UTILIZACION DE VARIOS GENES REPORTEROS PARA ELIMINACION DE FALSOS POSITIVOS EN EL METODO DE TWO HYBRID SYSTEM Castao T.

Catalina

El two hybrid system es un mtodo gentico que permite detectar interaccin protena protena in vivo, la deteccin es por observacin de fenotipo indirecto, por lo cual es susceptible de detectar interacciones artefactuales. En esta revisin se evalo el papel que cumple la utilizacin de varios genes reporteros como lacZ, HIS3, ADE2, URA3 en la disminucin de la deteccin de falsos positivos. Encontrndose que el empleo de varios genes es importante durante el proceso de screening pero no debe ser la nica estrategia utilizada durante el desarrollo del mtodo; ya que es necesario utilizar un mtodo de confirmacin de las interacciones verdaderas positivas que tenga un sistema que sea capaz de detectar la interaccin in vitro como es la coinmunoprecipitacin. El proyecto genoma humano ha revelado un gran nmero de genes de nuestro genoma, pero no se cuenta con informacin acerca de la funcin de cada uno de los productos de estos (1). La interaccin entre protenas es esencial para la ejecucin de muchas de las funciones biolgicas y de todos los mecanismos celulares como sntesis de DNA, transcripcin, traduccin, vas de sealizacin; todo est relacionado con interaccin protena - protena (molecular and celular biochemistry). El two hybrid system es un mtodo gentico para deteccin de la interaccin protena protena in vivo. Se basa en la reconstitucin del activador transcripcional eucariotico. La protena de inters cebo fusionada al dominio de unin al DNA, y una librera o protena de interaccin conocida presa se fusiona con domino de activacin. La Interaccin entre protenas hibridas cebo - presa reconstituye activacin transcripcional y estimula la expresin de gen reportero (1). El gran avance que tuvo este mtodo fue el de detectar la interaccin protena protena in vivo, ya que la mayora de mtodos bioqumicos tradicionales se basaban en la interaccin in vitro como la co-inmunoprecipitacin, crosslinking. En el ao de 1989 Fields S. (2) genero el mtodo de two hybrid system teniendo en cuenta propiedades de la protena GAL4 de levadura Saccharomyces cerevisiae. El mtodo se ha utilizado para evaluar la interaccin de una protena de inters con otra protena conocida (3) los productos de clones de una librera (4), o entre todas las protenas de un

mismo organismo como Saccharomyces cerevisiae (1) (5). En algunos estudios se han generado diferentes modificaciones con la intensin de disminuir el nmero de falsos positivos detectados, entre ellos el efectuado por Shweta Tyagi y Sunil K. Lal en el ao 2000 (6), en el cual se incluye la utilizacin de varios genes reporteros como una estrategia diferente; en el estudio desarrollado por Ilya Serebriiskii y colaboradores (7) utilizan dos protenas cebo e incorporan controles para falsos positivos y para las interacciones no especificas en una sola clula; en el 2004 Pierre-Olivier Vidalain y colaboradores (8), identifican diferentes situaciones que pueden generar falsos positivos, desarrollando estrategias para intentar solucionar cada uno de ellos. El diseo del ensayo hace que la deteccin de interaccin protena- protena positiva sea a travs de la observacin de un fenotipo indirecto, el cual es dependiente de la activacin transcripcional del gen reportero. La interpretacin indirecta de una interaccin positiva hace que el two hybryd system sea susceptible a en la deteccin de clones de levadura positivos artefactuales (6). El proceso de deteccin debe ser riguroso para evitar en lo posible la deteccin de falsos positivos, es as como el papel de los genes reporteros es esencial dentro del mtodo. Estos genes reporteros son genes cuya expresin fenotpica es fcil de ser monitoreada y de identificar cuando son expresados por el organismo que contiene el gen. Los genes reporteros ms utilizados son el lacZ, ADE2, HIS3, URA3 entre otros, cada uno est regulado por un promotor corriente arriba, al cual va a ser el sitio de unin del dominio de unin al DNA y domino de activacin para activar su transcripcin. El hecho de utilizar cada uno su propio promotor puede ser una herramienta para disminuir el nmero de falsos positivos, al emplear durante el proceso de screening varios genes reporteros. En esta revisin se pretende estudiar, como el uso de varios genes reporteros puede ayudar en la disminucin de deteccin de falsos positivos.

