MINISTRIO DA EDUCAO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM AGRONOMIA

RECURSOS GENTICOS DE ESPINHEIRA-SANTA (Maytenus ilicifolia E M. aquifolium) NO RIO GRANDE DO SUL

MRCIO PAIM MARIOT

Tese apresentada Universidade Federal de Pelotas, sob orientao da Dra. Rosa La Barbieri, como parte das exigncias do Programa de PsGraduao em Agronomia, rea de Concentrao: Fitomelhoramento, para obteno do ttulo de Doutor (Dr.) em Cincias.

PELOTAS Rio Grande do Sul - Brasil Agosto de 2005

Dados de catalogao na fonte: (Marlene Cravo Castillo CRB-10/744)

M342r Mariot, Mrcio Paim Recursos genticos de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia e M. aquifolium) no Rio Grande do Sul / Mrcio Paim Mariot; orientadora Rosa La Barbieri . Pelotas, 2005. 131 f.: il. Tese (Doutorado). Fitomelhoramento. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2005. 1. Espinheira-santa 2. Plantas medicinais 3. Caracterizao morfolgica 4. Etnobotnica 5. Anlise multivariada 6. Banco de Germoplasma I. Barbieri, Rosa La (orientador) II. Ttulo.

MRCIO PAIM MARIOT

RECURSOS GENTICOS DE ESPINHEIRA-SANTA (Maytenus ilicifolia E M. aquifolium) NO RIO GRANDE DO SUL

Tese apresentada Universidade Federal de Pelotas, sob orientao da Dra. Rosa La Barbieri, como parte das exigncias do Programa de PsGraduao em Agronomia, rea de Concentrao: Fitomelhoramento, para obteno do ttulo de Doutor (Dr.) em Cincias.

Aprovada em: 25 de agosto de 2005

______________________________ _______________________________ Rosa La Barbieri (Dra.) Fernando Iraj Flix de Carvalho (Ph.D) Pesquisadora da Embrapa Clima Professor da FAEM/UFPel Temperado orientadora

______________________________ _______________________________ Maria Jane Cruz de Melo Sereno (Dra.) Mauricio Sedrez dos Reis (Dr.) Professora da FA/UFRGS Professor da FA/UFSC

___________________________________ Andra Mittelmann (Dra.) Pesquisadora da Embrapa Clima Temperado

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E Deus disse: produza a terra erva verde, ervas que produzem semente, e rvores que dem frutos sobre a Terra, frutos que contenham semente, cada uma segundo a sua espcie. E assim se fez. E a terra produziu relva, ervas que produzem semente, e rvores que do fruto com a semente. E os frutos serviro de alimento e as folhas de remdio. O Senhor fez a terra produzir os medicamentos e o homem sensato no o despreza. (Adaptado de Gen. 1, 11-12; Ez. 47, 12 e Ecl. 38, 4).

A minha esposa Cludia Campos Ribeiro e a minha filha Martha Ribeiro Mariot, pelo apoio constante, amor, carinho e compreenso nos longos momentos de ausncia; ao meu filho Pietro Ribeiro Mariot (in memoriam), um anjinho que, em sua breve vida, me ensinou o que no aprendi em muitos anos; aos meus pais Cesar Mariot e Maria Paim Mariot, pais maravilhosos, que me deram vida e me ensinaram a lutar, ter f e acreditar que os obstculos foram feitos para serem vencidos; aos meus irmos Sandra Maria Mariot Lazzarotto, Luciane Maria Paim Mariot, Cesar Paim Mariot, Carlos Henrique Paim Mariot e Viviane Paim Mariot, que sempre me apoiaram e rezaram pela minha felicidade. Dedico.

Para Rosa Lia Barbieri, pela amizade, dedicao, por partilhar seus conhecimentos e, principalmente, pela oportunidade de realizar um trabalho to gratificante. Meus Agradecimentos

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AGRADECIMENTOS

Ao vencer mais uma etapa em minha formao, no s cientfica, mas tambm humana, quero agradecer a todas quelas pessoas que direta ou indiretamente contriburam para esta realizao. No poderia deixar de registrar um agradecimento especial a Deus, que atravs de meus pais, me deu vida e sade para trabalhar e perseverana para vencer as dificuldades. A toda minha famlia, que sempre me apoiou, nos momentos mais difceis, aqui deixo registrado o meu carinho e minha gratido. Agradeo aos meus sobrinhos Matheus Mariot Lazzarotto, Luiza Mariot da Silva, Pedro Mariot da Silva e Nathlia Schoenardie Mariot e aos meus cunhados Gilson Jos Lazzarotto, Luciano Amaral da Silva e Rossana Schoenardie Mariot que, apesar de no constarem na dedicatria, so muito importantes em minha vida e sempre me apoiaram. Rosa Lia Barbieri, pelo exemplo, dedicao, amizade, ensinamentos e apoio em todas as etapas do trabalho, meus sinceros agradecimentos. Embrapa Clima Temperado, por ter disponibilizado a sua estrutura e a todos os seus funcionrios, pelo apoio constante, pelas contribuies sempre oportunas e amizade, em especial Ema Gldis Correa. Aos pesquisadores da Embrapa Clima Temperado, em especial, Caroline Marques Castro, Andra Mittelmann, Adalberto Miura, Eva Choer, Marilice Garrastazu, pelos ensinamentos e sugestes que muito contriburam para o desenvolvimento deste trabalho. Aos estagirios e bolsistas da Embrapa, Cledimara Sinigaglia, Mrcia Vaz Ribeiro, Simone Silveira, Lcia Helena Bento, Fabiano Correa, Renata Louzada e Gustavo Heiden, pelo apoio em todas as etapas de desenvolvimento do experimento da tese. iv

Aos produtores rurais, por terem permitido a realizao das coletas em suas propriedades e por terem disponibilizado seu tempo para me auxiliar na localizao das plantas. A todas as outras pessoas que contriburam nas coletas e identificao das espcies de espinheira-santa. Ao colega e amigo Francisco Motta Bicca, quem despertou em mim o interesse pelas plantas medicinais. Aos mestres Antnio Costa de Oliveira e Fernando Iraj Flix de Carvalho, pelos valiosos ensinamentos compartilhados, pela oportunidade de cursar o doutorado e por terem acreditado em minha proposta de trabalho. Aos colegas do Centro de Genmica e Fitomelhoramento, entre os que j partiram para a vida profissional e os que ainda esto na universidade, meus agradecimentos, pela amizade e pelos conhecimentos comigo compartilhados Adeliano Cargnin, Albina Bernardes, Andreomar Kurek, Andreza Martins, Claudir Lorencetti, Cyrano Busato, Daniel Simioni, Carlos Danilo Chacn, Darci Kunzler, Douglas Schmidt, Eduardo Vieira, Eduardo Caiero, Eduardo Padilha, Emilia Malone, Fbio Freitas, Filipa Fonseca, Gaspar Malone, Giovane Olegrio, Giovani Benin, Guilherme Ribeiro, Igor Valrio, Igor Tonin, Irineu Hartwig, Jefferson Coimbra, Jos Silva, Juliana Branco, Luciano Maia, Lus Martins, Luiz Mattos, Maicon Corra, Marcos Carvalho, Maurcio Kpp, Maria Marques, Melissa Maia, Paulo Zimmer, Pedro Cruz, Simone Silva, Ricardo Lorenzet, Rodrigo Soares, Roni Azevedo, Taciane Finato, Velci Queiros e Volmir Marchioro. Aos funcionrios do Centro de Genmica e Fitomelhoramento Graciele Pucinelli, Marici Fagonde, Jorge Costa e Silvisnei Silva e s secretrias do Programa de Ps-Graduao em Agronomia Laura Vilanova, Rita Fagonde e Madelon Schimmelpfening Lopes, pela disponibilidade e auxlio prestado. Ao Conjunto Agrotcnico Visconde da Graa, em especial aos colegas da rea de agricultura, pela liberao para cursar o doutorado e Universidade Federal de Pelotas, em especial Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, pela oportunidade que me foi concedida.

NDICE NDICE ...............................................................................................................vi RESUMO .........................................................................................................viii ABSTRACT ........................................................................................................x 1. INTRODUO GERAL ..................................................................................1 2. CAPTULO I Metablitos secundrios e propriedades medicinais da espinheira-santa (Maytenus ilicifolia e M. aquifolium)..........................5 2.1 Introduo ..................................................................................................5 2.2 Propriedades medicinais da espinheira-santa............................................7 2.3 Metablitos secundrios em espinheira-santa e ao farmacolgica ........9 2.4 Influncia do ambiente e relao de caracteres morfolgicos na concentrao de metablitos secundrios em espinheira-santa...............15 2.5 Melhoramento gentico de plantas medicinais e perspectivas para espinheira-santa........................................................................................17 2.6 Referncias Bibliogrficas........................................................................19 3. CAPTULO II Coleta de germoplasma de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. e M. aquifolium Mart.) no Rio Grande do Sul ...23 3.1 Introduo ................................................................................................23 3.2 Material e Mtodos...................................................................................25 3.3 Resultados e Discusso...........................................................................28 3.4 Concluses ..............................................................................................45 3.5 Referncias Bibliogrficas........................................................................46

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4. CAPTULO III Variabilidade em matrizes de acessos de espinheirasanta (Maytenus ilicifolia e M. aquifolium) ...............................................50 4.1 Introduo ................................................................................................50 4.2 Material e Mtodos...................................................................................53 4.3 Resultados e Discusso...........................................................................56 4.4 Concluses ..............................................................................................69 4.5 Referncias Bibliogrficas........................................................................70 5. CAPTULO IV Variabilidade gentica para caracteres morfolgicos e fisiolgicos em prognies de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia e M. aquifolium) ...................................................................................................73 5.1 Introduo ................................................................................................73 5.2 Material e Mtodos...................................................................................76 5.3 Resultados e Discusso...........................................................................81 5.4 Concluses ..............................................................................................93 5.5 Referncias Bibliogrficas........................................................................94 6. CAPTULO V Divergncia gentica entre acessos de espinheira-santa com base em caracteres morfolgicos e fisiolgicos das prognies....97 6.1 Introduo ................................................................................................97 6.2 Material e Mtodos.................................................................................100 6.3 Resultados e Discusso.........................................................................104 6.4 Concluses ............................................................................................116 6.5 Referncias Bibliogrficas......................................................................117 7. DISCUSSO GERAL .................................................................................120 8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS (Introduo Geral e Discusso Geral)..........................................................................................................127 ANEXO I .........................................................................................................131

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RESUMO MARIOT, MRCIO PAIM. Universidade Federal de Pelotas, Agosto de 2005. Recursos genticos de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia e M. aquifolium) no Rio Grande do Sul. Orientadora: Rosa La Barbieri (Dra.) Embrapa Clima Temperado. Maytenus ilicifolia e M. aquifolium so espcies medicinais nativas do Brasil, popularmente conhecidas como espinheira-santa, que apresentam ao contra gastrite e lcera gstrica. Entre os metablitos secundrios que estas espcies apresentam, destacam-se os triterpenos, flavonides e taninos. A forte ao antrpica tem promovido uma eroso gentica destas espcies, sendo consideradas prioritrias para a coleta e conservao de germoplasma. O objetivo deste trabalho foi relatar as coletas realizadas e avaliar a variabilidade gentica de germoplasma de espinheira-santa do Rio Grande do Sul. Foram descritos os ambientes onde se localizavam as plantas, caracterizadas morfologicamente as matrizes e, atravs de entrevista, foram coletados dados para o estudo etnobotnico. Posteriormente, foi instalado um experimento para caracterizao das prognies. Foram ento estimadas, para as matrizes e as prognies, a divergncia gentica, atravs de anlises multivariadas; os parmetros genticos nas prognies e as correlaes entre os caracteres. Foi evidenciado que a espinheira-santa apresenta uma ampla distribuio no Rio Grande do Sul, sendo mais escassa na Regio Nordeste. M. ilicifolia mais freqente do que M. aquifolium. Foram coletados 105 acessos, sendo que a maioria das plantas era arbustiva e silvestre, e encontrava-se em campo e beira de mata, com topografia plana, em locais meio-sombreado ou ensolarado. A poca de maturao dos frutos variou de acordo com a latitude,

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iniciando na Metade Sul e terminando na Regio Nordeste do Estado. Cancorosa o nome popular mais utilizado para M. ilicifolia e M. aquifolium e a maioria das pessoas indicou o seu uso medicinal para problemas estomacais e como depurativo do sangue. Os caracteres que mais contriburam para a divergncia foram o nmero de espinhos por folha, para as matrizes, e a estatura de planta aos 360 dias, para as prognies. Os caracteres morfolgicos avaliados nas matrizes permitiram separar os acessos em sete grupos e as populaes em seis grupos, e os avaliados nas prognies resultaram na formao de 3 grupos. Atravs das anlises de agrupamento ficou evidenciada uma proximidade filogentica entre M. ilicifolia e M. aquifolium. Os parmetros genticos estimados nas prognies indicam a eficincia na seleo, para os caracteres analisados, em programas de melhoramento, bem como pela importante variabilidade identificada, eficincia na estratgia de conservao ex situ das espcies de espinheira-santa em banco de germoplasma. Foram identificadas correlaes significativas entre os caracteres morfo-fisiolgicos em espinheira-santa, o que permite o descarte de algumas variveis na caracterizao de germoplasma e a seleo indireta em programas de melhoramento.

