Isolamento e Purificao de Biomolculas Aula 07

CFBio 2010 Emanuel Carrilho

DETECTORES PTICOS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA 13.f. Detectores 13.f.1. Detectores de absorvncia no UV-vis 13.f.2. Detectores de absorbncia no Infravermelho 13.f.3. Detectores de fluorescncia 13.f.4. Detectores Refratomtricos 13.f.5. Outros: eletroqumicos, espalhamento, radioatividade 13.f.6. Detectores por Espectrometria de Massas

DETECTORES
monitoramento do efluente que sai da coluna ESTRATGIAS: medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas, amostras e fase mvel medidas de uma propriedade da amostra que no apresentada pela fase mvel deteco aps eliminao da fase mvel

DETECTOR IDEAL
alta sensibilidade e baixo limite de deteco resposta rpida a todos os solutos insensibilidade a mudanas de temperatura e na vazo da fase mvel resposta independente da fase mvel pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto no destruio do soluto segurana e convenincia para uso informao qualitativa do pico desejado

DETECTORES
2 TIPOS: SELETIVO versus UNIVERSAL UNIVERSAL: responde s propriedades da fase mvel (ndice de refrao, constante dieltrica ou densidades, moduladas pela presena do soluto) SELETIVO: responde s propriedades do soluto (absorvncia no UV-vis, fluorescncia, corrente de difuso) que a fase mvel no possui

UV-vis: detector por espectrofotometria no UV-vis FLU: detector por fluorescncia

IRef: detector por ndice de refrao ELETR Hg: detector eletroqumico (Hg gotejante)

COND E: detector por condutividade eltrica

detector

CARACTERSTICAS DE ALGUNS DETECTORES

UV-vis FLU IRef ELETR Hg

COND E

princpio de operao tipo quantidade mnima de deteco (g/mL) faixa de linearidade volume da cela (mL) sensibilidade temperatura sensvel vazo da fase mvel til com gradientes aplicaes
Tabela IX-12 Collins p219

PARMETROS (da tabela anterior)

sensibilidade: relao entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal (termo relativo, depende da amostra) linearidade: faixa linear do sistema onde o sinal do detector diretamente proporcional concentrao do soluto; se concentrao da amostra muito alta (diluies apropriadas) limite mnimo de deteco: menor quantidade da substncia que pode ser detectada, produzindo um sinal igual ao dobro do nvel de rudo do instrumento; rudo a variao do sinal do instrumento que no atribuda amostra e pode ser produzida por falhas eletrnicas, aparelhos mal aterrados, variaes de vazo ou temperatura, flutuaes na tenso, bolhas de ar no detector, etc. variaes na composio da fase mvel podem produzir grandes flutuaes na linha de base, principalmente nos casos de eluio por gradiente

NMERO DE TRABALHOS PUBLICADOS EM LC

at 1982: 365 trabalhos publicados 71%: UV-vis 15%: fluorescncia 5,4%: ndice de refrao 4,3%: eletroqumico 4,3%: outros UV-vis: 39%: baseados em linhas de emisso do Hg) 13%: radiao filtrada de uma fonte de deutrio 48%: radiao emitida de um monocromador de rede

DETECTORES DE ABSORVNCIA
PRINCPIO: absorvncia da luz por parte da amostra ao passar atravs desta qualquer radiao eletromagntica (normalmente do ultravileta at o infravermelho) resposta seletiva: s detecta os componentes da amostra que absorvem a radiao no comprimento de onda selecionado; grande maioria das substncias absorvem radiao UV (substncias com eltrons ou eltrons desemparelhados), por exemplo olefinas, compostos aromticos e compostos contendo >C=O, >C=S, -N=O e N=N-

DETECTORES DE ABSORVNCIA CELA EM Z

volume mantido pequeno para minimizar alargamento de banda: 1-10 L comprimento: 2-10 mm P < 600 psi (redutor de presso requerido

