THESE

Prsente lUniversit Louis Pasteur, Strasbourg I Facult des Sciences de la Vie pour obtenir le titre de :

Docteur de lUniversit Louis Pasteur

Domaine : Biologie Molculaire et Cellulaire

Par

Jean Michel UBEDA

Les cellules sanguines de drosophile: Etude transcriptionnelle et analyse gntique de leur rponse une infection parasitaire

Soutenue le 12 octobre 2005 devant la commission dexamen: Mme Angela GIANGRANDE

(examinatrice, IGBMC, Illkirch)

M. Serge POTIER
(rapporteur interne, Institut de Botanique, Strasbourg)

M. Thierry JAFFREDO
(rapporteur externe, Laboratoire de Biologie du Dveloppement, Paris)

Mme Marylne POIRI

(rapporteur externe, UMR 1112 INRA, Nice)

Mme Marie MEISTER

(directrice de thse, IBMC, Strasbourg)

-RemerciementsJexprime ma reconnaissance au Pr Jules Hoffmann pour mavoir accueilli dans son laboratoire, me donnant ainsi la chance de raliser ce travail de thse dans un environnement scientifique de grande qualit. Je le remercie pour mavoir soutenu durant les premires annes de mon doctorat. Mes plus sincres remerciements Mme Angela Giangrande, M. Serge Potier, M. Thierry Jaffredo et Mme Marylne Poiri, pour avoir accept de me faire don dune partie de leur temps pour lire et juger ce travail. Tout particulirement, je tiens remercier Marie Meister pour mavoir paul, guid, et conseill tout au long de mon doctorat. Je te remercie galement pour ta disponibilit et ton aide au quotidien. Je suis content davoir pu effectuer ce travail tes cts, et davoir bnfici de tes qualits scientifiques et humaines. Le hasard a voulu que je sois ton dernier tudiant, cest dommage et je te souhaite bonne chance pour la suite. Une grande partie de ce travail a pu exister grce une collaboration avec lquipe dAlain Vincent et Michle Crozatier Toulouse. Je les remercie personnellement pour cette interaction trs enrichissante. Quand on arrive en DEA, on a tout apprendre et jai beaucoup appris avec le Dr Marie Lagueux, je la remercie chaleureusement pour avoir contribu ma formation pratique. Je tiens aussi remercier Daniel Doucet pour mavoir appris toutes les astuces de la biologie molculaire Ce rapport reprsente quatre ans de travail, je le voulais complet et clair. Je suis reconnaissant envers le Dr Jean-Luc Imler, mais aussi Vanessa et Catherine pour avoir lu ce rapport et pour mavoir fait part de leurs critiques. Je remercie Ccile pour sa matrise de EndNote(6, pas plus). Les annes passes dans ce laboratoire mont permis de crer des liens et rencontrer des personnes formidables. Je pense particulirement Vanessa, merci pour ton oreille, ton amiti et ton soutien inconditionnel, ainsi quaux filles de notre club trs ferm qui sont Ccile V., Ccile F. et Catherine, merci pour mavoir ouvert les yeux et mavoir rendu cette dernire anne si agrable! Merci Anne Braun pour ses conseils et Richard pour sa bonne humeur dans lquipe, merci vous deux pour votre participation au projet Latran. Merci aux personnes qui mont facilit le travail au quotidien: Paule et Rachel, merci pour votre gentillesse, Sebahat et Marie-Eve, mes deux voisines de paillasse, merci pour votre aide. Je suis heureux davoir pu profiter des conseils dautres personnes au laboratoire au cours des labmeetings mais galement dautres occasions: Dominique Ferrandon, JeanMarc Reichhart, Vincent Leclerc, Jean-Luc Imler, Julien Royet, un grand merci vous.

Je suis galement reconnaissant envers les anciens jeunes et les nouveaux jeunes du laboratoire qui mont aid un moment donn: merci Hana, Nadge, Vincent B., Jessica, Emmanuel, Anne-Isabelle, Nadine, Marie G., Francine et David. Chacun a contribu la vie du laboratoire et directement ou indirectement mes travaux. Je ne vous nomme pas mais je vous remercie et vous souhaite chacun bonne route. Je remercie ma famille, mes parents, ainsi que mes frres et sur qui ont toujours cru en moi et sans qui je ne serais jamais parvenu jusquici.

-INTRODUCTION- __________________________________________________________ 3 I. La rponse immunitaire de la drosophile______________________________________ 6 A. La rponse humorale aux infections bactriennes et fongiques__________________ 6
1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. Les peptides antimicrobiens ________________________________________________________ 6 Rgulation des gnes codant les peptides antimicrobiens __________________________________ 7 Reconnaissance des microorganismes et activation des voies de rgulation ___________________ 10 Les plasmatocytes et la phagocytose _________________________________________________ 13 Les cellules cristaux et la mlanisation ______________________________________________ 15 Les lamellocytes et lencapsulement _________________________________________________ 17 La coagulation chez la limule ______________________________________________________ 19 La coagulation chez la drosophile ___________________________________________________ 20

B. Les rponses cellulaires : les hmocytes et leurs fonctions_____________________ 12

C. La coagulation ________________________________________________________ 19

II.

Lhmatopose chez la drosophile_________________________________________ 21

1. 2. 3. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. Lhmatopose chez lembryon ____________________________________________________ 21 Lhmatopose larvaire __________________________________________________________ 22 La double origine ontognique des hmocytes de la drosophile ____________________________ 23 Le facteur GATA Serpent _________________________________________________________ Les facteurs de lignage ___________________________________________________________ La voie de signalisation Notch _____________________________________________________ Le rcepteur PVR (PDGF-VEGF Receptor) ___________________________________________ La voie JAK/STAT ______________________________________________________________ La voie Toll____________________________________________________________________ Les facteurs GATA, FOG et Runx dans lhmatopose des mammifres_____________________ Les facteurs domaine Runt _______________________________________________________ La voie JAK/STAT ______________________________________________________________ La voie Notch __________________________________________________________________ Les voies Ras/Raf et VEGFR dans lhmatopose des mammifres_________________________ 24 25 28 29 31 33 34 35 35 36 37

A. Les processus hmatopotiques __________________________________________ 21

B. La rgulation gntique de lhmatopose _________________________________ 24

C. Comparaison des systmes hmatopotiques des mammifres et de la drosophile 33

III. Les interactions htes-parasitodes chez la drosophile _________________________ 37 A. Le parasitisme chez les Insectes __________________________________________ 37 B. Les Hymnoptres endoparasitodes et leurs htes___________________________ 39 C. La relation hte-parasitode Drosophila melanogasterLeptopilina boulardi ______ 40 IV. Objectif de ce travail ____________________________________________________ 42 -RESULTATS- _____________________________________________________________ 44 CHAPITRE I : Analyse de lactivit transcriptionnelle des hmocytes de la drosophile __ 45 I. II. Introduction____________________________________________________________ 46 Article I : New insights into Drosophila larval haemocyte functions through

genome-wide analysis. _______________________________________________________ 47 III. Rsum_______________________________________________________________ 49 1

IV. Discussion ____________________________________________________________ 51 CHAPITRE II : Etude du facteur Collier dans le dveloppement hmatopotique de la drosophile _________________________________________________________________ 54 I. II. Introduction____________________________________________________________ 55 Article II : Cellular Immune Response to Parasitization in Drosophila Requires the

EBF Orthologue Collier______________________________________________________ 56 III. Rsum_______________________________________________________________ 58 IV. Discussion ____________________________________________________________ 59 V. Objectifs : A la recherche des partenaires de Col _____________________________ 63

CHAPITRE III : Les homologues des rcepteurs IL-6R des mammifres dans lhmatopose de la drosophile________________________________________________ 65 I. Introduction____________________________________________________________ 66 A. Les rcepteurs cytokines de la famille IL-6R des mammifres________________ 66 B. Les homologues des rcepteurs IL-6R/gp130 chez la drosophile________________ 68 II. Donnes prliminaires __________________________________________________ 69 A. Latran et Domeless, deux candidats pour le rcepteur R2_____________________ 69 B. Les approches transgniques_____________________________________________ 70 III. Gnration dun mutant latran perte-de-fonction _____________________________ 72 A. Mutagense par mobilisation dlments P _________________________________ 72
1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. Principe _______________________________________________________________________ Recherche dlments P proches de latran ____________________________________________ Mobilisation de llment P par sauts locaux___________________________________________ Rsultats ______________________________________________________________________ 72 73 73 74

B. Invalidation du gne latran par recombinaison homologue ____________________ 75

Le Knock-Out chez la souris _______________________________________________________ 75 Application de cette technique chez la drosophile pour la dltion de latran___________________ 76 Frquence des vnements de recombinaison __________________________________________ 78

IV. Discussion et perspectives ________________________________________________ 78 -DISCUSSION GENERALE- _________________________________________________ 82 Rfrences bibliographiques __________________________________________________ 84

Table des Figures

Figure 1: Schma rcapitulatif de la voie Toll dans le corps gras de drosophiles adultes Figure 2: Schma rcapitulatif de la voie IMD dans le corps gras de drosophiles adultes Figure 3: Le plasmatocyte Figure 4: La cellule cristaux Figure 5: La cascade de la mlanisation chez les arthropodes Figure 6: Le lamellocyte Figure 7: La coagulation chez la limule Figure 8: Reprsentation schmatique de lhmatopose embryonnaire chez Drosophila melanogaster Figure 9: La glande de la lymphe Figure 10: Rgulations gntiques de lhmatopose chez la drosophile Figure 11: Le parasitisme de Drosophila melanogaster par Leptopilina boulardi Figure 12: Collier est lorthologue de EBF chez la drosophile Figure 13: Modle de diffrenciation des lamellocytes suite une infection parasitaire Figure 14: Les rcepteurs de la famille IL-6R des mammifres et leurs homologues chez la drosophile Figure 15: La signalisation par les rcepteurs de la famille IL-6R chez les mammifres Figure 16: Expression de latran et domeless dans la glande de la lymphe Figure 17: Les lments P au voisinage de latran et la stratgie de PCR pour le crible des lignes mutantes Figure 18: Clonage du fragment donneur pour la recombinaison homologue Figure 19: Dltion du gne latran par recombinaison homologue

7 8 13 15 16 17 19

21 22 24 40 55 59

66 67 69

73 76 77

Introduction

-INTRODUCTION-

Introduction

Tout organisme vivant est confront en permanence des pathognes potentiels appartenant plusieurs catgories (virus, bactries, parasites, champignons). Ces pathognes peuvent lenvahir par diffrentes voies dentre : les voies respiratoires, le tractus digestif, la peau, et le sang loccasion des blessures. Lorsque les barrires physiques sont franchies, un systme de dfense complexe se met en place pour contenir linvasion, le systme immunitaire. On distingue classiquement dans le systme immunitaire deux grands bras, celui de limmunit inne et celui de limmunit acquise dite adaptative . Limmunit inne est la premire ligne de dfense lors des infections, elle est efficace contre de nombreux microorganismes dont les constituants de surface communs sont rests constants au cours de lvolution. Ces motifs molculaires sont reconnus par des rcepteurs invariables cods dans la ligne germinale, les PRRs (Pattern Recognition Receptors). Cette reconnaissance, au sens large, des motifs microbiens a fait croire que cette immunit tait nonspcifique vis--vis du pathogne. Suite aux infections, elle dclenche rapidement des mcanismes effecteurs comme la phagocytose et la production de peptides antimicrobiens. Les insectes, tels que la drosophile, qui ne bnficient que de cette immunit inne, combattent pourtant les infections microbiennes et parasitaires de faon efficace. Contrairement limmunit inne, limmunit adaptative, qui existe uniquement chez les vertbrs, a dvelopp des rcepteurs spcialiss dune trs grande variabilit, les anticorps et les rcepteurs des lymphocytes T. Cette variabilit est cause par de nombreux rarrangements somatiques des gnes codant ces rcepteurs. Les lymphocytes se sont spcialiss dans la production de ce vaste rpertoire. Les lymphocytes diffrent ainsi les uns des autres par la structure des rcepteurs prsents leur surface. Un avantage dterminant de limmunit adaptative est ltablissement dune mmoire immunitaire, permettant de dvelopper des rponses plus rapides et plus efficaces vis--vis des agresseurs microbiens lorsque les contacts se rptent. Dimportants efforts ont t apports ces dernires dcennies pour ltude des mcanismes des immunits inne et adaptative. La drosophile est un organisme modle largement utilis pour la comprhension des processus biologiques. Son gnome est entirement squenc (Adams et al., 2000) et de nombreux outils gntiques sont disponibles pour effectuer ces tudes. Labsence dimmunit adaptative chez la drosophile reprsente un avantage pour ltude des mcanismes de limmunit inne. En effet, ce modle permet de saffranchir des interactions entre les deux rponses immunitaires, qui peuvent compliquer lanalyse chez les mammifres. Les tudes ralises chez la drosophile ont

Introduction

contribu de faon importante une meilleure comprhension du fonctionnement de la rponse inne. Les investigations menes jusquici se sont focalises essentiellement sur la rponse humorale antibactrienne et antifongique, plus prcisment sur les voies de signalisation qui contrlent la synthse des diffrents peptides antimicrobiens. Cette thmatique est dsormais relativement bien documente. En revanche, nous ne disposons que de peu de donnes molculaires concernant les facettes de la rponse cellulaire ou les fonctions des cellules sanguines. Lquipe du Dr Marie Meister, que jai intgre pour effectuer mon doctorat, sintresse prcisment aux fonctions des cellules sanguines de la drosophile et leur contribution aux mcanismes de limmunit inne. Une partie de mon projet de thse, en collaboration avec dautres personnes au laboratoire, a consist en une dissection des caractristiques transcriptionnelles des cellules sanguines, ou hmocytes, de la drosophile. Nous avons analys les activits transcriptionnelles des hmocytes dans diffrents contextes gntiques et suite des infections bactriennes, par la technique des puces ADN. En parallle, mon projet de thse principal fut de comprendre le processus dencapsulement de parasites qui ncessite chez la drosophile linduction et la prolifration dhmocytes spcialiss, appels lamellocytes. Mon travail a permis de dmontrer le rle indispensable du transactivateur Collier, unique orthologue de EBF (Early B-cell Factor) des mammifres, pour la spcification des lamellocytes suite une infection parasitaire. Dans la suite de mon travail, je me suis intress un gne jusque-l non caractris, qui code une protine transmembranaire putative homologue des rcepteurs IL-6R/gp130 des mammifres. Dans la premire partie de cette introduction, je vais prsenter nos connaissances actuelles concernant les diffrentes facettes de la rponse immunitaire chez la drosophile. La deuxime partie sera consacre aux cellules sanguines de la drosophile. Enfin, je prsenterai quelques donnes bibliographiques sur la rponse antiparasitaire chez les insectes, et plus particulirement chez la drosophile.

Introduction

I. La rponse immunitaire de la drosophile

La cuticule de la drosophile et les epithelia de surface reprsentent une barrire physique efficace contre lentre de microorganismes dans la cavit gnrale, appele hmocoele chez linsecte. A loccasion dune blessure, les microorganismes vont pntrer dans lhmocoele, o se trouve lhmolymphe qui est lquivalent du sang des mammifres. Les microorganismes sont alors confronts plusieurs mcanismes dfensifs. Trs rapidement des cascades protolytiques sont actives dans lhmolymphe, elles aboutissent la mlanisation, la coagulation et la production de molcules signal (Hoffmann and Reichhart, 2002) Une rponse humorale est assure par les cellules du corps gras (quivalent du foie des mammifres) qui synthtisent et librent dans lhmolymphe des peptides antibactriens et/ou antifongiques large spectre daction. Les hmocytes sont impliqus dans une rponse cellulaire, ils permettent la phagocytose des microbes, lencapsulement des parasites, et certains hmocytes participent aux ractions de mlanisation.

A. La rponse humorale aux infections bactriennes et fongiques

1. Les peptides antimicrobiens La drosophile dispose de plusieurs peptides antimicrobiens, qui ont pour caractristique commune de possder une alternance de parties cationiques et hydrophobes. On pense en gnral que la partie cationique leur permet de se fixer aux ttes polaires des phospholipides des membranes bactriennes, lesquelles sont charges ngativement contrairement celles des cellules eucaryotes. Les parties hydrophobes permettent ensuite leur insertion dans la membrane cellulaire dune large palette de bactries, la dstabilisant et entranant la lyse par entre deau. Sept familles diffrentes de peptides antimicrobiens ont t caractrises chez la drosophile (Meister et al., 2000) Elles peuvent tre assembles en trois groupes qui se distinguent par leur spectre daction. Les Dfensines constituent un exemple de peptides antibactriens particulirement actifs contre les bactries Gram positif. La Drosomycine et la Metchnikowine sont des peptides antifongiques, alors que les peptides Diptricine, Attacine, Ccropine, et Drosocine sont principalement actifs contre les bactries Gram ngatif.

Introduction

2. Rgulation des gnes codant les peptides antimicrobiens La drosophile semble adapter la production des peptides antimicrobiens au type de microorganisme qui linfecte. En effet, une infection naturelle par des champignons entomopathognes induit lexpression des peptides antifongiques Drosomycine et Metchnikowine, et ninduit pas lexpression des peptides antibactriens. Lexpression des peptides antibactriens, comme la Diptricine, est quant elle active prfrentiellement par des infections Gram ngatif (Lemaitre et al., 1997). Il est maintenant clairement tabli que cette induction diffrentielle des diffrents peptides antimicrobiens dans les cellules du corps gras est rgule au niveau gntique par deux voies de signalisation de type NF-kB (Nuclear Factor-kB), les voies Toll et IMD (Hoffmann et al., 1999). La synthse des peptides appropris en rponse une infection reflte lactivation slective de lune de ces deux voies de signalisation. Schmatiquement, la voie Toll est active suite des infections fongiques et par des bactries Gram positif, alors que la voie IMD est active par des bactries Gram ngatif. a. La voie Toll La voie de transduction Toll fut caractrise chez la drosophile pour son rle au cours de lembryogense o elle contrle la mise en place de laxe dorso-ventral (revue dans (Belvin and Anderson, 1996). Cette voie porte le nom du rcepteur transmembranaire Toll, qui est le premier maillon de la voie de signalisation intracellulaire (Figure 1). En aval de Toll, quatre gnes furent identifis : tube, pelle, cactus et dorsal. Les travaux mens par Lemaitre et al. (Lemaitre et al., 1996a) ont dmontr que certains composants de cette voie de signalisation, plus prcisment Toll, tube, pelle et cactus, sont rutiliss pour la rponse immunitaire chez ladulte. Depuis, dautres composants de la voie Toll ont t identifis pour leur rle dans ce processus : MyD88 (TauszigDelamasure et al., 2002), qui est galement utilis chez lembryon pour lorganisation de laxe dorso-ventral, et Dif (Dorsal-related immune factor), qui est spcifique de la rponse immunitaire (Ip et al., 1993; Meng et al., 1999; Rutschmann et al., 2000a). Le domaine extracellulaire du rcepteur Toll prsente des rptitions riches en leucine et son domaine intracytoplasmique prsente des similarits avec celui du rcepteur de linterleukine-1 (domaine TIR pour Toll- IL 1- Receptor). Ce domaine TIR interagit avec un complexe adaptateur compos de MyD88, Tube et Pelle (Sun et al., 2002). Ces trois protines interagissent entre elles par lintermdiaire de leur Death Domain (DD). En plus de son DD, MyD88 possde un 7

Champignons

Bactries Gram-positif Bact

Nec

GNBP3

PGRP-SD

GNBP1 PGRP-SA

Pro-Spz
Psh

Toll
T I R T I R

MyD88 Tube

Pelle

Cactus/DIF Cactus
(Dgradation (D par le protasome) prot asome)

DIF Drosomycine

et autres gnes cibles g

Figure 1 : Schma rcapitulatif de la voie Toll dans le corps gras de drosophiles adultes. La voie Toll est active suite une infection par des
champignons ou des bactries Gram positif (voir texte pour les dtails)

Introduction

domaine TIR qui lui permet dinteragir avec le rcepteur Toll. Lactivation de la voie Toll lors dune infection microbienne conduit la phosphorylation puis la dgradation de linhibiteur Cactus, un homologue de I-kB (Inhibitor of NF-kB). La kinase implique dans ce phnomne na pas encore t identifie. Cactus est complex dans le cytoplasme un facteur de transcription de la famille Rel. Sa dgradation permet ainsi la libration du transactivateur et son transport dans le noyau o il va rguler lexpression de gnes cibles. Pour lorganisation de laxe dorso-ventral chez lembryon, le facteur de transcription impliqu dans la voie Toll est Dorsal. Cependant chez ladulte, la voie Toll va mobiliser un autre facteur de la famille Rel pour activer les gnes des effecteurs de la rponse immunitaire, il sagit de DIF. Chez la larve, DIF et Dorsal ont des fonctions redondantes pour la rponse immunitaire mais chez ladulte, seul DIF contrle lexpression des peptides antimicrobiens (Ip et al., 1993; Manfruelli et al., 1999; Rutschmann et al., 2000b). Lanalyse de linduction des peptides antimicrobiens chez des mutants perte-de-fonction de cette voie ont permis de dmontrer que la voie Toll joue un rle important dans la rsistance aux infections par des bactries Gram positif et par les champignons. De ce fait, les mutants perte-defonction de la voie Toll sont trs sensibles ces types dinfections, et prsentent une survie rduite (Lemaitre et al., 1997; Rutschmann et al., 2002; Tauszig-Delamasure et al., 2002). En revanche, ils ne sont pas sensibles aux infections par des bactries Gram ngatif et expriment normalement les peptides antibactriens comme la Diptricine, apportant la preuve quau moins une autre voie est implique dans la rponse ces microorganismes. b. La voie IMD Lidentification dune mutation appele immune deficiency (imd) apporta la dmonstration de lexistence de cette deuxime voie de transduction (Figure 2). Cette voie IMD dirige les ractions de dfense contre les bactries Gram ngatif (Lemaitre et al., 1995), et contrle lexpression des peptides antibactriens Diptricine, Ccropine, Drosocine et Attacine. Comme pour la voie Toll, linduction de lexpression des gnes qui codent ces peptides antibactriens est place sous le contrle transcriptionnel dun transactivateur de la famille Rel : Relish. Relish nest pas squestr dans le cytoplasme par liaison un inhibiteur de type I-kB, mais par la prsence dans sa rgion C-terminale de domaines ankyrine qui le maintiennent dans le cytoplasme. Son activation ncessite une coupure protolytique pour librer la rgion N-terminale,

Bactries Gram-ngatif Bact Gram-n

PGRP-LE

PGRP-LC

IMD
TAK1 F A D D

b P Relish

D R E D D

g IKK

P
Motifs ankyrines

et autres gnes cibles g

Diptricine Dipt

Figure 2 : Schma rcapitulatif de la voie IMD dans le corps gras de Sch r drosophiles adultes. La voie IMD est active suite une infection par les
bactries Gram ngatif (voir texte pour les dtails).

Introduction

qui contient le domaine Rel, et permettre sa translocation dans le noyau o il va rguler la transcription de gnes cibles (Dushay et al., 1996; Hedengren et al., 1999; Stoven et al., 2000). Un rcepteur transmembranaire de la voie IMD a t rcemment identifi, PGRP-LC (PeptidoGlycan Recognition Protein-LC), qui est capable de reconnatre et de fixer le peptidoglycane des bactries Gram ngatif (Choe et al., 2002; Gottar et al., 2002; Ramet et al., 2002b). Cependant, des donnes exprimentales suggrent que PGRP-LC nest pas le seul rcepteur capable de dtecter les bactries Gram ngatif, il agirait en coopration avec dautres rcepteurs ou co-rcepteurs. Des informations nous indiquent que PGRP-LE pourrait tre un partenaire de PGRP-LC dans ces mcanismes de reconnaissance (Takehana et al., 2002; Takehana et al., 2004). Le rcepteur PGRP-LC active la voie IMD en interagissant directement avec IMD (Choe et al., 2005). Une ramification de la voie se produit en aval de IMD pour activer deux branchements. Dune part, IMD est impliqu dans un complexe adaptateur o il interagit avec deux autres protines domaine DD : dFADD et DREDD, un homologue de la caspase-8 des mammifres (Hu and Yang, 2000; Leulier et al., 2000; Leulier et al., 2002; Naitza et al., 2002). Dautre part, en aval de IMD, on retrouve une kinase homologue de TAK1 (Transforming growth factor-b Activated Kinase 1) (Vidal et al., 2001), qui active un quivalent du signalosome des mammifres. Ce signalosome regroupe les homologues de IKKb et IKKg (I-k B Kinase b et g), cods respectivement par les gnes ird5 et kenny (Lu et al., 2001; Rutschmann et al., 2000c; Silverman et al., 2000). Les actions conjugues du complexe IKK et de la caspase DREDD sont responsables de la coupure protolytique qui active Relish (Stoven et al., 2003) et de lexpression des peptides antibactriens. Les mutants perte-de-fonction de la voie IMD sont sensibles aux infections par les bactries Gram ngatif, et ils prsentent une expression fortement rduite des peptides antibactriens. En revanche, ils ne sont pas sensibles aux infections fongiques, ni aux infections par les bactries Gram positif. Ces mutants ne sont pas affects dans la synthse des peptides exclusivement contrls par la voie Toll, comme la Drosomycine et la Metchnikovine. Le fait que le double mutant imd ;Toll ne soit plus capable de produire les peptides antimicrobiens (Lemaitre et al., 1995) confirme que la rgulation de la synthse des peptides antimicrobiens dpend uniquement des deux voies de signalisation intracellulaires Toll et IMD.

