CULTIVAREA SI IZOLAREA

BACTERIILOR
Mediile de cultură
Mediile de cultură sunt medii artificiale care permit
dezvoltarea in vitro a bacteriilor. Primele medii de cultură au fost
obţinute pornind de la bulionul de carne, medii complexe cu
compoziţie incomplet cunoscută.
În prezent se utilizează medii sintetice, cu o compoziţie bine
precizată. Ele se comercializează fie gata preparate şi turnate,
gata de folosire, fie sub formă deshidratată, urmând a fi
rehidratate, sterilizate şi apoi turnate în plăci Petri sau tuburi, în
funcţie de utilitatea lor.
Medii deshidratate şi suplimente selective (Oxoid)

Medii turnate în plăci Petri şi în tuburi (Oxoid)

 Mediile de cultură trebuie să îndeplinească
anumite cerinţe:
- să conţină substanţele nutritive organice necesare bacteriilor:
proteine, peptone, hidrocarburi, folosite ca surse de energie, de
azot, carbon, etc.
- Să conţină săruri minerale: cloruri, sulfaţi, fosfaţi,
oligoelemente ( Fe, Ca, Zn, Mg, Mn, Co )
- Să fie bine hidratate, apa fiind un element indispensabil
creşterii bacteriilor
- pH-ul să fie adecvat, în general neutru, dar existând şi medii cu
ph alcalin, favorabil anumitor specii.
- Factorii de creştere sunt necesari anumitor bacterii: coenzime,
aminoacizi, baze purinice sau pirimidinice .
- Sterilitatea mediilor este o condiţie esenţială pentru evaluarea
corectă a unei culturi din produsele biologice.
 Clasificarea mediilor de cultură
În funţie de starea de agregare, mediile de cultură se clasifică în:
- medii lichide
- medii solide
- medii semisolide
 Mediile lichide conţin hidrolizate proteice, cu conţinut variabil în
aminoacizi şi peptone, de exemplu apa peptonată şi bulionul. Pornind
de la acest două medii de bază, se pot obţine alte medii lichide prin
adaosul altor substanţe.
 Mediile solide conţin geloză sau agar, polizaharid extras din algele
marine Gelidum sp., solubil în apă şi care la temperatura de 90O C se
topeşte complet şi rămâne în stare lichidă până la scăderea temperaturii
la 40O C. La această temperatură se solidifică sub forma unui gel
transparent care, reîncălzit se lichefiază din nou. Mediile solide se obţin
din medii lichide prin adaosul de agar, în concentraţie de 1.5%.
 Mediile semisolide au o concentraţie de agar de 0.5%.
 În funcţie de complexitatea
structurii, există :
- medii simple, ce conţin un număr redus de
componente şi pe care pot creşte bacteriile
nepretenţioase; exemplu: geloza nutritivă (
geloza simplă)
- medii complexe, ce conţin sânge, ser, ascită,
oligoelemente şi alte suplimente necesare
creşterii bacteriilor pretenţioase; exemplu:
geloza sânge
 În funţie de utilitatea mediilor de cultură, acestea
se clasifică în:
 Medii uzuale, folosite de rutină, pe care cresc majoritatea speciilor bacteriene de
interes medical, folosite pentru însămânţarea majorităţii produselor patologice:
bulionul, geloza nutritivă, geloza sânge.
 Medii de îmbogăţire folosite pentru produsele paucimicrobiene şi care permit,
după incubare, dezvoltarea şi înmulţirea preferenţială a acelor bacterii aflate în număr
mic. Aceste medii sunt medii lichide, bogate în substanţe nutritive. Cele mai folosite
sunt: bulionul nutritiv, bulionul cu extract de creier şi cord. Dacă la aceste medii se
adaugă, ele devin medii selective favorabile unor anumite specii: streptococ, pentru
stafilococ (Chapmann lichid), pentru bacilul difteric, etc.
 Medii diferenţiale şi selective . Mediile diferenţiale conţin substanţe ( zaharuri,
aminoacizi)care sunt substrate ale unor reacţii metabolice şi substanţe indicatoare, ce
evidenţiază dacă tulpina bacteriană testată are sau nu capacitatea de ale utiliza.
 Medii de conservare și transport Compoziţia lor este echilibrată în aşa fel încât
să menţină în produsele patologice viabilitatea microorganismelor şi aspectul cantitativ
original. Sunt în general medii semisolide. Exemplu: mediul Carry-Blair.
 MEDII DE TRANSPORT
 Mediul Cary Blaire este semi-solid, de
culoare alb, folosit pentru materii fecale in
vederea diagnosticului infectiilor cu
Salmonella, Shigella, Vibrio sau Cam-
pylobacter.

 Mediul cu carbune: aceasta ajuta la

eliminarea produselor metabolice aparute
in timpul cresterii bacteriilor.

