Laborator 1

Pentru realizarea experimentelor de genetică moleculară şi inginerie genetică, acizii

nucleici trebuie izolaţi într-o formă cât mai pură. Deşi tehnicile de izolare diferă în funcţie de sursă,
etapele principale sunt urmatoarele:
1. Alegerea materialului biologic de la care se izolează acizii nucleici;
2. Distrugerea peretelui celular;
3. Ruperea membranei plasmatice (liza celulară);
4. Deproteinizarea;
5. Precipitarea acizilor nucleici:
6. Purificarea.
1. Alegerea materialului biologic de la care se izolează acizii nucleici:
 Bacterii – se folosesc suspensii bacteriene obţinute după o cultivare timp de 18-24 h, cu
sau fără agitare;
 Drojdii – se folosesc suspensii celulare obţinute după o cultivare timp de 18-24 h;
 Fungi filamentoşi – se foloseşte miceliu obţinut în mediu lichid prin cultivare timp de 24-
48 h;
 Organisme animale – pentru izolarea acizilor nucleici se pot folosi fragmente de organe,
ţesuturi moi sau culturi de celule;
 Plante - în acest caz, se poate folosi o gamă de material vegetal precum: ţesut foliar tânăr,
calus, embrioni. În anumite cazuri se pot utiliza şi alte tipuri de fragmente vegetale (secţiuni
de tulpină, scoarţă, seminţe etc.), însă metodele de izolare a acizilor nucleici sunt mai
complexe.
2. Distrugerea peretelui celular.
 La bacterii: există mai multe modalitati de distrugere a peretelui celular:
- Fizice (mojararea, ultrasonicarea, şocul termic). Prin tratamente fizice se fragmentează
peretele celular şi se sparg celulele. Ultrasonicarea provoacă ruperea pereţilor celulari.
Ultrasunetele sunt generate prin trecerea unui curent alternativ printr-un cristal de cuarţ.

1
 - Chimice (tratament enzimatic cu lizozim etc) sau prin inhibarea sintezei peretelui celular cu
ajutorul antibioticelor.
Efectul lizozimului consta in degradarea legaturii β-1,4 dintre dintre N-acetilmuramic şi N-
acetilglucozamina şi permeabilizarea peretelui celular pentru diversi agenti de liză celulară. Pentru
bacteriile Gram-pozitive concentraţia de lizozim folosită trebuie să fie mai mare (15-30 mg/ml)
decât la bacteriile Gram-negative (5-15 mg/ml). Lizozimul degradează legăturile β-1,4- dintre
acidul N-acetilmuramic şi N-acetilglucozamina, componente ale peptidoglicanului.
La unele bacterii Gram-pozitive, aşa cum sunt cele din genul Staphylococcus, se utilizează
lizostafin – un complex enzimatic sintetizat de anumite tulpini de stafilococi, lizozimul fiind
ineficient;
Utilizarea antibioticelor din gama β-lactamilor (de exemplu penicilina), care au rol în
inhibarea formării peretelui celular;
 La drojdii şi fungii filamentşi se folosesc tratamente fizice (ultrasonicare, mojarare cu nisip de
cuart sau bile de sticlă) sau enzimatice cu “suc de melc” (complex enzimatic extras din sucul
gastric al Helix pomatia), care conţine chitinaze, celulaze, proteaze, amilaze, etc; (cu suc de
melc).
 Celulele animale nu sunt protejate de perete celular;
 Celulele vegetale pot fi tratate fizic (ultrasonicare, mojarare), cu azot lichid sau enzimatic (cu
celulaze şi hemicelulaze). Peretele celular vegetal, cu excepţia unor alge, este alcătuit din
celuloză. Hemiceluloza este un amestec complex de polizaharide care, împreună cu celuloza și
lignina, intra în structura pereților celulelor vegetale. Efectul enzimelor celulolitice (celulaze şi
hemicelulaze) este acela de a degrada pereţii celulari vegetali facilitand eliberarea constituienţilor
celulari.
3. Ruperea membranei plasmatice si eliberarea continutului celular
sau liza celulară, se realizează cu ajutorul unui tampon de liză ce conţine un detergent
(membrana plasmatică fiind de natură fosfolipidică) de tipul SDS (sodiu dodecil sulfat), CTAB
(cetil-trimetil amoniu brom), sarcozil sau deoxicolat de sodiu. Tamponul de liză trebuie sa aibă
un pH>8. La valori mari de pH are loc o denaturare a ADN, renaturarea avand loc la
neutralizarea soluţiei.
În urma lizei celulare se eliberează nucleaze, care pot degrada acizii nucleici. Astfel, pentru
protejarea ADN de acţiunea nucleazelor, în tamponul de liză, se adaugă EDTA (etilen-