Introduction

3. Reconnaissance des microorganismes et activation des voies de rgulation a. Activation de la voie Toll par des cascades protolytiques Chez lembryon, Toll est activ par Sptzle (Spz), une protine scrte proche des facteurs de croissance des mammifres, qui doit subir une coupure protolytique pour se lier au rcepteur Toll (DeLotto and DeLotto, 1998; Mizuguchi et al., 1998; Weber et al., 2005; Weber et al., 2003). Spz est galement implique, chez ladulte, dans lactivation de la voie Toll au cours de la rponse immunitaire (Lemaitre et al., 1996b) (Figure 1). La cascade protolytique activatrice de la voie Toll chez lembryon nest pas utilise chez ladulte pour la rponse immunitaire. La coupure de Spz, aprs une infection, est ainsi sous le contrle dautres protases dont la plupart sont encore inconnues. Limplication dune cascade protolytique pour lactivation de la voie Toll fut suggre avec la dcouverte quun inhibiteur de protase srine (serpine), appel Necrotic (Nec), contrle la coupure de Spz (Figure 1). La mutation perte-de-fonction nec provoque une coupure constitutive de Spz et lexpression du gne codant la Drosomycine en absence de stimuli immun (Levashina et al., 1999). Depuis, une protase srine implique dans cette voie a t isole: la protase Persphone (Psh) (Ligoxygakis et al., 2002a). La serpine Nec contrle de faon ngative la cascade protolytique qui coupe Spz en agissant probablement sur Psh. De manire surprenante, les mutants psh se comportent comme des mutants classiques de la voie Toll suite des infections par les champignons, alors quils sont rsistants et produisent de la Drosomycine aprs infection par les bactries Gram positif. Ces rsultats mettent en vidence quau moins deux cascades contrlent lactivation de la voie Toll au cours de la rponse immunitaire : lune est active par les champignons et implique la protase Psh et la serpine Nec, lautre est active par les bactries Gram positif. Une question capitale est de comprendre les mcanismes de reconnaissance qui permettent au systme immunitaire de la drosophile de diffrencier les microorganismes et dactiver la voie adquate. b. Les molcules de reconnaissance : la famille des PGRPs et des GNBPs Nos connaissances actuelles font tat de deux familles de molcules responsables de linitiation de la rponse immunitaire. Ces molcules appartiennent aux familles des PGRPs et des GNBPs/bGRPs (Gram Negative Binding Proteins/b-Glucan Recognition Proteins).

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Introduction

Les protines PGRPs ont t isoles pour la premire fois chez les Lepidoptres pour leur capacit fixer le peptidoglycane (Yoshida et al., 1996), un composant de la paroi des bactries. Ce peptidoglycane est prsent dans la paroi interne des bactries Gram ngatif, mais il est particulirement abondant et disponible au niveau de la couche externe des bactries Gram positif. Des protines PGRPs ont par la suite t identifies chez dautres espces dinvertbrs, mais galement chez les vertbrs, mettant en vidence leur conservation au cours de lvolution (Kang et al., 1998). Le gnome de la drosophile contient 13 gnes codant des PGRPs, six dentre eux codent des formes PGRP-S (S pour Small) et sept codent des PGRP-L (Long) (Werner et al., 2000). Les formes S sont de petites molcules circulantes, alors que les formes L, de taille suprieure, sont pour la plupart potentiellement transmembranaires. La premire tude in vivo consacre aux rles des PGRPs dans la rponse immunitaire a confirm lexistence dune deuxime voie dactivation de la voie Toll, par les bactries Gram positif, indpendamment du couple Nec/Psh (Figure 1). Cette tude tait base sur lisolement de la mutation semmelweiss (seml) et lidentification du gne correspondant : PGRP-SA. Les drosophiles mutantes seml se sont rvles sensibles aux infections par les bactries Gram positif, et sont incapables dactiver la voie Toll suite cette infection. En revanche, lactivation de la voie Toll par les champignons reste normale chez ces mutants. PGRP-SA est une protine soluble, circulant dans lhmolymphe, capable de reconnatre le peptidoglycane des bactries Gram positif, et dinitier une voie de signalisation aboutissant lactivation de Toll (Michel et al., 2001). Des tudes biochimiques ont conduit lidentification dune deuxime famille de protines chez les Lpidoptres. Elles prsentent la particularit de fixer in vitro les bactries Gram ngatif ainsi que le b(1-3)glucane, un composant de la paroi des champignons (Kim et al., 2000). Ces protines ont t regroupes sous le nom de GNBPs/bGRPs. Le gnome de la drosophile code trois protines de cette famille, GNBP1,2 et 3. Des rsultats inattendus furent obtenus avec lobservation que le mutant perte-de-fonction GNBP1, appel osiris (GNBPosi), se comportait de faon identique au mutant PGRP-SAseml. Des tudes complmentaires ont mis en vidence que ces deux protines agissent en synergie en formant un complexe PGRP-SA/GNBP1 en circulation (Figure 1). Ce complexe est ncessaire lactivation de la cascade conduisant la coupure de Spz et au dclenchement de la rponse immunitaire (Gobert et al., 2003; Pili-Floury et al., 2004).

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Introduction

Simultanment, des tudes ont rvl que certaines bactries Gram positif peuvent activer la voie Toll indpendamment du complexe PGRP-SA/GNBP1, suggrant une redondance fonctionnelle et lexistence de rcepteurs alternatifs. Ainsi, le rle de PGRP-SD comme rcepteur de certaines bactries Gram positif, telles que Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus ou Streptococcus pyogenes a pu tre tabli (Bischoff et al., 2004). Le rle de GNBP3 a t tudi suite lobtention dun mutant appel hades. Ce mutant perte-de-fonction prsente une grande sensibilit aux infections par les champignons. GNBP3 est engag, en amont du rcepteur Toll, dans lactivation de la rponse antifongique en dfinissant une voie parallle Psh (Gottar et al., soumis) (Figure 1). Deux voies indpendantes semblent ainsi contrler lactivation de la voie Toll suite une infection fongique : la premire requiert Psh et pourrait tre active par des protases o des facteurs de virulence scrts par les champignons. La deuxime est initie par GNBP3 qui reconnat des constituants de la membrane des champignons.

B. Les rponses cellulaires : les hmocytes et leurs fonctions

Les insectes possdent un systme circulatoire ouvert. Lensemble des organes et des hmocytes baigne dans lhmolymphe et le brassage est assur par un organe pulsatile : le vaisseau dorsal, ouvert ses deux extrmits. Chez les vertbrs, le transport de loxygne est assur par les rythrocytes. Les insectes ont une respiration trachenne : loxygne est transport directement aux cellules par le systme trachen qui prsente de trs nombreuses ramifications. Les hmocytes ne sont donc pas impliqus dans ce processus. Les diffrents ordres dinsectes prsentent des populations dhmocytes qui sont trs htrognes. Ces diffrentes populations peuvent nanmoins tre regroupes autour de plusieurs archtypes ayant des fonctions prcises. De faon gnrale, les insectes sont dots de cellules phagocytaires, le plus souvent appeles cellules granulocytes, des cellules ddies aux fonctions dencapsulement, et des cellules responsables des ractions de mlanisation. Ces trois types cellulaires ne sont pas uniques, des variantes existent chez certaines espces. Certains hmocytes se rapprochent de la ligne mylode des mammifres, et il nexiste chez les arthropodes aucune cellule sanguine comparable aux lignes lymphodes.

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Introduction

La premire description des cellules sanguines de Drosophila melanogaster fut ralise par Rizki et ses collaborateurs (revue dans (Rizki, 1978; Rizki and Rizki, 1984) partir de cellules isoles de lhmolymphe et sur des coupes histologiques de larves et dadultes. Ces auteurs ont dcrit trois types de cellules sanguines : les plasmatocytes, les cellules cristaux et les lamellocytes. 1. Les plasmatocytes et la phagocytose a. Description Les plasmatocytes sont des cellules de 10 15 m de diamtre, reprsentant plus de 90% de la population des hmocytes circulants chez la larve. Ils sont le seul type hmocytaire prsent chez ladulte. Les plasmatocytes peuvent sapparenter aussi bien dun point de vue fonctionnel que structural aux monocytes/macrophages des mammifres. Les plasmatocytes sont les phagocytes professionnels : ce sont les seuls hmocytes capables de phagocytose chez la drosophile . Lexamen de ces cellules au microscope lectronique transmission (Figure 3A) permet de constater la prsence dans le cytoplasme de nombreux lysosomes, de phagosomes, et de corps de rsorption, ce qui traduit une activit phagocytaire importante. Les plasmatocytes vont assurer la phagocytose des cellules apoptotiques et des tissus histolyss au cours du dveloppement (Franc et al., 1996; Franc et al., 1999; Lanot et al., 2001). Ces phagocytes sont des acteurs importants dans le remodelage des tissus au cours du dveloppement, dautant plus quils prsentent galement des caractristiques dune synthse protique intense. Des tudes ont montr quils synthtisent des protines structurales de la matrice extracellulaire qui entoure les organes, comme le collagne et la Peroxydasine (Fessler et al., 1994). Les plasmatocytes contribuent galement aux dfenses immunitaires suite une infection, par la phagocytose des agents infectieux (Figure 3B). b. La phagocytose des cellules apoptotiques Pour jouer leur rle de phagocytes, les plasmatocytes doivent tre en mesure de reconnatre les cellules en apoptose ainsi que les microorganismes dtruire afin de permettre une clearance , selon le terme consacr en anglais, du milieu environnant. En ce qui concerne lapoptose, cette reconnaissance requiert la participation, dune part, de la cellule en apoptose, qui doit exhiber des signaux de mort et, dautre part, des macrophages, qui doivent tre en mesure de les interprter efficacement. Deux rcepteurs ont t identifis pour leur

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Figure 3 : Le plasmatocyte. A) un plasmatocyte observ au microscope lectronique

transmission (MET). Les plasmatocytes de drosophile prsentent des caractristiques structurales et fonctionnelles quivalentes aux monocytes/macrophages de mammifres. B) lanalyse au MET rvle la prsence de nombreux phagosomes (flches blanches) renfermant des bactries, dans le cytoplasme des plasmatocytes, ce qui tmoigne de leur activit phagocytaire.

Introduction

rle dans la phagocytose des corps apoptotiques chez la drosophile. Le premier rcepteur identifi est un homologue de CD36 des mammifres, appel Croquemort (Franc et al., 1996; Franc et al., 1999). Ce rcepteur est indispensable pour la reconnaissance des corps apoptotiques et pour leur ingestion par les plasmatocytes au cours de lembryogense. Des travaux rcents ont dvoil lexistence dun deuxime mcanisme de phagocytose, indpendant de Croquemort, et responsable de la phagocytose dune partie des cellules apoptotiques chez lembryon. Ce mcanisme fait appel au rcepteur Draper, un homologue de CED-1 de C. elegans (Manaka et al., 2004). Chez ce nmatode, CED-1 est le rcepteur de lune des deux voies dirigeant la phagocytose des corps apoptotiques. c. La phagocytose des bactries A lheure actuelle, nous connaissons trois rcepteurs phagocytaires la surface des plasmatocytes capables de reconnatre et de promouvoir lingestion des bactries : dSR-CI, PGRPLC, et Eater. dSR-CI est un rcepteur scavenger proche des rcepteurs scavenger de classe A des mammifres (Pearson et al., 1995), son expression est restreinte aux macrophages au cours du dveloppement de la drosophile. dSR-CI prsente une grande affinit pour des ligands anioniques de grande taille (tel que le lipopolysaccharide des bactries Gram ngatif). Des tudes in vitro ont montr que dSR-CI est un rcepteur commun pour les bactries Gram ngatif et Gram positif (Ramet et al., 2001). Jai dcrit plus haut PGRP-LC, un rcepteur de la voie IMD dans les cellules du corps gras. Cependant, PGRP-LC fut identifi comme un rcepteur phagocytaire qui promeut la phagocytose des bactries Gram ngatif (Ramet et al., 2002b). En absence de PGRP-LC, les cellules S2 prsentent des capacits de phagocytose lgrement rduites envers les bactries Gram ngatif. Eater est une protine transmembranaire avec une rgion extracellulaire prsentant des domaines de type Epidermal Growth Factor. Cette protine fut identifie rcemment comme un rcepteur majeur pour la phagocytose des bactries. Des tests in vivo ont montr que lefficacit de phagocytose des bactries Staphylococcus aureus (Gram positif) et Escherichia coli (Gram ngatif) par les plasmatocytes de larves mutantes eater tait fortement diminue (Kocks et al., 2005). Chez les mammifres, de nombreux microorganismes ne sont pas reconnus directement par les macrophages. La phagocytose est rendue possible par lopsonisation, un procd qui ncessite 14

Introduction

le dpt, la surface des microorganismes, de molcules dopsonines. Les opsonines facilitent lattachement des cellules phagocytaires aux microorganismes. Les opsonines sont diverses, et parmi elles la protine C3 du complment est un puissant facteur dopsonisation. Des tudes ont rapport des exemples dopsonisation chez les insectes, et six gnes codant des protines prsentant de nombreuses similitudes avec les protines de la famille du complment C3/a2macroglobuline ont t dcouvertes (Lagueux et al., 2000). Ces protines, appeles TEP (ThioEster-containing Proteins) possdent toutes un peptide signal, suggrant quelles sont scrtes. Aucune tude na pour le moment dmontr une implication de ces protines TEP dans la phagocytose de microorganismes chez la drosophile. Cependant, une tude mene chez le moustique Anopheles gambiae, a permis Levashina et collaborateurs disoler des gnes codant des protines homologues et de prouver que ces molcules agissent en tant quopsonines pour promouvoir la phagocytose des bactries Gram ngatif (Levashina et al., 2001).

2. Les cellules cristaux et la mlanisation a. Description Ces cellules apparaissent au stade embryonnaire, et sont plus tard retrouves en circulation chez la larve. Elles reprsentent alors environ 5% des hmocytes. Cette population disparat au cours de la mtamorphose, et chez les adultes, les cellules cristaux ne sont plus prsentes (Lanot et al., 2001). Les cellules cristaux doivent leur nom la prsence, dans leur cytoplasme, dimportantes inclusions cristallines, non enveloppes par une membrane (Figure 4). Ces inclusions sont supposes correspondre aux enzymes et aux substrats ncessaires la mlanisation. Pour permettre la mlanisation, ces cellules se lysent et librent dans lhmolymphe les enzymes inactives sous formes de zymognes qui peuvent alors tre activs. b. La mlanisation chez les insectes La production de mlanine intervient directement ou indirectement dans les mcanismes de dfense des arthropodes. Dune part, au cours du dveloppement, la cuticule est mlanise, ce qui participe au tannage et au durcissement de cette enveloppe, renforant son rle protecteur. Dautre part, en cas de lsions cuticulaires, une pigmentation apparat au niveau de la blessure, suggrant le lien entre la mlanisation et la cicatrisation. Enfin, la mlanisation est aussi un processus de

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Figure 4 : La cellule cristaux A) Photographie au MET dune cellule

cristaux. Ces cellules se caractrisent par la prsence dans leur cytoplasme de larges inclusions cristallines. Ces cristaux renferment les enzymes et probablement les substrats de la mlanisation, telle que la Prophnoloxydase. B) Les cellules cristaux peuvent tre observes, in vivo, chez des larves ayant subi au pralable un traitement la chaleur de 10 minutes 60C. Ce traitement active vraisemblablement les enzymes de la mlanisation et entrane le noircissement spcifique des cellules cristaux, qui sont alors visibles travers la cuticule.

Introduction

dfense humorale, elle seffectue la surface des parasites et des microbes infectieux (Carton and Nappi, 1997). La cascade de mlanisation est initie suite une infection, par la reconnaissance de motifs microbien: le b(1-3)glucane des champignons et le peptidoglycane des bactries (Ashida and Brey, 1997). Ces motifs microbiens sont dtects par des molcules de reconnaissance, comme les PGRPs et les GNBPs. Les molcules de reconnaissance activent ensuite une cascade protolytique qui aboutit lactivation de lenzyme clef de la biosynthse de la mlanine : la phnoloxydase (PO). Cette enzyme est une oxydorductase qui est synthtise et scrte sous forme dun prcurseur inactif, appel prophnoloxydase (proPO) (Figure 5). Les proPOs sont actives par une coupure protolytique au niveau de la squence N-terminale, cette coupure est assure par une protase srine appele PPAE (ProPhenoloxidase Activating Enzyme). Un modle gnral de la synthse de la mlanine chez les insectes implique une suite de ractions biochimiques dont le substrat initial est la tyrosine ((Christensen et al., 2005). La PO active catalyse loxydation de phnols en quinones, qui vont ensuite polymriser de faon non enzymatique pour former la mlanine (Nappi and Vass, 1993). Les diffrentes tapes de la mlanisation gnrent un certain nombre de composs actifs (quinones, radicaux libres, anions superoxydes, peroxyde dhydrogne) hautement toxiques pour les microorganismes et lhte. Ces molcules modifient le pH et ragissent dans des ractions doxydo-rduction. Elles peuvent se lier de faon covalente avec les membranes cellulaires du parasite, provoquant la dpolymrisation des lipides et la dnaturation des enzymes. Afin dviter des effets dltres sur les cellules de lhte, il est impratif de contenir lactivit des phnoloxydases au site de blessure ou dinfection. La mlanisation est maintenue un niveau local grce lactivit dinhibiteurs de protases, de type serpine, qui empchent lamplification des cascades protolytiques. c. La mlanisation chez la drosophile Le gnome de la drosophile contient trois gnes codant des proPOs : proPO45 (CG8193), proPO54 (CG5779 ou DoxA1) et proPO59 (CG2952 ou DoxA3) (Fujimoto et al., 1995). Peu de choses sont connues sur lexpression de ces trois gnes. Nous savons que des proPOs sont prsentes dans les cellules cristaux mais nous ne savons pas lesquelles. Nanmoins, dautres tissus sont capables de produire au moins une de ces enzymes puisque la proPO54 est retrouve

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Lipopolysaccharide

b-(1,3) glucane

Peptidoglycane

Molcules de reconnaissance

Protases srine

Inhibiteurs de protases

Prophnoloxydase

Phnoloxydase

Phnols, O2 Ph

Quinones

Mlanine Figure 5 : La cascade de la mlanisation chez les arthropodes. (Reprsentation

simplifie). La reconnaissance de motifs microbiens permet de dclencher la cascade dactivation de la phnoloxydase. Cette cascade aboutit la synthse de la mlanine, un polymre de quinones. Daprs Sderhall & Cerenius, 1998 apr S Cerenius,

Introduction

dans lhmolymphe de mouches adultes (Levy et al., 2004), alors quaucune cellule cristaux nexiste ce stade (Lanot et al., 2001). Les diffrents lments de la cascade protolytique qui active les proPOs chez la drosophile ne sont pas bien connus. Les seuls travaux publis concernent une molcule inhibitrice : la serpine27A (Spn27A) (De Gregorio et al., 2002a; Ligoxygakis et al., 2002b). Cette serpine contrle lactivation de la PO chez la drosophile en inhibant la cascade protolytique en absence dinfection. Lidentification de cette serpine nous indique quau moins une protase srine est implique dans lactivation de cette enzyme chez la drosophile. Des travaux rcents ont permis didentifier une protase de type PPAE de la cascade protolytique, code par le gne CG3066 et appele PAE1 (N. Pelte, communications personnelles). La mutation Black cell (Bc) (Rizki et al., 1980) entrane la mort et le noircissement des cellules cristaux, avant quelles nachvent leur processus de diffrenciation (Braun et al., 1998; De Gregorio et al., 2002a). Cependant, la mutation Bc nest pas caractrise et les mutants Bc ne prsentent aucune activit phnoloxydasique dans leur hmolymphe. Ces mutants ne sont pas capables de produire de mlanisation humorale, et meurent dhmorragie lorsque la blessure est trop importante (Ramet et al., 2002a). 3. Les lamellocytes et lencapsulement a. Description Les lamellocytes sont des cellules de grande taille (40 50 mm de diamtre) et de forme aplatie (Figure 6A,B). Lobservation de ces cellules au microscope lectronique transmission permet dobserver un cytoplasme relativement clair renfermant peu dorganites lexception de nombreux ribosomes ltat libre (Lanot et al., 2001). Il a t longtemps propos, partir des travaux de Rizki et collaborateurs que ces cellules taient des plasmatocytes une tape ultrieure de diffrenciation (Rizki and Rizki, 1984). Les auteurs ont dcrit des plasmatocytes dots de pseudopodes quils ont nomm podocytes ; ils ont propos que ces podocytes reprsentent un tat de diffrenciation intermdiaire entre plasmatocytes et lamellocytes. Cependant, Lanot et collaborateurs (2001) ont dmontr que les lamellocytes correspondent un lignage diffrent. Les lamellocytes se diffrencient indpendamment partir de prcurseurs indiffrencis, appels prohmocytes, dans la glande de la lymphe qui est lorgane hmatopotique larvaire (voir partie II). De plus, ils ont montr que les cellules appeles podocytes correspondaient des plasmatocytes qui, sous leffet de lhormone de mue ecdysone, subissaient des modifications 17

L oe

Figure 6 : Le lamellocyte. Observation de lamellocytes (A) au MET dans la glande de la

lymphe et (B) en circulation au microscope contraste de phase. (C,D) Coloration nuclaire au DAPI des hmocytes en circulation chez une larve saine (C) et chez une larve parasite o les lamellocytes se sont diffrencis massivement (D). Encapsulement dun uf de gupe parasite Leptopilina boulardi (E). Un transposon P-LacZ insr dans le gne misshapen, permet la coloration spcifique des lamellocytes lors dune raction histochimique au X-Gal. Luf tu a subi une mlanisation. P: plasmatocyte, L: lamellocyte, oe: uf de L. boulardi. Barre (A): 10m, (B): 20m, (C,D,E): 40m.

Introduction

structurales et fonctionnelles au moment de lempupement (tape de mtamorphose). Ces plasmatocytes sont alors connus sous le terme de macrophages pupaux, et sont engags dans une phagocytose intense des tissus larvaires histolyss. Les lamellocytes sont incapables de phagocytose, ils sont responsables de la formation de capsules autour dlments trangers trop gros pour tre phagocyts par les plasmatocytes, comme par exemple les endoparasitodes. b. Les ractions dencapsulement Comme la mlanisation, lencapsulement de parasites est un mcanisme trs rpandu chez les insectes, il permet disoler un parasite volumineux dans une capsule cellulaire pour lliminer (Figure 6E). Le parasitisme reprsente un rel danger pour les drosophiles dans la nature, en particulier pour les larves qui sont les htes de nombreux Hymnoptres (Carton et al., 1986). On dnombre au minimum une cinquantaine despces diffrentes dHymnoptres qui infestent les larves de drosophile. Les ractions de dfense contre les parasites reprsentent donc un vritable enjeu immunitaire pour la drosophile. Les ractions dencapsulement chez la drosophile reposent sur la diffrenciation des lamellocytes, qui en sont les principaux acteurs. Ces cellules reprsentent un type dhmocytes un peu particulier dans le sens o il est absent de lhmolymphe de larves saines, et ne se diffrencient quen cas de parasitisme. La raction dencapsulement chez la drosophile seffectue en plusieurs tapes. Lors dune infection parasitaire, les plasmatocytes, qui sont les surveillants immunitaires en circulation, forment la premire couche dhmocytes qui entoure le parasite (Russo et al., 1996). Le mcanisme de reconnaissance du parasite est pour le moment inconnu. Lanot et al. (2001) proposent que, lorsque les plasmatocytes rencontrent un parasite quils ne peuvent phagocyter, ils scrtent un signal qui est peru par les prohmocytes de la glande de la lymphe. La nature de ce signal est inconnue, il pourrait tre de type cytokine ou facteur de croissance, et il dclencherait la diffrenciation des prohmocytes en lamellocytes. Suite linfestation, les lamellocytes saccumulent rapidement dans lhmolymphe (Figure 6C,D). Ces lamellocytes sont des cellules avec de grandes capacits adhsives, ils entourent le parasite en formant plusieurs couches, afin de lenfermer dans une capsule cellulaire. En partenariat avec les cellules cristaux, la capsule est ensuite mlanise et devient noire. Le parasite meurt certainement par asphyxie et par laction des intermdiaires de ractions cytotoxiques de la mlanisation (Nappi et al., 1995; Nappi et al., 2000). La capsule reste ensuite une structure inerte,

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Introduction

qui ne gne pas le dveloppement de la drosophile. Elle traverse ltape de mtamorphose sans tre limine, et est retrouve dans labdomen des mouches adultes. Il existe de nombreux mutants qui ont la particularit de prsenter dans leur hmocoele des tumeurs mlaniques. Ces tumeurs ont pour cause des mutations qui provoquent la diffrenciation massive de lamellocytes de faon constitutive, lesquels finissent par sagrger entre eux dans une raction de pseudo-encapsulement (Gateff, 1977; Gateff, 1994). Ces tumeurs peuvent galement rsulter dune raction auto-immune o des tissus larvaires endommags sont encapsuls puis mlaniss. Au laboratoire, pour tester la diffrenciation des lamellocytes et tudier la spcification de ce type hmocytaire, nous utilisons les gupes endoparasitodes Leptopilina boulardi, un Hymnoptre de la famille des eucoilids, parasite des larves de drosophile (Carton et al., 1986). Les infections sont simples raliser. Pour cela, il suffit de mettre en prsence quelques femelles L. boulardi avec de jeunes larves de drosophile durant une priode courte. Je dcrirai dans la partie III de cette introduction les diffrents aspects de cette interaction hte-parasite.

