticultural Society, Inglaterra, maio 2005. 5.2.
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Dissertao de Mestrado
Semioqumicos Produzidos por Bactrias Fitopatognicas e Opilies Brasileiros

Resumo Armando Mateus Pomini Profa. Dra. Anita Jocelyne Marsaioli
Este trabalho abordou dois tpicos relacionados comunicao qumica inter e intraespecfica. O primeiro tpico descreveu a produo de sinalizadores qumicos da classe das acil-homosserina lactonas (acil-HSLs) por bactrias Gram-negativas fitopatognicas, em mecanismos comunicativos conhecidos como quorum-sensing. Foram estudadas trs espcies: Erwinia psidii RODRIGUES, que causa a principal bacteriose da goiabeira no Brasil; Pantoea ananatis SERRANO, um fitopatgeno de distribuio mundial e que causa perdas em diversas culturas agrcolas e Pantoea agglomerans EWING & FIFE, isolada da doena da pinta branca do milho. O estudo propiciou a identificao de diversos metablitos da classe das acil-HSLs, sendo que os produtos majoritrios tiveram suas configuraes absolutas estabelecidas. Avaliou-se ainda a atividade biolgica de extratos, fraes e produtos sintticos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), em ensaios de expresso de enzimas -galactosidase. Trata-se de um trabalho pioneiro no Instituto de Qumica da Unicamp. Na segunda linha de pesquisas desenvolvida, o enfoque recaiu sobre alomnios produzidos por opilies (Arachnida: Opiliones) e utilizados em
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mecanismos de defesa qumica contra predadores e na defesa territorial. Estudou-se as secrees de defesa das espcies Goniosoma longipes ROEWER e Camarana flavipalpi SOARES, nativas do Estado de So Paulo. Este trabalho rendeu a identificao de benzoquinonas substitudas e um fenol, inclusive com a caracterizao de um produto natural indito (2-etil-3-metil-1,4benzoquinona).
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Semiochemicals Produced by Phytopathogenic Bacteria and Brazilian Opilionids