2
diamino-tetra-acetat) - un agent chelator ce fixează ionii de Mg2+, care sunt cofactori ai DN-
azelor. În acest fel, DN-azele nu mai pot acţiona. Liza celulară este totală atunci când soluţia se
clarifică şi devine vâscoasă.
4. Deproteinizarea are scopul de a îndepărta proteinele din lizatul celular.
Ea se realizează fie cu solvenţi organici (fenol, amestec de cloroform: alcool izoamilic 24:1
v/v sau amestec fenol: cloroform: alcool izoamilic 25:24:1 v/v), prin tratament enzimatic
(proteinază E, proteinază K) sau cu soluţii saline concentrate (KCl 2,5M). După agitare, se
obţine o emulsie, care după centrifugare se separă astfel: o faza apoasă (supernatantul) care
conţine acizii nucleici (ADN, ARN), stratul proteic (peliculă ce conţine proteine denaturate) şi o
faza organică. Sedimentul depus la baza tubului de centrifugă este alcătuit din nisip de cuarţ şi
resturi celulare.
5. Precipitarea ADN se realizează în general, prin utilizarea unor alcooli (alcool etilic
absolut, alcool izopropilic).
Se poate face cu: 2 volume de alcool etilic absolut si incubare la rece (-20°C), 0,7 – 1 volume
alcool izopropilic şi incubare 10-15 min. la temperatura camerei sau cu PEG (polietilenglicol) 60%
şi incubare la - 43 0C, peste noapte. Recuperarea ADN se realizează prin centrifugare, timp de 5-
10 minute, la 15.000 rpm, spălarea sedimentului cu alcool etilic 70o şi reluare într-un volum minim
de tampon TE (Tris 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0).
6. Purificarea ADN. Pentru a putea fi folosit în experimentele ulterioare (transformare
genetică, clivare cu enzime de restricţie, PCR, RFLP etc.) ADN trebuie să fie pur,
necontaminat cu proteine şi ARN. Acest lucru se realizează prin 2 – 3 operaţii de
deproteinizare cu amestec de cloroform:alcool izoamilic în raport de 24 : 1 v/v (sau
fenol:cloroform: alcool izoamilic în raport de 25:24:1 v/v), prin tratament cu 10 mg/ml
RN-aza si incubare la 37oC timp de 30 de min. (dacă scopul experimentului este izolarea
ADN), spălări cu etanol 70 % sau, în cazuri speciale, ultracentrifugare in gradient de
clorură de cesiu.

Lucrare practica
Izolarea ADN din fructe
Material biologic: kiwi, banane sau orice alt fruct.

3
Necesar:
• NaCl (sare de bucatarie)
• Detergent vase, dizolvat in apa distilata;
• Alcool etilic absolut (rece);
• Hârtie de filtru;
• Eprubete;
• Pâlnii;
• Mojare.
Mod de lucru
 Fructul se curata de coaja, se portioneaza, iar pulpa lui (~2-3 g) se transfera in mojare
pregatite in prealabil;
 Segmentele de fruct se mojareaza adaugand, pe rand, sarea de bucatarie si
detergentul;
 Pasta obtinuta se transfera in palnii cu hartie de filtru umectata si se filtreaza in
eprubetele pregatite anterior;
 Faza lichida (supernatantul) obtinuta (~2-3 ml) se trateaza cu 2 – 3 ml de alcool etilic
absolut rece, care se prelinge usor (cu ajutorul unei pipete Pasteur) pe peretele
eprubetei;
 Se va observa ca, la interactiunea dintre supernatant si alcool, ADN incepe sa
precipite;

ADN din Kiwi

 Dupa 2 – 3 minute, ADN poate fi recoltat din stratul de alcool etilic si transferat in
tuburi de centrifuga Eppendorf cu 1 ml TE.
 Probele obtinute se pastreaza la congelator, pana la analize ulterioare de determinare
a concentratiei si puritatii ADN prin metode spectrofotometrice.
ATENTIE !!!!
Aceasta metoda, este o metoda empirica; ADN izolat NU ESTE PUR;

4
Aceasta metoda NU se foloseste in laboratoarele de specialitate unde se utilizeaza protocoale
specifice de izolare ADN - in care se urmeaza, in general, etapele de izolare cu reactivi
specifici, descrise in partea teoretica.
Metoda descrisa mai sus este destinata doar vizualizarii ADN si poate fi accesata prin linkul
https://www.youtube.com/watch?v=uDWSuSBYsdM

5
 Laborator 2

Utilizarea acizilor nucleici izolaţi sau purificaţi în experimente ulterioare, este condiţionată
de stabilirea gradului de puritate şi a concentraţiei lor în probele de analizat. Pentru aceasta se
pot utiliza diferite metode cum ar fi:
1. Metode spectrofotometrice;
2. Metode colorimetrice (metoda Disché pentru ADN şi metoda Bial pentru ARN);
3. Metoda electroforetică.

Un spectrofotometru este un instrument analitic utilizat pentru a măsura cantitativ

transmiterea sau reflectarea luminii vizibile, a luminii UV sau a luminii infraroșii.
Spectrofotometrele măsoară intensitatea în funcție de lungimea de undă a sursei de lumină.

