Meios de cultura At cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios lquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram

os meios de cultura slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas (culturas puras), separando-as de espcies contaminantes. Meios de cultura consistem da associao qualitativa e quantitativa de substncias que fornecem os nutrientes necessrios ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em vista a ampla diversidade metablica dos microrganismos, existem vrios tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigncias nutricionais. Alm dos nutrientes preciso fornecer condies ambientais favorveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, presso osmtica, umidade, temperatura, atmosfera (aerbia, microaerbia ou anaerbia), dentre outras. Os meios de cultura so classificados quanto ao estado fsico emslidos, quando contm agentes solidificantes, principalmente gar (cerca de 1 a 2,0 %); semi-slidos, quando a quantidade de gar e ou gelatina de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistncia intermediria, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tenses variadas de oxignio ou a verificao da motilidade e tambm para conservao de culturas; e lquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativao das culturas, repiques de microrganismos, provas bioqumicas, dentre outros. Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto aprocedncia dos constituintes em naturais ou complexos, quando usa ingredientes com composio qumica no definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubrculos, peptona de soja, etc.) de animais (carne, crebro, fgado, casena, etc.) e de microrganismos (levedura) e artificiais,sintticos ou ainda quimicamente definidos quando acomposio qumica conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigncias nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, nitrognio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando ento so conhecidas as necessidades nutricionais especficas. Quanto a composio qumica podem ser simples (meios bsicos) ou complexos. Bsicos so aqueles que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigncia em especial (Ex. caldo e gar simples). Especiais quando cumprem com as exigncias vitais de determinados microrganismos, como meio de infuso de crebro e corao, gar suco de tomate, gar sangue, meio de Loeffler (com soro bovino), gar chocolate (agar simples fundido, adicionado de sangue e aquecido a 80C), Meio de Tarozzi (com fragmento de fgado - para anaerbios), Meio de Lowenstein, meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP), Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) , Baird -Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substncias citadas), etc. http://microbiologiabrasil.blogspot.com/2009/01/meios-de-cultura.html

Funo das substncias do gar e Caldo simples

Extrato de carne - Fonte de carbono orgnico, nitrognio, vitaminas e sais minerais e, nesse caso de energia Peptona protena semi-digerida que serve como fonte de nitrognio Cloreto de sdio - aumenta a presso osmtica e mantm a isotonia do meio gar-gar - Sulfato de cido poligalacturnico extrado de vrias espcies de algas do gnero Gellidum e outras algas afins. Tem como funo solidificar os meios e no metabolizado por bactrias de interesse clnico.

Obs. 1. A adio de extrato de levedura (0,5%) e glicose (0,5 a 1,0 %) ao caldo simples enriquece o meio fornecendo vitamina B, fonte adicional de nitrognio e carbono, e pode at permitir o crescimento de alguns microrganismos exigentes. 2. Os meios de cultura aps esterilizao devem ser incubados em condies ambientais (temperatura e atmosfera) adequadas para verificao da esterilidade (Prova da esterilidade). 3. A estocagem dos meios de cultura esterilizados e esfriados deve ser feita acondicionandoos invertidos, em sacos plsticos fechados, para reduzir a desidratao dos mesmos, colocando-os em refrigerao por, no mximo 15 dias.
www.microbiologia.ufba.br/.../MEIOS%20DE%20CULTURA.doc Uso em Microbiologia O gar muito usado em meios de cultura slidos para bactrias [2] e fungos, mas no para vrus. Alguns vrus podem, no entanto, ser cultivados em bactrias que por sua vez crescem em gar. Menos de 1% de todas as bactrias conhecidas podem ser cultivadas neste tipo de meios, mas a formulao bsica do meio de cultura com gar adequado para a maioria. Este tipo de meio de cultura feito adicionando agar (normalmente 1,5 a 2% (p/v)) e componentes de meio de cultura especficos para cada tipo de microorganismo a gua destilada. Esta mistura, aps esterilizada, vertida enquanto lquida para placas de Petri ou tubos. Por vezes adicionado um suplemento aps a esterilizao, como por exemplo antibiticos (o calor da esterilizao destri determinados suplementos, no permitindoa sua adio anterior). Aps solidificao do meio, este encontra-se apto a albergar o crescimento de microorganismos. Diferentes microorganismos possuem diferentes necessidades nutricionais, por isso o meio de cultura adaptado para satisfazer essas necessidades. Por exemplo, um tipo de meio o blood agar (literalmente, gar de sangue), que possui como suplemento sangue de cavalo, usado para detectar a presena de organismos hemorrgicos como a Escherichia coli O:157 H:7. A deteco feita atravs da digesto do sangue, que torna a placa mais clara. Meio selectivo