Abstract Armando Mateus Pomini Prof. Dr. Anita Jocelyne Marsaioli
This work encompasses two different topics, both related to the intra and interspecific chemical communication. The first part concerns to the production of acyl-homoserine lactones (acyl-HSLs), which are signalling substances of Gram-negative, plant pathogenic bacteria. These substances are responsible for their chemical communication, in a process known as quorumsensing. Three species were studied: Erwinia psidii RODRIGUES, which causes the most important bacteriosis in Brazilian guava crops; Pantoea ananatis SERRANO, a worldwide-spread phytopathogen, which causes crop losses in different plant species and Pantoea agglomerans EWING & FIFE, isolated from the white spot disease of maize in Brazil. This study allowed the identification of four acyl-HSLs, and the absolute configurations of the most abundant substances were established. The activities of the extracts, fractions and synthetic products were evaluated using the bioreporter Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), in -galactosidase expression assays. This is a pioneer work at the Chemistry Institute at Unicamp. The second research topic was on the opilionids allomones (Arachnida: Opiliones), employed in chemical defense mechanisms against predators and in territorial defense. The exudates of Goniosoma longipes ROEWER and Camarana flavipalpi SOARES, both native from So Paulo State (Brazil), were chemically characterized, allowing the identification of a known substituted
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benzoquinone and a phenol, including a new natural product (2-ethyl-3methyl-1,4-benzoquinone).
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ABREVIATURAS E SMBOLOS
Acil-HSL ACP CC CCD CDCl3 CG(quiral)-FID
Deslocamento qumico (em partes por milho, ppm) Acil-homosserina lactona Acyl carrier protein (Protena carreadora de acila) Cromatografia em coluna Cromatografia em camada delgada Clorofrmio deuterado Cromatografia gasosa acoplada a deteco por ionizao em chama e fase estacionria quiral
CG-EM
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
CoA COSY EMAR eV HMBC
Co-enzima A Correlation Spectroscopy (1H, 1H 3J) Espectrometria de massas de alta resoluo Eltron-volt Heteronuclear multiple bond correlation (correlao heteronuclear de 1H, 13C a mltiplas ligaes)
HSQC
Heteronuclear single quantum coherence (correlao heteronuclear de 1H, 13C a uma ligao)
Hz LB m/z NB NOE Ppm
Hertz Meio de cultivo Luria Bertani Relao massa por carga Meio de cultivo caldo nutriente Efeito Overhouser nuclear Parte por milho
XVI
RMN SAM TMS X-Gal
Ressonncia magntica nuclear S-adenosilmetionina Tetrametilsilano 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiranosdeo
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NDICE
Introduo geral CAPTULO 1 A QUMICA DA COMUNICAO BACTERIANA 1.1. Introduo 1.1.1. Quorum-sensing: Um mecanismo de regulao da expresso gnica 1.1.1.1. Mecanismo de regulao da expresso de bioluminescncia em V. fischeri 1.1.2. Quorum sensing no gnero Erwinia 1.1.3. Erwinia psidii, um fitopatgeno da goiabeira 1.1.4. Pantoea ananatis, um fitopatgeno de distribuio mundial 1.1.5. Pantoea agglomerans isolada da doena da pinta branca do milho 1.2. Objetivos 1.3. Resultados e discusso A qumica da comunicao bacteriana 1.3.1. Testes biolgicos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) 1.3.2. Caracterizao qumica das acil-HSLs produzidas por E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans 1.3.3. Anlise do branco para acil-homosserina lactonas por CG-EM 1.3.4. Sntese de acil-homosserina lactonas 1.3.5. Avaliao da atividade biolgica de fraes e produtos sintticos com o biossensor A. tumefaciens NTL4(pZLR4) 1.3.6. Determinao da configurao absoluta das acilhomosserina lactonas majoritrias identificadas 1.3.7. N-heptanoil-HSL, um metablito de rara ocorrncia 1.3.8. Avaliao da atividade biolgica das espcies P. ananatis e P. agglomerans contra folhas de milho (Zea mays) 1.3.9. Avaliao da presena de acil-homosserina lactonas em folhas de milho infectadas pela cepa P. agglomerans CBMAI 732 1.4. Concluses A Qumica da Comunicao Bacteriana 01 07 09 14 20 22 28 32 32 35 36 37 42 49 50 56
57 62 64
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XVIII
CAPTULO 2 DEFESA QUMICA EM OPILIES 2.1. Introduo 2.1.1. Gonisoma longipes Roewer e Camarana flavipalpi Soares (Gonyleptidae) 2.2. Objetivos 2.3. Resultados e Discusso 2.3.1. Estudo qumico da secreo de defesa do opilio C. flavipalpi (Laniatores: Gonyleptidae) 2.3.2. Estudo qumico da secreo de defesa do opilio G. longipes (Laniatores: Gonyleptidae) 2.4. Concluses Defesa Qumica em Opilies CAPTULO 3 CONCLUSES FINAIS
71 73 77 79 80 80 84 92 93
CAPTULO 4 PARTE EXPERIMENTAL 4.1. Materiais e Equipamentos 4.1.1. Equipamentos 4.1.2. Meios de cultivo para microrganismos 4.1.3. Reagentes e solventes 4.1.4. Cepas bacterianas 4.2. Bioensaio com Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) in vivo 4.3. Avaliao da atividade biolgica com extratos dos meios de cultivo de E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans 4.4. Cultivo das bactrias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans para extrao de acil-homosserina lactonas 4.5. Deteco de acil-homosserina lactonas por CG-EM 4.6. Anlise do branco para acil-homosserina lactonas identificadas por CG-EM 4.7. Sntese de acil-homosserina lactonas 4.8. Co-injeo de produtos naturais e sintticos em CG-EM 4.9. Avaliao da atividade biolgica de produtos sintticos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) 4.10. Determinaes de configuraes absolutas de produtos naturais por CG-FID com fase estacionria quiral 4.11. Avaliao da atividade patognica das cepas P. ananatis CCT 6481T e P. agglomerans CBMAI 732 em folhas jovens de milho (Zea mays)
97 99 99 102 103 103 105 107 108 109 112 112 117 117 117 118
XIX
4.12. Avaliao da presena de acil-homoserina lactonas em folhas de milho infectadas pela cepa P. agglomerans CBMAI 732 e folhas de milho provenientes de campo 4.13. Determinao da constituio qumica da secreo de defesa dos opilies Goniosoma longipes e Camarana flavipalpi REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ANEXOS: ESPECTROS ANEXOS: ARTIGO
119
121
125 137 165
INTRODUO GERAL
____________________ INTRODUO GERAL
INTRODUO GERAL
INTRODUO GERAL
A utilizao de substncias qumicas como carreadoras de informaes entre organismos de uma mesma espcie ou at mesmo entre espcies
diferentes amplamente difundida e pode ser encontrada em vertebrados, invertebrados, plantas e microrganismos. Estes mecanismos de comunicao so mediados por substncias denominadas semioqumicos (do Grego simeon, sinal), que podem estar envolvidos em atividades comportamentais diversas como procura por alimento, reproduo, sinal de alerta na presena de predadores e como substncias de defesa qumica, por exemplo (Mori, 1998). As substncias semioqumicas so divididas em duas grandes classes, os feromnios e aleloqumicos. Feromnios so substncias secretadas por um organismo com o objetivo de causar uma reao especfica em outro indivduo da mesma espcie. As finalidades mais comuns dos feromnios so a atrao para fins reprodutivos, marcao territorial e sincronizao de atividades em populaes, incluindo disperso e agregao (Nordlund e Lewis, 1976). As substncias aleloqumicas so aquelas empregadas na transmisso de informaes entre espcies distintas, pertencentes ou no ao mesmo nvel trfico. Os aleloqumicos so divididos em trs sub-grupos (Nordlund e Lewis, 1976):
1. Alomnio: substncia qumica produzida por um organismo que, quando em contato com um indivduo de outra espcie no contexto natural, provoca no receptor uma reao comportamental ou fisiolgica favorvel ao organismo emissor. Esta classe inclui uma grande
INTRODUO GERAL
variedade de substncias, incluindo venenos e secrees de repelncia em animais e plantas.
2. Cairomnio: substncia qumica produzida por um organismo que, quando em contato com um indivduo de outra espcie no contexto natural, provoca no receptor uma reao comportamental ou fisiolgica favorvel ao organismo receptor, mas no ao organismo emissor. Podese citar nesta classe as substncias emitidas por uma presa que atraem o predador.
3. Sinomnio: substncia qumica produzida por um organismo que, quando em contato com um indivduo de outra espcie no contexto natural, provoca no receptor uma reao comportamental ou fisiolgica favorvel a ambos organismos, receptor e emissor. Isto ocorre por exemplo durante a polinizao, onde a flor libera ao meio substncias qumicas capazes de atrair o polinizador; a flor ganha em seu processo reprodutivo e o polinizador recompensado com essncias, leos florais e nctar.
O presente trabalho se concentrou em dois tpicos, ambos relacionados com os semioqumicos. Um destes a atrao feromonal intraespecfica em bactrias. Atualmente, sabe-se que estes microrganismos so capazes de coordenar diversas atividades biolgicas, como a sntese de metablitos secundrios e exoenzimas, atravs da liberao ao meio de substncias de auto-percepo. Utilizando-se destes mecanismos comunicativos as bactrias conseguem fazer com que toda a populao inicie atividades patognicas de modo sincronizado, constituindo assim um artifcio de sobrevivncia
4
INTRODUO GERAL
extremamente importante. O segundo tpico versar sobre alomnios, especificamente as substncias qumicas produzidas pelas glndulas de defesa de aracndeos conhecidos como opilies; estes animais utilizam-se de alomnios, por exemplo, na defesa territorial, defesa de ovos e contra predadores.
________________________CAPTULO 1 A QUMICA DA COMUNICAO BACTERIANA
____________________________ CAPTULO 1
CAPTULO 1. A QUMICA DA COMUNICAO BACTERIANA
1.1. Introduo
A comunicao entre organismos vivos, que outrora pensava-se ser restrita ao mundo macroscpico, sabe-se hoje ser amplamente difundida at no mundo microscpico. Assim, as bactrias no existem como clulas solitrias, mas sim como microrganismos coloniais que exploram sistemas elaborados de comunicao intercelular para facilitar sua adaptao s mudanas das condies ambientais (Whitehead et al., 2001). Os microrganismos so constantemente sujeitos a diversos estmulos ambientais. Tais estmulos englobam alteraes de temperatura, osmolaridade, pH, disponibilidade de nutrientes, presena de substncias qumicas que interferem em seu desenvolvimento e at mesmo a presena de outros organismos. Desta forma, as bactrias tm desenvolvido ao longo de milhares de anos de evoluo mecanismos adaptativos em resposta estas flutuaes do ambiente, bem como nas interaes ecolgicas com outras espcies, seja de modo simbitico ou at mesmo patognico (Whitehead et al., 2001). Recentemente, foi dado um passo importante na elucidao dos mecanismos de percepo e resposta empregados pelas bactrias. Esta linguagem apresenta a forma de sinais qumicos secretados a partir das clulas e que podem induzir diversas alteraes na fisiologia bacteriana. Ao contrrio do que se imaginava, no se trata de um fenmeno raro: a auto-percepo (quorum sensing) um processo altamente difundido entre os mais diversos gneros de bactrias, mostrando sua habilidade em perceber e responder presena de populaes microbianas vizinhas (Whitehead et al., 2001).
O processo quorum-sensing se baseia na produo de uma substncia sinalizadora de baixa massa molecular, cuja concentrao extracelular est relacionada com a densidade populacional do microrganismo que a produziu. A substncia sinalizadora pode ser detectada pelas clulas e isto permite a populao como um todo iniciar uma ao coordenada, uma vez atingida uma densidade populacional crtica. Isto pode ser de vital importncia, por exemplo, em infestaes patognicas, onde a produo de fatores de virulncia prematuramente (em baixas densidades celulares) pode alertar os sistemas de defesa do hospedeiro (Fast, 2003). Diversas classes qumicas de substncias sinalizadoras foram
identificadas em bactrias. De forma geral, elas podem ser divididas nas seguintes categorias: (1) aminocidos e peptdeos de baixa massa molecular, empregados principalmente em bactrias Gram-positivas e (2) derivados de cidos graxos, freqentemente utilizados por bactrias Gram-negativas (Whitehead et al., 2001). Dentre as bactrias Gram-negativas, as substncias sinalizadoras melhor caracterizadas so as acil-homosserina lactonas (acil-HSLs). A estrutura genrica destes metablitos uma lactona (poro homosserina) ligada uma cadeia acila saturada ou insaturada, que pode conter substituintes (carbonila ou hidroxila na posio 3) (Figura 1).
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O O (CH2)n NH O (CH2)n O O NH O
OH (CH2)n
O O NH O (CH2)n (CH2)n
O O NH O
O (CH2)n (CH2)n
O O NH O (CH2)n
OH (CH2)n
O O NH O
Figura 1. Acil-homosserina lactonas. Substituies na cadeia acila, como carbonila ou hidroxila na posio 3, alm de insaturaes, so comuns.
O primeiro relato de controle da expresso fenotpica por acil-HSLs foi reportado na bactria Vibrio fischeri (Eberhard et al., 1981). Quando esta bactria se desenvolve livremente na gua do mar, no se observa a formao de luz (bioluminescncia). No entanto, quando crescida at altas concentraes celulares, V. fischeri produz bioluminescncia com luz azulesverdeada. Normalmente, este microrganismo encontrado em interaes simbiticas com peixes e moluscos, especialmente com a espcie Euprymna scolopes (Figura 2). Euprymna scolopes um pequeno molusco que habita as guas rasas dos recifes de corais no arquiplago havaiano. Trata-se de um predador de hbitos noturnos, que se beneficia do fenmeno de bioluminescncia gerada pela bactria V. fischeri para confundir suas presas. O animal possui um rgo
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especfico onde a bactria se desenvolve at altas concentraes celulares, o que leva formao de luz. A bactria se beneficia na relao simbionte, uma vez que recebe do molusco nutrientes que propiciam o seu desenvolvimento (Graft e Ruby, 1998). A gerao de bioluminescncia pela espcie V. fischeri ocorre atravs da ao de uma enzima denominada luciferase, que catalisa a reao de oxidao de aldedos via flavina mononucleotdeo reduzida (FMNH2) (Hastings, 1978). Os produtos so principalmente cidos graxos de cadeia longa, gua e um excesso de energia livre que emitida ao meio sob a forma luminosa, conforme a equao abaixo:
Luciferase
O2 + RCHO + FMNH2
RCOOH + FMN + H2O + hv
Tanto a sntese quanto a atividade da luciferase podem ser ativadas ou desativadas pela bactria atravs da secreo de um sinalizador, que induz a sntese de luciferase quando sua concentrao atinge um determinado valor crtico. Inicialmente, a identificao qumica deste sinalizador foi dificultada pela baixa concentrao presente e pela complexidade do meio de cultivo empregado para o crescimento da bactria. Assim, o isolamento do metablito tornou-se possvel com a utilizao de um grande volume de meio de cultivo (6 litros) e com o uso de uma cepa super-produtora de luminescncia que conseqentemente forneceu uma maior concentrao da substncia
sinalizadora (Vibrio fischeri MJ-1). A purificao bioguiada (por testes de bioluminescncia com cepas mutantes) levou elucidao estrutural desta substncia, cuja anlise de dados espectroscpicos (RMN de
1
H,
espectroscopia no infravermelho e espectrometria de massas) conduziram N(3-oxo-hexanoil)-homosserina lactona (Figura 3), cuja ocorrncia foi
12
confirmada pela comparao de seus dados espectroscpicos com um padro sinttico (Eberhard et al., 1981).
Figura 2. Espcie hawaiana de molusco (Euprymna scolopes) com a qual a bactria V. fischeri interage simbioticamente. direita observa-se na penumbra uma bioluminescncia azulada no animal.1
O O NH O
O O NH O
N-(3-oxo-hexanoil)-HSL
N-octanoil-HSL
Figura 3. Substncias de comunicao bacteriana produzidas por V. fischeri.
Imagens
retiradas
de
http://radio.weblogs.com/0105910/images/bobtailsquid.jpg
http://digilander.libero.it/atreliu/relazioni/images/fotobatteri/Euprimnya. Acesso em 17 de novembro de 2004.
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1.1.1. Quorum-sensing: Um mecanismo de regulao da expresso gnica
A utilizao de processos comunicativos mediados por acil-HSLs permite espcie V. fischeri regular a expresso de um fator fenotpico (bioluminescncia) muito importante em suas relaes ecolgicas e para a sobrevivncia da espcie. Estudos mostraram que o processo de comunicao bacteriana , ao nvel molecular, um mecanismo de regulao da expresso gnica. Um genoma bacteriano tpico contm aproximadamente 4000 genes. Porm, apenas uma frao destes genes expressa num dado momento no ciclo de vida celular. Alguns produtos gnicos tm funes que demandam sua presena em quantidades muito grandes. Por exemplo, a sntese de enzimas relacionadas com as vias metablicas centrais (como o ciclo de Krebs) extremamente ativa em todo o perodo de desenvolvimento bacteriano e os genes que codificam estas protenas possuem uma alta taxa de transcrio. Estes genes so freqentemente referidos como genes da economia domstica. A expresso gnica constante denominada constitutiva (Lehninger et al. 1995). Outros genes, porm, so transcritos com pequena freqncia, como por exemplo aqueles que codificam a sntese de enzimas que reparam leses raras no DNA. Produtos gnicos, que aumentam sua concentrao sob circunstncias moleculares prescritas, so referidos como induzveis e o processo de aumento da expresso do gene chamado de induo. Contrariamente, os produtos gnicos que diminuem sua concentrao em resposta a um sinal molecular so referidos como reprimveis e o decrscimo na expresso gnica chamado de represso (Lehninger et al. 1995).
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As necessidades para um certo produto gnico podem tambm se alterar com o tempo. A necessidade das enzimas em certas vias metablicas pode crescer ou diminuir, medida que as fontes de alimentos se alteram ou se esgotam. Portanto, extremamente importante para o desenvolvimento bacteriano regular quais genes sero expressos e fazer com que estes sejam expressos no momento certo (Lehninger et al. 1995). A regulao da expresso gnica um componente crtico na regulao do metabolismo celular. Dado o alto custo da sntese de protenas, a regulao da expresso gnica essencial para a clula fazer o melhor uso da energia disponvel (Lehninger et al. 1995). Regular a concentrao de uma protena celular envolve um equilbrio concatenado de muitos processos. H pelo menos seis pontos potenciais onde a quantidade de protena pode ser regulada:
1. A sntese do transcrito primrio de mRNA; 2. O processamento ps-transcrio do mRNA; 3. A degradao do mRNA; 4. A sntese protica (traduo); 5. Modificaes na protena aps a traduo e 6. Degradao da protena.
A concentrao de uma determinada protena controlada por mecanismos reguladores em qualquer um ou em todos estes pontos. Porm, de todos estes pontos, a regulao ao nvel da iniciao da transcrio a melhor documentada e a mais comum. Isto pela simples razo de ser o primeiro passo da via. Desta forma, biossnteses desnecessrias podem ser interrompidas no incio, sem que ocorra um gasto energtico elevado.
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A transcrio efetuada por uma enzima denominada RNA polimerase. A RNA polimerase liga-se ao DNA e inicia a transcrio em stios especficos, chamados de promotores. Os promotores se localizam muito prximos da posio onde a sntese do RNA comea a partir do DNA molde. O incio da transcrio regulado pela interao da RNA polimerase com o seu promotor. A transcrio nos promotores de muitos genes que no caem na categoria da econmica domstica regulada por sinais moleculares e seus respectivos complexos formados com protenas reguladoras (Lehninger et al. 1995). Pelo menos trs tipos de protenas regulam o incio da transcrio pela RNA polimerase:
1. Fatores de especificidade alteram a especificidade da RNA polimerase para um certo promotor ou conjunto de promotores. 2. Repressores ligam-se a um promotor, bloqueando o acesso da RNA polimerase ao promotor. 3. Ativadores ligam-se prximos de um promotor, aumentando as interaes RNA polimerase-promotor.
Nos mecanismos de comunicao bacteriana mediados por acil-HSLs, as protenas repressoras e ativadoras so as classes mais importantes de protenas reguladoras. Os repressores ligam-se a stios especficos no DNA. Nos procariotos os stios de ligao para os repressores so denominados operadores. Stios operadores esto geralmente prximos e freqentemente se sobrepem ao promotor, de forma tal que a ligao da RNA polimerase, ou a sua movimentao ao longo do DNA aps a sua ligao, seja bloqueada toda vez que o repressor esteja presente. A regulao por meio de uma protena
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repressora que se liga ao DNA e bloqueia a transcrio referida como regulao negativa. A ligao do repressor regulada por um sinal molecular, usualmente uma pequena molcula especfica que se liga e induz uma alterao conformacional no repressor. A interao entre o repressor e a molcula sinal pode levar tanto a um aumento quanto a uma diminuio na transcrio. Em alguns casos a alterao conformacional resulta na dissociao de um repressor ligado ao operador no DNA. A iniciao da transcrio pode, ento, prosseguir sem interrupes. Em outros casos a interao entre um repressor inativo e a molcula sinal fora o repressor se ligar ao operador, impossibilitando a transcrio (Figura 4) (Lehninger et al. 1995). Os ativadores fornecem um contraponto molecular aos repressores. A regulao mediada por um ativador chamada de regulao positiva. Ativadores ligam-se a stios adjacentes a um promotor e aumentam a ligao e a atividade da RNA polimerase naquele promotor. Os stios de ligao para os ativadores so freqentemente encontrados prximos aos promotores. A transcrio nestes genes praticamente negligencivel na ausncia do ativador. Algumas vezes, o ativador est ligado normalmente ao DNA e dissocia-se quando se liga molcula sinal, freqentemente uma molcula pequena especfica ou uma outra protena. Quando ligada ao DNA, a protena ativadora facilita a ligao da RNA polimerase e aumenta a velocidade da iniciao da transcrio. Em outros casos o ativador no se liga ao DNA at que ele tambm se ligue a uma molcula sinal (Figura 5) (Lehninger et al. 1995).
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a.
b.
Figura 4. Mecanismos de regulao negativa. a. Sinal molecular promove a sada do repressor do stio operador e incio da transcrio. b. Sinal molecular promove a ligao do repressor no stio operador, impedindo a transcrio (Lehninger et al. 1995).
a.
b.
Figura 5. Mecanismos de regulao positiva. a. Sinal molecular promove a sada do ativador do seu stio de ligao, reprimindo a transcrio. b. Sinal molecular promove a ligao do ativador no seu stio de ligao, estimulando a transcrio (Lehninger et al. 1995).
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As bactrias possuem um mecanismo geral simples para a coordenao da regulao de genes cujos produtos esto envolvidos em processos relacionados, como por exemplo a expresso de um fator fenotpico. Este mecanismo se baseia no agrupamento de genes em seqncia no cromossomo, o que leva a sua transcrio conjunta, gerando um mRNA que contm as seqncias transcritas de mltiplos genes. Estes mRNAs so denominados policistrnicos. O promotor nico requerido para iniciar a transcrio do agrupamento o nico ponto onde a expresso dos genes regulada. O agrupamento dos genes, o promotor e as seqncias adicionais que funcionam na regulao so chamados no seu conjunto de um operon. So comuns operons que incluam de 2 a 6 genes transcritos como uma unidade; alguns operons contm 20 genes ou mais (Lehninger et al. 1995; Berg et al., 2002).
Figura 6. Um operon. Os genes A, B e C so transcritos num mRNA nico (policistrnico). Seqncias reguladoras tpicas incluem os stios de ligao para protenas que ou ativam ou reprimem a transcrio a partir do promotor (Lehninger et al., 1995).
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1.1.1.1. Mecanismo de regulao da expresso de bioluminescncia em V. fischeri
Ao nvel molecular, a atuao das acil-HSLs em V. fischeri pode ser explicada da seguinte maneira: inicialmente, um gene luxI codifica uma enzima LuxI responsvel pela sntese de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL; medida que a concentrao desta substncia atinge nveis superiores, ela passa a interagir com o receptor LuxR (codificado inicialmente por um gene luxR). O complexo (acil-HSL)-LuxR passa a controlar atravs de um mecanismo de regulao positiva (Figura 5, b) a transcrio dos genes luxA e luxB, que codificam a sntese das duas subunidades da enzima luciferase. Alm disso, outros genes (luxC e luxE, que codificam a sntese de um complexo multienzimtico responsvel pela sntese do substrato aldedo e luxG, que provavelmente codifica a sntese de uma flavina redutase) tambm esto sob o controle do receptor LuxR. Alm de iniciar a sntese de luciferase, a substncia sinalizadora N-(3-oxo-hexanoil)-HSL tambm induz sua autoproduo, de maneira progressiva (Figura 7). Portanto, em V. fischeri os genes envolvidos na expresso de bioluminescncia esto reunidos num operon, o luxICDABEG. Observaes tm mostrado que a concentrao crtica de N-(3oxo-hexanoil)-HSL necessria para o incio da produo de bioluminescncia est na ordem de nanomolares (Eberhard et al, 1981; Engebrecht e Silverman, 1984). Os avanos nos estudos de quorum-sensing em V. fischeri mostraram ainda a ocorrncia de uma segunda molcula sinalizadora, a N-octanoil-HSL (Figura 3) (Kuo et al, 1994). A descoberta desta molcula permitiu reconhecer uma segunda forma de interao com o receptor LuxR: acredita-se que, em baixas densidades celulares, a substncia N-octanoil-HSL compete com a N20
(3-oxo-hexanoil)-HSL pelo receptor LuxR, reduzindo a ativao deste receptor e assim prevenindo a emisso de bioluminescncia prematura. A substncia N-octanoil-HSL sintetizada por uma protena AinS, que codificada por um gene ainS que no possui identidade com luxI. Acredita-se que AinS constitua, portanto, uma nova classe de protenas sintetizadoras de acil-HSL. Este fenmeno de modulao da bioluminescncia mostrou que a prpria bactria interfere quimicamente no processo coordenado pela N-(3oxo-hexanoil)-HSL (Hanzelka et al, 1999; Gilson et al., 1995).
Figura 7. Modo de ao da N-(3-oxo-hexanoil)-HSL em V. fischeri. a. em baixas densidades celulares, a transcrio dos genes para bioluminescncia
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(luxICDABEG) fraca e insuficiente para emisso de luz, devido aos baixos nveis de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL. b. em altas densidades celulares, uma concentrao crtica da substncia sinalizadora alcanada; ela se liga ao receptor LuxR e estimula a transcrio de luxICDABEG, levando emisso de luz (Whitehead et al., 2001).
A produo da substncia sinalizadora N-(3-oxo-hexanoil)-HSL diretamente proporcional ao nmero de indivduos numa populao de V. fischeri. Assim, o operon luxICDABEG s ser expresso quando uma concentrao adequada da substncia sinalizadora estiver presente, o que definido pela constante de complexao entre a substncia sinalizadora e a protena receptora LuxR. Isto garante que a expresso da bioluminescncia s ocorrer em altas concentraes celulares, o que se reflete diretamente numa maior intensidade da luz emitida. Isto evita que a energia celular seja gasta expressando luminescncia em baixas densidades celulares, onde a intensidade luminosa seria pequena e inadequada (Whitehead et al., 2001).
1.1.2. Quorum sensing no gnero Erwinia
O gnero Erwinia constitudo por bactrias Gram-negativas que atuam como fitopatgenos. A doena da podrido mole causada por estes patgenos, que atinge uma grande diversidade de hospedeiros, caracterizada por uma degradao extensiva dos tecidos atravs de enzimas que so fundamentais para a sobrevivncia dos fitopatgenos (Pirhonen et al., 1993). A importncia das exoenzimas demonstrada pela grande variedade enzimtica encontrada, por exemplo, na espcie E. carotovora subsp. carotovora (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum). As enzimas
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degradadoras incluem pectato liase (Pel), pectina liase (Pnl), poligalacturonase (Peh), celulase (Cel) e proteases (Prt) (Py et al., 1998; Thomson et al., 1999). Em E. carotovora, a produo de enzimas degradadoras da parede celular das plantas um processo regulado e que depende de estmulos tanto metablicos quanto ambientais. Alm disso, esta espcie produz um antibitico -lactmico, carbapenem (cido 1-carbapen-2-en-3-carboxlico, Figura 8), caracterizado por uma potente atividade antibacteriana, alm de ser capaz de inibir a ao de -lactamases. Este antibitico constitui tambm um dos fatores de virulncia desta espcie (Axelrood et al., 1988). O controle da produo de carbapenem est condicionado presena de um sinalizador, a N-(3-oxo-hexanoil)-HSL. Este metablito foi isolado a partir de culturas de E. carotovora, e identificado com base em dados de espectrometria de massas e espectroscopia de ressonncia magntica nuclear de hidrognio. A comparao dos dados espectroscpicos do produto natural com os do produto sinttico confirmou a estrutura da substncia. Alm disso, a sntese dos enantimeros (R) e (S) permitiu comparar os dados de espectroscopia de dicrosmo circular com o produto natural, indicando que este se tratava do enantimero (S) (Bainton et al., 1992). O estudo de diversas cepas mutantes no produtoras de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL demonstrou a correlao entre sua concentrao crtica no meio e a sntese de carbapenem, mostrando ainda que o enantimero (S) era muito mais eficiente na ativao da sntese do antibitico que o enantimero (R) (Chhabra et al., 1993). Testes biolgicos em tubrculos de batata mostraram ainda que cepas mutantes de E. carotovora, incapazes de produzir a N-(3-oxo-hexanoil)-HSL, no colonizavam com sucesso os tecidos da planta. Porm, a administrao externa da substncia sinttica N-(3-oxo-hexanoil)-HSL propiciava a ativao da sntese de exoenzimas e conseqentemente a virulncia da cepa. Assim, o
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acmulo deste metablito no meio tambm induz a produo de enzimas degradadoras (Figura 9) (Jones et al., 1993).
N O COOH cido (5R)-carbapen-2-en-3-carboxlico
Figura 8. O antibitico cido (5R)-carbapen-2-en-3-carboxlico produzido em E. carotovora sob controle do sinalizador N-(3-oxo-hexanoil)-HSL.
Figura 9. Avaliao da atividade biolgica de cepas de E. carotovora em batata. a. Cepa selvagem E. carotovora subsp. carotovora SCRI193,
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mostrando necrose dos tecidos vegetais. b. Cepa mutante Rex-, incapaz de produzir a N-(3-oxo-hexanoil)-HSL, com atividade patognica reduzida. c. Restaurao da virulncia da cepa Rex- mediante co-inoculao com o produto sinttico N-(3-oxo-hexanoil)-HSL. d. Branco com o produto sinttico N-(3-oxo-hexanoil)-HSL (Bainton et al., 1992).
Metablitos secundrios produzidos por plantas podem influenciar na comunicao bacteriana em Erwinia carotovora. Demonstrou-se que furanonas halogenadas produzidas pela alga marinha Delisea pulchra so capazes de antagonizar a ao da N-(3-oxo-hexanoil)-HSL, inibindo a produo de enzimas e antibitico carbapenem (Figura 10) (Manefield et al., 2001).
H Br O OH O Br
Figura 10. Furanona halogenada produzida por D. pulchra, capaz de inibir o processo de comunicao bacteriana em E. carotovora.
Outra bactria importante sob o ponto de vista econmico a Erwinia stewartii. Esta espcie responsvel pela doena da murcha bacteriana do milho (conhecida como Stewarts wilt). Nesta bactria, identificou-se nos seus caldos de crescimento a mesma substncia sinalizadora produzida por E.
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carotovora, a N-(3-oxo-hexanoil)-HSL. Demonstrou-se ainda que esta substncia responsvel pelo controle em quorum-sensing da biossntese de um polissacardeo extracelular (EPS), um fator fenotpico responsvel pela proteo das clulas e que contribui para a virulncia da espcie. Este EPS forma uma barreira volta da clula bacteriana, protegendo-a dos mecanismos de defesa do hospedeiro. Alm disso, o EPS obstrui a circulao de gua pelo sistema vascular do milho, causando necrose e murcha durante a fase sistmica da infeco. A avaliao da atividade biolgica de necrose em folhas de milho com cepas no produtoras de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL e EPS demonstrou uma grande reduo da virulncia. Porm, o crescimento do mutante no produtor de EPS na presena de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL sinttica propiciou a retomada da atividade biolgica, sendo mais uma prova da importncia desta substncia na patogenicidade de E. stewarti. (Figura 11) (Beck von Bodman et al., 1995). Erwinia chrysanthemi (Pectobacterium chrysanthemi) uma bactria fitopatognica que causa uma doena semelhante quela produzida por E. carotovora (podrido mole). Esta espcie se caracteriza por produzir uma grande variedade de exoenzimas degradadoras, como celulases, proteases e principalmente, pectato liases. O estudo qumico dos caldos de cultivo desta bactria mostraram que ela produz trs acil-homosserina lactonas: N-(3-oxohexanoil)-HSL (identificada previamente em E. carotovora), N-hexanoil-HSL e N-decanoil-HSL. Porm, demonstrou-se que nenhuma destas acilhomosserina lactonas era capaz de controlar completamente a biossntese de pectinases. Apenas 2 tipos de pectinases, o que corresponde a 15 % das enzimas deste tipo produzidas por esta espcie, se mostraram sob controle das acil-HSLs (Nasser et al., 1998).
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Figura 11. Teste biolgico de inoculao de diferentes cepas de E. stewartii em folhas de milho. Cepa selvagem (DC283) produziu necrose clara no meio da folha. Cepa ESVB51 esaI, incapaz de produzir N-(3-oxo-hexanoil)-HSL, no produziu necrose. Cepa ESVB51 contendo plasmdeo pSVB2 (produtora de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL) mostrou o sintoma da necrose. Cepa ESVB51 no produtora de N-(3-oxo-hexanoil)-HSL porm suplementada com o autoindutor sinttico, mostrou forte atividade fitopatognica (Beck von Bodman et al., 1995).
A espcie Erwinia amylovora se caracteriza por produzir doenas em plantas da famlia Rosaceae, especialmente em ma e ervilha (Eastgate, 2000). Os principais fatores fenotpicos de virulncia da espcie so protenas e exopolissacardeos (Wei et al., 2000). Um estudo recente demonstrou que a espcie E. amylovora tambm produz acil-HSLs. Entretanto, no foi possvel determinar a natureza qumica das substncias sinalizadoras identificadas, uma vez que apenas ensaios de cromatografia em camada delgada com bioreveladores foram empregados. Foram relatadas ainda evidncias de que tecidos de ervilha infectados pela bactria tambm apresentam acilhomosserina lactonas, fornecendo indcios da presena de mecanismos de
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comunicao bacteriana durante a infeco do hospedeiro (Venturi et al., 2004). O estudo da espcie E. carotovora subsp. atrosepticum (Pectobacterium atrosepticum) tambm mostrou evidncias da produo de acil-HSLs atravs de anlises por CCD e biorevelao. A natureza qumica das acil-HSLs detectadas no foi estabelecida. Estudos com mutantes tambm revelaram menor patogenicidade contra folhas de tabaco e tubrculos de batata para mutantes que apresentavam genes capazes de hidrolisar acil-HSLs, clonados a partir da espcie Bacillus sp. A24 (Smadja et al., 2004). Os exemplos mostrados acima mostram o quo importante o sistema quorum-sensing no gnero Erwinia, principalmente por controlar a ao de genes que codificam fatores de virulncia das espcies. Ainda, a produo de substncias pela alga D. pulchra com atividade antagonista das acil-HSLs abre possibilidades para interferncias nos processos de comunicao bacteriana. Assim, conhecer este sistema comunicativo pode fornecer maneiras de controlar a ao destes fitopatgenos, o que representaria um grande avano no controle de pragas importantes na agricultura.
1.1.3. Erwinia psidii, um fitopatgeno da goiabeira
O Brasil o maior produtor mundial de goiaba (Psidium guajava L.), sendo a rea ocupada com esta cultura de aproximadamente 11500 hectares. Os principais estados produtores so Pernambuco e So Paulo, mas a cultura tambm explorada comercialmente de forma expressiva nos estados do Rio Grande do Sul, Minas Gerais e Distrito Federal (Coelho et al., 2002). Entre os fatores que limitam a produo de goiaba no pas est a ocorrncia da bacteriose, tambm conhecida como seca dos ponteiros, causada
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por Erwinia psidii. Esta doena foi descrita em 1982 nos municpios de Valinhos e Pindamonhangaba, estado de So Paulo (Neto et al., 1983). Posteriormente, sua ocorrncia foi relatada nos estados de Minas Gerais (Zona da Mata) (Romeiro et al., 1994), Esprito Santo (Oliveira et al., 2000), no Distrito Federal, no Paran e em Gois (Figura 12) (Neto et al., 1983).
Figura 12. Distribuio geogrfica da seca dos ponteiros da goiaberia (Erwinia psidii) (Coelho et al., 2002).
Embora a seca dos ponteiros da goiabeira esteja restrita a ramos jovens da planta e aos frutos e no causar infeco sistmica ou morte das plantas, a doena tem provocado perdas elevadas na colheita e prejudicado extensivamente a explorao comercial da fruta (Coelho et al., 2002). Entre os principais sintomas da seca dos ponteiros, esto: 1. seca de ramos e brotos, os quais murcham e adquirem colorao pardo-escura ou negra; 2. amarelecimento e leso em folhas, apresentando, muitas vezes,
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tecidos com aspecto encharcado prximo s nervuras; 3. necrose e mumificao de flores e frutos imaturos (Figura 13) (Coelho et al., 2002). Em geral, esta doena introduzida nos pomares atravs de mudas contaminadas. A bactria pode ainda penetrar em aberturas naturais ou ferimentos produzidos na planta, durante o processo de poda. Atualmente, no existe uma medida efetiva para o controle da doena. Sabe-se apenas que a poda ou colheita realizada em condies de alta umidade aumenta a sua incidncia (Coelho et al., 2002). Alm disso, testes biolgicos mostraram que E. psidii capaz de infectar outras plantas como o ara (Psidium cattleianum), jambo vermelho (Eugenia jambolana) e melaleuca (Melaleuca viridiflora) (Neto et al., 1987). A E. psidii classificada como no-pectoltica. Esta cepa forma colnias de colorao esbranquiada em meios de cultura no seletivos. Tratase de uma bactria dotada de flagelos e mobilidade. Dados bioqumicos de concentrao de GC (guanina-citosina) no DNA mostram uma alta
semelhana com as espcies E. tracheiphila (um fitopatgeno do pepino) e E. rubrifaciens. Porm, testes bioqumicos permitiram distinguir claramente as espcies (Neto et al., 1987).
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A. Primrdio foliar da goiabeira infectado por E. psidii
B. Frutos jovens de goiaba enegrecidos pelo ataque de E. psidii
C. Fruto maduro de goiaba enegrecido pelo ataque de E. psidii
D. Ramo de goiabeira morto pelo ataque de E. psidii
Figura 13. Sintomas do ataque de E. psidii em diferentes partes da goiabeira (Coelho et al., 2002).
Tratando-se de um fitopatgeno de ocorrncia exclusivamente brasileira, a E. psidii apresenta-se como um excelente exemplo para as pesquisas em qumica da comunicao bacteriana (quorum-sensing) no Brasil, principalmente por levantar uma nova possibilidade de tratamento futuro para a principal bacteriose da goiabeira.
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1.1.4. Pantoea ananatis: um fitopatgeno de distribuio mundial
A espcie Pantoea ananatis (Erwinia ananas) foi inicialmente descrita como um fitopatgeno do abacaxi (Serrano, 1928). Atualmente, um dos principais focos de ocorrncia da espcie so as plantaes de cebola nos Estados Unidos, no estado da Gergia, onde tem causado srias perdas (Walcott et al., 2002). A espcie tambm foi relatada como fitopatognica ao arroz na Austrlia, ao eucalipto na frica do Sul (Figura 14) e forrageira Sorghum sudanense no estado da Califrnia, Estados Unidos (Cother et al., 2004; Coutinho et al., 2002; Azad et al., 2000).
Figura 14. Pantoea ananatis atacando mudas jovens de eucalipto na frica do Sul (Coutinho et al., 2002).
1.1.5. Pantoea agglomerans isolada da doena da pinta branca do milho
No incio da dcada de 1980, descreveu-se no Brasil a ocorrncia de uma doena foliar no milho que foi inicialmente atribuda ao fungo Phaeosphaeria maydis (Fantin, 1994). A incidncia e severidade da doena aumentaram no pas ao decorrer da dcada seguinte e hoje em dia
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encontrada em praticamente todas as regies produtoras de milho no pas (Fernandes e Oliveira, 1997). A doena em condies favorveis pode levar senescncia das folhas, um ciclo vegetativo reduzido e perdas na produo dos gros. Em cultivares suscetveis, as perdas podem chegar a 63 % no rendimento dos gros (Pinto, 1995). Os sintomas iniciais da doena so leses aquosas que evoluem para um estado necrtico (Figura 15). O nmero e tamanho das leses varia de acordo com a variedade de milho. A severidade da doena aumenta em condies de alta umidade e temperaturas amenas, principalmente quando h um forte decrscimo na temperatura ambiente aps as chuvas, o que comum durante o cultivo de milho no Brasil (PaccolaMeirelles et al., 2001). Inicialmente, a doena foi atribuda ao fungo P. maydis. Diversas controvrsias existiam a respeito do agente causador, uma vez que nos estgios iniciais de desenvolvimento da doena no eram observadas estruturas tpicas de fungos. Estudos mostraram que uma bactria era responsvel pela colonizao inicial dos tecidos do milho. As leses eram, em seguida, invadidas pelo fungo. Uma das cepas foi identificada como Pantoea ananatis (Paccola-Meirelles et al., 2001). Numa colaborao do nosso grupo de pesquisas com a Profa. Luzia Doreto Paccola-Meirelles, da Universidade Estadual de Londrina, Paran, identificou-se uma segunda espcie a partir de leses em folhas de milho. Esta espcie foi identificada como Pantoea agglomerans, que filogeneticamente muito prxima P. ananatis.
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Figura 15. Doena da pinta branca do milho. Fotos: Dra. L. D. PaccolaMeirelles.
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1.2. Objetivos
O objetivo deste captulo caracterizar quimicamente as acil-homosserina lactonas produzidas pelas bactrias fitopatognicas E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans, incluindo snteses, determinaes de configuraes absolutas e avaliaes de atividades biolgicas.
35
1.3. Resultados e discusso A qumica da comunicao bacteriana
As pesquisas relacionadas aos mecanismos de comunicao bacteriana se desenvolveram muito nos ltimos anos graas aos avanos na rea de biologia molecular e nas tcnicas analticas em micro-escala. Sob o ponto de vista ecolgico, estes mecanismos comunicativos so interessantes pois denotam a capacidade destes microrganismos em realizar aes de modo coordenado, atuando como verdadeiros organismos coloniais. Apesar das pesquisas terem se desenvolvido em sua maior parte in vitro, evidncias sugerem que os mecanismos comunicativos so de extrema importncia para as bactrias durante suas interaes com outros microrganismos, na disputa pelo nicho ecolgico. Ainda, acredita-se que a expresso coordenada de fatores fenotpicos constitua um fator evolutivo importante durante as interaes entre as bactrias e seus hospedeiros, seja de modo simbionte ou at mesmo patognico (Middleton et al., 2002; BrellesMario et al., 2001). O estudo dos mecanismos comunicativos utilizados por bactrias no se restringe apenas ao enfoque ecolgico. Est sendo reconhecido que estes mecanismos podem constituir uma maneira interessante de combater bacterioses, ou ainda estimular o metabolismo bacteriano no sentido de otimizar a produo de algum metablito ou enzima de interesse. Estas potenciais aplicaes biotecnolgicas tm sido cada vez mais evidentes com os avanos nas pesquisas na rea (Robson et al., 1997). Em vista da importncia do assunto, decidiu-se estudar trs fitopatgenos brasileiros (Erwinia psidii, Pantoea ananatis e Pantoea agglomerans) quanto produo de substncias da classe das acilhomosserina lactonas, notoriamente os metablitos mais empregados por
36
bactrias Gram-negativas em processos de sinalizao intercelular. Em alguns casos, estes fitopatgenos constituem um fator crtico nos cultivares agrcolas em que se estabelecem, levando a perdas econmicas expressivas em determinadas condies.
1.3.1. Testes biolgicos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)
Uma consulta na literatura disponvel sobre a produo de feromnios por bactrias revelou que, normalmente, estes microrganismos produzem apenas pequenas quantidades de substncias sinalizadoras. Este fato atenuado nos casos de microrganismos selvagens (Eberhard et al., 1981). Cientes da problemtica envolvida na investigao de compostos produzidos em quantidades traos considerou-se apropriado estabelecer um teste muito sensvel e visual que indicasse a presena das acil-HSLs em organismos no estudados anteriormente. Uma avaliao da literatura disponvel sobre o assunto indicou que o teste de expresso de enzimas galactosidase com cepas mutantes de Agrobacterium tumefaciens normalmente utilizado para detectar a presena destes compostos, de maneira rpida e simples. Entre diversos biossensores construdos para esta finalidade, o mutante A. tumefaciens NTL4(pZLR4) apresenta-se como um dos que apresentam a maior faixa de sensibilidade para acil-HSLs com diferentes comprimentos de cadeia acila e substituintes do tipo oxo e hidroxi (Cha et al., 1998). A espcie A. tumefaciens selvagem produz a N-(3-oxo-octanoil)-HSL, que coordena a expresso de fatores de virulncia deste fitopatgeno (Zhang et al., 1993; Pierson III et al., 1998). O mutante NTL4(pZLR4) incapaz de
37
produzir a substncia sinalizadora pela supresso do gene que codifica a enzima TraI. Alm disso, esta cepa recebeu um plasmdeo pTiC58 que contm uma fuso traG::lacZ e o gene traR. Assim, o gene traR codifica a sntese da protena receptora TraR, que capaz de se complexar acil-HSLs exgenas. O complexo assim formado [TraR-(acil-HSL)] regula positivamente a expresso do gene lacZ, responsvel pela sntese de uma enzima galactosidase capaz de degradar o reagente 5-bromo-4-cloro-3-indolil--Dgalactopiranosdeo (X-Gal). Assim, observa-se uma colorao azul no meio caso exista alguma acil-HSL em concentrao suficiente para ativar o biossensor (Figuras 16 e 17) (Ravn et al., 2001; Cha et al., 1998).
Figura 16. Mecanismo de atuao do biossensor A. tumefaciens NTL4(pZLR4).
38