MATERIALES Y METODOS Se realiz una revisin bibliogrfica del principio de la tcnica, continuando con la seleccin y estudio de artculos que proporcionaran informacin relacionada con los componentes y pasos fundamentales para el desarrollo de un 2HS prototipo. Se busc informacin que permitiera saber cules han sido las principales modificaciones que ha tenido el mtodo, adems de sus posibles usos. La revisin de varios artculos arrojo informacin sobre los principales factores que influyen en la obtencin de falsos positivos. Teniendo en cuenta el objetivo del trabajo, se busco informacin de los genes reporteros utilizados en este mtodo.

A partir de la informacin encontrada y la bsqueda de nuevos artculos se obtuvo informacin en los cuales el mtodo utiliza diferentes genes reporteros para el screening y si estos ayudaron en evitar la obtencin de falsos positivos. Una vez revisados y analizados los artculos, se determinaron cuales podran ser las ventajas y desventajas que presenta el mtodo. Mtodo Estudio de tcnicas desarrolladas en cada uno de los artculos y diferentes modificaciones que tienen respecto al two hybrid system original, con un mayor enfoque en los genes reporteros utilizados y cul es su papel en la disminucin de falsos positivos detectados.

DESCRIPCION DE LA METODOLOGIA DEL TWO HYBRID SYSTEM El termino two hybrid system se deriva de dos clases de protenas quimricas, o hbridos . Es un mtodo gentico para identificar protenas que interactan con una protena blanco especfico y que busca detectar la interaccin protena protena in vivo. Se basa en la reconstitucin funcional de un activador transcripcional eucariotico donde la protena de inters (cebo) es expresada en levadura como un hibrido, con un dominio de unin al DNA, y una librera o protena de interaccin conocida (presa) que se fusiona con el dominio de activacin (3). La interaccin entre protenas hibridas cebo y presa reconstituyen la activacin transcripcional y estimula la expresin del gen reportero (6). En el primer ensayo de two hybrid system, desarrollado por Fields en el ao 1989, l utiliz el producto del gen de la levadura GAL4 que regula un grupo de genes involucrados en el metabolismo de la galactosa, el GAL4 es un activador transcripcional eucariotico, el cual cuenta con los dos dominios individuales, un dominio de activacin transcripcional y un dominio de unin al DNA (1) (9) (10) (6). Para el two hybrid system, inicialmente se deben crear dos genes fusin, el primero lleva una secuencia que codifica para la protena en estudio (protena X) cebo unida a secuencia del dominio de unin al DNA . Un segundo gen fusin es generado con las secuencias de protena Y que puede ser de interaccin conocida o una protena codificada por una librera presa y una secuencia de dominio de activacin . (6). Estos dos hbridos son codificados por separado en plsmidos de expresin de la levadura, con marcadores seleccionables independientes (Kanamicina, ampicilina, neomicina etc.) Los dos plsmidos son transfectados en cepas de levaduras que contienen un gen reportero tal como LacZ fusionado al promotor GAL1 (9) y marcadores auxotrficos

