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Arrt du 21 dcembre 1979

relatif aux critres microbiologiques auxquels doivent satisfaire certaines denres animales ou d'origine animale (mod. par ) (JONC du 19 janvier 1980) Le ministre de l'agriculture et le ministre des transports, Vu le dcret no 71-636 du 21 juillet 1971, pris pour l'application des articles 258, 259 et 262 du code rural et relatif l'inspection sanitaire et qualitative des animaux vivants et des denres animales ou d'origine animale, et notamment son article 3 ainsi conu : Des arrts du ministre de l'agriculture et, lorsqu'il s'agit de produits de la mer, des arrts conjoints du ministre de l'agriculture et du ministre charg des pches maritimes fixeront les normes sanitaires et qualitatives auxquelles devront satisfaire les animaux, les denres animales et les denres d'origine animale, pour tre reconnus propres la consommation ; Vu l'arrt du 15 mai 1974 concernant les viandes haches destines la consommation humaine ; Vu l'arrt du 26 juin 1974 rglementant les conditions d'hygine relatives la prparation, la conservation, la distribution et la vente des plats cuisins l'avance ; Vu l'arrt du 8 juillet 1977 sur les ovoproduits destins la consommation humaine, Arrtent : Art. 1 - Pour tre reconnues propres la consommation, les denres animales ou d'origine animale, ci-aprs numres, doivent satisfaire aux critres microbiologiques fixs au prsent arrt et vrifis selon les dispositions dcrites en annexe. En outre, elles doivent tre exemptes de micro-organismes ou toxines dangereuses pour la sant publique : - viandes de boucherie ; - viandes haches l'avance, viandes cuites, produits de charcuterie, quenelles, plats cuisins l'avance, potages dshydrats ; - viandes de volaille ; - produits de la pche ; - ovoproduits, ptisseries, crmes ptissires ; - laits ferments (yaourts, kfir,...), laits glifis, fromages frais pasteuriss, crmes fraches pasteurises, glaces et crmes glaces, casines et casinates ; - conserves base de denres animales ou d'origine animale ; - semi-conserves base de denres animales ou d'origine animale ; - graisses animales ; - (Arr. 17 sept. 1984) lait de producteur destin un traitement thermique ou la transformation ; - (Arr. 23 mars 1993, art. 1er) camemberts fabriqus partir de lait cru l'exception de ceux bnficiant d'une appellation d'origine . Art. 2 - Au sens de l'article 1er, les critres microbiologiques relatifs aux viandes de boucherie sont les suivants : Dsignation MicroCaliformes Staphylococcus Anarobies Salmonella organismes fcaux (par aureus (par sulfitodans 25 arobies 30 gramme) gramme) rducteurs 46 grammes C (par C (par gramme) gramme) Carcasses ou (3) 5.102 2 Absence coupes de demi-gros, rfrigres ou congeles (1) .....

Pices (3) 5.104 102 2 Absence conditionnes sous vide ou non, rfrigres ou congeles (1) ..... Portions 3.102 102 10 Absence unitaires conditionnes rfrigres ou congeles et portions unitaires du commerce de dtail rfrigres ou congeles (2) (1) Le prlvement est effectu en profondeur, aprs cautrisation de la surface. (2) Le prlvement concerne profondeur plus surface sans cautrisation. (3) Seules les tolrances de caractre analytique sont acceptes (plan deux classes). Art. 3 - (Arr. 29 fvr. 1996, art. 40) Les critres microbiologiques relatifs aux viandes cuites, aux produits de charcuterie, aux plats cuisins et aux potages dshydrats sont les suivants : Dsignation MicroColiformes Coliformes Staphylococcus Anarobies Salmonella organismes 30 C (par fcaux (par aureus (par sulfitodans 25 arobies 30 gramme) gramme) gramme) rducteurs grammes C (par 46 C (par gramme) gramme) Plats (2) 3.105 103 10 102 30 Absence cuisins l'avance, escargots prpars, pices de viandes cuites tranches ou non ..... Produits de charcuterie crus, hachs : Soumis 102 5.102 50 Absence dessiccation et consommer en l'tat ..... Produits de (3) 103 5.102 50 Absence