NH
CH2OH OH OH OO Cl
Br
Galactosidase
NH
2
Br OH Galactose Cl
OH
X-Gal
O NH NH Cl O Cl Br
Br
Colorao azul
Figura 17. Reao de degradao do reagente X-Gal e formao do derivado de ndigo de colorao azul por ao da enzima -galactosidase (Berg et al., 2002).
Inicialmente, foram realizados bioensaios com as cepas E. psidii e P. ananatis in vivo, atravs do co-cultivo destas bactrias com o biossensor A. tumefaciens NTL4(pZLR4), na presena de X-Gal, em tubos de ensaio. Como controle positivo, utilizou-se o co-cultivo com a espcie Pseudomonas aeruginosa, que reconhecidamente produz acil-HSLs (Pearson et al., 1994; Pearson et al., 1995). O ensaio in vivo interessante uma vez que permite uma visualizao do processo comunicativo de maneira mais prxima realidade, isto , clulas vivas que produzem metablitos que incitam fatores fenotpicos em clulas vizinhas. O teste biolgico mostrou uma atividade positiva para ambas espcies E. psidii e P. ananatis. O teste branco feito com o cultivo da espcie E. psidii na presena de X-Gal no mostrou qualquer atividade, fornecendo portanto indcios de que o biossensor foi ativado por substncias produzidas pela
39
bactria. Porm, o branco feito com a espcie P. ananatis apresentou atividade biolgica positiva. Isto foi justificado pelo fato da espcie P. ananatis produzir enzimas -galactosidase constitutivamente, que degradam o reagente X-Gal mesmo na ausncia do biossensor (Figura 18) (Paccola-Meirelles et al., 2001). Para evitar que enzimas produzidas pelas bactrias pudessem influenciar nos resultados obtidos nos ensaios biolgicos, os testes foram em seguida realizados com extratos obtidos a partir dos cultivos das bactrias. Estes extratos foram previamente cromatografados em coluna de slica gel filtrante, para garantir um enriquecimento em metablitos secundrios na frao acetato de etila e remover quaisquer enzimas ou polmeros biolgicos. Um fato que deve ser levado em considerao a complexidade do meio de cultivo empregado para o desenvolvimento das bactrias. Poder-se-ia supor que os metablitos que ativam o biossensor nos testes biolgicos so provenientes do meio e no do metabolismo bacteriano. Portanto, realizou-se tambm um ensaio biolgico com extrato proveniente do meio de cultivo caldo nutriente (NB), obtido nas mesmas condies. Os testes biolgicos mostraram que os extratos provenientes de todos os microrganismos eram capazes de ativar o biossensor A. tumefaciens NTL4(pZLR4), o que foi observado pelo desenvolvimento de uma colorao verde-azulada nos respectivos ensaios. No foram observadas atividades biolgicas em testes realizados com o extrato do meio de cultivo caldo nutriente. As atividades biolgicas positivas so indicativas da possvel produo de substncias da classe das acil-HSLs pelas bactrias, o que estimulou um estudo qumico mais aprofundado (Figura 18). Destacamos ainda que o protocolo de uso de tubos de ensaio neste tipo de teste biolgico indito na litetatura.
40
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
l.
j.
k.
m.
Figura 18. Avaliao da atividade biolgica, em duplicata, de expresso de enzimas galactosidase com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4) na presena de X-Gal. Legenda:
Fig. a. Componentes A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal Resultado A bactria biossensora no produziu enzimas -galactosidase na ausncia de acil-HSL, verificando-se ausncia de colorao azulesverdeada. A bactria P. aeruginosa produziu acil-HSL, ativando o biossensor. A bactria E. psidii produziu acil-HSL, ativando o biossensor e gerando colorao. A bactria E. psidii no produz enzima -galactosidase. A bactria P. aeruginosa no produziu enzima -galactosidase. A bactria P. ananatis produz acil-HSL ativando o biossensor.* A bactria P. ananatis produz enzima -galactosidase, degradando o X-Gal e fornecendo um falso positivo (branco). A atividade na figura f. no pode ser atribuda ativao do biossensor por acilHSL.* O extrato livre de enzimas ativou o biossensor, o que atribudo produo de acil-HSLs pela bactria P. ananatis CCT 6481T. Uma das fraes purificadas do cultivo de P. ananatis CCT 6481T onde foram identificadas acil-HSLs por CG-EM apresentou atividade positiva. O extrato do meio de cultivo caldo nutriente no ativou o biossensor. Logo, o meio de cultivo no contm acil-HSLs. O extrato livre de enzimas ativou o biossensor, o que atribudo produo de acil-HSLs pela bactria E. psidii IBSBF 435T. Uma das fraes purificadas do cultivo de E. psidii IBSBF 435T onde foram identificadas AHSL por CG-EM apresentou atividade positiva. O extrato livre de enzimas ativou o biossensor, o que atribudo produo de acil-HSLs pela bactria P. agglomerans 732.
b. c. d. e. f. g.
A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Pseudomonas aeruginosa CCT 1987. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Erwinia psidii IBSBF 435T. Erwinia psidii IBSBF 435T + X-Gal P. aeruginosa CCT 1987 + X-Gal A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + P. ananatis CCT 6481T. P. ananatis CCT 6481T + X-Gal
h.
i.
j.
k.
l.
m.
A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Extrato do meio de cultivo P. ananatis CCT 6481T A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Frao FRA43, proveniente do cultivo de P. ananatis CCT 6481T. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Extrato do meio de cultivo caldo nutriente (NB). A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Extrato do meio de cultivo E. psidii IBSBF 435T A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Frao FRA33-35, proveniente do cultivo de E. psidii IBSBF 435T. A. tumefaciens NTL4(pZLR4) + X-Gal + Frao acetato de etila proveniente do cultivo de Pantoea agglomerans 732.
41
1.3.2. Caracterizao qumica das acil-HSLs produzidas por E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans
Normalmente, o estudo qumico de substncias sinalizadoras requer um grande volume de meio de cultivo, dada a baixa concentrao destes metablitos. Alm disso, a complexidade do meio de cultivo tambm um fator restritivo, sendo necessrio aplicar metodologias de enriquecimento de amostras contendo os metablitos de interesse. Desta forma, as bactrias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans foram cultivadas em l litro de meio caldo nutriente, que foi em seguida centrifugado (evitando-se, portanto, a lise celular e o possvel aumento da complexidade do meio com substncias intracelulares) e extrado com acetato de etila. Este procedimento foi repetido para as bactrias E. psidii e P. ananatis, totalizando-se 8 litros de meio de cultivo. Os extratos foram purificados atravs de cromatografia em coluna de slica gel com os solventes hexano, diclorometano e acetato de etila, em ordem crescente de polaridade. As fraes foram reunidas por semelhana em CCD e analisadas por CG-EM, onde foram monitorados os sinais com padres de fragmentao caractersticos das acil-HSLs, como m/z 185, 143, 128, 102, 101, 100 e 85 (Figuras 19 e 20) (Chhabra et al., 1993). Em todas as bactrias estudadas foram observados sinais em fraes eludas na polaridade CH2Cl2:AcEt 4:1.
42
O O O m/z 85 HN NH2 O
+
O
+
O NH3 O m/z 102

+
O O NH O m/z 128
O m/z 101
m/z 100
H O O N H O N H O m/z 143 OH O
H O O O N H O H O O O N H O N H m/z 185 O O H O O
Figura 19. Proposta de racionalizao de alguns fragmentos caractersticos das acil-HSLs por CG-EM (IE, 70 eV). Na espcie E. psidii IBSBF 435T, dois sinais com padres de fragmentao (EM) caractersticos foram identificados na frao FRA33-35 (Figura 21). O sinal mais intenso apresentou um espectro de massas coerente com o esperado para a N-hexanoil-HSL (1) (M.+ m/z 199) (Chhabra et al., 1992). O pico base apresentou m/z 143, resultante do rearranjo de McLafferty com a carbonila da cadeia acila. Os sinais m/z 156 (12 %) e 170 (5 %) apresentaram um decrscimo na abundncia relativa, caracterstico de
43
fragmentao em cadeia acila no substituda, com perdas de CH2CH2CH3 e CH2CH3, respectivamente. Outros sinais caractersticos so m/z 125 (21 %) (m/z 143 H2O), m/z 128 (5 %) (fragmentao a carbonila da cadeia acila), m/z 100 (8 %) e suas formas protonadas m/z 101 (15 %) e 102 (12 %) correspondentes ao fragmento homosserina lactona. Destaca-se ainda o sinal m/z 99 (22 %), resultante da perda do grupo homosserina lactona (M+. C4H6NO2) (Figura 22). Uma segunda substncia foi identificada na frao FRA33-35 de E. psidii, tratando-se da N-heptanoil-HSL (2) (Figura 21). Porm, este metablito apresentou-se em concentrao extremamente baixa na frao (trao), utilizando-se portanto o modo de deteco single ion monitoring (SIM) que confere uma maior sensibilidade s anlises por CG-EM. Basicamente, o padro de fragmentao observado similar ao da N-hexanoil-HSL. Neste caso, a perda do grupo homosserina lactona d origem ao fragmento m/z 113 (15 %) (M+. - C4H6NO2) (Figura 22). A anlise por CG-EM das amostras obtidas do fracionamento do extrato em acetato de etila do cultivo de P. ananatis CCT 6481T tambm levou identificao de acil-HSLs (Figura 23). Alm da N-hexanoil-HSL (1) (majoritria) e N-heptanoil-HSL (2) (minoritria), previamente identificadas em E. psidii, foi observada a ocorrncia de quantidade trao de N-octanoilHSL (3) na frao FRA35-38. Para esta substncia, a perda do grupo homosserina lactona d origem ao fragmento m/z 127 (10 %) (M+. C4H6NO2). Esta substncia tambm foi monitorada utilizando o modo SIM de deteco (Figura 24).
44

m/z 170 m/z 156 m/z 184
O O N H O
m/z 170
O O N H
m/z 156 m/z 113
m/z 99
(1)
m/z 198 m/z 184 m/z 170
(2)
O O N H
O O N H O
m/z 71
m/z 156 m/z 127
O (4)
(3)
Figura 20. Fragmentao caracterstica de cada acil-HSL identificada nos cultivos das bactrias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans.
(1) (2)
(1 )
(2 )
Figura 21. Cromatograma de ons totais (CG-EM, IE, 70 eV) da frao FRA33-35 (2,5 mg) de E. psidii. Condies de anlise: coluna HP-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 m), programa de temperaturas 100C-(10C/min)-290C-(10 min).
45
________________________CAPTULO 1 A QUMICA DA COMUNICAO BACTERIANA a.

O O N H O
(1 )
b.
O O N H O
(2 )
Figura 22. Espectros de massas (IE, 70 EV) da (a) N-hexanoil-HSL (1) e (b) N-heptanoil-HSL (2) (modo SIM), identificadas na frao FRA33-35 proveniente do cultivo de E. psidii.
(1 ) ( 3) (2 )
Figura 23. Cromatograma de ons totais (CG-EM, IE, 70 eV) da frao FRA35-38 (2,4 mg) de P. ananatis. Condies de anlise: coluna HP-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 m), programa de temperaturas 70C-(5C/min)-290C-(10 min).
46
O O N H O
(3 )
Figura 24. Espectro de massas (IE, 70 eV, SIM) da N-octanoil-HSL (3) detectada na frao FRA35-38 proveniente do cultivo de P. ananatis.
(4 )
Figura 25. Cromatograma de ons totais (CG-EM, IE, 70 eV) da frao acetato de etila (26,4 mg) de P. agglomerans. Condies de anlise: coluna HP-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 m), programa de temperaturas 100C(10C/min)-290C-(10 min).
47
O O NH O
(4 )
Figura 26. Espectro de massas (IE, 70 eV) da N-butanoil-HSL (4) detectada na frao acetato de etila proveniente do cultivo da bactria P. agglomerans.
(1 )
Figura 27. Cromatograma (CG-EM) da frao FRA56-58 de P. agglomerans. Condies de anlise: coluna HP-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 m), programa de temperaturas 100C-(10C/min)-290C-(10 min). A cepa P. agglomerans CBMAI 732 foi cultivada em 1 litro de meio caldo nutriente, como descrito anteriormente. O extrato acetato de etila obtido do sobrenadante centrifugado foi cromatografado em coluna flash de slicagel. A anlise em CG-EM da frao acetato de etila revelou a presena de um sinal com padro de fragmentao caracterstico das acil-HSLs (Figura 25), resultado que no havia sido obtido previamente com esta pequena quantidade de extrato em modo SCAN com as cepas P. ananatis CCT 6481T e E. psidii
48
IBSBF 435T. O padro de fragmentao em CG-EM sugeriu a ocorrncia de N-butanoil-HSL (4) nos caldos de cultivo desta cepa. Como fragmentos caractersticos, alm daqueles tpicos em m/z 143, 102, 101 e 100, destacam-se os fragmentos de m/z 171 (M+, 7 %) e de m/z 71 em alta intensidade (64 %), resultante da perda do fragmento homosserina lactona (M+. - C4H6NO2) (Figuras 26 e 27). A substncia (4) foi posteriormente purificada por cromatografia em coluna. Identificou-se ainda uma quantidade trao de Nhexanoil-HSL (1), que foi detectada utilizando-se o modo SIM de deteco (Figura 27).
1.3.3. Anlise do branco para acil-homosserina lactonas por CG-EM
Devido complexidade do meio de cultivo empregado para o crescimento das bactrias, extremamente importante averiguar se os metablitos identificados so provenientes do metabolismo bacteriano e no do prprio meio de cultivo. Resultados prvios obtidos em bioensaios com o reprter A. tumefaciens NTL4(pZLR4) mostraram que o extrato do meio de cultivo caldo nutriente no era capaz de ativar a expresso de enzimas galactosidase (Tpico 1.3.1). A confirmao qumica foi feita atravs da anlise dos extratos obtidos a partir de 1 L de cultivo de cada bactria utilizando-se a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Utilizou-se o modo SIM de deteco, varrendo-se os ons caractersticos das acil-HSLs majoritrias identificadas em cada espcie bacteriana. Os
resultados mostraram que as substncias so provenientes do metabolismo bacteriano (Figura 28).
49
a.
(1 )
b.
(4 )
c.
Ausente
d.
(1 )
Figura 28. Anlise por CG-EM (IE, 70 eV) dos extratos semi-purificados de a. E. psidii; b. P. agglomerans; c. meio de cultivo caldo nutriente; d. P. ananatis. As acil-HSLs majoritrias foram identificadas em todos os cultivos provenientes das bactrias. Condies de anlise: coluna HP-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 m), programa de temperaturas 100C-(10C/min)-290C-(10 min).
1.3.4. Sntese de acil-homosserina lactonas
No estudo das bactrias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans, foram detectadas pequenas quantidades de acil-HSLs, o que no permitiu na maior parte dos casos isolar os metablitos de interesse. Com isso, a confirmao da ocorrncia dos mesmos foi feita atravs da co-injeo em CG-EM dos produtos naturais com produtos sintticos, obtidos a partir da acilao do bromidrato de -amino--butirolactona com os respectivos cidos graxos, na presena de um derivado de carbodiimida solvel em gua. O fato de todos os reagentes serem solveis em gua facilitou o processo de purificao, que consistiu apenas numa extrao das acil-HSLs produzidas com solvente orgnico (acetato de etila), seguida de extrao cido-base amena (Figura 29).
50
O R O + R OH N + ClN C N Et3N H2O N ClH

+
O O
-
R Et3N
N C N H
O N C N N Cl H
+
O + R O
O R
H
-
O O R O O + R NH2 O Et3N H2O
O NH R
O + O HO
O R
Figura 29. Mecanismo de sntese de acil-HSLs (March, 1965).
Uma
reviso
bibliogrfica
mostrou
ausncia
de
dados
espectroscpicos publicados para a N-heptanoil-HSL (2). O espectro de infravermelho da substncia (2) (Anexo E10) mostrou uma banda caracterstica de distenso axial de hidrognio de amida monossubstituda em 3315,8 cm-1. As distenses axiais dos hidrognios ligados a carbonos alifticos foram observadas mais intensamente em 2929,5 e 2858,8 cm-1. A distenso axial de carbonila de lactona foi observada como uma banda proeminente em 1776,7 cm-1 (C=O); a banda apareceu em regio de maior energia do que o esperado para uma carbonila de ster convencional (~1720 cm-1), por fazer parte de um anel de cinco membros, tensionado. A banda
51
correspondente carbonila de amida da cadeia lateral foi observada em 1646,4 cm-1. So proeminentes ainda os sinais correspondentes s distenses axiais da ligao C-O de ster, em 1173,6 e 1013,6 cm-1. A anlise do espectro de ressonncia magntica nuclear de hidrognio da substncia (2) (Anexo E11) permitiu distinguir os sinais dos hidrognios diastereotpicos H-4 em H 2,14 e 2,84. Os hidrognios diastereotpicos H-5 apareceram em regio mais desprotegida, em H 4,28 e 4,47, por pertencerem ao carbono ligado ao heterotomo na poro lactona. O sinal do hidrognio ligado ao nitrognio apareceu sob a forma de um dubleto largo, em H 6,15. A anlise do espectro de ressonncia magntica nuclear de carbono da substncia (2) (Anexo E 12) mostrou a presena de onze sinais. A diferenciao dos sinais das carbonilas foi feita utilizando-se a tcnica bidimensional de correlaes 1H,
13
C a mltiplas ligaes (gHMBC) (Anexo
E16). O sinal do carbono em C 175,5 apresentou correlaes a longa distncia com os hidrognios em H 2,84 (H-4), 4,47 (H-5) e 4,56 (H-3), sendo portanto atribudo o sinal como o carbono carbonlico da poro lactona (C-2). O sinal de carbono em C 173,7 apresentou correlaes a longa distncia com os hidrognios H 2,25 (H-2) e 1,64 (H-3), sendo portanto atribudo ao carbono carbonlico da cadeia acila lateral (C-1). A diferenciao dos sinais dos carbonos metilnicos da cadeia acila C4, C-5e C-6 foi inicialmente feita com o uso do espectro de ressonncia magntica nuclear bidimensional de correlaes 1H,
13
C a uma ligao
(HSQC) (Anexo E15). Os sinais de carbonos em c 22,43; 28,83 e 31,44 apresentaram correlaes a uma ligao com o multipleto de 6 hidrognios em
H 1,29. A diferenciao destes sinais foi feita com o auxlio do mapa de

correlaes 1H,
13
C a mltiplas ligaes (gHMBC) (Anexo E16). O sinal de
52
carbono em C 22,43 apresentou correlao a longa distncia com o sinal dos hidrognios da metila terminal em H 0,88, sendo portanto este carbono assinalado como C-6. O sinal em C 31,44 apresentou correlaes com os hidrognios vicinais em H 0,88 (H-7), 1,29 (H-4 e H-6) e 1,64 (H-3), sendo portanto atribudo ao carbono C-5. Finalmente, o sinal de metileno em
C 28,83 apresentou correlaes a longa distncia com o sinal do H-3 em

1,64 e com o sinal do metileno H-2 em 2,25, e foi atribudo ao carbono C4. Tcnicas adicionais de ressonncia magntica nuclear como DEPT 135 e DEPT 90 (Anexo E13), alm das correlaes 1H, 1H 3J (gCOSY) (Anexo E14) foram utilizadas nas assinalaes de deslocamentos qumicos para a substncia (2). Os resultados so mostrados na Tabela 1.
53

