Investigacin Bibliogrfica Aplicaciones de la Cromatografa de Capa Fina

1. Ttulo de articulo Metabolitos secundarios en losextractos secos de Passiflora incarnata L., Matricaria recutita L.y Morinda citrifolia L. 2. Resumen (no mayor de 10 lneas) Para la determinacin de metabolitos secundarios en los extractos secos de Passiflora incarnata L., Matricaria recutita L. y Morinda citrifolia L, se emplea la tcnica cromatografa de capa fina con el objetivo de identificar sus principios activos utilizados en la elaboracin de productos farmacuticos para la cura de enfermedades. Los extractos se prepararon a partir de extractos fluidos con material vegetal seco utilizando como fase estacionaria silica gel y diferentes fases mviles y reveladores para obtencin positiva de diferentes metabolitos. Identificndose flavonoides en P. incarnata, compuestos antraquinnicos y terpenos en M. citrifolia, y cumarinas en M. recutita se, entre otros compuestos que coinciden con los reportados en la literatura para cada especie. 3. Identificacin de: a. Fase estacionaria Silica gel b. Fase mvil: Componentes Aceites esenciales terpenos Flavonoides y Fases mviles Tolueno: acetato de etilo (95:5) Tolueno: acetato de etilo:acetona:cido frmico (5:2:2:1); cloroformo:metanol:amoniaco concentrado (4:1:0.1); acetato de etilo:metanol:agua (10:1.5:1); acetato de etilo:cido actico:cido frmico:agua (10:1:1:2) Cloroformo:metanol:amoniaco concentrado (4:1:0.1); butanol:etanol:amoniaco concentrado:agua (7:2:2:3) n-propanol:acetato de etilo:agua:cido actico (4:3:2:1) n-propanol:acetato de etilo:agua:cido actico (4:3:2:1) Cloroformo:metanol:amoniaco concentrado(4:1:0.1) Acetato de etilo:metanol:agua (10:1.5:1) y n-

Glicsidosterpenoides Aminocidos y aminas Azcar y oligosacridos Alcaloides Compuestos antraquinnicos coumarinas

c. Tipo de cromatografa segn relaciones de polaridad (normal o reversa): Normal d. Tipo de elucin (en gradiente o isocratica): Elucin isocratica ya que se utilizan uno o varios solventes en adelante y su composicin es constante. e. Tcnica de deteccin o revelado: Componentes Aceites esenciales y terpenos Flavonoides Glicsidosterpenoides Aminocidos y aminas Azcar y oligosacridos Alcaloides Compuestos antraquinnicos y coumarinas Reveladores Anisaldehdo-cido sulfrico. Solucin de cido brico 10 % y solucin de cido oxlico 10 % (2:1) Anisaldehdo-cido sulfrico Ninhidrina -naphtol-cido sulfrico Dragendorff y solucin de cido sulfrico10 % Solucin etanlica de KOH 10 %; Solucin de cido brico 10 % y solucin de cido oxlico 10 % (2:1)

f. Tipo de analitos: Flavonoides, aminocidos, aminas, azcares y oligosacaridos en los 3 extractos secos estudiados. En el de M. citrifolia se observ adems la presencia de compuestos antraquinnicos y terpenos, mientras que en M. recutita se identific la presencia de cumarinas. g. Tipo de muestra: Extractos secos de Passiflora incarnata L. (pasiflora), Matricaria recutita L. (manzanilla) y Morinda citrifolia L. (noni). 4. Explicacin breve del orden de elucin de los analitos Depende la polaridad de los metabolitos. Los metabolitos ms apolares se desplazaran ms en la fase estacionaria (mayor distancia o recorrido) y metabolitos polares quedaran retenidos, se desplazarn menos en la fase estacionaria ya que el mtodo cromatografico utilizado es la capa

fina y esta solo se puede realizar en fase normal lo que indica que nuestra fase estacionaria va a ser polar.