C. La coagulation
1. La coagulation chez la limule La coagulation est un mcanisme de dfense largement rpandu dans le rgne animal. Chez les arthropodes, la coagulation permet la synthse dune matrice utilise pour colmater les blessures, afin de minimiser les pertes dhmolymphe, et immobiliser les microorganismes pour viter les infections. Les donnes les plus compltes concernant la coagulation chez les arthropodes ont t obtenues chez la limule (Limulus polyphemus, Chlicrate) (Iwanaga, 1993; Iwanaga and Kawabata, 1998; Theopold et al., 2004) (Figure 7). La raction de coagulation rsulte dune cascade enzymatique qui est dclenche par le LPS des bactries Gram ngatif et le b(13)glucane des champignons. Les composantes de cette cascade sont stockes dans les granules des hmocytes, et sont rapidement libres dans lhmolymphe lorsque les hmocytes entrent en contact avec un pathogne . La cascade de coagulation aboutit la conversion du coagulogne, une protine soluble dans lhmolymphe, en coaguline insoluble. La cascade de coagulation requiert la participation de trois protases srine libres sous forme de zymognes, les facteurs C, G et B, ainsi que de la proenzyme de coagulation (Iwanaga, 1993; Muta et al., 1990; Muta et al., 1993). Deux voies dactivation sont possibles. En prsence de 19

LPS

LICI-1 b(1-3)glucane

Facteur C

Facteur C

LICI-3

Facteur B

Facteur B

Facteur G

Facteur G

Proenzyme de coagulation

Enzyme de coagulation

LICI-2 Coagulogne Coaguline

Figure 7: La coagulation chez la limule. Le LPS active le zymogne du facteur C en

facteur C actif. Le facteur C actif va ensuite activer le facteur B en facteur B, qui son tour converti la pro-enzyme de coagulation en enzyme de coagulation. Lenzyme de coagulation coupe ensuite deux liaisons peptidiques du coagulogne pour former un gel insoluble de coaguline. La cascade est galement active par le b(1-3)glucane, via un autre zymogne de protase srine, le facteur G, qui active directement la proenzyme de coagulation. Trois inhibiteurs de protases srine contrlent cette cascade: LICI-1,-2 et -3. X reprsente le facteur actif.

Introduction

LPS, le facteur C est activ par une coupure autocatalytique. Deux facteurs sont ensuite activs successivement par protolyse, le facteur B et lenzyme de coagulation, qui convertit le coagulogne. La deuxime voie passe par lintermdiaire du facteur G, qui est activ de faon autocatalytique en prsence de b(1-3)glucane. Le facteur G activ coupe directement la proenzyme de coagulation. Ces ractions sont localises au niveau du site de la blessure par trois inhibiteurs de protase srine de la famille des serpines (Agarwala et al., 1996; Miura et al., 1994; Miura et al., 1995). Ces inhibiteurs nomms LICI 1, 2 et 3 (Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor 1,2,3) sont contenus dans les granules hmocytaires, et leur spectre dinhibition a t dtermin de faon biochimique. LICI 1 inhibe spcifiquement le facteur C activ. LICI 2 inhibe principalement lenzyme de coagulation, mais il peut galement rduire, avec une affinit moindre, lactivit des facteurs C et G. LICI 3 inhibe principalement le facteur G activ. 2. La coagulation chez la drosophile Bien que les mcanismes de coagulation soient relativement bien dcrits chez certains arthropodes comme les crustaces, peu de donnes sont disponibles concernant la coagulation chez les insectes. Chez la drosophile, aucune cascade de protase implique dans la coagulation na pour linstant t mise en vidence. Cependant, le dveloppement rcent dun protocole permettant lisolement et ltude biochimique des caillots dhmolymphe a permis une avance importante dans la description de ce processus chez la drosophile. La formation du caillot dhmolymphe chez les larves de drosophile commence avec la structuration dun coagulum fibreux et visqueux. Ce coagulum correspond un agrgat dhmocytes, de dbris cellulaires et de matrice extracellulaire. Des ractions de cross-linking du coagulum, qui lient de faon covalente les protines, ainsi que la mlanisation, permettent la gnration dune matrice solide et insoluble. Comme chez la limule, la coagulation repose sur des facteurs humoraux, solubles dans lhmolymphe, et sur des facteurs hmocytaires. En ralit, les hmocytes interviennent plusieurs niveaux dans ce processus o ils sont indispensables. En effet, les larves mutantes domino, qui sont dpourvues dhmocytes, sont incapables de coaguler leur hmolymphe lors dune infection ou dune blessure (Scherfer et al., 2004). En premier lieu, les hmocytes scrtent de nombreux constituants qui composent le caillot. Ceci est le cas de lhmolectine (Goto et al., 2003), qui est le principal constituant du coagulum. Cest aussi le cas de la mucine gp150, une glycoprotine portant de nombreuses O-glycolysations

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Introduction

(Korayem et al., 2004). Cette mucine prend part la structuration du caillot dhmolymphe o elle est capable dinteragir avec les bactries pour les immobiliser. Par le biais de la mlanisation, les cellules cristaux participent galement au durcissement du coagulum (Scherfer et al., 2004). Les larves Bc, dpourvues de cellules cristaux, coagulent normalement mais le coagulum nest pas mlanis. Les phnoloxydases ne sont pas les seules enzymes impliques dans ce processus, mais les nombreux intermdiaires cytotoxiques de la raction contribuent llimination des bactries emprisonnes dans le caillot. Chez de nombreux arthropodes, dautres enzymes telles que des transglutaminases et des peroxydases sont utilises pour les ractions de cross-linking des protines du coagulum (Theopold et al., 2004), ce qui pour linstant na pas t dmontr chez la drosophile. De nombreuses protines humorales constituant les caillots dhmolymphe ont t identifies par des tudes biochimiques et protomiques. Nous pouvons citer, parmi les protines connues, la Lipophorine, la Gelsoline, la Tiggrine (une protine de la matrice extracellulaire), et FBP1 (Fat Body Protein 1, une protine produite par le corps gras) (Karlsson et al., 2004; Scherfer et al., 2004).

II. Lhmatopose chez la drosophile

A. Les processus hmatopotiques

Lhmatopose chez la drosophile se droule en deux phases distinctes au cours du dveloppement ((Evans et al., 2003). La premire vague de production des hmocytes a lieu au cours du dveloppement embryonnaire, elle est qualifie de vague primitive. Elle donne naissance la premire population dhmocytes chez la drosophile. La deuxime vague dhmatopose se droule au cours des stades larvaires, au sein dun organe spcialis : la glande de la lymphe. Durant la mtamorphose, la glande de la lymphe disparat et aucune hmatopose nest plus observe chez ladulte (Lanot et al., 2001). 1. Lhmatopose chez lembryon Par des expriences de transplantation, Holz et collaborateurs ont pu identifier les prcurseurs des hmocytes embryonnaires ds le stade blastoderme cellulaire, cest--dire avant la gastrulation (Holz et al., 2003). Les premiers signes de diffrenciation apparaissent aprs la 21

dorsal antrieur ant

Daprs Lebestky et al., 2000 Figure 8 : Reprsentation schmatique de lhmatopose embryonnaire chez Drosophila melanogaster. (A) Embryon de stade 5: le msoderme antrieur est reprsent
en violet, les prcurseurs hmocytaires en vert (he), les cellules prcurseurs de la glande de la lymphe larvaire en bleu (lg). (B) Embryon de stade 11: les nombreux plasmatocytes (bleus) commencent migrer, alors que les cellules cristaux (ccp, rouge) se diffrencient proximit du futur proventricule. Les prcurseurs de la glande de la lymphe commencent migrer dorsalement. (C) Embryon de stade 17: les plasmatocytes sont disperss, les cellules cristaux restent groupes au niveau du proventricule (pv); la glande de la lymphe sorganise dorsalement, le long du vaisseau dorsal (dv).

Introduction

gastrulation, lorsque des cellules du msoderme antrieur procphalique commencent exprimer un marqueur prcoce : la Peroxydasine (Nelson et al., 1994; Tepass et al., 1994) (Figure 8). Ces cellules vont ensuite migrer pour coloniser lensemble de lembryon. Au cours de cette migration, la majorit des hmocytes se diffrencie et acquiert des proprits caractristiques des plasmatocytes, qui sont alors des macrophages actifs qui ingrent les cellules apoptotiques et produisent de la matrice extracellulaire (Franc et al., 1999; Tepass et al., 1994). Simultanment la diffrenciation des plasmatocytes, une deuxime population dhmocytes (de 20 30 cellules) se diffrencie partir de la mme rgion msodermique, mais reste localise au niveau du proventricule de lintestin antrieur. Elle donne naissance aux cellules cristaux (Lebestky et al., 2000; Tepass et al., 1994) (Figure 8). Les prcurseurs de lorgane hmatopotique larvaire se diffrencient, au cours de lembryogense, partir de cellules du msoderme latral (Tepass et al., 1994). Ces cellules migrent ensuite dorsalement pour se localiser de part et dautre du vaisseau dorsal, et former les primordia de la glande de la lymphe (Figure 8). 2. Lhmatopose larvaire A la fin de lembryogense, les primordia de lorgane hmatopotique se rsument en deux lobes, contenant chacun une vingtaine de cellules, localiss le long du vaisseau dorsal de lembryon. Ces cellules sont des prohmocytes, elles ne prsentent aucune des caractristiques morphologiques des hmocytes diffrencis, et nexpriment aucun des marqueurs connus des plasmatocytes ou des cellules cristaux (Jung et al., 2005). Durant les deux premiers stades larvaires, la croissance des lobes de la glande de la lymphe est limite. En revanche, au cours du troisime stade, les hmocytes vont prolifrer activement, la taille des lobes va augmenter, et des lobes supplmentaires vont se diffrencier postrieurement au premier. La glande de la lymphe de larves en fin de troisime stade est compose de 3 6 paires de lobes disposs le long du vaisseau dorsal (Figure 9A). On distingue les lobes primaires (ou antrieurs) des lobes secondaires (ou postrieurs) par leur position le long du vaisseau dorsal. Rcemment, une tude exhaustive de la glande de la lymphe a permis de dcrire la prsence dans les lobes antrieurs de trois rgions qui se distinguent par leur morphologie et par leur composition hmocytaire (Jung et al., 2005) (Figure 9B). Ces trois rgions sont le reflet dune distribution trs organise des hmocytes. A la priphrie des lobes antrieurs, la zone corticale dapparence granuleuse renferme essentiellement des hmocytes diffrencis, cest--dire des

22

lobes antrieurs B

lobes postrieurs

Daprs Jung et al., 2005 Figure 9: La glande de la lymphe. (A) Photographie de la glande de
la lymphe de larve de troisime stade au microscope lectronique balayage. La glande est compose de 3 6 paires de lobes disposs le long du vaisseau dorsal. (B) Reprsentation schmatique de la glande de la lymphe au troisime stade larvaire. MZ: zone mdullaire, CZ: zone corticale, PSC: centre signalisateur postrieur, DV: vaisseau dorsal, PC: cellule pricardiale. (voir texte pour dtails)

Introduction

plasmatocytes et des cellules cristaux. La zone mdullaire, situe dans la rgion mdiane des lobes antrieurs, est dapparence plus lisse que la zone corticale. Elle rassemble une population de cellules plus denses et non diffrencies, les prohmocytes. En accord avec cette distribution cellulaire, les hmocytes de la zone corticale sont caractriss par lexpression de nombreux marqueurs de lignages diffrencis. Au contraire, la zone mdullaire se dfinit par labsence des marqueurs de diffrenciation. Il a t propos que la zone corticale correspondrait un site de maturation des prohmocytes provenant de la zone mdullaire. La troisime rgion des lobes antrieurs correspond un groupe de quelques cellules formant un compartiment indpendant, situ lextrmit postrieure des lobes antrieurs. Ce compartiment correspond au centre de signalisation postrieur (PSC pour Posterior Signaling Center) qui a t propos comme jouant un rle instructeur pour la diffrenciation des cellules cristaux (Lebestky et al., 2003). Les travaux de Jung et collaborateurs (2005) sur la structure de la glande de la lymphe ont identifi le PSC comme tant compos dune population hmocytaire unique, caractrise par lexpression de marqueurs spcifiques, diffrents des marqueurs des hmocytes matures ou indiffrencis. 3. La double origine ontognique des hmocytes de la drosophile Par des expriences de transplantation, Holz et collaborateurs (Holz et al., 2003) ont tabli une carte prcise des tissus msodermiques qui donnent naissance aux hmocytes des deux vagues dhmatopose. Les auteurs ont prlev chez un embryon donneur exprimant la GFP de faon ubiquitaire, des cellules provenant de diffrentes rgions du msoderme. Ces cellules furent ensuite greffes diffrents endroits du msoderme chez des embryons receveurs. Cette technique permet de localiser avec prcision les domaines donnant naissance aux hmocytes embryonnaires ou larvaires. Elle permet galement de dterminer lautonomie cellulaire, et de suivre le destin des cellules greffes travers les diffrents stades du dveloppement. A titre dexemple, lorsquune cellule msodermique provenant de la rgion qui va donner naissance aux hmocytes embryonnaires est greffe dans la mme rgion de lembryon receveur, elle va donner naissance de nombreux hmocytes GFP+ chez lembryon. Dans ce cas, aucun autre tissu nexprime la GFP ce qui dmontre que ces cellules acquirent leur identit hmocytaire de faon prcoce au cours du dveloppement. En effet, les cellules furent prleves au stade blastoderme cellulaire, avant la gastrulation. De faon tout fait surprenante, ces travaux ont mis en vidence, pour la premire fois, que le pool de plasmatocytes embryonnaires subsiste au stade

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Introduction

larvaire et quil constitue lensemble des plasmatocytes circulants chez la larve. De plus, une proportion des hmocytes embryonnaires est toujours visible chez ladulte. Ces rsultats furent un bouleversement pour nos tudes car lide commune tait que la glande de la lymphe reprsentait la principale source dhmocytes larvaires et adultes. Lorsque les cellules du msoderme latral, qui donnent naissance la glande de la lymphe, sont greffes dans la mme rgion de lembryon receveur, les cellules transplantes vont prendre part la glande de la lymphe. Ils ont ainsi observ quen ralit la glande de la lymphe ne libre, en condition normale et sans infection, aucun hmocyte avant la fin du troisime stade larvaire, cest--dire peu de temps avant la mtamorphose.

B. La rgulation gntique de lhmatopose

1. Le facteur GATA Serpent Les facteurs GATA sont des rgulateurs transcriptionnels caractriss par un domaine de liaison lADN largement conserv au cours de lvolution. Chez les vertbrs, les facteurs GATA ont de nombreux rles dans les programmes de dveloppement. Ils sont impliqus dans la diffrenciation et le dveloppement de nombreux organes. Les facteurs GATA 1, 2 et 3 sont ncessaires pour diffrentes tapes de lhmatopose chez la souris (Orkin, 1998) GATA 4, 5, 6 sont ncessaires pour le dveloppement de nombreux organes dorigine msodermiques, comme lintestin et le foie, et sont impliqus dans la diffrenciation de lendoderme (Molkentin, 2000). Cinq homologues des facteurs GATA sont cods dans le gnome de la drosophile, parmi lesquels trois ont t caractriss, serpent (srp), pannier et grain. Leurs fonctions ont t tudies chez lembryon et seule lactivit du gne srp est dmontre pour le dveloppement hmatopotique de la drosophile (Lebestky et al., 2000; Rehorn et al., 1996). Au cours du dveloppement embryonnaire, srp est exprim dans les cellules msodermiques prcurseurs des hmocytes embryonnaires (Rehorn et al., 1996). Lactivit du gne srp est indispensable pour attribuer aux cellules du msoderme antrieur leur identit hmocytaire, et les engager dans les lignages hmatopotiques (Figure 10). Srp reprsente un marqueur hmocytaire prcoce, il est exprim par les prcurseurs avant tout autre marqueur de diffrenciation connu des hmocytes embryonnaires. Il est exprim au stade larvaire par les prohmocytes ainsi que par les hmocytes diffrencis (Lebestky et al., 2000; Rehorn et al., 1996).

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srp (GATA) prohmocyte prolifration

Toll PVF2/PVR Ras/Raf srp (GATA)

diffrenciation

si parasitisme
PVR? gcm/gcm2 ush Ser/N lz JAK/STAT

plasmatocyte

cellule cristaux

lamellocyte

Figure 10: Rgulations gntiques de lhmatopose chez la drosophile. Ce schma regroupe nos connaissances des rgulations gntiques qui
contrlent lhmatopose embryonnaire et/ou larvaire. (voir texte pour dtails)

Introduction

Les embryons mutants srp prsentent trs peu de cellules msodermiques engages dans un destin hmocytaire et aucun de ces hmocytes narrive maturit (Rehorn et al., 1996) Les mutations srp sont ltales en fin dembryogense, ce qui empche ltude de son rle au cours de lhmatopose larvaire. Cependant, on peut supposer quil garde ces mmes fonctions puisquil est prsent dans toutes les cellules de la glande de la lymphe (Lebestky et al., 2000). Des tudes rcentes ont montr que deux isoformes du facteur Srp sont gnres par pissage alternatif (Waltzer et al., 2002) : une isoforme SrpNC contenant deux doigts de zinc en Cet N-terminal, et une isoforme SrpC, qui ne prsente quun seul doigt de zinc en C-terminal. La prsence des doigts de zinc aux extrmits de la protine est une caractristique commune des facteurs GATA des vertbrs. Bien que ces deux isoformes prsentent certaines caractristiques fonctionnelles identiques, SrpNC prsente une affinit de liaison lADN diffrente de celle de SrpC. Le doigt de zinc en N-terminal est un site dinteraction avec des facteurs de lignage qui contrlent les spcifications hmocytaires. Ces interactions vont modifier lactivit du facteur SrpNC qui rgule alors diffremment lexpression de plusieurs gnes cibles (Fossett et al., 2003; Waltzer et al., 2002; Waltzer et al., 2003). Ces interactions seront dcrites plus loin. 2. Les facteurs de lignage Chez lembryon des facteurs de transcription spcifiques de lignage, agissant en aval de Srp, orchestrent les processus de sgrgation des prohmocytes en deux populations cellulaires distinctes : les plasmatocytes et les cellules cristaux. a. Les protines doigt de zinc Glial Cell Missing (Gcm) et Gcm2 Les protines doigt de zinc Gcm et Gcm2 contrlent la prolifration et le dveloppement des plasmatocytes (Alfonso and Jones, 2002; Bernardoni et al., 1997) (Figure 10). gcm (aussi connu sous le nom glide) a t identifi pour son rle lors de la formation du systme nerveux chez lembryon. Gcm y agit comme un commutateur en rgulant lexpression des gnes qui excutent le programme de diffrenciation des cellules gliales, au dtriment des neurones (Hosoya et al., 1995; Jones et al., 1995). gcm2 fut identifi plus tard pour son homologie avec gcm. Sa caractrisation a dmontr quil prsente des fonctions partiellement redondantes avec gcm dans la gliogense et dans le dveloppement des macrophages embryonnaires (Alfonso and Jones, 2002) Gcm et Gcm2 ne sont pas ncessaires pour la spcification initiale des plasmatocytes, ils sont cependant indispensables pour leur maturation. Chez lembryon, en absence de gcm et/ou gcm2, seul un nombre trs limit dhmocytes expriment le marqueur Croquemort des plasmatocytes 25

Introduction

diffrencis, ce qui reflte un dfaut important de diffrenciation (Alfonso and Jones, 2002; Bernardoni et al., 1997). Lexpression de Gcm et Gcm2 dans les hmocytes embryonnaires est sous le contrle transcriptionnel du facteur Srp. Ces deux facteurs sont exprims de faon transitoire et, en fin dembryogense, les plasmatocytes pleinement diffrencis nexpriment plus ces facteurs (Alfonso and Jones, 2002; Bernardoni et al., 1997). b. Le facteur domaine Runt Lozenge Les protines domaine Runt sont connues chez les vertbrs sous la dnomination RUNX. Le domaine Runt est une squence de liaison lADN et les protines correspondantes agissent comme rgulateurs transcriptionnels. Lactivit du facteur RUNX Lozenge (Lz) est indispensable la fois chez lembryon et chez la larve de drosophile pour la diffrenciation des cellules cristaux (Lebestky et al., 2000) (Figure 10). Les mutants thermosensibles lzts1, placs temprature restrictive (29C), sont totalement dpourvus de cellules cristaux, alors que la diffrenciation des plasmatocytes nest pas affecte. Lexpression de Lz disparat chez les embryons perte-de-fonction srp, ce qui place Lz en aval du facteur Srp, de mme que Gcm/Gcm2. Lz est exprim par les pro-cellules cristaux, mais galement par les cellules cristaux diffrencies, y compris celles de la glande de la lymphe jusqu la fin des stades larvaires. Cette expression ininterrompue suggre que Lz est galement important pour le maintien de cette population hmocytaire ou dans leur fonction. c. La protine Friend Of GATA U-Shaped Les protines de la famille des Friend Of GATA (FOG) sont des protines doigt de zinc qui agissent comme rgulateurs fonctionnels des facteurs GATA. Ces protines peuvent tout aussi bien agir en tant que coactivateurs et que corpresseurs. Les protines FOG modifient les activits rgulatrices des facteurs GATA en interagissant directement avec leur N-finger (doigt de zinc Nterminal). Le facteur U-Shaped (Ush) de drosophile est lhomologue des protines FOG de mammifres. Ce facteur est identifi comme un rgulateur ngatif du dveloppement des cellules cristaux (Fossett et al., 2001) (Figure 10). Ush est exprim par les prohmocytes et les plasmatocytes tout au long du dveloppement embryonnaire et larvaire, et son expression chez lembryon dpend de lactivit du facteur Srp. Une expression accrue de Ush dans les 26

Introduction

prohmocytes embryonnaires rduit de faon importante le nombre de cellules cristaux, alors quune perte-de-fonction entrane une augmentation de cette population (Fossett et al., 2001). La rpression de ush est, de ce fait, une tape importante pour permettre le dveloppement des cellules cristaux. d. Les actions combinatoires de Srp, Lz et Ush Des tudes biochimiques ont rcemment mis en vidence que la protine FOG Ush inhibe le dveloppement des cellules cristaux en rprimant lactivit du facteur GATA SrpNC (Fossett et al., 2003) : i) la surexpression msodermique de SrpC ou de SrpNC suffit augmenter le nombre de cellules cristaux. ii) la surexpression combinatoire de Ush avec SrpC provoque galement une augmentation du nombre de cellules cristaux, iii) alors que la surexpression de Ush conjointement SrpNC bloque compltement leur diffrenciation. Ces expriences montrent que Ush ne peut pas interagir avec SrpC, qui na pas de N-finger, et quil ne peut interagir quavec SrpNC pour interfrer avec son rle promoteur dans le dveloppement des cellules cristaux. Deux tudes indpendantes ont mis en vidence que Srp agit galement de faon synergique avec Lz pour induire la diffrenciation des cellules cristaux (Fossett et al., 2003; Waltzer et al., 2003). Des expriences in vitro ont montr que ces deux protines interagissent par lintermdiaire des motifs doigt de zinc (Srp) et du domaine Runt (Lz). En effet, lexpression msodermique de Lz seule ne rprime pas la transcrition de Ush dans les prohmocytes. En revanche, elle est fortement inhibe lorsque Lz et SrpNC sont surexprims ensemble. En accord avec ces observations, les surexpressions individuelles des facteurs Lz et SrpNC nentranent quune augmentation modeste du nombre de cellules cristaux, alors que la double surexpression Lz et SrpNC provoque une augmentation bien plus importante. Le facteur SrpNC prsente une activit versatile en fonction du partenaire, Ush ou Lz, avec lequel il interagit. Des donnes suggrent que Ush et Lz sont en comptition pour se fixer au facteur Srp, et que les interactions qui seffectuent dpendent des concentrations relatives de ces trois protines (Fossett et al., 2003) dans les prcurseurs hmocytaires. La nature de ces interactions dtermine le programme de diffrenciation enclench.