DETECTORES DE ABSORVNCIA
2 TIPOS: comprimento de onda fixo (fotomtrico): sensvel e econmico comprimento de onda varivel (espectrofotomtrico): verstil ambos, relativamente insensveis a variaes de vazo ou temperatura; sensiblidades de at 0,001 unidades de absorvncia; possvel a deteco de dcimos de nanograma (10-10g) muitos instrumentos so de duplo feixe: um feixe passa pela cela da amostra/eluente, e outro passa por um filtro que reduz sua intensidade; detectores piezoeltricos geminados so usados para comparar a intensidade dos dois feixes; alternativamente, um sistema de recorte de feixe usado em conjuno com um nico fototubo; cromatogramas: grficos do log da razo dos sinais dos transdutores em funo do tempo instrumentos de feixe simples tambm so encontrados: medidas da intensidade do solvente so armazenadas em memria e depois recuperadas para o clculo da absorvncia

DETECTORES DE ABSORVNCIA comprimento de onda fixo

radiao de uma fonte de mercrio de baixa presso transmitida atravs da amostra quantidade de radiao no absorvida (transmitida) atinge a clula fotoeltrica da amostra (fotomultiplicador) a radiao da fonte dirigida atravs de um divisor de feixe para a cela de referncia, e atinge a clula fotoeltrica de referncia a diferena de corrente das duas clulas fotoeltricas alimenta um amplificador, que gera um sinal de sada para o registrador

a maioria dos detectores de comprimento de onda fixo opera em 254 nm (filtro) e 280 nm

DETECTORES DE ABSORVNCIA faixa do visvel

alguns compostos absorvem na regio visvel do espectro eletromagntico e podem ser analisados com detectores que funcionam nessa regio do espectro reagentes podem ser adicionados ao efluente de maneira contnua, ou peridica, para formar compostos coloridos que podem ento ser monitorados (derivao ps-coluna); exemplo: aa com ninidrina (cor prpura) detectado a 570 nm detectores de absorvncia (lmpadas de tungstnio) podem ter comprimento de onda fixo ou varivel com monocromador

cobrindo a faixa de 190 a 800 nm; atravs de monocromador que seleciona o desejado do feixe de luz emitido por lmpadas de deutrio (UV) ou tungstnio (vis) VANTAGENS sobre os instrumentos de onda fixo: maior versatilidade: atravs da escolha apropriada do possvel trabalhar nas regies de alta absorvncia dos componentes da amostra (alta sensibilidade) maior seletividade: possvel escolher onde um determinado componente da amostra absorve e outros no otimizar eluies por gradiente: selecionar onde a fase mvel no apresenta variao de absorbncia com a concentrao obteno do espectro de absorvncia de cada componente da amostra durante sua eluio (arranjo de diodos) ou interrompendo a vazo da fase mvel no momento de deteco

DETECTORES DE ABSORVNCIA comprimento de onda varivel

ESQUEMA DE UM DETECTOR DE ABSORVNCIA NO UV-VIS COM COMPRIMENTO DE ONDA VARIVEL

DETECTORES DE ABSORVNCIA arranjo de diodos

alto custo relativamente complexo toda a luz da fonte passa pela cela da amostra a luz emergente dispersada por uma grade hologrfica (rede de difrao a radiao dispersada resultante (comprimentos de onda distintos) focalizada sobre uma fila de fotodiodos (256-512nm) todo o espectro da substncia passando pelo detector armazenado no microcomputador

DETECTORES DE ABSORVNCIA arranjo de diodos

possvel exibir um cromatograma para cada comprimento de onda selecionado possvel exibir o espectro em cada tempo determinado, ou seja, o espectro do pico cromatogrfico
Figura IX-13 Collins p223