salaison crus sals et/ou schs, tranchs ou non ..... Produits de (2) (3) 103 10 102 30 Absence charcuterie 3.105 cuits, tranchs ou non, quenelles ..... Jambon cuit 104 10 Absence Absence Absence Absence entier ..... Potages 3.105 103 10 102 30 Absence dshydrats ..... (1) Tolrance prvue en annexe comprise. (2) Pour les ptes farcies du type ravioli, cannelloni, lasagne, les quenelles et les plats cuisins auxquels est incorpor du fromage, ce critre doit tre interprt. (3) Pour les produits de charcuterie conditionns sous pellicule plastique et sous vide, le critre relatif aux micro-organismes arobies 30C (3.105) par gramme ne s'applique qu'au stade de la fabrication (usine). Art. 4 - Les critres microbiologiques relatifs aux viandes de volaille sont les suivants : Dsignation MicroColiformes Staphylococcus Anarobies Salmonella organismes fcaux (par aureus (par sulfitoarobies 30 gramme) gramme) rducteurs 46 C (par C (par gramme) gramme) Volailles Absence dans entires 25 grammes rfrigres, de muscles congeles ou pectoraux surgeles ..... Rtis, 5.105 103 5.102 30 Absence dans escalopes et 1 gramme (1) paupiettes crus, pans ou non ..... Rtis cuits, 3.105 10 102 10 Absence dans entiers ou 25 grammes tranchs et paupiettes cuites ou prcuites ..... Viande crue 106 5.103 103 102 Absence dans spare 1 gramme (1) mcaniquement 3

..... Viande cuite 3.105 10 102 30 Absence dans spare 25 grammes mcaniquement ..... (Arr. 5 mars 104 50 10 1 Absence dans 1985, 25 grammes art.1)Viande crue spare mcaniquement traite par rayonnements ionisants (3) ..... (1) Critre provisoire. (3) (Arr. 5 mars 1985, art. 2) Seules les viandes crues spares mcaniquement rpondant aux critres microbiologiques les rendant propres la consommation, l'exception de ceux visant les salmonelles, pourront tre traites par rayonnements ionisants conformment aux dispositions rglementaires en vigueur. Art. 5 - Les critres microbiologiques relatifs aux produits de la pche ci-dessous mentionns sont les suivants (1) : Dsignation MicroColiformes Streptocoques Staphylococcus Anarobies Salmonella organismes fcaux fcaux (par aureus (par sulfitoarobies (par gramme) gramme) rducteurs 30 C (par gramme) 46 C (par gramme) gramme) Crustacs 105 1 2 Absence entiers cuits dans 25 rfrigrs grammes autres que crevettes ..... Tous 103 1 2 Absence crustacs, dans 25 compris grammes crevettes entires cuites ou crues, congels ou surgels ..... Crevettes 105 10 102 10 Absence cuites dans 25 dcortiques grammes rfrigres et dcortiques congeles ou surgeles .....

(Arr. 2 juin 1988, art. 1)Escargots dcoquills surgels ou congels ..... (Arr. 13 mars 1989, art. 1)Cuisses de grenouilles fraches, congeles ou surgeles (6) ..... Poissons tranchs, pans ou non, filets de poisson frais rfrigrs ... (Arr. 13 mars 1989, art. 1)Poissons tranchs, pans ou non, filets de poisson congels ou surgels ..... Prparations base de chair de poisson, haches, crues ..... Coquilles SaintJacques et moules prcuites .....

103 (2)

Absence dans 1 gramme (3)

5.105

102

102 (2)

Absence dans 25 grammes

105

10

102 (2)