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3. La voie de signalisation Notch La voie de signalisation Notch est conserve au cours de lvolution, elle est prsente autant chez les invertbrs que chez les vertbrs o elle joue des rles essentiels dans le dveloppement (Lai, 2004). La voie Notch agit frquemment en limitant les choix de diffrenciation de cellules prcurseurs, grce un mcanisme de communication de cellule cellule. Notch (N) est un rcepteur transmembranaire prsent la surface de nombreux types cellulaires. Pour tre activ, Notch doit interagir avec lun de ses ligands transmembranaires, prsent la surface des cellules voisines. Lactivation du rcepteur Notch entrane la coupure protolytique du domaine intracellulaire, qui devient alors un facteur de transcription. Il est ensuite achemin dans le noyau o il rgule lexpression des gnes cibles. La voie Notch fut initialement identifie pour son rle dans le dveloppement de laile chez la drosophile. Dans ce modle, elle rgule de nombreux processus dveloppementaux, parmi lesquels la formation du systme nerveux central et priphrique, la myogense, la cardiogense, la formation des yeux et des appendices adultes (Lai, 2004; Portin, 2002). Le gnome de la drosophile code un seul rcepteur Notch, et deux ligands, Serrate (Ser) et Delta. En comparaison, chez les mammifres, on dnombre quatre rcepteurs Notch (Notch1-4) et cinq ligands (Delta-like 1,2,3 et Jagged 1,2). Une tude rcente a dmontr le rle crucial de la voie Notch dans la spcification des prcurseurs de la glande de la lymphe, au cours de lembryogense (Mandal et al., 2004). Cette tude est en faveur de lexistence dun hmangioblaste chez la drosophile. Lhmangioblaste des vertbrs correspond une cellule bipotentielle dorigine msodermique, qui peut donner naissance la fois aux cellules sanguines et aux cellules vasculaires. Lexistence dun hmangioblaste chez les embryons de drosophile est suggre par lobservation que les cellules de la glande de la lymphe, ainsi que les cardioblastes (cellules qui forment le vaisseau dorsal) et les cellules pricardiales (qui sparent les lobes successifs de la glande de la lymphe), drivent chez lembryon de progniteurs msodermiques communs. Le dveloppement de cet hmangioblaste prsomptif a rvl que la voie Notch favorise la spcification des prcurseurs de la glande de la lymphe en rprimant celui des cardioblastes (Mandal et al., 2004). Une deuxime fonction, plus tardive, pour la voie Notch dans lhmatopose fut dcrite par deux tudes simultanes. En effet, la voie Notch joue un rle instructif pour la diffrenciation des cellules cristaux au stade larvaire (Duvic et al., 2002; Lebestky et al., 2003) (Figure 10). Des mutations perte-de-fonction pour Notch rduisent de faon importante le nombre des cellules

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cristaux, alors que lexpression dune forme constitutivement active du rcepteur provoque la diffrenciation dun grand nombre de ces hmocytes. Lexpression de Lz dans les cellules cristaux est contrle par la voie Notch (Lebestky et al., 2003). Dans ce processus, le ligand Ser assure lactivation du rcepteur Notch. En effet, bien que la surexpression des deux ligands Ser et Delta puisse provoquer une diffrenciation massive de cellules cristaux, seule la perte de fonction de Ser affecte leur diffrenciation (Duvic et al., 2002). Lanalyse de lexpression de Ser dans la glande de la lymphe a conduit lidentification du centre de signalisation postrieur (PSC) puisque cette expression est restreinte ce groupe de cellules (Lebestky et al., 2003). Il est suggr que les cellules du PSC interagissent avec les prohmocytes de la glande de la lymphe pour induire, via linteraction Ser/Notch, la diffrenciation des cellules cristaux. 4. Le rcepteur PVR (PDGF-VEGF Receptor) Chez les mammifres, les rcepteurs des facteurs de croissance Platelet Derived Growth Factors (PDGFs) et Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs) sont des rcepteurs de type tyrosine-kinase, impliqus de faon gnrale dans des processus de prolifration et de diffrenciation cellulaire. Deux facteurs de croissance de type PDGF (PDGF-A et B) et deux rcepteurs PDGFR (PDGFRa et b) sont caractriss chez les mammifres (Hoch and Soriano, 2003). Des expriences de knock out ont dmontr que PDGF-B et PDGFRb sont essentiels dans les embryons de souris pour le dveloppement vasculaire. PDGF-A et PDGFRa ont des expressions plus ubiquitaires ce stade chez la souris, o ils assurent plusieurs fonctions essentielles comme les migrations cellulaires, le dveloppement de cellules neurales du systme nerveux central et le dveloppement de la crte neurale. Trois rcepteurs VEGFR sont connus chez la souris (VEGFR-1, 2, 3), ainsi que cinq ligands (VEGF-A , B, C, D et PIGF) (Ferrara et al., 2003). Les rcepteurs VEGFR-1 et VEGFR-2 sont tous deux essentiels pour la morphogense et le dveloppement du systme vasculaire. Ces deux rcepteurs remplissent dautres fonctions importantes. Entre autres, VEGFR-1 est prsent la surface des monocytes-macrophages et est impliqu dans la migration des monocytes. VEGFR-2 est prsent la surface des cellules souches hmatopotiques et est indispensable leur dveloppement.

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Le gnome de la drosophile code un seul rcepteur tyrosine kinase homologue des rcepteurs PDGFs et VEGFs de mammifres, appel PVR (pour PDGF VEGF Receptor), il code galement trois ligands PVF1, 2 et 3 (Cho et al., 2002; Duchek et al., 2001). Les rcepteurs PDGFR et VEGFR sont impliqus chez la souris dans les migrations cellulaires en direction des ligands attracteurs, un phnomne connu sous le nom de chimiotactisme. Un tel rle pour PVR fut galement dcrit pour la migration des cellules somatiques vers loocyte, qui scrte PVF1, dans la chambre de luf au cours de lovogense (Duchek et al., 2001). PVR dirige galement la migration des hmocytes embryonnaires (Cho et al., 2002). De faon intressante, les ligands PVF sont exprims par les tissus qui longent les voies de migration empruntes par les plasmatocytes embryonnaires (Cho et al., 2002). En accord avec cette fonction, la premire expression de PVR apparat dans les plasmatocytes embryonnaires (Heino et al., 2001). Son expression est ensuite maintenue dans les plasmatocytes diffrencis, ainsi que dans les plasmatocytes de la glande de la lymphe (Munier et al., 2002). Cependant, les rsultats dune tude plus rcente suggrent que les dfauts de migration des plasmatocytes chez les embryons perte-de-fonction PVR auraient pour cause une diminution de la survie des hmocytes dans ce contexte gntique (Bruckner et al., 2004). Ces auteurs ont montr que PVR a un effet antiapoptotique dans les hmocytes embryonnaires. Un rle supplmentaire pour PVR et son ligand PVF2 dans la prolifration des prcurseurs hmocytaires a t montr chez la larve (Munier et al., 2002). De faon spectaculaire, la surexpression ubiquitaire de PVF2 provoque une surprolifration des hmocytes larvaires (jusqu 300 fois), au dtriment des programmes de diffrenciation. Cependant, ces rsultats ne sont pas en accord avec ceux de Jung et collaborateurs (2005) qui ont gnr des clones mutants PVR- dans la glande de la lymphe. Ces auteurs ont observ quune perte-de-fonction PVR affecte le dveloppement des plasmatocytes. Le rcepteur PVR et la voie Ras/Raf/MAPK Les voies Ras/Raf et MAPK sont des cibles potentielles du rcepteur PVR du fait de lobservation que PVR induit lactivation de la voie MAPK dans les cellules Schneider en culture (Duchek et al., 2001), et que lexpression de PVR concide avec lactivation de MAPK dans les hmocytes embryonnaires (Bruckner et al., 2004; Cho et al., 2002). Brckner et collaborateurs ont dmontr que la surexpression dune forme constitutivement active de Ras chez les embryons PVR- est capable de sauver le phnotype de dfaut de migration et de mort par apoptose des plasmatocytes embryonnaires (Bruckner et al., 2004). Ces rsultats suggrent une coopration 30

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fonctionnelle entre PVR et la cascade cytoplasmique Ras/Raf/MAPK pour relayer les informations de survie et de migration. Plusieurs tudes ont galement impliqu la voie Ras/Raf/MAPK dans la prolifration des hmocytes chez la drosophile. Lexpression dune forme active de Ras dans la population hmocytaire provoque une prolifration importante des cellules sanguines. Cette signalisation est relaye par la voie D-Raf/MAPK(Asha et al., 2003; Kwon et al., 2000). Aucune tude na pour le moment dmontr une pistasie entre PVR et les voies Ras/Raf/MAPK dans le contrle de la prolifration des hmocytes chez la drosophile. Cependant, compte tenu des rsultats dcrits cidessus, il est vraisemblable que les voies Ras/Raf et MAPK agissent sur la prolifration des hmocytes en aval de PVR. 5. La voie JAK/STAT La voie Janus kinase (JAK)/Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) prsente une grande conservation de ses composantes et de ses fonctions au cours de lvolution. Les Janus kinases sont des tyrosine kinases cytoplasmiques qui ont pour rle de transmettre les signaux mis par diffrentes cytokines lorsque celles-ci se lient leurs rcepteurs (pour revue (O'Shea et al., 2002; Schindler, 2002). La fixation du ligand sur le rcepteur de cytokine entrane la dimrisation du rcepteur ainsi quun changement conformationnel de sa rgion intracytoplasmique. Ce changement de conformation appose les kinases JAK qui leur sont associes, lesquelles sactivent par transphosphorylation de rsidus tyrosines clefs. Ces rsidus tyrosines reprsentent des sites damarrage pour les facteurs STAT localiss dans le cytoplasme, ainsi que pour dautres protines qui reconnaissent ces motifs. Une fois recruts, les facteurs STAT sont activs par des phosphorylations qui sont assures par la JAK. Les facteurs STAT activs sont alors transports dans le noyau pour rguler la transcription de gnes cibles. Lactivit de la voie JAK/STAT est rgule par des inhibiteurs de deux types : les PIAS (Protein Inhibitor of Activated STAT) qui se fixent directement aux facteurs STATs, et les SOCS (Suppressor Of Cytokine Signaling) qui inhibent lactivit du rcepteur ou de la kinase JAK (Hou et al., 2002) Chez les mammifres, quatre JAK kinases et sept STAT ont t caractriss et sont impliqus dans de nombreux processus de prolifration et de diffrenciation cellulaire. On dnombre galement cinq protines PIAS et au minimum huit protines de type SOCS. Chez la drosophile, la voie JAK/STAT a initialement t identifie pour son rle dans le dveloppement embryonnaire o elle contrle la segmentation (Binari and Perrimon, 1994; Perrimon and Mahowald, 1986). La caractrisation de la voie JAK/STAT chez la drosophile a fait 31

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apparatre une image simplifie par rapport aux mammifres. Le gnome de la drosophile ne code quune seule kinase de type JAK appele Hopscotch (Hop), et une seule protine STAT nomme Stat92E (aussi connue sous le nom de Marelle). A lheure actuelle, un seul rcepteur de la voie, appel Domeless (Dome) (Brown et al., 2001; Chen et al., 2002), ainsi que trois ligands, Unpaired (Upd) (Harrison et al., 1998), Upd2 et Upd3 (Agaisse et al., 2003; Gilbert et al., 2005; Hombria and Brown, 2002) sont identifis. Un seul gne codant un homologue des PIAS de mammifres et agissant en aval de Hop est prsent chez la drosophile (Betz et al., 2001), alors que plusieurs gnes codant des homologues de protines SOCS ont t dcrits (Callus and Mathey-Prevot, 2002). Des mutations qui produisent une forme constitutivement active de la kinase Hop, telle que la mutation dominante hopTum-l (hopTumorous-lethal), affectent de faon importante lhmatopose et provoquent des phnotypes svres. La mutation hopTum-l est associe une glande de la lymphe hypertrophie, et une diffrenciation anormale de nombreux lamellocytes avec formation de pseudo-tumeurs mlaniques (Harrison et al., 1995; Luo et al., 1995). Il a souvent t rapport que la mutation hopTum-l provoque galement une surprolifration des hmocytes, plaant ainsi la voie JAK/STAT dans le contrle de la prolifration des prcurseurs hmocytaires (Harrison et al., 1995; Luo et al., 1995). Cependant, Remillieux-Leschelle et collaborateurs ont montr que les mutations perte-de-fonction hopM38 nont aucun effet sur la densit hmocytaire ou sur les hmocytes en circulation (Remillieux-Leschelle et al., 2002). En contexte hopTum-l, les mutations qui diminuent lactivit de Stat92E ont un effet suppresseur sur la diffrenciation des lamellocytes et la formation des pseudo-tumeurs (Dearolf, 1998). Ces rsultats suggrent que la voie JAK/STAT rgule lexpression des gnes impliqus dans la diffrenciation des lamellocytes (Figure 10). Cette hypothse fut confirme par les travaux de Sorrentino et al., qui ont montr que la diffrenciation des lamellocytes est dpendante de Hop et Stat92E {Sorrentino, 2004 #458}. Les mutations invalidant domeless et unpaired sont ltales embryonnaires ; de ce fait, les rles potentiels de ces deux protines dans lhmatopose larvaire de la drosophile nont, pour le moment, pas pu tre tablis. upd2 et upd3 ont t identifis rcemment pour leur homologie avec upd (Hombria and Brown, 2002). Il a t montr que des infections bactriennes induit dans les hmocytes des mouches adultes la production et la scrtion de la cytokine Upd3 (Agaisse et al., 2003). Une fois scrte, Upd3 active la voie JAK/STAT dans les cellules du crops gras, laquelle va alors induire lexpression de la protine de stress TurandotA. Cependant, lors dune infection par les bactries Gram n gatif, la voie IMD seule par lintermdiaire de son rcepteur PGRP-LC est capable dinduire lexpression de totA. 32

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6. La voie Toll Lindication que la voie Toll est implique dans le dveloppement des hmocytes provient de lobservation que les mutations qui affectent lactivit de cette voie ont un effet sur la population hmocytaire chez la larve. Les mutations perte-de-fonctions de Toll, tube et pelle entranent une diminution de la concentration des cellules sanguines en circulation (Qiu et al., 1998). Nous savons aussi que la mutation Toll10B, qui engendre un rcepteur Toll constitutivement actif, provoque un phnotype comparable celui observ avec la mutation hopTum-l, cest--dire une augmentation du nombre dhmocytes circulants, la prsence de nombreux lamellocytes avec formation de pseudo-tumeurs mlaniques. Des tudes plus rcentes confirment le contrle de la voie Toll sur la prolifration des cellules sanguines en circulation (Sorrentino et al., 2004). Cependant, elles suggrent que la diffrenciation des lamellocytes dans le contexte Toll10B serait due une activation secondaire qui nest pas directement lie la mutation. Cette suggestion dcoule du fait que les larves mutantes pour la voie Toll, contrairement aux larves stat92E, gardent leur capacit produire des lamellocytes un niveau statistiquement identique aux larves contrles. La voie Toll semble donc agir uniquement dans les mcanismes de prolifration des hmocytes, et nest pas implique dans la diffrenciation des lamellocytes.

C. Comparaison des systmes hmatopotiques des mammifres et de la drosophile

Chez la souris, les premires cellules hmatopotiques apparaissent peu aprs la gastrulation dans le msoderme extra-embryonnaire du sac vitellin (SV), au sein de structures nommes lots sanguins , dans lesquelles cellules endothliales et hmatopotiques se diffrencient simultanment. Cette premire vague de production de cellules souches hmatopotiques (CSH), ou hmatopose primitive, engendre essentiellement des rythrocytes primitifs transitoires. Lhmatopose dfinitive prend place secondairement, dans les tissus embryonnaires et foetaux, le foie, le thymus, la rate, la moelle osseuse (et la bourse de Fabricius chez les oiseaux), lorsque ces tissus sont coloniss par une deuxime vague de CSH extrinsques circulantes. Il a t dmontr que lensemble des cellules hmatopotiques prsentes aprs la naissance provenaient de lembryon lui-mme, savoir du msoderme de la splanchnopleure paraaortique. Cependant, labsence de participation du SV lhmatopose dfinitive des mammifres reste encore tablir exprimentalement.

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Introduction

Les vertbrs ont un rpertoire vari de cellules sanguines possdant diverses fonctions. Cependant toutes ces cellules drivent du mme groupe de CSH pluripotentes. De telles cellules souches nont pas t identifies chez la drosophile, nanmoins les donnes concernant les prohmocytes et leur capacit se diffrencier en nimporte quel type hmocytaire suggrent que ces cellules reprsentent des prcurseurs hmatopotiques pluripotentiels. Jai dcrit dans la partie prcdente les facteurs et les voies de signalisation qui contrlent, chez la drosophile, les diffrents aspects de lhmatopose. La drosophile possde un systme hmatopotique relativement simple compar celui des mammifres, puisque les cellules sanguines sont moins diversifies et les fonctions moins nombreuses. En faisant le parallle entre le contrle gntique du dveloppement des cellules sanguines chez la drosophile et chez les mammifres, nous constatons de nombreuses similitudes entre ces deux systmes. Cette partie de lintroduction est consacre la prsentation la rgulation gntique de lhmatopose des mammifres, qui met en jeu les voies de signalisation et les facteurs de transcription dcrits prcdemment chez la drosophile. 1. Les facteurs GATA, FOG et Runx dans lhmatopose des mammifres Au total, six facteurs GATA sont connus chez la souris, GATA-1,2,3 ont des rles prpondrants dans le dveloppement des cellules sanguines, GATA-4,5,6 sont impliqus dans la formation de lendoderme et dans la diffrenciation de plusieurs organes dorigine endodermique. Chez la drosophile, le facteur GATA Srp est indispensable aux processus hmatopotiques pour confrer aux prcurseurs msodermiques une identit de cellules sanguines (Rehorn et al., 1996). Le dveloppement des cellules sanguines chez les mammifres requiert galement lactivit dun membre de cette famille, GATA-2. GATA-2 contrle la prolifration et la survie des cellules souches. Linactivation gntique de srp chez les embryons de drosophile et celle de GATA-2 chez la souris bloquent les processus hmatopotiques, conduisant une perte totale de toutes les cellules sanguines (Fossett et al., 2001) Srp nest pas uniquement requis pour le dveloppement des prcurseurs hmocytaires de la drosophile, il va galement diriger les programmes de diffrenciation des plasmatocytes et des cellules cristaux. Dune faon analogue, des facteurs GATA sont responsables de la spcification de lignages cellulaires chez les mammifres : GATA1 est requis pour lhmatopose dfinitive et permet la diffrenciation des rythrocytes, des mgacaryocytes et des osinophiles, alors que GATA-3 est impliqu dans la diffrenciation des lymphocytes T.

34

Introduction

Prcdemment, jai dcrit chez la drosophile la protine Ush, homologue des co-rgulateurs transcriptionnels de la famille des FOG de mammifres. Les protines de cette famille se fixent aux facteurs GATA pour moduler leur activit transcriptionnelle. SrpNC, sous forme libre est capable dinduire lexpression de Lz, permettant ainsi le dveloppement des cellules cristaux. En interagissant avec Ush, SrpNC devient alors un antagoniste des cellules cristaux. Ce complexe rprime lexpression de lz, engageant ainsi les cellules dans un destin plasmatocyte (Fossett et al., 2003). Dune faon similaire, chez la souris, GATA-1 va promouvoir la diffrenciation des osinophiles alors que sous forme complexe FOG-1, il inhibe la diffrenciation de ce type de cellules sanguines (Querfurth et al., 2000). En revanche la formation du complexe GATA-1/FOG1 est indispensable pour activer la diffrenciation des rythrocytes et des mgacaryocytes (Tsang et al., 1998; Tsang et al., 1997). 2. Les facteurs domaine Runt Le dveloppement des cellules cristaux chez la drosophile est plac sous le contrle transcriptionnel de Lz (Lebestky et al., 2000), un membre de la famille des transactivateurs Runx caractriss par la prsence dun domaine Runt. Chez les mammifres, Runx1 est requis trs tt au cours de lembryogense pour spcifier les prcurseurs mylodes. Les souris dficientes Runx1-/meurent un stade prcoce suite un arrt du dveloppement des cellules sanguines (Coffman, 2003). De faon intressante, la protine Lz prsente une grande identit de squence avec Runx1 (71% au niveau du domaine Runt), qui est galement connu sous le nom de AML-1 chez lhomme. AML-1 est une cible frquente de translocations chromosomiques lorigine de leucmies mylodes aiges (Lenny et al., 1997). 3. La voie JAK/STAT Chez la drosophile, une perte dactivit de la voie JAK/STAT entrane une baisse de la densit des hmocytes ainsi quun dfaut de diffrenciation des lamellocytes. Une suractivation de cette voie provoque, au contraire, une diffrenciation abondante de lamellocytes. De nombreuses tudes de Knock-Out chez la souris, ainsi que lanalyse de mutations chez des personnes malades, indiquent que la voie JAK/STAT joue galement des rles fondamentaux dans le dveloppement hmatopotique des mammifres (Schindler, 2002) Ainsi, des souris dficientes JAK2-/- meurent prmaturment au cours de la gestation suite un blocage de lrythropose. En accord avec un rle de JAK2 dans lhmatopose, une translocation chromosomique qui gnre une protine de fusion entre le facteur de transcription 35

Introduction

Tel et la kinase JAK2 est lorigine de certaines leucmies (O'Shea et al., 2002). Dans ce contexte gntique, les perte-de-fonction Stat5 ont un effet suppresseur sur les transformations provoques par la protine de fusion Tel-JAK2. Linactivation de JAK3 provoque chez lHomme de graves immunodficiences. Lanalyse de souris JAK3-/- a permis de caractriser cette immunodficience qui est due labsence de dveloppement des lymphocytes T et des cellules NK. Les souris dficientes stat5a/b-/- se caractrisent par une absence de cellules Natural Killer, et des dfauts de dveloppement des lymphocytes B et T. Elles prsentent galement une faible densit cellulaire au niveau de la moelle osseuse et des tudes in vitro avec des prcurseurs mylodes stat5a/b-/- montrent quils ont une survie limite et sont incapables de prolifrer (pour revue, (Hou et al., 2002). Ces quelques exemples, en conjonction avec les donnes qui impliquent la voie JAK/STAT dans la production des hmocytes chez la drosophile, suggrent une conservation de la fonction de la voie JAK/STAT dans les mcanismes hmatopotiques au cours de lvolution. 4. La voie Notch Chez les mammifres, on dnombre quatre rcepteurs Notch, qui interagissent avec les protines de la famille Jagged/Delta. Le rcepteur Notch1 est prsent la surface des prcurseurs lymphodes communs aux cellules B et T, et de nombreuses tudes ont montr que Notch1 est un composant clef pour la spcification des lymphocytes T (pour revue, (Bartholdy and Matthias, 2004; Busslinger et al., 2000). En effet, lactivation de Notch1 dans les prcurseurs lymphodes est ncessaire pour initier la lymphopose T et assurer une premire tape de diffrenciation des prcurseurs en pro-cellules T. En absence de Notch1, la lymphopose T sarrte une tape trs prcoce. En revanche le dveloppement des cellules B nest pas affect. Le dveloppement des lymphocytes T se droule au niveau du thymus alors que les lymphocytes B se dveloppent au niveau de la moelle osseuse. Lexpression dune forme active de Notch1 dans les cellules souches de la moelle osseuse suffit les diffrencier en cellules T immatures, aux dpends du dveloppement des cellules B dont la spcification se trouve inhibe. Au contraire, la dltion de Notch1 promeut le dveloppement des lymphocytes B dans le thymus. Au niveau molculaire, il a t prouv que cette inhibition est due lintervention de Notch1 qui interfre avec le facteur de transcription E47, dont lactivit est indispensable dans les premires tapes de la lymphopose B.

36

Introduction

5. Les voies Ras/Raf et VEGFR dans lhmatopose des mammifres Le facteur de croissance VEGF et son rcepteur VEGFR-2 jouent un rle prpondrant, aux premires tapes du dveloppement embryonnaire. Ils stimulent la prolifration initiale des prcurseurs msodermiques communs aux lignes endothliale et hmatopotique, ainsi que leur migration vers les premiers sites de production hmatopotique extra- et intra-embryonnaires. Les souris dficientes pour le gne VEGFR-2, lun des trois rcepteurs connus du VEGF, meurent prcocment en raison de labsence de diffrenciation dlots sanguins dans le sac vitellin, qui entrane labsence de cellules endothliales et de cellules hmatopotiques (Clauss, 2000). La voie Ras/Raf est implique dans la rgulation de la lymphopose B une tape prcoce, savoir la maturation des pr-pro-cellules B en pro-cellules B. Cette tape de transition peut tre fortement ralentie par lexpression de dominants ngatifs de Ras. Le dveloppement normal de la lymphopose peut tre rtabli par lexpression dune forme active de Raf-1, confirmant ainsi limplication de la voie Ras/Raf dans ce processus (Iritani et al., 1997).

III.

Les interactions htes-parasitodes chez la drosophile

Un objectif important de mon travail de thse tait lidentification de gnes requis dans

les processus de diffrenciation des lamellocytes, en rponse une infection parasitaire. Ltude de cette facette de la rponse immunitaire de la drosophile ncessite une connaissance prcise des interactions qui se produisent entre lhte et son parasite lors dune infection. Dans la premire partie de ce chapitre, je prsenterai des donnes gnrales sur le parasitisme chez les insectes. Ensuite jexposerai des caractristiques plus prcises concernant les parasitodes Hymnoptres et les mcanismes de virulence quils ont dvelopp. Dans la dernire partie de ce chapitre, je prsenterai plus particulirement la gupe endoparasitode Leptopilina boulardi, que nous utilisons au laboratoire pour parasiter nos larves de drosophile. Ces infections nous permettent dtudier les processus de diffrenciation des lamellocytes, produits uniquement en rponse ce type dinfestation.