Distinguindo Escherichia coli (1 e 3) deSalmonella enterica Typhimurium (2 e 4) recorrendo a meios diferenciais. O meio de cultura slido pode ser formulado de modo a aplicar uma presso selectiva nos organismos que crescem no mesmo. Por exemplo, se fr adicionada uma grande quantidade de cloreto de sdio (NaCl), apenas organismos halfilos toleraro essa grande quantidade, que inibir o crescimento de outros organismos. Usando o meio MacConkey, apenas organismos gram-negativos crescero, indicando ainda se fermentam ou no lactose (as colnias tomam um aspecto vermelho se sofermentadores de lactose). Meio diferencial O meio diferencial inclui um indicador que provoca mudanas claramente visveis no aspecto do meio ou das colnias que neste crescem. Por exemplo, no meio EMB (do ingls Eosin Methylene Blue, azul de eosina metileno) a bactria E. coli toma um aspecto esverdeado metlico; o meio MSA (Mannitol Salt Agar) toma uma colorao amarela na presena de bactrias capazes de fermentar o manitol. http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81gar-%C3%A1gar

A esterilizao a vapor realizada em autoclaves, cujo processo possui fases de remoo do ar, penetrao do vapor e secagem. A remoo do ar diferencia os tipos de autoclaves. Os ciclos de esterilizao so orientados de acordo com as especificaes do fabricante. Um ciclo de esterilizao do tipo "Flash" pode ser realizado em autoclave com qualquer tipo de remoo do ar [2]. As autoclaves podem ser divididas segundo os tipos abaixo: TIPOS GRAVITACIONAL

O vapor injetado forando a sada do ar. A fase de secagem limitada uma vez que no possui capacidade para completa remoo do vapor. Desvantagem: pode apresentar umidade ao final pela dificuldade de remoo do ar. As autoclaves verticais so mais indicadas para laboratrios. Venturi - O ar removido atravs de uma bomba. A fase de secagem limitada uma vez que no possui capacidade para completa remoo do vapor. Desvantagem: pode apresentar umidade pelas prprias limitaes do equipamento de remoo do ar.

ALTO VCUO

Introduz vapor na cmara interna sob alta presso com ambiente em vcuo. mais seguro que o gravitacional devido a alta capacidade de suco do ar realizada pela bomba de vcuo.

Vcuo nico O ar removido de uma nica vez em pequeno espao de tempo. Desvantagem: pode haver formao de bolsas de ar.

Vcuo fracionado (por pulso ou escalonado) remoo do ar em perodos intermitentes, com injeo simultnea de vapor. Tambm funciona por gravidade A formao de bolsas de ar menos provvel.

EXEMPLOS DE PARMETROS PARA ESTERILIZAO A VAPOR[3] Tipo de autoclave Gravitacional

EXEMPLOS DE TEMPOS MAIS COMUNS DE EXPOSIO [4] Temperatura 121 a 123o.C 132 a 135o.C Tempo do ciclo 15 a 30 min 10 a 25 min

Temperatura Tempo de exposio 121 a 123o.C depende da orientao do fabricante

132 a135 .C Pr vcuo 132 a 135o.C depende da orientao do fabricante o 141 a 144 .C 121 a 123o.C depende da orientao do fabricante 132 a 135o.C