10

Absence dans 25 grammes

5.104

102

Absence dans 25 grammes

5.105

10

102

Absence dans 25 grammes

106

10

102

30

Absence dans 25 grammes

(1) Cette recherche est effectue en cas de suspicion particulire, selon les commmoratifs, dans 100 ml de mlange chair-liquide intervalvaire . (2) Seules les tolrances d'origine analytique sont acceptes (plan deux classes). (3) Critre provisoire. (5) Seules les cuisses de grenouilles rpondant aux critres mentionns, l'exception de ceux visant les Salmonella, peuvent tre destines au traitement par rayonnements ionisants (art. 2 de l'arrt du 2 juin 1988). (6) Ces critres s'appliquent aussi aux cuisses de grenouilles congeles ou surgeles traites par rayonnements ionisants. Art. 6 - Les critres microbiologiques relatifs aux ovoproduits, ptisseries et crmes ptissires sont les suivants : Dsignation MicroColiformes Coliformes Staphylococcus Anarobies Salmonella organismes 30 C (par fcaux (par aureus (par sulfitodans 25 arobies 30 gramme) gramme) gramme) rducteurs grammes C (par 46 C (par gramme) gramme) Ptisseries, 3.105 103 1 102 10 Absence crmes ptissires Microorganismes arobies 30 C (par gramme) 104 Entrobactries Staphylococcus Salmonella par gramme ou aureus par dans 25 par ml gramme ou par grammes ml ou 25 ml 10 Absence Absence

(Arr. du 11 mars 1998, art. 1) Ovoproduits traits thermiquement

Art. 7 - (Arr. 20 dc. 2000, art. 1er) Les produits viss au prsent article doivent tre exempts de micro-organismes ou toxines des niveaux dangereux pour la sant publique. En outre, les critres microbiologiques et biochimiques applicables aux laits de consommation ou aux produits laitiers non revtus d'une estampille de salubrit communautaire, d'une part, et, d'autre part, aux laits de consommation ou aux produits laitiers revtus d'une marque de salubrit communautaire jusqu' leur date limite de consommation (DLC) sont les suivants : Dsignation Microarobies (par Coliformes 30 oC (par Coliformes fcaux organismes 30 % gramme) gramme) Lait 30 000 pasteuris conditionn jusqu' J + 4. 10 Absence 10 dans 1 ml Absence Ngative dans 250 ml

Art. 8 - Les conserves base de denres animales ou d'origine animale, quelle que soit la nature de leur emballage, doivent satisfaire des preuves permettant de vrifier leur stabilit.

Ne doivent pas tre soumis ce contrle les botes mtalliques ou les bocaux en verre couvercles dformables prsentant des dfauts majeurs tels que bombement, flocage, fuitage. Il en va de mme pour les conserves prsentes en emballage en matire plastique ou complexes mtalloplastiques qui prsenteraient une modification apparente de l'emballage. Les preuves comportent les oprations suivantes : - tuvage d'individus 37 C ( 1 C) durant sept jours et 35 C ( 1 C) durant dix jours ; - tuvage d'individus 55 C ( 2 C) durant sept jours. A l'issue de ces preuves aucun bombement ou fuitage ne doit tre constat. Une apprciation de la variation du pH entre les units tuves et des units non tuves tmoins, laisses la temprature du laboratoire pendant les dures prcites, cette temprature devant tre cependant infrieure 25 C. La variation de pH ne doit pas dpasser 0,5 unit. Une apprciation de la variation de la flore microbienne entre units tuves et non tuves. Soit n le nombre de micro-organismes dnombrs sur 20 champs microscopiques observs sur une bote incube, et no le nombre de micro-organismes dnombrs sur une bote non incube, le rapport doit tre infrieur 100. Nota. - 1. Ce rapport apparemment lev n'a pas pour but de tolrer une multiplication mme modre des micro-organismes. Il n'est tabli cette valeur qu'en raison de l'inconstance de la reproductibilit de l'examen bactrioscopique. 2. En cas de doute, et notamment lors du contrle de certains produits de la pche, un examen bactriologique conduit avec toute la rigueur technique requise est effectu. 3. En cas de litige, il peut tre fait application des normes Afnor V 08-401 et V 08-402 relatives au contrle de la stabilit des conserves. Art. 9 - Les critres microbiologiques relatifs aux semi-conserves base de denres animales ou d'origine animale sont les suivants : Art. 10 - Les critres microbiologiques relatifs aux graisses animales sont les suivants : Art. 11 - Les critres du prsent arrt, vrifis selon les dispositions dcrites en annexe, sont ceux des laboratoires officiels et des laboratoires choisis par les responsables d'entreprise lorsque les conditions d'hygine dans lesquelles sont ralises les oprations de rception, de transformation, de conditionnement, d'entreposage et de transport des denres numres aux articles prcdents font l'objet de contrles obligatoires. Annexe I Observations Les valeurs indiques dans les tableaux du prsent arrt correspondent aux niveaux de contamination microbienne qu'il est habituel d'attendre de produits fabriqus, transports et distribus dans des conditions de bonnes pratiques professionnelles en matire d'hygine. Malgr les diverses contraintes lies en particulier la disparit des fabrications dans notre pays, il a t tenu le plus grand compte possible, dans la prsente annexe, de l'esprit des travaux mens actuellement au sein des instances internationales dans les domaines de l'chantillonnage et de l'interprtation des rsultats, notamment quant aux modalits d'interprtation des rsultats d'analyses microbiologiques, dans le but d'viter que des conclusions non justifies ne soient tires des rsultats obtenus. 1 - chantillon pour laboratoire et technique de prise d'essai 1.1 - chantillon pour laboratoire La taille de l'chantillon pour laboratoire d'un produit de mme nature doit tre comprise comme suit : - portions unitaires de viande et denres vises aux articles 2 et suivants, tant au niveau de la fabrication que des points de vente : si possible, au moins cinq units ;