A. Le parasitisme chez les Insectes

Le parasitisme est omniprsent. La plupart des espces prsentes sur notre plante sont parasites au moins une fois au cours de leur vie. Les parasites sont des organismes qui exploitent 37

Introduction

des ressources fournies par un autre individu non apparent, appel hte. Les parasites ne tuent gnralement pas leurs htes, mme sils se dveloppent ses dpends. tant donn que les ressources consommes par les parasites ne peuvent pas tre utilises par lhte pour ses fonctions vitales, cest--dire la croissance, la survie et la reproduction, on assiste gnralement une rduction de la valeur slective des htes parasits. Le parasitisme reprsente une contrainte slective sur lvolution des organismes htes, au mme titre que la prdation ou la comptition. Lvolution des parasites nest pas indpendante de lvolution de leurs htes. De nombreuses interactions htes-parasites ont converg vers des processus de co-volution qui, dans la plupart des cas, nimpliquent quune espce hte et une espce parasite. Ce processus se traduit par lmergence de mcanismes dadaptation de la part de lhte lui permettant de se dfendre contre linfestation, et des contre-adaptations de la part du parasite lui permettant de contourner le systme immunitaire de lhte. Les mcanismes dfensifs des htes parasits peuvent prsenter plusieurs formes, actives ou passives. Parmi les dfenses passives, les modifications du comportement permettent de minimiser limpact du parasitisme sur la dynamique de la population. Par exemple, les femelles du grillon du foyer, Acheta domesticus, la suite de linjection dune bactrie pathogne pondent le lendemain plus doeufs que des tmoins sains. De faon similaire, certaines drosophiles modifient galement leur comportement suite des infections parasitaires. Les mles de la drosophile Drosophila nigros-piracula infests par lacarien ectoparasite Macrocheles subbadius vivent moins longtemps que des mles sains mais, avant leur mort, paradent plus et saccouplent davantage (Michalakis and Hochberg, 1994; Thomas et al., 2000). Dautres espces acclrent leur dveloppement pour avancer lge de la maturit sexuelle afin de limiter les effets dune infestation par un parasite dltre. Les mcanismes de dfense actifs contre un parasite infectieux font appel au systme immunitaire de lhte. Les insectes utilisent trs largement des ractions dencapsulement pour se dfendre contre les parasites. Ces ractions dencapsulement sont de deux types : lencapsulement cellulaire et lencapsulement humoral (Carton et al., 2005). Lencapsulement humoral correspond au processus de mlanisation humorale que jai prcdemment dcrit. Au cours de lencapsulement cellulaire, le parasite est isol par les juxtapositions successives sa priphrie de plusieurs couches dhmocytes, la capsule cellulaire est ensuite mlanise. Un exemple prcis de mlanisation humorale de parasite est bien connu chez le moustique Anopheles gambiae, qui est le principal vecteur du paludisme en Afrique. Le parasite Plasmodium,

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Introduction

responsable de la maladie, est transmis lhomme lors de la piqre dun moustique femelle infect. Certaines souches, au sein des populations de moustiques, sont capables de bloquer le cycle de Plasmodium. Dans ces souches dites rfractaires le dveloppement des parasites est arrt la suite dun processus dencapsulement, o ce dernier est enferm dans une matrice de mlanine. La rsistance des moustiques du genre Aedes au nmatode Dirofilaria immitis, un ver parasite qui sinstalle dans les muscles thoraciques de lhte, est galement assur par les hmocytes qui se lysent la surface du parasite pour librer les enzymes de la mlanisation (Forton et al., 1985). Les hmocytes de Aedes aegypti expriment galement la prophnoloxydase (Hillyer and Christensen, 2002). Dans le modle dinfection moustique-nmatode Armigeres subalbatus-Brugia malayi, limplication des hmocytes dans lencapsulement a galement t tudie. Le nombre dhmocytes dcrot fortement dans les 24h qui suivent une infection, ce qui correspond au temps ncessaire lencapsulement. Le niveau normal est ensuite rtabli dans les jours qui suivent (Guo et al., 1995).

B. Les Hymnoptres endoparasitodes et leurs htes

Un parasitode est un parasite qui se dveloppe sur (ectoparasitode) ou dans (endoparasitode) un organisme hte et provoque la mort de ce dernier. La mort de son hte est un rsultat direct ou indirect de son dveloppement (Godfray, 2004). Contrairement aux parasites, il ny a quune seule gnration par hte et seuls les stades immatures en sont dpendants. Ladulte a un mode de vie libre. Dans un grand nombre de cas, le parasitode et son hte sont des insectes. Le mode de vie parasitode reprsente entre 5 et 20% des espces dinsectes (Godfray 1994). On retrouve des espces ayant un mode de vie parasitode dans 6 ordres dinsectes: Hymnoptres, Coloptres, Diptres, Neuroptres, Lpidoptres et Trichoptres. Cependant, ce sont les parasitodes Hymnoptres, Diptres et Coloptres qui sont les plus nombreux. Limportance relative du mode de vie parasitode varie beaucoup dun ordre lautre. Lordre des Hymnoptres compte 67 000 espces, dont environ 70% ont un mode de vie parasitode. Cest dans cet ordre que se retrouve la plus grande diversit de modes de vie et dadaptations diffrents htes et habitats. Parmi les Hymnoptres, les gupes endoparasitodes qui sont les mieux caractrises appartiennent la famille des Braconids. Les gupes braconides parasitent un ventail dhtes assez vaste allant des chenilles de Lpidoptres, aux larves de mouches, aux Coloptres et aux pucerons, etc... Les femelles possdent un ovipositeur lextrmit de leur abdomen, quelles 39

Introduction

utilisent pour injecter les ufs dans les insectes. Aprs lclosion des ufs injects dans lhte, les larves se nourrissent lentement de ce seul hte. Au moment o son hte meurt, la larve est parvenue sa pleine croissance. Elle se nymphose lintrieur ou proximit de lhte mort, quelquefois dans un cocon de soie, pour apparatre ensuite sous forme de gupe adulte. Les hymnoptres endoparasitodes ont dvelopp au cours de lvolution des stratgies leur permettant de se dvelopper lintrieur dun hte immunocomptent. Lchec ou la russite de linfestation dpend des mcanismes de virulence dvelopps par les espces parasites, qui ont pour but de contourner le systme immunitaire de lhte. Une des stratgies de contournement les plus originales consiste transmettre lhte, au moment de loviposition des particules virales de type polydnavirus (PDV), dnomms bracovirus. Le gnome viral des PDV est compos de plusieurs molcules dADN intgres au gnome de la gupe parasitode. Ces virus permettent aux parasitodes de moduler la physiologie de leur hte et de le rendre propice leur propre dveloppement. Les particules virales sont produites dans les ovaires de la femelle parasitode aprs excision et circularisation des molcules. Un tel exemple de mcanisme immunosuppressif est utilis par la gupe Cotesia congregata qui doit, pour se perptuer, pondre ses oeufs dans la chenille du sphynx du tabac Manduca sexta. Au cours de ce parasitisme, la gupe injecte 50 150 ufs endoparasites lintrieur de son hte (Amaya et al., 2005), ainsi que des bracovirus. Les gnes viraux ports par ces virus codent une srie de protines qui sont produites dans les tissus de la chenille parasite. Le squenage et lanalyse du gnome du bracovirus de Cotesia congregata ont t raliss (Espagne et al., 2004). Lexistence de plusieurs familles multigniques a t mise en vidence, avec notamment des gnes codant des protines tyrosines phosphatases, des cystatines, et des inhibiteurs de protases cystine (Espagne et al., 2004; Provost et al., 2004). Ces protines virales jouent un rle essentiel la russite parasitaire. En effet, leur expression entrane une drgulation des systmes physiologiques et endocriniens lorigine dun blocage du dveloppement au stade pupal, et de la mort par apoptose des hmocytes.

C. La relation hte-parasitode Drosophila melanogasterLeptopilina boulardi

Les drosophiles sont les cibles de nombreuses espces de gupes endoparasites, de lordre des Hymnoptres, telles que Leptopilina et Asobora, qui sont les plus tudies (Figure 11). Les femelles pondent les oeufs lintrieur de la cavit de jeunes larves de drosophile. Lintroduction

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Drosophila melanogaster

larve de drosophile

Leptopilina boulardi

Hte rsistant et/ou parasite avirulent

Hte sensible ou parasite virulent Luf parasite uf chappe au systme syst immunitaire de lhte. La larve de gupe clt gu cl puis se dveloppe lintrieur de int lhte

Luf parasite est tu uf tu lintrieur dune l int d capsule cellulaire

La drosophile poursuit son cycle de dveloppement Aprs la Apr mtamorphose, une gupe adulte gu sort de la pupe

Figure 11: Le parasitisme de Drosophila melanogaster par Leptopilina boulardi.

LHymnoptre endoparasitode L. boulardi pond ses ufs dans lhmocoele de jeunes larves de drosophile. Les larves de souches rsistantes liminent le parasite dans une capsule cellulaire qui est mlanise. Cette capsule inerte ne gne pas le dveloppement de la drosophile et persiste au stade adulte. Lencapsulement choue lorsque les larves de drosophiles sensibles sont infectes, o lorsque le parasitode provient dune souche virulente. Dans ce cas, la larve de gupe clot puis se dveloppe lintrieur de lhte. La larve de drosophile entre en mtamorphose mais meurt avant dachever son cycle. Finalement, une gupe adulte sort de la pupe.

Introduction

de ce corps tranger dans lhmocoele de la larve est dtecte par son systme immunitaire, lequel initie la production de cellules spcialises dans lencapsulement, les lamellocytes. Chez les larves rsistantes, on assiste alors lencapsulement cellulaire de luf de gupe. La capsule ainsi forme autour du parasite est mlanise, conduisant la mort de lintrus. Chez les larves sensibles, les lamellocytes chouent dans les processus dencapsulement, luf clot et la larve de gupe se dveloppe lintrieur de la cavit de la drosophile. Au moment de la mtamorphose de lhte, celui-ci meurt permettant la larve de gupe de se mtamorphoser lintrieur de la pupe de drosophile, do elle sortira au stade adulte. Toutes les souches de D. melanogaster ne rpondent pas avec la mme efficacit aux infections parasitaires. Un facteur gntique contrlant cette rsistance/sensibilit des drosophiles aux infections par la gupe Leptopilina boulardi a t mis en vidence. Ce gne est appel Rlb (pour Resistance to L. boulardi), il existe sous deux formes allliques, lallle rsistant tant dominant (Carton and Nappi, 1997). Ce gne de rsistance nappartient pas un mcanisme de dfense gnral contre tous les Hymnoptres parasitodes puisque la rsistance contre Asobora tabida, une autre gupe parasitode du mme groupe, dpend du gne de rsistance Rat ((Benassi et al., 1998; Carton and Nappi, 2001; Hita et al., 1999; Poirie et al., 2000). Ces tudes ont mis en vidence lexistence dau moins deux systmes de protection distincts, contre les infestations par les gupes endoparasitodes, cods dans le gnome de la drosophile. Lefficacit parasitaire ne dpend pas uniquement de la rsistance/sensibilit des souches de drosophiles face aux parasites, mais dpend galement de la virulence des souches de gupes infestantes. Bien que la plupart des souches de Leptopilina boulardi soient virulentes, cest--dire quelles sont capables dinhiber la rponse immunitaire de lhte, certaines souches dites avirulentes, contournent les ractions dencapsulement avec une efficacit plus faible. La virulence du parasite L. boulardi est sous le contrle gntique dun gne majeur, cod dans son gnome. Ce gne de virulence contre D. melanogaster est not Ism (Immune suppressive) avec deux allles, Ism+ pour les souches virulentes et Ism- pour les souches avirulentes (Carton and Nappi, 2001). L. boulardi, comme de nombreuses espces Braconides, injecte des facteurs immunosuppressifs lors de loviposition pour contourner le systme immunitaire de lhte. Des tudes ont rvl la prsence de particules de type viral (VLP pour Virus Like Particles) dans les substances injectes lors des pontes par les femelles de souches virulentes de L. boulardi (Russo et al., 2001). Ces particules ne correspondent pas des bracovirus, ils sont considrs comme des virus dfectueux dont le gnome, intgr dans celui de la gupe, nest pas envelopp dans les nouveaux virions (Labrosse et al., 2003). Linjection de ces particules est associe un 41

Introduction

changement de morphologie des lamellocytes qui deviennent bipolaires et qui ont probablement modifi leurs proprits adhsives. Ces VLP auraient donc pour effet de bloquer les mcanismes dencapsulement (Nappi et al., 2004). Des tudes rcentes ont mis en vidence, chez les souches virulentes Ism+, un facteur de virulence (P4) produit dans la glande venin de lhymnoptre (Labrosse et al., 2005), relie son systme gnital. Ce facteur, inject dans lhte au moment de la ponte, induit une modification de la morphologie des lamellocytes. La caractrisation de ce facteur de virulence a montr quil sagit dune protine de la famille Rho-GAP (Ras homologous GTPase Activating Protein), une famille de protines connue pour son rle rgulateur des RhoGTPases. Le mode daction du facteur P4 nest pas caractris ce jour. Cependant, les RhoGTPases tant des acteurs importants de la dynamique du cytosquelette, il est possible que le facteur P4 inhibe les ractions dencapsulement en agissant sur le cytosquelette et la dynamique des lamellocytes.

IV.

Objectif de ce travail
Au cours de mon travail de thse, jai dvelopp trois projets troitement lis. Le premier

projet, que je prsenterai dans le premier chapitre, avait pour but dexplorer lactivit transcriptionnelle des hmocytes de la drosophile, afin denrichir nos connaissances molculaires sur les diffrentes fonctions exerces par les cellules sanguines. Nous avons analys lactivit transcriptionnelle des hmocytes par la technique des puces ADN Affymetrix, qui permet de mesurer individuellement la transcription des 13000 gnes de la drosophile. Nous avons imagin une stratgie qui permet, par recoupement des donnes obtenues partir de plusieurs chantillons distincts, dallouer un type hmocytaire une activit gntique caractristique. Nous nous sommes particulirement intresss la contribution des hmocytes aux mcanismes de limmunit inne (encapsulement, phagocytose et mlanisation), en analysant lactivit transcriptionnelle des hmocytes de larves mutantes et de larves infectes par un mlange bactrien. Le deuxime chapitre des rsultats sera consacr au facteur Collier, lunique orthologue chez la drosophile du facteur EBF (Early B-cell Factor) des mammifres, et au dcryptage de son rle dans les processus hmatopotiques de la drosophile. Ce projet a dbut avec lobservation, par lquipe du Dr Alain Vincent (UMR 5547, Toulouse), que le gne collier est exprim trs tt au cours de lembryogense dans la glande de la lymphe. Nous avons dmontr que lactivit du

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Introduction

gne collier est indispensable la diffrenciation des lamellocytes, identifiant le premier facteur de transcription requis pour ce processus. Nous avons mis en vidence une similitude supplmentaire entre le systme hmatopotique de la drosophile et celui des mammifres, o EBF est un facteur clef contrlant la diffrenciation prcoce des lymphocytes B (Dubois and Vincent, 2001; Lin and Grosschedl, 1995). Suite ces travaux, nous avons propos un modle pour la spcification des lamellocytes suite une infection parasitaire. Nous avons cherch valider ce modle en identifiant dautres gnes requis pour la spcification des lamellocytes. Dans ce but, plusieurs approches ont t mises en uvre, parmi lesquelles ltude, par la technique des puces ADN Affymetrix, de lactivit transcriptionnelle dorganes hmatopotiques surexprimant collier. Cette stratgie nous a permis didentifier un gne jusque-l non caractris, annot CG14225 dans les bases de donnes, qui code une protine transmembranaire putative homologue des rcepteurs IL-6R/gp130 des mammifres (Hombria and Brown, 2002). Je prsenterai dans le troisime chapitre les rsultats des tudes menes sur ce rcepteur candidat et les diffrentes approches envisages pour tudier son implication dans les processus hmatopotiques de la drosophile.

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-RESULTATS-

44

CHAPITRE I :

Analyse de lactivit transcriptionnelle des hmocytes de la drosophile

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Chapitre I : Activit transcriptionnelle des hmocytes

Analyse de lactivit transcriptionnelle des hmocytes de la drosophile

I. Introduction
Les approches traditionnelles pour lanalyse des expressions gniques dun chantillon biologique ne nous permettent dexaminer lexpression que dun nombre limit de gnes par exprience. En revanche, la technologie rcente des puces ADN permet une mesure simultane du niveau dexpression de plusieurs milliers de gnes voire dun gnome entier, dans des dizaines de conditions diffrentes, physiologiques ou pathologiques. Son utilit est scientifiquement incontestable car la connaissance du niveau dexpression dun gne dans ces diffrentes situations constitue une avance vers sa fonction. Chez les mammifres, lutilisation des puces ADN applique lhmatopose a permis la dfinition des profils dexpression caractristiques des diffrents stades de diffrenciation des cellules sanguines. Ces profils dexpression dterminent des signatures molculaires , et les variations des profils peuvent dfinir le programme gntique suivi par les cellules. Ainsi, une quipe amricaine a dfini la signature molculaire des cellules souches hmatopotiques de souris. Elle correspond lexpression combinatoire dun ensemble de gnes dont les transcrits se trouvent enrichis au sein des cellules souches alors quils sont soit absents, soit peu exprims, dans les cellules diffrencies qui en drivent (Ivanova et al., 2002). Cette technique est galement utilise chez les mammifres pour ltude des processus immunitaires (inns et adaptatifs), avec de nombreuses applications possibles, telles par exemple la comprhension des drgulations lorigine des cancers ou des maladies auto-immunes (van der Pouw Kraan et al., 2004). Dans ce dernier cas, les lymphochips regroupent les informations dexpression de prs de 18 000 gnes. Ces gnes sont ceux prfrentiellement exprims dans les cellules lymphodes, et ceux impliqus ou suspects de ltre dans les mcanismes immunitaires et cancreux. Les puces ADN Affymetrix ont t utilises pralablement par notre laboratoire, ainsi que dautres, pour lanalyse transcriptionnelle globale de la rponse immunitaire inne de la drosophile. Ces travaux ont dmontr lefficacit de cette technique, par la quantit et la spcificit des informations recueillies. A titre dexemple, les puces ADN ont rvl que les voies Toll et imd rgulent la transcription de plus de 600 gnes aprs une infection, autant de gnes qui peuvent jouer un rle dans la rponse immunitaire de la drosophile (De Gregorio et al., 2001; De Gregorio 46

Chapitre I : Activit transcriptionnelle des hmocytes

et al., 2002b; Irving et al., 2001). Cependant, cette technique navait jamais t applique ltude des hmocytes de drosophiles. Dans le but didentifier de nouveaux gnes impliqus dans les mcanismes de prolifration et de diffrenciation, ou contribuant aux diverses fonctions hmocytaires, nous avons analys les activits transcriptionnelles de populations dhmocytes provenant de plusieurs types dchantillons biologiques. De faon similaire aux tudes transcriptionnelles des cellules hmatopotiques de mammifres, nous avons tent dallouer chaque type hmocytaire un profil dexpression qui le caractrise, sans pour autant parler de signature molculaire . Un des objectifs de cette tude transcriptomique tait lidentification de marqueurs spcifiques pour chaque type hmocytaire. En effet, alors que les cellules sanguines des mammifres et leur stade de diffrenciation peuvent tre facilement identifis par lexpression de nombreux marqueurs de surface, nous ne disposions que de peu de marqueurs spcifiques pour les hmocytes de drosophile, ce qui reprsente un inconvnient majeur pour ltude de ces cellules. Nous avons recherch des indications sur les gnes impliqus dans les fonctions des diffrents types hmocytaires. Notre intrt sest galement port sur la contribution des hmocytes aux mcanismes de dfense immunitaire, qui reste encore mal dfinie, en analysant les profils dexpression des hmocytes de larves ayant subi une infection bactrienne. Larticle I prsente les travaux que nous avons effectus.

II. Article I : New insights into Drosophila larval haemocyte functions through genome-wide analysis.

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Chapitre I : Activit transcriptionnelle des hmocytes

New insights into Drosophila larval haemocyte functions through genome-wide analysis

Phil Irving*, Jean-Michel Ubeda*, Daniel Doucet*, Laurent Troxler, Marie Lagueux, Daniel Zachary, Jules A. Hoffmann, Charles Hetru and Marie Meister. (* : ces auteurs ont contribu parts gales ce travail)

Cellular Microbiology (2005) 7(3), 335-350

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[Signalement bibliographique ajout par : ULP SCD Service des thses lectroniques] New insights into Drosophila larval haemocyte functions through genome-wide analysis Phil Irving*, Jean-Michel Ubeda*, Daniel Doucet*, Laurent Troxler, Marie Lagueux, Daniel Zachary, Jules A. Hoffmann, Charles Hetru and Marie Meister (*: ces auteurs ont contribu parts gales ce travail) Cellular Microbiology, 2005, Volume 7, N 3, Pages 335 - 350 Pages 335 350 : La publication prsente ici dans la thse est soumise des droits dtenus par un diteur commercial. Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de l'diteur : http://www.blackwell-synergy.com/doi/full/10.1111/j.1462-5822.2004.00462.x Il est galement possible de consulter la thse sous sa forme papier ou d'en faire une demande via le service de prt entre bibliothques (PEB), auprs du Service Commun de Documentation de l'ULP: peb.sciences@scd-ulp.u-strasbg.fr

Chapitre I : Activit transcriptionnelle des hmocytes

III.

Rsum
Nous avons analys les expressions gniques de plusieurs chantillons hmocytaires,

prlevs partir de lhmolymphe de larves de drosophile, dans diffrents contextes gntiques. Nous avons ainsi mesur et compar les activits transcriptionnelles des hmocytes de larves sauvages celles de larves portant des mutations qui provoquent des drgulations du systme hmatopotique. Ces drgulations taient choisies pour leur effet sur la prolifration et/ou la diffrenciation des cellules sanguines. En recoupant les donnes obtenues sur les puces et en tenant compte des compositions relatives des diffrents chantillons, nous avons dfini les transcrits qui sont prfrentiellement enrichis dans chaque type dhmocytes. La comparaison des niveaux dexpression dans les diffrents chantillons permet galement de dtecter les gnes qui sont rguls diffremment en fonction du contexte gntique. Ces modifications dexpression peuvent, dans certains cas, traduire une fonction pour ce gne dans les processus dhmatopose ou bien dans les fonctions des hmocytes. Enfin, pour analyser la contribution des hmocytes aux mcanismes de dfense immunitaire, nous avons mesur les activits transcriptionnelles des hmocytes suite une infection bactrienne. Parmi les 13000 gnes reprsents sur les puces ADN Affymetrix, plus de 5000 gnes prsentant un niveau significatif dexpression ont t dtects dans au moins un des chantillons hmocytaires. Parmi ceux-ci, 2517 gnes prsentent une activit transcriptionnelle significativement enrichie dans les hmocytes (indice dexpression augment de deux fois au minimum) par rapport aux larves entires qui ont servi de contrle, ce qui reprsente une quantit leve pour un seul tissu. 423 transcrits sont communs tous les chantillons hmocytaires. Ils reprsentent aussi bien des gnes exprims de faon pan-hmocytaire que des gnes exprims dans les plasmatocytes, puisque ces derniers sont prsents dans tous les chantillons. Nous retrouvons dans ce groupe les transcrits de gnes ayant des rles connus dans les processus hmatopotiques chez la drosophile, ou dans les fonctions des hmocytes. A titre dexemple, des expressions significatives sont dtectes pour les gnes serpent, indispensable la fois dans le dveloppement et les fonctions des hmocytes, stat92E, le transactivateur de la voie JAK/STAT, mais galement PVR, dSR-CI et croquemort. Nous retrouvons galement des gnes codant des protines de la matrice extracellulaire comme la Peroxydasine, le Collagne, lHmolectine.

49

Chapitre I : Activit transcriptionnelle des hmocytes

Lexpression de nombreux transcrits jusque-l non dcrits dans les hmocytes a t mise en vidence. Ces transcrits codent des molcules dadhsion cellulaires, des intgrines, des lectines, des facteurs de croissance, ou encore des protases srine. Les hmocytes sont apparus comme des acteurs importants de la facette humorale de limmunit inne. Outre le fait que la voie Toll soit active dans les hmocytes et quils expriment fortement certains peptides antimicrobiens suite une infection, nous avons observ que les hmocytes expriment plusieurs gnes codant des PGRPs et des GNBPs. Dun intrt particulier, PGRP-SA, un rcepteur clef dans la dtection des bactries Gram positif en amont de la voie Toll, est principalement produit par les hmocytes. Nous avons galement observ que le gne sptzle est exprim dans les hmocytes et que sa transcription est fortement augmente dans ces cellules suite une infection. Cependant, le transcrit spz est quasiment indtectable dans les larves contrles, et nous avons mesur par des analyses complmentaires que le gne spz ntait pas significativement induit dans le corps gras. Nos rsultats dmontrent ainsi de faon claire que le gne spz nest pas une cible de la voie Toll dans les cellules du corps gras larvaire. La production de Spz par les hmocytes aprs une infection pourrait correspondre la remise niveau de son taux en circulation, sous forme dun propeptide prt tre coup pour devenir fonctionnel lors dune infection ultrieure. Nous avons pu apporter des informations nouvelles sur le mcanisme dencapsulement. En effet, nous avons montr que la formation des capsules par les lamellocytes requiert la fonction des intgrines, ce qui navait jamais t dmontr in vivo. Les intgrines sont formes par la dimrisation de deux sous-units a et b. Les donnes obtenues nous ont permis de dmontrer que la sous-unit bPS code par le gne myospheroid est indispensable pour la formation de la capsule. De plus, nous avons identifi la sous-unit aPS4 comme un marqueur spcifique des lamellocytes. Ces indications nous suggrent que le dimre form par les deux sous-units bPS/aPS4 contribue la cohsion structurelle des capsules formes par les lamellocytes. Nous avons montr galement que lun des trois gnes codant une Prophnoloxydase, proPO59, est exprim non pas dans les cellules cristaux comme les deux autres gnes, mais spcifiquement dans les lamellocytes. Cette caractristique inattendue permet aux lamellocytes de participer directement la mlanisation de la capsule quils forment, et nous fournit, en plus de

aPS4, un marqueur spcifique des lamellocytes.