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ABSTRACT MARIOT, MRCIO PAIM. Universidade Federal de Pelotas, August 2005. Genetic resources of espinheira-santa (Maytenus ilicifolia and M. aquifolium) at Rio Grande do Sul. Adviser: Rosa La Barbieri (Dra.) Embrapa Clima Temperado. Maytenus ilicifolia and M. aquifolium are Brazilian medicinal species known as espinheira-santa, which have action against gastritis and gastric ulcer. Among secondary metabolites that these species have, emphasize triterpenes, flavonoids and tannins. A strong anthropic action has caused genetic erosion of this species. Then, it is a priority species for collecting germplasm and conservation. The objective of this work was to relate the collecting and to evaluate the genetic variability of M. ilicifolia and M. aquifolium germplasm achieved in Rio Grande do Sul State. The environment where the plants were located was described, plants were characterized morphologically and an interview with the local people to ethnobotanic evaluation was done. After this, an experiment for progenies characterization was installed. Then, genetic divergence among matrices and among progenies, by multivariate analysis, genetic parameters of the progenies and correlation between characters were estimated. Espinheira-santa is broadly distributed at Rio Grande do Sul and it is rarer in the Northeast Region of the State. M. ilicifolia occur more frequently than M. aquifolium. 105 accesses were collected. The majority of plants are shrub and wild. They are located at fields and thickets edges, in plane land, in partiality shady or suntrap places. The time of fruit maturation was different, depending of the latitude, beginning in the South of the State and finishing in the Northeast Region. Cancorosa is the folk name most used to M. ilicifolia and

M. aquifolium and most of the people indicated the medicinal use of espinheirasanta to stomachic disorders and bloods depurative. The characters that contributed more for divergence were the number of thorn for leaf, for matrices, and the plant height at 360 days after sowing, for the progenies. The morphological characters analyzed in the matrices enabled us to separate the accesses in seven clusters and the populations in six clusters. The characters evaluated in the progenies resulted in the formation of three clusters. The clustering analysis can indicate the phylogenetic relatedness between M. ilicifolia and M. aquifolium. The genetic parameters estimated in the progenies indicate the efficiency in the selection for these characters in breeding programs and in the strategies of conservation ex situ of espinheira-santa in gene bank, due the important variability identified in the germplasm collected. Significant correlations among morphological and physiological characters were identified in espinheira-santa, indicating that some variables can be discarded in germplasm characterization and that its possible to make indirect selection in breeding programs.

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1. INTRODUO GERAL

O uso de plantas medicinais para o tratamento de enfermidades bastante expressivo. Segundo Farnsworth (1996), cerca de 75% da populao mundial utilizam as plantas medicinais para alvio de alguma sintomatologia desagradvel, e, deste total, 30% se d atravs de prescrio mdica. Aproximadamente 85% dos medicamentos so originados dos vegetais e aproximadamente dois teros das plantas medicinais utilizadas pela indstria farmacutica so originadas de extrativismo nos pases tropicais. O Brasil, como maior detentor da biodiversidade vegetal, ocupa posio de destaque com relao diversidade de espcies nativas com potencial medicinal espalhados em seus biomas (Vieira, 1999). O uso destas plantas comum na medicina popular no Pas. Neste sentido, a conservao e a disponibilizao destes recursos genticos so importantes para a preservao da variabilidade gentica e utilizao em programas de melhoramento, alm de servirem como alternativa de renda para pequenos produtores rurais. De maneira geral, as espcies medicinais introduzidas no Brasil (exticas) esto em processo de melhoramento mais avanado do que as nativas; entretanto, ambas possuem germoplasma que pode ser explorado com sucesso (Oliveira et al., 2003). A partir dos anos 90, o Brasil tem concentrado esforos nos trabalhos de coleta e preservao da variabilidade gentica de plantas medicinais (Vieira, 1999). A Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, em colaborao com outras unidades de pesquisa da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) e vrias universidades, possuem um programa para estabelecer bancos de germoplasma para espcies medicinais e aromticas. O programa

brasileiro de conservao de plantas medicinais tem trs focos: (1) estudos etnobotnicos; (2) coleo e caracterizao de germoplasma e (3) conservao in situ e ex situ. Entre as espcies medicinais nativas do Brasil destaca-se a espinheirasanta (Maytenus ilicifolia e M. aquifolium), pelo seu alto valor medicinal para o tratamento de problemas digestivos. M. ilicifolia foi alvo de biopirataria na dcada de 90, tendo seu extrato sido patenteado por uma empresa japonesa, logo aps as primeiras publicaes que comprovavam a eficincia da planta contra gastrite e lcera gstrica em pesquisa realizada no Brasil (Carvalho, 2005). Entre os metablitos secundrios que podem estar associados ao farmacolgica em espinheira-santa, destacam-se os triterpenos, os taninos e os flavonides (Gonzales et al., 2001). Esta importncia medicinal da espinheira-santa destacada nas pesquisas levou a um aumento do extrativismo nas populaes naturais, o que tornou a espcie prioritria para coleta e conservao (Vieira, 1999). Existem duas espcies de espinheira-santa, a M. ilicifolia e a M. aquifolium, que ocorrem predominantemente na Regio Sul do Brasil (Scheffer, 2001), sendo que M. ilicifolia apresenta uma maior distribuio no Rio Grande do Sul do que a M. aquifolium (Mariot, et al., 2003). Estas espcies, assim como as demais do gnero Maytenus, foram descritas morfologicamente por Carvalho-Okano (1992). Com uma taxa de fecundao cruzada de 99,6%, Scheffer (2001) classificou a espcie M. ilicifolia como algama. A forte ao antrpica a que as espcies de espinheira-santa vm sendo submetidas tem levado a uma perda da variabilidade gentica. Neste sentido, visando conservao desta variabilidade, a Embrapa Clima Temperado implantou um banco ativo de germoplasma de espinheira-santa, com acessos oriundos de vrios locais do Rio Grande do Sul. Neste trabalho, que envolve recursos genticos, a caracterizao fundamental para a identificao dos acessos, sendo que a avaliao morfolgica a primeira a ser realizada. O estudo da divergncia gentica, atravs de anlises multivariadas deve ser destacado neste trabalho de caracterizao, pois permite conhecer melhor o germoplasma disponvel e assim otimizar as atividades na rea de recursos genticos, em que se dispe de muitos acessos. A quantificao do grau de dissimilaridade entre gentipos de 2

fundamental

importncia

tambm

em

gentica

de

populaes

no

melhoramento de plantas (Reif et al. 2005). Anlises multivariadas para estimar a divergncia gentica com base em caracteres morfolgicos e/ou fisiolgicos tm sido utilizadas em germoplasma de espcies medicinais, como Bacopa monnieri (Mathur et al., 2003) e Centella asitica (Mathur et al., 2003), atravs da estimativa de componentes principais, variveis cannicas e distncia de Mahalanobis. Em espinheira-santa, entretanto, existe uma carncia de informaes com relao caracterizao de germoplasma, estudos de divergncia gentica, bem como estimativa de parmetros genticos para caracteres morfolgicos e fisiolgicos que tenham importncia agronmica. Estes estudos servem de suporte para trabalhos de melhoramento e conservao de recursos genticos para esta espcie. O crescimento mais rpido, por exemplo, um dos caracteres agronomicamente importantes em espinheira-santa, que devem ser considerados na seleo, pois, segundo Nicoloso et al. (2000), a espcie de crescimento lento. Em trabalho desenvolvido com M. ilicifolia, Scheffer (2001) estudou aspectos silviculturais, alm da variabilidade gentica com base em anlise de isoenzimas. A autora identificou uma ampla variabilidade gentica na espcie, em que a maior variao foi observada dentro das populaes, o que caracterstico de espcies de fecundao cruzada. Resultados semelhantes foram observados para esta mesma espcie por Perecin e Kageyama (2002) e Steenbock (2003), em trabalho desenvolvido com isoenzimas, e por Bittencourt (2000) e Mossi (2003), em trabalho desenvolvido com marcadores do tipo RAPD. A espinheira-santa tem potencial para ser inserida na matriz agrcola, o que reduziria a eroso gentica j detectada na espcie, promovendo sua conservao in situ e ex situ que um dos focos dos programas de conservao de espcies medicinais nativas do Brasil (Vieira, 1999). Estudos bsicos de gentica e de aspectos relacionados produo devem acompanhar esta iniciativa, de forma a garantir o avano tecnolgico para produo de fitofrmacos a partir da espinheira-santa, o que, segundo Carvalho (2005), j est em fase de estudos, com boas perspectivas de lanamento de medicamento em um futuro prximo.

Os objetivos deste trabalho foram coletar germoplasma de espinheira-santa em populaes do Estado do Rio Grande do Sul; descrever os ambientes em que as plantas se encontravam; resgatar o conhecimento popular sobre o uso da espinheira-santa, com base em estudo etnobotnico; caracterizar os acessos coletados; avaliar a variabilidade gentica; agrupar os acessos atravs de anlises multivariadas e conserv-los atravs da instalao de um banco de germoplasma de M. ilicifolia e M. aquifolium.

2. CAPTULO I

METABLITOS SECUNDRIOS E PROPRIEDADES MEDICINAIS DA ESPINHEIRA-SANTA (Maytenus ilicifolia E M. aquifolium)

2.1 INTRODUO

Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. e Maytenus aquifolium Mart., espcies medicinais autctones (nativas) pertencentes famlia Celastraceae, so popularmente conhecidas como espinheira-santa ou cancorosa. Estas espcies apresentam propriedades medicinais para problemas de gastrite e lcera gstrica comprovadas por pesquisas coordenadas pelo CEME (Central de Medicamentos) do Ministrio da Sade do Brasil (Di Stasi, 2004). A espinheira-santa tem sido intensamente explorada nas populaes naturais e a crescente demanda, devido ao seu alto valor medicinal, tem levado a um extrativismo predatrio, resultando em uma perda da variabilidade gentica. Por este motivo, a espinheira-santa considerada como prioritria para coleta e conservao (Vieira, 1999). Neste sentido, visando a conservao da variabilidade gentica, a Embrapa Clima Temperado implantou um banco ativo de germoplasma de M. ilicifolia e M. aquifolium, que conta com acessos oriundos de vrios locais do Rio Grande do Sul. Apesar da indicao para o tratamento de gastrite e lcera gstrica, existem relatos de eficcia das espcies de espinheira-santa para outras doenas. Uma ampla reviso sobre o uso tradicional e atual da espinheira5

santa foi realizada por Scheffer (2004). Apesar da grande utilizao pela populao brasileira, no pas no h patentes relacionadas com Maytenus, mas a World Intellectual Propertie Organization WIPO (Organizao Mundial de Propriedade Intelectual), em seu banco de dados, revela o registro de sete patentes que envolvem M. ilicifolia. Alm dos trabalhos relacionados elucidao da importncia farmacolgica das espcies de espinheira-santa, estudos vm sendo realizados para elucidar quais metablitos secundrios esto envolvidos na ao teraputica. Este trabalho tem, portanto, o objetivo de apresentar uma reviso bibliogrfica sobre os diversos compostos presentes na espinheira-santa, bem como estudos da ao farmacolgica de M. ilicifolia e M. aquifolium, alm de discutir aspectos relacionados ao melhoramento gentico de plantas medicinais.

2.2 PROPRIEDADES MEDICINAIS DA ESPINHEIRA-SANTA

A espinheira-santa empregada no tratamento de problemas estomacais (gastrites e lceras) (Lorenzi & Matos, 2002). As pesquisas com as espcies de espinheira-santa M. ilicifolia e M. aquifolium foram iniciadas na dcada de 60, estimuladas pela sua eficcia no tratamento de lceras e at mesmo do cncer. Estudos iniciais revelaram que elas contm compostos bioativos que mostraram potente ao anti-tumoral e anti-leucmica em doses muito baixas. Na medicina tradicional o emplastro de suas folhas usado no tratamento do cncer de pele. O decocto das folhas usado em lavagens para o mesmo tratamento. M. ilicifolia tem sido usada popularmente no Brasil para tratamento de cncer (Fox, 1991). Entretanto, seu uso mais popular no tratamento de lceras, indigesto, gastrites crnicas e dispepsia, conforme mostrado em trabalho desenvolvido por Carlini (1988). Jorge et al. (2004) observaram que extratos hexano e etilacetato de M. ilicifolia que promovem um aumento do volume gstrico e do pH no estmago apresentam ao antiulcerognica e antiinflamatria. Foi observado por Ferreira et al. (2004) que o extrato de folhas de M. ilicifolia reduz a secreo cida na mucosa gstrica de rs, com efeito semelhante ao medicamento cimetidina. M. ilicifolia tem se tornado conhecida e usada na medicina herbalstica dos EUA, onde o extrato de suas folhas vem sendo empregado para lceras, para recomposio da flora intestinal e inibio de bactrias patognicas, como laxante, para eliminar toxinas atravs dos rins e pele e para regular a produo do cido clordrico do estmago (Lorenzi & Matos, 2002; Melo et al., 2001). Extratos do caule de M. ilicifolia mostraram atividade anti-fngica contra Microsporum gypseum e Trichophyton mentagrophytes, mas as folhas no 7

mostraram o mesmo efeito (Portillo et al., 2001). Esta espcie utilizada como contraceptivo por populaes indgenas e do meio rural no Paraguai, e como abortivo por mulheres do nordeste da Argentina (Montanari et al., 1998). Os autores estudaram o efeito do extrato etanlico de folhas de M. ilicifolia sobre a espermatognese em ratos, no tendo sido mostrado efeito significativo sobre a formao dos espermatozides. Foi observado por Montanari & Bevilacqua (2002) que o extrato de folhas desta espcie causou uma perda na primplantao embrinica em ratos, mas sem efeito sobre a implantao ou organognese. A atividade estrognica do extrato sugere que ele pode estar interferindo com a receptividade uterina ao embrio. Entretanto, os efeitos no foram uniformes entre os animais, sendo que, em alguns, nenhuma alterao foi observada, nem mesmo na fase de pr-implantao do embrio. Isto significa que o aborto ocorre em algumas mulheres e em outras no.