5. Comentario acerca de la seleccin de condiciones de anlisis (fase estacionaria, fase mvil, flujo, gradiente de solventes, gradiente de temperatura, tipo de deteccin, etc.) Se utiliz como fase estacionaria silica gel y diferentes fases mviles para obtener la mxima separacin de cada metabolito analizado, el flujo se desplaza segn la diferencia de polaridad con la fase estacionaria, la elucin es isocratica ya que se utiliz una fase mvil para cada metabolito en diferentes placas, y la deteccin de los metabolitos se llev a cabo por medio de reveladores. 6. Copia del Artculo.

Revista Cubana de Plantas Medicinales

versin On-line ISSN 1028-4796

Rev Cubana Plant Med v.14 n.2 Ciudad de la Habana abr.-jun. 2009
ARTCULO ORIGINAL

Metabolitos secundarios en losextractos secos de Passiflora incarnata L., Matricaria recutita L.y Morinda citrifolia L.
Secondary metabolites in Passiflora incarnate L.,Matricaria recutita L. and Morinda citrifolia L. dry extracts
Caridad M. Garca PeaI; Nguyen Kim BichII; Nguyen Bich ThuIII; Juana Tillan CapoIV; Jacqueline Aylema Romero DazV; Orestes Daro LpezVI; Viviana Fuste MorenoVII I Mster en Tecnologa y Control de Medicamentos. Investigadora Agregada. Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ciudad de La Habana, Cuba. II Licenciada en Qumica. Investigadora. Instituto de Materia Mdica. Viet Nam. III Doctora en Ciencias. Investigadora. Instituto de Materia Mdica. Viet Nam. IV Doctora en Ciencias Veterinarias. Investigadora Auxiliar. CIDEM. Ciudad de La Habana, Cuba. V Licenciada en Bioqumica. Investigador Aspirante. CIDEM. Ciudad de La Habana, Cuba. VI Mster en Ingeniera de los Procesos Biotecnolgicos. Ingeniero Qumico. Investigador Agregado. CIDEM. Ciudad de La Habana, Cuba.

VII Tcnica en Tecnologa Farmacutica. CIDEM. Ciudad de La Habana, Cuba.

RESUMEN INTRODUCCIN: resulta de inters establecer una tecnologa propia para la elaboracin y el establecimiento de especificaciones de calidad en diversas formulaciones slidas de extractos secos de Passiflora incarnata L. (pasiflora), Matricaria recutita L. (manzanilla) y Morinda citrifolia L. (noni). OBJETIVOS: realizar los estudios fitoqumicos y analizar parmetros de control de calidad de los extractos secos de Passiflora incarnata L., Matricaria recutita L. y Morinda citrifolia L. MTODOS: para el estudio fitoqumico por cromatografa en capa delgada se emplearon tcnicas simples, rpidas, selectivas y con equipamiento mnimo para determinados compuestos. Para el anlisis de los parmetros de calidad, se aplicaron los ensayos descritos en la Norma Ramal del Ministerio de Salud Pblica (NRSP 309). RESULTADOS: se comprob la presencia de flavonoides, aminocidos, aminas, azcares y oligosacaridos en los 3 extractos secos estudiados. En el de M. citrifolia se observ adems la presencia de compuestos antraquinnicos y terpenos, mientras que en M. recutita se identific la presencia de coumarinas. CONCLUSIONES: los resultados obtenidos demostraron que los 3 extractos se encuentran dentro de los lmites establecidos para su empleo como principio activo de origen natural. Palabras clave: Passiflora incarnata, Matricaria recutita, Morinda citrifolia, flavonoides, aminocidos, aminas, azcares, oligosacridos.

