Lucrare de laborator N.

2
Tema: ANALIZA CHIMICO-TOXICOLOGICĂ
A COMPUŞILOR CU CARACTER SLAB BAZIC. DERIVAŢII 1,4-BENZODIAZEPINELOR,
PIRAZOLONEI ŞI PURINELOR

Scopul lucrării: Studierea metodologiei analizei derivaţilor 1,4-benzodiazepine, pirazolonei şi purinelor

în materialul biologic.
Sarcinile

1.Aplicarea metodelor corecte de izolare a preparatelor medicamentoase din lichidele biologice şi

organele de importanţă vitală.
2.Extragerea toxicilor medicamentoşi din materialul biologic cu ajutorul solvenţilor organici
corespunzători.
3.Purificarea extrasului organic de impurităţile de origine endo- şi exogenă.
4.Aplicarea metodelor chimice şi fizico-chimice de analiză pentru identificarea preparatelor
medicamentoase.
5.Dozarea toxicilor extraşi prin metodele contemporane de dozare.
6.Interpretarea rezultatelor analizei chimico-toxicologice efectuate conform metodelor aplicate şi a
legităţilor generale de comportare a toxicilor medicamentoşi în organism.

Reactive și preparate necesare:

soluție de clorură de fier (III), soluție de nitrit de sodiu de1%, metanol, etanol, soluție de iodură de
potasiu, clorzinciod,cupruiod, clozepid, diazepam, oxazepam, fenazepam, Nitrazepam, soluție de acid
clorhidric 2 mol/l, soluție de nitrit de sodiu de 0,1%, soluție de clorhidrat N-1-naftiletilendiamină sau
soluție bazică de b-naftol, soluție de acid percloric de 10%, lampa UV, fenazonă, cafeină, teobromină,
teofilină, clorură de mercur, reactivul Dragendorff

Subiectele pentru lucrul individual al studenților

1. Particularităţile izolării din materialul biologic a 1,4-benzodiazepinelor.

2. Identificarea compuşilor 1,4-benzodiazepinelor după izolare din materialul biologic.
3. Biotransformarea derivaţilor 1,4-benzodiazepinelor în organismul uman.
4. Cercetarea extractului acid din materialul biologic prin metoda CSS.
5. Proprietăţile fizico-chimice, particularităţile reactive ale derivaţilor 1,4-benzodiazepinelor.
6. Hidroliza acidă şi caracteristica produselor de hidroliză a 1,4-benzodiazepinelor.
7. Identificarea compuşilor pirazolonei şi purnei.
Întrebări pentru pregătirea practică
1. Care derivaţi ai 1,4-benzodiazepinelor se descompun în organismul uman în urma reacţiei N-metilare
şi reducere?
2. Care din compuşii 1,4-benzodiazepinelor se elimină mai repede din organism şi din ce cauză?
3. În ce constă principiul hidrolizei benzodiazepinelor?
4. Care compuşi ai 1,4-benzodiazepinelor au, după hidroliză, aceleaşi benzofenone?
5. Care este reacţia de recunoaştere a produselor de hidroliză?
6. Care compus (benzofenon) nu participă la reacţia de formare a azocoloranţilor?
7. Care sunt propărietăţile chimice, particularităţile izolării derivaţilor pirazolonei şi a purinelor.

Material informativ
Derivaţii pirazolonei
Din punct de vedere toxicologic, principalii derivați ai pirazolonei sunt: antipirina, amidopirina,
analgina. Cercetarea biomaterialului asupra acestor preparate se efectuiază după o schemă specială.
 Fenazona (antipirina)-1-fenil-2,3-dimetilpirazolon-5, este uşor solubilă în apă, formează sarea
internă – betain.
 Antipirina (fenazona) posedă proprietăţi slab bazice. De aceea, din materialul biologic, acesta se
izolează din soluţiile apoase acide, dar şi din soluţiile apoase alcaline.
Identificarea
1. Reacţia de formare a nitrozoantipirinei, este un produs de culoare verde ca smaraldul. Reacţia se
efectuiază în eprubetă şi pe lamelaCH
de sticlă.
3 NaNO2 O N CH3
N CH3 N CH3
O N H2SO4
O N
C6H5 C6H5

2. Reacţia de formare a azocoloranţilor (reacţie specifică): nitrozoantipirina cu α-naftilamina

formează azocolorantul pirazolonic
NH2 de culoare roşie. Limita de identificare este egală cu 2 µkg.
O N CH3
N N CH3
N CH3 + N
O N CH3
O N
C6H5
C6H5

3. Clorura de fier (III) cu antipirina formează ferropirina, de culoare roşie. Aceasta formează sarea
complexă.
CH3
3
N CH3 x 2 FeCl3
O N
C6H5

Maximumul de absorbție al antipirinei în soluția H2SO4 0,1 N se produce la λ 230 nm. În spectru IR,
antipirina are picurile de bază la 1660, 770, 1486 cm‾¹.