Metoda spectrofotometrică de analiză se bazează pe determinarea coeficientului de extincţie al

soluţiei la diferite lungimi de undă.
Datorită prezenţei bazelor azotate purinice şi pirimidinice cu duble legături conjugate,
moleculele de acizi nucleici (atât ADN cât şi ARN) au proprietatea de a absorbi radiaţiile
ultraviolete cu lungimi de undă cuprinse între 250-320 nm, cu un maxim de absorbţie la 260 nm.
Principiul metodei constă în expunerea unei probe la radiaţii UV cu lungimea de undă
de 260nm, prin intermediul unui spectrofotometru. Radiaţiile luminoase care trec prin probă
sunt măsurate cu ajutorul unui fotodetector (fig. 1-1).
Cu cât proba absoarbe mai multă lumină, cu atât la nivelul fotodetectorului ajunge mai
puţină lumină, ceea ce înseamnă că concentraţia de acid nucleic din probă este mai mare.

1
 Fig. 1-1. Principiul metodei spectrofotometrice

Studiul variaţiei absorbţiei în UV a soluţiilor de acizi nucleici reprezintă o metodă

rapidă, exactă şi relativ nedestructivă de măsură a concentraţiei şi purităţii acestora.
Astfel de determinări au la bază legea Lambert- Beer care oferă o relaţie matematică,
lineară între concentraţia unei substanţe (în acest caz acizii nucleici) în soluţie şi proprietăţile de
absorbţie ale acestora (fig. 1-2). Legea Lambert- Beer este redată de formula:

A = Εx Cx l

Unde:
A – reprezintă absorbanţa sau extincţia;
Ε- coeficientul de extincţie molară (M –1 cm –1) (sau absorbţia molară a soluţiei);
c- concentraţia substanţei din soluţie (mol/l);
l – grosimea stratului de soluţie străbătută de fascicolul de radiaţii (în mod uzual se ia 1cm).

Fig. 1-2. Analiza spectrofotometrică

2
 Fig. 1-3. Spectrofotometru
După determinarea extincţiei unei soluţii cu ajutorul spectrofotometrului (fig.1.3), pe baza
legii Lambert-Beer se poate calcula concentraţia acizilor nucleici din soluţie atunci când se
cunoaşte coeficientul de extincţie molară al acesteia (valori preluate din tabele) sau, la o
concentraţie cunoscută, se poate deduce absorbţia molară (E) necunoscută a soluţiei.
Dacă coeficientul de extincţie molară este exprimat în M –1 cm –1, concentraţia obţinută se
exprimă în mol/l. Dacă coeficientul de absorbţia molară este exprimat în (µg/ml) –1
cm –1
,
concentraţia se exprimă în µg/ml. Astfel, dacă se consideră că grosimea stratului de soluţie
străbătută de fascicolul de radiaţii este de 1 cm, coeficienţii specifici de absorbţie a acizilor nucleici
sunt :

ADN monocatenar: 0.027 (µg/ml) –1 cm –1

ADN dublu catenar: 0.020 (µg/ml) –1 cm –1

ARN: 0.025 (µg/ml) –1 cm –1

Introducând aceste valori în ecuaţia Lambert- Beer, la 260 nm şi o extincţie egală cu 1,
concentraţiile acizilor nucleici sunt următoarele :

ADN monocatenar = 37 µg/ml

ADN dublu catenar = 50 µg/ml

ARN = 40 µg/ml

Variaţia absorbţiei în UV a soluţiilor de ADN permite studiul denaturării acestuia. Odată

cu trecerea de la forma dublu catenară la forma monocatenară, absorbţia soluţiilor de ADN creşte
cu până la 40 % (efect hipercromic), variaţie ce depinde de procentul bazelor guanină (G) şi
citozină (C).

3
 Acizii nucleici au un spectru de absorbţie cuprins între 250-320 nm. O extincţie mai mare
de 260 nm indică prezenţa altor tipuri de molecule în soluţie.
Pentru determinarea tipului de molecule cu care proba poate fi contaminată, se citesc
extincţiile soluţiilor la două lungimi de undă diferite :
 260 nm- lungimea de undă la care acizii nucleici au absorbţia maximă şi 280 nm-
lungimea de undă la care proteinele au absorbţie maximă.
Sau
 260 nm- lungimea de undă la care acizii nucleici au absorbţia maximă şi 230 nm-
lungimea de undă la care carbohidraţii au absorbţie maximă.
Astfel, au fost introduse anumite criterii de puritate:
 O valoare a raportului A260/ A280 cuprinsa între 1,8 şi 2 indică o puritate ridicată a
soluţiei de acizi nucleici; Valoarea de 1,8 indică o puritate ridicată pentru ADN, iar
valoarea 2 indică o puritate ridicată pentru ARN.
- Valori mai mici de 1,8 indică contaminarea cu proteine sau cu fenol (dacă in metodele
de purificare s-a utilizat fenol).
- Valori mai mari de 2 indică prezenţa în soluţie a unei cantităţi mari de ARN;
 O valoare a raportului A260/ A230 > 2 - indică o puritate ridicată pentru acizii
nucleici (ADN sau ARN).
 O valoare a raportului A260/ A230 < 2 - indică contaminarea probei cu carbohidraţi,
săruri sau solvenţi organici.