ABSTRACT INTRODUCTION: it is interesting to develop our own technology to work out and to set quality specifications for different solid formulations of Passiflora incarnata L. ((passiflora), Maricaria recutita L. (chamomile) and Morinda citrifolia L. (noni) dry extracts. OBJECTIVES: toconduct phytochemical studies on and to examine the quality control parameters of Passiflora incarnata L. Maricaria recutita L. and Morinda citrifolia L. (noni) dry extracts. METHODS: for the phytochemical study based on thin layer chromatography, quick, simple and selective techniques were used, and minimal amount of equipment was employed for certain compounds. The analysis of the quality control parameters included the assays described in the Branch Standard of the Ministry of Public Health known as NRSP 309. RESULTS: flavonoids, aminoacids, amines, sugars and oligosaccharides were found in the three dry extractsunder study. Antraquninone compounds and terpens were observed in the M. citrifolia extract whereas coumarins were present in the M. recutita leaf extract.

CONCLUSIONS: the results proved that the three extracts are within the set limits for their use as natural active principle. Key words: Passiflora incarnata, Matricaria recutita, Morinda citrifolia, flavonoids, aminoacids, amines, sugars, oligosaccharides.

INTRODUCCIN
Passiflora incarnata L., conocida como pasiflora, es una planta que se le ha comprobado experimentalmente accin sedante sobre el sistema nervioso. Otras propiedades atribuidas son su efecto contra clicos, epilepsia, neuralgia, neurosis, etc.1 Entre los componentes de la planta se encuentra un glicsido ciangeno denominado cianocarcina, adems se le han encontrado alcaloides y flavonoides (responsables del efecto sedante). Se ha reportado tambin la presencia de cidos hidrocinico, ctrico, mlico, pantotnico y tnico.1-4 Matricaria recutita L. (manzanilla) se conoce por sus propiedades medicinales como: sedante, tnica, carminativa, antiespasmdica, antisptica, entre otras; posee un uso variado en la preparacin de licores y en la industria de cosmticos (talcos, cremas, champes, dentrficos contra la inflamacin de la boca, encas, entre otras).5 A Morinda citrifolia L. (noni) se le atribuyen efectos relacionados con actividad antibacteriana, antiviral, antifngica, antitumoral, antihelmntica, analgsica, antiinflamatoria, hipotensora e inmunoestimulante.6 Estudios realizados en Cuba, especficamente en el Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM), han demostrado que presenta actividad antiinflamatoria y analgsica. Los extractos secos de P. incarnata, M. recutita y M. citrifolia tienen mltiples utilidades en la industria farmacutica, en el desarrollo de nuevas formas farmacuticas, por su alta estabilidad del material de partida y su fcil transportacin. Teniendo en cuenta las propiedades demostradas por otros autores y la tendencia a desarrollar la Medicina Natural Tradicional en Cuba, se realizaron los estudios fitoqumicos y el anlisis de los parmetros de control de la calidad a 3 extractos secos de especies diferentes, con el objetivo de conocer sus componentes (principios activos) y de este modo contar con un basamento cientfico para su empleo en la cura de diversas enfermedades en la atencin primaria de salud, con vistas a su futura obtencin para la elaboracin de productos farmacuticos.

MTODOS
En el presente trabajo se utilizaron extractos de Passiflora incarnata L., Matricaria recutita L. y Morinda citrifolia L., estos extractos se prepararon a partir de extractos fluidos y todos se hicieron con material vegetal seco. A continuacin se relacionan el nmero de herbario para