- conserves : cinq units ; - coquillages : nombre suffisant pour obtenir au laboratoire cinq fois au moins 25 grammes de chair et de liquide intervalvaire. Nota . - 1. Le laboratoire doit disposer, pour conduire les analyses compltes, d'environ 500 grammes de produits, soit cinq fois 100 grammes. Ces 100 grammes peuvent tre fournis par une ou plusieurs pices. 2. Cas particulier. - Lorsqu'il s'agit d'une production artisanale pour laquelle le prlvement de cinq chantillons peut s'avrer trop important au regard de la quantit fabrique, il pourra tre procd un talement dans le temps de la prise de ces chantillons. Toutefois, dans l'ventualit o les premiers rsultats se rvleraient d'emble non satisfaisants, il serait procd au prlvement simultan de cinq chantillons. 1.2 - Technique de prise d'essai La prise d'essai destine la prparation de la suspension mre et des dilutions dcimales porte : - sur les parties superficielles et profondes, notamment pour les produits en tranches, hachs, diviss, pour les plats cuisins l'avance... ; - sur la partie profonde du produit pour les viandes (pices), les produits de charcuterie (pices) et les poissons entiers, aprs cautrisation de la surface ; - pour les produits laitiers et selon la nature des produits, elle porte sur le produit homognis ou sur les parties superficielles et profondes. Dans le cas d'examens microbiologiques, la suite de toxi-infections alimentaires, il est ncessaire de pratiquer la recherche des germes pathognes, toxicognes et/ou de leurs toxines, aussi bien en surface qu'en profondeur. 2 - Interprtation des rsultats Remarque . - Il convient de retenir que la valeur des mthodes de dnombrement microbien n'est pas absolue, quelle que soit la nature des milieux de culture utiliss. Il est gnralement admis que la variabilit peut atteindre 1/2 log. avec les milieux solides et 1 log. avec les milieux liquides. 2.1 - Plan trois classes Principe : Ce plan est ainsi dsign parce que les rsultats des examens interprts sur cette base permettent de fixer trois classes de contamination : - celle infrieure ou gale au critre m ; - celle comprise entre le critre m et le seuil M ; - celle suprieure au seuil M. m Critre fix au prsent arrt. Tous les rsultats gaux ou infrieurs sont considrs satisfaisants. M Seuil limite d'acceptabilit, au-del duquel les rsultats ne sont plus considrs comme satisfaisants, sans que pour autant le produit soit considr comme toxique. Les valeurs de M sont fixes : M = 10 m lors du dnombrement effectu en milieu solide ; M = 30 m lors du dnombrement effectu en milieu liquide. n Nombre d'units composant l'chantillon. c Nombre d'units de l'chantillon donnant des valeurs situes entre m et M. Application pratique (tenant compte de variations lies la technique microbiologique, remarque supra ). La qualit du lot est considre comme satisfaisante ou acceptable en application de l'article 1er du prsent arrt lorsque, aucun rsultat ne dpassant M : a) Les valeurs observes sont (qualit satisfaisante) : 3 m lors d'emploi de milieu solide ;