4
 Lucrare practică
 Se determină puritatea şi concentraţia ADN dintr-o probă, cu ajutorul
spectrofotometrului (A)

 Valorile ce indică concentraţia şi puritatea ADN din probă sunt afişate pe ecran (B)

 Interpretarea rezultatelor:
Dupa valorile afisate pe ecranul aparatului se deduc urmatoarele:

Concentratia ADN din proba: 25,2 µg/ml;

Puritatea ADN din proba se deduce din valorile rapoartelor afisate pe ecran:

5
Stim ca:

 O valoare a raportului A260/ A280 cuprinsa între 1,8 şi 2 indică o puritate ridicată a
soluţiei de acizi nucleici;

 Valoarea de 1,8 indică o puritate ridicată pentru ADN;

 Daca valoarea raportului A260/A280 < 1,8 – proba este contaminata cu proteine sau
cu fenol;
 Daca valoarea raportului A260/A280 > 2 – proba este contaminata cu ARN;

 O valoare a raportului A260/ A230 > 2 - indică o puritate ridicată pentru acizii nucleici
(ADN sau ARN).
 O valoare a raportului A260/ A230 < 2 - indică contaminarea probei cu carbohidraţi,
săruri sau solvenţi organici.
Valorile afisate pe ecranul spectrofotometrului sunt:

Problemă rezolvată
O proba este analizata spectrofotometric pentru determinarea concentratiei si puritatii ADN.
Valorile afisate pe ecranul aparatului sunt:
88, 5 µg/ml;
A260/A280 = 1,5
A260/A230 = 1,88
Sa se interpreteze rezultatele.
Rezolvare
Concentratia de ADN din proba este: 88, 5 µg/ml
Valoarea raportului A260/A280 = 1,5 (< 1,8) – proba este contaminata cu proteine (sau cu fenol);
Valoarea raportului A260/A230 = 1,88 (< 2) - indică contaminarea probei cu carbohidraţi (sau cu
săruri sau solvenţi organici).

6
 2. Metode colorimetrice pentru determinarea concentratiei acizilor
nucleici
a. Metoda Disché pentru dozarea ADN
Principiul metodei. Prin tratarea unei probe de ADN cu acizi puternici, are loc depurinarea
ADN (bazele purinice sunt indepartate). Are loc ruperea legaturilor fosfodiesterice si eliberarea
deoxiribozei. Grupul aldehidic reactiv al deoxiribozei devine disponibil, iar reacţia acestuia cu
difenilamina produce compuşi coloraţi în albastru. Concentraţia compuşilor de reacţie prezintă un
maximum de absorbţie la 595 nm. Metoda constă în analiza cantitativă a compusului colorat prin
măsurarea cantităţii de lumină absorbită de acesta. Intensitatea culorii este proporţională cu
concentraţia de ADN.
Metoda a fost descrisă de Disché (1930) şi constă în analiza cantitativă a compusului
colorat, prin masurarea cantitătii de lumina absorbită de acesta.

b. Metoda Bial pentru dozarea ARN

Principiul metodei. Metoda se bazează pe faptul că ARN, în mediu acid, eliberează
riboza care este deshidratată la furfurol, prin pierderea intramoleculară a trei molecule de apă.
Acesta, în prezenţa orcinolului formează produşi de culoare verde, cu maximum de absorbţie la
665 nm. Intensitatea culorii este direct proporţională cu concentraţia de ARN.
Pentru a se putea determina concentraţia de ARN dintr-o anumită probă, se realizează mai
întâi o curbă etalon utilizând soluţii de ARN cu concentraţie cunoscută. În funcţie de această curbă
se apreciază apoi concentraţia ARN din proba dorită.

7
 Laborator 3

Electroforeza este o metodă fizico-chimică analitică, de separare, bazată pe migrarea

diferenţiată a unor particule încărcate electric, sub acţiunea unui câmp electric extern.
Denumirea de electroforeză provine din asocierea cuvântului grec elektron (electric) cu cel
latin phore (purtător) evidenţiindu-se astfel rolul esenţial al câmpului electric.
În funcţie de scopul urmărit, analiza electroforetică asigură obţinerea unor date
importante legate, în principal, de caracteristicile unor proteine aflate într-un amestec sau
purificate, de particularităţile unor acizi nucleici sau a altor tipuri de molecule. Cele mai
multe aplicaţii ale electroforezei vizează studiul acizilor nucleici şi proteinelor.

În biologia moleculară, migrarea moleculelor de acizi nucleici în gel de agaroză sub

influenţa unui câmp electric, este o tehnică folosită pentru separarea, purificarea şi identificarea
acestor molecule.
Agaroza este un polimer natural extras din alge, este un polizaharid liniar, cu o masă
moleculară de aproximativ 12.000 Da, alcătuit din unităţi repetitive de agarobioză ce alternează cu
unităţi de galactoză şi 3,6-dehidrogalactoză. Gelurile de agaroză se obţin prin fierberea unei soluţii
apoase de agaroză (0,6-2%) care apoi, prin răciere, se solidifică. Datorită dimensiunilor mari ale
porilor, aceste geluri sunt utilizate, în primul rând, pentru separarea moleculelor cu o masă
moleculară mai mare de 200 kDa. Astfel, un fragment de ADN de o anumită mărime, poate migra
în proporţii diferite în funcţie de concentraţia de agaroză din gel. Distanţa de migrare depinde, în
principal, de greutatea moleculară a materialului iniţial. Din această cauză, alături de probele
supuse electroforezei, în stânga şi în dreapta gelului, se încarcă un marker ADN cu o mărime
cunoscută. In general, un astfel de marker conţine un număr definit de segmente cunoscute de
ADN, fapt care facilitează determinarea mărimii unor fragmente de ADN necunoscute.