DETECTORES DE ABSORVNCIA no infra-vermelho

a absorvncia na regio do infra-vermelho pode ser usada como detector universal ou especfico sensibilidade em geral muito pequena usados principalmente em sistemas de cromatografia por excluso tcnica de parar a vazo da fase mvel com a amostra na cela e tirar o espectro infravermelho limitado a fases mveis transparentes no comprimento de onda utilizado

DETECTORES DE FLUORESCNCIA
deteco especfica para compostos que fluorescem e uma das mais sensveis tcnicas de deteco (picogramas, 10-12g); comparvel ao detector por captura de eltrons em GC alta intensidade de fluorescncia esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que no podem produzir estruturas fortemente inicas reaes de derivao ps-coluna (esterides podem produzir fluorescncia quando aquecidos com cido sulfrico) aplicaes: rea farmacutica, alimentos, caracterizao de destilados do petrleo de alto p.e. fase mvel deve ser criteriosamente selecionada (intensidade de emisso depende do meio; efeito quencher)

ESQUEMA DE UM DETECTOR POR FLUORESCNCIA

filtro primrio escolhido para deixar passar somente o comprimento de onda de excitao filtro secundrio escolhido para eliminar o comprimento de onda excitante, e deixar passar o comprimento de onda emitido pela amostra

DETECTORES POR NDICE DE REFRAO

acompanha continuamente a diferena de no ndice de refrao entre a fase mvel e o efluente que sai da coluna resposta universal e sensibilidade moderada (micrograma, 10-6g) controle rigoroso de temperatura (0,001 C): circulao de gua de uma fonte termostatizada atravs do refratmetro ou controle da temperatura ambiente sensvel a variaes de vazo e mudanas na composio da fase mvel (dificulta/impede seu uso na eluio por gradiente); difcil encontrar um par de solventes com ndices de refrao idnticos no so instrumentos muito estveis, nem de fcil manipulao emprego mais importante: em cromatografia por excluso (polmeros, amostras de interesse biolgico) e em cromatografia preparativa

ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMTRICO tipo Fresnel

na interface entre um prisma de vidro e um lquido, a quantidade de luz transmitida e refletida proporcional ao ngulo de incidncia da luz e ao ndice de refrao do lquido a luz da fonte atravessa um seletor, um filtro de infravermelho, outro seletor e uma lente os seletores e a lente produzem dois raios colimados que entram no prisma e incidem sobre a interface vidro-lquido das celas de referncia e amostra o ajuste grosso e fino do ngulo de incidncia nas interfaces realizado atravs da rotao do corpo do projetor

ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMTRICO tipo Fresnel

as celas so cavidades ovaladas de teflon (3 L) presas entre o prisma e a uma placa de ao inoxidvel que contm os tubos de entrada e sada a diferena de intensidade da luz transmitida atravs das celas funo do Ind. Refr. de ambos os lquidos e se determina por meio de um fotodetector duplo, o qual gera um sinal eltrico, transmitido para o registrador desvantagem: para cobrir a faixa de Ind. Refr. normal ( = 1,31 a 1,63), so necessrios dois prismas

ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMTRICO por deflexo

a luz emitida pela fonte limitada pelo seletor, colimada pela lente e passa atravs da clula

a cela tem os compartimentos de amostra e referncia separados por um pedao de vidro quando a composio da fase mvel muda na cela da amostra, a mudana do ndice de refrao causa uma deflexo na posio final do raio de luz no fotodetector

ESQUEMA DE UM DETECTOR REFRATOMTRICO por deflexo

uma luz incidente passa atravs da cela, deflectada, refletida pelo espelho atrs da cela e, de novo defletada a lente focaliza a luz deflectada no fotodetector que produz um sinal eltrico proporcional posio da luz o sinal ento amplificado e registrado detector por deflexo possui ampla faixa de linearidade menos sensvel a variaes de temperatura muito sensvel aa vibraes ou movimento do instrumento celas no so to pequenas como as do tipo Fresnel (10 a 15 L)