Amidopirina (aminofenazona), 1-fenil-2,3-dimetil-4-dimetilaminopirazolon- 5, este o substanţă

cristalină, bine solubilă în solvenţi organici şi posedă proprietăţi bazice. Se izolează din materialul
biologic cu acid oxalic, se extrage în solvenţi organici din mediul acid şi bazic. Pentru identificarea
amidopirinei în extractul din biomaterial se aplică reacţiile de culoare bazate pe reacţiile de oxidare. Ca
oxidantţi se aplică în AchT pe lung.
1. FeCl (III), HNO2, se obţin din soluțiile NaNO 2 şi H2SO4, dar şi din AgNO 3. Produsele
intermediare de oxidare a amidopirinei au culoare albastră, sau albastră-violet, care se pierde în
surplusul reactivului. În asociație cu AgNO 3, când amidopirina este prezentă în cantităţi mărite,
C=O
apare luciul metalic. Chimismul acestor 3 reacţii poate fi redat în felul următor:
(CH3)2 N CH3 (CH3)2 N C=O CH3
[O] N CH3
N CH3
O N O N
C6H5 C6H5

2. Cu reactivii generali de precipitare a alcaloizilor-tanin, acid picric, reactivul Mayer, amidopirina

formează precipitate amorfe.
3. Spectrul UV al amidopirinei în soluția H2SO4 0,1 N are un maximum de absorbţie la λ 250 nm. În
IR posedă vibraţii egale cu 1660, 1315 şi 1216 cm‾¹.
4. Cercetarea prin metoda CSS (cloroform-aceton 9:1): pentru developare se aplică reactivul
Dragendorff sau FeCl3 (culoarea violetă) și Rf 0,15- 0,17.
5. Dacă se presupune prezenţa concomitentă a amidopirinei şi antipirinei, atunci se aplică reacţia cu
acid azotic. La început apare culoarea violetă, pe care o dă amidopirina, apoi aceasta dispare şi, în
exces de reactiv, apare coloraţia verde a nitrozoantipirinei.
6. Amidopirina cu H2SO4 poate să se descompună și să se obţină aldehida formică, care, în asociație
cu acidul cromotropic, dau culoarea violetă.

Metamizol de sodiu (analgina) se izolează din apă la pH 3,dar se extrage cu cloroform din soluția
apoasă –la pH 10. Identificarea metamizolului de sodiu se bazează pe reacția de oxidare. Cu clorura de fer
(III) metamizolul de sodiu formează produse colorate în albastru, care ulterior treptat trece în galben; Cu
reactivul Nessler metamizolul de sodium formează precipitat oranj. Prezența antipirinei este indiferentă
în față de această reacție. La acțiunea soluției de bicromat de potasiu în acid sulfuric concentrat asupra
metamizolului de sodium apare culoarea verde.
Fenilbutazon (butadion) se extrage din soluția apoasă acidă cu heptan și această soluție se
analizează prin metoda cromatografiei de gaze. Fenilbutazona cu vanadatul de amoniu [(NH 4)3 VO 4]
formează colorație purpurie și roșie la reacția Vitali-Moren.

Acţiunea toxicologică şi metabolismul

Fenazona,(antipirina) posedă acţiune antipiretică şi antiinflamatoare. În caz de supradozare, poate
afecta stratul cutanat, sub formă de urticarie, dar poate provoca și leucopenie, tahicardie, colaps,
hipotermie, tremor, depresie. Antipirina se absoarbe repede în sânge. Concentraţia maximă în plasmă se
constată peste 1-2 ore de la ingerare, iar peste 20 min, aceasta poate fi identificată în urină. Procesul
biotransformării are loc încet. Numai 5% se elimină în forma de origine, iar 50% sunt metabolizate. Me -
taboliţii principali sunt: 4-oxiantipirina şi glucuronizii săi.
Aminofenazona,(amidopirina) posedă acţiune anestezică şi antiinflamatoare. Intoxicaţia apare atunci
când se administrează incorect. În caz de intoxicare (supradozare) este posibilă scăderea temperaturii
corpului, herpes pe buze, tremor. Amidopirina se absoarbe repede în tractul gastrointestinal şi se supune
repede biotransformării (10-30%/oră). Numai 3% se elimină în forma de origine. Din metaboliţi, sunt
cunoscuţi: 4-metilaminoantipirina, 4-aminoantipirina şi conjugat N-acetil-4-aminoantipirina. Urina este
galbenă sau roşie ceea ce vorbeşte despre prezenţa metabolitului rubazon şi a acidului metilrubazon.
4-oxiantipirina se elimină odată cu urina.
Metamizol de sodiu (analgina ) după demetilare are loc conjugarea cu acid acetic.

In practica medicală se administrează ca antiinflamatorii în cazul reumatizmelor, miozitelor,

infecțiilor virale, ca adaosuri în tratamentul cu narcotice.
Intoxicațiile cronice se caracterizează prin disfuncții hematolitice(leucopenie,
agranulocitoză),reacții alergice, dereglări ale SNC, convulsii.(epilepsia).
Intoxicații acute- afectarea SNC, convulsii, paralizii, cianoză dermului, membranelor
mucoase, stop respirator,.
Cea mai frecventă cauză a intoxicațiilor este-supradozarea întîmplătoare mai ales în vîrsta
copiilor. DL5-15g.
Derivaţii purinei
Derivaţii purinei posedă proprietăţi bazice slabe: constanta ionizării cafeinei 4,1×10‾¹³, teofilina –
1,9×10‾¹³; acestea sunt baze foarte slabe şi sărurile cu acizii hidrolizează în soluţii apoase. De aceea, când
acestea se izolează din materialul biologic cu apă acidulată cu acid oxalic, pH-ul lor este de 2-3, în formă
de baze şi se extrag în solvenţi organici, maximumul de absorbție al cafeinei la pH=4-5,5; teobromina şi
teofilina la pH=4-7.
Cafeina şi teofilina pot să se extragă şi din mediul apos însă este incompletă, teobromina chiar nu se
extrage, deoarece în mediul bazic ea este predispusă la tautomeria lactam- lactimică.
O
OH ONa
NH N-CH3
NaOH
N N-CH3
N N-CH3
O N N + H2O
OH - O N N
CH3 O N N
CH3
CH3