50

Chapitre I : Activit transcriptionnelle des hmocytes

IV.

Discussion
Les analyses que nous avons effectues ne nous permettent pas de dfinir des signatures

molculaires qui caractriseraient les prohmocytes et les diffrents types dhmocytes diffrencis. En effet, linconvnient majeur de notre stratgie danalyse est quaucun des chantillons tests nest compos dun seul type de cellules sanguines, ce qui nous aurait permis danalyser spcifiquement les expressions gniques dun type hmocytaire prcis. Il nous tait impossible lpoque de nous affranchir de cet inconvnient puisquaucune technique permettant la rcolte et le tri diffrentiel des hmocytes ntait dcrite. Rcemment, la mthode de sparation par cytomtrie FACS (Fluorescence activated cell sorting) a t adapte au tri des hmocytes de la drosophile (Tirouvanziam et al., 2004). Cette mthode permet la sparation dhmocytes frachement prlevs, et leur assortiment en populations homognes, permettant par la suite des tudes ex vivo. Bien quelle ne soit applicable pour le moment qu de trs petits chantillons, le dveloppement de cette technique permettrait de nombreuses avances dans ltude fonctionnelle et transcriptionnelle des hmocytes de drosophile. Il est remarquer que les transcrits de nombreux gnes ayant des fonctions tablies dans lhmatopose de la drosophile, tels que Notch, Serrate, gcm, lozenge, hopscotch, Raf, etc, nont pas t dtects dans nos chantillons. Cette observation pousse la rflexion. Il est en effet possible que les niveaux dexpression de ces gnes soient trop faibles pour tre dtects par notre analyse et que ceci reflte les limitations techniques de notre approche. Il est aussi possible que certains gnes ne soient exprims que de faon transitoire pour assurer leur fonction. Nous pouvons galement imaginer que certains de ces gnes sont exprims par un nombre limit de cellules, ce qui est le cas pour Serrate par exemple, ce qui rsulte en une trop grande dilution des transcrits dans nos prparations dARNs. Dans une tude rcente (Johansson et al., 2005), les auteurs ont analys les activits transcriptionnelles des cellules mbn-2 suite un traitement au LPS ou par la bactrie Gram ngatif Escherichia coli. Ces cellules en culture drivent de macrophages de drosophile et ont gard leur capacit de phagocytose, ainsi que celle de rpondre aux infections microbiennes en produisant des peptides antimicrobiens via les voies de signalisation intracellulaires Rel/NF-kB. Des tudes avaient dmontr que les cellules mbn-2 rpondent un stimulus immun au LPS (Samakovlis et al., 1992). Il est cependant important de noter que le LPS nest pas un inducteur de la rponse immunitaire chez les mouches adultes, et que lactivation des voies de signalisation Rel/NF-kB dans les cellules mbn-2 est trs certainement cause par la contamination des 51

Chapitre I : Activit transcriptionnelle des hmocytes

prparations commerciales de LPS avec des peptidoglycanes (Leulier et al., 2003). Notre approche fut diffrente dans le sens o nous avons utilis, pour les mesures dexpression sur les puces ADN, des hmocytes prlevs in vivo chez des larves pralablement infectes par un mlange bactrien. Nanmoins ces deux travaux partagent un objectif commun qui est lanalyse des rgulations transcriptionnelles qui soprent lors de la rponse immunitaire dans les hmocytes. Ainsi, en comparant les donnes que nous avons obtenues avec celles de Johansson et collaborateurs, nous trouvons un certain nombre de rsultats concordants, cest--dire que certains gnes sont induits de faon similaire dans les deux tudes. Cest le cas par exemple des gnes PGRP-SA, PGRP-SB1 et Tep4 qui sont fortement induits aprs infection. Cependant, de nombreux exemples deffets inverses sur les rgulations transcriptionnelles sont remarqus. Par exemple, les gnes de la voie JAK/STAT dome, upd2 et upd3, qui ne sont pas dtects sur nos puces ont une transcription augmente dans les cellules mbn-2 aprs un stimulus bactrien. Un autre exemple marquant concerne le rcepteur scavenger dSR-CI. Son expression est fortement augmente dans nos puces suite une infection bactrienne, alors quil ne subit aucune modification dexpression dans les cellules mbn-2 sous leffet de LPS et des bactries E. coli. Ces observations mettent bien en vidence les disparits qui peuvent exister entre des tudes in vitro et les tudes in vivo. En effet, les cellules mbn-2 prsentent certaines caractristiques des plasmatocytes/macrophages des drosophiles, mais en ont perdu dautres. Les tudes in vivo se basent, elles, sur des cellules prleves directement dans leur milieu physiologique avec lequel elles ont de nombreuses interactions. Bien que les puces ADN reprsentent une technique trs efficace pour lidentification des gnes qui sont induits ou rprims en rponse une infection microbienne, elle ne permet pas didentifier les protines qui subissent des rgulations au niveau traductionnel ou posttraductionnel. Ces rgulations peuvent tre analyses par une approche protomique. Une tude rcente a analys le protome des cellules mbn-2 de drosophile et ses modifications suite un traitement au LPS (Loseva and Engstrom, 2004). Les auteurs ont mis en vidence que des modifications trs rapides du protome apparaissent suite au traitement. Je citerai titre dexemple les protines du cytosquelette impliques dans la phagocytose, des protines de transport nuclaire et des rgulateurs transcriptionnels pour la transcription de gnes cibles, des protases scrtes sous la forme de zymognes inactifs, qui doivent subir une coupure protolytique pour tre actives. Ces protines sont ainsi actives au niveau post-traductionnel, et leurs transcrits ne sont pas forcment affects par un stimulus immun. Les tudes protomiques et transcriptomiques des hmocytes de la drosophile, ou des lignes cellulaires qui en drivent, sont ainsi complmentaires car elles procurent deux perspectives diffrentes des activits cellulaires. 52

Chapitre I : Activit transcriptionnelle des hmocytes

Notre travail a permis ltablissement du transcriptome des hmocytes larvaires de la drosophile, ce qui nous permet aujourdhui davoir une ide plus prcise et plus tendue des fonctions qui peuvent y tre associes. Nous avons pu associer des familles de gnes des types cellulaires prcis et identifier ainsi des marqueurs spcifiques. Lensemble des voies de signalisation actives dans les hmocytes pose la question de connatre leur implication dans les diffrents processus comme la phagocytose, lencapsulement et la mlanisation ou dans dautres mcanismes comme la prolifration et la diffrenciation. En ce sens, nous avons tabli une banque dinformations qui servira comme base de rfrence pour les tudes futures sur les cellules sanguines de la drosophile.

53

CHAPITRE II :

Etude du facteur Collier dans le dveloppement hmatopotique de la drosophile

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Chapitre II : Etude du facteur Collier

Etude du facteur Collier dans le dveloppement hmatopotique de la drosophile

I. Introduction
Lors de mon arrive au laboratoire, jai commenc mon travail de thse par la recherche dun rle potentiel du facteur Collier dans les processus hmatopotiques de la drosophile. Collier (Col) est un facteur de transcription. Il est lunique orthologue chez la drosophile de EBF (Early Bcell Factor) des mammifres, un acteur clef du dveloppement des lymphocytes B (Figure 12A). Durant la lymphopose B, les prcurseurs lymphodes subissent plusieurs tapes de diffrenciation et des facteurs de transcription, agissant de faon successive, contrlent les tapes intermdiaires de ce processus. Les facteurs EBF et E2A agissent de concert trs tt au cours de cette diffrenciation. EBF nest pas requis dans les prcurseurs lymphodes pour initier le programme de diffrenciation des lymphocytes B, il agit en rendant les cellules comptentes poursuivre ce programme. Son activit est indispensable pour assurer la maturation des procellules B en pr-cellules B (Bartholdy and Matthias, 2004; Busslinger et al., 2000). Ainsi, des souris KO ebf
-/-

sont compltement dpourvues de lymphocytes B diffrencis (Lin and

Grosschedl, 1995) et les prcurseurs lymphodes restent bloqus un stade prcoce de leur dveloppement. EBF et E2A rgulent lexpression de nombreux gnes de la lymphopose B, notamment Pax5 qui code un troisime transactivateur, et dont lactivit est tout aussi cruciale au bon droulement de ce processus. Lexpression force des facteurs E2A et EBF dans les prcurseurs hmatopotiques suffit dclencher le programme entier de diffrenciation et de maturation des lymphocytes B (O'Riordan and Grosschedl, 1999). Les facteurs EBF et Col appartiennent une famille de protines caractrises par un domaine de liaison lADN de 210 acides amins renfermant une structure en doigt de zinc. Ce domaine est associ un motif HLH et une rgion de 135 acides amins hautement conservs qui recouvre en partie les motifs HLH (Figure 12B). EBF, Col, et Olfactory1 identifi chez le rat, sont les trois membres de cette famille de facteurs transcriptionnels, appel COE (Crozatier et al., 1996; Dubois and Vincent, 2001) Les facteurs EBF et Col prsentent une importante conservation de squence. Col a t identifi chez la drosophile pour son rle au cours du dveloppement embryonnaire, o il contrle la formation de certains segments de la tte. Au stade blastoderme, 55

A
Cellule souche hmatopotique GATA2 E2A EBF Notch1 Prcurseur lymphode commun Pax5 Pro-lymphocyte B

Prcurseur mylode

Pro-lymphocyte T

B
1 575 liaison ADN

Collier

86%
1 (210aa)

89%
(135aa)

44%

identit
591

EBF
motif HLH

Figure 12 : Collier est lorthologue de EBF chez la drosophile. .

(A) EBF est un transactivateur clef de la lymphopose B, il est impliqu dans la hirarchie transcriptionnelle contrlant la diffrenciation des pro-lymphocytes partir de prcurseurs lymphodes communs. (B) Lalignement entre EBF et Collier montre une grande identit de squence dans les domaines de liaison lADN, et dans une deuxime rgion de 135 acides amins qui englobe le motif HLH.

Chapitre II : Etude du facteur Collier

col est exprim par les cellules du single mitotic domain MD2 et chevauche en partie les primordia des segments mandibulaires et intercalaires (parasegment 0). Lors de la gastrulation, Col est requis pour une diffrenciation correcte de ces structures (Crozatier et al., 1996). En plus de son rle dans la segmentation de la tte, le facteur Col est ncessaire la spcification des muscles somatiques embryonnaires DA3 (Crozatier et al., 1999) et contribue la formation de laile en contrlant la taille du compartiment postrieur. Cette fonction implique la spcification de la veine L4 et lorganisation de la rgion interveines L3-L4 (Crozatier et al., 2002; Mohler et al., 2000). Le Dr Michle Crozatier (UMR 5547, Toulouse, dirig par le Dr Alain Vincent) en tudiant le profil dexpression de col chez lembryon de drosophile avait observ par des hybridations insitu, ainsi que par immunolocalisation, deux groupes de cellules marques localises dans la rgion dorsale en fin dembryogense. Il est apparu par la suite que ces cellules correspondent aux prcurseurs de la glande de la lymphe, lorgane hmatopotique larvaire. Suite ces observations, M. Crozatier et ses collaborateurs ont voulu savoir si Col jouait un rle dans la rponse immunitaire et/ou dans lhmatopose de la drosophile. La rponse humorale des mutants col aux infections microbiennes a t teste et aucun dfaut de rsistance na pu tre observ (M. Crozatier, communication personnelle). Les voies Toll et IMD sont normalement actives, Col nest vraisemblablement pas impliqu dans la rponse humorale de la drosophile. Dans un travail de collaboration entre lquipe toulousaine et notre quipe au laboratoire, nous avons recherch un phnotype hmatopotique chez les mutants col, afin de caractriser un rle ventuel de ce facteur dans les processus de prolifration et/ou de diffrenciation des hmocytes de la drosophile.

II. Article II : Cellular Immune Response to Parasitization in Drosophila Requires the EBF Orthologue Collier

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Chapitre II : Etude du facteur Collier

Cellular Immune Response to Parasitization in Drosophila Requires the EBF Orthologue Collier
Michle Crozatier*, Jean-Michel Ubeda*, Alain Vincent, Marie Meister. (* : ces auteurs ont contribu parts gales dans ce travail)

PLoS Biology 2004 Aug;2(8):E196

57

[Signalement bibliographique ajout par : ULP SCD Service des thses lectroniques] Cellular Immune Response to Parasitization in Drosophila Requires the EBF Orthologue Collier Michle Crozatier*, Jean-Michel Ubeda*, Alain Vincent, Marie Meister (*: ces auteurs ont contribu parts gales dans ce travail) PLoS Biology, 2004, Volume 2, N8, Pages 1107-1113

Pages 1107-1113 : La publication prsente ici dans la thse est soumise des droits dtenus par un diteur commercial. Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de l'diteur : http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-archive&issn=1545-7885&year=2004 Il est galement possible de consulter la thse sous sa forme papier ou d'en faire une demande via le service de prt entre bibliothques (PEB), auprs du Service Commun de Documentation de l'ULP: peb.sciences@scd-ulp.u-strasbg.fr

Chapitre II : Etude du facteur Collier

III.

Rsum
Col est exprim par une sous-population cellules hmatopotiques. La premire expression de Col dans les tissus hmatopotiques est dtecte assez tt au

cours du dveloppement embryonnaire (stade 11), dans les prcurseurs de la glande de la lymphe au niveau du msoderme latral. Col reprsente le marqueur le plus prcoce pour les territoires prsomptifs de la glande de la lymphe chez lembryon. En fin dembryogense, alors que ces primordia ont migr dorsalement pour se positionner le long du vaisseau dorsal, seules quelques cellules situes postrieurement dans lorgane en formation continuent exprimer Col fortement. Ces cellules prfigurent le centre signalisateur postrieur (PSC) puisquau cours de lhmatopose larvaire, larrire des lobes antrieurs de la glande de la lymphe, seules les cellules du PSC expriment Col. Le PSC avait t pralablement identifi par une quipe amricaine (Lebestky et al., 2003) qui avait propos un rle instructif des cellules du PSC pour le dveloppement des cellules cristaux. Lidentification du PSC tait base sur le domaine dexpression de Serrate, Col constitue ainsi le deuxime marqueur pour les cellules du PSC au stade larvaire. Les prohmocytes contenus dans les lobes antrieurs nexpriment pas Col, ce qui nest pas le cas dans les lobes postrieurs o Col est exprim par un nombre variable de prohmocytes. Bien que Col soit exprim relativement tt dans la glande de la lymphe, sa fonction nest pas requise pour la spcification et la formation de cet organe au stade embryonnaire. Cependant les cellules du PSC ne peuvent se diffrencier chez les larves mutantes col. La fonction de col est indispensable la diffrenciation des lamellocytes La perte-de-fonction col est associe une dficience de spcification des lamellocytes en rponse une infection parasitaire par Leptopilina boulardi. Col est ainsi un facteur indispensable au programme de diffrenciation de ces cellules. Ce rle de Col est confirm par la mise en vidence que le destin lamellocyte peut tre forc dans les prohmocytes par la surexpression de col de faon ectopique laide dun pilote pan-hmatopotique. Cette surexpression entrane la diffrenciation massive des lamellocytes en absence de toute infection. Cependant, nous avons montr que les cellules Col+ ne sont pas les prcurseurs directs des lamellocytes, puisque le profil dexpression de Col ne change pas suite une infection par les gupes parasitodes. Des expriences de double immunolocalisation avec un marqueur de lamellocytes montrent bien que les cellules Col+ ne sont pas celles qui se diffrencient en 58

Chapitre II : Etude du facteur Collier

lamellocytes. A aucun moment, nous navons observ une expression de Col dans les hmocytes diffrencis. Les cellules Col+ exercent ainsi un rle instructif en confrant aux prohmocytes prsents dans la glande de la lymphe la comptence de se diffrencier en lamellocytes suite une infection parasitaire. Hormis Stat92E, dont nous ne comprenons pas encore clairement le rle exact dans la diffrenciation des lamellocytes, Col est le premier transactivateur identifi dans le programme de diffrenciation de ce lignage hmocytaire. Mise en vidence du caractre bipotentiel des prohmocytes La surexpression de col provoque la diffrenciation massive des prohmocytes en lamellocytes, au dtriment de la diffrenciation des cellules cristaux qui deviennent rares. En revanche, chez les larves mutantes col qui ne peuvent pas diffrencier les lamellocytes, on observe une augmentation du nombre de cellules cristaux. La combinaison de ces donnes suggre que le facteur Col contrle une balance de diffrenciation lamellocytes/cellules cristaux partir de cellules souches bipotentielles. Modle dinduction des lamellocytes Nous avons propos un modle de diffrenciation des lamellocytes dans la glande de la lymphe, en rponse une infection parasitaire. Ce modle se dcompose en deux tapes (Figure 13). Nous proposons que le facteur Col confre la comptence aux cellules du PSC rpondre un signal informatif (S1), vraisemblablement de type cytokine, mis par les plasmatocytes suite linfection parasitaire. Dans notre modle, les cellules du PSC mettent alors un signal secondaire (S2), instructif, vers les prohmocytes pour y dclencher le programme de diffrenciation des lamellocytes.

IV.

Discussion
La dissection du rle du transactivateur Col dans la spcification du lignage lamellocyte

souligne une fois de plus les nombreuses analogies qui existent entre le contrle du systme hmatopotique chez la drosophile et chez les mammifres. Col chez la drosophile et EBF chez les mammifres, sont tous deux requis pour permettre la diffrenciation de lignages sanguins mdiateurs de limmunit, respectivement les lamellocytes et les lymphocytes B. Cette analogie est dautant plus marquante que le dveloppement de ces deux types de cellules prsente un caractre dinductibilit. En effet, ce nest que lorsquils sont activs par la reconnaissance de motifs 59

B
Glande de la lymphe

prohmocyte Reconnaissance du parasite S2 S1 PSC Col+ L lamellocyte S1

CC cellule cristaux

plasmatocyte Figure 13: Modle de diffrenciation des lamellocytes suite une infection parasitaire. (A) Lors dune infection parasitaire par la gupe L. boulardi, luf est reconnu
comme infectieux par les plasmatocytes, qui reprsentent 95% des hmocytes circulants. Nous proposons que les plasmatocytes scrtent un signal dalerte (S1) qui diffuse dans lhmolymphe et signale aux cellules du PSC la ncessit de produire les lamellocytes (L). (B) Les cellules du PSC ragissent en mettant un second signal (S2) vers les prohmocytes pour y dclencher le programme de diffrenciation des lamellocytes, au dtriment de la diffrenciation des cellules cristaux (CC). N: Voie Notch

Chapitre II : Etude du facteur Collier

antigniques infectieux, que les lymphocytes B dont le commitment a t assur par EBF, poursuivent leur maturation en se spcialisant en plasmocytes, des cellules ddies la production danticorps solubles. Chez la drosophile, lexpression de Col dans un groupe de cellules de lorgane hmatopotique donne aux prcurseurs la comptence de se diffrencier en lamellocytes en rponse une menace immunitaire particulire. Bien que la drosophile et les mammifres soient trs loigns dun point de vue volutif, les deux protines orthologues EBF et Col sont requises pour le dveloppement de cellules sanguines appropries, ncessaires pour combattre une infection prcise. Ces observations suggrent lexistence dune protine ancestrale Col/EBF, dont lactivit aurait permis des cellules hmatopotiques de rpondre un signal immun mis par des cellules circulantes de surveillance immunitaire (de type phagocyte ou macrophage), en achevant leur programme de diffrenciation. Ainsi Col et EBF auraient conserv partiellement la fonction de la protine ancestrale, mais auraient vu diverger leurs modes dactions. En effet, EBF agit de faon autonome cellulaire : il est exprim directement par les cellules qui sont engages dans le destin lymphocyte B. Ce nest pas le cas de Col qui nagit pas de faon autonome cellulaire et nest pas exprim par les prcurseurs des lamellocytes, mais par des cellules voisines. Lebestky et collaborateurs (2003), en analysant le rle de la voie Notch pour la diffrenciation des cellules cristaux, ont identifi le PSC en analysant lexpression de son ligand Ser. En observant que Ser est exprim par des cellules localisation trs prcise dans les lobes primaires de la glande de la lymphe, et quil est le seul responsable de lactivation du rcepteur Notch dans les prohmocytes, les auteurs ont dfini le PSC comme un centre instructeur pour la diffrenciation des cellules cristaux. Nanmoins, ils ont galement remarqu quelques cellules Ser+ isoles dans les lobes primaires et secondaires. Nous avons dmontr que la spcification du PSC dpend de lactivit du facteur Col, et quen contexte col- le PSC est absent. Pourtant, bien que lexpression de Ser soit perdue dans la rgion du PSC, les cellules cristaux sont toujours produites dans la glande de la lymphe. Nos rsultats sont en dsaccord avec ceux de Lebesky et collaborateurs et nous apportons la preuve que le PSC nest pas indispensable pour la spcification des cellules cristaux. Notre hypothse est que les cellules Ser+ disperses dans la glande de la lymphe suffisent dclencher le programme de diffrenciation des cellules cristaux Le modle de diffrenciation des lamellocytes que nous avons propos concerne les hmocytes des lobes antrieurs de la glande de la lymphe, o nous avons observ que Col est exclusivement exprim par les cellules du PSC. Ce modle de diffrenciation ninclut pas ncessairement les hmocytes des lobes postrieurs. En effet, les lobes postrieurs ont une 60

Chapitre II : Etude du facteur Collier

organisation trs variable, et beaucoup de cellules disperses dans les lobes peuvent exprimer Col. Nous ne connaissons pas exactement la nature des cellules Col+ des lobes postrieurs, mais une possibilit est que ces cellules correspondent dun point de vue fonctionnel aux cellules du PSC. Elles pourraient permettre la diffrenciation des lamellocytes dans les lobes postrieurs. Cette hypothse est taye par lobservation que Ser, un marqueur spcifique des cellules du PSC, est galement exprim par des hmocytes disperss dans les lobes postrieurs (Lebestky et al., 2003). Il serait intressant de savoir si les deux expressions Col et Ser colocalisent, et si ces cellules expriment galement les autres marqueurs gntiques des cellules du PSC. Dans notre modle, nous proposons quun signal dalerte mis par les plasmatocytes est intgr par les cellules du PSC, lesquelles assurent lactivation du programme de diffrenciation des lamellocytes dans les prohmocytes voisins. Le mcanisme dactivation que nous privilgions aujourdhui est la synthse par les cellules du PSC dune molcule signal (S2), de type cytokine, qui diffuse dans la glande pour atteindre les prohmocytes. Nous ne pouvons cependant pas exclure la possibilit que cette activation puisse se faire par des contacts cellulaires entre les cellules du PSC et les prohmocytes. Lobservation rcente que les cellules du PSC forment de longues extensions cytoplasmiques de type filopodes (M. Crozatier, communication personnelle), suggre cette ventualit. De plus, des cellules Col+ semblant provenir du PSC sont parfois observes dans dautres zones des lobes primaires, et pourraient informer les prohmocytes plus loigns. Nanmoins, ces cellules Col+ sont rares. Nous pouvons aussi proposer que les filopodes sont impliqus dans les processus de spcification des cellules cristaux. Ceci serait en accord avec le rle du couple ligand-rcepteur Ser-Notch dans la diffrenciation de ces cellules. Pour son rle dans la spcification des muscles embryonnaires, col est exprim dans chaque hmisegment par la cellule prcurseur des muscles DA3 et DA5. Lexpression de col est ensuite restreinte dans les muscles DA3, o il contrle leur dveloppement, mais la spcification des muscles DA5 ncessite la rpression de col par Notch (Crozatier and Vincent, 1999). De faon intressante, ces deux partenaires Col et Notch sont impliqus dans les choix de lignages de diffrentes cellules musculaires et hmocytaires. En effet, nous savons que la voie Notch est implique dans la diffrenciation des cellules cristaux, et quelle est galement ncessaire la diffrenciation des lamellocytes, puisque des larves Notch thermosensibles, leves temprature restrictive, produisent beaucoup moins de lamellocytes suite une infection parasitaire (Duvic et al., 2002). Compte tenu de ces informations, une interaction entre la voie Notch et col dans le dveloppement du systme hmatopotique peut tre envisage, dautant plus que la surexpression dune forme active du rcepteur Notch dans les cellules du PSC semble altrer lexpression de col (M. Crozatier, communication personnelle). Cette dualit entre Col et Notch 61

Chapitre II : Etude du facteur Collier

pourrait tre un facteur important de la balance de diffrenciation des prcurseurs hmocytaires de la glande de la lymphe. Des tudes supplmentaires sont ncessaires pour dfinir la nature relle de cette interaction. Plusieurs travaux ont mis en vidence le rle de la voie JAK/STAT dans le processus de diffrenciation des lamellocytes en rponse aux infections parasitaires. Les mutations perte-defonctions qui affectent les composants de la voie JAK/STAT sont associes un dfaut de diffrenciation des lamellocytes (Sorrentino et al., 2004). En revanche, la mutation gain-defonction hopTum-l conduit une diffrenciation massive des lamellocytes (Harrison et al., 1995; Luo et al., 1995). Par pistasie, nous avons montr que les mutations nulles col nabolissent pas le phnotype associ la mutation gain de fonction hopTum-l (non publi), ce qui nous suggre que la voie JAK/STAT fonctionne en aval de Col. Deux possibilits sont alors envisageables. La voie JAK/STAT pourrait fonctionner dans les cellules du PSC pour transmettre le signal S1 et induire lexpression du signal S2. Cette possibilit suppose que la voie JAK/STAT soit sous la dpendance du rcepteur R1. La deuxime possibilit est que la voie JAK/STAT agisse dans les prohmocytes sous le contrle du rcepteur R2. Dans ce dernier cas, la voie JAK/STAT contrlerait lexpression des gnes de spcification des lamellocytes. Enfin, je conclurai cette discussion sur lambigut de la fonction de Col dans les cellules du PSC. Nous ne comprenons pas encore quel niveau le facteur Col agit. Est-il ncessaire pour induire lexpression dun rcepteur de surface qui puisse reconnatre les signaux (S1) provenant de lextrieur ? Si oui, la surexpression du facteur Col ne devrait pas forcer la diffrenciation des lamellocytes, moins que cette surexpression ne finisse par provoquer une transcription accrue du rcepteur en question. A son tour, la grande quantit de rcepteurs la surface des cellules pourrait entraner leur dimrisation et leur autoactivation, et ainsi lactivation des voies fonctionnant en aval. Une autre ventualit serait que Col soit impliqu dans la rgulation de lexpression du gne codant le signal S2. Cependant, S2 devrait alors tre exprim de faon permanente puisque Col est prsent dans les cellules du PSC en conditions non infectieuses et cette expression ne subit aucune modification suite une infection parasitaire. De fait, nous avons pu remarquer plusieurs reprises par immunolocalisations que Col prsente une localisation cytoplasmique dans de nombreuses cellules du PSC et nuclaire dans dautres (donnes personnelles, non publies). Cette observation suggre la possibilit que Col soit squestr dans le cytoplasme pour tre transport dans le noyau lors dune infection parasitaire. Avec cette hypothse, la surexpression de Col

62

Chapitre II : Etude du facteur Collier

devrait suffire forcer la diffrenciation des lamellocytes, mais aucune rgulation de ce type na, jusqu prsent, t rapporte pour Col dans la bibliographie.