132 a 135o.C 3 a 4 min

Vcuo fracionado

121 a 123o.C 20min 132 a 135o.C 3a4 min

141 a 144o.C

Esterilizao rpida (Flash) y y y O ciclo pr programado para um tempo e temperatura especficos baseado no tipo de autoclave e no tipo de carga (para outros ciclos se assume que a carga contm materiais porosos). De forma geral o ciclo dividido em duas fases: remoo do ar e esterilizao. Embora possa ser programado uma fase de secagem esta fase no est includa no ciclo "flash". Os materiais em geral so esterilizados sem invlucros a menos que as instrues do fabricante permitam. Se assume que sempre estaro midos aps o processo de esterilizao. Devem, portanto, ser utilizados imediatamente aps o processamento, sem ser armazenados. Este ciclo no deve ser utilizado como primeira opo em hospitais. Indicadores qumicos, fsicos e biolgicos (B. stearothermophillus).

Exemplos de tempos mnimos de exposio em estrilizao tipo "flash"[3] , [2] Tipo de autoclave GRAVITACIONAL Tipo de carga -Metais, tens no porosos, sem lumes. - Metais com lumes, tens porosos (plsticos, Temperatura 132o.C Tempo do ciclo 3 min

132o.C

10 min

borrachas) PR VACUO -Metais, tens no porosos, sem lumes. - Metais com lumes, itens porosos (plsticos, borrachas) VCUO FRACIONADO -Metais, itens no porosos, sem lumes. - Metais com lumes, itens porosos (plsticos, borrachas) *incomum no Brasil 132o.C 3 min

132o.C 132o.C a 135 o.C

4 min 3 min

141o.C a 144o.C*

2min

http://www.cih.com.br/esterili zacao.htm#autoclaves A utilizao de calor em ambiente hmido um dos mtodos mais eficazes de destruio de microrganismos. A morte das clulas microbianas por aco do calor hmido resulta da desnaturao das protenas e da destabilizao da membrana citoplasmtica. Ocorre quando as clulas so sujeitas a temperaturas superiores temperatura mxima de crescimento dos microrganismos em causa. A esterilizao por calor hmido efectuada em autoclave (figura 1), que consiste numa cmara com vapor de gua saturado presso de 1 atm acima da presso atmosfrica, a que corresponde, em locais ao nvel do mar, uma temperatura de ebulio da gua de 121C. No laboratrio de Microbiologia, usual sujeitar o material a esterilizar a 121C (1 atm; presso relativa) durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as formas de vida bacterianas, incluindo a dos endsporos bacterianos, mais resistentes ao calor que as clulas vegetativas. Contudo, o tempo necessrio para se esterilizar convenientemente os materiais, a esta temperatura, depende da natureza do material a esterilizar e/ou do seu volume. O calor hmido sob presso utilizado na esterilizao de meios de cultura que no contenha m componentes termolbeis e na esterilizao de material de plstico e de vidro a utilizar nos trabalhos experimentais de Microbiologia. tambm usado na descontaminao de roupas e instrumentos mdicos e cirrgicos, assim como de diversos materiais, reutilizveis ou descartveis, contaminados com culturas de clulas viveis, antes de serem lavados ou colocados no lixo. http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=365
O QUE O PROCESSO DE AUTOCLAVE? Autoclave (ou seja, a esterilizao) refere-se ao processo de cozedura crtico utilizado na fabrico de embalagens para alimentos diversos.Isso preserva o sabor e textura, e permite um longo armazenamento. O recipiente de alimento cheio e, em seguida, cozido em um recipiente grande de ao

inoxidvel fechado durante 20-30 minutos. O processo utiliza uma combinao de vapor, gua em spray, imerso em gua e imerso parcial aquecida a uma presso elevada entre 115-130 C.As altas temperaturas necessrias para matar os esporos de bactrias potencialmente prejudiciais, Clostridium botulinum em concreto (ou seja, botulismo).