tales como Trp, Leu, His etc. (6). Las regiones regulatorias de estos genes estn diseadas para tener sitios de unin al DNA, que son reconocidos por el dominio de unin al DNA fusionado a la protena X (cebo). (9). La transformacin de las levaduras se realiza con diferentes mtodos, el ms utilizado es el Litio-Acetato, en el cual las levaduras se cultivan en un medio sinttico completo, se tratan con litio acetato, polietilenglicol (PEG) y portador de cadenas de DNA sencilla para inducir la captacin del plsmido (9). La levadura Saccharomyces cerevisiseae es mas la utilizada, ya que su apareamiento es determinado por el locus mating-type (MAT) con dos alelos diferentes el MAT y el MATa que difieren en 700 pb en su secuencia. El apareamiento de levaduras se da entre mating de tipo haploide, el subsecuente apareamiento de las clulas de tipo de mating opuesto permite convertirse en un estado diploide (11). Este tipo de reproduccin es aprovechada por el ensayo de two hybrid system que utiliza levaduras haploides de MAT y MATa, cada tipo conteniendo uno de los plsmidos (pCebo o pPresa). La seleccin de levaduras que incorporan a cada tipo de plsmido se realiza por crecimiento en un medio sinttico completo (SC) carente de marcador auxotrfico. Posterior a esto las colonias de levaduras que contiene el plsmido cebo o presa se aslan por cultivo en medio SC carente de ambos marcadores auxotrficos, lo que confirma que la levadura tiene ambos plsmidos. Una vez la levadura tiene ambos plsmidos, es necesario evaluar la interaccin positiva entra las protenas X y Y. S las dos protenas interaccionan, los dominios de unin al DNA y de activacin transcripcional se unen, formando as el factor de transcripcin que va a dar inicio a la expresin del gen reportero que codifica en este caso para la galactosidasa, que tiene su accin enzimtica sobre el sustrato cromognico X-gal ( -5bromo-4-cloro-3-indolyl- -D-Galactopiranosida) adicionado al medio, produciendo un color azul, en colonias que producen el gen (12). La identidad de las protenas interactuantes se determina por la amplificacin por PCR de la protena presa unido al dominio de activacin de cada colonia seleccionada.

TWO HYBRID SYSTEM Y FALSOS POSITIVOS Este mtodo es susceptible de generar falsos positivos, debido a diferentes causas entre las que se encuentran: a) Los falsos positivos producidos por una interaccin protena-protena que se da en levaduras pero no se da in vivo en el organismo en estudio porque las dos protenas no se expresan en el mismo tiempo y tejido. b) Los falsos positivos que son generados debido la utilizacin de concentraciones elevadas de protenas en el sistema que podran llevar a interacciones que no se realizan en niveles fisiolgicos (8). c) Adicionalmente, existen algunas protenas pegajosas que son frecuentemente detectadas usando diferentes cebos lo que podra llevar a falsos positivos. d) Falsos positivos se pueden presentar por alteraciones en las levaduras debido a la presencia de protenas cebo y presa como cambios en la tasa de crecimiento y transcripcin, en la permeabilidad celular, viabilidad entre otras (8) e) Genes fusin dominio de unin al DNA Protena cebo que activan directamente sin la interaccin de protenas o dominio de activacin. f) Asimismo se puede dar la activacin de trascripcin de gen reportero por el domino de activacin por s solo, sin ser necesaria la interaccin de protena o dominio de unin al DNA (13).

En este ltimo caso el two hybrid system detecta una supuesta interaccin protenaprotena por observacin de un fenotipo indirecto, el cual depende de la activacin transcripcional del gen reportero que no estara siendo dada por la unin del dominio de unin al DNA y dominio de activacin que sera lo esperado. Lo que indica que esta deteccin indirecta es susceptible de clones de levadura positivos artefactuales.

TWO HYBRID SYSTEM Y SISTEMA DE DETECCION DE INTERACCION PROTEINA-PROTEINA Un gen reportero es un gen cuya expresin fenotpica es medible y que puede ser identificado fcilmente sobre un ruido de protenas endgenas del organismo que lo expresa. Se controla la actividad de cada gen por secuencias regulatorias cis, las cuales son responsables de alteraciones en la regulacin y expresin en clulas hospederas (14) El two hybrid system realizado por Fields en 1989, utilizo el factor de transcripcin GAL 4 para unirse a la secuencia corriente arriba UAS del promotor GAL 1 y permitir la expresin del gen reportero lacZ que participa en el metabolismo de la galactosa, codificando para la enzima -galactosidasa. Este factor de transcripcin adems regula otros genes reporteros codificando selectivamente marcadores seleccionables que permiten la deteccin de la interaccin de la Protena X-dominio de unin al DNA y Protena Y- dominio de activacin . El gen reportero lacZ, es ampliamente utilizado en la actualidad, como se explico anteriormente, codifica para la protena -galactosidasa, al adicionar X-gal (color claro) es clivado por la por la enzima produciendo galactosa y un producto color azul insoluble, caracterstica que le permite ser utilizado como gen reportero.