cada una de las plantas empleadas, as como la parte utilizada y el menstruo de extraccin (tabla 1). Las muestras empleadas en la realizacin del trabajo fueron preparadas de la manera siguiente: se pesaron 0,1 g de cada uno de los extractos secos objetos de estudio y se disolvieron en 20 mL de metanol, despus fueron concentradas mediante un bao de agua por 30 min y evaporados hasta obtener 2 mL, una vez concentradas se aplicaron en cada una de las placas cromatogrficas 10 L de cada muestra. En la tabla 2 se relacionan las fases mviles y los reveladores empleados en el estudio fitoqumico, por cromatografa en capa delgada, realizados a cada uno de los extractos evaluados, con el objetivo de identificar componentes activos Tabla 2. Condiciones empleadas para el estudio fitoqumico Componentes Aceites esenciales y terpenos Flavonoides Fases mviles Tolueno:acetato de etilo (95:5) Tolueno:acetato de etilo:acetona:cido frmico (5:2:2:1); cloroformo:metanol:amoniaco concentrado (4:1:0.1); acetato de etilo:metanol:agua (10:1.5:1); acetato de etilo:cido actico:cido frmico:agua (10:1:1:2) Cloroformo:metanol:amoniaco concentrado (4:1:0.1); nbutanol:etanol:amoniaco concentrado:agua (7:2:2:3) n-propanol:acetato de etilo:agua:cido actico (4:3:2:1) n-propanol:acetato de etilo:agua:cido actico (4:3:2:1) Cloroformo:metanol:amoniaco concentrado(4:1:0.1) Reveladores Anisaldehdocido sulfrico. Solucin de cido brico 10 % y solucin de cido oxlico 10 % (2:1)

Glicsidosterpenoides

Anisaldehdocido sulfrico

Aminocidos y aminas Azcar y oligosacridos Alcaloides

Ninhidrina -naphtol-cido sulfrico Dragendorff y solucin de cido sulfrico10 % Solucin etanlica de KOH 10 %; Solucin de cido brico 10 % y solucin de cido oxlico 10 % (2:1)

Compuestos antraquinnicos y coumarinas

Acetato de etilo:metanol:agua (10:1.5:1)

Las muestras de extractos secos fueron sometidas a un anlisis farmacognstico descrito en la norma ramal de salud pblica (NRSP) 309 del Ministerio de Salud Pblica (MINSAP).Se le realizaron los ensayos siguientes: Determinacin de humedad residual. Determinacin de cenizas totales y cenizas cidas insolubles. Para llevar a cabo estos ensayos se emple una balanza analtica digital Sartorius MC 1, AC 210s, estufa HS 62 A y mufla Phoenix Gurnaces Tipo MRB 3-01.

RESULTADOS
En la tabla 3 se pueden apreciar los compuestos presentes en los extractos secos de P. incarnata, M. recutita y M. citrifolia.

En la tabla 4 se reportan los resultados de los parmetros de calidad para cada uno de los extractos secos estudiados.

DISCUSIN
Se obtuvieron respuestas positivas para una gran diversidad de grupos funcionales de compuestos; se comprob la presencia de flavonoides, aminocidos, aminas, azcares y oligosacridos en los 3 extractos secos estudiados. Estos resultados se encuentran en correspondencia con lo reportado para esta especie,4 donde se identifica y cuantifica el contenido de flavonoides totales en P. incarnata. En el de M. citrifolia se observ adems la presencia de compuestos antraquinnicos y terpenos, mientras que en M. recutita se identifica la presencia de coumarinas; estos resultados coinciden con los reportados en la literatura para cada una de estas especies. Los porcentajes de humedad obtenidos fueron inferiores al lmite considerado como adecuado por las farmacopeas10 para evitar el crecimiento microbiano (< 14 %), los resultados de las cenizas totales fueron inferiores a 5 %, mientras que las cenizas insolubles en medio cido se encuentran dentro de los lmites establecidos (< 5 %), al nivel nacional, por el Centro para el Control Estatal de los Medicamentos (CECMED), para el registro de productos de origen natural, en la Regulacin 28/02 - Requisitos para las solicitudes de inscripcin, renovacin y modificacin en el registro de medicamentos de origen natural de uso humano. En el presente trabajo se demostr que los 3 extractos secos de M. citrifolia, M. recutita, P. incarnata tienen en su composicin flavonoides, aminocidos, aminas, azcares y oligosacridos, mientras que los extractos de M. citrifolia y de M. recutita poseen adems compuestos antraquinnicos, terpenos y coumarinas, respectivamente. Adems, los resultados obtenidos del anlisis de 3 parmetros evaluados a varios lotes de los extractos secos, demostraron que los 3 se encuentran dentro de los lmites establecidos para su empleo como principio activo de origen natural.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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6. Wang MY, West BJ, Jensen CJ, Nowicki D, Su C, Palu AK, et al. Morinda citrifolia (Noni): a literature review and recent advances in noni research. Acta Pharmacol Sin. 2002;23(12):1127-41. 7. Carretero ME. Compuestos Fenlicos: quinonas. Panorama Actual Med. 2000; 24(236):778-82. 8. Cuba. Ministerio de Salud Pblica. NRSP 311. Medicamentos de origen vegetal: extractos fluidos y tinturas. Procesos Tecnolgicos. La Habana: MINSAP; 1992. 9. OMS. Mtodos de control de calidad de plantas medicinales. Ginebra: OMS; 1984. p. 88 (International Organization for Standarization, ISO 6571. Species, condiments and herbs. Determination of volatile oil content). 10. Farmacopea de los Estados Unidos USP 30. The United States Pharmacopeial Convention. NF- 25. 30 ed. Rockville: Mack Printing; 2007. p. 3. Recibido: 26 de octubre de 2008. Aprobado: 5 de abril de 2009. M. C. Caridad M. Garca Pea. Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 # 1605 e/. Boyeros y Puentes Grandes. CP. 10600. Ciudad de La Habana, Cuba. Telf.: 8810818/8810830 Fax: (537) 335556. Correo electrnico: caridadgp@infomed.sld.cu; caridad@cidem.sld.cu