Os recipientes de metal esto sendo suplantados por uma variedade de embalagens, como sacos flexveis, covetes, bacias e banheiras. Os sacos fabricam-se a partir de laminados ou de films de embalagem tais como o polister, nylon, alumnio e polipropileno, projectados para suportar altas temperaturas de processamento e presses. O autoclave em sacos utiliza materiais diferentes dos padro. A camada seladora tipicamente de polipropileno (PP) e PET, em vez de polietileno (PE), que no pode lidar com temperaturas de autoclave.Outros filmes recentes para micro-ondas incluem laminados da capa de polietileno tereftalato gli (PETG) revestido com xido de silcio ou alumnio. Este novo material reduz a durao de 20 a dois anos, em comparao com a embalagem de alumnio, mas ainda considerado um equilbrio aceitvel para atingir a convenincia de um pronto-a-comer e apto para microondas. Tubos, pratos, bacias, covetes para microondas tambm podem ser submetidos a processos de autoclave. Alm disso, os alimentos embalados em embalagens flexveis muitas vezes podem ser embalados com menos gua. Este pacote flexvel fornece uma grande rea de superfcie entre comida e calor durante o processo de cozedura - de calor. Mais rpida e mais uniformemente distribuda, e o tempo de cozedura mais preciso. Isso ajuda a preservar o sabor dos alimentos e a textura do produto, uma vez que poderia haver secces que nao ficassem suficientemente cozidas, isto acontece por vezes com as latas.
Durante o autoclave, os recipientes rgidos (por exemplo, latas, recipientes de plstico) so muitas vezes agitados e girados para reduzir o tempo de cozedura dos alimentos e atingir a temperatura de esterilizao, minimizando o efeito de excesso de cozedura. Se as latas no se agitam, o calor ser transportado atravs de alimentos pelo mtodo de conduo (lento). O tamanho e o formato do recipiente tambm importante. Assim as latas grandes beneficiam mais da agitaao que as pequenas e finas.

http://www.videojet.eu/pt/12f583a5621.html

DETERMINAO DO NDICE DE COLIFORMES EM SUMOS, POLMES E SEUS DERIVADOS

I. Objectivos

y Determinar o ndice de coliformes em sumos, polmes e seus derivados.

II. Introduo

O menor volume de produto em anlise, expresso em cm3 , capaz de produzir gases, por fermentao da lactose existente num meio de cultura de caldo bileverde brilhante, nas condies definidas pela Norma De Qualidade Portuguesa N 1410, designa-se por ndice de coliformes.

Semeiam-se volumes conhecidos em tubos de ensaio com meio de cultura de caldo de bile-verde brilhante contendo um tubo de Durham invertido. A presena de bactrias coliformes que fermentam a lactose presente no meio, leva produo de gs, recolhido no tubo de Durham. Considera-se como resultado indicativo da presena de bactrias coliformes a produo de gases em tubos de Durham at, pelo menos, cerca de um dcimo da sua altura. A apresentao de resultados expresso em ndice de coliformes positivo ou negativo num determinado volume de produto.

III. Tcnicas Envolvidas

 Esterilizao em autoclave;  Sementeira com tubo de Durham;

IV. Preparao do Trabalho

Ler, atentamente, a introduo e o procedimento experimental. Ler os textos de apoio de apoio relativos a: Esterilizao em autoclave; Preparao de diluies da amostra; Preparao de meios de cultura; Sementeira em tubos contendo tubo de Durham. Preparar uma tabela de registos.

V. Material

Material

Produtos

Material de vidro esterilizado Frascos de 100mL; Pipetas graduadas 1, 10 e 15mL; Tubos de Durham ( 35mm/5mm ); Tubos de ensaio (180mm/18mm ); Tubos de ensaio marcados aos 9mL; Gobel. Solues Soluo aquosa de hidrxido de sdio. Meios de cultura Caldo bile-verde brilhante.

Material diverso Autoclave; Estufa de incubao; Estufa de esterilizao.