El gen reportero HIS3 se ensaya por crecimiento en medio carente de histidina y que contiene 3-amino-1,2,4-triazole (3 AT). Otro gen reportero utilizado es el URA3 que codifica para orotidina 5-fosfato descarboxilasa, una enzima envuelta en la sntesis de nucletidos de pirimidinas, la perdida de la actividad de esta, conduce a una falta de

crecimiento de las levaduras a menos que se adicione al medio de cultivo uracilo o uridina (seleccin positiva), lo que permite ser utilizado como gen reportero. En el two hybrid system es ensayado por crecimiento en medio que contiene acido 5-fluoro orotico (5FOA), (8). El gen de la ADE2 es regulado por el promotor GAL2. Una variedad de genes reporteros son utilizados en la actualidad HIS3, ADE2, LEU2y URA3 y reporteros colorimtricos como el LacZ ya mencionado y la protena verde fluorescente (6)

UTILIZACION DE VARIOS GENES REPORTEROS Y SU IMPLICACIN EN ELIMINACION DE FALSOS POSITIVOS En algunos estudios, se ha utilizado el sistema de doble hibrido, donde se ha incorporado dentro del screening, la utilizacin de varios genes reporteros. En el ao 2000, Shweta Tyagi and Sunil K. Lal (6) buscaron eliminar la cantidad de falsos positivos, utilizando una serie de modificaciones al mtodo original, que involucran la coexpresin de ambos plsmidos que contenan cada uno de los genes fusin Protena cebo-dominio de unin al DNA y Protena presa- dominio de activacin , y para su screening se recurre a dos genes reporteros HIS y LacZ; luego se realiz un sistema de doble hibrido en el que se utilizan plsmidos positivos para el primer screening, y se transfectan en levaduras con mating diferente y a para que se genere una levadura diploide que contenga ambos plsmidos, para el segundo screening tambin se usaron los mismos genes reporteros (figura 1). Las cepas de levadura utilizadas contiene diferentes promotores para el factor de transcripcin GAL4 dirigidos corriente debajo de los genes reporteros HIS3 y LacZ, as la

activacin de un gen reportero no necesariamente tiene que activar al otro, ayudando as a la disminucin de falsos positivos (figura 2) Figura 1

Figura 2

Otros estudios como el desarrollado por el grupo de investigacin conformado por investigadores del Centro Genoma Humano, Instituto de Ciencia Mdica y la Universidad de Tokio (2000) en el cual hacen una identificacin sistemtica de interaccin entre las aproximadamente 6000 pares de protenas de Saccharomyces cerevisiae en el cual todos

los ORFs son clonados tanto en cebos como presas agrupados en sets de 96 clones y usados para screening sistemtico (5) (figura 3). El uso de mltiples genes reporteros dirigidos por diferentes promotores que responden al factor de transcripcin Gal 4, en este caso los tres genes reporteros (ADE, HIS, URA) y finalmente evaluadas en medio suplementado con X-Gal para examinar activacin de gen MEL1 endgeno, el cual es blanco del factor de transcripcin GAL 4, que acta como un cuarto gen reportero. Con cada gen que se va evaluando se permite una mayor certeza, de que la interaccin protena - protena si se est efectuando. Figura 3

En el ao 2002 un estudio realizado por Joel W. Graff y colaboradores en el cual se utilizo el two hybrid system para identificar protenas celulares que pudieran interaccionar con la protena NSP1 de rotavirus que ayudaran a esclarecer la funcin de esta protena viral (12). Para esto se construyo una librera de cDNA de clulas MA104 unidos al dominio de activacin y el gen 5 que codifica para la protena NSP1 se uni al dominio de unin al DNA, el screening ocurre por activacin de genes reporteros HIS3, ADE2 y MEL1 lo que permite el crecimiento de levaduras en medio carente de histidina, adenina y la habilidad para metabolizar el sustrato X-Gal. Para confirmacin de la interaccin observada levaduras que contenan plsmido con la secuencia que codifica para protena NSP1 fueron cotransfectadas con clones de librera de cDNA, las transformantes se cultivaron en medio sin leucina, triptfano (marcadores auxotroficos), histidina y adenina (genes reporteros). Las colonias que median 2 a 4 mm de dimetro se re extrajeron y fueron incubadas en medio que contena X-Gal.