1
 Principiul metodei – constă în faptul că la pH alcalin sau neutru, acizii nucleici - care
au o sarcină globală negativă - dacă sunt plasaţi într-un câmp electric vor migra spre electrodul
pozitiv (anod).
Acizii nucleici (ADN şi ARN) sunt molecule polimere, formate din numeroase
nucleotide ce conţin grupări fosfat care imprimă moleculelor respective o sarcină globală
negativă. Din acest motiv, moleculele de acizi nucleici vor migra în câmp electric spre electrodul
pozitiv (anod).
Separarea electroforetică a moleculelor de ADN se realizează în suporturi poroase de
tipul gelului de agaroză (Fig. 1).

Fig. 1. Electroforeza in gel de agaroza

Viteza de migrare în gel a moleculelor de acizi nucleici variază în funcţie de:
• dimensiunea lor (moleculele de dimensiuni mici vor migra mai repede decât moleculele
de dimensiuni mai mari care vor migra mai încet);
• conformaţia lor;
• concentraţia gelului de agaroza;
• tensiunea curentului electric aplicat.
În funcţie de dimensiunea şi de conformaţia moleculelor de acizi nucleici studiate acestea
prezintă mobilităţi electroforetice diferite. Astfel, moleculele cu aceeaşi dimensiune vor prezenta
mobilităţi electroforetice diferite în funcţie de conformaţia moleculară: moleculele circulare,
compacte vor migra cel mai rapid prin porii gelului de agaroză; în schimb, moleculele lineare
sau cele circulare desfăşurate vor migra mai încet, ele traversând mai greu gelul.

2
 În funcţie de dimensiunea moleculelor de ADN ce sunt supuse separării, concentraţia
gelului de agaroză poate varia între 0,3-2%. Pentru gelul de verificare a unor extracte de ADN
cromosomal, concentraţia agarozei este de 0,7-0,9 %, iar pentru ADN plasmidial de 1-1,2 %.
Grosimea gelului de agaroză trebuie să fie de 3- 4,5 mm.
Separarea moleculelor de ADN fiind influenţată şi de valoarea tensiunii curentului
electric aplicat gelului, aceasta nu trebuie să depăşească 5 V/ cm. O tensiune mai mare va
determina distorsionarea benzilor de ADN, acestea apărând curbate (fenomenul smiling).
Evidenţierea (vizualizarea) frontului de migrare se realizează prin adăugarea în godeuri,
alături de probele de ADN, a albastrului de bromfenol (Fig. 2). Probele sunt lăsate să migreze ¾
din lungimea gelului.

Fig. 2. Adăugarea în godeuri, alături de probele de ADN, a albastrului de bromfenol

(dupa www.alamy.com)

Colorarea moleculelor de ADN se realizează cu un colorant fluorescent numit bromură

de etidiu (se intercalează între bazele azotate ale acizilor nucleici). Bromura de etidiu poate fi
adăugată în gel (0,5- 1 μg/ml). Datorită acestui colorant, după migrare, benzile de ADN pot fi
vizualizate în lumină ultravioletă, la un transiluminator UV, unde vor apărea colorate în roz-violet
(fig. 3).

3
 Fig. 3. Benzile de ADN vizualizate în lumină ultravioletă
Compoziţia chimică a soluţiei tampon în care este realizată electroforeza, influenţează
în mod semnificativ valorile mobilităţilor electroforetice mergând până la schimbarea direcţiei de
migrare. Valoarea pH a soluţiei tampon determină sarcina netă a ionului iar tăria ionică a soluţiei
tampon determină potenţialul electrocinetic care reduce sarcina netă efectivă. Se poate deci
considera că mobilitatea este invers proporţională cu rădăcina pătrată a tăriei ionice. Tării ionice
scăzute ale soluţiilor tampon permit obţinerea unor viteze de migrare mai mari, cu o producere mai
mică de căldură, în timp ce la tării ionice mai mari apar forţe suplimentare de rezistenţă, ce conduc
la viteze scăzute şi o generare mai mare de căldură.
Ca soluţiile tampon pentru electroforeza acizilor nucleici se pot folosi:
• TBE (Tris 0,084M, acid boric 0,089M, EDTA 0,002M, pH 8- 8,5)
• TAE (Tris 0,084M, acid acetic 0,04M, EDTA 0,002M, pH 8,5)
• TPE (Tris 0,084M, acid fosforic 0,09M, EDTA 0,002M, pH 8- 8,5)
Cea mai folosită soluţie tampon este TBE. Se prepară o soluţie stoc (concentraţie 5x sau
10x), care se păstrează la frigider .
Pentru evidenţierea electroforetică a acizilor nucleici se utilizează, în general, un aparat
de electroforeză în SISTEM ORIZONTAL (fig. 4).