DETECTORES outros tipos

detectores eletroqumicos: alta seletividade (anlise de traos); princpios: amperometria, polarografia, coulometria e conductometria; uso comum do detector condutomtrico: cromatografia por troca inica, por excluso ou fase reversa por pares de ons detectores de espalhamento de luz por evaporao: efluente da coluna passa por nebulizador no qual convertido em uma nvoa fina por um fluxo de nitrognio ou ar; as gotculas so ento conduzidas atravs de um tubo com temperatura controlada no qual ocorre evaporao da fase mvel, levando formao de finas partculas do soluto; a nuvem de partculas do soluto passa atravs de um feixe de laser; a radiao espalhada detectada perpendicularmente ao fluxo por um fotodiodo detectores de radioatividade: projetados para detectar solutos radiomarcados; aplicaes cromatogrficas com emissores ou - forte (131I, 210Po e 125Sb),usando sistemas de cintilao ou mesmo contador Geiger, tm sido reportados

DETECTORES espectrometria de massas

PRINCPIO: analito ionizado na fonte; ons com razo carga-massa (m/z) discreta so separados e focalizados no analizador de massas; o feixe focalizado atinge um detector (electron multiplier) que determina sua intensidade FONTE DE ONS (mtodos de ionizao): electron ionization (EI), chemical ionization (CI), fast-atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), thermospray (TSI), laser desorption (LD) so utilizadas nas aplicaes de cromatografia a lquido ANALIZADOR DE MASSAS magnetic sector, quadrupole, time-offlight (TOF), Fourier transform ion cyclotron esonance (ICR) exemplo: LCQ (Finningan): ESI, octapole (quadrupolo duplo), seguido de um ion-trap

SPE SELEO DE FASES E SOLVENTE

AMOSTRA MM<2000 SOLVEL EM GUA INICA CATINICA ANINICA POLAR MODERADAMENTE POLAR APOLAR NO-INICA INSOLVEL EM GUA

Figura 4.7 Snyder p133

SPE SELEO DE FASES E SOLVENTE

AMOSTRA MM<2000 INICA CATINICA CEX -COOH (WCX) -SO3H (SCX) tampes cidos
Figura 4.7 Snyder p133

SOLVEL EM GUA NO-INICA ANINICA AEX amino (WAX); 1,2-diamino (WAX); quat. amino (SAX) tampes bsicos

SPE SELEO DE FASES E SOLVENTE

AMOSTRA MM<2000 INICA POLAR n-BPC -CN; diol; 1,2diamino C6; CHCl3; CH2Cl2; acetona; MeOH; IPA
Figura 4.7 Snyder p133

SOLVEL EM GUA NO-INICA MODERADAMENTE POLAR LSC SiO2; florisil; alumina C6; CHCl3; CH2Cl2; EtOAc; MeOH; IPA APOLAR RPC C18; C8; ciclohexil; fenil; C2; C4; -CN C6; CH2Cl2; MeOH; H2O

SPE SELEO DE FASES E SOLVENTE

AMOSTRA MM<2000 INSOLVEL EM GUA

POLAR n-BPC -CN; diol; 1,2diamino C6; CHCl3; CH2Cl2; acetona

Figura 4.7 Snyder p133

MODERADAMENTE POLAR LSC SiO2; florisil; alumina C6; CHCl3; CH2Cl2; EtOAc; MeOH; IPA