V. Objectifs : A la recherche des partenaires de Col

Aprs le dcryptage du rle de Col dans lhmatopose de la drosophile, la suite de mon travail avait pour but dapporter de nouvelles informations molculaires sur les contrles gntiques qui rgulent la spcification des lamellocytes. Lobjectif de ce projet tait didentifier de nouveaux gnes qui sintgrent dans le modle de rponse antiparasitaire que nous avons propos. Lapproche exprimentale laquelle jai particip a consist en ltude des transcrits de la glande de la lymphe par puces ADN Affymetrix. Les mutants col sont incapables de monter une rponse antiparasitaire, ce qui suppose que ce facteur contrle lexpression de gnes qui sont importants pour lintgration et la transmission des signaux dalerte. Bien que nous ne connaissions pas le mcanisme daction exact du facteur Col dans lhmatopose de la drosophile, sa surexpression entrane la diffrenciation des lamellocytes, et donc lactivation des gnes qui permettent la dtermination de ce lignage. Pour rechercher les gnes cibles du facteur Col, nous avons compar lactivit transcriptionnelle dorganes hmatopotiques dans lesquels nous avons forc la diffrenciation des lamellocytes par surexpression de Col, celle de glandes de la lymphe contrles. En analysant les donnes des puces, nous avons trouv de nombreux gnes dont lexpression est altre par la surexpression de Col. A titre dexemple, 122 gnes prsentent une augmentation du niveau dexpression dau minimum deux fois. Parmi les gnes dont lexpression est augmente, notre attention sest particulirement porte sur les gnes codant des protines transmembranaires qui pourraient jouer le rle de rcepteur pour les signaux S1 ou S2. Un gne particulirement intressant a attir notre attention. Il est annot CG14225 dans les bases de donnes. Ce gne, jusque l non caractris, code un rcepteur homologue des rcepteurs de cytokines de type gp130 des mammifres. Dans le troisime chapitre des rsultats, je prsenterai les caractristiques des rcepteurs gp130 ainsi que leurs fonctions dans le systme hmatopotique des mammifres. Je dcrirai ensuite les donnes prliminaires qui nous suggrent que CG14225 est un bon candidat pour coder le rcepteur R2 de notre modle. Les approches par transgense que nous avons adoptes ne nous ont pas permis jusquici de dmontrer une fonction

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Chapitre II : Etude du facteur Collier

de ce gne dans lhmatopose de la drosophile. Je prsenterai les stratgies que jai dveloppes pour gnrer des mutants nuls, qui seuls nous permettront de conclure sur son implication.

64

CHAPITRE III :

Les homologues des rcepteurs IL-6R des mammifres dans lhmatopose de la drosophile

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Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

Les homologues des rcepteurs IL-6R des mammifres dans lhmatopose de la drosophile

I. Introduction
Nous avons identifi partir des puces ADN le gne CG14225. Dans les glandes de la lymphe surexprimant le facteur Col, ce gne est 1.8 fois plus fortement transcrit que dans les glandes contrles sauvages. Ce gne code une protine transmembranaire prsentant de nombreuses caractristiques des rcepteurs de type IL6-R/gp130 des mammifres. Cette caractristique fait de lui un candidat intressant puisque cette famille de rcepteurs signale par la voie JAK/STAT, et nous avons montr au laboratoire, par pistasie, que la voie JAK/STAT fonctionne en aval de Col dans le programme de diffrenciation des lamellocytes.

A. Les rcepteurs cytokines de la famille IL-6R des mammifres

LInterleukine-6 (IL-6), lIL-11, loncostatine M (OsM), le leukemia inhibitory factor (LIF), et le ciliary neutrophic factor (CNTF) sont des cytokines appartenant la famille des cytokines dites de type IL-6 (Ernst and Jenkins, 2004; Heinrich et al., 2003). Ces cytokines prsentent des redondances fonctionnelles dans la rgulation de la prolifration, la diffrenciation et la maturation de cellules appartenant plusieurs lignes hmatopotiques. Limportance des cytokines de la famille IL-6 dans la rgulation de lhmatopose a t dmontre avec des souris portant des modifications gntiques dans les gnes codant ces interleukines ou leurs rcepteurs. Par exemple, les souris KO pour IL6 ou LIF prsentent une diminution svre du nombre de cellules souches hmatopotiques (Ernst and Jenkins, 2004). Les rcepteurs des cytokines de la famille des IL-6 (IL-6R) sont caractriss par la prsence, dans leur rgion extracellulaire dune srie de domaines Fibronectine-type-III (FNIII) et dun domaine Immunoglobulin-like (Figure 14). Chaque rcepteur contient au minimum un Cytokine Binding Module (CBM) compos de deux domaines FNIII, lesquels renferment quatre rsidus cystines clefs dans la rgion N-terminale, ainsi quun motif WSXWS en Cterminal. Ce CBM est indispensable pour linteraction avec le ligand. Les rcepteurs de la famille des IL-6R sont composs de deux types de sous-units, a et b. De faon gnrale, les cytokines IL-6 se lient des rcepteurs a qui leur sont spcifiques, et qui 66

Mammifres Mammif

Drosophile

domaines

LIFR

OsMR gp130

Domeless Latran CNTFR

Ig-like CBM FNIII N C

Figure 14 : Les rcepteurs de la famille IL-6R des mammifres et leurs homologues chez la drosophile. Les domaines Fibronectin III (FNIII) sont reprsents
en rouge. Les modules de fixation aux cytokines (reprsents en vert) sont composs de deux domaines de type FNIII: un domaine N-terminal (CBM N) renfermant quatre cystines conserves, et un domaine C-terminal (CBM C) avec un motif WSXWS essentiel pour la signalisation. Les rcepteurs IL-6R des mammifres possdent un motif Immunoglobulinlike. CNTFR est un rcepteur a, alors que LIFR, gp130 et OsMR sont des rcepteurs b. Deux rcepteurs homologues des IL-6R existent chez la drosophile. Les comparaisons de squence rvlent que Domeless est plus le plus proche de CNTFR alors que Latran est un homologue de gp130.

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

sont exprims de faon restreinte. Les rcepteurs a nont pas de capacit de signalisation intrinsque, et la transmission du signal ncessite le recrutement et la dimrisation de rcepteurs b (Figure 15). La redondance fonctionnelle des cytokines de la famille IL-6 rsulte de lutilisation commune dune sous-unit b rceptrice, appele gp130 et qui, elle, est exprime de faon ubiquitaire. Les autres sous-units b sont spcifiques une ou plusieurs cytokines et sont exprimes de faon restreinte. Deux cas de figures sont possibles en fonction des couples ligand-rcepteur. La fixation de IL-6 et IL-11 sur leur rcepteur a spcifique, respectivement IL-6Ra et IL-11Ra, induit lhomodimrisation du rcepteur b gp130 pour permettre la signalisation intracellulaire (Figure 15A). Les autres membres de cette famille de cytokine, aprs fixation sur leur sous-unit a spcifique, provoquent la dimrisation de gp130 avec une autre sous-unit b, LIFRb ou OsMRb, fonctionnellement et structuralement similaires gp130 (Figure 15B). Les rcepteurs b sont associs, dans leur rgion cytoplasmique, des kinases de la famille JAK. Le mode dactivation privilgi est que la dimrisation des rcepteurs b rapproche leurs kinases JAK qui vont alors se phosphoryler. Cependant, certains dimres de rcepteurs b ont pu tre observs, par cristallographie et par co-immunoprcipitation, en absence de leur ligand, ce qui suggre un mode daction alternatif. Dans ce modle la dimrisation des rcepteurs b est indpendante du ligand et prcde sa fixation. Les kinases JAK seraient actives par un changement de la conformation des rcepteurs suite la fixation du ligand. Un tel mode daction a t dmontr pour le rcepteur linsuline, dont la structure prsente de nombreuses homologies avec le rcepteur gp130 (Grotzinger, 2002). Une fois les kinases actives, elles phosphorylent les rcepteurs b au niveau de rsidus tyrosines clef de la rgion cytoplasmique. Les tyrosines phosphoryles dans la rgion distale reprsentent des sites de fixation pour les facteurs STAT. Tous les rcepteurs de la famille des IL6R induisent lactivation des facteurs STAT3, et avec une affinit plus faible STAT1. Les STAT sont activs par une phosphorylation qui est JAK dpendante, et qui induit leur dimrisation ainsi que leur transport dans le noyau o ils rgulent lexpression de gnes cibles. La phosphorylation dune tyrosine en position proximale facilite la fixation des rgulateurs ngatifs de type SOCS, et ragit galement avec la phosphatase SHP2 qui, une fois phosphoryle, active les voies MAPK et PI3K. Ces voies sont impliques dans la protection des cellules contre lapoptose (Heinrich et al., 2003).

67

homodimre gp130

htrodimre gp130/LIFR

CNTF IL-6

IL-6R

CNTFR

a
P

a JAK
P P P P P P P P

JAK
P P P P

STAT1/3

SHP2

MAPK
STAT1/3
P

STAT1/3

Figure 15 : La signalisation par les rcepteurs de la famille IL-6R chez les mammifres. La fixation du ligand son rcepteur a active la dimrisation des sous-units b
pour transmettre le signal lintrieur de la cellule. Les cytokines IL-6 et IL-11 induisent la formation dun homodimre gp130 (A), alors que les autres cytokines de la famille des IL-6 (OsM, LIF, CNTF) provoquent la dimrisation du rcepteur gp130 avec la sous unit b LIFR (B) ou OsMR (non reprsente). La fixation du ligand et la dimrisation des sous-units b entranent la phosphorylation de rsidus tyrosines clefs par les kinases JAK associes aux rcepteurs. Ces phosophorylations sont indispensables pour activer deux cascades de signalisations intracellulaires, SHP2/MAPK et STAT1/3.

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

Le rcepteur gp130, en contrlant lactivation des facteurs STAT1 et 3, est un rcepteur important pour la rgulation de nombreux processus hmatopotiques. Les souris dficientes pour la sous-unit gp130 prsentent un blocage de lhmatopose ftale accompagn dune rduction importante du nombre de progniteurs hmatopotiques. Une activation persistante de STAT3 est frquemment observe dans des dsordres hmatologiques de type myloprolifratifs et lymphoprolifratifs (Benekli et al., 2003; Ernst and Jenkins, 2004).

B. Les homologues des rcepteurs IL-6R/gp130 chez la drosophile

Un seul rcepteur de la voie JAK/STAT est fonctionnellement identifi chez la drosophile, ce rcepteur, appel Domeless (Dome, galement connu sous le nom de MOM pour Master Of Marelle), prsente de nombreuses caractristiques des rcepteurs IL-6R voqus plus haut (Brown et al., 2001; Brown et al., 2003; Chen et al., 2002) (Figure 14). Sa squence protique sapparente davantage CNTFR et LIFR. Lactivation de la voie JAK/STAT dans lectoderme des embryons de drosophile ncessite lhomodimrisation de Dome (Brown et al., 2003). Cependant, des donnes exprimentales suggrent que cette dimrisation est indpendante de son ligand Upd. Ainsi, la formation des homodimres Dome dans lectoderme est une premire tape pour permettre la fixation du ligand Upd et lactivation de JAK/STAT. Cette tude suggre galement la possibilit que Dome puisse former un htrodimre avec un deuxime rcepteur encore inconnu. En effet, dans certains tissus o la voie JAK/STAT est active, lhomodimrisation de Dome na pas pu tre mise en vidence, alors que Dome est indispensable lactivation de la voie JAK/STAT pour toutes ses fonctions embryonnaires (Ghiglione et al., 2002) Aucun rcepteur supplmentaire pour la voie JAK/STAT na t fonctionnellement identifi chez la drosophile. Cependant, suite au squenage de son gnome, un autre gne codant une protine trs proche des rcepteurs IL-6R des mammifres a pu tre identifi (Hombria and Brown, 2002). Ce gne, annot CG14225, est adjacent dome et sa squence protique montre une grande homologie avec le rcepteur gp130 (Figure 14). Les domaines intracellulaires de Dome et CG14225 ne prsentent aucune homologie avec les motifs recenss dans les bases de donnes. Nanmoins, la rgion intracellulaire de Dome est indispensable pour sa fonction de signalisation, et des tudes pistatiques ont dmontr que dome interagit avec Stat92e (Chen et al., 2002) En rsum, les donnes dont nous disposons sont que les gnes dome et CG14225 sont les seuls dans le gnome de la drosophile qui codent des homologues des rcepteurs IL-6R. Les 68

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

rcepteurs IL-6R fonctionnent en troite collaboration avec la voie JAK/STAT chez les mammifres et le rle de Dome en tant que rcepteur de la voie JAK/STAT a t dmontr chez lembryon. Nous savons galement que la voie JAK/STAT est implique dans le programme de diffrenciation des lamellocytes et que le gne CG14225 est plus fortement transcrit dans les hmocytes lorsque nous y surexprimons le facteur Col. Ce contexte gntique, nous lavons vu dans le chapitre II, conduit lactivation du programme de diffrenciation des lamellocytes. Compte tenu de ces observations, nous avons considr que ces deux gnes reprsentaient de bons candidats pour tre impliqus dans la diffrenciation des lamellocytes. Dans notre quipe et usage interne, nous avons appel latran le gne CG14225. Je ferai donc rfrence au gne latran et la protine Latran dans la suite de mon rapport.

II. Donnes prliminaires

A. Latran et Domeless, deux candidats pour le rcepteur R2

La premire exprience que nous avons ralise fut de valider les donnes des puces ADN en vrifiant, par hybridation in-situ, que latran tait bien exprim par les hmocytes de la glande de la lymphe (Figure 16A,B). Nous avons ainsi observ que latran ny est pas transcrit de faon ubiquitaire. Son expression est dtecte dans les cellules de la zone mdullaire des lobes antrieurs, et dans les cellules des lobes postrieurs. Daprs les analyses morphologiques et immunohistochimiques effectues par Jung (2005, voir introduction), ce profil dexpression reflte essentiellement la distribution des prcurseurs hmocytaires dans la glande de la lymphe. latran est donc vraisemblablement exprim dans les prohmocytes. En revanche, contrairement dome qui est largement exprim au stade embryonnaire, aucune expression zygotique ou maternelle de latran na t dtecte par hybridation in-situ chez lembryon. De mme, les hybridations in-situ effectues sur des larves entires dissques na rvl aucune expression de latran dans un tissu particulier. Ces observations suggrent que Latran prsente un profil dexpression trs restreint, alors que Dome est plus largement exprim. Bien que les transcrits dome ne soient que trs faiblement dtects sur les puces ADN, et que son expression ne soit pas modifie par surexpression de col dans la glande de la lymphe, une tude rcente suggre que dome est exprim dans les prohmocytes (Jung et al., 2005). En effet, la pilote dome-gal4, o la rgion promotrice de dome contrle lexpression du transactivateur Gal4, 69

Zone Corticale Zone Mdullaire M

Lobes postrieurs post Lobes antrieurs ant

latran
Zone Corticale Zone Mdullaire M

latran

(Jung et al., 2005)

Lobes postrieurs post

dome

Figure 16: Expression de latran et domeless dans la glande de la lymphe. Par :

des hybridations in situ sur des glandes de la lymphe (A,C), nous observons que latran et domeless sont exprims dans un grand nombre dhmocytes des lobes postrieurs. Tous deux sont galement exprims dans la zone mdullaire des lobes antrieurs (B,D). Le pilote dome-gal4, qui permet lexpression dun gne rapporteur dans le domaine dexpression de dome, conduit lexpression de la GFP dans la zone mdullaire (D, Jung et al., 2005).

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

conduit prfrentiellement lexpression de gnes rapporteurs dans les hmocytes de la zone mdullaire (Figure 16C,D). En effet, par hybridation in-situ, nous avons pu constater que Dome est exprim dans les hmocytes de la zone mdullaire, ainsi que dans les hmocytes des lobes postrieurs. Si nous nous basons sur les caractristiques structurales des protines Latran et Dome, et sur leur domaine dexpression spcifique dans la glande de la lymphe, elles pourraient toutes deux correspondre au rcepteur R2 de notre modle. Sachant que les rcepteurs de la voie JAK/STAT chez les vertbrs agissent en tant quhomodimres ou htrodimres, nous avons considr trois possibilits : i) Latran agit sous la forme dun homodimre comme rcepteur de la voie JAK/STAT pour la diffrenciation des lamellocytes ; ii) Dome agit seul dans ce processus, ou encore iii) Latran et Dome agissent ensemble sous la forme dun htrodimre.

B. Les approches transgniques

De nombreuses lignes de drosophiles mutantes pour dome sont disponibles dans les Stocks Center . Cependant, toutes les perte-de-fonctions dome provoquent une ltalit embryonnaire cause par de nombreux dfauts dveloppementaux. Les embryons perte-defonctions meurent avant lclosion, ce qui nous empche dtudier directement les effets de la mutation dome sur lhmatopose larvaire de la drosophile. En ce qui concerne latran, aucune ligne mutante nest disponible lheure actuelle, que ce soit dans les Stock Center, ou dans les diverses banques dlments P (lment transposable, qui en sinsrant dans le gne dintrt gnre des allles nuls ou tronqus). Nous avons, dans un premier temps, adopt une stratgie de transgense pour tenter dlucider le rle potentiel des rcepteurs Latran et Dome dans les processus hmatopotiques de la drosophile. Technique de silencing par RNA interfrant Des lignes transgniques UAS-latranRNAi ont t gnres dans lquipe. La technique du RNAi permet dengendrer des mutants hypomorphes en dtruisant de faon spcifique les transcrits des gnes cibls. Bien que la diminution du niveau de transcrit ait t significative, aucun effet de la diminution dactivit de latran na t observ sur la spcification des lignages hmocytaires au stade larvaire. Les larves srp>latranRNAi infestes par les gupes endoparasites gardent leurs capacits produire de nombreux lamellocytes et former des capsules mlaniques. Les autres types hmocytaires, plasmatocytes et cellules cristaux, ne semblent pas davantage tre affects. Les formes Dominante-Ngatives 70

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

Deux lignes transgniques permettant la surexpression de deux formes dominantengatives (DN) du rcepteur ont galement t construites. Les constructions DN correspondent la protine Latran tronque de son domaine transmembranaire et/ou cytoplasmique. Nous avons galement rcupr des lignes transgniques portant des constructions DN similaires de Dome (don de J. Castelli-Gair Hombria). La surexpression de ces formes DN dans la glande de la lymphe avait pour but de bloquer la signalisation des rcepteurs correspondants en titrant leur ligand ou en inhibant leur dimrisation. Les larves surexprimant les formes DN de Latran ou de Dome ont t testes pour la production des lamellocytes aprs infection par L. boulardi : aucun effet na t observ. Les larves avaient un phnotype sauvage. La surexpression des formes natives Des lignes transgniques UAS-latran permettant la surexpression de la forme native du rcepteur ont t tablies. Nous avons de mme rcupr des lignes UAS-dome (don de J. Castelli-Gair Hombria). Nous avons test la surexpression de chaque rcepteur et son effet sur le dveloppement des hmocytes. La surexpression de Latran dans les hmocytes de la glande de la lymphe nentrane aucune modification dans les populations hmocytaires. En revanche, la surexpression de Dome provoque la diffrenciation de lamellocytes. La double surexpression provoque un phnotype intermdiaire. Conclusions Les rsultats que nous avons obtenus par la surexpression des formes natives des rcepteurs sont en accord avec la possibilit que Dome est impliqu dans la diffrenciation des lamellocytes. Dautre part, bien quils soient tous ngatifs, les rsultats que nous avons obtenus avec les diffrentes constructions latran (RNAi, DN et natif) ne nous permettent pas de conclure sur le rle de Latran dans la diffrenciation des lamellocytes. En effet, des critiques peuvent tre apportes pour chacune des approches transgniques dcrites ci-dessus. Ces critiques, dont je parlerai dans la discussion du chapitre III, mettent en vidence les limites des approches par surexpression pour lanalyse fonctionnelle dun gne. Il est toujours indispensable davoir recours un mutant nul. Dans le but danalyser de faon incontestable limplication de Latran dans la diffrenciation des lamellocytes, jai dvelopp deux approches diffrentes pour invalider le gne latran et gnrer des lignes mutantes perte-de-fonction.

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Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

III.

Gnration dun mutant latran perte-de-fonction

A. Mutagense par mobilisation dlments P

1. Principe Lorsque lon ne dispose pas de lignes mutantes pour un gne dintrt, la drosophile offre, outre les procds de mutagense classiques (agents chimiques tel que lEthyl-Mthane-Sulfonate), la possibilit dutiliser des transposons (par exemple llment P) comme source mutagne. Le but est dinsrer un lment P dans la rgion promotrice du gne, ou alors directement dans le gne, de faon perturber son expression et gnrer des mutants nuls ou hypomorphes. Chez la drosophile, il est possible de manipuler la transposition dun lment P. Le procd repose sur lutilisation dune ligne de drosophile portant un lment P dfectif. Un lment P dfectif est immobile car il ne contient plus le gne de la transposase, lenzyme qui catalyse les vnements de transposition. La mobilisation de cet lment P dfectif est obtenue en croisant la ligne de dpart avec une ligne portant un autre transposon qui apporte la transposase. Ce dernier transposon ne peut pas lui-mme tre transpos car ses extrmits ont t modifies pour que la transposase ne puisse lexciser. Pour arrter le processus de transposition, il suffit de retirer la source de transposase la gnration suivante. Une fois quun lment P sest insr dans le gne cible ou proximit, on peut dans un deuxime temps provoquer des excisions imprcises du transposon, et slectionner par la suite les vnements qui ont gnr des dficiences qui dltent le gne dintrt. Lintrt dune mutagense llment P est quelle ne ncessite pas dhypothse, priori, sur le phnotype attendu des mutants. On peut en effet utiliser un crible uniquement molculaire, qui dtecte linsertion dun lment P dans la rgion gnomique. Ce crible est bas sur une stratgie de PCR. Lors dune transposition, llment mobile a une forte tendance sintgrer localement, proximit de son site dorigine (Tower et al., 1993). Ainsi, pour obtenir une insertion dans la rgion du gne latran, il est judicieux de partir dune ligne transgnique portant un lment P le plus proche possible. Jai donc, dans un premier temps, recherch les bons outils pour cette mutagense.