O
7' 6' 5' 4' 3' 2' 1' NH 4 5 3 2 1O
Tabela 1. Assinalao dos deslocamentos qumicos em RMN de 1H e 13C da N-heptanoilHSL (2) (CDCl3, TMS, 499,88 MHz para RMN de 1H e 125,71 MHz para RMN de 13C).
No. 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3
C
173,7 36,1 25,3 28,8 31,4 22,4 14,0 175,6 49,2
H
2,25 (t, 2H, J 8,9 Hz) 1,64 (quinteto, 2H, J 7,6 Hz) 1,29 (m, 2H) 1,29 (m, 2H) 1,29 (m, 2H) 0,88 (t, 3H, J 7,3 Hz) 4,56 (ddd, 1H, J 5,8; 11,6 e 8,6 Hz) 2,14 (m, 1H) 2,84 (m, 1H)
(1H, 1H 3J) gCOSY 1,64 1,29; 2,25 0,88; 1,64 0,88; 1,64 0,88; 1,64 1,29 2,14; 2,84; 6,15 2,84; 4,28; 4,47; 4,55 2,14; 4,28; 4,56 2,14; 2,84; 4,47 2,14; 4,28 4,56
(1H, 13C nJ) gHMBC 1,64 (3J); 2,55 (2J); 6,15 (2J) 1,64 (2J) 2,25 (2J) 1,64 (2J); 2,25 (3J) 0,88 (3J); 1,64 (3J) 0,88 (2J) 1,29 (2J) 2,84 ( J); 4,47 (4J); 4,55 (2J)
3
DEPT C CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 C CH
2,14 (2J); 2,84 (2J); 4,47 (3J) 4,47 (2J); 4,55 (2J)
30,5
CH2
66,1
NH
4,28 (ddd, 1H, J 5,8; 11,3 e 9,5 Hz) 4,47 (t, 1H, J 8,9 Hz) 6,15 (d, NH, J 3,7 Hz)
2,14 (2J)
CH2
d: dubleto; dd: duplo dubleto; ddd: duplo-duplo-dubleto; m: multipleto; t: tripleto.
54
a.
O
3' 4' 2' 1' 4 5 3 2 1O
NH
b.
O
3' 4' 2' 1'
NH
4 5 3 2 1O
Figura 30. Espectros de RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da Nbutanoil-HSL sinttica (a) e natural (b), isolada de P. agglomerans.
55
O estudo dos caldos de cultivo da bactria P. agglomerans permitiu isolar a N-butanoil-HSL, tornando possvel a comparao dos espectros de ressonncia magntica nuclear de hidrognio do produto natural e sinttico (Figura 30).
1.3.5. Avaliao da atividade biolgica de fraes e produtos sintticos com o biossensor A. tumefaciens NTL4(pZLR4)
Assim como os extratos obtidos dos cultivos das bactrias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans, as fraes provenientes da purificao dos extratos onde foram identificadas as acil-HSLs por CG-EM foram bioensaidas com o reprter A. tumefaciens NTL4(pZLR4). Os produtos sintticos tambm foram ensaiados. As atividades biolgicas positivas de todas as fraes e produtos sintticos corroboraram com os resultados obtidos com os extratos (Figura 31 e Figura 18, pgina 37).
a.
b.
c.
d.
e.
a.
f.
g.
h.
Figura 31. Avaliao da atividade biolgica de expresso de enzimas galactosidase com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4) na presena de X-Gal
56
a. Etanol (20 L, controle negativo). b. ()-N-hexanoil-HSL. c. (S)-(-)-Nhexanoil-HSL. d. ()-N-heptanoil-HSL. e. ()-N-octanoil-HSL. f. ()-Nbutanoil-HSL. g. (S)-(-)-butanoil-HSL. h. Frao F59-64 do cultivo de P. agglomerans, contendo a N-butanoil-HSL natural purificada.
1.3.6. Determinao da configurao absoluta das acil-homosserina lactonas majoritrias identificadas
Como reportado na literatura, a configurao absoluta de extrema importncia para a atividade biolgica das substncias sinalizadoras. No primeiro trabalho qumico reportando o isolamento de uma substncia desta classe, demonstrou-se que a mistura racmica (sinttica) ()-N-(3-oxohexanoil)-HSL era menos eficiente na ativao da bioluminescncia na bactria Vibrio fischeri que o produto natural, o que foi atribudo a uma possvel atividade reduzida de um dos enantimeros na mistura racmica (Eberhard et al., 1981). No estudo realizado com o fitopatgeno Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (ex Erwinia carotovora subsp. carotovora), demonstrou-se que a forma natural (S)-(-)-N-(3-oxohexanoil)-HSL 90 % mais ativa na regulao da biossntese do antibitico carbapenem que o enantimero (R)-(+) (Chhabra et al., 1993). Desta forma, compreendemos a necessidade de determinar a configurao absoluta das acilHSLs identificadas nas bactrias em estudo. No presente trabalho, em ambas espcies E. psidii e P. ananatis, a Nhexanoil-HSL apresentou-se como o metablito sinalizador predominante, tornando possvel a determinao de sua configurao absoluta. Na espcie E. psidii, o metablito foi encontrado com abundncia relativa (CG-EM) de 6 % na frao FRA32 (massa total de 2,0 mg), a mais pura obtida. Esta quantidade
57
extremamente pequena de material requisitava uma metodologia sensvel o suficiente para determinar a configurao absoluta da substncia. A metodologia escolhida foi a cromatografia em fase gasosa com deteco por ionizao em chama e coluna com fase estacionria quiral da Chrompack (chirasil ciclodextrina CB). As condies analticas foram otimizadas utilizando a mistura racmica sinttica [enantimero (R) em 56,72 min e enantimero (S) em 56,89 min]. A eluio do estereoismero sinttico (S)-(-)N-hexanoil-HSL (93 % ee) nas mesmas condies, forneceu o tempo de reteno de 56,93 min. Anlise da frao FRA32 obtida do cultivo de E. psidii mostrou um sinal com tempo de reteno (56,97 min) muito prximo do observado para o enantimero (S) sinttico. A co-injeo do produto natural FRA32 com o produto racmico sinttico resultou numa perfeita sobreposio de sinais, com um incremento na abundncia relativa do enantimero (S) (56,96 min) em comparao com a do (R) (56,79 min). Desta forma, o produto natural foi identificado como a (S)-(-)-N-hexanoil-HSL (Figura 32). A purificao dos extratos provenientes do cultivo de P. ananatis rendeu uma quantidade maior de N-hexanoil-HSL do que aquela observada com a bactria E. psidii. A frao FRA43 (1,3 mg) apresentava este metablito como sinal majoritrio, com 50 % de abundncia relativa em CGEM. A anlise por CG(quiral)-FID com fase estacionria quiral Chrompack chirasil ciclodextrina CB da frao FRA43 mostrou um sinal com tempo de reteno (56,93 min) muito prximo do observado para o enantimero (S) sinttico. A co-injeo do produto natural FRA43 com o produto racmico sinttico resultou numa perfeita sobreposio de sinais, com um incremento na abundncia relativa do enantimero (S) (56,95 min) em comparao com a do enantimero (R) (56,78 min). Desta forma, o produto natural proveniente do
58
cultivo de P. ananatis tambm foi identificado como sendo a (S)-(-)-Nhexanoil-HSL (Figura 32).
a.
A b u n d n c i a
(R) (S)
b.
(S)
c.
(S)
d. (R)
(S)
e. (S)
f.
(R)
(S)
Tempo (min)
Figura 32. Determinao da configurao absoluta da S-(-)-hexanoil-HSL, utilizando a tcnica CG(quiral)-FID. a. ()-N-hexanoil-HSL sinttica. b. S-()-N-hexanoil-HSL sinttica. c. Frao FRA33-35 do cultivo de E. psidii. d. Co-injeo da frao FRA33-35 natural com o produto sinttico ()-Nhexanoil-HSL. e. Frao FRA43 proveniente do cultivo de P. ananatis. f. Coinjeo da frao FRA43 natural com o produto sinttico ()-N-hexanoilHSL. Condies de anlise: coluna Chrompack chirasil dex (25 m, 0,25 mm, 0,25 m), programa de temperatura 50C-(2C)-180C-(5 min).
59
A determinao da configurao absoluta da N-butanoil-HSL isolada de P. agglomerans tambm foi feita por CG(quiral)-FID. A coluna quiral Chrompack chirasil ciclodextrina no foi eficiente na discriminao da mistura racmica de ()-N-butanoil-HSL. Desta forma, a configurao absoluta deste metablito foi determinada a partir de anlises cromatogrficas com a coluna quiral heptakis-(2,3-dimetil-6-pentil)--ciclodextrina. A mistura racmica foi desdobrada em dois sinais [enantimero (R) em 50,79 e enantimero (S) em 50,95 minutos]. A identificao do tempo de reteno do enantimero (S) foi feita pela anlise do produto sinttico (S)-(-)-N-butanoilHSL (51,01 minutos). A anlise do produto natural (FRA59-64) isolado de P. agglomerans revelou a presena de um sinal com tempo de reteno muito prximo ao do produto sinttico (S) (50,90 minutos). A co-injeo do produto natural e do produto sinttico racmico resultou num incremento na abundncia relativa do sinal em 50,90 minutos. O produto natural era portanto a (S)-(-)-N-butanoil-homosserina lactona (Figura 33).
a.
A b u n d.
(R) (S)
b.
(S)
c.
(S)
d. (S) (R)
Tempo (min)
Figura 33. Determinao da configurao absoluta da (S)-(-)-N-butanoilHSL, utilizando a tcnica CG(quiral)-FID. a. ()-N-butanoil-HSL sinttica. b. (S)-(-)-N-butanoil-HSL sinttica. c. Frao FRA59-64 do cultivo de P.
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agglomerans. d. Co-injeo da frao FRA59-64 natural com o produto sinttico ()-N-butanoil-HSL. Condies de anlise: coluna heptakis-(2,3dimetil-6-pentil)--ciclodextrina (25 m, 0,25 mm, 0,25 m), programa de temperatura 50C-(2C)-180C-(5 min).
A utilizao da metodologia CG-FID com fase estacionria quiral provou ser conveniente para a determinao da configurao absoluta das acilHSLs, principalmente devido pequena quantidade destes metablitos produzida pelas bactrias e ainda devido ao fato de estarem presentes em misturas complexas nos casos das espcies E. psidii e P. ananatis. Esta metodologia pioneira no estudo de substncias sinalizadoras identificadas em bactrias Gram-negativas. Em todos os casos reportados no presente trabalho, as acil-HSLs mais abundantes apresentaram centro estereognico na poro lactnica com configurao absoluta (S). Uma reviso bibliogrfica mostrou um nmero extremamente reduzido de trabalhos onde substncias desta classe foram caracterizadas quanto configurao absoluta. A bactria P. carotovorum produz a (S)-(-)-N-(3-oxo-hexanoil)-HSL (Bainton et al., 1992) e a espcie Sinorhizobium leguminosarum sintetiza a N-[(3R)-hidroxi-7-cis-
tetradecenoil]-(S)-HSL (Schripsema et al., 1996). A configurao absoluta (S) pode ser explicada analisando-se a provvel origem biossinttica destes metablitos. Estudos realizados com a bactria Vibrio fischeri possibilitaram a purificao da enzima LuxI responsvel pela sntese de acil-HSLs nesta bactria. Os substratos para a sntese de Nhexanoil-HSL so o hexanoil-ACP (acyl carrier protein, protena carreadora de acila), que fornece a poro acila da molcula, e a S-adenosil metionina (SAM), cuja poro aminocido o bloco construtor da poro homosserina
61
lactona no produto final (Schaefer et al., 1996). Portanto, a origem da estereoqumica (S) no produto (S)-(-)-N-hexanoil-HSL poderia ser derivada da estereoqumica (S) da posio -aminocido na SAM (Figura 34).
O S
O O N H
-
ACP
N O O H NH2 HO OH CH3 S+ O N
NH2 N N
NH2 N CH3 S O N N
HO
OH
Figura 34. Esquema biossinttico da N-hexanoil-HSL em V. fischeri.
1.3.7. N-heptanoil-HSL, um metablito de rara ocorrncia
Um fato interessante observado neste trabalho a ocorrncia do metablito N-heptanoil-HSL (2) nas espcies E. psidii IBSBF 435T e P. ananatis CCT 6481T. Trata-se do primeiro relato desta substncia nos gneros Erwinia e Pantoea. A substncia (2) j havia sido reportada na espcie Sinorhizobium leguminosarum, onde participa do controle da expresso de genes envolvidos nos fenmenos de formao de ndulos em leguminosas
62
simbiontes e na espcie Serratia marcescens, controlando a expresso do antibitico prodigiosina, que confere colorao vermelha s colnias desta bactria (Horng et al., 2002; Lithgow et al., 2000). Nestas espcies bacterianas, a substncia (2) foi identificada por tcnicas espectroscpicas como CG-EM e CLAE-EM-EM, por comparao do padro de fragmentao e co-injeo com produtos sintticos. Em adio, indcios da ocorrncia deste metablito tambm foram detectados nos caldos de cultivo da bactria Edwardsiella tarda, onde participaria do controle da expresso de genes que levam fatores de patogenicidade contra algumas espcies de peixes. No entanto, em E. tarda a substncia (2) foi identificada apenas por cromatografia em camada delgada, por biorevelao com a cepa biossensora
Chromobacterium violaceum CV026, e os prprios autores relatam a incerteza a respeito da identidade da molcula (Morohoshi et al., 2004).
O SCoA
-
cido graxo sintase (AGS) O O O SCoA
O S Enz
AGS 1. Reduo (NADPH) 2. Eliminao 3. Reduo (NADPH)
O S Enz
1. Novo ciclo AGS 2. ACP
O O N H (2) O
Enzima homloga LuxI SAM
O ACP
Figura 35. Provvel origem biossinttica da substncia (2) a partir do propionil-CoA.
O que chama a ateno ao metablito (2) a presena do grupo heptanola, um derivado de cido graxo com nmero mpar de carbonos. As
63
formas mais comuns de ocorrncia de cidos graxos so aqueles formados por nmeros pares de carbonos, o que est relacionado com a sua origem biossinttica. Dentre os microrganismos procariontes, a biossntese desta classe de metablitos melhor compreendida em Escherichia coli, no complexo cido graxo sintase (Lehninger et al., 1995). O iniciador da cadeia acila normalmente grupo acetato (unidade C2), ao qual so inseridos novas unidades acetato atravs do ataque nucleoflico de malonato, ativado por descarboxilao. Assim so gerados os cidos graxos com nmero par de carbonos na cadeia acila. No caso de cidos graxos com nmero mpar de carbonos, o iniciador das diversas etapas biossintticas o propionato (unidade C3), ao qual so inseridas as demais unidades de acetato. A literatura aponta esta via metablica como a provvel origem da poro acila da Nheptanoil-HSL (Figura 35) (Whithers et al., 2001).
1.3.8. Avaliao da atividade biolgica das espcies P. ananatis e P. agglomerans contra folhas de milho (Zea mays)
As espcies P. agglomerans e P. ananatis so filogeneticamente muito prximas entre si e por vezes confundidas (Walcott et al., 2002; Azad et al., 2000). No presente trabalho, a cepa P. agglomerans CBMAI 732 era proveniente de leses em folhas de milho, enquanto que a cepa P. ananatis CCT 6481T foi isolada como fitopatgeno em abacaxi. Num trabalho em colaborao com a Dra. Luzia D. P. Meirelles (Depto. de Biologia Geral, UEL, Londrina-Paran), avaliou-se a atividade patognica de ambas espcies contra folhas de milho. Duas metodologias distintas de inoculao das bactrias foram utilizadas. Na primeira, uma suspenso bacteriana foi espalhada sobre as
64
folhas de milho sem causar injrias. Na segunda, as folhas de milho foram previamente injuriadas com esponja e as suspenses bacterianas foram depositadas na forma de gotas, com o auxlio de um molde. Ao final dos experimentos, em ambos os casos a espcie P. ananatis no mostrou atividade patognica, ao contrrio da espcie P. agglomerans, que apresentou atividade, sob a forma de manchas brancas nas folhas. Isto comprovou a atividade patognica da cepa P. agglomerans isolada.
1.3.9. Avaliao da presena de acil-homosserina lactonas em folhas de milho infectadas pela cepa P. agglomerans CBMAI 732
A observao in vitro da ocorrncia de (S)-(-)-N-butanoil-HSL (6) na cepa P. agglomerans estimulou-nos a averiguar a produo destes
metablitos em folhas de milho infectado pela doena em casa de vegetao. Tambm avaliou-se a presena de acil-HSLs em folhas de milho naturalmente infectados, provenientes de campo (Embrapa Soja, Londrina - PR). Inicialmente, prepararam-se extratos de folhas de milho BR HS200 cultivado em casa de vegetao. Duas folhas foram coletadas: uma inoculada pela cepa P. agglomerans e com sinais de necrose e outra no inoculada, sadia (controle). As folhas foram segmentadas e extradas com acetato de etila. Os extratos foram em seguida submetidos filtrao em coluna de slica-gel com acetato de etila como eluente e a partir dos slidos obtidos por evaporao foram preparadas solues estoque em etanol absoluto de cada extrato. Os extratos foram bioensaiados com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4). Como controle positivo, utilizou-se ()-N-hexanoil-HSL e como controle negativo, etanol absoluto. Um segundo tipo de controle foi feito com o objetivo de distinguir a colorao do meio de cultivo contendo apenas os extratos e os
65
meios de cultivo onde foram realizados os testes. Os meios de cultivo contendo extratos apresentaram colorao amarela, claramente distinta do azul-esverdeado formado nos casos de atividade biolgica positiva. Aps 24 h, tanto o extrato proveniente da planta contaminada quanto o extrato proveniente da planta no contaminada apresentaram atividade biolgica positiva (Figura 36). O mesmo procedimento descrito acima foi aplicado com folhas de milho oriundas de cultivo em campo. Todas as plantas apresentavam 100 dias de cultivo (plantio em dezembro de 2004), j no final do ciclo vegetativo do milho. Os seguintes extratos em acetato de etila foram preparados:
1. Milho BRS1010 resistente doena e sem sintomas; 2. Milho de variedade desconhecida infectado pela doena e com sinais de necrose; 3. Milho de variedade desconhecida infectado pela doena (dos mesmos vegetais de onde foram coletadas as folhas necrosadas), porm sem sinais de necrose.
Foram preparadas solues estoque em etanol absoluto de cada extrato, e estas foram bioensaiadas da mesma maneira descrita para o milho proveniente do cultivo em casa de vegetao, incluindo os controles positivo e negativos. Foram observadas atividades positivas em todos os extratos, inclusive naquele proveniente de plantas no infectadas e resistentes (milho BRS1010) (Figura 37). As atividades biolgicas positivas observadas em todos os extratos, mesmo nos controles no-infectados pelos patgenos, deve ter ocorrido devido presena de outras bactrias endofticas, no patognicas, que podem estar
66
presentes em todos os tecidos e que tambm poderiam sintetizar acil-HSLs, ativando o biossensor. Outra possibilidade seria a possvel produo pelo milho de substncias com atividade agonista das acil-HSLs e que tambm poderiam ativar o biossensor. Na literatura, foram reportados casos onde plntulas de ervilha (Pisum sativum) cultivadas em condies estreis propiciaram ativao do biossensor Chromobacterium violaceum CV026, numa clara indicao da produo de substncias com atividades homlogas s das acil-HSLs no vegetal livre da presena de microrganismos em seus tecidos. O fenmeno tambm foi observado com seedlings de arroz, alface, soja, tomate e outros vegetais (Teplitski et al., 2000).
a.
b.
c.
d.
Figura 36. Avaliao da atividade biolgica de expresso de enzimas galactosidase com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4) na presena de XGal. a. Etanol (branco). b. ()-N-hexanoil-HSL sinttica (controle +). c. Extrato de milho HS200 infectado pela bactria P. agglomerans, com o respectivo controle do extrato direita. d. Extrato de milho HS200 no infectado, com o controle do extrato direita. Solues preparadas em etanol.
67
a.
b.
c.
d.
e.
Figura 37. Avaliao da atividade biolgica de expresso de enzimas galactosidase com a cepa A. tumefaciens NTL4(pZLR4) na presena de XGal. Amostras: extratos em acetato de etila obtidos a partir de folhas de milho coletado em campo. a. Etanol (controle negativo). b. ()-N-hexanoil-HSL (controle positivo). c. Extrato de milho BRS1010 no infectado, com o respectivo controle do extrato direita. d. Extrato de milho de variedade desconhecida com folhas doentes apresentando necrose, e o respectivo controle do extrato direita. e. Extrato de milho de variedade desconhecida com folhas coletadas de plantas doentes, mas as folhas no apresentavam necrose, e o respectivo controle do extrato direita. As solues estoque foram preparadas em etanol.
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1.4. Concluses A Qumica da Comunicao Bacteriana
O estudo qumico dos caldos de cultivo das bactrias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans rendeu a identificao de diversas substncias da classe das acil-homosserina lactonas, reconhecidamente empregadas em mecanismos de comunicao intercelular. Este trabalho reporta as primeiras ocorrncias da substncia Nheptanoil-HSL (2) nos gneros Pantoea e Erwinia, sendo uma substncia sinalizadora de rara ocorrncia. O diferencial estrutural desta substncia est em sua cadeia acila com nmero mpar de carbonos, suja origem biossinttica est associada provavelmente ao cido propinico. Sob o ponto de vista quimiotaxonmico, as acil-HSLs identificadas neste trabalho correspondem estruturalmente ao que tm sido reportado na literatura sobre esta classe de substncias para o gnero Erwinia, sendo observados principalmente compostos com cadeias acila curtas. Reportou-se pela primeira vez o uso da metodologia de CG-FID com coluna quiral para determinar a configurao absoluta de acil-HSLs naturais. A metodologia provou ser eficiente em casos onde a quantidade de substncia era pequena ou ainda quando a substncia de interesse estava presente em misturas complexas. Acredita-se que este seja o primeiro trabalho de identificao qumica de acil-HSLs produzidas por bactrias brasileiras. Uma vez que os microrganismos estudados possuem destacada importncia econmica, esperase que um aprofundamento nos estudos sobre os fatores fenotpicos controlados pelas acil-HSLs possa fornecer maneiras de controlar estas bacterioses. Este aprofundamento est relacionado principalmente ao sequenciamento dos genes homlogos de luxI e luxR, responsveis pela
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sntese e deteco das substncias sinalizadoras; obteno de mutantes incapazes de produzir as acil-HSLs e verificar quais fatores fenotpicos so afetados; e finalmente, obter compostos com atividades antagonistas, que uma vez administrados podem reduzir a virulncia das cepas interferindo nos mecanismos comunicativos. Abre-se, portanto, uma vasta rea de pesquisas a partir dos resultados apresentados neste trabalho.
70
___________________________________CAPTULO 2 DEFESA QUMICA EM OPILIES
____________________________ CAPTULO 2
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Captulo 2 Defesa Qumica em Opilies
2.1. Introduo
Opilies (ordem Opiliones) so animais pertencentes classe Arachnida. Estes aracndeos vivem em locais midos e sombreados, sendo ativos principalmente noite. Durante o dia eles normalmente se escondem sob toras, cavernas, pedras, no folhio ou em vegetaes densas. Sua alimentao consiste basicamente de insetos vivos, porm podem se alimentar ocasionalmente de animais mortos ou seiva de plantas (Eisner et al., 1978). Todas as subordens da ordem Opiliones Cythophthalmi, Laniatores, Eupnoi e Dyspnoi possuem glndulas de defesa. Estes rgos consistem de um par de sacos compressveis, situados no dorso do animal e com sadas situadas prximo das margens de sua carapaa (Eisner et al., 1978). Assim como as outras glndulas excrinas de artrpodes, estas so invaginaes na parede corporal, consistindo de um epitlio glandular e canais membranosos. A presena ou ausncia de msculos especializados na compresso destas glndulas varia de acordo com a subordem. Nas espcies onde o msculo compressor ausente, este papel realizado pelos rgos adjacentes (Eisner et al., 1978). O estudo qumico da secreo de defesa dos animais da subordem Laniatores tm revelado principalmente a presena de quinonas e fenis. Quinonas so substncias qumicas altamente empregadas como defesa em artrpodes, notoriamente insetos e centopias. Entretanto, as benzoquinonas alquiladas presentes em opilies possuem ocorrncia mais restrita (Eisner et al., 1978).
73
Estas secrees so utilizadas pelos animais na defesa contra predadores. Em laboratrio, as substncias repelem eficientemente formigas e aranhas. A forma de disposio do fludo pode ser por spray (raramente) ou de modo mais comum, simplesmente saindo da glndula e formando gotculas nas laterais do animal. O fludo pode ento ser espalhado por toda a carapaa atravs de canais externos, ou ainda ser pincelado pela pata do animal e esfregado sobre o predador (Eisner et al., 1978). Apesar da grande diversidade de espcies da subordem Laniatores (mais de 3000 espcies), poucas foram estudadas sob o ponto de vista qumico (Bragagnolo e Pinto-da-Rocha, 2005). Na subordem Laniatores as secrees de defesa de apenas 13 espcies foram estudadas, revelando a presena de 5 tipos de benzoquinonas alquiladas (Figura 38), alm de fenis alquilados. A primeira espcie estudada na subordem Laniatores foi Vonones sayi (Cosmetidae). Esta espcie administra a substncia repelente com as patas. O animal produz quinonas, que so estocadas na forma no diluda. Quando perturbado, ele libera um fludo entrico (constitudo principalmente por gua) atravs da boca e que escorre atravs de canais at a abertura da glndula. Em seguida, as quinonas so expulsas da glndula e se diluem no fludo entrico, formando gotas amareladas nas laterais do animal. A anlise da secreo glandular por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas e espectroscopia no infravermelho permitiu identificar as substncias como a 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona e 2,3,5-trimetil-1,4-benzoquinona, o que foi confirmado por comparaes com dados de padres autnticos (Eisner et al., 1971).
74