Pentru toţi derivaţii este caracteristică reacţia de formare a murexidei în mediul acid, apoi, cu
amoniac aceasta formează sarea tetrametil acid purpuric (1) de culoare purpurie.
Cercetarea cafeinei în prezenţa barbituricelor: reacţia de formare a murexidului nu este specifică,
deoarece şi barbituricele poate produce reacţie de formare a murexidului. Pentru separarea cafeinei de
barbiturice, soluţia cloroformică care se cercetează se prelucrează cu soluție de hidroxid de sodiu.
Barbituricele, datorită proprietăţilor tautomeriei imino-imidole, în formă de săruri de sodiu se reextrag în
soluţia apoasă, iar cafeina rămiine în cloroform. Numai acum rezultatul pozitiv al reacţiei de formare a
murexidului în soluţia cloroformică confirmă prezenţa cafeinei.
 O
O O
CH3 H
CH3 - N N - CH3 Br2 O
CH3-N NH CH3-N
O N
+ OH
N C=O
O N O O N O
CH3 NH2
CH3 CH3
O O
H O O
HCl CH3-N CH3-N
O N-CH3 NH3
N N-CH3
O N O N O
N O N
O O
CH3 CH3 NH4O O
CH3 CH3
La cercetarea prin metoda CSS în sistema eter: aceton: sol amoniac 25% după developare cu
reactivul Dragendorff, derivaţii purinei au Rf diferit: cafeina Rf= 0,62; teofilina Rf= 0,22; teobromina
Rf= 0,45- 0,47.
Mecanismele toxice ale purinelor
La nivel celular, purinele prezintă trei tipuri de acțiuni de bază care sunt responsabile de
efectele lor diverse:
-Blocarea receptorului adenozinei
-Creșterea acumulării de nucleotide ciclice
-Translocarea calciului intracelular
Adenozina este produsă de către neuroni în timpul zilei, și cu cât cantitatea produsă este
mai mare cu atât mai tare sistemul nervos își încetinește activitatea.
Sistemul nervos monitorizează nivelul adenozinei prin receptori, în special receptorul A1
care se găsește atât în SNC, cât și în cel periferic. În timp ce substanța chimică trece prin
receptori, adenozina crește până când SN ajunge să cedeze și să provoace o stare de inhibare.
Remarcabilă calitate a cafeinei este să mimeze forma și mărimea adenozinei. Atunci receptorii
sunt blocați efectiv de cafeina (se inhiba receptorul adenozinei A1).
Acest lucru este important în primul rând pentru că prin blocarea receptorilor, cafeina întrerupe
și monitorizarea sistemului nervos asupra adenozinei, dar și pentru că apar noi
neurotransmițători, precum dopamina și glutamatul, proprii stimuli ai SN.

Derivații 1,4 benzodiazepinelor

Anii 50 ai secolului al XX-lea a fost începutul erei psihofarmacologice. Atunci au fost efectuate
cercetări asupra metodelor de tratare a bolnavilor cu disfuncţie psihică.
Descoperirea unor preparate capabile să contribuie la tratarea pacienților cu disfuncții psihice a fost un
eveniment egalabil cu descoperirea sulfamidelor, antibioticelor, vitaminelor şi hormonilor. Printre primele
preparate au fost meprobamatul și mefenazina – tranchilizante de generaţia 1. La începutul anilor 60 locul
acestora încep să-l ocupe preparate mai efective din grupa 1,4-benzodiazepinelor.
Clordiazepoxidul (elenium), diazepamul (seduxen), oxazepamul (tazepam), nitrazepamul,
fenazepamul şi altele sunt principalele tranchilizante cunoscute astăzi.
După o scurtă durată de timp, derivaţii 1,4-benzodiazepinelor au devenit unele din cele mai răspândite
preparate medicamentoase. Din totalul de medicamente prescrise, cele mai numeroase sunt derivatele 1,4-
benzodiazepine precedate doar de aspirină.
În anii 70 a apărut problema cercetării obiectelor biologice de origine animală şi vegetală cu conținut
de derivaţi 1,4-benzdiazepinelor. Toţi factorii de aplicare a 1,4-benzdiazepinelor, narcoticelor au servit
argumente pentru comisia ONU. În 1984 ca prescrierea lor să fie leglamentată.
1,4-benzodiazepinele sunt sisteme heterociclice condensate, în care includ nucleul este benzenic şi
1,4-diazepinic.1,4-benzodiazepinele sunt sisteme heterociclice condensate, în care inelul benzoic (A) şi
inelul 1,4-benzodiazepinic (B) conţine 2 atomi de azot în poziţia 1 şi 4.
diazepin benzodiazepin
9 1 2
NH 8 N
A B 3

N 7 N4
6 5
 Există o serie de tautomeri ai 1,4-benzodiazepinelor: С-3 (3Н-1,4-benzodiazepină) (I), 1Н (II) и 5Н-
1,4-benzodiazepină (III):
H
N N N

N N N
I II III

Derivaţii 1,4-benzodiazepinelor au formula generală:

R R1 – Cl, Br, NO2;
O R2 – Cl;
N C
R3 – H; OH ș.a.
C N
R1
R2
Majoritatea în poziţia 5 conţin radicalul ciclic aril.
Primul 1,4-benzodiazepin a fost sintetizat în 1926, însă structura 1,4-benzodiazepinelor a fost
determinată în 1968.
H
O
N C

C N
O
H

Datorită proprietăţii psihotrope unice 1,4-benzodiazepinele au căpătat o răspândire largă.