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Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

2. Recherche dlments P proches de latran Jai interrog les banques de donnes de drosophile (BDGP, Flybase), pour trouver les lments P dans la rgion du gne latran. Ce gne, situ sur le chromosome X, est bord en amont par dome, et en aval par le gne Zwischenferment (Zw) (Figure 17A). Le gne Zw a une orientation inverse de latran et code une Glucose-6-Phosphate Dshydrognase. Plusieurs lments P sont insrs dans la rgion promotrice de dome, ainsi que dans sa rgion 5UTR. Dautres lments P sont insrs dans la squence du gne Zw. Ces deux groupes de transposons sont ainsi situs proximit de latran, environ 8 kb de son site dinitiation de la transcription. Cette proximit rendait envisageable une approche de mutagense par sauts locaux. 3. Mobilisation de llment P par sauts locaux Afin de gnrer de nouveaux sites dinsertion partir des lignes P{lacW}dome[G0PX] (X correspond au numro de la ligne mutante) et P{lacW}Zw[GE23], jai effectu les croisements suivants : G0 : 300 drosophiles femelles vierges portant llment P sont croises avec 100 mles apportant le gne de la transposase. Ces femelles proviennent des lignes pour lesquelles jai pu observer, dans un test pralable, les meilleures efficacits de mobilisation. La transposition est effective dans la ligne somatique et germinale et les drosophiles dysgniques sont identifiables par leurs yeux mosaques. G1 : Les vnements de recombinaison dans les cellules de la ligne somatique sont visibles cette tape. Les femelles vierges avec les yeux mosaques sont croises avec des mles portant le chromosome balanceur FM6w. G2 : Les vnements de recombinaison dans la ligne germinale peuvent tre identifis grce la pigmentation de lil des descendants. Le rapporteur mini-white en contexte w- confre aux yeux une coloration pouvant aller du jaune ple au rouge vif en fonction du site dinsertion de llment P. Afin dtablir les lignes mutantes, les femelles vierges chez lesquelles la mobilisation est effective sont croises avec des mles balanceurs FM6w. De cette manire, jai pu gnrer 1800 lignes mutantes, que jai ensuite cribles pour rechercher une insertion dans le gne latran. Jai pour cela utilis une stratgie de PCR. Pour chaque ligne, lADN gnomique a t prpar partir dune seule mouche.

73

A
5

domeless A C

latran

Zw 3

7,3 kb

0,3kb

B 3,3 kb

D
0,3kb

5,2 kb

P367 P405 P441

GE23

2 kb 2 kb

B
dome1

C
domeless
2 kb dome2 1 kb

gnotype

amplicon

PM
P441 FM7c dome FM7c

dome1/2 dome1-IR

dome2-IR

IR lment P IR Figure 17: Les lments P au voisinage de latran et la stratgie de PCR pour le : crible des lignes mutantes. (A) Organisation des gnes latran et domeless sur le chromosome X.
De nombreux sites dinsertion dlments P sont localiss dans la rgion promotrice de domeless, ainsi que sa rgion 5UTR. Un lment P est localis dans le gne Zw. Aprs mobilisation des lments P, les lignes sont testes par PCR, en utilisant deux couples damorces oligonuclotidiques (A-B et C-D) en combinaison avec une amorce spcifique pour llment P (IR). (B) La dtection des lments P par PCR a t teste avec les lignes de dpart P{lacW}dome en utilisant des amorces (dome1/2) qui entourent les sites dinsertions et lamorce IR. (C) Si un lment P est insr sur le chromosome entre deux amorces, deux fragments supplmentaires sont amplifis par PCR, qui rsultent de la combinaison de loligonuclotide IR avec les deux amorces dome1/2. PM: marqueur de taille.

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

Jai utilis deux couples damorces (A-B et C-D) permettant damplifier des fragments PCR (amplicons) denviron 2 kb chacun de faon recouvrir les 3.3 kb du locus latran (Figure 17A). Ces amplifications constituent les tmoins positifs de chaque raction de PCR. En effet, lADN qui sert de matrice aux ractions PCR provient de mouches qui portent la fois le chromosome mutagnis et le chromosome balanceur. Le chromosome balanceur sert de matrice pour lamplification des fragments tmoins. En plus du couple damorces spcifiques, jai introduit un oligonuclotide (IR) complmentaire des squences inversement rptes qui flanquent llment P, et orient vers lextrieur de llment. On obtiendra une amplification additionnelle (en plus du fragment tmoin) seulement si llment P sintgre proximit de la squence correspondant lune des amorces A, B, C ou D (Figure 17B,C). Avant de commencer le crible PCR, jai test la faisabilit dune telle approche et lefficacit damplification dune raction PCR avec un mlange de trois amorces. Jai utilis pour cela les lignes o les lments P sont insrs dans la rgion promotrice de dome. Pour ces PCR contrles, jai dessin un couple damorces spcifiques (dome1-dome2) que jai utilis en combinaison avec loligonuclotide IR. Ce test ma galement permis de contrler la prsence des lments P dans les lignes de dpart. Afin de minimiser les manipulations et le cot de lexprience, jai test dans chaque raction de PCR, non pas une ligne, mais un mlange de 5 lignes prsentant des vnements dinsertion indpendants. Une mise au point pralable mavait permis de dterminer que dans ces conditions jtais toujours capable de dtecter un vnement intressant dans lune des cinq lignes. 4. Rsultats Jai utilis pour la mutagense les lignes P{lacW}dome[G0PX], cest--dire celles qui prsentent des lments P insrs en 5 de dome. Dans un premier temps, jai vrifi que les lments P de dpart avaient t correctement exciss dans les lignes tablies. Pour cela, jai contrl labsence dlment P aux abords de dome dans 10% des lignes que jai gnres et choisies au hasard. Par PCR, avec la combinaison damorces dome1-dome2 et IR, je nai observ aucune amplification due la prsence dans le milieu ractionnel de lamorce IR. Ceci dmontrait lefficacit de la mobilisation. Jai analys chacune des 1800 lignes tablies par la stratgie de PCR dcrite plus haut. Malheureusement, dans aucune de ces lignes, je nai pu identifier dvnement dinsertion de llment P dans le gne latran. 74

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

Malgr la tendance des lments P se relocaliser prioritairement prs de leur site de dpart, une mutagense base sur leur mobilisation est alatoire. De fait, il doit tre possible dobtenir une insertion dans notre gne dintrt, mais cette fin ncessiterait un nombre bien suprieur de croisements et ltablissement de bien plus de lignes que nous ne lavions estim. En pratique, on remarque que les lments P ont des sites dinsertion privilgis appels hot spot . Un exemple concerne prcisment la rgion promotrice de dome pour laquelle un grand nombre de lignes P diffrentes sont disponibles. De mme, on remarque que certaines rgions sont rfractaires une insertion de llment P, ce qui pourrait tre le cas de latran car nos conditions de mutagense taient favorables une insertion. Nous avons alors opt pour une approche diffrente qui permet de gnrer une dltion prcise du gne dintrt par recombinaison homologue. Cette approche a linconvnient dtre assez longue, elle combine ltablissement de lignes transgniques et plusieurs tapes de croisements successifs. Nanmoins elle assure thoriquement une plus grande garantie de rsultats.

B. Invalidation du gne latran par recombinaison homologue

1. Le Knock-Out chez la souris La procdure dite de Knock-Out chez la souris consiste insrer une mutation, ou un gne rapporteur, dans la squence dun gne cible de faon a le rendre inactif. Pour cette technique, on utilise les cellules souches embryonnaires ES, qui sont transformes par un plasmide contenant la squence modifie du gne cible et appel fragment donneur. Par une recombinaison homologue, le fragment donneur va prendre la place de lallle sauvage dans le noyau de certaines cellules ES transformes. Une fois les cellules recombinantes ES slectionnes, elles sont rimplantes dans un blastocyte, qui est implant dans une femelle pour la gestation. Les cellules ES sont pluripotentes, ce qui signifie quelles sont capables de se diffrencier en tous les types cellulaires de la souris adulte y compris les cellules germinales. Les cellules manipules se divisent, puis se dveloppent dans diffrents tissus du souriceau, donnant naissance une souris chimre. Lorsque cette souris se reproduit, on recherche dans la progniture les souris provenant des gamtes issus des cellules ES modifies. Par croisement, il est ensuite possible de produire un mutant nul homozygote ayant perdu la fonction du gne inactiv.

75

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

2. Application de cette technique chez la drosophile pour la dltion de latran Cette stratgie de KO nest pas applicable au modle de la drosophile pour les raisons suivantes : a) il nexiste aucune ligne de cellules souches embryonnaires multipotentes chez la drosophile. La premire tape de modification ex vivo nest donc pas possible, et b) la rimplantation de cellules modifies dans lovaire des drosophiles adultes est galement impossible. Cependant, une approche alternative pour gnrer des KO par recombinaison homologue a t dcrite rcemment (Gong and Golic, 2003; Rong and Golic, 2000). Linconvnient tait dintroduire le fragment donneur dans les cellules germinales pour que la recombinaison puisse se faire. Linnovation provient de lide de produire in vivo le fragment donneur directement dans les cellules des mouches. Pour les recombinaisons ends-out classiques, le gne dintrt est invalid par linsertion dans sa squence dun gne rapporteur, qui permet galement la slection des vnements de recombinaison. Pour ma part, jai utilis une technique base sur la recombinaison ends-out pour gnrer une dltion complte du gne latran (Gong and Golic, 2004). Cette technique sopre en plusieurs tapes, que je vais dcrire dans la suite. a. Clonage du transgne donneur Le fragment donneur doit renfermer des rgions dhomologie du gne que lon dsire inactiver. Dans cette mthode, la rgion dhomologie du fragment donneur ne correspond pas la squence cible sur le gnome. Deux rgions dhomologie sont en fait utilises, qui correspondent aux squences flanquantes du gne dlter (en 5 et 3) (Figure 18). Lors de la recombinaison, les squences dhomologie vont se substituer en entranant le gne rapporteur mini-white dans le gnome et en provoquant la dltion du gne latran. Le vecteur de transgense pW25 (don de Franois Karch, Genve) correspond au vecteur de transformation pCaSpeR, driv de llment P, qui a t modifi pour lapplication dcrite cidessus (Gong and Golic, 2004). Des squences FRT et les sites de coupure pour la mganuclase ISceI ont t intgrs au vecteur. Les rgions gnomiques flanquantes du gne latran, dune taille de 4 kb chacune, ont t clones de part et dautre du gne rapporteur mini-white (Figure 18). Les sites FRT aux extrmits de la construction permettront par la suite dextraire le fragment donneur du gnome de la drosophile, sous laction de lenzyme flipase (FLP), et de gnrer une molcule extrachromosomique circulaire. Le site de coupure I-SceI, digr par la mganuclase de levure du mme nom, permettra de linariser la molcule double brin 76

domeless 5 homologie
Clonage des squences dhomologie 5 et 3 de part et dautre du rapporteur mini-white dans le vecteur pW25

latran

Zw 3 homologie

5 homologie
I-SceI

RT

pW25

HS-white

FR

I-SceI

3 homologie

Transformation dembryons de drosophile et tablissement des lignes transgniques

I-SceI

5 homologie

HS-white

3 homologie

I-SceI

FRT

FRT

Figure 18: Clonage du fragment donneur pour la recombinaison homologue.

Les squences de 4 kb flanquant le gne latran sont insres dans le vecteur pW25, de part et dautre du gne rapporteur mini-white. Ce vecteur est ensuite inject des embryons de drosophile pour tablir les lignes transgniques qui portent le fragment donneur pour la recombinaison (voir texte pour dtails).

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

circulaire. Il est ncessaire de prciser ce niveau quaucun site endogne pour la mganuclase I-SceI nexiste dans le gnome de la drosophile. b. La recombinaison et le crible des recombinants Le vecteur pW25 dans lequel jai clon les rgions flanquantes de latran a t inject des embryons de drosophile de faon tablir des lignes transgniques. Du fait de la taille importante du transgne insrer dans le gnome de la drosophile, lefficacit de transformation fut faible. Nanmoins, nous avons obtenu trois lignes indpendantes : deux lignes pour lesquelles les transgnes sont localiss sur le chromosome II, ainsi quune ligne avec une insertion sur le chromosome III. Plusieurs tapes sont ncessaires pour provoquer la recombinaison et gnrer les lignes mutantes : 1- Les lignes transgniques ont t croises avec une ligne portant les gnes de la FLP et de la mganuclase I-SceI sous le contrle dun promoteur inductible par la chaleur. Les larves issues de ce croisement ont t exposes un choc thermique (37C, 90 minutes) pour induire lexpression des enzymes FLP et I-SceI. 2- Nous avons rcupr au stade adulte les femelles vierges qui portent le chromosome donneur et le chromosome de la construction FLP et I-SceI. La majorit de ces femelles prsentaient des yeux white, traduisant lactivit de la FLP. Chez certaines femelles, quelques ommatidies de lil sont restes rouges, une coloration trs certainement cause par la non excision du fragment donneur dans ces cellules. A cette tape, la linarisation et/ou la recombinaison peuvent ne pas se produire. Pour slectionner les vnements dintgration du fragment donneur la place de latran, ces femelles ont ensuite t croises avec une ligne qui exprime une FLP constitutive. 3- Si lvnement dintgration est bon, lexcision des fragments donneurs ne peut plus se faire car les squences FRT sont perdues lors de la recombinaison (Figure 19). Ainsi, le rapporteur mini-white ne peut tre excis, et il faut rechercher dans la descendance les mouches mles et femelles qui ont les yeux colors. Ces croisements sont en cours. 4- Lors de ce dernier croisement, des vnements de recombinaison accidentelle peuvent engendrer des rptitions en tandem du fragment donneur. Les lignes tablies devront tre testes par une stratgie de PCR ou par Southern Blot pour vrifier la dltion du gne latran.

77

I-SceI

5 homologie

HS-white

3 homologie

I-SceI

FRT
Excision du fragment donneur par la Flipase

FRT

I-SceI

FRT

I-SceI
gie olog mol hom 5 h

3 homologie

HS-white Linarisation par la mganuclase I-SceI

I-SceI

5 homologie

HS-white

3 homologie

I-SceI

Fragment donneur

Recombinaison entre les rgions dhomologie

domeless 5 homologie
Le fragment donneur sinsre dans le chromosome la place des squences cibles

latran

Zw 3 homologie

domeless

HS-white

Zw

Figure 19: Dltion du gne latran par recombinaison homologue. Le fragment

donneur est excis et linaris sous laction des enzymes flipase et I-SceI. Dans la ligne germinale dune fraction de mouches, les rgions dhomologie du fragment donneur vont se substituer aux rgions homologues dans lADN gnomique. La recombinaison entrane la dltion du gne latran, qui est remplac par le rapporteur mini-white.

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

Une fois quun mutant sera isol, que la dltion sera dmontre molculairement et que la ligne sera tablie, il ne restera plus qu tester ses capacits diffrencier les lamellocytes en rponse une infection parasitaire. 3. Frquence des vnements de recombinaison Gong et Golic, qui ont labor cette technique, ont dmontr quune mutagense cible par la technique de recombinaison ends-out chez la drosophile est assez efficace pour permettre son utilisation. Ils ont calcul que le taux de remplacement dune squence cible par un gne rapporteur est denviron un vnement pour 400 gamtes. Cette frquence de recombinaison peut paratre basse, mais cette technique est tout fait ralisable avec le modle drosophile, qui est adapt ces techniques dtudes. En effet, un crible peut tre ralis chez la drosophile en croisant en masse plusieurs femelles vierges et mles du bon gnotype. Le grand nombre de mouches dans chaque descendance permet un crible rapide, dautant plus que le rapporteur utilis, ici la couleur de lil, est facilement identifiable.

IV.

Discussion et perspectives
Malgr les tudes prliminaires que nous avons ralises sur latran et dome, il est difficile,

lheure actuelle, dapporter une conclusion sur leur rle dans les processus hmatopotiques larvaires. Du fait que les mutants dome sont ltaux embryonnaires, et quaucun mutant pour latran ntait disponible, nous avons abord le sujet par une approche de surexpression et une approche RNAi. Dans ces expriences, nous navons observ aucun effet sur la diffrenciation des lamellocytes en rponse une infection par L. boulardi. Cependant, ce type dtude prsente de nombreuses limitations qui peuvent expliquer elles seules labsence des phnotypes recherchs. Les expriences de RNAi et les surexpressions de formes DN permettent de gnrer uniquement des mutations hypomorphes. En effet, bien que les formes DN agissent en titrant le ligand, il subsistera toujours quelques interactions entre le ligand et son rcepteur natif, permettant la transmission dun signal intracytoplasmique. De mme, la destruction des messagers par la technique des RNAi nest pas totale, et les transcrits rescaps latran pourraient permettre la synthse dune quantit suffisante de protine pour rpondre au signal S2. Cette hypothse serait dautant plus envisageable que la protine transmembranaire peut tre stable et sa demi-vie longue. Il est possible quune diminution mme substantielle de lactivit des rcepteurs Dome et Latran ne suffise pas abolir leur fonction. Dans ce cas de figure, une activit rsiduelle suffirait assurer 78

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

la transmission du signal dans la cellule, lequel peut tre pris en charge et amplifi par les voies de signalisation intracellulaires. Nous nous trouverions ainsi dans une situation du tout ou rien o uniquement la perte totale de fonction nous renseignerait de faon non-quivoque sur les rles de Dome et Latran. Un exemple prcis illustrant ce type de situation concerne la protase Persphone, implique dans la cascade protolytique activatrice de la voie Toll. Un RNAi dirig contre les transcrits psh ne suffit pas bloquer lactivation de la voie Toll en cas dinfection microbienne car la cascade protolytique amplifie le signal en aval (JM. Reichhart, communications personnelles). La surexpression de Dome dans les prohmocytes provoque lapparition de lamellocytes en circulation, ce qui prouve que Dome peut activer la voie JAK/STAT dans ces cellules. Cependant, des tudes ont montr que la surexpression de Dome dans plusieurs tissus embryonnaires ne provoque pas lactivation de la voie JAK/STAT (Brown et al., 2003). La formation des homodimres Dome y est indpendante de la liaison au ligand Upd et confre uniquement ces tissus la comptence rpondre au ligand. Linteraction de Dome avec son ligand est indispensable pour la signalisation. La diffrenciation de lamellocytes lors de la surexpression de Dome dans la glande de la lymphe nest pas en accord avec ce mode dactivation et suggre que celui-ci puisse tre diffrent dans ce tissu. Un fort niveau dexpression de Dome pourrait induire son homodimrisation constitutive la surface des prohmocytes, et constituer une modification suffisante pour activer la voie JAK/STAT et le programme de diffrenciation des lamellocytes. Si Latran rpond au mme mode dactivation que Dome dans les tissus embryonnaires, sa simple surexpression ne suffira pas activer les voies quil contrle. Dans lhypothse que Latran est impliqu dans la diffrenciation des lamellocytes, ce mode de fonctionnement explique aisment labsence de phnotype lors de sa surexpression. Des tudes supplmentaires sont lvidence ncessaire pour lucider limplication relle de dome et latran dans la diffrenciation des lamellocytes. Pour ltude de Dome, une alternative est dutiliser les mutations perte-de-fonction pour gnrer des clones mitotiques dans la glande de la lymphe. Ces clones mitotiques dome peuvent tre obtenus par le systme recombinase FLP/FRT. Des expriences tests ont mis en vidence quil est difficile, mais nanmoins possible, dobtenir des clones recombinants dans la glande de la lymphe. Le but est de dterminer si les prohmocytes des clones mitotiques dome gardent leur capacit se diffrencier en lamellocytes suite une infection par L. boulardi. A cette tape, il est impratif de pouvoir reconnatre dans la glande de la lymphe les cellules du clone mutant et les lamellocytes. Les cellules mutantes seront reconnues par labsence de GFP (Green Fluorescent Protein) dans un contexte GFP+. Les lamellocytes devront tre identifis par immunohitochimie. 79

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

Le problme pour une telle tude provient du fait que nous ne disposons pas pour le moment danticorps marqueur de lamellocytes. Je me suis donc propos de produire un anticorps qui nous permettra de raliser ces expriences. Nous avions identifi lintgrine aPS4 comme un marqueur spcifique des lamellocytes (Chapitre I, Article I) et jai choisi de produire lanticorps contre cette protine. Les intgrines de la drosophile sont peu nombreuses et prsentent de grandes homologies de squences. Par des alignements, jai identifi une courte squence de 48 acides amins spcifique de lintgrine aPS4, que jai alors choisie pour produire un antigne. Jai produit en masse une protine de fusion GST-Ag(aPS4) en systme bactrien, que jai ensuite purifie et digre pour isoler le peptide antignique. Ce peptide est en cours dinjection des lapins et nous esprons quun anticorps spcifique des lamellocytes pourra tre purifi partir du srum. Si Latran est impliqu dans la diffrenciation des lamellocytes est juste, il sera dune grande utilit de disposer dun anticorps spcifique contre ce rcepteur. Jai ainsi produit, en parallle aPS4, un polypeptide correspondant la partie intracellulaire de Latran que jai ensuite purifi. Ici encore, le peptide est en cours dinjection des lapins. Un anticorps spcifique contre Latran nous permettra des expriences dimmunohisto- et cytochimie, mais galement de biochimie pour des (co-)immunoprcipitations et pour identifier ses partenaires. Nous avons vu que les rcepteurs Latran et Dome ont des caractristiques structurales trs intressantes qui nous interpellent sur leur(s) fonctions potentielle(s) dans lhmatopose. Si, de fait, ces rcepteurs ne sont pas impliqus dans le mcanisme pour lequel nous les avons tudis, leur expression conjointe dans les prohmocytes de la glande de la lymphe devrait nanmoins reflter une fonction dans ces cellules. Il sera alors important de rechercher ces fonctions. Le mutant latran qui est en cours de gnration, les clones mitotiques pour dome ainsi que les anticorps en cours de production seront des outils indispensables pour ces recherches. A terme, il sera intressant de dterminer le mode de fonctionnement de ces deux rcepteurs homologues des IL-6R de mammifres, cest--dire savoir si ceux-ci agissent uniquement en tant quhomodimres, ou bien si un htrodimre des deux rcepteurs est fonctionnel. Des investigations sont menes en parallle dans notre quipe pour tenter didentifier les ligands qui peuvent lier Dome et/ou Latran dans les prohmocytes. Nous nous sommes pour le moment intresss aux ligands connus de Dome : la famille des Upd (Upd, Upd2 et Upd3). Les travaux sont prliminaires et ne nous permettent pas, pour le moment, de les impliquer dans la diffrenciation des lamellocytes. Upd3 nous parat un candidat particulirement intressant car une tude a montr que le pilote upd3-gal4 conduit une forte expression dans les cellules du PSC (Jung et al., 2005). 80

Chapitre III : Les rcepteurs de type IL-6R de drosophile

Lensemble de ce travail est men en proche collaboration avec lquipe toulousaine dAlain Vincent et Michle Crozatier. Ils ont rcemment identifi un gne candidat pour le rcepteur R1. Ce rcepteur est exprim spcifiquement par les cellules du PSC et cette expression diminue chez les mutants col. Ce rcepteur est actuellement ltude dans leur quipe, selon des approches similaires aux ntres.

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-DISCUSSION GENERALE-

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Discussion gnrale

Les travaux que jai dvelopps au cours de mes trois annes de thse ont procur des informations sur deux thmes centraux : lactivit transcriptionnelle des hmocytes de la drosophile, et la rgulation gntique de la diffrenciation des lamellocytes suite une infection parasitaire. En premier lieu, ltablissement du transcriptome des diffrentes populations hmocytaires nous permet davoir aujourdhui une vue plus prcise et plus tendue des activits transcriptionnelles des hmocytes et de leurs fonctions. Les puces nous fournissent des indications pour identifier, par exemple, des marqueurs molculaires ou les effecteurs possibles de la rponse antibactrienne des cellules sanguines. Elles nous procurent galement des indications sur les voies de signalisation qui peuvent tre impliques dans les diffrentes fonctions des hmocytes, telles que la phagocytose, la mlanisation et lencapsulement. En ce sens, nous avons tabli une banque dinformation qui servira comme base de rfrence pour les tudes futures sur les cellules sanguines de la drosophile. On observe un intrt grandissant de la communaut scientifique pour les mcanismes de rgulation de lhmatopose de la drosophile depuis que de nombreuses similitudes gntiques et dveloppementales avec celle des mammifres ont t mises en vidence. Nos travaux sur le rle du transactivateur Collier dans la spcification du lignage lamellocyte souligne une fois encore les nombreuses ressemblances que nous pouvons trouver entre ces deux systmes hmatopotiques. Nous avons apport de nouvelles informations en dmontrant que les molcules de type Col/EBF permettent de spcifier, aussi bien chez la drosophile que chez les mammifres, des cellules sanguines qui prsentent des caractres adaptatifs. Lensemble des rsultats obtenus dans cette tude nous men proposer un modle de rponse une infection parasitaire qui met en uvre un mcanisme plus sophistiqu que celui imagin auparavant, savoir une intgration en plusieurs tapes du signal dinfection par plusieurs types de cellules, qui aboutit la diffrenciation des prohmocytes en lamellocytes. La poursuite de ce travail nous a conduits ltude de deux rcepteurs homologues des rcepteurs IL-6R de mammifres, cods par les gnes domeless et CG14225, lequel na pour le moment pas t caractris. Des tudes prliminaires nous suggrent que ces rcepteurs pourraient tre impliqus dans les mcanismes molculaires qui permettent la diffrenciation des lamellocytes suite une infection parasitaire. Jai dvelopp des outils pour analyser limplication de ces deux gnes dans ce processus. Jai galement gnr des perte-de-fonction pour CG14225 et les lignes sont en cours dtablissement. Nous esprons terme pouvoir dterminer le rle de ces rcepteurs dans lhmatopose de la drosophile.

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Rfrences bibliographiques

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