4
Separarea electroforetică a proteinelor dintr-un amestec se realizează în gel de poliacrilamidă, gel
cu o consistenţă mai mare comparativ cu cel de agaroză, ce permite diferenţierea unor molecule
de dimensiuni mai mici.
Evidenţierea benzilor proteice, după electroforeză, se face în lumină vizibilă, mai rar în
lumină ultravioletă, după o colorare specifică cu diferite substanţe (Coomasie Brilliant Blue,
azotat de argint etc.).
Migrarea electroforetică se poate realiza cu ajutorul unui aparat de electroforeză în
SISTEM VERTICAL (fig. 5).

Fig. 5. Aparat de electroforeză în sistem vertical

Concentraţia gelului de separare se pregăteşte în funcţie de greutatea moleculară a

proteinelor analizate. După preparare, gelul de separare se lasă la polimerizat 30-60 de minute,
după care se adaugă gelul de concentrare (3ml).
Concentraţia proteinelor ce vor fi supuse separării electroforetice trebuie să fie de
aproximativ 1,33 mg/ml.

5
 Lucrare practică
Electroforeza ADN in gel de agaroză

Mod de lucru
Pentru prepararea unui gel de electroforeză 0,8% se parcurg etapele:
• Se cântăreşte 0,8 % agaroză pentru o cantitate de 35 ml soluţie de agaroză;
• Cu ajutorul unui cilindru gradat, se măsoară 35 ml tampon TBE 1 x (se prepară din soluţia
stoc de 5x) ;
• Într-un pahar Erlenmeyer (de 100 ml) se introduce soluţia tampon împreună cu agaroza
cântărită în prealabil. Amestecul astfel obţinut se pune pe baia de apă pentru topirea
agarozei;
• În gelul astfel obţinut (răcit la 40oC) se adaugă 4 μl bromură de etidiu 1%;
• Se pregăteşte cuva de electroforeză: se pun plăcuţele delimitatoare şi pieptenul, se toarnă
gelul si se lasă 30 min. să se solidifice;
• După solidificarea gelului, se scoate uşor pieptenul (pentru a se evita ruperea gelului);
• Probele de ADN ce trebuie analizate se pregătesc prin amestecarea a 7 μl soluţie de ADN
cu 3 μl tampon de incărcare (20 % sucroză şi albastru de bromfenol);
• Cu ajutorul unei micropipete, probele astfel pregătite, se introduc în godeurile gelului;

• Se pune capacul cuvei şi se conectează aparatul de electroforeză la sursa de curent. Se

stabileşte tensiunea de migrare la 50 V;
După ce probele au migrat ¾ din lungimea gelului (aprox. 30 min.), se scoate gelul din cuva de
electroforeză şi se examinează benzile de ADN la un transiluminator UV.

6
 Laborator 4

Virusurile sunt entităţi biologice cu organizare acelulară. Sunt patogeni importanţi ai tuturor
categoriilor de organisme celulare, bacterii, fungi.
Genomul viral poartă o cantitate limitată de informaţie genetică şi se poate replica numai
in celula gazdă. Un virus este alcătuit dintr-un înveliş proteic numit capsidă şi un miez de acid
nucleic (fig. 4-1).

Fig. 4-1.Structura virală (după Hartl şi colab.,1988)

Miezul de acid nucleic (genomul viral) este constituit din ADN (deoxiribovirusuri) sau
ARN (ribovirusuri), niciodată ambele.

Particula virală completă se numeşte virion sau virus infecţios matur şi rezultă în urma
autoasamblării componentelor sale sintetizate de celula gazdă (bacterii, fungi, celule
vegetale, animale) pe baza informaţiei genetice conţinute în acidul nucleic viral.
Particula virală lipsită de învelişul proteic – capsidă, se numeşte virus vegetativ când
se află liber în citoplasma celulei gazdă în timpul replicării sale sau provirus când este
integrat în cromozomul celulei gazdă.

1
 Virusurile care parazitează celulele bacteriene se numesc bacteriofagi. Bacteriofagii au
fie un genom constituit dintr-o moleculă de ADN dublucatenar sau monocatenar linear, fie un
genom ARN (foarte rar).
Din punct de vedere al morfologiei capsidei, fagii au fost clasificaţi în trei tipuri:
 icosaedrici (φX174),
 icosaedrici cu coadă (T4, λ) şi
 filamentoşi (φ29, M13).
Dupa infectarea celulelor sensibile, bacteriofagii pot parcurge un ciclu de viaţă litic sau lizogen.
In ciclul litic, bacteriofagii îşi "injectează" materialul genetic (genomul, cromozomul
viral) în citoplasma celulei gazdă (Fig. 4-2), care este replicat independent de cromozomul
bacterian; are loc transcrierea, se sintetizează proteinele virale şi componentele structurale ale
bacteriofagului, se asamblează particulele virale, iar în final celulele bacteriene sunt lizate (Fig.
4-2).

Fig. 4-2. Adsorbţia, penetrarea şi injectarea ADN bacteriofagic intr-o celulă bacteriană
(http://textbookofbacteriology.net/phage.html)

In ciclul lizogen, bacteriofagii după ce-şi introduc genomul în celula gazdă, acesta se
integrează în cromozomul bacterian, devine profag şi se replică odată cu cromozomul celulei

2
gazdă, iar genele virale în marea lor majoritate nu se exprimă. Integrarea se realizează la nivelul
unor situsuri specifice (genomul fagului λ se integrează între operonii gal şi bio) sau la întâmplare
în diferite regiuni ale cromozomului bacterian (Fig.4-3).