O O O O
O O
O OH
O OH
O OH
Figura 38. Benzoquinonas e fenis identificados nas secrees de defesa de opilies da subordem Laniatores.
O estudo qumico da secreo glandular da espcie Stygnomma spinifera (Stygnommatidae), uma espcie de opilio que habita a Flrida (Estados Unidos), demonstrou ser formada de diversas substncias volteis: 2metil-5-etil-fenol, 2,3-dimetil-fenol e 2,3-dimetil-5-etil-fenol (Duffield et al., 1981). O estudo de quatro espcies da Amrica Central (nativas das proximidades do Canal do Panam) permitiu a identificao de quinonas em sua secreo glandular. Da espcie Paecilaemella eutypa (Cosmetidae) foram identificadas a 2,5-dimetil-1,4-benzoquinona, 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona e 2,3,5-trimetil-1,4-benzoquinona. Paecilaemella quadripunctata (Cosmetidae) utiliza-se da 2,3,5-trimetil-1,4-benzoquinona e 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona como defesa qumica. Cynorta astora (Cosmetidae) utiliza-se de 2,3-dimetilfenol e 2-metil-5-etil-fenol. Por fim, a espcie Zygopachylus albimarginis (Gonyleptidae) utiliza-se da 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona e um segundo componente no identificado como secreo de defesa (Eisner et al., 1977).
75
Na
espcie
argentina
Pachyloidellus
goliath
(Gonyleptidae),
identificou-se os fenis 2,3-dimetilfenol, 2-metil-5-etilfenol e 2,3-dimetil-5etilfenol. Tambm foram identificadas as quinonas 2,3,5-trimetil-1,4benzoquinona, 2,3-dimetil-5-etil-1,4-benzoquinona e 2,3-dimetil-1,4-
benzoquinona (Acosta et al., 1993). Outras espcies estudadas foram a Nesopachylus monocerus
(Gonyleptidae), onde identificou-se a 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona e 2,3,5trimetil-1,4-benzoquinona; Cynorta nannacornuta (Cosmetidae),
identificando-se os mesmos metablitos; e Eucynortula albipunctata (Cosmetidae) que se utiliza dos fenis 2,3-dimetil-fenol e 2-metil-5-etil-fenol como defesa qumica (Roach et al., 1980). Recentemente, a espcie Acanthopachylus aculeatus (Gonyleptidae) foi re-estudada (Figura 39), confirmando-se a presena de 2,3-dimetil-1,4benzoquinona, 2,5-dimetil-1,4-benzoquinona e 2,3,5-trimetil-1,4-
benzoquinona, identificadas na dcada de 1950 atravs de tcnicas clssicas de elucidao qumica (Figura 39) (Eisner et al, 2004; Estable et al., 1955).
Figura 39. Acanthopachylus aculeatus (Gonyleptidae). esquerda, fludo entrico aquoso indicado por seta; direita, o fludo entrico est misturado com as benzoquinonas, que conferem colorao amarela secreo de defesa (Eisner et al, 2004).
76
A nica espcie do gnero Goniosoma cuja composio qumica da glndula de defesa foi descrita a Goniosoma spelaeum (Gonyleptidae). Esta espcie brasileira ocorre na regio do Vale do Ribeira, So Paulo. Nesta espcie, identificou-se a 2-etil-1,4-benzoquinona e 2,3,5-trimetil-1,4-
benzoquinona como substncias de defesa (Gnaspini e Cavalheiro, 1998).
2.1.1. Goniosoma longipes ROEWER e Camarana flavipalpi SOARES (Gonyleptidae)
Goniosoma longipes um opilio pertencente famlia Gonyleptidae, que ocorre no Estado de So Paulo, especificamente no Parque Florestal Itapetinga, municpio de Atibaia. Esta espcie possui hbitos noturnos e caverncolas, exibindo ainda cuidados maternos com os ovos (Figura 40). Este animal tem sido extensivamente estudado pelo Dr. Glauco Machado, do Instituto de Biologia da Unicamp (Machado e Silveira, 1998). Assim, num trabalho de colaborao, realizamos o estudo qumico da secreo de defesa desta espcie.
Figura 40. G. longipes em habitat natural. Esquerda: agrupamento de animais; Centro: fmea cuidando dos ovos, na parede da caverna. Direita: fmea em destaque.
77
A espcie Camarana flavipalpi nativa do litoral paulista. No existem relatos na literatura do estudo da secreo de defesa de opilies do gnero Camarana (Figura 41).
Figura 41. C. flavipalpi em habitat natural.
78
2.2. Objetivos
Os objetivos deste captulo so caracterizar quimicamente as secrees de defesa dos opilies G. longipes e C. flavipalpi, atravs de tcnicas como espectrometria de massas e espectroscopia de ressonncia magntica nuclear de hidrognio e carbono uni e bidimensionais.
79
2.3. Resultados e Discusso Defesa qumica em opilies
Os opilies so aracndeos que se utilizam de substncias qumicas para se defenderem contra predadores. A elucidao da composio qumica dessas secrees importante, pois fornece pistas sobre seu modo de ao.
2.3.1. Estudo qumico da secreo de defesa do opilio C. flavipalpi (Laniatores: Gonyleptidae)
A coleta da secreo de defesa do opilio Camarana flavipalpi foi feita pressionando as glndulas produtoras (situadas nas laterais do animal) com algodo tratado, ou seja, sucessivamente lavado com acetato de etila bidestilado. Uma quantidade extremamente pequena (~0,3 mg) de secreo foi coletada de um indivduo. A secreo era incolor e apresentava odor desagradvel. A secreo foi extrada do algodo com acetato de etila. A fase orgnica foi analisada inicialmente por CCD, revelando a presena de uma nica substncia, o que foi confirmado por CG-EM (Figura 42). O padro de fragmentao da substncia era coerente com o reportado na literatura para o etil-metil-fenol (Figura 43) (McLafferty e Stauffer, 1992). O on molecular intenso em m/z 136 (42 %) e outros sinais caractersticos como m/z 121 (100 %) (resultante da perda de metila e formao de um on-radical derivado de benzila, altamente estvel), m/z 91 (9 %, on troplio) e 77 (16 %, on fenila) eram sugestivos da presena de uma estrutura aromtica. Porm, a partir do espectro de massas seria arriscado definir o padro de substituio do anel aromtico.
80
Figura 42. Cromatograma de ons totais (CG-EM, IE, 70 eV) da secreo do opilio C. flavipalpi (Gonyleptidae). Condies de anlise: coluna HP-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 m), programa de temperaturas 50C-(10C/min)-200C(16C/min)-290C.
OH
Figura 43. Espectro de massas (IE, 70 eV) da substncia (5) identificada na secreo de defesa do opilio C. flavipalpi.
Devido pequena quantidade de substncia secretada pelos indivduos, as anlises de ressonncia magntica nuclear s puderam ser realizadas mediante extrao da secreo de defesa de diversos animais. Desta forma, 7 animais foram utilizados, totalizando aproximadamente 2,1 mg de secreo, que foi diretamente extrada do algodo com CDCl3/TMS. A anlise de
81
ressonncia magntica nuclear de hidrognio mostrou uma amostra menos pura do que o observado por CG-EM, muito provavelmente devido ao maior nmero de indivduos de onde a secreo foi extrada; no est descartada a possibilidade de contaminao por fludo entrico. Porm, a amostra apresentava um componente majoritrio, passvel de ser identificado (Figura 44). A regio aromtica apresentou um padro de substituio 1, 2, 5 evidente, com um dubleto em 7,03 (H-3, 3J 7,6 Hz), um duplo-dubleto em 6,70 (H4, 3J 7,6 Hz; 4J 1,5 Hz) e um dubleto com acoplamento meta (H-6, 4J 1,5 Hz) em 6,40, cada sinal integrando para um hidrognio.
OH
Figura 44. Espectro de RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (5), identificada na secreo de defesa do opilio C. flavipalpi.
82
O espectro de diferena de NOE mostrou 0,53 % de incremento no sinal do hidrognio H-3 quanto o grupo metila (singleto) em 2,22 foi irradiado (Figura 45). No foram observados incrementos em sinais correspondentes ao grupo etila em 2,57 (CH2, quarteto, 2H, J 7,6 Hz) e 1,22 (CH3, tripleto, 3H, J 7,6 Hz). Portanto, inferiu-se que o grupo etila estava ligado ao carbono 5, e o composto foi identificado como 2-metil-5-etil-fenol (5). Esta substncia foi previamente descrita nas secrees de defesa dos opilies Strygnomma spinifera (Duffield et al., 1981), Cynorta astora (Eisner et al., 1977), Pachyloidellus goliath (Acosta et al., 1993) e Eucynortula albipunctata (Roach et al., 1980). Porm, trata-se do primeiro caso onde o metablito (7) aparece como a nica substncia de defesa, e no como um componente em misturas com outros fenis ou quinonas.
0,53 %
OH
H 7,1
Figura 45. Espectro de RMN de 1H (NOESY 1D) (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (5), obtido por irradiao do singleto em 2,22 (CH3).
83
2.3.2. Estudo qumico da secreo de defesa do opilio G. longipes (Laniatores: Gonyleptidae)
O opilio Goniosoma longipes (Laniatores: Gonyleptidae) nativo do Parque Florestal Itapetinga, municpio de Atibaia (2315S; 4645W), So Paulo. Os animais so encontrados habitando principalmente paredes de cavernas. A coleta da secreo de defesa desta espcie tambm foi feita utilizando-se algodo tratado, pressionando as glndulas laterais do animal. Para anlises em CCD e CG-EM, a secreo de um indivduo macho (~12 mg) foi coletada e extrada com acetato de etila. A secreo apresentava colorao marrom e odor extremamente forte, alm de uma alta volatilidade que dificultava a manipulao da amostra. A anlise em CCD mostrou a presena de uma nica mancha. Porm, a anlise por CG-EM revelou a presena de duas substncias de alta volatilidade (Figura 46a). O padro de fragmentao de um dos compostos era idntico ao reportado da 2,3-dimetil-1,4benzoquinona (6) (Figura 46b) (Budzikiweicz et al., 1967). Uma pequena quantidade do composto puro (6) pde ser obtida por cromatografia em camada delgada. Devido simetria molecular, o composto (6) mostrou dois singletos no espectro de ressonncia magntica nuclear de hidrognio, em 2.05 para 6 prtons de metilas e em 6.72 para os outros 2 prtons
aromticos (Figura 47). A frmula molecular C8H8O2 foi confirmada por espectrometria de massas de alta resoluo (calculado: 136,05244; observado: 136,05392) (Anexo E42). Em seguida, o mapa de contornos de ressonncia magntica nuclear bidimensional de correlaes 1H,
13
C 1J (HSQC) (Anexo
E35) foi utilizado na assinalao dos deslocamentos qumicos dos carbonos ligados a hidrognio nesta substncia, permitindo diferencia-los dos outros sinais dos carbonos do segundo componente da amostra. Tcnicas adicionas
84
de RMN de correlaes 1H, 13C nJ (gHMBC) (Anexo E38), correlaes 1H, 1H (gCOSY) (Anexo E34), RMN de
13
C DEPT-135 e DEPT-90 (Anexo E32)
permitiram a assinalao total dos deslocamentos qumicos em RMN para esta substncia.
a.
(7 )
(6 )
b.
(6 )
c.
(7 )
Figura 46. a. Cromatograma de ons totais (CG-EM) da secreo de defesa do opilio G. longipes macho. b. Espectro de massas (IE, 70 eV) da 2,3dimetil-1,4-benzoquinona (6). c. Espectro de massas (IE, 70 eV) da 2-etil-3metil-1,4-benzoquinona (7). Condies de anlise: coluna HP-5 (30 m, 0,25
85
mm,
0,25
m), programa de temperaturas 50C-(10C/min)-200C-
(16C/min)-290C.
Figura 47. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, TMS, 300,07 MHz) da substncia (6) isolada da secreo de defesa de G. longipes.
O
Figura 48. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, TMS, 300,07 MHz) das substncias (6) e (7) da secreo de defesa de G. longipes. Os sinais da substncia (6) esto indicados.
86
A simplicidade espectral da substncia (6) permitiu a identificao do segundo componente da mistura sem purifica-la. Este fato foi aproveitado, uma vez que diversas tentativas de purificar grandes quantidades da secreo por CCD e CC falharam, principalmente devido no separao dos componentes em diversas misturas eluentes e devido alta volatilidade da amostra, que ocasionava grandes perdas de material. O padro de fragmentao por CG-EM (IE) do segundo componente da amostra no coincidia com nenhuma fragmentao de 1,4-benzoquinonas identificadas em artrpodes (Figura 46c). O uso das tcnicas de RMN de 1H e
13
C uni e bidimensionais permitiu a assinalao dos deslocamentos qumicos
deste composto, que foi identificado como a 2-etil-3-metil-1,4-benzoquinona (7). A frmula molecular C9H10O2 foi confirmada por espectrometria de massas de alta resoluo (calculado: 150,06810; observado: 150,06824) (Anexo E42). Um substituinte CH2CH3 foi facilmente caracterizado pelo sistema de spin A3X2 ( 2.51 para 2H e 1.06 para 3H) no espectro de RMN de 1H (Figura 48), o que foi posteriormente confirmado pelo espectro de correlaes 1H, 1H homonucleares (gCOSY) (Anexo E34). O padro de substituio do composto (7) foi inicialmente sugerido pela presena de um intenso fragmento m/z 54 no espectro de massas de baixa resoluo, atribuvel ao fragmento ciclopropenona e posteriormente confirmado por espectrometria de massas de alta resoluo (C3H2O+ observado: m/z 54,01036; calculado: m/z 54,01056) (Figura 49). Esta hiptese foi posteriormente confirmada pelas correlaes 3J H-7/C-3, H-7/C-1, H-9/C-2 e H-9/C-4 espectro de correlaes heteronucleares 1H,
13
observadas pelo
C a longa distncia (gHMBC)
(Anexo E38). Outros mtodos espectroscpicos como gHSQC (1H,13C 1J) (Anexo E35), DEPT-135 e DEPT-90 (Anexo E32) tambm foram utilizados na assinalao dos deslocamentos qumicos do composto (7).
87
A anlise por CG-EM de secrees de defesa de indivduos macho, fmea, fmea ovgera e fmea aps postura no revelou diferenas em sua composio qumica. Observou-se apenas pequenas variaes na proporo dos componentes. A substncia (7) sempre se manteve em proporo pouco menor que a substncia (6) (Tabela 2).
m/z 54 (50%) O
1 6 5 4 2 3 8 7
m/z 54 (22%) O
1 6 5 4 2 3 9 7 8
O (6)
O (7)
Figura 49. Origem do fragmento m/z 54 nos espectros de massas das substncias (6) e (7).
Tabela 2. Abundncias relativas obtidas por CG-EM (IE, 70 eV) das substncias identificadas nas secrees de defesa de diferentes indivduos de G. longipes. Animal Abundncia relativa de 2,3-dimetil-1,4benzoquinona (6) Macho Fmea Fmea ovgera Fmea aps postura
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Abundncia relativa de 2etil-3-metil-1,4benzoquinona (7) 39,35 % 42,99 % 46,90 % 42,35 %
60,65 % 57,01 % 53,09 % 57,65 %
A substncia 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona j havia sido reportada para diversas espcies de opilies da subordem Laniatores. No entanto, a substncia 2-etil-3-metil-1,4-benzoquinona nunca havia sido reportada nesta subordem. Buscas no Chemical Abstracts e Scifinder com a frmula molecular C9H10O2 realizada entre os anos 1907 e 2005 mostram que esta substncia um produto natural indito.
Tabela 3. Deslocamentos qumicos em RMN para a substncia 2,3-dimetil1,4-benzoquinona (6) (CDCl3, TMS, 499,88 MHz para RMN de 1H e 125,71 MHz para RMN de 13C). C 1 2 3 4 5 6 7 8
H
6,72 (s, 1H) 6,72 (s, 1H) 2,05 (s, 3H) 2,05 (s, 3H)
C
187,39 140,99 140,99 187,39 136,04 136,04 12,18 12,18
HSQC 1H, 13 C (1J) 136,24 (C5) 136,24 (C6) 12,18 (C7) 12,18 (C8)
gHMBC 1H, 13C (nJ) 187,39 (C4) 187,39 (C1) 140,90 (C2); 187,39 (C1) 140,90 (C3); 187,39 (C4)
DEPT CH CH CH3 CH3
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Tabela 4. Deslocamentos qumicos em RMN para a substncia 2-etil-3-metil1,4-benzoquinona (7) (CDCl3, TMS, 499,88 MHz para RMN de 1H e 125,71 MHz para RMN de 13C).
H
6,71(s largo, 1H) 6,71(s largo, 1H) 2,51 (q, J 7.6 Hz, 2H)
gCOSY 1 H, 1H 1,06
C
187,10 146,15 140,37 187,90 136,19a 136,37a 19,73
1 2 3 4 5 6 7
12,84 (C8); 140,37 CH2 (C3); 146,15 (C2); 187,10 (C1) 8 1,06 (t, J 7.6 2,51 12,84 12,84 19,73 (C7); 146,15 CH3 Hz, 3H) (C8) (C2) 9 2,05 (s, 3H) 11,63 11,63 140,37 (C3); CH3 (C9) 146,15 (C2); 187,90 (C4) a,b c os C com a mesma letra podem ser intercambiados. Experimentos DEPT135 e DEPT-90
HSQC 1 H, 13C (1J) 136,19 (C5)b 136,37 (C6)b 19,73 (C7)
gHMBC 1 H, 13C (nJ) 187,90 (C4) 187,10 (C1)
DEPTc
CH CH
A caracterizao qumica da secreo de defesa de G. longipes revelou, com isso, a presena de duas benzoquinonas substitudas. As estruturas das substncias identificadas coerente com a alta volatilidade da secreo de defesa. Esta volatilidade importante, uma vez que permite uma maior efetividade de disperso sobre o animal que porventura ataque o opilio. Existem evidncias de que a secreo de defesa possa ser utilizada tambm como feromnio de alarme, numa situao onde a volatilidade e
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dispersibilidade so fatores importantes. Num trabalho recente, verificou-se que a secreo de defesa de G. longipes efetiva na repelncia de formigas, aranhas, grilos e sapos (Machado, 2002; Machado et al., 2005).
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2.4. Concluses Defesa Qumica em Opilies
Reportou-se neste captulo o estudo qumico indito de duas espcies de opilies brasileiros, G. longipes e C. flavipalpi. Em ambas as espcies foram identificadas substncias de alta volatilidade e irritabilidade, utilizadas em mecanismos de defesa territorial e contra predadores. O estudo da espcie G. longipes rendeu a identificao de duas benzoquinonas substitudas, uma das quais um produto natural indito (2etil-3-metil-1,4-benzoquinona). A espcie C. flavipalpi utiliza-se de um fenol substitudo como secreo de defesa. Alm de serem interessantes sob o ponto de vista quimiotaxonmico, os resultados obtidos colaboram com a pesquisa desenvolvida pelo Dr. Glauco Machado, do Instituto de Biologia da Unicamp, provendo uma melhor compreenso dos mecanismos de defesa dos opilies.
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____________________________________________CAPTULO 3 CONCLUSES FINAIS
____________________________ CAPTULO 3
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Captulo 3 Concluses Finais
O presente trabalho abordou dois temas relacionados s substncias carreadoras de informaes entre indivduos, os semioqumicos. O estudo de substncias sinalizadoras produzidas por bactrias Gramnegativas brasileiras rendeu a identificao de quatro acil-homosserina lactonas distintas. O trabalho de identificao qumica foi acompanhado por testes biolgicos com um reprter construdo especificamente para detectar esta classe de compostos, alm de snteses das substncias identificadas. Os microrganismos estudados so economicamente importantes no Brasil pois afetam a produo de diversas culturas como a goiaba, o abacaxi e o milho. As acil-homosserina lactonas representam a principal classe de substncias comunicadoras produzidas por bactrias Gram-negativas. notria na literatura a importncia destas substncias no controle da expresso de diversos fatores de patogenicidade em diferentes microrganismos. Portanto, acredita-se que uma melhor compreenso de como estes mecanismos comunicativos atuam nas bactrias em questo possa fornecer maneiras de controlar estas doenas. Vale a pena destacar o uso da metodologia de cromatografia gasosa acoplada com deteco por ionizao em chama e fase estacionria quiral para determinar a configurao absoluta das acil-homosserina lactonas. A tcnica se mostrou eficiente, uma vez que requer pequenas quantidades de amostras, j que as substncias sinalizadoras so produzidas pelas bactrias em pequenas concentraes.
95
Alm dos feromnios produzidos por bactrias, estudou-se tambm os alomnios produzidos por duas espcies de opilies brasileiros no estudadas anteriormente. Esta seo do trabalho rendeu a identificao de trs metablitos, um dos quais indito na natureza, alm de contribuir para uma melhor compreenso dos mecanismos defensivos em opilies. Alm dos avanos cientficos alcanados, vale a pena destacar o aprendizado de diversas tcnicas e metodologias laboratoriais descritos ao longo do texto, que enriqueceram o mestrando em duas reas distantes da Ecologia Qumica, tendo como objetos de estudos desde bactrias at aracndeos. Acredita-se tambm que este constitua o primeiro trabalho de identificao qumica de substncias sinalizadoras produzidas por bactrias no Brasil.
96
__________________________________________CAPTULO 4 PARTE EXPERIMENTAL
____________________________ CAPTULO 4
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CAPTULO 4 - PARTE EXPERIMENTAL
4.1. Materiais e Equipamentos
4.1.1. Equipamentos
Cromatografia a gs-espectrometria de massas (CG-EM)
As anlises de cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (CG-EM) foram feitas em cromatgrafo a gs marca Agilent modelo 6890, acoplado a um detector seletivo de massas operando por impacto de eltrons a 70 eV marca Hewlett Packard modelo 5973. O cromatgrafo operava com coluna capilar de slica fundida do tipo HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m). Empregou-se hlio de alta pureza como gs de arraste, com fluxo de 1 mL/min. As anlises foram realizadas com injetor operando a 250C e interface a 280C. Os volumes injetados foram de 1 L de soluo, sem diviso de fluxo. Utilizou-se os seguintes programas de desenvolvimento cromatogrfico:
Programa 1: Forno inicialmente a 70C, com incremento de temperatura de 5C/min at 290C, e 10 minutos isotermicamente 290C. Deteco por varredura de ons com intervalo de massas entre m/z 50-550.
Programa 2: Forno inicialmente a 100C, com incremento de temperatura de 10C/min at 290C, e 10 min isotermicamente 290C. Deteco por varredura de ons com intervalo de massas entre m/z 40-450.
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Programa 3: Forno inicialmente a 50C, com incremento de temperatura de 10C/min at 200C, e 16C/min at 290C. Deteco por varredura de ons com intervalo de massas entre m/z 40-450.
Cromatografia a gs-deteco por ionizao em chama (CG-FID)
As anlises de cromatografia gasosa acoplada deteco por ionizao em chama e fase estacionria quiral [CG(quiral)-FID] foram feitas em cromatgrafo a gs marca AGILENT modelo 6890. O cromatgrafo operava com coluna do tipo Chrompack chirasil ciclodextrina CB (25 m x 0,25 mm x 0,25 m) ou com coluna do tipo heptakis-(2,3-dimetil-6-pentil)-ciclodextrina (25 m x 0,25 mm x 0,25 m), fabricante Universidade de Hamburg, Alemanha. Empregou-se hidrognio de alta pureza como gs de arraste, com fluxo de 1 mL/min. As anlises foram realizadas com injetor operando a 220C. Os volumes injetados foram de 1 L com concentrao de solutos a 1 mg/mL, com diviso de fluxo de 1/100. O forno foi inicialmente mantido a 50C, com incremento de temperatura de 2C/min at 180C, e 5 min isotermicamente 180C.
Ressonncia magntica nuclear (RMN)
Os espectros de ressonncia magntica nuclear de hidrognio foram obtidos em equipamento Varian Inova-500, operando a 499,88 MHz ou em equipamento Varian Gemini-300, operando a 300,06 MHz. Utilizou-se CDCl3 como solvente e tetrametilsilano (TMS) como referncia interna ( 0,0). As anlises foram realizadas temperatura ambiente. Os valores de
100
deslocamentos qumicos foram obtidos em ppm e as constantes de acoplamento em Hertz (Hz). Em alguns casos, dados adicionais foram obtidos pelo uso da tcnica gCOSY, permitindo verificar em mapas de contorno o acoplamento entre hidrognios a trs ligaes. Os espectros de ressonncia magntica nuclear de carbono foram obtidos em equipamento Varian Inova, operando a 125,71 MHz ou em equipamento Bruker Gemini, operando a 75,45 MHz. Utilizou-se CDCl3 como solvente e tetrametilsilano (TMS) como referncia interna ( 0,0). As anlises foram realizadas temperatura ambiente. Os valores de deslocamentos qumicos foram obtidos em ppm e as constantes de acoplamento em Hertz (Hz). Como dados auxiliares, em alguns casos foram obtidos espectros pela tcnica DEPT 135 onde: CH3 e CH aparecem como sinais positivos, CH2 como sinais negativos e carbonos quaternrios com intensidade zero. A tcnica DEPT 90 mostra apenas sinais de CH. Alm disso, espectros bidimensionais de correlaes 1H, ligaes (gHMBC) foram
13
C a uma ligao (HSQC) e mltiplas nas assinalaes dos dados
utilizados
espectroscpicos.
Espectroscopia no infravermelho (IV), expectrometria de massas de alta resoluo (EMAR) e rotao tica especfica []D
As anlises polarimtricas foram feitas em equipamento Perkin-Elmer 341 a 17C e os resultados foram convertidos para 20C atravs de equaes indicadas pelo fabricante. Utilizou-se metanol grau HPLC de pureza como solvente nas anlises polarimtricas. As anlises de espectrometria de massas de alta resoluo foram feitas em equipamento Micromass VG AutoSpecE (IE, 70 eV). As anlises de espectroscopia no infravermelho foram feitas em
101
equipamento Bomem Michelson MB, utilizando pastilhas de KBr para suporte das amostras.
Manipulao de microrganismos
A manipulao e cultivo dos microrganismos utilizou capela de fluxo laminar VECO modelo VLF 509, BOD marca QUIMIS, incubadora Shaker MARCONI modelo MA 420, centrfuga marca HARRIER MSE 18/80 e autoclave marca PHOENIX modelo LV30.
Outros equipamentos
Outros equipamentos: geladeira marca ELECTROLUX, freezer ELECTROLUX, balana analtica SARTORIUS BL1205, estufa de secagem, agitador magntico THERMOLYNE Cimarec 2 e evaporador rotativo marca BCHI B-480.
4.1.2. Meios de cultivo para microrganismos O meio de cultivo Caldo Nutriente (NB) era proveniente da OXOID. O meio NB lquido foi preparado a partir de 20 g de meio NB para 1000 mL de gua destilada. O meio slido NB foi produzido pela adio de 2 % de gar bacteriolgico marca SIGMA. O meio de cultivo Luria-Bertani (LB) possui a seguinte constituio: 1 % peptona (OXOID), 0,5 % NaCl, 0,5 % extrato de levedura (OXOID). Para o meio slido, adicionou-se 2 % de gar (SIGMA) (Ravn et al., 2001). O meio TSB era proveniente da Biobrs e foi preparado como descrito para o meio de cultivo caldo nutriente.
102
4.1.3. Reagentes e solventes
Todos os solventes utilizados eram da marca SYNTH, grau P.A. de pureza. Estes foram destilados ou bidestilados antes do uso. Os reagentes bromidrato de ()--amino--butirolactona, bromidrato de (S)-(-)--amino-butirolactona, cido hexanico, cido heptanico, cido butanico e cido octanico eram provenientes da ALDRICH. O reagente cloridrato de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida era proveniente da SIGMA. Estes so conservados sob refrigerao (-20C). A trietilamina era proveniente da
MERCK, foi destilada e mantida sob KOH (SYNTH). A slica para cromatografia em coluna era proveniente da MERCK, com granulometria 0,035-0,070 mm. As anlises em cromatografia em camada delgada foram feitas em placas de slica suportadas sobre alumnio Slica gel 60 F254 (MERCK). Como reveladores, utilizou-se a tcnica fsica de exposio luz ultravioleta (254 nm) e revelao qumica, atravs da asperso ou mergulho das placas em soluo de p-anisaldedo (5 %), cido actico glacial (50 mL) e cido sulfrico concentrado (1 mL), seguida de aquecimento at aparecimento de manchas coloridas.
4.1.4. Cepas bacterianas
A cepa Erwinia psidii RODRIGUES-NETO IBSBF 435 tipo foi gentilmente cedida pelo Dr. Jlio Rodrigues Neto, curador da coleo de culturas do Instituto Biolgico de So Paulo, subestao Campinas. Isolado de Psidium guajava (goiabeira) em 1982, Brasil (=ICMP 8426, NCPPB 3555; LMG 7039; ATCC 49406). A reativao do cultivo liofilizado foi
103
realizada segundo instrues prprias da Coleo de Culturas IBSBF que forneceu a cepa. Basicamente, a cepa foi re-hidratada por 20 minutos com meio lquido caldo nutriente (NB) com agitaes aleatrias com o pipetador. Alquotas de 100 L da suspenso celular foram transferidas para placas de petri contendo meio NB slido, e espalhadas com ala de Drigalski estril. As placas foram levadas para incubao em BOD a 30C por 45 horas. Aps este perodo, as colnias esbranquiadas foram transferidas para tubos slant contendo meio NB slido. A pureza da cepa foi atestada mediante lminas de Gram e observaes ao microscpio (Instituto de Biologia, Unicamp). A cepa Pantoea ananatis SERRANO CCT 6481T (= IBSBF 860, NCPPB 1846, ICMP 1850, ATCC 33244), linhagem tipo, foi adquirida da Coleo de Culturas Tropical, da Fundao Andr Tosello (Campinas, So Paulo). A bactria foi mantida em meio NB slido. A bactria foi isolada no Brasil a partir de uma infeco em abacaxi (Ananas comosus) em 1965. A bactria Pantoea agglomerans EWING & FIFE CBMAI 732 foi isolada a partir de leses do tipo anasarca em folhas de milho infectado pela doena da pinta branca do milho, pela Dra. Luzia D. Paccola-Meirelles, da Universidade Estadual de Londrina (UEL), Paran. O milho foi coletado num cultivo de campo realizado na Fazenda Escola da UEL em dezembro de 2003. O procedimento de isolamento da cepa est descrito na literatura (PaccolaMeirelles et al., 2001). A identificao da cepa foi feita mediante seqenciamento e anlise filogentica de fragmentos do gene rRNA 16S. A metodologia consistiu na amplificao do DNA ribossomal 16S pela metodologia PCR, utilizando como molde o DNA genmico extrado diretamente da amostra. Os primers (oligonucleotdeos sintticos) utilizados para a reao de PCR foram p27f e p1401r, homlogos s extremidades conservadas do gene rRNA 16S de bactrias. Em seguida, os fragmentos de
104
rDNA 16S amplificados foram purificados e submetidos diretamente ao sequenciamento em seqenciador automtico MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences). Os primers utilizados para o sequenciamento foram p10f, 765f, 782r e 1100r. As seqncias parciais de rDNA 16S obtidas com os diferentes primers foram montadas em um contig (seqncia nica combinando os diferentes fragmentos obtidos) e comparadas com as seqncias de rDNA 16S de organismos representados nas bases de dados do RDP (Ribosomal Database Project, Wiscosin, USA)2 e Genbank3 . Foram ento selecionadas seqncias de organismos relacionados seqncia do organismo
desconhecido para realizao das anlises filogenticas. Esta metodologia permitiu identificar a bactria como sendo da espcie Pantoea agglomerans. Um repique da cepa foi depositado na Coleo Brasileira de Microrganismos do Meio Ambiente e Indstria (CBMAI), do CPQBA, UNICAMP (Campinas So Paulo), sob cdigo CBMAI 732.
4.2. Bioensaio com Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) in vivo
Realizou-se o teste biolgico in vivo com as cepas E. psidii IBSBF 435T e P. ananatis CCT 6481T atravs do bioreprter Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) para produo de acil-homosserina lactonas. Os inculos dos microrganismos Pseudomonas aeruginosa CCT 1987, Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), E. psidii IBSBF 435 e P. ananatis CCT 6481 foram preparados em tubos de ensaio contendo 2 mL de meio lquido LB. Um repique de cada microrganismo foi realizado, e os cultivos permaneceram por 24 h 28C para crescimento em BOD. Diversos tubos de
2 3
http://www.cme.msu.edu/RDP/html/index.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov
105
ensaio receberam 2 mL de meio lquido LB. Os tubos foram numerados de 1 a 6, com duplicatas. cada tubo foram adicionados: * Tubo 1 (Branco): 20 L do inculo de A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 L X-Gal (estoque 50 mg/mL em dimetilformamida). * Tubo 2 (Controle positivo): 20 L do inculo de A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 L X-Gal, 20 L do inculo de P. aeruginosa. * Tubo 3 (Teste): 20 L do inculo de A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 L X-Gal, 20 L do inculo de E. psidii. * Tubo 4 (Branco): 20 L X-Gal, 20 L do inculo de E. psidii. * Tubo 5 (Teste): 20 L do inculo de A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 L X-Gal, 20 L do inculo de P. ananatis. * Tubo 6 (Branco): 20 L X-Gal, 20 L do inculo de P. ananatis.
Aps as adies, os tubos foram agitados e mantidos sob incubao em BOD a 28C. Aps 18 horas, avaliou-se visualmente a colorao das solues. O tubo 1 (branco) apresentou apenas turbidez incolor. O tubo 2 (controle positivo) apresentou forte colorao azul; o tubo 3 (teste) tambm apresentou colorao azul. O tubo 4 (branco) apresentou turbidez incolor. Os tubos 5 (teste) e 6 (branco) apresentaram atividade biolgica positiva, com forte colorao azul.
106
4.3. Avaliao da atividade biolgica com extratos dos meios de cultivo de E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans
Prepararam-se inculos dos microrganismos E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans em tubos de ensaio contendo 10 mL de meio lquido NB. Os tubos foram mantidos sob incubao a 30C, sem agitao, em BOD. Aps 24 horas, os inculos foram transferidos a erlenmeyers (2 L) contendo 1 L de meio de cultivo NB lquido. Os cultivos foram ento incubados sob agitao. A bactria E. psidii foi cultivada a 30C e sob agitao orbital de 100 rpm, enquanto que os demais microrganismos foram incubados a 28C e 150 rpm. Aps 24 horas, os meios de cultivo foram centrifugados, sob refrigerao (5C), 5000 rpm por 20 minutos. Os sobrenadantes reunidos (1 L) foram
extrados com acetato de etila (previamente destilado), 3 x 500 mL. As fases orgnicas reunidas (1,5 L) foram extradas com gua destilada (1 x 500 mL), secas sob sulfato de sdio anidro e evaporadas sob presso reduzida a 4045C. O branco foi feito a partir de 1 L de meio de cultivo NB estril. O meio de cultivo foi extrado com acetato de etila e o extrato foi preparado como descrito acima. Os extratos assim obtidos foram cromatografados em coluna flash de slica (coluna com 1 cm de dimetro; 2 g de slica 0,035-0,070 mm de granulometria). Foram recolhidas trs fraes: 1. hexano; 2. acetato de etila ; 3. metanol, com 50 mL cada. As fraes foram evaporadas sob presso reduzida. As fraes acetato de etila provenientes dos cultivos dos microrganismos foram bioensaiadas em testes de expresso de enzimas galactosidase com o reprter Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) como
107
descrito no tpico anterior. As fraes foram solubilizadas em etanol, na concentrao de 2 mg/mL. Utilizou-se 20 L de cada soluo. Como controle branco, utilizou-se a frao acetato de etila proveniente do meio de cultivo caldo nutriente (NB). Todas as fraes acetato de etila provenientes dos cultivos dos microrganismos apresentaram respostas positivas frente ao teste biolgico. A frao proveniente do meio de cultivo caldo nutriente apresentou resposta negativa.
4.4. Cultivo das bactrias E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans para extrao de acil-homosserina lactonas
Prepararam-se inculos dos microrganismos E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans em tubos de ensaio contendo 10 mL de meio lquido NB. Os tubos foram mantidos sob incubao a 30C, sem agitao, em BOD. Aps 24 horas, os inculos foram transferidos a erlenmeyers (2 L) contendo 1 L de meio de cultivo NB lquido. Os cultivos foram ento incubados sob agitao. A bactria E. psidii foi cultivada a 30C e sob agitao orbital de 100 rpm, enquanto que os demais microrganismos foram incubados a 28C e 150 rpm. Aps 24 horas, os meios de cultivo foram centrifugados, sob refrigerao (5C), 5000 rpm por 20 minutos. Os sobrenadantes reunidos (1 L) foram
extrados com acetato de etila (previamente destilado), 3 x 500 mL. As fases orgnicas reunidas (1,5 L) foram extradas com gua destilada (1 x 500 mL), secas sobre sulfato de sdio anidro e evaporadas sob presso reduzida a 4045C. O procedimento global descrito acima foi repetido, perfazendo-se 8 litros de cultivo nos casos das bactrias E. psidii e P. ananatis. Obteve-se
108
assim a quantidade total de 0,728 g de extrato para a bactria E. psidii e 0,705 g para a bactria P. ananatis. Estes extratos foram cromatografados em coluna de slica (15 g slica, coluna com 2 cm de dimetro), com os solventes hexano, diclorometano e acetato de etila, em ordem crescente de polaridade, coletando-se fraes de 50 mL. O acompanhamento da eluio foi realizado via CCD em placas de slica suportadas sobre alumnio e revelao com anisaldedo sulfrico, seguida de aquecimento a 120C por 2 minutos. Foram tomadas fraes de 50 mL, evaporadas sob presso reduzida. Foram retiradas 84 fraes no caso da bactria E. psidii e 80 fraes com o extrato da bactria P. ananatis. As fraes foram reunidas por semelhana em CCD. O extrato de 1L de cultivo (228,0 mg) da espcie P. agglomerans foi fracionado por cromatografia flash em coluna de slica (coluna com 1 cm de dimetro; 2 g de slica 0,035-0,070 mm de granulometria). Foram recolhidas trs fraes: 1. hexano; 2. acetato de etila ; 3. metanol, com 50 mL cada. As fraes foram evaporadas sob presso reduzida. A frao acetato de etila (26,4 mg) foi fracionada em coluna de slica (6,5 g de slica; coluna com 1,0 cm de dimetro), eluda com os solventes hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, em ordem crescente de polaridade. Foram recolhidas 81 fraes, com 8 mL cada. As fraes foram reunidas por semelhana em CCD.
4.5. Deteco de acil-homosserina lactonas por CG-EM
anlise
das
fraes
reunidas,
obtidas
dos
cultivos
dos
microrganismos, foi feita por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) nas condies descritas pelo Programa 2 de temperatura. Em todas as espcies bacterianas estudadas, foram identificados sinais com padro de fragmentao caracterstico
109
das
acil-HSLs
em
fraes
correspondentes polaridade de eluio CH2Cl2:AcEt 4:1. Em alguns casos, as acil-HSLs foram identificadas utilizando-se o modo SIM de deteco. Na espcie E. psidii, foram identificadas duas acil-HSLs. A N-hexanoilHSL estava presente na frao FRA32 e na frao FRA33-35. Detectou-se ainda uma quantidade trao de N-heptanoil-HSL na frao FRA32.
O O NH O
N-hexanoil-homosserina lactona (1): CG-EM (IE, 70 eV) m/z: 199 (M+, 2%), 170 (5%), 156 (12%), 143 (100%), 128 (5%), 125 (21%), 115 (6%), 102 (12%), 101 (15%), 100 (8%), 99 (22%), 85 (7%), 71 (23%), 57 (45%), 56 (18%), 55 (13%), 43 (47 %).
O O NH O
N-heptanoil-homosserina lactona (2): CG-EM (IE, modo SIM, 70 eV) m/z: 213 (M+, 1%), 184 (1%), 170 (2%), 156 (10%), 143 (100%), 128 (5%), 125 (20%), 113 (15%), 102 (14%), 101 (15%), 100 (7%), 85 (16%), 83 (13%), 57 (44%), 43 (35%).
No estudo da bactria P. ananatis, as fraes reunidas FRA35-38 e FRA39-41, FRA42 e FRA43 correspondentes polaridade de eluio CH2Cl2:AcEt 4:1 apresentaram sinais cromatogrficos com padro de fragmentao caracterstico das acil-HSL. Estes metablitos foram
110
identificados como a N-hexanoil, N-heptanoil e N-octanoil-HSL. Os dados de fragmentao por CG-EM obtidos para a N-hexanoil e N-heptanoil-HSL foram idnticos aos reportados anteriormente no estudo da espcie E. psidii. A N-octanoil-HSL foi identificada utilizando-se o modo SIM de deteco, sob as condies de anlise em CG-EM descritas pelo Programa 1 de temperaturas.
O O NH O
N-octanoil-homosserina lactona (3). CG-EM (IE, modo SIM, 70 eV) m/z: 227 (M+, 4%), 198 (4%), 184 (4%), 170 (4%), 156 (18%), 143 (100%), 128 (8%), 127 (10%), 125 (19%), 102 (12%), 101 (12%), 100 (5%), 85 (6%), 57 (48%).
A anlise das
fraes provenientes do cultivo de P. agglomerans
revelou a presena de uma quantidade trao de N-hexanoil-HSL na frao FRA56-58. Foi ainda possvel obter 1,1 mg de N-butanoil-HSL pura (frao FRA59-64) do cultivo desta bactria.
O O NH O
N-butanoil-homosserina lactona (4). CG-EM (IE, 70 eV) m/z: 171 (M+., 5%), 153 (4%), 143 (91%), 125 (9%), 113 (8%), 102 (6%), 101 (9%), 100 (9%), 85 (13%), 71 (60%), 57 (90%), 43 (100%). RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): 0,96 (H-4, 3H, t, J 7,3 Hz), 1,69 (H-3, 2H, m), 2,14 (H-4, 1H, m), 2,24 (H-2, 2H, t, J 7,3 Hz), 2,87 (H-4, 1H, m), 4,19 (H-5, 1H, ddd, J 5,8; 11,3
111
e 9,2 Hz), 4,48 (H-5, 1H, t, J 9,5 Hz), 4,55 (H-3, 1H, ddd, J 5,9; 8,9 e 11,3 Hz), 6,03 ppm (NH, s largo).
4.6. Anlise do branco para acil-homosserina lactonas identificadas por CG-EM
O branco para as acil-HSLs majoritrias identificadas em cada bactria foi feito analisando-se por CG-EM as fraes acetato de etila obtidas a partir de 1 L de meio de cultivo de cada espcie, bem como o extrato acetato de etila obtido do meio de cultivo caldo nutriente (Tpico 4.3). Utilizou-se o modo SIM de deteco, selecionando-se os ons mais intensos em cada caso. Identificou-se as acil-HSLs majoritrias em todos os cultivos das bactrias, o que no foi observado para o meio de cultivo caldo nutriente. As anlises foram feitas utilizando-se o Programa 2 de temperaturas.
4.7. Sntese de acil-homosserina lactonas
Br- NH3+
O O +
(CH2)n
O OH
Cl-
H2O, Et3N t.a., 24 h