2011 1999, Editorial Ciencias Mdicas Calle 23 # 177 entre N y O - Edificio Soto, Piso 2 Vedado, Ciudad de La Habana, CP 10400 Cuba ecimed@infomed.sld.cu

1. Ttulo: DESARROLLO DE UN METODO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA INSTRUMENTAL PARA ANALISIS CUANTITATIVO DE ACIDO ACETILSALICILICO 2. Resumen: Se desarroll y valid un mtodo por cromatografa en capa fina instrumental (HPTLC) para cuantificar cido acetilsaliclico. La validacin del mtodo indic que ste es lineal entre 100 y 600 ng/mancha, con un coeficiente de regresin de 0,996. Present buena repetitividad y reproducibilidad (desviacin estndar relativa entre 2,1 y 3,5% y entre 4,8 y 6,0%, respectivamente) y una exactitud promedio de 99%. Adems, se demostr ser selectivo para el principio activo ensayado, lo que lo hace adecuado para su anlisis cuantitativo. 3. Identificacin: a. Fase estacionaria: Silica gel F254 b. Fase Mvil: acetato de etilo + metanol + cido actico glacial (80+19+1, v/v)9), y ciclohexano +cloroformo + cido actico glacial. c. Tipo de Cromatografa: Fase Normal d. Tipo de Elucin: Isocratica. e. Tipo de deteccin o revelado: Las lecturas se realizaron por densitometra. Para esto se utiliz un espectrodensitmetro Scanner Camag III acoplado a un computador con software CATS versin 4,05, y como fuente de radiacin una lmpara de deuterio. f. Tipo de analito: Las soluciones de cido acetilsaliclico se prepararon en acetonitrilo/cido frmico g. Muestra: cido Acetilsaliclico: La siembra de las muestras se realiz en bandas de 3 mm mediante el uso de un aplicador semiautomtico Linomat IV. 4. Factores de referencia de los analitos: Los Rf fueron de 0,8 y de 0,15, respectivamente. La longitud de desarrollo fue de 5 cm, en un tiempo aproximado de 10 minutos para la primera y de 2 cm, en un tiempo aproximado de 17 minutos para la segunda fase mvil. Se eligi la segunda, ya que sta permite visualizar mejor las manchas, las cuales quedan ms separadas del frente de solvente. Se utilizaron cmaras de desarrollo vertical. 5. Comentario acerca de la seleccin de condiciones.