10 m lors d'emploi de milieu liquide ; b) Les valeurs observes sont comprises (qualit acceptable) : - entre 3 m et 10 m (= M) en milieu solide ; - entre 10 m et 30 m (= M) en milieu liquide, et est 2/5 avec le plan n = 5 et c = 2 (ou tout autre plan d'efficacit quivalente ou suprieure). Les rsultats sont considrs comme non satisfaisants : a) Lorsque est > 2/5 ; b) Dans tous les cas o des valeurs suprieures M sont observes. Cependant, le seuil de dpassement pour les micro-organismes arobies + 30 C, alors que les autres critres sont respects, doit faire l'objet d'une interprtation, notamment pour les viandes, volailles et produits crus. Lorsque les valeurs sont suprieures M, les rsultats sont considrs comme non satisfaisants. Mais il est bien vident qu'au-del d'un certain ordre de grandeur, la notion de toxicit s'impose de plus en plus ; en tout tat de cause, le produit doit tre considr comme toxique ou corrompu lorsque la contamination atteint la valeur microbienne limite S qui est fixe dans le cas gnral m 103. Pour Staphylococcus aureus , cette valeur S ne doit jamais pouvoir excder 5 104. Les tolrances lies aux techniques d'analyse ne sont pas applicables aux valeurs de M et de S. 2.2 - Plan deux classes Ce plan est ainsi dsign car les rsultats des examens interprts sur cette base permettent de dterminer seulement deux classes de contamination. Ce type de plan, qui n'accepte aucune tolrance, mme de caractre analytique, correspond le plus souvent aux expressions : Absence dans : le rsultat est considr comme satisfaisant ; Prsence dans : le rsultat est considr comme non satisfaisant ; le produit est dclar impropre la consommation. En outre, dans certains cas particuliers mentionns aux articles 2 et 5 du prsent arrt, il est fait application du plan deux classes, avec tolrance analytique. Nota . - Ce plan est en particulier applicable aux contaminations par salmonella. Cependant, pour les volailles, lorsqu'il s'agit de contamination superficielle, le lot est considr comme satisfaisant lorsque le rapport d/n 1/5, d tant le nombre d'units de l'chantillon dont les rsultats sont positifs. 2.3 - Cas particulier des conserves Lorsque les conserves base de denres animales ou d'origine animale ne rpondent pas aux preuves de stabilit fixes l'article 8 du prsent arrt, la transposition au lot d'origine ne pourra intervenir que dans la mesure o un plan d'chantillonnage pralablement dfini aura t mis en oeuvre. 3 - Dispositions particulires relatives aux chantillons soumis la conglation en vue d'une analyse microbiologique diffre Remarque . - La conglation d'un chantillon (plat cuisin, viande hache...) provoque une diminution plus ou moins sensible, selon les cas, du nombre de germes servant de test pour le jugement de la qualit microbiologique telle que dfinie par la rglementation en vigueur. Le fait de congeler un chantillon d'un produit rfrigr peut tre de nature provoquer certains litiges (chantillon rfrigr jug inacceptable, alors qu'un chantillon du mme lot, mais ayant subi une conglation, se rvle satisfaisant au plan bactriologique). Il convient, pour viter au maximum l'apparition de cette disparit, de traiter les chantillons dans les conditions suivantes, lorsqu'ils doivent tre congels et conservs en l'tat, pralablement leur analyse bactriologique. 3.1 - Modalits de conglation et de dconglation