(CH2)n
N C N N H
O NH O O
C4H8NO2Br PM = 181 g/mol
Num balo de ensaio de 5 mL, adicionou-se trietilamina (1,05x10-4 mol), bromidrato de ()--amino--butirolactona (1,05x10-4 mol) e cido butanico, hexanico, heptanico ou octanico (1,57x10-4 mol), dissolvidos em 2,5 mL de gua ultra pura (Milli-Q). Em seguida, adicionou-se cloridrato
112
de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (1,57x10-3 mol). A mistura reacional permaneceu sob agitao magntica temperatura ambiente. Aps 24 horas, esta foi extrada com acetato de etila (3 x 10 mL) e a fase orgnica combinada foi extrada com soluo de bicarbonato de sdio 5% (2 x 6 mL), bissulfato de sdio 1 M (1 x 6 mL) e soluo saturada de cloreto de sdio (1 x 6 mL). O solvente foi evaporado sob presso reduzida, formando um slido branco.
O
3' 4' 2' 1'
NH
4 5 3 2 1O
()-N-butanoil-homoserina lactona (4). 19 % de rendimento. CG-EM (IE, 70 eV). m/z 171 (M+, %), 153 (6%), 143 (90%), 125 (9%), 113 (9%), 102 (6%), 101 (9%), 100 (10%), 85 (12%), 71 (63%), 57 (93%), 43 (100%). ndice de Kvats: 1523. IV (KBr). 3311,7; 2961,2; 2871,6; 1776,1; 1646,3; 1550,2; 1383,8; 1175,2 cm-1. RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): 0,98 (H-4, 3H, t, J 7,3 Hz), 1,71 (H-3, sexteto, 2H, J 7,3 Hz), 2,14 (H-4, 1H, m), 2,25 (H-2, 2H, t, J 7,1 Hz), 2,88 (H-4, 1H, m), 4,30 (H-5, 1H, ddd, J 5,9; 11,4 e 9,2 Hz), 4,48 (H-5, 1H, t, J 8,1 Hz), 4,57 (H-3, 1H, ddd, J 5,9; 8,4 e 11,7 Hz), 6,04 ppm (NH, s largo). RMN de
13
C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): 13,6 (C-4), 18,9 (C-3),
30,7 (C-4), 38,0 (C-2), 49,3 (C-3), 66,1 (C-5), 173,6 (C-1), 175,5 ppm (C-2).
113