CH3 NH-CH3
O
O N NH
N
OH
N N N
Cl Cl Cl
O

(I)
diazepam clordiazepoxid oxazepam

CHCH - CONHNH
2 –2CONHNH22 H
O O O
N NH
N

N N
N O2 N Br
Br Cl

nitrazepam enazepam
Acestea sunt substanţe, care se cristalizează, sunt insolubile în apă, greu solubile în alcool şi
cloroform. Bine solubile în dimetilformamid.
(CH3)2N – C = O
\
H
În spectrul electronic UV sunt 3 puncte de absorbţie: în regiunile 200-215 nm, 220-240 nm și 290-
330 nm. Primele două corespund excitaţiilor cromoforilor aromatici, a treia (290-330 nm) apare din
contul legăturile 4,5-hidrat (II).
H
H
O O
N N
H
N
R C NH
R
 (II)
1,4-benzodiazepinele sunt cristale incolore. Temperatura de topire fără radical în poziţia 1 (-N-) este
mai înaltă decât a 1-metilderivaţilor, ceea ce se explică prin asocierea moleculei neînlocuite în poziţia I pe
contul legăturilor de hidrogen, care duc la formarea dimerilor ciclici.
C6H5
N R1
CH2
N
O H

H O Temperatura de topire clozepidei = 238ºC

N
Temperatura de topire diazepamului (N1-CH3) = 125ºC
CH2
R2 N
C6H5
După caracterul absorbţiei în UV, 1,4-benzodiazepinele se referă la compuşii absorbţia cărora se
schimbă în funcție de pH, cu cât pH-ul este mai mic cu atât 1,4-benzodiazepinele se absorb mai ușor în
UV: în mediu acid pe baza protonizării atomului de N 1 (la elenium) şi N4 (la nitrazepam, oxazepam,
diazepam, fenazepam).
H O
N
OH
+
Cl N
H
C6H5
oxazepam protonizat
Maxima de absorbție în UV a unor preparate:
− Elenium în C2H5OH – la lungimea de undă λ= 243, 260 nm în soluţie H2SO4 0,1 n la 245, 306 nm.
− Diazepam în soluție HCl 2 M – la λ= 242, 287 nm, în soluţie H2SO4 0,1 M la 241, 284, 359 nm.
− Nitrazepam în C2H5OH – la λ= 218 nm şi 260 nm, la λ= 277 şi 340 nm în soluţie H2SO4 0,1 M.
Proprietatea de absorbție la o anumită lungime de undă stă la baza identificării 1,4-benzdiazepinelor
după spectrul de absorbţie în UV.
1,4-benzodiazepinele sunt baze slabe, însă în urma reacției clordiazepoxidul formează săruri stabile cu
acizii minerali (H2SO4, HCl).
Compuşii, cu conţinut – RN-CO grupa (diazepam, oxazepam, fenozepamul, nitrizepamul) și
formează săruri cu bazele sau metalele, adică manifestă proprietăţi slab acide.
De aceea, restul 1,4-benzdiazepinelor sunt baze mai slabe decât clordiazepoxid, diazepam formează
săruri cu acizii minerali, dar mai slabe decât ale eleniumului.
Ionii Cl-, Br-, NO2- micşorează intensitatea norului de electroni în inele, sarcina negativă a atomului
de azot N4 și alcalitatea 1,4-benzodiazepinelor – oxazepamului, nitrazepamului, fenozepamului.
Pentru analiza 1,4-benzodiazepinelor se aplică cromatografia în strat subţire. Pentru revelarea
acestora se aplică reactivul Dragendorf (apar spoturi cafenii), acizii (sulfuric şi azotic). Sub acţiunea
razelor UV, benzodiazepinele capătă o fluorescenţă caracteristică. Mai des se foloseşte sistema CHCl 3 –
aceton – 9:1 pe silufol.

Afinitatea compuşilor 1,4-benzodiazepinelor cu proteinele

Activitatea biologică a 1,4-benzodiazepinelor, ca şi a altor compuşi medicamentoşi, se determină
prin interacţiunea fizico-chimică a compuşilor cu complecşi moleculari din organism, numiţi receptori.
Durata acţiunii, atât terapeutică cât şi toxică, se determină de concentraţia compusului în biofază.
Nivelul concentraţiei depinde de concentraţia preparatului în plasma sangvină. De aceea concentraţia
preparatului în plasmă nu este totdeauna proporţională cu acţiunea acestuia, deoarece o parte din ea este
legată cu proteinele plasmei. Însă cu receptorii, interacţionează numai compusul liber, care nu este legat
de plasmă.
Interacţiunea dintre preparatele cu conţinut de azot şi plasmă este efectuată de catre fracţia
albuminică. Aceasta are loc datorită legăturilor intermoleculare. Valoarea energetică a legăturilor este de
8-10 kkal/mol. Aceste legături stabile dintre macromoleculele de hidropreparat (de hidrogen şi ionice)
sunt legături stabile.
Durata de acţiune a toxicului depinde de puterea legăturii sale cu proteinele plasmei sanguine. Cu cât
mai slabă este legătura, cu atât mai mult toxicul se află în stare liberă, și cu cât mai mult acesta se află în
stare liberă, cu atât acţiunea toxică este mai mare.
Afinitatea moleculei de 1,4-benzodiazepină cu albuminele depinde de mărimea radicalilor, de
orientarea lor spre grupele active de receptori. Când radicalul pentru N1 (N=; NH-; -N-CH3) se mărește, se
observă dezabilităţi în apropierea proteinei şi liganzilor. Cu alte cuvinte, în aceleaşi condiţii, concentraţia
diazepamului în sânge va fi mai mare decât concentraţia oxazepamului.