VI. Procedimento

1. Preparar o meio de cultura caldo bile-verde brilhante e distribuir cerca de 12mL por cada tubo de ensaio (180mm/18mm) contendo um tubo de Durham invertido. Esterilizar o conjunto em autoclave a 121C durante 20 minutos. 2. Homogeneizar a amostra, agitando moderadamente o recipiente que a contm. Retirar cerca de 25mL de amostra para o gobel esterilizado e neutralizar a amostra com uma soluo de hidrxido de sdio.
( Comprovar a neutralidade com papel indicador, usando uma vareta de vidra esterilizada) ( No caso de concentrados de sumo, reconstituir a amostra assepticamente na concentrao indicada na respectiva norma de caractersticas, com gua destilada esterilizada).

3. Preparar diluies 1:10 e 1:100 da amostra com gua destilada esterilizada. 4. Medir 10mL da amostra, com pipeta esterilizada, para o tubo de ensaio que contm o tubo de Durham. Repetir o procedimento para cada uma das diluies.
( As inoculaes devem ser feitas em triplicado )

5.

Proceder do mesmo modo, usando apenas 1mL da amostra e de cada uma das diluies.

6. Incubar os tubos durante 48h 3h em estufa a 37 C 1 C. 7. Fazer a leitura dos tubos positivos e registar os resultados em tabela.

VII. APRESENTAO DE RESULTADOS

5) Consideram-se positivos os resultados obtidos nos tubos de ensaio que apresentarem gs nos tubos de Durham at, pelo menos 1 dcimo da sua altura. 6) O ndice de coliformes positivo no menor volume de produto correspondente sementeira se, pelo menos, dois dos trs tubos apresentarem resultados positivos. 7) Se, numa determinada sementeira, s um dos trs tubos apresentar resultados positivos e se na de volume de produto imediatamente superior o mesmo suceder, considera-se o ndice de coliformes como positivo no maior volume de produto. 8) Se apenas na sementeira correspondente ao maior volume de produto houver um tubo com resultado positivo, considera-se o ndice de coliformes como positivo nesse volume de produto.
http://utilizadores.leirianet.pt/~labmicbio/colifsumo.htm

Meios de cultura: Meio sinttico: Constitudo por compostos qumicos conhecidos. Meio complexo: Constitudo por matrias-primas complexas extrato de carne, extrato de leveduras, etc. Meio de enriquecimento: Utilizado para isolar um microrganismo de um meio em que est presente em pequena quantidade. Meios diferenciais: Permitem vis http://pt.scribd.com/doc/5014423/Aula-2-Cultivo-de-Microrganismos

Caldo Verde Brilhante Bile 2%

recomendado para a contagem e confirmao da presena de coliformes a partir de testes presuntivos em amostras de gua, leite e derivados. A associao de bile, em baixa concentrao (2%) ao corante verde brilhante exerce inibio sobre outros microorganismos ca pazes de fermentar a lactose 35C, permitindo uma melhor recuperao de Escherichia coli. Peptona 10g Lactose 10g Bile bovina 20g Verde brilhante 0,0133g gua destilada 1000mL pH final 7,2 Dissolver em gua destilada. Aquecer at a ebulio. Distribuir em tubos com tubinho de Durham. Autoclavar 15 minutos 121C.