En este estudio se observa de nuevo la utilizacin de varios genes reporteros para realizar los diferentes screening a lo largo de todo el procedimiento. En el ao de 2004 se realiza un estudio por investigadores del Instituto de Cncer y Departamento de Gentica, Escuela Mdica de Harvard (8) en el cual se desarrolla un sistema de two hybrid system de alto rendimiento en el cual se utilizan diferentes estrategias para identificacin de falsos positivos causado por transcripcin de genes reporteros en presencia de protena cebo -dominio de unin al DNA, sin necesidad de interaccin con protena presa-dominio de activacin, o por caso contrario en el cual el dominio de activacin unido a la protena presa activa la transcripcin de genes por s solo, adems de la interaccin de dominio de activacin con muchas protenas cebo unida al dominio de unin. Dentro de las estrategias utilizadas se encuentra el uso de marcadores de levaduras de seleccin negativa como el CYH2, bajos niveles de expresin de plsmidos y la utilizacin de varios genes reporteros cada uno bajo control de un promotor distinto, GAL1-HIS3 (125 pb de GAL1 en el promotor de HIS3 corriente arriba de gen HIS3), GAL1-lacZ (contiene el promotor GAL1 fusionado a lacZ) y un SPAL10 (tiene promotor SPO13 con 10 sitios de unin a Gal4 fusionado a URA3). Estos genes reporteros son utilizados en diferentes combinaciones para los screening realizados durante el transcurso de todo el procedimiento.

DISCUSION Como se observa la utilizacin de varios genes reporteros no est limitada a un tipo especfico de ensayo, aqu vemos como diversas metodologas que difieren en pasos que buscan disminuir al mximo el nmero de falsos positivos identificados utilizan a lo largo de su desarrollo genes reporteros. Por remocin de clones que solo activan la transcripcin de un gen reportero, muchos falsos positivos podran ser eliminados. Se observa que en general estos genes reporteros son regulados cada uno por un promotor especfico, lo que permite que en caso de activarse la transcripcin de un gen reportero, no indica que necesariamente se activen los dems, lo que lleva a un screening que va a ser ms riguroso. El gen reportero HIS3 ampliamente utilizado en diferentes estudios, requiere para su uso la adicin en el medio de cultivo del 3-AT y se acompaa por la acumulacin de precursor de histidina desfosforilado, el imidazolglicerol. El 3-AT inhibe as la sntesis de histidina por interferencia con la actividad de la enzima imidazolglicerol fosfato deshidrogenasa, que

tendra como objetivo eliminar crecimiento en medio SC deficiente de histidina de levaduras en las que no est siendo expresado este gen reportero. Su utilizacin es en niveles tan bajos que no afectan el crecimiento de verdaderos positivos, esperndose que fuera un buen gen reportero. En estudios realizados se encuentra que este gen genera una gran cantidad de falsos positivos como en el desarrollado por Philip James y colaboradores en el que observaron que solo 18 de 350 colonias con screening para His+ fueron positivas para otros genes reporteros evaluados (15), lo que evidenciara que este gen no debe ser utilizado como gen reportero nico para el screening, podra ser empleado en compaa de otros genes reportero que den mayor rigurosidad al sistema. De igual manera en el mismo estudio se relaciona que el gen reportero ADE2 puede detectar interacciones dbiles, interacciones protena- protena que producen 3.5 unidades de -galactosidasa que son permitidas para crecimiento adecuado en medio deficiente de Adenina. De esta manera es til no solo para eliminar falsos positivos aunque no en un cien por ciento, sino tambin falsos negativos debido a interacciones dbiles que no puedan ser detectadas. En los estudios descritos anteriormente se observa, que se considera de importancia el paso de deteccin, siendo el que va a permitir indirectamente observar la interaccin protena- protena, es por eso necesario utilizar dentro de la metodologa varios genes reporteros durante todos los pasos de deteccin, y as intentar eliminar falsos positivos. Se debe tener en cuenta que esta no debe ser la nica estrategia usada, es necesario incrementar la rigurosidad del mtodo durante todos los pasos, no solo en la deteccin. Es primordial entender que los genes reporteros nunca van a ser cien por ciento libres de error, todos producen un largo nmero de falsos positivos, pero la lgica es que entre ms se utilicen se podr reducir en mayor medida su nmero. En el estudio realizado por Shweta Tyagi and Sunil K. Lal (6) en el cual se hace primero una cotransfeccin para luego, por screening con HIS3-LacZ se extraen plsmidos de clones positivos, y se transfecta cada uno en levadura mating a o , para realizar el apareamiento, para posteriormente detectar a travs de los mismos reporteros las levaduras diploides con dos plsmidos y la interaccin protena protena, vemos que hay dos estrategias para la eliminacin de falsos positivos, aparte de los genes reporteros, es una buena opcin; sin embargo ese proceso de deteccin debera tener una mayor rigurosidad utilizando un mayor nmero de genes reporteros entre ellos el ADE2, que puede disminuir considerablemente el ruido de fondo. En el estudio realizado por Joel W. Graff y colaboradores (12) se observa que es muy similar a la metodologa en el estudio anterior, pero en este caso se invierten las