Fig. 4 -3. Ciclul de viaţă al fagului λ (după Hartl şi colab.,1988)

Lizogenia implică represia replicării genomului fagic şi integrarea sa în structura

cromozomului bacterian prin recombinare la nivelul unor situsuri specifice.
Starea de lizogenie poate fi perpetuată de-a lungul mai multor generaţii bacteriene, dar
în anumite condiţii genomul viral poate fi excizat din cromozomul celulei gazdă şi eliberat în
citoplasmă, evoluând spre ciclul litic. Acesta este fenomenul inducţiei fagice (litice).
Inducţia fagică poate fi declanşată spontan sau poate fi stimulată de factori fizici
(radiaţii ionizante (X), neionizante (UV), temperatură) sau chimici (antibiotice - mitomicina C în
cazul tulpinilor de Streptomyces producătoare de streptomicină).
Cel mai cunoscut fag litic este fagul T4 care infectează in mod specific celulele de
Escherichia coli. Structura bacteriofagului T4 este următoarea: cap, coadă, placă bazală, fibrele
cozii (Fig. 4 -4).

3
 Fig. 4 -4. Structura bacteriofagului T4
(http://www.intralytix.com/Intral_PhageHistory.htm)

Importanţa fenomenului inducţiei fagice

Infecţia cu bacteriofagi virulenţi sau temperaţi a culturilor bacteriene utilizate în procese
fermentative (în industria alimentară sau farmaceutică) produce pagube însemnate (pierderea unei
şarje).
Fenomenul lizogeniei are importanţă practică pentru că numeroase bacterii utile din punct
de vedere biotehnologic pot fi lizate în urma declanşării fenomenului de inducţie litică. Din această
cauză, inainte de utilizarea practică, tulpinile bacteriene de interes sunt testate în privinţa
caracterului lizogen (prin tratamente ce pot declanşa inducţia fagică).

Se utilizează o tulpină bacteriană de colecţie, cunoscută a fi sensibilă la bacteriofagi (de

exemplu : Escherichia coli E28 - gazdă pentru λ sau E. coli 27 –gazdă pentru fagul T4).

Tulpina bacteriană este cultivată timp de 24 h la 370C în 5 ml mediu lichid LB (mediu

Luria-Bertani ce conţine : 10 g/l triptonă, 5 g/l extract de drojdie, 10 g/l NaCl) suplimentat cu 5 μl
CaCl2 1 mM (asigură adsorbţia fagică la peretele celulei bacteriene).

4
 Pentru determinarea prezenţei unor bacteriofagi in mediile naturale, se utilizează două probe:
• O probă de apă prelevată dintr-un lac sau de la o staţie de epurare (Ep) şi
• O probă de sol (S) .
Cu ajutorul unui filtru biologic (cu diametrul porilor de 0,2 μm), din probele respective se
sterilizează câte 1 ml (prin filtrare sunt eliminate toate organismele celulare, putând trece doar
virusurile). Din fiecare probă astfel sterilizată, se fac diluţii seriale de până la 10-4 conform
exemplului din figura (fig. 4 -5).

Fig. 4 -5. Exemplu de realizare a diluţiilor seriale

 Din suspensia bacteriană obtinuta, se amestecă o cantitate de 1 ml cu 0,1 ml din fiecare
diluţie din proba de apă (Ep) şi respectiv cu 0,1 ml din fiecare diluţie din proba de sol (S)
şi se incubează pe baia de apă timp de 20 min. la 37 oC;
 După incubare, 0,1 ml din fiecare probă se adaugă in câte 5 ml mediu de cultură (LB) slab
agarizat (0,6% agar), topit şi răcit la 45 oC ; se amestecă rapid şi se toarnă în plăci Petri,
deasupra unui strat de mediu solid, normal agarizat - (tehnica dublului strat) (Fig. 4 -6);
 Se incubează 24 h la 37 oC după care se examinează prezenţa plajelor de liză şi se
calculează PFU/ml (unităţi formatoare de plaje de liză) (Fig. 4 -7).

5
 2 ml suspensie E. coli E28

Proba A Proba B

1 ml E. coli E28 1 ml E. coli E28

Incubare 20 min. la 37 oC Incubare 20 min. la 37 oC

Plaje de liză
Fig. 4 -6. Shema de lucru pentru evidenţierea plajelor de liză

6
 Laborator 5

Bacteriile, inclusiv actinomicetele şi cianobacteriile, prezintă o organizare celulară

procariotă. Genomul procariot este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici:
1. Gene esenţiale, localizate în structura cromozomului;
2. Gene accesorii, localizate în structura plasmidelor, a transpozonilor, secvenţelor de inserţie,
bacteriofagilor.
1. Cromozomul bacterian este alcătuit, în general, dintr-o moleculă de ADN dublu-
catenar circular închis, covalent. Acesta este situat în regiunea centrală a celulei
bacteriene, este inclavat direct în citoplasmă fiind prins prin mezosom de membrana
plasmatică şi formează nucleoidul (nucleosom, nucleoplasm) sau nucleul de tip
procariot lipsit de membrană nucleară (Fig. 5 -1).