Las fases mviles fueron desarrolladas conforme a la mayor polaridad de sus analitos, siendo una mezcla de tres compuestos, los ms utilizados fueron, acetato de etilo, metanol, y cido actico glacial. La fase estacionaria fue la silica gel F254, que es la ms recomendada para muchos anlisis de este tipo, los gradientes de solventes fueron seleccionados fueron del ciclohexano, cloroformo, y cido actico glacial ya que permiti visualizar mejor las manchas. Para la deteccin se realizaron a cabo por lecturas realizadas por densitometra. Para esto se utiliz un espectrmetro Scanner Camag 3 acoplado a un computador con software Cats Versin y como fuente de radiacin una lmpara de Deuterio. DESARROLLO DE UN FINA INSTRUMENTAL ACETILSALICILICO.
1

METODO POR PARA ANALISIS

CROMATOGRAFIA CUANTITATIVO

EN DE

CAPA ACIDO

Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepcin, Casilla 237, Concepcin, Chile. 2 Departamento de Bromatologa, Nutricin y Diettica, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepcin, Casilla 237, Concepcin, Chile. (Recibido: Octubre 14, 2000 - Aceptado: Agosto 14, 2000) RESUMEN Se desarroll y valid un mtodo por cromatografa en capa fina instrumental (HPTLC) para cuantificar cido acetilsaliclico. La validacin del mtodo indic que ste es lineal entre 100 y 600 ng/mancha, con un coeficiente de regresin de 0,996. Present buena repetitividad y reproducibilidad (desviacin estndar relativa entre 2,1 y 3,5% y entre 4,8 y 6,0%, respectivamente) y una exactitud promedio de 99%. Adems, demostr ser selectivo para el principio activo ensayado, lo que lo hace adecuado para su anlisis cuantitativo. Palabras claves: HPTLC (cromatografa en capa fina instrumental), anlisis cuantitativo, cido acetilsaliclico, validacin, medicamentos. ABSTRACT A High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) method was developed and validated to determine quantitatively acetylsalicylic acid. The results proved that the method is linear between 100 and 600 ng/spot, with repeatability (RSD = 2,1-3,5%), reproducible (RSD = 4,8-6,0%), accurate (99%) and selective for tested substance. In conclusion, it is an adequate method for its quantitative analyses. Keywords: HPTLC (High performance thin layer chromatography), quantitative analysis, acetylsalicylic acid, validation, drugs.

INTRODUCCION El cido acetilsaliclico es el analgsico-antiinflamatorio-antipirtico ms usado en todo el mundo. Se estima que la cantidad de este frmaco consumida solo en los Estados Unidos es del orden de las 200.000 toneladas al ao.1) Producto de su estructura qumica es estable en aire seco, pero en contacto con la humedad se hidroliza lentamente 1,2,3,4), degradacin que depende principalmente de la presin de vapor de agua y de la temperatura (factores medioambientales).4) Por esto es importante cuantificar el cido acetilsaliclico presente en sus especialidades farmacuticas, como modo de asegurar una terapia adecuada.5,6) La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) es el mtodo de eleccin para la mayora de los protocolos de anlisis de medicamentos.7) Sin embargo, ya que se requiere analizar un gran nmero de especialidades farmacuticas del principio activo, y, por ende numerosas muestras, sin que ello demande un tiempo considerable y un alto costo, es que en el presente trabajo se valida y propone un mtodo analtico por HPTLC para cuantificar cido acetilsaliclico. Esta tcnica posee importantes ventajas sobre otros mtodos cromatogrficos, pues no requiere de purificaciones exhaustivas, utiliza cantidades mnimas de solventes, es una metdica rpida y, adems, por ser un sistema abierto, permite analizar distintas muestras y diferentes analitos en forma simultnea, lo que se traduce en economa de tiempo, materiales y reactivos. 8) PARTE EXPERIMENTAL MATERIALES Y REACTIVOS: Para el estudio se utiliz cido acetilsaliclico estndar USP. Todos los reactivos fueron de calidad proanlisis. Las soluciones de cido acetilsaliclico se prepararon en acetonitrilo/cido frmico (99:1) como solvente. 2 ) CROMATOGRAFIA: La cromatografa se realiz en placas HPTLC de slica gel F254, previamente lavadas con metanol y activadas a 130C por 30 minutos. La siembra de las muestras se realiz en bandas de 3 mm mediante el uso de un aplicador semiautomtico Linomat IV. Se prob como fase mvil acetato de etilo + metanol + cido actico glacial (80+19+1, v/v)9), y ciclohexano +cloroformo + cido actico glacial (60+5+5, v/v)10). Los Rf fueron de 0,8 y de 0,15, respectivamente. La longitud de desarrollo fue de 5 cm, en un tiempo aproximado de 10 minutos para la primera y de 2 cm, en un tiempo aproximado de 17 minutos para la segunda fase mvil. Se eligi la