estrategias primero se realiza el procedimiento que permite el apareamiento de las levaduras, para seguir con la cotransfeccin, pero se recurre a tres genes reporteros HIS3, ADE2 y MEL1 siendo posible que este mtodo admita una mejor deteccin de interaccin protena protena relevantes. Es interesante como la metodologa del two hybrid system es flexible al empleo de diferentes mejoras. En el estudio realizado por investigadores del Centro Genoma Humano, Instituto de Ciencia Mdica y la Universidad de Tokio (5) se realizan screening con diferentes genes reporteros durante el desarrollo del mtodo pero no se emplean maniobras adicionales que hacen pensar que este experimento puede llevar a un gran nmero de falsos positivos y ms en el contexto para el cual se est haciendo el two hybrid system que es evaluar interaccin protena- protena entre las aproximadamente 6000 protenas que tiene Saccharomyces cerevisisae. El estudio realizado por investigadores del Instituto de Cncer y Departamento de Gentica, Escuela Mdica de Harvard (8), se presentan varias estrategias para los diferentes tipos de falsos positivos, como seleccin negativa con CYH2, las cepas de levaduras usadas en el ensayo fallan para crecer en medios que contienen 1 g/ml de ciclohexamida. Adems aprovechan baja expresin de plsmidos para evitar que la existencia de gran cantidad de protenas cebo que de alguna manera pueda evitar detectar interacciones relevantes. Otro punto de control, es que despus del screening y con uso de la bioinformatica se pude determinar que hay algunas interacciones positivas por produccin de un corto pptido que se produce en las levaduras transformadas con plsmidos, que interactan con la protena fusin cebo dominio de unin al DNA ; para eliminar estos falsos positivos es necesario observar la secuencia del plsmido y si la secuencia que codifica para el dominio de activacin no est en la estructura con la protena inserta, este clon lo consideran como falso positivo. Esta metodologa es muy interesante porque miran todos los posibles falsos positivos que se pueden presentar y generan estrategias podran disminuir su deteccin. La gran ventaja que tiene el mtodo y en lo cual se considera un gran avance metodolgico, es el hecho de poder evaluar la interaccin protena protena in vivo. En la actualidad se tiene conocimiento de una gran cantidad de genes que codifican para protenas, pero a la mayora no se les conoce su funcin, el two hybrid system se convierte en una herramienta valiosa, porque es un importante elemento en la caracterizacin de la funcin biolgica de una protena en la identificacin de protenas conocidas, con las cuales interacciona (Serebriiskii 2005 en el capitulo two hybrid system del libro Protein Protein Interactions. A Molecular Cloning Manual).