Acţiunea toxicologica şi biotransformarea benzodiazepinelor

1,4-benzodiazepinele au acţiune tranchilizantă şi fac parte din psihotropi. Acestea combat (reduc)
axietatea, încordarea, neliniştea, calmează dereglările psihice.
În cazul intoxicaţiilor acute, se distruge SCN, subiectul cade în coma, pierde reflexele superficiale şi
centrale, i se dereglează mişcările, reacţia sa la lumină este slabă.
1. Semnele intoxicaţiei uşoare:
− paliditate,
− somnolenţă,
− pupile dilatate.
2. Semnele intoxicaţiei medii:
− puls frecvent,
− lipsa reflexelor,
− tremor al membrelor inferioare şi superioare,
− euforie.
3. Semnele intoxicaţiei acute:
− dereglări psihice,
− întreruperea respiraţiei,
− sistemul cardiovascular afectat,
− potenţierea dereglărilor,
− edem pulmonar.
Benzodiazepinele posedă afinitate cu lipidele unde se acumulează şi de unde trec apoi în sânge. Prin
aceasta se explică durata perioadei de înjumătăţire.
Biotransformarea benzodeazepinelor are loc în ficat după reacţiile de:
− oxidare,
− demetilare,
− dezaminare,
− hidroxilare,
− acetilare,
− reducere,
− conjugare cu acid glucuronic.
Analiza chimico-toxicologică a 1,4-benzodiazepinelor
Extragerea 1,4-benzodiazepinelor din ficat, rinichi, din conţinutul stomacal se efectuează cu apă
acidulată cu acid oxalic cu pH-ul mai jos de 2-2,5.
Există o altă metodă de izolare a 1,4-benzodiazepinelor cu amestec de apă-alcool (9:1) acidulat cu
acid oxalic, care elimină până la 90% de elenium şi 100% de diazepam.
Dat fiind proprietăţile acido-bazice ale derivaţilor 1,4-benzdiazepinei, extragerea cu solvenţi organici
nu se face în mod diferit.
Eleniumul se extrage din mediul bazic. Diazepamul – din mediul bazic şi neutru, Fenazepamul,
oxazepamul, nitrozepamul – din mediul bazic şi mediul acid.
 Pentru o extracţie deplină, în soluţia apoasă se adaugă KCl, NaCl, Na 2SO4.
Pentru extragerea din mediul acid, neutru şi bazic deseori se foloseşte cloroform sau etilacetat.
Pentru nitrazepam dicloretanul este mai eficient. Extragerea clordiazepoxidului, diazepamului,
nitrozepamului şi a produselor de descompunere din plasma sanguină şi urină se recomandă să se
efectueze cu eter dietilic. Din ficat şi creier – cu cloroform.
În funcție de obiect, se schimbă și gradul de extragere. De aceea, se şi recomandă diferiţi extragenţi.
Analiza comparativă a extracţiei oxazepamului din plasma sanguină şi urină cu cloroform, dicloretan şi
clorură de metilen a arătat, că în toate cazurile extracţia » 80%. Dar se recomandă clorura de metilen,
deoarece acesta se stratifică repede în mediu apos şi se evaporă uşor.
Pentru purificarea 1,4-benzdiazepinelor de compuşi coextractivi se formează săruri bine solubile în
apă. Astfel, din extractul cloroformic clozepid, se extrage cu 0,1; 0,5 n HCl, iar oxazepamul, diazepamul
– cu HCl 1n.
Pentru analiză se recurge la metoda CSS în două direcţii:
1) Identificarea în prealabil după produsele de descompunere – 2-aminobenzofenone –
determinarea sumară 1,4-benzodiazepinelor după produsele de descompunere;
2) După rezultatul pozitiv al cercetărilor cromatografice, se efectuează cercetările de confirmare –
după metaboliţi.
Cercetările preliminare asupra benzofenonelor
Pe baza acestor cercetări stă reacţia de hidroliză a benzodiazepinelor în HCl, 6 N şi obţinerea produselor
de hidroliză – benzofenonelor. Apoi efectuarea CSS, în calitate de martori fiind luate benzofenonele.
Developarea plăcii cromografice se efectuează în felul următor:
1) UV – benzofenonele au culoare proprie;
2) UV – va fi repetat peste 5-10 ore.
3) Fluorescenţa în zona A este de peste 9-10 ore;
4) Se constată reacţia Brattona-Marsala.
Zona A (metilamino-5-clor benzofenon) nu produce acestă reacţie.
Coloraţia
Substanţa Rf Reacţia
UV
Brattona-Marsala
2-metilaminoclorbenzofenon 0,76 albastru –
2,5-diaminobenzofenon 0,18 oranj liliachiu
2-NH2 -5 -Cl-benzofenon 0,6 galben-verde violet
2-NH2 -NO2-benzofenon 0,54 verde roz
2-NH2 -5 -Br-benzofenon 0,62 galben-verde violet