O
5' 6' 4' 3' 2' 1' 4 5 3 2 1O
NH
()-N-hexanoil-homosserina lactona (1). Rendimento da reao: 54 %. CG/EM (IE, 70 eV) m/z: 199 (M+, 1%), 170 (4%), 156 (11%), 143 (100%), 128 (5%), 125 (21%), 115 (5%), 102 (12%), 101 (15%), 100 (8%), 99 (23%), 85 (7%), 71 (26%), 57 (52%), 56 (20%), 55 (17%), 43 (49 %). ndice de Kvats: 1731. IV (KBr). 3316,2; 2961,7; 2865,1; 1777,5; 1645,0; 1547,9; 1383,9; 1173,8; 1015,0 cm-1. RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): 0,89 (t, 3H, J 6,9 Hz, H6), 1,31 (m, 4H, H-4, H-5), 1,65 (quinteto, 2H, J 7,6 Hz, H-3), 2,14 (m, 1H, H-4), 2,25 (t, 1H, J 6,9 Hz, H-2), 2,85 (m, 1H, H-4), 4,29 (ddd, 1H, J 5,9; 11,4 e 9,5 Hz, H-5), 4,47 (t, 1H, J 9,1 Hz, H-5), 4,56 (ddd, 1H, J 5,9; 11,4 e 8,4 Hz, H-3), 6,09 (s largo, NH). RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): 13,9 (C-6); 22,4 (C-5); 25,1 (C-3); 30,6 (C-4); 31,4 (C-4); 36,1 (C-2); 49,3 (C-3); 66,1 (C-5); 173,7 (C-1); 175,5 (C-2).
O
7' 6' 5' 4' 3' 2' 1'
NH
4 5 3 2 1O
()-N-heptanoil-homosserina lactona (2). Rendimento da reao: 64%. CG/EM (IE, 70 eV) m/z: 213 (M+, 2%), 184 (2%), 170 (4%), 156 (15%), 143
114
(100%), 128 (5%), 125 (20%), 113 (13%), 102 (12%), 101 (16%), 100 (6%), 85 (16%), 83 (13%), 57 (50%), 43 (43%). ndice de Kvats: 1841. IV (KBr). 3315,8; 2955,4; 2858,8; 1776,7; 1646,4; 1545,7; 1384,2; 1173,6; 1013,6 cm-1. RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): 0,88 (t, 3H, J 7,3 Hz, H7), 1,29 (m, 6H, H-4, H-5, H-6), 1,64 (quinteto, 2H, J 7,6 Hz, H-3), 2,14 (m, 1H, H-4), 2,25 (t, 1H, J 8,9 Hz, H-2), 2,84 (m, 1H, H-4), 4,28 (ddd, 1H, J 5,8; 11,3 e 9,5 Hz, H-5), 4,47 (t, 1H, J 8,9 Hz, H-5), 4,56 (ddd, 1H, J 5,8; 11,6; 8,6 Hz, H-3), 6,15 (d, NH, J 3,7 Hz). RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): 14,0 (C-7); 22,4 (C-6); 25,3 (C-3); 28,8 (C-5); 30,5 (C-4); 31,4 (C-4); 36,1 (C-2); 49,2 (C-3); 66,1 (C-5); 173,7 (C-1); 175,5 (C-2).
O
7' 8' 6' 5' 4' 3' 2' 1'
NH
4 5 3 2 1O
()-N-octanoil-homoserina lactona (3). 53 % de rendimento. CG-EM (IE, 70 eV). m/z 227 (M+, 2%), 198 (2%), 170 (3%), 156 (17%), 143 (100%), 128 (8%), 127 (10%), 125 (21%), 102 (13%), 101 (14%), 57 (76%), 43 (22%). ndice de Kvats: 1947. IV (KBr). 3316,3; 2954,1; 2856,3; 1777,3; 1644,9; 1549,3; 1383,4; 1173,7; 1013,7; 656,6 cm-1. RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): 0,88 (H-8, 3H, t, J 7,2 Hz), 1,29 (H-7, H-6, H-5, m, 6H), 1,64 (H-3, 2H, quinteto, J 7,2 Hz), 2,15 (H-4,
115
1H, m), 2,26 (H-2, 2H, t, J 7,8 Hz), 2,83 (H-4, 1H, m), 4,28 (H-5, 1H, ddd, J 5,9; 11,1 e 9,2 Hz), 4,46 (H-5, 1H, t, J 9,0 Hz), 4,57 (H-3, 1H, ddd, J 5,7; 11,6 e 8,6 Hz), 6,23 ppm (NH). RMN de
13
C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): 14,0 (C-8), 22,6 (C-7),
25,4 (C-3), 28,9 (C-4), 29,1 (C-5), 30,6 (C-4), 31,6 (C-6), 36,1 (C-2), 49,2 (C-3), 66,1 (C-5), 173,9 (C-1), 175,6 (C-2).
As snteses das acil-homosserina lactonas quirais foram feitas atravs do mesmo procedimento descrito acima, porm utilizando-se como reagente o bromidrato de S-(-)--amino--butirolactona.
O
3' 4' 2' 1'
NH
4 5 3 2 1O
(S)-(-)-N-butanoil-homosserina lactona (4). Rendimento e dados de CG-EM, RMN de 1H e

13
C similares aos obtidos para a ()-N-butanoil-homoserina
lactona. []D20 23,68 (c. 0,38 MeOH).

O
5' 6' 4' 3' 2' 1'
NH
4 5 3 2 1O
(S)-(-)-N-hexanoil-homosserina lactona (1). Rendimento e dados de CG-EM, RMN de 1H e

13
C similares aos obtidos para a ()-N-hexanoil-homosserina
lactona. []D20 22,86 (c. 0,35 MeOH).
116
4.8. Co-injeo de produtos naturais e sintticos em CG-EM
As fraes contendo as acil-homosserina lactonas naturais identificadas nos microrganismos E. psidii, P. ananatis e P. agglomerans foram coinjetadas em CG-EM com os produtos sintticos correspondentes, segundo o Programa 2 de temperaturas. No caso da N-octanoil-homosserina lactona identificada nos cultivos de P. ananatis, a co-injeo foi feita seguindo o Programa 1 de temperaturas.
4.9. Avaliao da atividade biolgica de produtos sintticos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)
Os
produtos
sintticos
foram
bioensaiados
com
reprter
Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), em ensaio de expresso de enzimas -galactosidase. Os produtos sintticos foram diludos em etanol absoluto (2 mg/mL) e bioensaiados como descrito anteriormente para os extratos (Tpico 4.3). Como controle negativo, utilizou-se etanol absoluto (20 L). As coloraes dos tubos foram avaliadas visualmente, aps 24 horas de incubao a 30C.
4.10. Determinaes de configuraes absolutas de produtos naturais por CG-FID As anlises foram feitas em cromatgrafo gasoso acoplado a um detector por ionizao em chama, utilizando-se colunas com fases estacionrias quirais. Inicialmente, determinou-se a configurao absoluta da N-hexanoil-HSL produzida por E. psidii, presente na frao FRA32 e
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produzida por P. ananatis, presente na frao FRA43. As condies analticas de separao na coluna Chrompack Chirasil ciclodextrina foram otimizadas utilizando-se o produto racmico ()-N-hexanoil-HSL sinttico. O tempo de reteno do enantimero (S) foi obtido pela anlise do produto sinttico (S)-()-N-hexanoil-HSL. A configurao do produto natural proveniente de E. psidii e posteriormente de P. ananatis (FRA43) foi feita pela injeo das respectivas fraes nas mesmas condies e por co-injeo com produto sinttico racmico.
A determinao da configurao absoluta da N-butanoil-homosserina lactona produzida por P. agglomerans foi feita da mesma maneira, porm utilizando-se a fase estacionria quiral heptakis--ciclodextrina. As condies de anlise foram descritas na seo Materiais e Equipamentos (4.1). 4.11. Avaliao da atividade patognica das cepas P. ananatis CCT 6481T e P. agglomerans CBMAI 732 em folhas jovens de milho (Zea mays)
A avaliao da patogenicidade das cepas P. agglomerans CBMAI 732 e P. ananatis CCT 6481T foi realizada atravs da inoculao artificial em folhas de milho da variedade BR HS200, reconhecidamente suscetvel doena da pinta branca do milho, em colaborao com a Dra. Luzia D. PaccollaMeirelles (UEL). As sementes do vegetal foram plantadas em vasos, totalizando 3 plantas/vaso. As plantas se desenvolveram em casa de vegetao mida por 35 dias, quando foram feitas as inoculaes. Um controle negativo, no inoculado, foi mantido. O inculo foi preparado em meio TSB lquido (Tryptic Soy Broth). A suspenso bacteriana foi espalhada sobre as folhas por spray, sem causar
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ferimentos e deixadas em cmara mida, a temperatura ambiente (~30-35C) durante 72 horas. A seguir, os vasos foram levados para choque trmico, sendo mantidos por 24 horas a 20C. Aps este perodo, os vasos retornaram para o cultivo cmara mida, onde permaneceram por mais 6 dias. Foi avaliada a formao de manchas brancas nas folhas, caractersticas da doena. Em um outro experimento de avaliao da patogenicidade, folhas de milho BR HS200 de 35 dias de idade foram levemente injuriadas com esponja e acopladas em moldes de acrlico contendo orifcios. Uma suspenso bacteriana em soluo salina (108 u.f.c.) foi pipetada nos orifcios do molde (1 gota/orifcio). Aps 72 horas de incubao temperatura ambiente, o molde foi desmontado e os sintomas observados. Para o controle negativo as folhas receberam apenas soluo salina.
4.12. Avaliao da presena de acil-homosserina lactonas em folhas de milho infectadas pela cepa P. agglomerans e folhas de milho provenientes de campo
Inicialmente, prepararam-se extratos de folhas de milho BR HS200 cultivado em casa de vegetao. Duas folhas foram coletadas: uma inoculada pela cepa P. agglomerans (3,10 g de material biolgico) com sinais de necrose e outra no inoculada, sadia (controle, 4,74 g de material biolgico). As folhas foram segmentadas e extradas com acetato de etila (50 mL). O sobrenadante foi filtrado e evaporado sob presso reduzida. Os extratos foram em seguida submetidos filtrao em coluna de slica-gel (2 g de slica, coluna com 1 cm de dimetro) com acetato de etila como eluente (40 mL). A partir dos slidos obtidos por evaporao foram preparadas solues estoque em etanol absoluto (10 mg/mL) de cada extrato. Os extratos foram bioensaiados com a cepa A.
119
tumefaciens NTL4(pZLR4), como descrito para os produtos sintticos (Tpico 4.9). Como controle positivo, utilizou-se 20 L de soluo de ()-N-hexanoilHSL em etanol (2 mg/mL) e como controle negativo, etanol absoluto (20 L). Um segundo tipo de controle foi feito com o objetivo de distinguir a colorao do meio de cultivo contendo apenas os extratos e os meios de cultivo onde foram realizados os testes. Os meios de cultivo contendo extratos apresentaram colorao amarela, claramente distinta do azul-esverdeado formado nos casos de atividade biolgica positiva. Aps 24 h, as coloraes das solues foram avaliadas visualmente. O mesmo procedimento descrito acima foi aplicado com folhas de milho oriundas de cultivo em campo. Todas as plantas apresentavam 100 dias de cultivo (plantio em dezembro de 2004), j no final do ciclo vegetativo do milho. Os seguintes extratos em acetato de etila foram preparados:
1. Milho BRS1010 resistente doena e sem sintomas (60,4 g de material biolgico). 2. Milho de variedade desconhecida infectado pela doena e com sinais de necrose (130,3 g de material biolgico). 2. Milho de variedade desconhecida infectado pela doena (dos mesmos vegetais de onde foram coletadas as folhas necrosadas), porm sem sinais de necrose (46,0 g de material biolgico).
Aproximadamente 30 mg de cada extrato foram filtrados em coluna de slica-gel (2 g de slica, coluna com 1 cm de dimetro) utilizando-se de acetato de etila (40 mL) como eluente. Foram preparadas solues estoque a 10 mg/mL em etanol absoluto de cada extrato, e estas foram bioensaiadas da mesma maneira como descrito para o milho proveniente do cultivo em casa de
120
vegetao, incluindo os controles positivo e negativos. Aps 24 h, as coloraes das solues foram avaliadas visualmente.
4.13. Determinao da constituio qumica das secrees de defesa dos opilies Goniosoma longipes e Camarana flavipalpi
As secrees de defesa qumica da espcie G. longipes e C. flavipalpi foram coletadas pressionando-se as glndulas produtoras com algodo tratado (~50 mg), preparado atravs da lavagem de algodo comum com acetato de etila bidestilado. O lquido absorvido foi extrado com acetato de etila (0,5-5 mL, bidestilado, SYNTH) para anlises em CG-EM ou com CDCl3/TMS (600 L) para anlises de ressonncia magntica nuclear. Para a espcie G. longipes, obteve-se aproximadamente 12 mg de secreo amarela de um indivduo macho. No caso da espcie C. flavipalpi, um indivduo macho rendeu apenas 0,3 mg de secreo incolor; em anlises de ressonncia magntica nuclear, utilizou-se as secrees de 7 indivduos da espcie C. flavipalpi, totalizando aproximadamente 2,1 mg de secreo. As amostras foram analisadas por cromatografia em camada delgada utilizando-se acetato de etila como eluente. As anlises das secrees de G. longipes e C. flavipalpi por CG-EM foram feitas segundo o Programa 3 de temperaturas. No caso da espcie G. longipes, realizou-se ainda a anlise por CG-EM das secrees produzidas por indivduos macho, fmea, fmea ovgera e fmea aps desova.
Substncias identificadas na secreo de defesa de G. longipes:
121
O
1 6 5 4 2 3 8 7
2,3-dimetil-1,4-benzoquinona (6). EMAR (IE, 70 eV): 136,05392 (calculado: 136,05244; C8H8O2). CG-EM m/z 136 (M+, 100%), 108 (57%), 107 (56%), 82 (44%), 79 (52%), 65 (5%), 54 (50%). RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): 2,05 (s, 6H, H-7, H-8), 6,72 (s, 2H, H-5, H-6). RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): 187,39 (C-1, C-4); 140,99 (C-2, C-3); 136,24 (C-5, C-6); 12,18 (C-7, C-8).
O
1 6 5 4 7 2 3 9 8
2-etil-3-metil-1,4-benzoquinona (7). EMAR (IE, 70 eV): 150,06824 (calculado: 150,06810; C9H10O2). CG-EM m/z 150 (M+, 100%), 135 (10%), 122 (37%), 121 (18%), 107 (79%), 82 (21%), 79 (38%), 67 (12%), 54 (22%). RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): 6,71 (singleto largo, 2H, H-5, H-6), 2,51 (q, J 7,6 Hz, 2H, H-7), 1,06 (t, J 7,6 Hz, 3H, H-8), 2,05 (s, 3H, H-9).
122
RMN de 13C (125,71 MHz, CDCl3, TMS): 187,10 (C-1); 146,15 (C2); 140,37 (C-3); 187,90 (C-4); 136,19 (C-5); 136,37 (C-6); 19,73 (C-7); 12,84 (C-8); 11,63 (C-9).
Um fenol substitudo foi identificado na secreo de defesa de Camarana flavipalpi:

OH
1 6 2 7
8 9
5 4
2-metil-5-etilfenol (8). CG-EM m/z 136 (M+, 42%), 121 (100%), 91 (9%), 77 (16%). RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS): 7,03 (d, 1H, J 7,6 Hz, H-3), 6,70 (dd, 1H, J 7,6 e 1,5 Hz, H-4), 6,40 (d, 1H, J 1,5 Hz, H-6), 2,57 (q, 2H, J 7,6 Hz, H-8), 2,22 (s, 3H, H-7), 1,22 (t, 3H, J 7,6 Hz, H-9).
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135
_______________________________________________________ ANEXOS: ESPECTROS
_____________________ ANEXOS: ESPECTROS
137
O O NH O
E1. Espectro de massas (IE, 70 eV) da substncia (1) sinttica.
32 30 28
Transmitncia
2865.06
26 24 22 20 18 16 4000 3000 2000
-1
2961.65 3316.20
646.56 1225.76
1015.01
O O NH O
1547.92 1777.54 1644.97

1000
1173.81
Nmero de onda (cm )
E2. Espectro no IV (KBr) da substncia (1) sinttica.
139

O O NH O
E3. Espectro de RMN de 1H (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (1) sinttica.
O O NH O
E4. Espectro de RMN de 13C (125,69 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (1) sinttica.
140
O O NH O
E5. Mapa de contornos de RMN 2D de correlaes 1H, 1H gCOSY (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (1) sinttica.
141
O O NH O
E6. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC da substncia (1) sinttica.
O O NH O
E7. Espectro de RMN de 13C DEPT 135 e DEPT 90 (125,69 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (1) sinttica.
142
O O NH O
E8.Expanso do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substncia (1) sinttica.
O O NH O
143
26 24 22
Transmitncia
20 18 16 14 12 10 8 4000
O
2858.77 2929.46 3315.82 1013.63

1545.71
1384.16
656.568
1173.56
O NH O
1776.70 1646.42
2000 1500
-1
3500
3000
2500
1000
500
Nmero de onda (cm )
O O NH O
144
O O NH O
O O NH O
145
O O NH O
E14. Mapa de contornos de RMN 2D de correlaes 1H, 1H 1J (gCOSY) (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (2) sinttica.
146
O O NH O
E15. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC da substncia (2) sinttica.
O O NH O
E16. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substncia (2) sinttica. 147
O O NH O
E17. Expanso do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substncia (2) sinttica.
O O NH O
148
O O NH O
O O NH O
E19. Expanso do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substncia (2) sinttica. 149
O O NH O
60
Transmitncia
50
2856.26
40
656.57 1013.73 1173.73 1549.30
2928.31 3316.30
30
O O
20
NH O
1777.32 1644.85
2000 1500
-1
4000
3500
3000
2500
1000
500
Nmero de onda (cm )
150
O O NH O
O O NH O
151
O O NH O
E24. Mapa de contornos de RMN 2D de correlaes 1H, 1H 1J (gCOSY) (499,88 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (3) sinttica.
152