http://www.scientia.blog.br/wordpress/?p=2359

Temperatura: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que h um aumento da temperatura, as reaes qumicas e enzimticas na clula tendem a tornar-se mais rpidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturao de protenas e cidos nuclicos, inviabilizando a sobrevivncia celular. Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas mnima, tima e mxima (temperaturas cardeais), para cada microrganismo. A temperatura mxima provavelmente reflete os processos de desnaturao mencionados acima, enquanto os fatores que determinam a temperatura mnima ainda no so bem conhecidos, embora certamente a fluidez da membrana seja um dos fatores determinantes destes nveis trmicos baixos. Temperaturas cardeais dos microrganismos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de temperatura, onde para alguns o timo encontra-se entre 5 e 10C, enquanto para outros de 90 a 100C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo com os timos de temperatura: psicrfilos (0 a 20C, timo de 15C - Flavobacterium), mesfilos (12 a 45C, 37C - E. coli), termfilos (42 a 68C, 62C Thermococcus), e hipertermfilos (80 a 113C, 105C - Pyrodictium brockii). Tipos de bactrias em relao temperatura (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Psicrfilos: os ambientes frios so predominantes na Terra (oceanos, polos, solos) entretanto este grupo (bactrias, fungos e algas) muito pouco estudado. Destes, os mais conhecidos so as algas que crescem sob o gelo ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis), dando colorao vermelha. H os microrganismos psicrotolerantes que so aqueles cujo timo encontra-se entre 20 e 40C e que sobrevivem a 0C. So um grupo amplo (bactrias, fungos, algas e protozorios) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados. Mesfilos: crescem numa faixa de 20 a 40C, com um timo em torno de 37C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente. Termfilos e Hipertermfilos: timos de 45 e 80C, respectivamente. So encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo ocenico, em fontes. Geralmente so procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes, apresentando enzimas e protenas termoestveis, provavelmente devido substituio de aminocidos, conferindo um novo folding. Tm tambm uma maior concentrao de cidos graxos saturados na MC. As Archaea no tem cidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetos de cadeias com diferentes comprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas a glicerol fosfato,

por ligao ter. Os termfilos e hipertermfilos tem grande interesse biotecnolgico porque tendem a fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminao por outros microrganismos e possuem enzimas mais termoestveis. http://vsites.unb.br/ib/cel/microbiologia/crescimento/crescimento.html 1. Autoclavagem Faz-se atravs do autoclave cujo funcionamento idntico ao da panela de presso sendo a temperatura necessria para esterilizaao de 121oC, e o tempo de esterilizao de cerca de 15 minutos. Este tempo de esterilizao dever ser aumentado quando se enche bastante o autoclave com meios para esterilizar. Objectivo: morte de todos os possiveis organismos vivos. As solues ao sair do autoclave esto estreis. Utiliza-se este tipo de esterilizao pelo calor hmido para meios de cultura e diversas solues. Existem vrios tipos de autoclaves verticais ou horizontais. http://www3.uma.pt/gcosta/docs/microbiology/prat1.pdf

CULTIVO DE MICRORGANISMOS EM LABORATRIO 1. INOCULAO E ISOLAMENTO

1.1 INOCULAO
Semear ou inocular significa introduzir artificialmente uma quantidade de amostra (inoculo) em um meio de cultura adequado, com a finalidade de iniciar um cultivo microbiano. Aps a inoculao, o meio de cultura incubado a uma temperatura adequada para o crescimento. A inoculao pode ser realizada em meio lquido, slido ou semi-slido, utilizando-se uma ala ou pipeta estril.

Cultivo em meio lquido Habitualmente se realiza em tubos ou em frascos de laboratrio (erlenmeyers, p. ex.). O crescimento da populao microbiana evidenciado pela turvao do meio, por formao de pelcula ou por formao de sedimento.

Fig. 1 Tubo direita, meio BHI sem semeadura; tubo esquerda, meio BHI aps crescimento bacteriano. Observar turvao indicativa de multiplicao microbiana.

Cultivo em meio slido Pode ser conduzido em tubos ou em placas. a) Tubos com gar inclinado Para inoculao, move-se suavemente a ponta da ala sobre a superficie do gar com um movimento em zig-zag do fundo at a parte superior, com cuidado para no danificar (ferir) a superfcie do meio. b) Tubos com gar no inclinado Inocula-se introduzindo a ponta de uma ala em agulha no centro do meio. c) Inoculao em placas de Petri Pode ser em superficie ou em profundidade.
A inoculao em superfcie pode ser realizada de duas formas: 1) Adiciona-se 0.1 mL de uma diluio da amostra com pipeta estril no centro da placa e espalha-se com o auxlio de uma ala de Drigalski estril. 2) Inocula-se com a ala de platina, conforme ser explicado mais adiante. No item tcnica de semeadura. Inoculao em profundidade: Adiciona-se 1 mL da amostra ou uma de suas diluies no centro de uma placa de Petri vazia. Verter sobre o inculo 20 mL de meio de cultura fundido e aquecido a 45C. Agitar a placa realizando movimentos circulares no sentido horrio e no sentido anti-horrio ou realizando movimentos em oito.
Incubar as placas na posio invertida, uma vez que a elevada concentrao de gua no meio pode provocar condensao durante a incubao. No meio slido, cada clula vivel dar origem a uma colnia, portanto a inoculao em placas pode ser utilizada, no somente para cultivar microrganismos, como tambm para contar e isolar. Em geral quando se deseja obter colnias isoladas a partir de um determinado material, necessrio diluir a amostra em tubos com gua destilada estril.