2.3 METABLITOS SECUNDRIOS EM ESPINHEIRA-SANTA E AO FARMACOLGICA

Entre os compostos bioativos em espinheira-santa, que podem ter ao antiulcerognica e anti-gstrica, destacam-se os triterpenos. Os triterpenides so compostos constitudos basicamente de trinta unidades de carbono seis isoprenos (Cardoso et al., 2001). A maioria possui em sua constituio hidroxilas que podem ser glicosiladas, produzindo os heterosdeos cardiotnicos, importantes agentes teraputicos para doenas cardiovasculares e as saponinas. Biossinteticamente so derivados de condensao de duas molculas de farnesil-PP unidas cauda-cauda, produzindo o esqualeno, precursor acclico desta classe de compostos. A provvel ciclizao da molcula de esqualeno leva formao da estrutura bsica dos triterpenides, o ciclopentanohidrofenantreno, importante precursor dos esterides vegetais e animais e das saponinas triterpnicas. As saponinas triterpenides apresentam trs tipos de estruturas bsicas: oleanos, ursanos e lupanos. Os taninos e flavonides so compostos fenlicos presentes em espinheira-santa que tambm podem ter ao em doenas estomacais (Gonzales et al., 2001). Os taninos so compostos de sabor adstringente, derivados de fenilpropanos, capazes de formar complexos com protenas, acares e alcalides indlicos (Cardoso et al., 2001). Dividem-se em duas categorias: derivados de esqueletos (C6-C1)n, chamados de taninos hidrosolveis, e derivados de esqueletos (C6-C3-C6)n, chamados de taninos condensados ou proantocianidinas. Os taninos hidrolizveis possuem rotas biossintticas ainda desconhecidas. Sabe-se que seu precursor o cido glico ou seu dmero de 9

condensao, o cido elgico. Os taninos condensados so biossintetizados pelas condensaes de derivados de cido chiqumico e unidades de malonilCoA, levando formao das catequinas. Estas so importantes precursoras das proantocianidinas (taninos condensados) e antocianidinas. Caracterizamse por serem oligmeros e polmeros formados pela policondensao de duas unidades flavonodicas (flavan-3-ol e favan-3,4-diol), portanto, tambm so considerados compostos flavonides, sendo tambm denominados de flavolanas, diferenciando-se dos taninos hidrolisveis por no possurem resduos glicosdeos em sua estrutura. Segundo o autor, entre as atividades farmacolgicas que os taninos condensados apresentam quando complexados com protenas , destacam-se a proteo da mucosa do estmago em tratamento de lcera pptica, as propriedades antiinflamatrias e cicatrizantes, e o bloqueio da formao da placa dental atravs da inibio da glicosiltransferase, produzida por bactrias bucais. Os flavonides existem em abundncia no reino vegetal, encontrados em sua maioria nas angiospermas, estando localizados nos vacolos, cloroplastos e cromoplastos. Caracterizamse estruturalmente por serem polifenlicos derivados de C6-C3-C6, ligados na orientao cabea-cauda, e que podem conter, como substituintes, hidroxilas ou seus derivados funcionais, tais como steres, metoxilas, alm de glicosdeos, isoprnicos, presos em posies especficas dos anis. Os flavonides tm como precursores a fenilalanina e a acetil-CoA. So originados de reaes de derivados do cido chiqumico e derivados do acetato. Os flavonides so divididos nas seguintes classes: flavonas, flavonis, antocianinas e isoflavonides, esta ltima restrita famlia Fabaceae. Os compostos mais importantes encontrados nos vegetais, para cada uma das trs primeiras classes so: flavonas apigenina e luteolina; flavonis canferol, quercetina, miricetina e galangina; antocianinas cianidina e malvidina. Derivados dos triterpenos friedelano so tpicos das famlias Celastraceae e Hippocrateaceae (Buffa Filho et al., 2002). Estes autores, atravs do desenvolvimento de um mtodo HPLC (High Performance Liquid Chromatography) fase-reversa para a quantificao de triterpenos em cinco tipos morfolgicos de Maytenus ilicifolia, identificaram os compostos 20 -

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hidroximaitenina e 22 -hidroximaitenina em baixa concentrao alm de maitenina, celastrol e pristimerina em alta concentrao. Os triterpenos friedelan-3-ol, friedelina e compostos polifenlicos presentes em M. ilicifolia e M. aquifolium so citados por Cordeiro et al. (1999) como componentes eficientes no tratamento de lceras e gastrites estomacais. Os autores caracterizaram triterpenos de extratos obtidos por extrao direta com etilacetato de folhas destas duas espcies, atravs de HRGC-MS (cromatografia gasosa de alta resoluo e espectrometria de massas). O perfil cromatogrfico foi semelhante para ambas as espcies, diferindo na concentrao relativa de alguns compostos. Estes dois triterpenos foram tambm destacados por Vilegas et al. (1995) e Lanas et al. (1997) como os mais importantes nas duas espcies de espinheira-santa para o tratamento de lcera gstrica. Os primeiros propuseram uma tcnica rpida para identificar friedelan-3-ol e friedelina atravs de cromatografia gasosa com alta temperatura de capilaridade em coluna polar , o que permite a distino entre extratos alcolicos aquosos de espinheira-santa autnticos e falsos (quando so misturadas folhas de outras espcies, como de Sorocea bomplandii). Os ltimos desenvolveram um mtodo para extrao de princpios ativos em espinheira-santa, atravs de uma adaptao do SFE (extrao com fluido supercrtico), com baixo custo. Atravs da utilizao do CO2 e etanol 10% como fluido extrator, conseguiram resultados satisfatrios na obteno dos triterpenos. O sistema SFE desenvolvido pelos autores foi mais eficiente, sendo uma alternativa aos outros mtodos, por ser mais rpido, alm de permitir uma flexibilidade de escolha do fluido extrator entre gases ou solventes lquidos a condies ambientes. Mossi et al. (2004), ao caracterizarem quimicamente extratos de M. ilicifolia obtidos atravs da utilizao de CO2 em alta presso observaram que a temperatura de extrao e a densidade do solvente exerceram um efeito importante sobre o rendimento lquido do extrato e a distribuio qumica dos compostos volteis, ao contrrio do tamanho de partcula e da taxa de fluxo de CO2. Apesar dos triterpenos friedelan-3-ol e friedelina terem sido destacados como sendo compostos eficientes no tratamento anti-lcera gstrica, Queiroga et al. (2000), em pesquisa realizada com ratos, mostraram que estes triterpenos no apresentam esta ao farmacolgica. 11

Atravs de estudo fitoqumico em extrato de M. aquifolium, Gonzales et al. (2001) identificaram triterpenos, taninos e flavonides. Em testes de laboratrio, os autores mostraram a ao antiulcerognica e analgsica do extrato desta espcie. Eles destacaram que os triterpenos apresentam habilidade na estimulao da sntese de muco ou manuteno do contedo de prostaglandina componente com atividade antiulcerognica da mucosa gstrica em altos nveis. Foi sugerido ainda que componentes antioxidantes como os taninos e os flavonides, podem ter ao contra leses gstricas. Ao analisarem quantitativamente, por HPLC, flavonides em infuso aquosa de folhas de M. ilicifolia e M. aquifolium, Leite et al. (2001) identificaram um novo composto deste grupo na primeira espcie. Os autores destacaram que os flavonides podem mediar uma variao de mecanismos relacionados atividade anti-cncer, anti-tumor e anti-oxidante, esta ltima relacionada caracterstica anti-lcera. Os flavonides tetra-glicosilados so teis como marcadores qumicos para o controle de qualidade em Maytenus. Dois novos tetraglicosdeos pertencentes aos grupos dos 3-Oglicosdeos de quercetina e canferol, que so os mais importantes entre os flavonides foram isolados por Vilegas et al. (1999) a partir da infuso de folhas de M. aquifolium. Os autores identificaram a ao anti-lcera da infuso de espinheira-santa, em que o aumento da dose levou ao decrscimo do nmero de lceras em ratos, sendo a dose de 800 mg/kg a mais eficiente. A maior atividade foi verificada em lceras do tipo III, que so as mais severas. Foi ainda destacado que o isolamento de flavonides poliglicosilados da infuso de M. aquifolium ser til para validao destes componentes como marcadores qumicos, como j anteriormente descrito por Vilegas et al. (1998) que distinguiram, atravs da tcnica HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographic), amostras autnticas de M. ilicifolia e M. aquifolium e amostras alteradas com Sorocea bomplandii, uma espcie muitas vezes confundida com a espinheira-santa, devido morfologia similar da folha. Os triterpenos denominados cangoronina e ilicifolina foram identificados por Itokawa et al. (1991) em M. ilicifolia. Eles so do tipo friedelano e foram fracionados junto com outros sete triterpenos j conhecidos. Os autores mostraram que alguns destes compostos tm ao citotxica, como, por exemplo, a pristimerina que foi a mais eficiente , indicando que 12

podem ser teis no tratamento de tumores. Trabalho semelhante foi desenvolvido por Shirota et al. (1994), que elucidaram a estrutura de alguns triterpenos aromticos. Estes compostos mostraram atividade citotxica moderada contra um nmero de linhagens de clulas de tumor cultivadas. As estruturas de outros dois triterpenos dmeros, denominados cangorosina A e cangorosina B, foram elucidadas por Shirota et al. (1997) em extrato de razes de M. ilicifolia. Quatro novos triterpenides maytefolina A-C (1-3) e uvaol-3caffeate (4) , alm de outros triterpenos, foram isolados de folhas de M. ilicifolia por Ohsaki et al. (2004). Os autores identificaram a ao citotxica do triterpenide eritrodiol. Apesar de a literatura destacar os triterpenos como os principais compostos bioativos em espinheira-santa, Corsino et al. (1998) destacaram que a famlia Celastraceae uma fonte rica de sesquiterpenos. Os autores isolaram e elucidaram a estrutura qumica de dois sesquiterpenos, a aquifoliulina E-I e a aquifoliulina E-II. Ao verificarem a ao citotxica do extrato de M. aquifolium em mutantes de Saccharomyces cerevisiae, eles sugeriram que os sesquiterpenos podem ser os principais responsveis por causar pequenos danos no DNA. Em outro trabalho, Corsino et al. (1998) isolaram e elucidaram a estrutura de outros dois sesquiterpenos, a aquifoliulina E-III e a aquifoliulina E-IV. Os triterpenos maitenina e 22-hidroximaitenina so membros de um pequeno grupo de produtos naturais peculiares s espcies das famlias Celastraceae e Hippocrateaceae com potencial anti-cncer (Corsino et al., 1998). A ligao da maitenina ao DNA sugere uma interao celular que pode elucidar a atividade antitumor. Os autores mostraram que estes compostos so efetivos contra carcinoma epidermide. Eles isolaram e identificaram maitenina e 22-hidroximaitenina a partir de calos oriundos de explantes de folhas de M. aquifolium atravs de HPLC cultivados em dois meios de cultura com diferentes concentraes de cinetina. O rendimento dos triterpenos no meio com menor concentrao de cinetina foi maior do que no outro. A cultura de tecidos parece ento ser uma fonte contnua e estvel de compostos de espcies de Maytenus, conforme proposto por Pereira et al. (1993). Os autores estabeleceram um protocolo para organognese total de plntulas de M. ilicifolia de matrizes selecionadas para produo de compostos para estudos 13

fitoqumicos, utilizando como explante gemas axilares. Foi identificada a ao antilcera gstrica da espinheira-santa em ratos, com ao semelhante ao medicamento cimetidina. Dois triterpenos j relatados na literatura, o friedelan3-ol e o friedelan-3-on foram identificados em extrato de M. ilicifolia, sendo sugeridos como substncias bioativas no tratamento das enfermidades estomacais. Segundo os autores, est sendo realizado melhoramento gentico usando Agrobacterium como vetor para aumentar a produo de triterpenos. Ao estudarem a biossntese de triterpenides friedelano e quinonametdicos em folhas e razes de M. aquifolium, Corsino et al. (2000) mostraram que folhas produzem 3-friedelanol e friedelina (friedelano) e razes acumulam maitenina e pristimerina (quinonametdicos). para as razes e posteriormente transformados nos Os triterpenos triterpenides derivados de friedelano, uma vez biossintetizados nas folhas, so translocados quinonametdicos, que apresentam ao antitumor. Estes triterpenides no foram encontrados em folhas, somente em razes.

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2.4 INFLUNCIA DO AMBIENTE E RELAO DE CARACTERES MORFOLGICOS NA CONCENTRAO DE METABLITOS SECUNDRIOS EM ESPINHEIRA-SANTA

A influncia do ambiente na produo de polifenis totais, polifenis no tanantes e taninos em M. ilicifolia foi estudada por Radomski (1998), tendo sido observado que a luminosidade o principal fator que influencia na produo destes compostos. Plantas que se encontram em pleno sol apresentam maior concentrao destas substncias. As correlaes entre luminosidade e polifenis totais (0,83), polifenis no tanantes(0,92) e taninos (0,78) foram altas e significativas. Foram observadas diferenas na morfologia foliar e na concentrao de taninos em folhas de M. ilicifolia de diferentes procedncias no Rio Grande do Sul (Bernardi e Wasicki, 1959 apud Radomski, 1998). Folhas de plantas desenvolvidas a pleno sol eram menores, com espinhos nas margens em nmero reduzido, e apresentavam maior concentrao de taninos. Em plantas de espinheira-santa desenvolvidas em ambiente com alta luminosidade, Radomski (1998) observou que as folhas das plantas eram mais amareladas, mais espessas e com espinhos mais pronunciados, caracterizando formas tpicas de adaptao de plantas de sombra expostas luz solar total. A autora avaliou a rea foliar, o peso de folhas e o peso especfico de folhas em ambientes com diferentes intensidades luminosas. A rea foliar foi menor e o peso especfico das folhas foi maior nas plantas desenvolvidas a pleno sol, quando comparadas s dos outros ambientes, com menor luminosidade. O peso especfico de folhas apresentou altas correlaes para concentrao de

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polifenis totais (0,87), polifenis no tanantes (0,82) e taninos (0,83). Estes compostos contribuem para o incremento da biomassa foliar. Em trabalho envolvendo a anlise fitoqumica em populaes de M. ilicifolia do Mato Grosso do Sul, Paran, Santa catarina e Rio Grande do Sul, Mossi (2003) observou uma grande variabilidade que foi maior dentro das populaes para concentrao dos metablitos secundrios limoneno, geranil acetato, cido palmtico, fitol, esqualeno, vitamina E, stigmasterol, friedelan-3ol, friedelin, friedelan-3-one. Atravs de anlise de agrupamentos (UPGMA), o autor no identificou uma relao entre os grupos formados e as caractersticas ambientais dos locais de coleta, o que pode indicar uma maior influncia das variveis locais, como microclima, insolao, condies nutricionais do solo, idade da planta, entre outros, sobre a concentrao dos compostos analisados, do que as condies macroambientais. Foram observadas por Buffa Filho et al.(2002), diferenas nas concentraes de triterpenos entre plantas com morfologia de folha diferentes, sendo que os compostos 22 -hidroximaitenina e celastrol foram encontrados em plantas de dois tipos morfolgicos.