segunda, ya que sta permite visualizar mejor las manchas, las cuales quedan ms separadas del frente de solvente. Se utilizaron cmaras de desarrollo verticales. Las lecturas se realizaron por densitometra. Para esto se utiliz un espectrodensitmetro Scanner Camag III acoplado a un computador con software CATS versin 4,05, y como fuente de radiacin una lmpara de deuterio. ESPECTROGRAMA DE ABSORCION: La longitud de onda de mxima absorcin (231 nm) se determin realizando un espectrograma in situ del compuesto cromatografiado. VALIDACION DEL METODO: Los parmetros analticos que se validaron fueron linealidad, lmites de deteccin y de cuantificacin, precisin, exactitud, selectividad y robustez. La validacin se llev a cabo segn normas internacionales 2,11,12) y utilizando estimadores estadsticos apropiados (desviacin estndar relativa, t de student, anlisis de varianza).11,13) LINEALIDAD: Para establecer el rango de linealidad del mtodo se elabor una curva de calibracin mediante la aplicacin de concentraciones del estndar entre 100 y 600 ng por mancha. Las siembras se hicieron en triplicado. LIMITES DE DETECCION Y DE CUANTIFICACION: Para su obtencin se trabaj con concentraciones de analito que estuviesen en la parte inferior del rango lineal de la curva de calibracin. Para esto se prepararon soluciones de concentraciones de 50, 75 y 100 ng/uL, cada una de las cuales se sembr tres veces (1 uL cada vez). PRECISION: Para este estudio se utilizaron soluciones de cido acetilsaliclico de 100, 300 y 500 ng/uL. Estas cubren el rango lineal determinado (siembra: 1uL). Para evaluar la repetitividad del mtodo se prepararon cinco soluciones de cada concentracin, cada una de las cuales se sembr tres veces. Para evaluar la reproducibilidad se trabaj con una solucin de cada concentracin, cada una de las cuales se sembr tres veces y durante cinco das. EXACTITUD:

Se evalu utilizando comprimidos comerciales de cido acetilsaliclico. Se prepararon seis soluciones, de las cuales a tres se les hizo recarga basal con cido acetilsaliclico estndar, para calcular el porcentaje de recuperacin. SELECTIVIDAD: Para evaluar la selectividad del mtodo se prepar una solucin de cido acetilsaliclico ms cido saliclico. Se utiliz el cido saliclico por tratarse del principal producto de degradacin del cido acetilsaliclico. La solucin se prepar a una concentracin de 300 ng/uL de cido acetilsaliclico y 150 ng/uL de cido saliclico. Se sembr cinco veces, obtenindose un Rf de 0,22 para el cido acetilsaliclico y de 0,27 para el cido saliclico. Las concentraciones obtenidas fueron de 304,3 ng/uL para el cido acetilsaliclico y de 149,6 ng/uL para el cido saliclico.