Diazepamul, care se descompune până la 2-metilamino-5-Cl-benzofenon nu participă la reacţia

Brattona-Marsala.
NHCH2 - CH2 - NH2

+
NH2 N N
NaNO2 Cl
HCl R C - C6H5
R C - C6H5
O O

N=N NH - (CH2 )2 - NH2

R C - C6H5
O

Dacă rezultatul este pozitiv, se efectuează următoarele cercetări.

Cercetări asupra benzodiazepinelor

Pe placă se depune extractul organic şi în, calitate de martor – 1,4-benzdiazepine – clozepid,
diazepam ş.a. Se cromatografiază în sistemul cloroform-aceton (9 : 1) ori toluol – aceton – NH 4OH.
Developarea plăcii:
1) În UV, după prelucrarea cu H2SO4, benzdiazepinele prezintă fluorescează.
 2) Reactivul Dragendorff face ca benzdiazepinele să ia forma de spoturi oranj. Dacă a apărut spot
colorat şi Rf corespunde cu martorul, se efectuează cercetări suplimentare pe produsele de
descompunere pe această placă.
3) Pentru aceasta, după developarea cu reactiv Dragendorff, se efectuează reacţia de hidroliză a 1,4-
benzodiazepinelor pe placă. Se prelucrează cu HCl concentrat. Până la dispariţia fundalului oranj
al reactivului Dragendorff, şi se introduce în termostat la temperatura de 120-130ºC timp de 20-30
min în funcție de compus. În timpul acesta are loc hidroliza.
După răcire, placa se prelucrează cu reactivele: HCl2 n, soluție NaNO2 de 0,1% şi soluția bazică b-naftol
ori N-a-naftilendiamină. Aceasta este reacţia Brattona-Marsala.
H O
N NH2
+
N N
HCl Cl
N T O2N C - C6H5 NO2 C - C6H5
O2N
C6H5 O O

ONa

OH
N=N

NO2 C - C6H5
O

În locul spotului, după prelucrare cu reactivul Dragendorff, dacă acest spot ar fi fost cauzat de 1,4-
benzodiazepine, se formează culoarea produsului azocolorant.
Pentru efectuarea analizei dirijate asupra nitrozepamului, identificarea acestuia prin metoda CSS se
efectuează în sistemul etilacetat: alcool metilic (soluție NH4OH de 25% – 85:10:5), developare cu
Dragendorff. Pentru oxazepam, în metoda dirijată se propune sistemul: cloroform–alcool propilic–aceton
(9:0,4:1). Pentru developare se aplică soluţie saturată de tiosulfat de sodiu. Prezenţa oxazepamului se
determină după culoarea galben-oranj a spotului.
Din metodele chimice de identificare a 1,4-benzodiazepinelor în extractele organice din materialul
biologic se evidenţiază ninhidrina, care, în amestec cu diazepamul, se colorează în roşu, cu clordiazepoxid
– în maro, cu nitrazepam – în galben-cafeniu. Din amestecul clordiazepoxidului cu reactivul Marquis –
rezultă culoarea galbenă, cu reactiv Froede – oranj, cu reactivul Vitali-Moren – galben.
O

O ninhidrina
Deoarece nitrazepamul de 40% se elimină prin urină neschimbat, acesta poate fi determinat fără a fi
hidrolizat până la benzofenone. Deci, se reduce grupa NH 2 până la NH4 grupa cu Na2S2O4 (ditionit de
sodiu), apoi urmează reacţia de formare a azocoloranţilor.
Astăzi, se propun noi metode de determinare a 1,4-benzodiazepinelor în ficat prin metoda nedirijată:
se recomandă fluoroimunoanaliza şi metoda imunofermentativă de analiză.
Pentru determinarea cantitativă a 1,4-benzodiazepinelor, extrase din materialul biologic şi purificate
prin CSS, se recomandă metoda spectrofotometrică, fotometrică, fluorimetrică. Metodele fotocolorimetri-
ce se bazează pe reacţiile de culoare a benzodiazepinelor.
Mai întâi, are loc hidroliza acidă, până la benzofenone, apoi reacţia Brattona-Marsala. Nitrazepamul,
în urină, sânge, salivă, se determină după precipitarea proteinelor cu sol acid tricloracetic de 30%, reacţia
cu 1,2-naftochinon în prezenţa amoniacului şi dimetilformamidei (cantitatea determinată este de 95%).

Schema analizei derivaţilor benzodiazepinelor 1,4 în materialului biologic

1. Cercetarea prealabilă după produsele de hidroliză 1,4benzdiazepinelor- aminobenzofenonele.
Ţesuturile organelor

Izolarea cu solvenţi Distrugerea ţesuturilor şi Sorbţia

polari organelor şi transformarea
 benzodiazepinelor-1,4 în
Extracţia în solvent 2-aminobenzafenone Eluarea
organic

Hidroliza până la Hidroliza până la

2-aminobenzofenon 2-aminobenzofenon

CSS

CGL CLIP UV

Prin cercetarea produselor de hidroliză 2-aminobenzofenone, e posibil determinarea unui şir de

metaboliţi. Aceste rezultate au importanţă chimico-toxicologică negativă.
În cazul unui rezultat pozitiv, se va efectua a doua cercetare (în baza compuşilor nativi şi
metaboliţilor), care va permite determinarea cu exactitate a naturii toxicului, mai ales a acelora, care
hidrolizează până la 2-amino-5-clorbenzofenon (clordiazepoxid, nozepam), precum şi precizarea
prezenţei sau lipsei diazepamului.