TCNICA DE SEMEADURA

Alguns procedimentos so indispensveis para deteco e quantificao de diferentes microrganismos. Estas tcnicas consistem de regras de assepsia e segurana para evitar a contaminao dos meios de cultura com microrganismos do ambiente; para obter culturas puras; para evitar acidentes laboratoriais. 1. A ala de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operao de semeadura. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama de 2 a 3 vezes. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma faa um ngulo de 45r em relao mesa de trabalho. 2. Antes de retirar o material para a elaborao do esfregao ou para semeadura deve-se esfriar a ala na parede interna do tubo ou na tampa da placa de Petri. 3. Para a semeadura em tubos de ensaio, deve-se flambar rapidamente a boca dos mesmos logo aps a retirada do tampo de algodo. Este dever ser mantido seguro pelo dedo mnimo da mo que est segurando a ala. Aps a retirada do material com a ala, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo. Flambar a ala aps o uso. No pousar os tampes sobre a bancada. 4. As pipetas utilizadas em Microbiologia so previamente embrulhadas em papel e esterilizadas. Para uso, torcer o papel na regio central da pipeta, retirar primeiramente o papel na parte superior e depois a inferior (correspondente ponta da pipeta). Esta seqncia evita que a pipeta seja contaminada pelas mos do operador. Uma vez usada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro ou plstico, contendo desinfetante. 5. As placas de Petri devero ser abertas prxima ao bico de Bunsen para evitar contaminao com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com tampa voltada para baixo.

Tcnica de semeadura em placa de Petri a partir de cultura de bactria.

(d)

(f)

(g)

Procedimento: a.) flambar a ala; b.) remover o tampo de algodo; c.) introduzir a ala na cultura de bactria; d.) com a ala, delicadamente, semear na placa de Petri; e.) flambar novamente a ala; f.) a partir de um ponto j semeado, distribuir o material na placa, fazendo estrias no restante da placa.

1.2. ISOLAMENTO
Isolar significa separar um tipo de microorganismo a partir de uma populao que o contm. Em habitats naturais, raramente encontramos os microrganismos em cultura pura (um nico tipo de microrganismo), portanto faz-se necessrio um procedimento de isolamento para separar e identificar os distintos tipos de microrganismos presentes. O isolamento pode ser feito diretamente a partir de uma amostra quando os microorganismos esto numa proporo adequada. Quando o microrganismo que se

deseja isolar se encontra em pequena quantidade, realizado o procedimento chamado enriquecimento que significa elevar a quantidade do microrganismo de interesse com relao ao restante da populao. A seguir se isola empregando o mtodo de isolamento por estrias ou por diluio, para posterior identificao. Procedimentos empregados no isolamento de microrganismos: a) isolamento por estrias b) isolamento por diluio Isolamento em placas por estrias Existem diversas tcnicas, todas com o objetivo de obter colnias isoladas. Tcnica A Consiste em carregar a ala de platina em O com a amostra e fazer estrias paralelas na quarta parte da superficie da placa; flambar a ala, esfriar, girar a placa 90 e continuar fazendo estrias recobrindo outro quarto da placa, aps tocar 3 ou 4 vezes a rea semeada inicialmente. Por ltimo, sem flambar novamente, fazer estrias no restante da superfcie da placa. Tcnica B Com a ala de platina carregada fazer 3 ou 4 estrias; flambar e fazer mais 3 ou 4 estrias perpendiculares s anteriores, flambar novamente e repetir o procedimento at esgotar a superficie da placa. Isolamento por diluio em meio slido usando tanto o mtodo de inoculao em profundidade como o mtodo de inoculao em superficie. Apenas necessria a diluio da amostra. Para tanto pode-se preparar diluies decimais utilizando-se gua estril ou outro diluente. A inoculao em profundidade pode ser realizada tal como descrita anteriormente. Uma outra forma preparar as diluies diretamente em tubos de gar fundido e aquecido (20 mL), agitar por rotao do tubo entre as mos e verter o meio em placas de Petri estreis.