Fig. 5 -1. Celula bacteriană

2. Elementele genetice accesorii au următoarele proprietăţi :

a) conţin informaţie genetică neesenţială pentru supravieţuirea organismului purtător, in condiţii
normale de mediu, dar care pot oferi un avantaj in condiţii modificate de mediu;
b) sunt capabile de replicare independentă faţă de cromozomul bacteriei purtătoare.

1
 Cele mai importante elemente genetice accesorii la procariote sunt plasmidele. Ele sunt
delimitate spaţial de cromosomul bacterian, se pot replica autonom faţă de acesta’
Plasmidele sunt reprezentate de molecule de ADN dublu-catenar circular covalent
închis sau linear, ce conţin informaţie genetică neesenţială în condiţii normale de mediu. În
anumite situaţii însă această informaţie genetică poate conferi avantaje selective bacteriilor
purtătoare, permiţându-le supravieţuirea în noul mediu..
Moleculele de ADN plasmidial pot prezenta trei conformaţii moleculare: circulare
covalent închise (CIC), circulare deschise (CD) şi lineare (L).
La nivelul plasmidelor au fost identificate numeroase gene care conferă bacteriilor
purtătoare fenotipuri specifice:
 rezistenţă la antibiotice;
 producerea de antibiotice (la bacterii din genul Streptomyces – plasmide lineare);
 producerea de bacteriocine (substanţe proteice cu efect inhibitor asupra unor bacterii
înrudite – Escherichia coli – colicine şi bacteriile lactice);
 rezistenţă la bacteriocine;
 producerea de toxine – E. coli – gene care conferă virulenţă, toxicogeneză;
 rezistenă la metale grele Pb, Hg;
 producerea de acid lactic la streptococi lactici;
 producerea de proteaze la bacteriile lactice;
 simbioză bacterie – plantă superioară: pe plasmide există gene care asigură simbioza între
bacterii din genul Rhizobium şi plante leguminoase şi sunt localizate şi gene care asigură
fixarea azotului atmosferic de către bacterii;
 tumorigeneză la plante – bacterii din genul Agrobacterium care conţin plasmide de
dimensiuni mari la nivelul cărora sunt localizate gene ce pot fi transferate celulelor vegetale
(în urma unui proces de infecţie). Celulele vegetale transformate prezintă modificări ale ratei
normale de diviziune, multiplicându-se anormal şi formează tumori – A. tumefaciens.
Pentru a evidenţia localizarea plasmidială a anumitor caractere se realizează
experimente de “curing” (engl. vindecare, curăţare).

2
 Prin utilizarea anumitor tratamente specifice se induce eliminarea preferenţială a
anumitor molecule de ADN (plasmidial).
Tratamentele de curing pot presupune:
 şoc termic – incubarea bacteriilor la temperaturi mai mari decât cele optime pentru
dezvoltare, dar nu letale;
 tratamente cu substanţe chimice – coloranţi acridinici de tipul acridin-orange şi acriflavină.
Aceşti coloranţi se intercalează între nucleotidele moleculelor de ADN, modificând
conformaţia şi perturbând procesul normal de replicare. Ei au capacitatea de a determina inhibarea
replicării ADN plasmidial, fără să afecteze cromosomul bacterian.
În populaţia bacteriană tratată cu coloranţi acridinici este afectată rata de diviziune, iar
celulele rezultate constituie o populaţie heterogenă cu celule cu sau fără plasmide. În concentraţii
mari, coloranţii acridinici pot determina mutaţii letale.

Evidenţierea localizării plasmidiale a genelor implicate in producerea de

acid lactic la bacteriile lactice

1. Se utilizează o cultură bacteriană de Lactococcus lactis ssp. cremoris tulpina 26 (martor)

obţinut în mediu lichid după incubare 18 h la 37 °C. Bacteriile test sunt cultivate în acelaşi
mediu, dar care conţine şi 20 µg/ml acriflavină.
2. Din aceste culturi se fac diluţii (10-4) iar din ultima diluţie se însămânţează câte 0,1 ml pe plăci
Petri ce conţin mediul LIA (Lactose Indicator Agar: 5 g/l peptonă, 3 g/l extract de carne, 10
g/l lactoză, 0,004% roşu de bromcrezol, 15 g/l agar).
3. După etalarea probei, plăcile se incubează 24 h la 37 °C.

Aprecierea rezultatelor: pe plăcile inoculate cu martorul vor apare colonii izolate gălbui în jurul
cărora se formează un halou de decolorare a mediului. Decolorarea mediului se datorează
faptului că bacteriile respective utilizează lactoza şi produc acid lactic care modifică valoarea
pH-lui mediului (lac+).
Pe plăcile însămânţate cu proba tratată cu acriflavină vor putea apare două categorii de
colonii: unele de tip martor şi altele în jurul cărora nu apare halou. Aceste colonii nu produc

3
acid lactic, respectivul caracter – producerea de acid lactic – fiind codificat de plasmide ce au
fost eliminate în urma tratamentului cu acriflavină (lac-).