 Mediul fara carbune: este ideal pentru

izolarea speciilor de
Mycoplasma si Ureaplasma

 Mediul Stuart : folosit de obicei pentru

transportul produselor patologice
suspectate de a avea Neisserii patogene (
N. gonorrhoeae). Deasemenea sunt folosite
pentru transportul exudatului faringian,
secretiilor vaginale, secretiilor de plaga, ce
pot contine bacterii pretentioase in ceea ce
priveste conditiile de mediu
 Mediile selective conţin substanţe inhibante: antibiotice, săruri
biliare, compuşi coloranţi, care permit dezvoltarea unui număr mic
de specii sau chiar ale unei singure specii.
Unele medii posedă atât sistemul selectiv cât şi sistemul
diferenţial.
Exemple:
- mediul AABTL (agar albastru bromtimol lactoza), mediul Mac
Conkey (lactoză, peptonă pacreatică de gelatină, cazeină și carne
peptonică peptică) – medii diferenţiale
- mediul Chapmann solid (geloză sinplă, NaCL 7,5 %, manitol,
roșu fenol) – mediu selectiv pentru stafilococi;
- mediul ABE ( agar, bilă, esculină) – mediu selectiv pentru
identificarea enterococilor.
- mediul ADCL( mediul dezoxicolat citrat lactoza), mediul
Salmonella-Shigella – medii selective şi diferenţiale pentru
enterobacterii
Exemplu: Mediu Salmonella-Shigella (mediu selectiv și diferențial;
inhibă creșterea majorității organismelor coliforme;
permite creșterea speciilor de Salmonella și Shigella; fermentarea
lactozei = culoarea roșie)
 Mediul Agar de esculină biliară ( ABE), (folosit pentru identificarea
streptococilor
din genul Enterococcus (E faecalis și E. Faecium);
testează capacitatea organismelor de a hidroliza esculina
în prezența bilei, determinând virajul culorii mediului la din galbui la maro
până la negru)
 Medii pentru antibiograme: medii nutritive care permit
creşterea majorităşii speciilor bacteriene; se urmăreşte ca inhibiţia
creşterii să fie datorată strict antibioticelor. Exemple: Muller-Hinton
solid pentru testarea susceptibilităţii antimicrobiene , Muller-Hinton
solid cu adaus de Na Cl 2% pentru testarea sensibilităţii la antibiotice
a stafilococilor, Muller-Hinton solid cu sânge pentru testarea
sensibilităţii la antibiotice streptococilor
Medii pentru identificare biochimică sunt medii ce conţin un zahar
( glucoză, lactoza, zaharoză, maltoză, etc) sau alte substrate
biochimice: uree, citrat, lizină sau medii cu mai multe substrate: TSI (
triple sugar iron), MIU ( triptofan, uree) , MILF ( triptofan, lizină,
fenil-alanină) şi diferiţi indicatori de culoare. După însămânţatarea cu
tulpina de cercetat şi incubare, virajul culorii indică metabolizarea
substanţelor respective.
 Însămânţarea mediilor de cultură
Trecerea unei cantităţi din produsul biologic sau dintr-o
cultură pe un mediu în vederea izolării microorganismelor se
numeşte însămânţare.
Însămânţarea mediilor lichide se poate face cu ansa
sterilă, cu pipeta sterilă sauprin descărcarea directă a seringii
atunci când produsul este recoltat în seringă ( sânge, LCR).
Pentru însămânţarea cu ansa, aceasta se sterilizează în
flacăra becului Bunsen, dacă nu este o ansă sterilă de unică
folosinţă, se încarcă cu produs biologic, apoi flaconul sau
tubul cu mediu lichid se destupă, se flambează gura acestuia.
În continuare flaconul sau tubul se înclină uşor, se descarcă
ansa pe peretele acestuia apoi prin mişcări uşoare se
dispersează inoculul în masa mediului
 Însămânţarea mediilor solide

Se depune o cantitate mică din produsul patologic (cu tamponul, pipeta, sau cu
ansa) pe suprafaţa mediului, într-o margine a plăcii Petri.
Apoi cu ansa sterilă se face dispersia în vederea obţinerii de colonii izolate.
Dispersia poate fi făcută pe toată suprafaţa plăcii sau într-un sector de placă marcat
în prealabil.
Se poate face o dispersie simplă, în zig-zag (fig. V.5.)sau o dispersie în cuadrant sau
pentagon deschis (fig.V.6). Însămânţarea mediilor solide turnate în tuburi în pantă se
face cu ansa, descriind un zig-zag pe suprafaţa pantei dinspre porţiunea inferioară
spre porţiunea superioară a pantei.
 Mediile turnate drept în tub se însămânţează prin înţeparea mediului
cu ansa în zona centrală şi retragerea ansei pe acelaşi traseu. Însămânţarea
mediilor anaerobe.
Mediile se toarnă în tuburi Weinberg, pentru ca raportul dintre
suprafaţa mediului şi volum să fie redus. Mediile se fierb în prealabil timp
de 20-30 minute pentru regenerare (eliminarea oricăror urme de oxigen din
mediu). După răcire, se trece la însămânţare, cu pipeta sau cu ansa , în
profunzimea mediului. După însămânţare, peste mediu se adaugă 2 ml ulei
de parafină steril ce împiedică contactul direct al mediului cu aerul (
oxigenul).
Dacă se folosesc sistemele de incubare în anaerobioză, însămânţarea
se face în mod obişnuit pe medii solide (Schaedler blood agar), se introduc
în dispozitivul special, alături de plicul cu substanţa reducătoare peste care
s-au turnat 10 ml apă. Se închide ermetic dispozitivul şi se incubează.
 Incubarea mediilor însămânţate se face în termostat, la 37, timp de 24h,
cu unele excepţii, cum ar fi hemoculturile ( 7 zile) sau culturile pentru
Mycobacterium tuberculosis ( 2-6 săptămâni).
Bacteriile cu necesităţi crescute de CO2 se incubează într-o atmosferă
îmbogăţită în acest gaz, obţinută prin aprinderea unei lumânări în vasul în
care se găsesc plăcile însămânţate. Flacăra se stinge când oxigenul necesar
arderii a fost consumat, acesta fiind înlocuit cu CO2