Schema analizei benzodiazepinelor după compușii nativi şi a metaboliţilor (argumentare)

Izolarea din material biologic a derivaţilor
benzodiazepinei-1,4

Extracţia benzodiazepinelor-1,4 cu solvenţi organici

Extrasul

CSS

Identificarea cu reactivul Determinarea prin reacţia de

Dragendorff obţinere a azocolorantului după
hidroliza pe cromatogramă

Eluarea

Spectrofotometria în UV, CGL

Această cercetare după compușii nativi și metabili și ne dă posibilitate

Realizarea lucrului practic
Identificarea benzodiazepinelor în baza
produselor de hidroliză

În urma hidrolizei derivaţilor benzodiazepinei-1,4 se formează produse care se pot extrage şi după
cromatografierea pe strat subţire, se pot identifica şi apoi se corelează cu substanţa iniţială, din derivaţii
benzodiazepinelor.
Produsele de hidroliză ale benzodiazepinelor
Clordiazepoxid, oxazepam ® 2-amino-5-clorbenzofenon
Diazepam ® 2-metilamino-5-clorbenzofenon
Nitrazepam ® 2-amino-5-nitrobenzofenon
Fenazepam ® 2-amino-5-brombenzofenon

Etapele de cercetare
− hidroliza benzodiazepinelor până la transformarea aminobenzofenonelor
− extragerea aminobenzofenonelor cu solvenţi organici
− depistarea prin metoda CSS.
 1. Hidroliza benzodiazepinelor-1,4
În eprubetă se introduc 0,5 ml soluție standard 100 mcg/ml al unui derivat al benzodiazepinei (la
indicaţia profesorului) şi 4,5 ml soluţie 6 mol/l HCl, şi se pune la bain-marie la fiert cu refrigerent
descendent. La fiecare 5 minute se agită.
2. Extracţia aminobenzofenonelor
Hidrolizatul răcit se transferă într-un balon ori pâlnie de separare şi se adaugă NaOH în granule, până
pH-ul capătă valoarea de 7-9, vasul se răcește sub jet de apă rece. Se extrage cu cloroform de 2 ori câte 5 ml.
Extracţiile se reunesc şi se spală cu apă şi soluţia cloroformică se transferă într-o capsulă de porţelan. Se
lasă să se evapore până la 0,2 ml şi se depune cu capilarul pe placa cromatografică.
3. Cromatografie pe strat subţire.
Faza staţionară – silicagelul este fixat cu ghips ori pe placa cromatografică „Silufol”; faza mobilă –
benzen.
− timpul de saturare a camerei cu vaporii benzenului nu va fi mai mic de 10 minute.
− distanţa migrării solventului va fi de 10 cm.
Pe linia de start, în punctul 1, se sportează câteva picături de soluție standard de aminobenzofenonă.
A B C În primul punct – 2-amino-5-clorbenzofenonă şi
2-amino-5-nitrobenzofenonă.
1 2 3 În al doilea punct – extras din hidrolizat.
Punctul 3-2-amino-5-metilbenzofenonă,
2-amino-5-brombrnzofenonă, 2-metilamino-5-clor-
benzofenonă.

Determinarea substanţelor pe placa cromatografică

− după culoarea proprie,
− după fluorescenţa caracteristică la UV (254-360 nm),
− după reacţia de formare a azocolorantului.
Identificarea: Se pulverizează stratul sorbentului din zonele A şi B (2-amino-5-benzofenonă şi 2-
amino-5-nitrobenzofenonă) cu reagenţii, în următoarea succesiune :
− soluţie 2 mol/l de HCl,
− soluţie 0,1% NaNO2,
− soluţie de clorhidrat N-1-naftiletilendiamină ori soluţie bazică de b-naftol.
Zona C (punctul 3) va fi prelucrată cu soluţie de 10% HClO 4 şi observată fluorescenţa la UV la 245
nm.
4. Prezentarea rezultatelor analizei
Rezultatele analizei se înscriu în tabel:
Rezultatele CSS
Denumirea Produsul de
Coloraţia spoturilor
compusului şi hidroliză şi
După reacţia de După
formula de formula de RF
formare a fluorescenţa
structură structură
azocolorantului în UV

Confirmarea concluziilor, prin chimismul reacţiile de obţinere a azocolorantului.