a) Conglation prcoce conduite de manire atteindre la temprature de -18 C le plus rapidement possible. b) Stockage et transport une temprature -18 C. La dure de stockage ne doit pas excder un mois. c) Dconglation rapide l'air ambiant une temprature de l'ordre de 20 C pendant le temps le plus court possible (infrieur trois heures) sans dpasser le stade o la consistance du produit permet le prlvement ncessaire la prparation de la suspension mre (temprature voisine de 0 C). Annexe II Mthodes gnrales d'analyse bactriologique 1 - Prparation de l'chantillon pour essai. - Prise d'essai Chaque fois qu'il est ncessaire, il est procd une homognisation du produit l'aide de techniques et d'appareils appropris (broyeur-homognisateur par exemple). Les prises d'essai sont effectues sur l'chantillon homognis en tenant compte de la nature des produits et des oprations analytiques conduire. Elles sont en principe de 10, 25 ou 50 grammes (dans ce dernier cas 25 grammes sont rservs la recherche des salmonelles). 2 - Suspensions mres et dilutions dcimales Dans un flacon tar contenant 90, 100 ou 225 ml de diluant, introduire aseptiquement 10 ou 25 grammes de produit afin de raliser des suspensions au 1/5 ou 1/10. Homogniser. Les diluants suivants sont prconiss : 2.1 - Cas gnral Tryptone sel : Tryptone1 g Chlorure de sodium8,5 g Eau distille1 000 ml Prparation : chauffer lentement jusqu' complte dissolution, ajuster si ncessaire le pH 7,0 (+ 0,1), rpartir, puis striliser vingt minutes 121 C 1. Eau peptone tamponne : Bacto peptone20 g Chlorure de sodium5 g Phosphate disodique9 g Phosphate monopotassique1,5 g Eau distille1 000 ml Striliser 121 C 1 pendant vingt minutes ; pH final : 7,2. 2.2 - Cas des produits laitiers Eau peptone pour le yaourt. Tryptone-sel pour les laits glifis et emprsurs. Phosphate dipotassique 2 p. 100 (pH final entre 7,4 et 7,6) pour les crmes fraches, les fromages frais et les casinates. A partir des suspensions mres, prparer les dilutions dcimales en utilisant le diluant correspondant au produit analyser. 3 - Revivification A l'exclusion des produits laitiers, si le produit a subi un traitement thermique ou s'il a t congel ou encore s'il renferme des sels pouvant exercer une action inhibitrice (Na Cl, Na NO 3, Na NO 2...) aprs homognisation laisser le flacon la temprature du laboratoire (20 C 2 C) pendant trente quarante-cinq minutes (optimum quarante minutes). 4 - Dnombrement des micro-organismes arobies 30 C Porter en double 1 ml de l'chantillon pour essai s'il est liquide ou 1 ml de la suspension mre dans le cas des autres produits, dans les botes de Ptri striles (90 100 mm de diamtre). Pratiquer de la mme manire partir des dilutions retenues en fonction du produit analyser.

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Couler dans chaque bote 15 ml de glose pour dnombrement pralablement fondue et ramene 47 C ( 1 C). Bien mlanger inoculum et milieu. Laisser solidifier. L'ensemble de ces oprations ne doit pas durer plus de quinze minutes. Nota . - Il est indispensable d'employer des pipettes striles changes pour chaque dilution et d'homogniser l'aide d'un agitateur pour tubes essai. Placer les botes retournes dans une tuve 30 C ( 1 C). Les laisser soixante-douze heures ( trois heures). Ne retenir pour le dnombrement que les botes contenant moins de 300 colonies (et plus de 30 si possible). En cas d'expertise, se conformer aux dispositions de la norme Afnor V 08-011. 5 - Dnombrement des Enterobacteriaceae Le dnombrement s'effectue en glose au cristal violet, rouge neutre, bile, glucose (VRBG). A partir du flacon contenant la suspension mre (1/5 ou 1/10) porter 1 ml dans deux botes de Ptri striles (90 100 mm de diamtre). Couler 12/13 ml de glose slective fondue et ramene 47 C ( 1 C). Bien mlanger inoculum et milieu. Laisser solidifier. Couler en surface environ 9 ml de milieu slectif vierge ramen 47 C ( 1 C). Laisser solidifier et placer les botes retournes dans une tuve 30 C ( 1 C). Les laisser vingt-quatre heures ( deux heures). Dnombrer les colonies violettes et vrifier la nature de ces colonies (les entrobactries sont oxydases et fermentent le glucose). 6 - Dnombrement des coliformes Les coliformes sont dnombrs soit en milieu solide (glose dsoxycholate lactose), soit en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (NPP) l'aide du bouillon lactos bili au vert brillant rparti dans des tubes contenant des cloches de Durham (10 ml de bouillon par tube). 6.1 Le dnombrement en milieu solide s'effectue partir du produit s'il est liquide, des suspensions mres dans les autres cas et des dilutions dcimales retenues selon la nature du produit en portant 1 ml dans deux botes de Ptri striles (90-100 mm de diamtre). Couler ensuite 13 ml environ de glose dsoxycholate lactose fondue et ramene 47 C ( 1 C). Bien mlanger inoculum et milieu. Laisser solidifier. Recouvrir d'une couche de glose dsoxycholate lactose vierge (9 ml environ), laisser solidifier. Porter les botes retournes l'tuve 30 C ( 1 C). Les laisser vingt-quatre heures ( deux heures). Dnombrer les colonies caractristiques rouge fonc d'un diamtre suprieur 0,5 mm en prenant si possible une srie de deux botes o le nombre est compris entre 15 et 150. 6.2 Le dnombrement en milieu liquide s'effectue en transfrant dans trois tubes de milieu slectif 1 ml du produit s'il est liquide ou de la suspension mre, puis en oprant de la mme manire pour les dilutions suivantes : - bien mlanger inoculum et milieu ; - porter les tubes l'tuve 30 C ( 1 C). Les laisser vingt-quatre - quarante-huit heures ( deux heures). Pour chaque dilution (y compris suspension mre et produit liquide) compter les tubes positifs, c'est--dire ceux qui prsentent un dgagement gazeux dans la cloche de Durham et calculer le nombre le plus probable l'aide des tables de rfrence. En cas d'expertise, se conformer aux indications des normes Afnor V 08-015 et V 08-016. 7 - Dnombrement des coliformes fcaux (Entrobactries fermentant le lactose aux tempratures leves) Il s'effectue :