APOLAR

RPC C18; C8; ciclohexil; fenil; C2; C4; -CN C6; CH2Cl2; acetona; ACN; MeOH; H2O

ESCOLHA DA TCNICA CROMATOGRFICA EM FUNO DAS CARACTERSTICAS DA AMOSTRA

MASSA MOLECULAR

< 2000

AMOSTRA

> 2000
Figura IX-2 Collins p 194

ALTA MASSA MOLECULAR

MASSA MOLECULAR PROPRIEDADES

INSOLVEL EM GUA > 2000 SOLVEL EM GUA NOINICO BSICO INICO CIDO
Figura IX-2 Collins p 194

SP: sulfopropil DEAE: dietilaminoetil

CE: cromatografia por excluso CTI: cromatografia por troca inica

> 2000 INSOLVEL EM GUA SOLVEL EM GUA NOINICO

MODALIDADE

FASE FASE MVEL ESTACIONRIA tpica tpica

CE

gel de poliestireno gel de dextrano SPdextrano DEAEdextrano

THF CHCl3 H2 O MeOH tampo aquoso tampo aquoso

CE

BSICO INICO CIDO

CTI CTI

BAIXA MASSA MOLECULAR

MASSA PROPRIEDADES MOLECULAR

SOLVEL EM HEXANO SOLVEL EM METANOL NOINICO INICO

NO POLAR MODERADAMENTE POLAR POLAR BASE FORTE BASE FRACA CIDO FORTE CIDO FRACO

INSOLVEL EM GUA < 2000 SOLVEL EM GUA

Figura IX-2 Collins p 194

FR: fase reversa FN: fase normal CN-nitrilo silca*=slica desativada ACN=acetonitrila MeOH=metanol pr-OH: propanol CLFL: cromatografia em fase ligada CLS: cromatografia lquido-slido

< 2000 INSOLVEL EM GUA

MODALIDADE

FASE FASE MVEL ESTACIONRIA tpica tpica

NO POLAR moderada mente POLAR

CLS CLFL/FR

slica C18 C8 slica slica* CN C8

n-C7H16/ CHCl3/C6H5CH3 MeOH/H2O ACN/H2O MeOH/H2O n-C7H16/CHCl3 n-C7H16/CHCl3 n-C7H16/ CHCl3/pr-OH ACN/H2O

SOLVEL EM HEXANO SOLVEL EM METANOL

CLFL/FR CLS CLS

POLAR

CLFL/FN CLFL/FR

FR: fase reversa pi: pareamento inico MeOH: metanol ACN: acetonitrila AHS: c. hexanossulfnico TBA: hidrxido de tetrabultilamnio CLFL: cromatografia em fase ligada CTI: cromatografia por troca inica

< 2000 SOLVEL EM GUA NOINICO INICO BASE FORTE BASE FRACA

MODALIDADE

FASE FASE MVEL ESTACIONRIA tpica tpica

CLFL/FR

C18

MeOH/H2O ACN/H2O

CTI CLFL/FR-pi CTI CLFL/FR-pi

trocador de ctions C18 trocador de nions C18

tampo aquoso AHS/H2O tampo aquoso TBA/H2O

CIDO FORTE CIDO FRACO

P2. INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS EM FASE LQUIDA P10. DETECTORES PTICOS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA 14. Mtodos qualitativos 15. Mtodos quantitativos 16. Validao

MTODOS QUALITATIVOS

Spiking com padres Razo de comprimentos de onda (antigas anotaes de CE) Coleta de fraes para IR, NMR e MS (MS como detector)

MTODOS QUANTITATIVOS

MEDIDA DO SINAL: rudo (constante de tempo) altura de pico rea de pico MTODO QUANTITATIVO Normalizao da rea Fator de resposta Calibrao externa Padronizao interna Adio de padro FONTES DE ERRO ANLISE DE TRAOS
Collins p168; Snyder p 643

VALIDAO EXATIDO comparao com padro de referncia recuperao adio de padro PRECISO LINEARIDADE INTERVALO LINEAR LIMITE DE DETECO LIMITE DE QUANTIFICAO ESPECIFICIDADE spiking com interferentes degradao da amostra aquisio de dados cross-check
Snyder p685; artigos: Ira Krull, Anal Chem,, USP25

ROBUSTEZ RESISTNCIA ESTABILIDADE EQUIVALNCIA t-teste F-teste ANOVA Q-teste