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2.5 MELHORAMENTO GENTICO DE PLANTAS MEDICINAIS E PERSPECTIVAS PARA ESPINHEIRA-SANTA

O melhoramento gentico em plantas medicinais visa produzir variedades que possuam alto rendimento de substncias desejadas e que as mantenham em nveis conhecidos, para padronizar a dosagem quando da aplicao farmacolgica (Oliveira et al., 2003). importante o aumento da massa seca e/ou fresca, ou, ainda, o aumento do teor de princpios ativos em determinado rgo vegetal, de modo que estas caractersticas sejam mantidas nas geraes seguintes. O produto do melhoramento de plantas medicinais o princpio ativo ou o fitocomplexo. Outros objetivos so: resistncia a pragas e doenas, e tolerncia a condies adversas de ambiente. Como o ambiente tem grande influncia na produo de metablitos secundrios, a interao gentipo x ambiente um fator importante para ser analisado no melhoramento de plantas medicinais. A possibilidade do melhor gentipo em um ambiente no o ser em outro influencia o ganho de seleo e dificulta a recomendao de cultivares com ampla adaptabilidade (Cruz & Regazzi, 2001). O conhecimento da herdabilidade dos caracteres de interesse tambm fundamental, para que a seleo seja aplicada com sucesso, de forma que o valor fenotpico de um carter possa servir como guia para o valor gentico (aditividade) (Carvalho et al., 2001). O conhecimento da associao entre caracteres de grande importncia nos trabalhos de melhoramento, principalmente se a seleo em um deles apresenta dificuldades, em razo da baixa herdabilidade, e/ou tenha problemas de medio e identificao (Cruz & Regazzi, 2001). Para tanto, o melhorista pode estimar as correlaes fenotpicas e genotpicas, o que pode 17

contribuir no processo de seleo. No caso das espcies medicinais, esta ferramenta muito importante, devido ao alto custo das anlises para determinar e quantificar metablitos secundrios com potencial farmacolgico, como as que envolvem cromatografia. Em espinheira-santa, a morfologia foliar est relacionada com os tipos e a concentrao de triterpenos (Buffa Filho et al., 2002), portanto, se for identificada correlao entre estes caracteres, a seleo indireta atravs da morfologia foliar pode vir a ser uma boa estratgia de seleo.

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2.6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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3 CAPTULO II

COLETA DE GERMOPLASMA DE ESPINHEIRA-SANTA (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. E Maytenus aquifolium Mart.) NO RIO GRANDE DO SUL

3.1 INTRODUO

A espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss e M. aquifolium) so espcies medicinais nativas do Brasil, pertencentes famlia Celastraceae (Carvalho-Okano e Leito-Filho, 2004). So chamadas espinheira-santa, por apresentarem folhas com margens epinescentes, associadas ao efeito teraputico. As propriedades medicinais, cientificamente comprovadas, so para problemas de gastrite e lcera gstrica (Di Stasi, 2004). Entretanto, o conhecimento popular sobre a espinheira-santa indica sua eficincia para vrias outras enfermidades, conforme descrito por Scheffer (2004) em uma reviso sobre o uso tradicional de M. ilicifolia e M. aquifolium. De acordo com Carvalho-Okano e Leito-Filho (2004), M. ilicifolia ocorre nos Estados de Mato Grosso do Sul, Paran, Santa Catarina e Rio Grande do Sul e cultivada em So Paulo; tambm distribuda no Paraguai, Bolvia e leste da Argentina. Esta espcie tambm cultivada no Paran, ocupando atualmente uma rea de 66 ha (Scheffer et al., 2004). J M. aquifolium ocorre em Minas Gerais, Rio de Janeiro, So Paulo, Paran, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, predominantemente no sub-bosque, entre 100 a 1000 m de altitude. De modo geral, essas espcies so bastante plsticas, ocorrendo sobre solos jovens, 23

como os Neossolos, e sobre solos mais desenvolvidos, como Latossolos e Argissolos (Radomski et al., 2004). O alto valor medicinal da espinheira-santa tem levado a uma intensa ao antrpica nas populaes naturais, acarretando, pelo extrativismo predatrio, a eroso gentica da espcie. No Estado do Paran considerada uma espcie em extino (CREA, 1999 apud Scheffer, 2001; SEMA/GTZ, 1995 apud Perecin et al., 2004;). No Rio Grande do Sul, apesar das populaes ainda serem maiores do que naquele Estado, existe tambm perda de variabilidade gentica da espinheira-santa pelo processo de extrativismo. Neste sentido, as pesquisas tm atuado em duas frentes: com a conservao e manejo sustentado em ambiente natural e com o cultivo em sistemas agrossilviculturais (CREA, 1999 apud Scheffer, 2001). Na ltima dcada, o Brasil tem concentrado esforos nos trabalhos de coleta e preservao da variabilidade gentica de plantas medicinais (Vieira, 1999). A Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, em colaborao com outras unidades de pesquisa da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) e vrias universidades, possuem um programa para estabelecer bancos de germoplasma para espcies medicinais e aromticas. Entre as espcies nativas brasileiras, consideradas como prioritrias para conservao, a espinheira-santa destacada por Vieira et al. (1999). Muitos trabalhos vm sendo realizados com espinheira-santa, como estudos ecolgicos (Radomski et al., 2004), levantamento de ocorrncia e distribuio geogrfica (Mossi, 2003; Mariot et al., 2003), caracterizao em populaes naturais, quanto a aspectos morfolgicos e voltados produo (Steenbock, 2003; Mariot et al., 2003), caracterizao de acessos em banco de germoplasma (Mariot et al., 2004) e caracterizao fitoqumica (Mossi, 2003). A Embrapa Clima Temperado implantou um banco ativo de germoplasma de Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium que conta hoje com 137 acessos, os quais vm sendo conservados e caracterizados. O objetivo deste trabalho foi relatar as coletas de germoplasma de espinheira-santa realizadas no Rio Grande do Sul, no perodo de novembro de 2002 a janeiro de 2003, englobando a caracterizao das plantas no campo e do ambiente em que se encontravam, alm de discutir aspectos etnobotnicos.

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3.2 MATERIAL E MTODOS

Os locais de coleta de germoplasma de espinheira-santa foram previamente determinados, a partir de informaes de pessoas que conheciam a espcie e sabiam a sua localizao agricultores, ervateiros, pesquisadores, estudantes e atravs de pesquisa em herbrios de instituies de ensino e pesquisa do Rio Grande do Sul. Os locais foram visitados para identificao de plantas com frutos, tendo sido tomados os dados de posicionamento geogrfico com o auxlio de um aparelho de Global Positional System (GPS)76, marca Garmin. A maioria das coletas foi realizada em propriedades rurais, e algumas em propriedades na zona urbana. As coletas foram realizadas entre os meses de novembro de 2002 e janeiro de 2003, perodo em que a espinheira-santa est em fase de frutificao no Rio Grande do Sul, com incio nos municpios da Metade Sul do Estado e trmino na Regio Nordeste do Estado, pois a maturao da espinheira-santa mais tardia quanto menor a latitude. Em cada local, foram coletados frutos de todas as matrizes, de acordo com a metodologia proposta por Querol (1993) para espcies em risco de extino. Morales (1999) tambm recomenda a coleta do mximo de matrizes possvel, para melhor representar os alelos que ocorrem com freqncia mais alta. Na maioria das plantas, os frutos coletados estavam em fase que antecede a abertura das cpsulas e em algumas matrizes, entretanto, os frutos quando coletados j estavam com as cpsulas abertas. A distncia mnima entre plantas matrizes estabelecida para as coletas foi de 5m. As informaes com relao aos dados de coleta foram adaptadas de Moss e Guarino (1995), tendo sido anotadas em fichas especficas (anexo 1), utilizando o modelo 25

proposto por Querol (1993), com algumas modificaes. Os frutos de cada matriz foram acondicionados em sacos de papel pardo, separadamente, sendo cada matriz considerada um acesso. As matrizes foram identificadas com etiquetas de alumnio, em que foram anotados os cdigos dos acessos e as datas de coleta. Foram coletados ainda ramos com folhas e frutos de cada matriz, para preparao de exsicatas destinadas ao acervo do Herbrio da Embrapa Clima Temperado. Todo o material foi gentilmente cedido pelos proprietrios dos locais visitados. Os frutos coletados foram secos ao ambiente e, aps a abertura das cpsulas, o arilo que reveste as sementes foi removido em laboratrio e as sementes armazenadas em cmara fria a 40C, at a semeadura. Foram registradas as seguintes informaes referentes a cada populao de espinheira-santa: I Taxonomia, no de entrada do acesso, data da coleta, nome local da espcie. II Geografia: local de coleta, municpio, latitude, longitude e altitude. III Ecologia: orografia (plano, topo, encosta, topo arredondado, declive ngreme, declive mdio, terrao, declive suave, depresso aberta, depresso fechada, outros); tipologia do local (campo, beira de caminho, beira de gua doce, pntano, beira de mata, pastagem, interior de mata, jardim, horta familiar, depresso fechada, pomar, outros); tipo de solo (arenoso, lodoso, argiloso, orgnico, pedregoso, outros); insolao (ensolarado, meio sombreado, sombreado, outros). IV Caractersticas das plantas: hbito de crescimento (arbrea e arbustiva) plantas com at 5,0 m foram consideradas arbustivas e maiores do que 5,0 m, arbreas, conforme classificao descrita por Marchiori (1995); abundncia (muito escassa, escassa, pouco freqente, freqente, muito freqente, populao nica); variabilidade da populao (homognea, pouco heterognea, heterognea, muito heterognea, no determinvel); avaliao das matrizes (estatura, dimetro do tronco e cor do fruto). Atravs da cor do fruto, foi determinada a homogeneidade quanto ao estdio de maturao dos frutos para o total de matrizes avaliadas, dividindo-se o nmero de plantas que apresentavam apenas uma cor de fruto pelo total de plantas e a homogeneidade no estdio de maturao dos frutos para cada populao, 26

dividindo-se o nmero de plantas que apresentavam frutos com a mesma cor pelo nmero de plantas da populao. V Informante: atividade (agricultor, bilogo, melhorista, engenheiro agrnomo, curandeiro, mdico, habitante); caractersticas (no agricultor, pequeno agricultor, mdio agricultor, grande agricultor); propriedade da terra (posseiro, proprietrio, arrendatrio, outros); relao produo/mercado (subsistncia, mista, 100% comercial, no produz para o mercado). Foram considerados como pequeno, mdio e grande agricultor aqueles que possuam, respectivamente, propriedades menores que 50 ha, entre 50 e 500 ha e maiores que 500 ha. VI Usos: uso principal e uso secundrio (medicinal, industrial, ornamental, cerimonial, invasora, nenhum, outros); parte da planta utilizada (semente, flor, fruto, talo, folha, raiz, crtex, planta inteira, nenhuma, outras); uso medicinal especfico e forma de uso. A metodologia para o estudo etnobotnico envolveu a utilizao de um questionrio estruturado, com perguntas feitas para as pessoas proprietrias dos locais de coleta, priorizando os produtores rurais. Era questionado se conheciam as espcies; qual o nome que utilizavam para design-las; qual o uso que faziam das espcies (indicao medicinal); qual parte da planta utilizavam e de que forma era o preparo para utilizao medicinal. Os itens V e VI e o nome local da espcie (item I), presentes nas fichas de coleta (anexo 1), compem as informaes referentes aos dados etnobotnicos.

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3.3 RESULTADOS E DISCUSSO

Foram coletados acessos de 30 populaes, no Estado do Rio Grande do Sul. Os dados referentes localizao geogrfica das populaes constam na Tabela 1. As descries quanto ecologia e caractersticas das plantas so apresentadas na Tabela 2. Cada matriz coletada nas populaes foi considerada como um acesso, para facilitar a organizao do banco de germoplasma. Entre os acessos coletados, seis pertencem espcie Maytenus aquifolium (90, 91, 110, 112, 113 e 114), e, 109, espcie Maytenus ilicifolia (Tabela 2). A determinao das duas espcies foi baseada em caracteres morfolgicos descritos por Carvalho-Okano (1992). M. ilicifolia apresenta ramos novos tetra ou multicarenados, angulosos, enquanto M. aquifolium apresenta os ramos arredondados e achatados, lisos. Alm disso, M. ilicifolia apresenta a disposio das folhas nos ramos de forma helicoidal, enquanto que em M. aquifolium esta disposio paralela. Com exceo do acesso de M. aquifolium de Canguu (114), na Metade Sul do Rio Grande do Sul, os demais acessos desta espcie foram encontrados somente na Regio Nordeste do Estado. A pequena quantidade de indivduos desta espcie, em relao a M. ilicifolia, amostrada nas expedies de coleta, mostra que a ocorrncia de M. aquifolium bem menor quando comparado de M. ilicifolia. Este fato pode estar relacionado a uma maior vantagem adaptativa desta em relao quela. Uma caracterstica observada em M. ilicifolia, j identificada por outros autores (Carvalho-Okano, 1992; Radomski et al., 2004), a ramificao desde a base, a partir de brotaes de raiz, ao contrrio de M. aquifolium, que apresenta caule nico. Esta caracterstica da M. ilicifolia, facilita a propagao da espcie 28

e a recuperao vegetativa em caso de corte. Foi observado, entretanto, que a maioria dos acessos de M. ilicifolia coletados na Regio Nordeste do Estado no apresentava ramificao desde a base. Como M. aquifolium e M. ilicifolia apresentam cruzamento natural e compartilham alelos (Perecin e Kageyama, 2002) e a primeira espcie foi mais encontrada na Regio da Serra, os acessos identificados como M. ilicifolia de acordo com as caractersticas descritas por Carvalho-Okano (1992) e que apresentam caule nico, podem ser plantas oriundas de cruzamentos entre as duas espcies, apresentando caractersticas de ambas. A ocorrncia natural de cruzamento interespecfico foi observada por Magalhes (comunicao pessoal, 2004) na Unicamp, em So Paulo, uma vez que prognies oriundas de M. aquifolium em uma populao em que coabitam indivduos das duas espcies originaram plantas com ramos multicarenados, caracterstica de M. ilicifolia.