CULTURA PURA
Uma cultura pura pode ser observada a partir de colnias isoladas em meio no seletivo, atravs de um exame microscpico que deve apresentar clulas morfologicamente semelhantes e com mesmo resultado para a colorao de Gram. Para facilitar a identificao, deve-se descrever as colnias macroscopicamente em funo do tamanho, forma, borda, elevao, transparncia e cor. Quando so obtidas colnias isoladas em meios seletivos, deve-se proceder a um novo isolamento em meio no seletivo utilizando-se o mtodo de estrias. Este procedimento conhecido como re-isolamento.

PESQUISA DE MICROORGANISMOS:

Quando se deseja saber se um determinado tipo de microorganismo est presente ou ausente numa amostra, deve-se realizar as seguintes etapas: a) enriquecimento b) isolamento por estrias em meios de cultura seletivos ou diferenciais. c) re-isolamento (meio de cultura no seletivo) d) identificao A etapa de enriquecimento pode subdividir-se em duas: pr-enriquecimento e enriquecimento seletivo. O pr-enriquecimento ou enriquecimento no seletivo deve ser realizado somente quando os microrganismos esto debilitados ou sofreram danos, sendo empregados apenas meios nutrientes lquidos, no seletivos. O enriquecimento seletivo realizado incubando-se a amostra em meios lquidos seletivos, ou seja, em presena de agentes qumicos ou biolgicos que favorecem o desenvolvimento em particular dos microrganismos pesquisados.
Uma vez cumprida a etapa de enriquecimento, procede-se ao isolamento, empregando a tcnica de estrias em superfcie, utilizando-se meios de cultura seletivos e diferenciais. O re-isolamento em meios no seletivos, para obteno de culturas puras e identificao das mesmas, a etapa final. O resultado da pesquisa se d sempre expressando PRESENA ou AUSNCIA por grama ou mL de amostra inoculada na primeira etapa do procedimento (enriquecimento). recife.ifpe.edu.br/recife/Isolamento_Microrganismos.doc

Controle, Escherichia coli

O caldo lactosado usado como prova bioqumica verifica a possvel fermentao com produo de cido. Para poder verificar a presena do cido, foi adicionado o indicador azul de bromotimol.
http://prokariotae.tripod.com/caldo_lactosado.htm Base Cientifica: O Caldo Lactose Cristal Violeta preparado como a frmula recomendada pela APHA (1, 2). Este meio usado em paralelo com o caldo lactose (M026) na anlise de gua para deteco de coliformes. Ele tambm pode ser usado como caldo de pr-enriquecimento para Salmonella e no estudo de fermentao de lactose de bactrias em geral. Digesto pptica de tecido animal fornece nutrientes essenciais para os metabolismos bacterianos. Lactose a fonte de carboidrato fermentvel enquanto os fosfatos ajudam a manter as condies e tamponamento no meio. Cristal violeta inibe bactrias gram-positivas que podem ser responsveis por resultados falso positivos ou mascarar os coliformes. Procedimento de Preparao do Meio de Cultura: Dissolva 16 gramas em 1000ml de gua destilada. Distribua 10 ml em t ubos teste contendo tubos de Durham invertidos. Esterilizar autoclavando a 15lbs de presso a 121C por 15 minutos. Se o inculo maior que 1ml, meios de concentrao dupla ou mltipla devem ser usados. http://www.biosystems.com.br/arquivos/produtos/946.pdf