ROBUSTEZ: La robustez del mtodo se evalu cambiando la proporcin de los componentes de la solucin para diluir muestras, y la proporcin de los solventes de la fase mvil. Se trabaj con soluciones de 100, 300 y 500 ng/uL. Como se mencion, la solucin para diluir las muestras fue de acetonitrilo/cido frmico (99:1, v/v). Se estudi el efecto que tena en los resultados el cambio de esta proporcin a 90:10, v/v. La proporcin de los solventes de la fase mvil se cambi de 60:5:5 a 50:10:10, v/v. RESULTADOS Y DISCUSION El mtodo result lineal entre 100 y 600 ng/mancha, con un coeficiente de regresin de 0,996 y un p de 0,0001. (Fig. 1.)

Para la determinacin de los lmites de deteccin y cuantificacin se grafic la cantidad de analito por mancha versus respuesta (rea del pico) promedio y se determin la ecuacin de esta recta, obteniendo de ella una estimacin de la respuesta del blanco: ybl11) (Fig. 2).

El valor de ybl corresponde al intercepto de la curva, y result ser de 6,48. El coeficiente de regresin fue de 0.999. Posteriormente se obtuvo una segunda curva, graficando cantidad de analito por mancha versus desviacin estndar de las respuestas. De la ecuacin de esta recta se obtuvo una estimacin de la desviacin estndar del blanco: sbl.11) que corresponde al intercepto de esta curva, que result ser de 5,92. Los lmites de deteccin y de cuantificacin se calcularon mediante las ecuaciones: 11)lmite de deteccin = (ybl + 3sbl)/b; lmite de cuantificacin = ( ybl + 10sbl)/b donde "b" es la pendiente de la curva de calibracin obtenida en el estudio de linealidad. El lmite de deteccin resultante fue de 3 ng/mancha, y el de cuantificacin de 9 ng/mancha. Los resultados del estudio de precisin fueron una desviacin estndar relativa entre 2,1% y 3,5% (n=5) para la repetitividad, y entre 4,8% y 6,0% (n=10) para la reproducibilidad. El porcentaje promedio de recuperacin fue de 99%, con una desviacin estndar de 5,01 y una desviacin estndar relativa de 5,06% (n=15). El intervalo de confianza del 95% fue de 96,271- 101,823. El test de student permiti concluir que no existen diferencias significativas entre recuperacin media y 100 (tobservado= 0,76; ttabulado (grados de libertad=14, alfa = 0,05) = 1,76). El mtodo permite la separacin del cido acetilsaliclico y del cido saliclico con una resolucin de 1,5, lo cual indica que bajo las condiciones establecidas, es selectivo para el principio activo estudiado. (Fig.3). Para estudiar la influencia del cambio de los parmetros considerados en la robustez del mtodo se realiz anlisis de varianza de los resultados obtenidos, mediante el diseo de experimento factorial.13) El cambio de proporcin de los componentes de la solucin para diluir muestras dio un Fc = 1,03 y un Ftab. = 9,33 (alfa =0.01), lo que permiti concluir que no existen diferencias significativas en los resultados al usar una u otra proporcin. Por tanto, ante esta variacin de condiciones, el mtodo es robusto (Fc: valor F calculado; Ftab : valor F tabulado. Distribucin F).

Sin embargo, el cambio de proporcin de los solventes de la fase mvil arroj diferencias significativas entre los resultados, al emplear una proporcin u otra (Fc = 37,89; y Ftab = 9,33) (alfa = 0,01). Esto indica que se debe ser muy riguroso en las medidas de los volmenes de los solventes de la fase mvil, de modo de garantizar ptimos resultados.

CONCLUSIONES El mtodo validado present una buena linealidad entre las concentraciones empleadas en el estudio, como as mismo result preciso, exacto y selectivo para el principio activo ensayado. Estos resultados permiten postular que es una buena alternativa al mtodo oficial (USP) por HPLC para anlisis cuantitativo de cido acetilsaliclico. http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0366-16442000000400015&script=sci_arttext