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Tabela 1 Localizao geogrfica e data de coleta das populaes de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Pop. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Acesso* 1-7 8-16 17-18 19-42 43 44-54 55-56, 86-87 57 58 59 60 e 92 61 62-75 76-83 84 85 88-89 90 91 93-94 95-96 97-98 99-101 102 Municpio Encruzilhada do Sul Encruzilhada do Sul Piratini Piratini Piratini Piratini Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Candiota Candiota Hulha Negra Pelotas Arroio Grande Farroupilha Farroupilha Arroio Grande Cachoeirinha So Fco. Paula Caxias do Sul Vacaria Data coleta 23/11/2002 23/11/2002 28/11/2002 28/11/2002 28/11/2002 28/11/2002 03/12/2002 03/12/2002 03/12/2002 03/12/2002 03/12/2002 e 20/12/2002 03/12/2002 12/12/2002 12/12/2002 12/12/2002 15/12/2002 10/12/2002 30/12/2002 31/12/2002 20/12/2002 04/01/2003 09/01/2003 09/01/2003 10/01/2003 10/01/2003 e 11/01/2003 10/01/2003 09/01/2003 12/01/2003 Jan/2003 Jan/2003 Latitute (S) 305625 305555,2 312649,9 312729,2 312129 312700 320421,61 320452,93 320512,26 320515,50 320458,8 320343,78 312043,4 312117,4 313138,5 314256,3 320456,1 291724,5 291723 320444,08 29 5717,4 29 2652,8 29104,8 28 3354,72 28 1320,93 28 144,4 291033,8 28 5815,6 312342 282958 Longitude (O) 523829 523731,2 530626 530744,3 531529,2 530743 530817,7 530745,34 530834,55 530850,39 530805,75 530754,26 534137,6 534131,3 535457,9 521854,6 530052,96 511957,6 51203,6 530809,38 51 0549 50 352,4 511044,4 50 5553,80 51 0538 51 0415,53 511055,2 51 044,8 524033,6 502831 Altitude (m) 82 80 368 330 369 330 139,1 112,6 140,5 172,3 125 225,5 325 300 165 17 105,2 783 783 148,5 8,2 907 980 968 932 933 760 776 386 959

103-104; 106Esmeralda 111 105 112 113 114 115 Vacaria Caxias do Sul So Marcos Canguu Bom Jesus

*Cada acesso corresponde a uma matriz.

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Tabela 2 Taxonomia, geografia e ecologia de populaes de espinheira-santa em municpios do Rio Grande do Sul. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Pop.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Municpio
Encruzilhada do Sul Encruzilhada do Sul Piratini Piratini Piratini Piratini Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Candiota Candiota Hulha Negra Pelotas Arroio Grande Farroupilha Farroupilha Arroio Grande Cachoeirinha So Francisco de Paula Caxias do Sul Vacaria Esmeralda Vacaria Caxias do Sul So Marcos Canguu Bom Jesus

Acessos*
1 ao 7 8 ao 16 17 e 18 19 ao 42 43 44 ao 54 55, 56, 86 e 87 57 58 59 60 e 92 61 62 ao 75 76 ao 83 84 85 88 e 89 90 91 93 e 94 95 e 96 97 e 98 99 ao 101 102 103, 104, 106 ao 111 105 112 113 114 115

Espcie
M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. aquifolium M. aquifolium M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. ilicifolia M. aquifolium (110) e M. ilicifolia M. ilicifolia M. aquifolium M. aquifolium M. aquifolium M. ilicifolia

Orografia do terreno
plano plano declive mdio declives suave e mdio declive suave declive suave encosta e declive mdio declive ngreme topo arredondado topo depresso aberta topo arredondado declive mdio e plano declive mdio e plano plano plano plano encosta encosta plano plano encosta plano plano plano plano declive suave encosta plano plano

Tipologia do local
campo beira de caminho e campo campo campo pedregoso e beira de caminho beira de mata beira de estrada beira de mata, pedregoso campo, prximo a mata campo campo pedregoso beira de mata, pedregoso, pomar campo pedregoso, prximo a um caminho campo pedregoso, prximo a um riacho e sanga campo pedregoso charco, lodoso jardim beira de mata interior de mata, em beira de gua doce, solo orgnico e pedregoso horta familiar, solo orgnico e pedregoso beira de mata jardim beira de mata beira de mata e beira de caminho horta familiar jardim, beira de mata, capo, interior de mata beira de gua doce, pedregoso horta familiar beira de mata, solo orgnico interior de mata beira de mata

Insolao
ensolarado ensolarado meio sombreado ensolarado e sombreado meio sombreado ensolarado meio sombreado ensolarado ensolarado ensolarado ensolarado, sombreado meio sombreado ensolarado, sombreado ensolarado meio sombreado meio sombreado meio sombreado sombreado ensolarado meio sombreado meio sombreado meio sombreado meio sombreado meio sombreada meio sombreado ensolarado ensolarado ensolarado sombreado meio sombreado

meio

arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva

Hbito crescimento

de

arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbrea arbrea arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva e arbrea arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva arbustiva

meio meio

* Cada acesso corresponde a uma matriz de espinheira-santa, totalizando 115 acessos (matrizes).

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Em coletas de germoplasma, a distribuio geogrfica o fator de maior influncia sobre a variao amostrada, atravs da presena ou ausncia de certos alelos em regies geogrficas especficas, alm da variao determinada pelos microclimas e pelas mudanas nos solos e outros fatores do meio (Allard, 1970). Os sistemas de informao geogrfica (SIG) so, portanto, ferramentas importantes para o estudo dos recursos genticos (Abadie, 2001). M. ilicifolia apresentou uma ampla distribuio geogrfica no Rio Grande do Sul, tendo sido encontrada em todos os locais em que foram realizadas expedies de coleta (Tabela 1), com latitude variando de 260832 a 315625, longitude de 502831 a 535457,9 e altitude de 8,2 a 980 m. Em coletas de M. ilicifolia realizadas nos estados do Paran, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, Scheffer (2001) tambm identificou uma ampla distribuio desta espcie, com latitude variando de 2513 a 2957, longitude de 4908 a 5149 e altitude de 7 a 1058 m. Atravs de consulta a acervos de herbrios, Mossi (2003) identificou uma ampla distribuio de M. ilicifolia e M. aquifolium no Rio Grande do Sul, com ocorrncia em todas as regies agroecolgicas do Estado, com exceo do litoral. No presente trabalho, entretanto, no foi identificada uma ampla distribuio para M. aquifolium, a qual ficou mais limitada Regio Nordeste do Estado e com ocorrncia rara. A poca de maturao dos frutos variou de acordo com a latitude, corroborando o observado por Scheffer (2001); iniciando em novembro na Metade Sul e terminando em janeiro na Regio Nordeste do Estado, o que mostra o efeito do fotoperodo na reproduo da espcie. Com relao ecologia dos locais de coleta, foi observado que nas populaes de espinheira-santa os indivduos estavam localizados, em sua maioria, no campo e em beira de mata, com solo pedregoso presente em vrios locais, principalmente nas populaes da Metade Sul (Tabela 2). Segundo Scheffer (2001), M. ilicifolia ocorre principalmente nas Florestas Ombrfila Mista e Estacional Semidecidual e em capes e margens de rios das estepes, nos Estados de So Paulo, Mato Grosso do Sul, Paran, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, especialmente nas reas de influncia fluvial. Ocorre ainda em sub-bosques de florestas em fase de sucesso secundria tardia ou climcicas, com distribuio predominantemente sub-tropical. Radomski et al. (2004), ao estudarem populaes de M. ilicifolia no Paran, 32

identificaram que esta espcie ocorre em manchas de sub-bosque das matas ciliares, ou nos capes de mato, nas encostas de morros, onde h limitaes para o uso agrcola. J Mossi (2003), identificou uma ocorrncia preferencial de M. ilicifolia no sub-bosque das florestas de araucria, s margens de rios e nos agrupamentos arbreos (capes) em regies de estepe. Nas expedies de coleta para este trabalho, plantas de espinheira-santa em capes foram encontradas somente nas populaes de nmero 3 (de Piratini acessos 17 e 18) e 25 (de Esmeralda acessos 107, 108 e 109), e em mata de araucria, somente foram encontrados os acessos 110 e 111, pertencentes populao 25, de Esmeralda. A maioria das reas de ocorrncia de espinheira-santa era, de acordo com a topografia, plana, seguida de encosta, declives mdio e suave. Quanto insolao, na maioria das populaes as plantas encontravam-se em local meio-sombreado, caracterstico de beira de mata, e ensolarado, caracterstico de campo. Somente dois acessos foram coletados em condies de sombreamento, no interior de mata (90 e 114), ambos pertencentes espcie M. aquifolium. Outros indivduos foram encontrados no interior de mata, sombreados, e no foram coletados, por no apresentarem frutos, assim como o acesso 114 que foi coletado somente como exsicata para o herbrio. O acesso 90 apresentou uma baixa produo de frutos. A formao abundante de frutos em espinheira-santa apenas nos indivduos situados nas bordas de mata ou em pleno sol tambm foi destacada por Radomski et al. (2004). M. ilicifolia e M. aquifolium encontram-se na lista de espcies ameaadas de extino no Paran (SEMA/GTZ, 1995 apud Perecin et al., 2004). Segundo Vieira (1999), M. ilicifolia uma espcie considerada prioritria para conservao de germoplasma, devendo-se focar a conservao in situ e a adoo de um sistema de extrativismo sustentvel. Barbieri (2003) tambm salienta que a conservao in situ a melhor estratgia de conservao para espcies florestais. De acordo com Querol (1993), nas atividades de coleta de germoplasma, importante o relato de ocorrncia de eroso gentica da espcie, devido a agricultura, extrativismo, ou outros fatores. Pelo presente trabalho, foi constatado que no Rio Grande do Sul ainda existem muitas populaes de espinheira-santa, entretanto, com forte ao antrpica, principalmente pelas atividades agrcolas, o que levou a uma reduo das 33

populaes remanescentes. As populaes estudadas encontram-se, em sua quase totalidade, em propriedades rurais, portanto mais suscetveis eroso gentica. Foi observado, em vrios locais, indcios de cortes de espinheirasanta para limpeza do campo e presena de rebrotes. A propriedade em que foi coletado um nico indivduo no municpio de Hulha Negra um exemplo. O local foi visitado em setembro de 2002 e foram identificadas treze plantas de espinheira-santa em fase reprodutiva (florao), quando foi solicitado ao proprietrio que preservasse as plantas, pela sua importncia medicinal, por ser uma espcie ameaada e para possibilitar a coleta na fase de maturao dos frutos. Em posterior visita ao local para coleta dos frutos, foi encontrada somente uma planta, tendo sido as demais cortadas. Apenas nas duas populaes de Candiota, localizadas na mesma propriedade rural, o agricultor conservava as plantas no campo, por conhecer a importncia da espcie. Entretanto, a espinheira-santa ainda amplamente distribuda no Estado, em que os diferentes habitats vem contribuindo para a sua evoluo, os quais devem ser conservados. Atravs de coletas de germoplasma de espinheira-santa para este trabalho, foi estabelecido um banco de germoplasma in vivo para conservao ex situ de parte da variabilidade gentica existente no Rio Grande do Sul, o que contribui para preservao da espcie, uma vez que a conservao in situ enfocada por Vieira (1999) como estratgia para conservao de M. ilicifolia pode ser mais difcil em propriedades rurais, o que envolveria um intenso trabalho de conscientizao. Oliveira e Martins (2002) desenvolveram um mtodo quantitativo para estimar a ameaa de eroso gentica de Psychotria ipecacuanha, espcie medicinal nativa do Brasil, em que vrios fatores como a distncia do fragmento de floresta em relao a centros populacionais e rodovias, atividade agrcola, distribuio da espcie, status da conservao da espcie e o extrativismo descontrolado foram os fatores que mais contriburam para a eroso gentica da espcie. Para as populaes de espinheira-santa estudadas neste trabalho, apesar de no ter sido realizada uma anlise quantitativa para estimar a eroso gentica, a atividade agrcola o fator que mais tem contribudo para a perda da variabilidade gentica. J em populaes naturais onde no existe atividade agrcola, o extrativismo , provavelmente, o fator que mais contribui para a eroso gentica de espinheira-santa, conforme 34

destacado por Radomski et. al (2004). Da mesma forma, o extrativismo, aliado falta de proteo de habitats e propenso a incndio so os fatores que mais contribuem para a eroso gentica da espcie medicinal Dimorphandra mollis (fava-danta) em Minas Gerais (Souza e Martins, 2004). A maioria dos acessos de espinheira-santa coletados eram de ocorrncia natural nas propriedades rurais, sendo que apenas na populao 21, de Cachoeirinha, foram plantadas mudas de M. ilicifolia. As populaes denominadas de 3, 16, 21 e 27 esto em zona urbana, enquanto todas as demais ocorrem na zona rural. Foi observada uma grande variao para estatura de plantas e dimetro base do caule (Tabela 3). Das 109 matrizes de M. ilicifolia, 108 apresentavam caracterstica arbustiva e apenas uma era arbrea. A variao total da estatura de plantas para esta espcie foi de 0,42 m (acessos 46 e 47, pertencentes populao 6, de Piratini) a 6,0 m (acesso 99, pertencente populao 23, de Caxias do Sul). Para a espcie M. aquifolium, das seis matrizes coletadas, duas eram arbreas e quatro arbustivas, e a estatura variou de 2,50 m (acessos 110, pertencente populao 25, de Esmeralda e acesso 113, pertencente a populao 28, de So Marcos) a 8,50 m (acesso 90, pertencente populao 18, de Farroupilha). Com relao ao dimetro base do caule, a variao total para M. ilicifolia foi de 0,50 cm (acessos 17 e 18, pertencentes populao trs e acessos 33 e 35, pertencentes populao 4, ambas de Piratini) a 12,0 cm (acesso 99, pertencente populao 23, de Caxias do Sul). Para M. aquifolium, o dimetro base do caule variou de 5,50 cm (acesso 110, de Esmeralda) a 35,0 cm (acesso 90, pertencente populao 18 e acesso 91, pertencente populao 19, ambas de Farroupilha). M. ilicifolia foi descrita por Carvalho-Okano (1992) como um subarbusto ou rvore, podendo atingir uma estatura de at 5 m, o que corresponde aos valores para a maioria das plantas avaliadas neste trabalho, com exceo do acesso 99, que apresentou estatura de 6,0 m. Uma populao de M. ilicifolia com grande variabilidade quanto a estatura de planta e dimetro do caule foi observada por Radomski et al. (2004) no Paran. Segundo os autores, esta heterogeneidade conseqncia dos freqentes cortes e rebaixamentos realizados nas plantas para coleta de folhas, alm do fato das plantas apresentarem idades diferentes. Estes fatores provavelmente tambm ocorrem 35