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- soit en milieu solide, selon les mmes modalits que pour les coliformes mais en portant les botes de Ptri ensemences + 44 C ( 0,5 C) durant vingt-quatre heures ( deux heures) ; - soit en milieu liquide (technique du NPP) en repiquant l'aide d'une anse boucle les tubes de bouillon lactos bili au vert brillant trouvs positifs lors du dnombrement des coliformes, dans des tubes de ce mme bouillon. Les tubes ensemencs sont incubs en bain d'eau 44 C ( 0,5 C) vingt-quatre - quarantehuit heures ( deux heures). Compter les tubes positifs, c'est--dire ceux prsentant un dgagement gazeux dans les cloches de Durham et calculer le nombre le plus probable l'aide des tables de rfrence. 8 - Dnombrement de Staphylococcus aureus A partir du produit, s'il est liquide, de la suspension mre et/ou des dilutions retenues selon la nature du produit, porter 0,1 ml sur deux botes de Ptri contenant du milieu de Baird Parker et taler l'inoculum l'aide d'un taleur de verre strile sur la surface pralablement sche du milieu. Ce dernier ne doit pas avoir plus de quarante-huit heures et doit tre conserv au froid. Pour les produits laitiers, ensemencer 1 ml en milieu de Baird Parker. Les botes sont incubes l'tuve 37 C ( 1 C) pendant vingt-quatre puis quarante-huit heures. Dnombrer les colonies caractristiques, c'est--dire noires, brillantes, d'un diamtre compris entre 0,5 et 2 mm, prsentant un liser blanc opaque, entoures d'une aurole d'claircissement du milieu. Certains staphylocoques retrouvs dans les produits laitiers peuvent donner des colonies noires dpourvues d'aurole. Repiquer au moins cinq colonies pour les soumettre aux tests de la coagulase ou de la thermonuclase. En cas d'expertise, se conformer aux indications de la norme Afnor V 08-014. 9 - Dnombrement des anarobies sulfito-rducteurs ( 46 C) Ce dnombrement peut s'effectuer en milieu SPS, TSN ou TSC (Tryptone Sulfite Cyclosrine), ce dernier milieu tant recommand. En raison de sa relative nouveaut, sa composition est rappele ci-aprs : Prparation du milieu base : - tryptone15 g - soytone5 g - extrait de levure5 g - mtabisulfite de sodium anhydre (S2 O5 Na2)1 g - citrate de fer ammoniacal1 g - agar-agar12 g 18 g - eau1 000 ml Ajuster le pH de sorte qu'aprs strilisation il soit 7,6 0,1 25 C. Rpartir en tubes de 20 x 200 raison de 19 ml par tube. Striliser quinze minutes 121 C 1 C. Conserver 4-5 C au maximum quinze jours. Solution de D cyclosrine : - D cyclosrine cristallise4 g - eau100 ml Dissoudre la cyclosrine dans l'eau. Striliser par filtration. Prparation du milieu complet : Au moment de l'emploi, ajouter la solution de D cyclosrine pour obtenir une concentration finale de 400 m gramme/ml soit 1 ml pour 100 ml de milieu soit 0,20 pour 20 ml ou 0,25 pour 25 ml de milieu. 10 - Dnombrement des streptocoques fcaux (Ne concerne que les produits de la pche) Il s'effectue en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (NPP).