O O NH O
O O NH O
E26. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC da substncia (3) sinttica. 153
O O NH O
E27. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC da substncia (3) sinttica.
O O NH O
154
O O NH O
O O NH O
E30. Espectro de RMN de 13C DEPT 135 e DEPT 90 (75,45 MHz, CDCl3, TMS) da substncia (4) sinttica. 155
E31. Espectro de RMN de 13C (125,69 MHz, CDCl3, TMS) das substncias (6) e (7).
E32. Espectro de RMN de 13C DEPT 135 e DEPT 90 (125,69 MHz, CDCl3, TMS) das substncias (6) e (7).
156
E33. Espectro de RMN de 13C DEPT 135 e DEPT 90 (125,69 MHz, CDCl3, TMS) das substncias (6) e (7) ampliado.
157
E34. Mapa de contornos de RMN 2D de correlaes 1H, 1H 1J (gCOSY) (499,88 MHz, CDCl3, TMS) das substncias (6) e (7).
158
E35. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC das substncias (6) e (7).
E36. Expanso do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC das substncias (6) e (7). 159
E37. Expanso do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) 1J HSQC das substncias (6) e (7).
E38. Mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC das substncias (6) e (7).
160
E39. Expanso do mapa de contornos de RMN 2D (CDCl3, TMS) de correlaes 1H (499,88 MHz), 13C (125,70 MHz) nJ gHMBC das substncias (6) e (7).
161
162
E42. Espectro de massas de alta resoluo das substncias (6) e (7).
163
164
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
________________________________ ARTIGO
165
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
Journal of Agricultural and Food Chemistry, Volume 53, p. 6262-6265, 2005. ACYL-HOMOSERINE LACTONES FROM Erwinia psidii R. IBSBF 435T, A
GUAVA PHYTOPATHOGEN (Psidium
guajava L.).
ARMANDO M. POMINI, GILSON P. MANFIO, WELINGTON L. ARAJO, AND ANITA J. MARSAIOLI,*.
Chemistry Institute, State University of Campinas, CP 6154, CEP 13083-970, Campinas - SP, Brazil; Natura Inovao e Tecnologia de Produtos Ltda. Rod. Anhagera s/n Km 30.5, CEP 07750-000, Cajamar SP, Brazil and Departamento de Gentica, ESALQ, USP, CP 83, CEP 13400-970, Piracicaba SP, Brazil.
ABSTRACT The phytopathogen Erwinia psidii R. IBSBF 435T causes rot in branches, flowers and fruits of guava (Psidium guajava L.), being responsible for crop losses and has no effective control. It was demonstrated that this strain produces two compounds [S-(-)-N-hexanoyl and N-heptanoyl-homoserine lactone], both belonging to the class of quorum-sensing signalling substances. A protocol using gas chromatography-flame ionization detection with chiral
Author to whom correspondence should be addressed (telephone + 55 19 37883098; email: anita@iqm.unicamp.br). Chemistry Institute, State University of Campinas. Natura Inovao e Tecnologia de Produtos Ltda. Departamento de Gentica, ESALQ, USP.
*
167
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
stationary phase is described for the absolute configuration determination of a natural acyl-homoserine lactone. Biological assays with specific reporter and synthesis of identified substances are also described. This is the first report on the N-heptanoyl-homoserine lactone occurrence in the Erwinia genus.
KEYWORDS: Acyl-homoserine lactones, Erwinia psidii R., Psidium guajava L., GC-MS, quorum-sensing.
INTRODUCTION The guava tree (Psidium guajava L.) is a perennial plant belonging to the Myrtaceae family, popularly known in Brazil as goiabeira. It is cultivated in ca. 11,500 hectares, being an important commercial culture mainly for small farmers. Their fruits are appreciated in natura and as juices, candies and jellies (1). One of the major drawbacks to guava production is caused by the phytopathogen Erwinia psidii R. This disease is characterized by wilt of new branches (which become black or brown), lesions and cell death in leaves, necrosis and mummification of flowers and fruits. The bacterium is introduced into the orchards by contaminated shoots and spreads during the pruning process (2). It has become clear that bacteria do not survive as solitary microorganisms, but exploit elaborate intercellular communication systems to adapt themselves to the fluctuations of environmental conditions, by a process known as quorum-sensing. This process is based on the production of lowmolecular weight diffusible substances, whose extra-cellular concentrations are related to the microorganism population density. Upon reaching the
168
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
critical concentration, the signalling substances can be detected by the cells, inducing the population to initiate a concerted action (3). This control of phenotypic expression may be of extreme importance in pathogenic infestations, when the premature production of virulence factors can alert host defense systems before a high population density is reached (4). In Gram-negative bacteria, the main class of signalling substances is acyl-homoserine lactones (acyl-HSL). The first study of phenotypic expression control by these substances was reported for the marine luminescent bacterium Vibrio fischeri B.. In the free-living bacterium, light emission is not observed, however, in high cellular concentrations, V. fischeri displays bioluminescence with blue-green light. During growth, this microorganism releases an autoinducer, N-(3-oxo-hexanoyl)-HSL, which regulates the expression of genes responsible for bioluminescence once its critical concentration is reached. This control of phenotypic expression is essential for this microorganism in ecological relationships with the squid Euprymna scolopes B.. Genes controlling synthesis and detection of the
autoinducer are called luxI and luxR, respectively, and are well characterized in this bacterium (5, 6). Since its discovery, the quorum-sensing system has been demonstrated in a great number of Gram-negative bacteria, many of which employ acylHSL in intercellular communication. The structural diversity of these metabolites relies on the acyl side chain, while the homoserine lactone moiety is maintained. The most common structural variations are the chain length, oxo and hydroxy substituents at the 3 position and unsaturations. This variety can be illustrated by N-butanoyl-HSL (biofilm synthesis control in Pseudomonas aeruginosa S.), N-(3-hydroxy-butanoyl)-HSL (bioluminescence control in Vibrio harveyi J. and S.), N-(3-oxo-octanoyl)-HSL (plasmid
169
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
conjugal transfer in Agrobacterium tumefaciens S. and T.) and N-(3-hydroxy7-cis-tetradecenoyl)-HSL (expression of rhizosphere genes in Rhizobium leguminosarum F.) (7). Many phytopathogens systems. exploit acyl-homoserine carotovorum lactone H. based
communication
Pectobacterium
(Erwinia
carotovora J.), which causes the soft rot disease, is one of the best-studied examples. It has been demonstrated that the carbapenem antibiotic and plantcell-wall-degrading enzymes syntheses are under the control of the same autoinducer, the N-(3-oxo-hexanoyl)-HSL (8). Furthermore, the
communication system can be disrupted by antagonists, such as halogenated furanones from the red algae Delisea pulchra M., thus decreasing antibiotic and exoenzyme production (9). This example shows the importance of the quorum-sensing system during development of some phytopathogenic bacteria in hosts. Suppression of this mechanism is considered a new research field in order to control bacteriosis (10). Therefore, it is important to understand how these biological mechanisms occur, starting from the chemical nature of substances involved. The current communication deals with the acyl-homoserine lactones produced by Erwinia psidii, a particularly destructive phytopathogen of Brazilian guava crops (P. guajava). The study of possible quorum-sensing signalling substances from this bacterium was carried out employing the IBSBF 435T type strain, isolated from infected guava trees.
MATERIALS AND METHODS
General Experimental Procedures. NMR spectroscopic data were acquired from a Varian Inova spectrometer, operating at 499.88 MHz for 1H170
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
NMR and 125.71 MHz for 13C-NMR. CDCl3 was used as solvent and TMS as internal reference (H and C 0.0 ppm). Chemical shifts were recorded in ppm and coupling constants J in Hertz (Hz). Optical rotation was measured on a Perkin-Elmer 341 polarimeter at 17C and the results converted to 20C by the usual equations. Fourier-transform infrared (FTIR) spectra were obtained with a Bomem MB Michelson spectrometer, using KBr (Merck, Darmstadt, Germany) as sample support. Silica-gel for CC (0.035-0.070 mm) was from Merck. TLC analysis were made on silica gel 60 F254 plates (Merck) and visualized under exposure to UV light (254 nm) or chemically with solution of p-anisaldehyde (5 %), acetic acid (50 mL) and concentrated sulfuric acid (1 mL), and heated to 90-100 C for 5 min. GC-MS analysis. GC-MS analyses were carried out on a HP 6890/5973 instrument, equipped with a 30 m x 0.25 mm x 0.25 m i.d. HP5 fused silica capillary column. Mass spectra were recorded over the 40-450 amu range at 3.54 scans/s, with an ionization energy of 70 eV. Helium was the carrier gas at a flow rate of 1 mL/min. The injector temperature was maintained at 250C. The initial oven temperature was 100C and programmed to increase to 290C at 10C/min, then held for 10 min. 1 L samples were injected, without splitting. Chiral GC-FID analyses. Chiral gas chromatography analyses were carried out with a HP 6890 instrument with flame ionization detection (FID), equipped with a 25.0 m x 250.0 m x 25.0 m chiral capillary column Chrompack CP chirasil-dex coating 7502 (Chrompack International BV, 4330 EA Middelburg, The Netherlands). The initial oven temperature was 50C and programmed to increase at 2C/min to 180C, and then held for 5 min. Hydrogen was the carrier gas at a flow rate of 1 mL/min. The injector
171
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
and detector (FID) temperatures were kept at 220C and 240C, respectively. 1 L samples were injected, with a 1:100 split ratio. Bacterial strains and cultivation media. The strain Erwinia psidii IBSBF 435T (= ATCC 49406 type strain) was kindly provided by Dr. Jlio Rodrigues Neto, curator of the collection of cultures of Instituto Biolgico de So Paulo, Campinas, Brazil. It was isolated from Psidium guajava L. 1982, Brazil and maintained in solid nutrient broth (NB) medium. Indicator strain Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) was maintained in Luria-Bertani (LB) medium supplemented with gentamicin (50 g/mL). Pseudomonas aeruginosa CCT 1987 was maintained in solid NB medium. NB medium (20g/L) was from Oxoid (Hampshire, England). LB medium is composed by 1% peptone (Oxoid), 0.5% NaCl and 0.5% yeast extract (Oxoid). Solid medium was prepared with 2% agar (Oxoid). X-Gal (5-bromine-4-chloro-3indolyl--D-galactopyranoside) was purchased from Sigma (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). Bioassay with reporter Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4). Inoculums of strains P. aeruginosa CCT 1987, A. tumefaciens NTL4(pZLR4) and E. psidii IBSBF 435T were prepared in test tubes with LB liquid medium (2 mL). These were maintained at 28C for 24 h. To four test tubes containing LB liquid medium (2 mL) the following solutions were added: tube 1 (blank control): 20 L of inoculum of E. psidii and 20 L of X-Gal (stock solution at 50 mg/mL in DMF); tube 2 (blank control): 20 L of inoculum of A. tumefaciens NTL4(pZLR4) and 20 L of X-Gal; tube 3 (positive control): 20 L of inoculum of A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 L of X-Gal and 20 L of inoculum of P. aeruginosa CCT 1987; tube 4 (test): 20 L of inoculum of A. tumefaciens NTL4(pZLR4), 20 L of X-Gal and 20 L of inoculum of E.
172
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
psidii. The four tubes (in duplicate) were incubated at 28C and the colorations were visually evaluated after 24 h. Culture of E. psidii and detection of acyl-HSL. E. psidii IBSBF 435T was grown in test tubes containing liquid NB medium (10 mL), incubated at 30C for 24 h, then transferred to NB medium (1L) to be incubated at 30C under shaking at 100 rpm. After 24 h, the culture medium was centrifuged at 5000 rpm for 20 min, under refrigeration (5C). The aqueous medium was extracted with ethyl acetate (3 500 mL). The combined organic phases (1.5 L) were washed with distilled water (1 500 mL), dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure at 50C. The whole procedure was repeated eight times yielding a crude extract (0.728 g), which was separated by silica column chromatography (15 g) eluted with hexane, dichloromethane and ethyl acetate, recovering 84 fractions of 50 mL, monitored by TLC. Similar fractions were combined and analyzed by GC-MS. Acyl-HSL were detected in fractions FRA32 (2.0 mg) and FRA33-35 (2.5 mg). N-Hexanoyl-HSL: GC-MS (EI, 70 eV) m/z: 199 (M+, 2), 156 (12), 143 (100), 125 (21), 115 (6), 102 (12), 101 (15), 99 (22), 57 (45), 43 (47). N-Heptanoyl-HSL: GC-MS (EI, 70 eV, SIM) m/z: 213 (M+, 1), 156 (10), 143 (100), 125 (20), 113 (15), 102 (14), 101 (15), 85 (16), 57 (52), 43 (40). Acyl-HSL synthesis. General procedure: to a round bottom flask (5 mL) containing distilled water (2.5 mL), triethylamine (1.0510-4 mol), amino--butyrolactone hydrobromide [racemic or S-(-), Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI] (1.0510-4 mol) and hexanoic or heptanoic acids (1.5710-4 mol) were added. To the stirred solution at room temperature, 1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (1.5710-3 mol) was
173
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
added. The reaction was further stirred at r.t. for 24 h. Extraction with ethyl acetate (3 10 mL), and the usual work-up yielded pure acyl-HSL. (+/-)-N-Hexanoyl-homoserine lactone. 54 % yield. GC-MS (EI, 70 eV) data were identical to the natural product. IR,
1 13
H and
C NMR data were

13
consistent with those previously reported (11, 12). S-(-)-Hexanoyl-homoserine lactone. 54% yield. IR, GC-MS, racemic compound. []D20 -22.86 (c. 0.35 MeOH). (+/-)-N-Heptanoyl-homoserine lactone. 64 % yield. GC-MS (IE, 70 eV) data were identical to the natural product. IR (KBr) 3315 (m), 2955 (m), 1776 (s), 1646 (s), 1545 (m), 1173 (m), 1013 (m), 646 cm-1 (w).
1
C and 1H-
NMR, DEPT-135 and DEPT-90 data were identical to those obtained for the
H-NMR (499.88
MHz, TMS, CDCl3) H (ppm) 0.88 (t, 3, J = 7.3 Hz, H-7'), 1.29 (m, 6, H-4', H-5', H-6'), 1.64 (quintet, 2, J = 7.6 Hz, H-3'), 2.14 (m, 1, H-4), 2.25 (t, 1, J = 8.9 Hz, H-2'), 2.84 (m, 1, H-4), 4.28 (ddd, 1, J = 5.8, 11.3, 9.5 Hz, H-5), 4.47 (t, 1, J = 8.9 Hz, H-5), 4.56 (ddd, H, J = 5.8, 11.6, 8.6 Hz, H-3), 6.15 (d, 1, J = 3.7 Hz, NH).
13
C-NMR (125.71 MHz, TMS, CDCl3) C (ppm) 14.0 (C-7');
22.4 (C-6'); 25.3 (C-3'); 28.8 (C-5'); 30.5 (C-4); 31.4 (C-4'); 36.1 (C-2'); 49.2 (C-3); 66.1 (C-5); 173.7 (C-1'); 175.5 (C-2). Biological assays with extract, fractions and synthetic products. Biological activities of the synthetic products, ethyl acetate extract and fractions from E. psidii culture medium with biosensor A. tumefaciens NTL4(pZLR4) were evaluated as described above. The tests were performed using solutions (20 L) of each synthetic product [(+/-)-N-hexanoyl-HSL, S(-)-N-hexanoyl-HSL and (+/-)-N-heptanoyl-HSL], ethyl acetate extract from E. psidii cultivation medium and fraction FRA32 in ethanol (2 mg/mL). The blank was performed with ethanol (20 L).
174
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
N-Hexanoyl-HSL absolute configuration: The optimum analytical conditions for the enantiomeric discrimination were established using synthetic (+/-)-N-hexanoyl-HSL (two peaks in an approximately 1:1 ratio), according to the conditions described above. The identification of the R- and S-N-hexanoyl-HSL retention times was obtained by analysis of the synthetic S-(-)-N-hexanoyl-HSL. The absolute configuration of the natural product was determined by comparing the retention times and relative abundances of the R- and S-(-)-N-hexanoyl-HSL in the synthetic racemic standard, in FRA32 and by co-injection of both samples (Table 1).
RESULTS AND DISCUSSION
Initially the production of acyl-homoserine lactones in E. psidii was evaluated using Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4) as reporter, by a methodology adapted from the literature (13, 14). This bioassay has been extensively employed in screenings of acyl-HSL producers, mainly due to its simplicity, quickness and high sensitivity. This mutant cannot produce its own acyl-HSL, by deletion of the traI gene. The detection system was inserted by the pZLR4 plasmid, which contains the traR gene and the fusion traG::lacZ. Exogenous acyl-HSL bind to the TraR receptor, and this complex regulates the expression of lacZ gene, which codifies the synthesis of -galactosidase enzymes. Finally, the reagent X-Gal is metabolized by the -galactosidase enzymes, yielding a blue color. Bioassays with E. psidii and P. aeruginosa (used as positive control) (15) exhibited blue coloration, furnishing evidence of the presence of acyl-HSL in both strains.
175
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
As previously reported (15, 16), acyl-HSL are usually synthesized in low concentrations, requiring therefore large amounts of culture medium for spectroscopic investigations. Consequently, E. psidii extracts from 8 L of culture medium were purified by column chromatography and fractions were analyzed by GC-MS. N-Hexanoyl-HSL was detected in 7 % of relative abundance in fraction FRA32 (a mixture of 2.0 mg,) and in 1% in FRA33-35 (a mixture of 2.5 mg) and trace amounts of N-heptanoyl-HSL were identified in fraction FRA33-35 (Figure 1). To improve the detection, some analyses were carried out in the SIM mode. These substances were not detected in the blank analyses with NB medium (data not shown).
O
5' 6' 4' 3' 1' 2' 4 3 5 2 1O 7' 6' 5' 4' 3' 1' 2'
O N H N-heptanoyl-HSL
4 3 2
5 1O
N H
S-(-)-N-hexanoyl-HSL
H O O N H O N H m/z
143
O O O
Figure 1. Acyl-homoserine lactones identified in extracts from Erwinia psidii IBSBF 435T culture medium and origin of the diagnostic base peak fragments in MS spectra.
The final structural confirmation of both acyl-HSL was carried out by co-injection and fragmentation pattern comparison of the natural products
176
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
with synthetic ones in GC-MS. These synthetic standards were fully characterized by FTIR, GC-MS, 1H and
13 13
C NMR spectroscopy in one and
two-dimensions (1H, 1H gCOSY; 1H, 13C 1J HSQC; 1H, 13C nJ gHMBC, n = 2 and 3; C-NMR DEPT-135 and DEPT-90; data not shown). The synthetic
substances, ethyl acetate extract and fraction FRA32 from E. psidii cultivation medium also exhibited positive bioassays with A. tumefaciens NTL4(pZLR4) reporter, corroborating the biological activity observed with the strain E. psidii IBSBF 435T in vivo. The absolute configuration of acyl-homoserine lactones plays an important role in communication systems (11). However, these substances are produced in low amounts and their analysis requires appropriate methodologies; in the present case, the chiral configuration of N-hexanoylHSL was determined using gas chromatographic analyses with chiral stationary phase and flame ionization detection. The optimum analytical conditions for the enantiomeric separation were obtained using a synthetic racemic mixture (R stereoisomer at 56.72 min and S stereoisomer at 56.89 min). Elution of synthetic stereoisomer S-(-)-N-hexanoyl-HSL (92% ee) under the same conditions furnished the retention time (56.93 min) for the S stereoisomer. Analysis of fraction FRA32, obtained from E. psidii culture medium, displayed a signal with retention time (56.97 min) very close to that of the synthetic S stereoisomer. Co-injection of the natural product and the synthetic racemic mixture resulted in perfect signal overlap, with increase in the relative abundance of the S stereoisomer (56.96 min) in comparison with that of the R stereoisomer (56.79 min). Thus, the natural product was the S-()-N-hexanoyl-HSL (Table 1). The N-heptanoyl-HSL is a minor constituent (trace amounts), and the same procedure could not be applied. The methodology proved to be very efficient in situations where the amount of
177
__________________________________________________________ ANEXOS: ARTIGO
substance is small and/or when they are present in complex mixtures. Furthermore, chiral GC-FID is applied to determine the absolute configuration of a natural acyl-homoserine lactone for the first time, providing an additional tool in quorum-sensing researches.
Table 1. Results of chiral GC-FID analyses and absolute configuration determination of natural S-(-)-N-hexanoyl-HSL.
(+/-)-N-hexanoyl- S-(-)-N-hexanoyl- FRA32 from E. HSL HSL psidii IBSBF435T Enantiomers R S S S 56.72 56.89 56.93 56.97 Retention times (min) ~50.00 ~50.00 96.34 >99.00 Relative abundances (%) FRA32 + (+/-)N-hexanoylHSL R S 56.79 56.96
42.16 57.83
In conclusion, it was demonstrated that Erwinia psidii IBSBF 435T produces acyl-HSL, which are well-recognized substances of the bacterial intercellular communication systems. N-hexanoyl-HSL is relatively common in quorum-sensing of Gram-negative bacteria, e.g, controlling the violacein production (17) in Chromobacterium violaceum B. and reported in trace concentrations in the phytopathogen Pectobacterium chrysanthemi S. (18). However N-heptanoyl-HSL, with an odd carbon number acyl side chain, is an autoinducer of rare occurrence, previously reported in Serratia marcescens B. (19) and Rhizobium leguminosarum (20). Therefore, this is the first report of this substance in Erwinia genus. Odd-chain fatty acids are biosynthesized by a route that exploits propionyl-CoA and malonyl-CoA as starter and extender of the acyl chain, respectively. Possibly, this biosynthetic route is explored by these microorganisms in the production of N-heptanoyl-HSL (21).
178
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Further work should be done to understand the role of these substances in the intercellular communication system in E. psidii. As interferences in quorum-sensing mechanisms are promising avenues for bacterial control, it is expected that these studies could provide an alternative method to detain this guava phytopathogen.
ABREVIATIONS
HSL: homoserine lactone. X-Gal: 5-bromine-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranoside.
ACKNOWLEDGMENT
We whish to express our gratitude to Carol H. Collins (IQ/UNICAMP) for revising the manuscript.
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The authors are indebted to FAPESP for financial support and a scholarship to A.M. Pomini (grant proc. 03/09357-7).
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I

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUMICA

SEMIOQUMICOS PRODUZIDOS POR BACTRIAS FITOPATOGNICAS E OPILIES BRASILEIROS

ARMANDO MATEUS POMINI

Orientadora Dra. Anita Jocelyne Marsaioli

Campinas So Paulo Fevereiro/2006

II FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUMICA DA UNICAMP

Armando Mateus Pomini 23-02-2006

3. 3.1. 3.2. 3.3. 4. 4.1.

Semioqumicos Produzidos por Bactrias Fitopatognicas e Opilies Brasileiros

Semiochemicals Produced by Phytopathogenic Bacteria and Brazilian Opilionids

benzoquinone and a phenol, including a new natural product (2-ethyl-3methyl-1,4-benzoquinone).

Acil-HSL ACP CC CCD CDCl3 CG(quiral)-FID

Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

CoA COSY EMAR eV HMBC

Hz LB m/z NB NOE Ppm

RMN SAM TMS X-Gal

Ressonncia magntica nuclear S-adenosilmetionina Tetrametilsilano 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiranosdeo

125 137 165

____________________ INTRODUO GERAL

variedade de substncias, incluindo venenos e secrees de repelncia em animais e plantas.

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RCOOH + FMN + H2O + hv

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Figura 3. Substncias de comunicao bacteriana produzidas por V. fischeri.

http://digilander.libero.it/atreliu/relazioni/images/fotobatteri/Euprimnya. Acesso em 17 de novembro de 2004.

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1.1.1. Quorum-sensing: Um mecanismo de regulao da expresso gnica

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1.1.1.1. Mecanismo de regulao da expresso de bioluminescncia em V. fischeri

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1.1.2. Quorum sensing no gnero Erwinia

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N O COOH cido (5R)-carbapen-2-en-3-carboxlico

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1.1.3. Erwinia psidii, um fitopatgeno da goiabeira

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A. Primrdio foliar da goiabeira infectado por E. psidii

B. Frutos jovens de goiaba enegrecidos pelo ataque de E. psidii

C. Fruto maduro de goiaba enegrecido pelo ataque de E. psidii

D. Ramo de goiabeira morto pelo ataque de E. psidii

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1.1.4. Pantoea ananatis: um fitopatgeno de distribuio mundial

1.1.5. Pantoea agglomerans isolada da doena da pinta branca do milho

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