nas populaes avaliadas neste trabalho, por estarem localizadas, em grande parte, em propriedades rurais, onde comum a limpeza dos campos, o que contribui para variabilidade nestes caracteres. Entretanto, outros fatores, como o solo, influenciam no porte das plantas. Ao realizarem um levantamento fitossociolgico de um remanescente de floresta ombrfila montana em Pernambuco, Tavares et al. (2000) observaram que as menores alturas mximas das rvores de espcies de vrias famlias como Bombacaceae, Anacardiaceae, Lauraceae, Rubiaceae e Fabaceae ocorriam em solos rasos e as maiores alturas mximas ocorriam em solos profundos. Grande parte dos acessos coletados para este trabalho encontrava-se em solos pedregosos, tendo sido encontradas plantas com frutos, desenvolvendo-se em cima de rochas, principalmente em Piratini, o que contribuiu para os menores valores de estatura encontrados em plantas de populaes da Metade Sul do Rio Grande do Sul, quando comparadas s da Regio Nordeste do Estado. Em populaes de M. ilicifolia avaliadas por Steenbock (2003) foi observado que existem importantes diferenas entre indivduos que crescem sob intensa luminosidade e sobre afloramentos de rochas e indivduos que crescem em ambientes semisombreados, sobre solos em formao. Segundo o autor, indivduos em clmax edfico so mais altos, apresentam caules principais com dimetro menor, maior quantidade de ramos e praticamente todas as folhas se inserem nos ramos primrios. Em sub-bosque de formaes secundrias, os indivduos apresentam menor nmero de ramos, grande quantidade de folhas inseridas no caule principal, menor estatura e folhas maiores. A espinheira-santa ocorre naturalmente tanto em solos rasos, frteis e bem drenados, como em solos com processos de sedimentao e gleizao (Radomski et al., 2004). Em trabalho desenvolvido com Minthostachys mollis, uma espcie arbustiva aromtica, tambm foi observada grande variao em estatura (Ojeda et al., 2001). Os autores citam Bhadula et al. (1996) para explicar esta variao, os quais definem que geralmente a altura das plantas decresce com o aumento da altitude. Para as populaes de espinheira-santa avaliadas neste trabalho ocorre o contrrio, ou seja, a estatura das plantas aumenta com a altitude. Entretanto, a altitude no parece ser o fator que mais influencia este carter. possvel que a profundidade do solo seja o fator ambiental que tem maior influncia sobre a estatura de planta em espinheira-santa. 36

Tabela 3 Caracterizao das matrizes (acessos) de espinheira-santa em relao a estatura, dimetro base do caule, cor dos frutos e homogeneidade na maturao dos frutos. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Pop. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 30 Acesso 1 ao 7 8 ao 16 17 e 18 19 ao 42 43 44 ao 54 55, 56, 86, 87 57 58 59 60 e 92 61 62 ao 74 75 ao 83 84 85 88 e 89 90 91 93 e 94 95 e 96 97 e 98 99 ao 101 102 103, 104, 106 ao 111 105 112 113 115 Amplitude Estatura (m) DBC* (cm) 0,60 1,50 0,56 1,77 1,20 3,00 1,00 6,00 1,06 1,30 0,50 0,44 3,00 1,76 0,42 1,19 0,65 2,50 1,80 1,50 1,60 1,00 1,10 1,20 1,35 3,50 0,80 4,00 0,70 3,20 0,80 0,95 8,50 7,00 1,20 1,80 2,10 2,30 4,00 4,50 3,00 6,00 1,25 1,88 4,50 1,50 4,00 2,50 2,00 0,50 2,50 2,20 0,70 2,00 1,20 2,00 2,00 2,50 3,50 1,00 2,00 1,50 9,00 1,00 5,00 0,60 5,50 1,00 35,00 35,00 1,50 2,00 3,50 4,00 8,00 2,70 12,00 3,5 3,00 9,00 2,80 10,00 7,00 5,00 Cor dos frutos alaranjado escuro, marrom, verde-amarronzado, vermelho-amarronzado vermelho-amarronzado, alaranjado, laranja-avermelhado, vermelho-alaranjado vermelho-amarronzado laranja-avermelhado, vermelho-alaranjado, verde-alaranjado, laranja-esverdeado, verde, verdeoliva, alaranjado, laranja-amarronzado, amarelo-esverdeado, vermelho, laranja claro, vermelho-amarronzado laranja-esverdeado alaranjado, vermelho-alaranjado, vermelho-esverdeado, laranja-esverdeado, vermelhoamarronzado, vermelho vermelho, alaranjado vermelho vermelho amarelado vermelho vermelho vermelho-alaranjado, laranja-avermelhado, alaranjado vermelho, laranja-claro, verde-amarelado alaranjado, laranja-esverdeado, vermelho, marrom, vermelho escuro, laranja-escuro vermelho vermelho vermelho alaranjado alaranjado vermelho vermelho, verde alaranjado alaranjado alaranjado, verde alaranjado, verde, amarelo laranja-escuro, verde, amarelo alaranjado alaranjado HMF** alta baixa alta alta alta alta alta alta alta alta alta alta alta mdia alta alta alta alta alta alta mdia alta alta baixa alta baixa alta alta -

*Dimetro base do caule **Homogeneidade na maturao dos frutos dentro de plantas na populao

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A homogeneidade quanto ao estdio de maturao dos frutos para o total das matrizes avaliadas foi alta, pois a maioria das plantas (78,5%) apresentava frutos com a mesma colorao. Atravs da avaliao da homogeneidade no estdio de maturao dos frutos dentro de cada planta na populao, foi observado que a populao com maior nmero de plantas heterogneas foi a 2, de Encruzilhada do Sul em que a maioria das plantas apresentava diversas cores de fruto e apenas 14,3% das plantas eram homogneas para este carter (Tabela 3). As populaes 21, de Cachoeirinha, e 14, de Candiota, foram consideradas mdias com relao a esta caracterstica, em que a primeira apresentou 50% das plantas homogneas quanto ao estdio de maturao dos frutos dentro de cada planta e a segunda, 66,7%. A populao de Cachoeirinha composta por apenas duas plantas cultivadas, de origens diferentes, o que explica esta baixa homogeneidade. As populaes 24 e 26, de Vacaria, no apresentaram homogeneidade para este carter, entretanto, eram plantas nicas, com frutos com diferentes cores. As demais populaes apresentaram alta homogeneidade na maturao dos frutos dentro de cada planta, acima de 70%. Pela comparao entre plantas dentro das populaes, ficou evidenciada uma variao com relao ao estdio de maturao dos frutos, uma vez que foram observadas cores de frutos diferentes entre as matrizes dentro de populaes. A populao 4, de Piratini, foi a que apresentou a maior variao quanto ao estdio de maturao dos frutos entre plantas, tendo sido identificados 12 diferentes cores de frutos. Foram identificadas plantas (no coletadas) com frutos ainda verdes e outras com flores nas populaes durante as expedies de coleta. A populao 2, de Encruzilhada do Sul e a populao 5, de Piratini, apresentaram, respectivamente, uma e duas plantas com frutos verdes. As populaes 1 e 2, de Encruzilhada do Sul e a populao 13, de Candiota, apresentaram, respectivamente, trs, uma e uma plantas (no coletadas) em estdio de florao. Algumas matrizes em que foram coletados frutos tambm apresentavam flores, como o acesso 95, pertencente populao 21, de Cachoeirinha, o 102, pertencente populao 24, de Vacaria e o 108, pertencente populao 25, de Esmeralda. Esta ltima populao apresentava, ainda, uma matriz (109) em fase de florao, em que foram coletados apenas ramos para o herbrio. Estes dados mostram que existe 38

variao entre as plantas de espinheira-santa quanto fase reprodutiva nas populaes, como tambm observada por Negrelle et al. (1999). Segundo os autores, em M. ilicifolia ocorrem flores e frutos com diferentes nveis de maturao num mesmo ramo, sendo que o ponto ideal de colheita dos frutos antes da abertura do pericarpo. Magalhes et al. (1992) tambm observaram variao no estdio de maturao em frutos de M. ilicifolia, o que segundo os autores, um mecanismo tpico de espcies silvestres. Foram evidenciadas vrias tonalidades de cores em frutos de espinheira-santa, o que mostra a diversidade de estdios de maturao dos frutos desta espcie. A maior ocorrncia foi de frutos de cor alaranjada, seguido de vermelho. Ao avaliarem a fase de frutificao de M. ilicifolia, Negrelle et al. (1999) observaram que medida que os frutos amadureciam, apresentavam, seqencialmente, colorao verde, verde-amarelada, amarelo-alaranjada, laranja-avermelhada, vermelho-amarronzada e marrom, sendo que, na penltima fase, o epicarpo rompia-se, expondo as sementes ariladas. J Taylor-Rosa e Barros (1996) identificaram a cor do pericarpo de frutos maduros de M. ilicifolia como vermelho-alaranjada. Todas estas cores de frutos foram tambm identificadas neste trabalho, alm de outras tonalidades intermedirias. Entretanto, algumas matrizes no obedeceram relao de cor vermelho-amarronzado com a abertura do pericarpo, como os acessos 24 e 28, pertencentes populao 4, de Piratini, que apresentaram, respectivamente, alguns frutos alaranjados e laranja-amarronzados com o pericarpo abrindo. O mesmo ocorreu com o acesso 75, da populao 13, de Candiota e os acessos 103 e 110, da populao 25, de Esmeralda, que apresentaram alguns frutos alaranjados com o pericarpo abrindo. Neste trabalho, a maioria dos frutos que tinham as valvas abertas apresentava o pericarpo com colorao vermelho-escuro, corroborando o que foi apresentado por Magalhes et al. (1992), que colheram frutos com pericarpo alaranjado com valvas fechadas e frutos com pericarpo vermelhoescuro, com valvas abertas, expondo o arilo. Para algumas matrizes, entretanto, a cor do pericarpo neste estdio era marrom, conforme descrito por Negrelle et al. (1999). Esta diferena em cores do pericarpo no momento da abertura das valvas sugere que pode existir variabilidade gentica para este carter, alm da influncia do ambiente.

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Os dados etnobotnicos foram obtidos a partir da entrevista com 15 pessoas, nos locais de coleta, em que se utilizou um questionrio estruturado (Tabela 4). Das pessoas que contriburam com as informaes, oito eram agricultores (53,33%), duas eram donas-de-casa (13,33%), dois eram bilogos (13,33%), uma era professora (6,67%), um era pedreiro (6,67%) e um engenheiro agrnomo (6,67%). Dos oito informantes que eram agricultores, seis eram pequenos agricultores (75%), um era mdio agricultor (12,5%) e um era grande agricultor (12,5%). Nenhuma das pessoas entrevistadas produz espinheira-santa para o mercado, sendo que as plantas ocorrem naturalmente em suas propriedades e apenas a informante da populao 21, de Cachoeirinha, plantou mudas de espinheira-santa, para consumo prprio. Dos 15 informantes, nas 18 populaes em que foram feitos levantamentos etnobotnicos, 11 identificaram as espcies como cancorosa (73,33%), quatro, como espinheira-santa (26,67%) e um como cancorosa-desete-espinhos (6,67%) (Tabela 4). Em um estudo etnobotnico do uso dos recursos genticos em So Joo do Polsine, RS, Soares et al. (2004) identificaram diferentes nomes locais para M. aquifolium (espinheira-santa, espinheiro, cancorosa e cancarosa) e M. ilicifolia (erva-santa-maria, espinheirasanta, cancorosa, cancarosa e cancerosa). Segundo Scheffer (2004), M. ilicifolia conhecida como congora, erva-cancerosa, espinho-de-deus, salvavidas e espinheira-santa no Brasil; quebrachillo na Argentina e no Uruguai; sombra-de-toro no Rio da Prata; concorosa no Uruguai; maiteno, cancerosa, cancrosa e coromilho-do-campo. Espinheira-santa e cancorosa tambm so nomes locais identificados nas populaes em que foram realizadas expedies de coleta para este trabalho. O nome cancorosa-de-sete-espinhos, entretanto, foi registrado apenas em duas populaes, 13 e 14, de Candiota que encontravam-se na mesma propriedade rural, portanto com apenas um informante. Esta denominao, segundo o informante de Candiota, para diferenciar esta espcie da cancorosa-de-trs-espinhos (Iodina rhombifolia, famlia Santalaceae).

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Tabela 4 Avaliaes etnobotnicas realizadas nas coletas de espinheirasanta. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Caracterstica do informante pequeno agricultor pequeno agricultor pequena agricultora pedreiro pequeno agricultor Nome local da espcie cancorosa cancorosa cancorosa cancorosa cancorosa cancorosade- seteespinhos cancorosa, espinheirasanta cancorosa espinheirasanta cancorosa cancorosa cancorosa espinheirasanta cancorosa espinheirasanta Parte da planta usada folhas raiz folhas folhas folhas folhas Forma de uso chimarro chimarro ch ch ch ch

Pop.