El two hybrid system permite no solo evaluar la interaccin protena protena, sino tambin permite evaluar interacciones protena - DNA, protena y RNA, protenas y ligandos, protenas y pptidos. Son muchas las aplicaciones que pueden ser estudiadas con esta metodologa. Otra posible aplicacin es el descubrimiento de nuevas drogas, al estudiar agentes que regulen la actividad de protenas biolgicamente importantes. (6) La desventaja que posee el mtodo es el gran nmero de falsos positivos que se pueden presentar por activacin de la transcripcin por la protena fusin cebo unida al dominio de unin al DNA sin existir interaccin alguna con el dominio de activacin , o al contrario por activacin de la transcripcin por dominio de activacin sin unirse al dominio de unin al DNA , o por presencia de protenas pegajosas o promiscuas que se unen a un gran nmero de protenas cebo , o por concentraciones elevadas de protenas entre otras. El mtodo, tambin puede ser susceptible de falsos negativos en las interacciones dbiles que no son reconocidas por el sistema; en protenas no expresadas establemente o mal plegadas en la clula hospedera; en protenas que no son localizadas en ncleo; y modificaines post trasduccionales no realizadas por maquinaria de la clula hospedera (13).

CONCLUSIONES El mtodo de two hybrid system es una herramienta valiosa que permite observar interaccin protena - protena in vivo pero es susceptible de muchos falsos positivos, sera recomendable utilizarlo pero confirmando la interaccin in vitro con mtodos como el de co- inmunoprecipitacin.

BIBLIOGRAFIA 1. Ito T., Chiba T., Ozawa R., Yoshida M., Hattori M., Sakaki Y. A comprehensible twohybrid analysis to explore the yeast protein interactome. PNAS 2001, 98: 45694574. 2. Fields S., Song O. A novel genetic system to detect protein protein interactions. Nature 1989, 340: 245-246. 3. Chien C.T., Bartel P. L., Sternglanz R., Fields S. The two hybrid system: A method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. PNAS 1991, 88:9578 9582.

4. Kabani M., BOisram A., Beckerich J. M., Gaillardin C. A highly representative two hybrid genomic library for yeast Yarrowia lipolytica. GENE 2000, 241:309-315. 5. Ito T., Tashiro K., Muta S., Ozawa R., Chiba T., Nishizawa M. Toward a protein protein interaction map of the budding yeast: A comprehensive system to examine. two hybrid interactions in all possible combinations between the yeast proteins. PNAS 2000, 97:1143 1147. 6. Tyagi S., Lal S. K. Combined transformation and genetic technique verification of protei-protein interactions in the yeast two hybrid system. Biochemical and Biophysical Research Communications 2000, 277: 589 - 593. 7. Serebriiskii I., Khazak V. Golemis E.A., A two hybrid dual bait system to discrimnate specificity of protein interactions. The Journal of Biochemistry 1999, 274: 17080 17087. 8. Vidalain P. O., Boxem M., Ge H., Li S., Vidal M. Increasing specificity in high throughput yeast two- hybrid experiments. METHODS 2004, 32: 363-370. 9. Gietz R. D., Raine B.T., Robbins A., Graham K. C., Woods R. A. Identification of proteins thet interact with a protein of interest: Applications of the yeast two hybrid system. Molecular and Cellular Biochemistry 1997, 172: 67 79. 10. Bendixen C., Gangloff S., Rothstein R. A yeast mating selectin scheme for detection of protein protein interactions. Nucleid Acids Research 1994, 22: 1778 1779. 11. West R. W., Yocum R. R., Ptashne M. Saccharomyces cerevisiae GAL1 GAL10 divergent promoter region: Location and function of the upstream activating sequence UASG. Molecular and Cellular Biology 1984 4: 2467 2678. 12. Graff J. W., Mitzel D. N., Weisend Carla M., Flenniken M.L., Hardy M.E. Journal of Virology 2002, 76: 9545 9550. 13. Chen G., Shin J. A., AhR/Arnt: XRE interaction: Turning false negatives into true positives in modified yeast one hybrid assay. Analytical Biochemistry 2008, 382: 101 106. 14. Naylor L.H. Reporter gene technology: The future looks bright. Biochemical Pharmacology 1999, 58: 749 757. 15. James P., Halladay J., Craig E. A. Genomic libraries and host strain designed for highly efficient two hybrid selection in yeast. Genetics 1996, 144: 1425 - 1436.