Problema 2. Cercetarea extractului acid după metoda cromatografiei pe strat subţire (CSS-scrining).
Reactivele:
Sorbentul – silicagel (Silufol)
Sistemul de sorbrnţi – cloroform:aceton (9:1).
20-30 ml de amestec de solvenţi se introduc în camera de cromatografiere, se lasă 15-20 minute
pentru saturarea camerei cu vapori de solvent, apoi se introduce placa cromatografică pregătită pentru
analiză cu compuşii respectivi pe linia de strat.
Exemplu de probleme:
1. Barbamil, barbital, fenazon (antipirin), cafeină, acid salicilic.
2. Etaminal, fenobarbital, aminofenazonă (amidopirină), fenazonă, teobromină.
3. Barbamil, barbital, aminofenazonă, cafeină, acid salicilic.
4. Fenobarbital, etaminal sodic, fenazonă, teofilină, acid salicilic.
 După ce faza mobilă se ridică la ¾ din înălţimea plăcii, placa se scoate din cameră, se usucă şi se
developează cu reagenţi în următoarea consecutivitate:
1. Difenilcarbazid 0,02% (soluție cloroformică), apoi soluția de sulfat de mercur (II) 5% în acid
sulfuric (pentru depistarea barbituraţilor şi a noxironului).
2. Soluţie apoasă de clorură de fier (III) 5% pentru identificarea derivaţilor pirazolonei şi a
salicilaţilor.
3. Reactivul Dragendorff (se identifică derivaţii purinelor, pirazolonei şi ai benzodiazepinelor-1,4.
Se calculează indicele de repartiţie Rf. Datele se înscriu în tabelul 1.
Tabelul 1
Culoarea
Determinarea
Rf DFC + R-v
compusului FeCl3
HgSO4 Dragendorff

Problema 3. Aplicarea reacţiilor chimice de identificare a compuşilor medicamentoşi în extractul

acid.
1. Fenazonă (antipirină) şi aminofenazonă
− reacţia cu FeCl3
− reacţia cu NaNO2, H2SO4
− reacţia cu AgNO3
2. Cafeină, teobromină şi teofilină
− reacţia de formare a murexidei
− reacţia microcristaloscopică a cafeinei cu clorura de mercur
3. Diazepam, clordiazepoxid
− reacţia cu ninhidrină
− reacţia cu reactivul Marquis, Frede
Fenazon, aminofenazon
1. Reacţia cu clorură de fier (III). La reziduul format după evaporarea cloroformului, în bolul de
porţelan se adaugă o picătură de soluţie de FeCl 3 (III). Prezenţa fenazonei face să apară culoarea roşie,
aminofenazona – cea violetă, care dispare atunci când reactivul este în exces.
Reacţia cu acid azotic. Reziduul uscat se dizolvă în 2-3 ml apă, se acidulează cu soluţie de acid
sulfuric de 10%, se adaugă câteva picături de soluţie saturată de nitrit de sodiu. Prezenţa fenazonei face să
apară culoarea verde, cea a aminofenazonei – culoarea violetă, care dispare repede.
Reacţia cu nitrat de argint. La o parte din soluţia apoasă de aminofenazonă se adaugă 3-5 picături de
soluţie de nitrat de argint şi se încălzeşte timp de 2-3 minute. Prezenţa aminofenazonei face să apară
culoarea violetă şi, în cazul cantităţilor maxime de preparat un precipitat de culoare închisă.
2. Reacţia de formare a murexidei. 1-2 ml de soluție cloroformică se evaporă fără încălzire. La
reziduul format se adaugă 0,5 ml de soluţie saturată de apă de brom şi se evaporă la bain-marie. La
reziduul colorat, după răcire, se adaugă 1-2 picături de soluţie amoniacală de 25%. Prezenţa cafeinei, a
teobrominei și a teofilinei face să apară culoarea violetă.
Reacţia cafeinei cu clorură de mercur (II). Pe reziduul uscat după înlăturarea cloroformului, se depinde
o picătură de soluţie de acid clorhidric (0,1 M) şi o picătură de soluție de clorură de mercur. Peste 10-15 mi-
nute, prezenţa cafeinei face să se formeze cristale aceforme. Sensibilitatea reacţiei este de 9,4 mg.

3. La 2-3 ml de soluţie etanolică se adaugă 10 mg de ninhidrină şi amestecul se încălzeşte timp de 2

min la bain-marie. După adăugarea a 5 ml de etanol, soluţia capătă culoare albastră, iar după adăugarea a
2 picături de soluţie de sulfat de cupru (II), prezenţa diazepamului îl face să se coloreze în roșu, iar
prezenţa clordiazepoxidei – în cea cafenie.
Concluzii: S-a studiat analiza chimico-toxicologică a compuşilor medicamentoşi cu caracter slab-
bazic: derivaţii purinei, pirazolonei, benzodiazepinei-1,4.

Bibliografie
1. Cotelea Tamara,Simonov Lidia Posibilități de identificare a compușilor ce se izolează din materialul biologic cu
solvenți polari. Aplicații practice pentru studenții anului IV. Chişinău:Centrul Editorial-Poligrafic Medicina,2015.
2. Brodicico T, Valica V. Curs de chimie toxicologică. – Chişinău: Centrul Editorial-Poligrafic Medicina.
3. Cotrău M., Popa L., Stan T., Preda N., Kineses-Ajtay M. Toxicologie. – Bucureşti: Ed. Medicală, 1991.
4. Cotrău M., Proca M. Toxicologie analitică. – Bucureşti: Ed.Medicală, 1988.
5. Guţu N. Toxicologie. – Chişinău: Ştiinţa, 1995.
6. Voicu A.B. Toxicologie clinică. – Bucureşti: Ed.Albatros, 1997.
7. Крамаренко В.Г. Токсикологическая химия. – Киев: Выща школа, 1989.
8. Белова А.В. Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии. Москва: «Медицина»,
1976.