Uso medicinal problemas estomacais e renais diabete purificar o sangue gastrite, purificar o sangue, problemas intestinais gastrite gastrite, emagrecedor, depurativo do sangue, problemas estomacais em geral purificar o sangue, problemas na bexiga gastrite problemas estomacais problemas estomacais problemas estomacais, emagrecedor purificar o sangue dor de estmago problemas estomacais

1 2 3 4 5

13 e 14 15 18 19 21 22 e 23 24 e 26 25 27 28

grande agricultor pequeno agricultor mdio agricultor professora dona-de-casa bilogo engenheiro agrnomo pequeno agricultor dona-de-casa bilogo

folhas folhas folhas folhas folhas folhas folhas folhas folhas

ch ch ch ch ch chimarro ch ch

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As indicaes medicinais populares foram bastante diversificadas. Dos 13 informantes que forneceram estes dados, cinco indicaram a espinheirasanta para purificar ou como depurativa do sangue (38,46%), quatro para gastrite (30,77%), sete para problemas estomacais e dor de estmago (53,85%), dois como emagrecedor (15,38%), um para problemas renais (7,69%), um para diabetes (7,69%), um para problemas intestinais (7,69%) e um para problemas na bexiga (7,69%). Houve uma coincidncia entre a indicao medicinal por grande parte dos informantes (30,77%) com aquela comprovada cientificamente por Carlini (1988), que para gastrite. Considerando ainda que 53,85% dos entrevistados indicaram a eficcia da espinheira-santa para problemas estomacais (em que esto includas a gastrite e a lcera gstrica) , dos quais um informante indicou a espinheira-santa tanto para gastrite como para problemas estomacais este nmero se eleva para 76,92%. Em So Joo do Polsine, entretanto, nenhum informante indicou M. ilicifolia e M. aquifolium especificamente para gastrite (Soares et al., 2004). Naquele estudo foi indicada apenas a ao digestiva de M. aquifolium, alm de estimulante biliar e depurativa do sangue, sendo que M. ilicifolia, foi indicada para cncer, presso alta, para deixar a pele bonita e como depurativa do sangue. Neste trabalho, foi expressivo o nmero de informantes (38,46%) que tambm indicaram a espinheira-santa como depurativo do sangue. Foi destacado, por Elisabetsky e Costa-Campos (1996), a importncia do conhecimento tradicional, o qual serve de base para pesquisa com plantas medicinais. Neste sentido, pelo elevado nmero de referncias espinheirasanta como depurativa do sangue, estudos farmacolgicos devem ser realizados para verificar a veracidade desta indicao popular. Todos os informantes que indicaram a parte da planta que utilizada para fins medicinais fizeram referncia s folhas (Tabela 4). O informante da populao 1 indicou ainda o uso da raiz da planta, especificamente para o tratamento da diabete. As folhas e razes da espinheira-santa j eram utilizadas pelas tribos indgenas que habitavam o sul do Brasil, a Argentina, o Uruguai e o Paraguai (Scheffer, 2004). Todos os informantes que identificaram o uso medicinal da espinheira-santa utilizam a planta na forma de ch, que o preparo por infuso, sendo que a maioria no mistura com outras espcies medicinais no preparo, e apenas dois (15,38%) utilizam a planta no chimarro. 42

A espinheira-santa adicionada erva-mate justamente para combater a azia e a gastrite que podem ser provocadas por esta bebida (Scheffer, 2004). Algumas outras referncias interessantes espinheira-santa foram registradas. Na populao 1, de Encruzilhada do Sul, por exemplo, foi comentado pelos informantes que naquele local morava um senhor que faleceu com 100 anos de idade e que este usava o ch da raiz de espinheira-santa para problemas estomacais e outras finalidades. O informante da populao 15, de Hulha Negra, destacou que o ch das folhas de espinheira-santa, juntamente com a casca do ip-roxo, mais eficiente para gastrite. Ele e a famlia fazem o ch e o tomam frio, em substituio gua, quando tm sede. Para estes informantes, a espinheira-santa, ou cancorosa, mais eficiente contra a gastrite do que a cancorosa-de-trs-espinhos (Iodina rhombifolia). Na populao 21, de Cachoeirinha, a informante destacou que, por indicao do centro esprita Allan Kardec, deveria tomar o ch de espinheira-santa por toda a vida. Ela ento plantou duas mudas de espinheira-santa, h mais de 10 anos, e desde ento vem consumindo o ch das folhas. Na populao 25, de Esmeralda, o agricultor informou que a espinheira-santa boa para todas as doenas. Em estudo etnobotnico de Ricinodendron heudelotti, Foundoun et al. (1999) ao entrevistarem agricultores observaram que a comunidade utilizava esta espcie na alimentao, na forma de condimento, como medicinal para febre amarela, anemia, como afrodisaco, doenas estomacais e malria , para atividade scio-cultural, em jogos e para fertilizar os solos. J para espinheira-santa, neste trabalho, somente foi registrado o uso medicinal. Entretanto, de acordo com Lorenzi e Matos (2002), M. ilicifolia apresenta atributos ornamentais, pela semelhana de suas flores e frutos com o azevinho usado nas decoraes de Natal no hemisfrio norte , tendo sido, portanto, introduzida no paisagismo. O levantamento etnobotnico, associado s atividades de coleta de germoplasma em programas de recursos genticos como os desenvolvidos neste trabalho so fundamentais para preservar tambm o conhecimento tradicional do uso das espcies vegetais patrimnio intelectual de uma comunidade ou de uma regio, que pode se perder com o tempo. A importncia deste conhecimento popular tambm foi observada por Alves et al. (2000). Os autores, ao realizarem uma seleo biolgica de plantas medicinais 43

do Cerrado brasileiro com base em informaes etnobotnicas e entrevistas com a populao local , identificaram que, das 60 espcies avaliadas, 42 mostraram alto grau de atividade em um ou mais dos bioensaios testados. Conservar o conhecimento indgena e a diversidade biolgica foi ainda destacado por Rossato et al. (1999), ao identificarem 276 espcies usadas para alimentao, como medicinais, e para construo, em comunidades caiaras da floresta atlntica costeira, no sudeste do Brasil. Segundo Scheffer (2004), a espinheira-santa pode ser considerada um exemplo didtico de como os medicamentos modernos podem ser desenvolvidos a partir do conhecimento popular. A autora destaca que as legislaes nacional e internacional no impediram que produtos derivados da espinheira-santa fossem patenteados no exterior e no garantiram aos fornecedores da informao uma participao nos benefcios monetrios, advindos dos lucros das empresas. Alm disso, colocam em risco de eroso gentica, as espcies de espinheira-santa, devido ao extrativismo descontrolado, em vista da divulgao da comprovao cientfica de suas propriedades teraputicas.

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3.4 CONCLUSES

A espinheira-santa apresenta uma ampla distribuio nas regies pesquisadas do Rio Grande do Sul, sendo mais escassa na Regio Nordeste do Estado, quando comparado Metade Sul. Maytenus ilicifolia mais freqente do que M. aquifolium. As plantas encontram-se em ambientes bastante variados e so, na maioria, arbustivas e de ocorrncia natural nas propriedades. A atividade agrcola o principal fator responsvel pela eroso gentica na espinheira-santa. Existe uma grande variao para a estatura, dimetro do caule e estdio de maturao dos frutos. Cancorosa o nome popular mais utilizado para M. ilicifolia e M. aquifolium nos locais de coleta. A maioria das pessoas consultadas indicou a espinheira-santa para problemas estomacais e como depurativa do sangue.

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3.5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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4. CAPTULO III

VARIABILIDADE EM MATRIZES DE ACESSOS DE ESPINHEIRA-SANTA (Maytenus ilicifolia E Maytenus aquifolium)

4.1 INTRODUO

As espcies de espinheira-santa, Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. e Maytenus aquifolium Mart., so nativas do Brasil e apresentam alto valor medicinal para o tratamento de gastrite e lcera gstrica (Carlini, 1988). Uma descrio botnica das duas espcies de espinheira-santa, assim como outras do gnero Maytenus foi realizada por Carvalho-Okano (1992). M. ilicifolia apresenta ramos jovens tetra ou multicarenados, angulosos, enquanto M. aquifolium apresenta os ramos arredondados e achatados, lisos. Alm disso, M. ilicifolia apresenta a disposio das folhas nos ramos de forma helicoidal, enquanto que em M. aquifolium esta disposio paralela. De acordo com Carvalho-Okano e Leito Filho (2004), a morfologia foliar, o tipo de inflorescncia e o nmero de flores so caracteres importantes para o reconhecimento das espcies de Maytenus. Pela forte ao antrpica a que estas espcies vm sendo submetidas, existe o risco de eroso gentica. Neste sentido, para preservar a variabilidade gentica, a Embrapa Clima Temperado implantou um banco ativo de germoplasma de espinheira-santa. Os acessos foram caracterizados morfologicamente, tanto nas populaes naturais, atravs das matrizes (Mariot 50

et al., 2003), quanto no banco de germoplasma, atravs das prognies (Mariot et al, 2004). O estudo da divergncia gentica, atravs de anlises multivariadas deve ser destacado neste trabalho de caracterizao, pois permite conhecer melhor o germoplasma de espinheira-santa disponvel. A quantificao do grau de dissimilaridade entre gneros, espcies, subespcies, populaes e gentipos elite utilizados no melhoramento de fundamental importncia em gentica de populaes e no melhoramento de plantas (Reif et al. 2005). Em recursos genticos, em que normalmente so caracterizados e conservados muitos acessos, esta ferramenta tambm se torna bastante til no sentido de identificar a variabilidade gentica do banco de germoplasma, agrupar os acessos mais similares e assim otimizar os trabalhos nas colees. Segundo Carvalho et al. (2003), a estimativa da distncia euclidiana vivel para este propsito, uma vez que podem ser utilizados dados sem repeties. Foi destacado por Skinner et al. (1999), a importncia de reunir uma coleo nuclear representativa e avaliar as relaes entre as caractersticas estudadas para tornar mais eficiente o uso de colees grandes de germoplasma. Os autores propuseram anlise de dissimilaridade, atravs da distncia euclidiana mdia, para auxiliar na formao de colees nucleares. Anlises multivariadas para estudar a diversidade gentica com base em caracteres morfolgicos e/ou fisiolgicos foram realizadas em germoplasma de muitas espcies, como feijo (Machado et al., 2002), Trifolium (Radomska, 2000), Medicago (Skinner et al., 1999), fava (Terzopoulos et al., 2003) e algodo (Carvalho et al., 2003). Em espinheira-santa, estudos de divergncia gentica tm sido realizados atravs de marcadores moleculares do tipo RAPD (Bittencourt, 2000; Mossi, 2003), metablitos secundrios (Mossi, 2003) e isoenzimas (Scheffer, 2001; Perecin e Kageyama, 2002; Steenbock, 2003). Os trabalhos desenvolvidos com isoenzimas pelos ltimos autores, permitiram a deteco de onze sistemas alozmicos, os quais foram eficientes para descrever a variabilidade em M. ilicifolia (Perecin et al., 2004). Foram revelados 14 locos alozmicos, em que foi evidenciada a existncia de 37 alelos, o que permitiu detectar uma riqueza allica nesta espcie de 2,64 alelos por loco. Em M.

51

aquifolium, foram detectados 31 alelos, o que resultou em uma mdia de 2,57 alelos por loco. Como a caracterizao morfolgica est inserida nas etapas que envolvem a identificao de acessos em bancos de germoplasma e normalmente a primeira a ser realizada, o objetivo deste trabalho foi identificar a variabilidade fenotpica para alguns caracteres morfolgicos em matrizes de espinheira-santa, estimar a dissimilaridade gentica e agrupar os acessos atravs de anlises multivariadas.

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4.2 MATERIAL E MTODOS

Os gentipos de espinheira-santa utilizados correspondem s matrizes que originaram o banco ativo de germoplasma da Embrapa Clima Temperado e so oriundos de 11 diferentes municpios do Estado do Rio Grande do Sul (Tabela 1). Foram analisadas 105 matrizes, sendo que cada uma foi considerada como um acesso. Os acessos 90, 91, 110 e 112 pertencem espcie M. aquifolium e os demais, M. ilicifolia. De cada matriz, nas populaes de origem, foram coletados frutos em estdio que antecede a abertura das cpsulas bivalvares, conforme descrito por Negrelle et al. (1999), e ramos com folhas. As avaliaes foram feitas em 20 frutos e 20 folhas, tomadas ao acaso de vrios locais da planta. Os caracteres avaliados foram: a) Comprimento e largura de fruto, em mm, medidos com auxlio de um paqumetro digital logo aps a coleta, antes da abertura das cpsulas; b) Nmero de sementes por fruto, contados aps a abertura das cpsulas; c) Comprimento e largura de folha, em cm, medidos com auxlio de uma rgua; d) Relao comprimento/largura de folha; e) Nmero de espinhos por folha.

53

Tabela 1 Acessos de espinheira-santa utilizados para anlise de dissimilaridade com base em caracteres morfolgicos das matrizes. Pelotas/RS, UFPel 2005.

Popul ao
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27 Total 1-7 8-16 17-18

Acesso

N. de acessos 7 9 2 23 1 11 4 1 1 1 2 1 14 8 1 1 2 1 1 2 1 1 1 7 1 1 105

Municpio Encruzilhada do Sul Encruzilhada do Sul Piratini Piratini Piratini Piratini Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Candiota Candiota Hulha Negra Pelotas Arroio Grande Farroupilha Farroupilha Arroio Grande Cachoeirinha Caxias do Sul Vacaria Esmeralda Vacaria Caxias do Sul

19-21, 23-42 43 44-54 55,56; 86,87 57 58 59 60 e 92 61 62-75 76-83 84 85 88-89 90* 91* 93-94 95 101 102 103,104; 106-108; 110*,111 105 112*

* Acessos pertencentes espcie M. aquifolium

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Foram calculadas as mdias e os desvios padro para cada carter e para cada acesso. Para anlise de dissimilaridade foi utilizada a distncia euclidiana, em que a distncia entre o par de acessos i e i definida pela expresso

dii' =

( y
j

ij

yi' j )2 , considerando yij a observao no i-simo acesso para a j-

sima caracterstica (Cruz e Carneiro, 2003). Esta anlise foi realizada com auxlio do programa GENES (Cruz, 2001), tendo sido utilizadas as mdias dos caracteres para cada acesso. Este programa fornece, alm da matriz de dissimilaridade, a contribuio relativa dos caracteres para divergncia, conforme Singh (1981). Atravs da matriz de dissimilaridade dos acessos foi feita a anlise de agrupamento pelo mtodo de otimizao de Tocher, conforme descrito por Cruz e Carneiro (2003). Este mtodo foi escolhido devido ao grande nmero de acessos, o que tornaria difcil a representao atravs de dendrograma. A consistncia do agrupamento foi verificada atravs da anlise discriminante de Anderson (Anderson, 1958). Posteriormente, atravs das mdias das populaes, foi feita uma nova anlise de dissimilaridade, utilizando-se tambm a distncia euclidiana. A partir da matriz de dissimilaridade das populaes, foi feita a anlise de agrupamento pelo mtodo hierrquico UPGMA, em que se obteve o dendrograma. Para verificar a consistncia do agrupamento foi estimado o coeficiente de correlao cofentica (Sokal e Rohlf, 1962). A anlise de agrupamento para as populaes foi realizada com auxlio do programa NTSys (Rohlf, 2000).