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Ensemencer successivement trois tubes de milieu de Rothe avec 1 ml de suspension mre ou des diffrentes dilutions au 1/20, 1/200, 1/2 000 (trois tubes par dilution). Faire incuber les tubes 37 C ( 1 C) vingt-quatre - quarante-huit heures. Repiquer les tubes positifs, c'est--dire ceux montrant une croissance bactrienne, dans des tubes contenant du milieu de Litsky (une anse boucle). Faire incuber les tubes 37 C ( 1 C) vingt-quatre - quarante-huit heures. Compter les tubes positifs (troubles et/ou avec pastille violette au fond des tubes) pour chaque dilution et calculer le NPP en utilisant les tables de rfrence. 11 - Recherche des Salmonella En cas d'expertise se conformer aux indications de la norme Afnor V 08-013. Dans les autres cas, utiliser la technique suivante : Prenrichissement : s'effectue en eau peptone tamponne (voir annexe 2, 2.1), pendant quatre heures 37 C ( 1 C) pour les ovo-produits et ceux dont la teneur microbienne initiale est prsume importante, et pendant seize vingt heures 37 C ( 1 C) dans les autres cas. Le rapport entre la prise d'essai et le volume du milieu doit tre 1/10. Enrichissement : partir du milieu de prenrichissement, porter 2 ml : - dans deux tubes de bouillon Muller Kauffmann au ttrathionate et vert brillant (20 ml par tube) ; - dans deux tubes de bouillon au slnite (20 ml par tube). Faire incuber 37 C ( 1 C) : un tube de bouillon au ttrathionate et un tube de bouillon au slnite. Faire incuber 43 C ( 1 C) : un tube de bouillon au ttrathionate et un tube de bouillon au slnite. Isolement : Aprs vingt-quatre heures et ventuellement quarante-huit heures d'incubation, effectuer, partir des milieux d'enrichissement, des isolements la surface de gloses au vert brillant et au rouge de phnol et, si possible, la surface d'un deuxime milieu slectif. Faire incuber les botes 37 C ( 1 C) pendant vingt heures ( deux heures). Si le dveloppement est insuffisant, poursuivre l'incubation. S'il y a prsence de colonies caractristiques ou douteuses, en repiquer un nombre suffisant et les soumettre aux essais biochimiques classiques. Adresser les souches repiques sur glose nutritive au service des entrobactries du laboratoire central d'hygine alimentaire, 43, rue de Dantzig, 75015 Paris. Nota . - Dans l'ventualit o l'analyse porte sur de nombreux chantillons d'un mme lot, une technique simplifie peut tre mise en oeuvre. Elle comporte : - prenrichissement (sans changement) ; - enrichissement : - un tube de bouillon ttrathionate incub 43 C ( 0,5 C) ; - isolement : - sur glose au vert brillant et rouge de phnol seulement. Remarques gnrales Expression des rsultats Les rsultats des dnombrements doivent tre rapports au gramme ou au millilitre. En cas de recherche, le poids ou le volume d'inoculum doit tre prcis. Valeur de certains rsultats En milieu solide les dnombrements donnant un nombre de colonies infrieur 10 ne peuvent conduire qu' une approximation numrique de la contamination d'un gramme de produit. Dans ce cas, il convient d'exprimer le nombre de colonies observes pour l'inoculum rellement utilis.

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Milieux de culture Afin d'amliorer la fidlit des rsultats, il est recommand d'utiliser les milieux complets dshydrats ou des composants de base dshydrats et de suivre scrupuleusement les prescriptions du fabricant.

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