55

4.3 RESULTADOS E DISCUSSO

Foi identificada uma alta variabilidade para todos os caracteres analisados (Tabelas 2 e 3). O carter que apresentou a maior variao foi o nmero de espinhos por folha, seguido de comprimento de folha e comprimento de fruto, e o que mostrou menor variao foi a largura de folha (Tabela 2). O coeficiente de variao foi mdio para os caracteres comprimento e largura de fruto e alto para os demais caracteres. Os maiores coeficientes de variao foram para os caracteres nmero de sementes por fruto e nmero de espinhos por folha, e os menores, para comprimento e largura de fruto. Por ser uma espcie de fecundao cruzada (Scheffer, 2001), j era esperada uma ampla variao. Alm disso, importante que se considere o fator ambiente que bastante variado entre as regies em que foram realizadas as coletas influenciando estes caracteres, o que justifica os altos valores para os coeficientes de variao. Os acessos de M. aquifolium apresentaram as maiores mdias para largura de fruto (acesso 91), comprimento (acesso 91) e largura de folha (acesso 110) e nmero de espinhos por folha (acesso 112), quando comparados com os acessos de M. ilicifolia (Tabela 3). Estes resultados esto de acordo com os apresentados por Carvalho-Okano (1992), que, ao caracterizar morfologicamente espcies do gnero Maytenus, descreveu valores maiores para estes caracteres na espcie M. aquifolium, quando comparado com M. ilicifolia. Segundo a autora, M. aquifolium apresenta comprimento e largura de folha variando, respectivamente, de 6 a 19 cm e de 2 a 6 cm, enquanto M. ilicifolia apresenta uma variao de 2,2 a 8,9 cm para comprimento de folha e de 1,1 a 3 cm para largura de folha. Os acessos 90 e 56

91 (M. aquifolium) oriundos, respectivamente das populaes 18 e 19, de Farroupilha e 17 e 18 (M. ilicifolia) oriundos da populao 3, de Piratini apresentaram os maiores valores para comprimento de fruto. Carvalho-Okano (1992) identificou uma variao de 7 a 10 mm para este carter em M. ilicifolia, que menor do que o encontrado nos acessos 90 e 91 ambos pertencentes espcie M. aquifolium neste trabalho. Entretanto, os valores encontrados nos outros acessos de M. aquifolium, so semelhantes aos identificados em alguns acessos de M. ilicifolia e correspondem ao descrito por Carvalho-Okano (1992) para esta espcie. Assim, tamanho de frutos torna-se um parmetro inadequado para diferenciar as duas espcies. Os acessos que apresentaram as menores mdias para estes caracteres todos pertencentes espcie M. ilicifolia foram o 3, para comprimento de fruto, o 4, para largura de fruto, o 20, para comprimento de folha, o 46, para largura de folha, e o 73, para nmero de espinhos por folha. O acesso 95 apresentou a maior variao para comprimento de fruto e os acessos 40 e 102, de Vacaria, mostraram menor variao (Tabela 3). Para largura de fruto, os acessos 89 e 110 mostraram uma maior variao, enquanto que o 56 mostrou menor variao. O nmero de sementes por fruto variou de um a quatro (Tabela 2), corroborando os trabalhos apresentados por Taylor-Rosa e Barros (1996) e Scheffer (2001). Os acessos 101 e 112 apresentaram, respectivamente, a maior (3,20) e a menor (1,07) mdia para o nmero de sementes por fruto (Tabela 3). Scheffer (2001) identificou uma variao mdia de 1,36 a 3,05 para este mesmo carter. De acordo com a autora, a variao no nmero de sementes por fruto influenciada por fatores como a idade das plantas, presena e atividade de polinizadores, fatores nutricionais e genticos, o que pode explicar as diferenas observadas entre os acessos neste trabalho. O acesso 21, de Piratini, apresentou a maior variao para nmero de sementes por fruto, enquanto que o acesso 112 mostrou a menor variao. O acesso 6 apresentou a maior variao para comprimento de folha, enquanto que o acesso 31 mostrou a menor variao (Tabela 3). Para largura de folha, o acesso 1 mostrou uma maior variao, enquanto que o 107 apresentou uma menor variao. O nmero de espinhos por folha variou de um a 24, para o total de plantas avaliadas (Tabela 2). O acesso 103 apresentou a 57

maior variao para este carter, enquanto que o 64 mostrou uma menor variao (Tabela 3). Carvalho-Okano (1992) tambm observou uma grande variao para estes caracteres em espinheira-santa. O maior tamanho de folha e a maior quantidade de espinhos por folha observados em M. aquifolium, aliado presena de carenas nos ramos, parecem ser bons parmetros para diferenciar esta espcie de M. ilicifolia e tambm para caracterizar acessos de espinheira-santa. Tambm foi destacado por Carvalho-Okano e Leito Filho (2004), a importncia da morfologia foliar para diferenciar espcies do gnero Maytenus. Em prognies de M. ilicifolia, Radomski e Scheffer (2004) identificaram nove morfotipos de espinheira-santa, baseados na morfologia foliar, o que confirma a grande variabilidade para estes caracteres, tambm observada neste trabalho. O acesso 95, de Cachoeirinha, mostrou a maior mdia para o carter relao comprimento/largura de folha, enquanto que o 60 apresentou a menor mdia (Tabela 3). Os acessos 6 e 60 apresentaram, respectivamente, a maior e a menor variao para este carter. Em estudo da morfologia de Maytenus boaria, Donoso e Wendler (1985) observaram que este carter apresentou uma amplitude de 2,8 a 4,3 cm, existindo uma variao clinal, em que, quanto mais ao sul, maiores e mais estreitas so as folhas.

Tabela 2 Valores mnimos e mximos, mdia, desvio padro e coeficiente de variao (CV) para os caracteres morfolgicos em matrizes de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Carter Comprimento de fruto (mm) Largura de fruto (mm) N de sementes/fruto Comprimento de folha (cm) Largura de folha (cm) Comprimento/largura de folha N de espinhos/folha Mnimo 4,4 3,4 1 0,7 0,5 0,4 1 Mximo 15,4 11,8 4 15,3 4,3 7,3 24,0 Mdia 9,4 7,3 2,0 4,2 1,8 2,4 7,9 Desvio padro 1,4 1,1 0,9 1,6 0,6 0,6 3,4 CV (%) 14,7 15,1 44,2 38,5 32,1 26,0 43,2

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Tabela 3 Mdia e desvio padro dos caracteres morfolgicos em matrizes (acessos) de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.

Acessos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61

Caracteres morfolgicos mdia e desvio padro CFr (mm)

8,39 0,68 9,27 0,86 7,04 0,78 11,12 0,88 7,64 0,97 11,16 0,80 8,78 0,64 11,40 0,61 9,95 0,85 7,92 0,61 9,52 0,91 7,60 0,61 9,13 0,56 10,11 0,63 9,78 1,10 8,59 0,52 13,22 0,94 12,95 1,36 9,22 0,60 8,74 0,68 10,23 0,62 9,10 0,78 8,13 0,56 9,14 0,77 8,50 0,47 8,93 0,47 8,82 0,58 8,91 0,44 8,72 0,58 8,72 0,71 8,09 0,58 8,86 0,75 9,65 0,72 8,30 0,80 8,74 0,58 8,91 0,46 9,08 0,71 8,56 0,50 9,61 0,43 10,33 0,78 9,60 0,92 9,56 0,47 10,56 0,59 10,10 0,71 10,00 0,81 10,39 0,76 10,05 0,56 10,42 0,81 10,48 0,96 9,17 0,55 9,42 0,78 10,87 0,72 7,89 0,50 8,72 0,84 7,72 0,50 7,68 0,73 9,84 0,91 8,40 0,54 10,53 0,89 10,43 0,80

LFr (mm)
7,02 0,69 7,62 0,98 6,27 0,81 5,75 0,60 6,55 0,66 7,53 0,88 7,10 0,57 6,87 0,71 6,95 0,95 6,75 0,68 6,35 0,77 5,15 0,89 7,01 0,51 7,27 0,77 7,48 0,74 7,29 0,59 8,52 0,97 8,21 1,07 7,49 0,60 7,11 0,69 8,22 1,07 7,97 0,81 6,27 0,53 6,53 0,73 6,71 0,69 6,92 0,61 7,75 0,65 7,75 0,60 7,09 0,62 6,91 0,75 6,76 0,72 7,00 0,57 7,01 0,76 6,49 0,70 7,40 0,76 6,21 0,55 6,59 0,67 6,05 0,64 7,39 0,76 7,07 0,68 6,33 0,72 7,00 0,74 7,87 0,55 8,12 0,77 7,76 1,18 8,21 0,85 7,65 0,57 8,06 0,91 6,36 0,74 6,90 0,58 6,88 1,00 6,18 0,46 6,81 1,22 7,11 0,77 6,86 0,44 6,31 0,79 6,83 0,75 7,04 0,71 7,41 0,86 6,83 0,74

NSem/fruto
2,95 0,88 2,05 0,69 2,90 0,55 2,00 0,65 2,20 0,77 1,65 0,87 2,20 1,00 1,85 0,67 1,90 0,72 1,95 0,60 1,30 0,47 1,65 0,67 1,50 0,69 2,00 0,97 1,95 1,00 1,80 0,70 1,85 1,04 1,67 0,78 1,70 0,73 1,70 0,66 2,85 1,14 1,95 0,76 2,10 0,91 1,95 0,94 1,75 0,79 2,35 0,67 2,80 0,62 2,40 0,82 1,40 0,75 1,50 0,69 2,40 0,60 1,90 0,91 1,80 0,83 1,55 0,76 3,10 0,85 2,10 0,85 1,25 0,44 1,45 0,69 2,20 0,83 1,50 0,61 2,55 0,94 2,30 0,92 2,15 0,99 2,00 0,92 1,75 1,02 1,40 0,68 1,85 0,93 2,40 1,05 1,50 0,61 1,85 0,74 1,45 0,51 1,40 0,60 2,45 0,89 2,15 0,93 2,80 1,00 1,60 0,60 1,95 0,60 1,95 0,94 1,75 0,72 1,95 0,76

CFo (cm)
5,48 1,48 4,38 1,36 4,22 1,38 3,92 0,67 3,77 0,45 6,52 2,45 3,99 1,43 4,24 1,37 5,37 1,34 5,57 1,13 4,65 1,14 5,95 1,09 5,19 1,05 4,44 1,14 4,82 0,53 4,92 0,73 4,29 0,84 4,43 0,72 4,03 0,95 2,33 0,73 3,82 0,75 4,00 0,59 4,83 0,72 4,60 0,42 4,69 0,61 4,17 0,99 4,97 0,92 4,75 1,28 2,63 0,38 2,51 0,29 3,08 0,66 3,45 0,50 3,45 0,63 3,47 1,03 5,12 1,16 3,17 0,46 3,20 0,73 3,21 0,81 3,17 0,98 3,68 0,64 3,92 0,74 3,92 0,60 4,75 1,09 3,50 0,81 3,23 0,57 3,48 0,42 4,00 0,81 3,78 0,56 4,29 0,59 3,05 0,70 3,26 0,54 3,79 0,82 4,00 0,53 3,46 0,80 2,54 0,64 2,57 0,40 3,35 0,57 2,99 0,66 3,33 0,46 3,50 0,93

LFo (cm)
2,72 0,73 2,25 0,52 2,21 0,60 1,92 0,48 1,62 0,32 2,08 0,32 2,22 0,53 1,81 0,49 2,48 0,56 2,23 0,47 2,05 0,49 2,52 0,49 2,48 0,56 2,10 0,69 2,36 0,36 2,29 0,42 1,78 0,46 2,05 0,41 2,34 0,59 1,52 0,40 2,35 0,43 2,08 0,41 2,12 0,32 2,19 0,39 2,09 0,33 1,54 0,43 1,97 0,45 1,98 0,60 1,30 1,33 1,13 0,16 1,56 0,42 1,39 0,28 1,78 0,37 1,43 0,35 2,76 0,58 1,47 0,16 1,37 0,40 1,29 0,22 1,37 0,44 1,76 0,22 1,81 0,39 1,38 0,17 1,85 0,39 1,11 0,21 1,03 0,20 1,19 0,18 1,25 0,23 1,21 0,21 1,65 0,36 1,66 0,31 1,22 0,27 1,55 0,35 1,59 0,33 1,89 0,39 1,48 0,40 1,67 0,34 1,48 0,44 1,51 0,53 2,18 0,30 1,64 0,28

C/LFo
2,07 0,46 1,94 0,37 1,90 0,32 2,09 0,27 2,42 0,55 3,16 1,10 1,77 0,46 2,36 0,49 2,17 0,23 2,53 0,37 2,27 0,24 2,38 0,34 2,12 0,29 2,21 0,49 2,08 0,35 2,18 0,30 2,52 0,60 2,27 0,68 1,77 0,38 1,62 0,64 1,65 0,33 1,96 0,23 2,31 0,37 2,15 0,31 2,27 0,24 2,74 0,31 2,59 0,48 2,48 0,57 2,09 0,38 2,26 0,32 2,06 0,50 2,55 0,50 2,02 0,61 2,42 0,29 1,86 0,22 2,17 0,36 2,46 0,68 2,47 0,43 2,37 0,57 2,11 0,36 2,23 0,42 2,87 0,43 2,57 0,22 3,16 0,43 3,20 0,46 2,96 0,37 3,22 0,42 3,17 0,42 2,73 0,80 1,84 0,22 2,73 0,32 2,48 0,51 2,59 0,40 1,85 0,32 1,75 0,31 1,57 0,19 2,40 0,57 2,10 0,50 1,54 0,15 2,12 0,38

NEsp/folha
8,60 2,32 10,15 3,23 9,15 1,90 8,43 1,78 8,40 0,88 9,82 1,67 5,53 1,26 8,00 2,00 14,65 1,27 11,50 2,31 8,78 1,30 12,45 1,81 6,85 1,93 6,35 1,53 6,80 1,67 7,70 2,58 8,60 1,73 7,00 1,13 8,75 1,77 6,72 2,16 8,80 1,64 9,70 1,42 9,10 1,29 10,00 1,78 7,30 1,34 6,95 1,76 7,25 1,62 7,65 1,50 4,90 1,45 8,85 1,27 8,60 1,90 9,00 1,15 8,05 1,50 10,00 1,38 6,60 1,50 8,65 1,14 4,55 1,43 9,35 1,69 8,75 2,36 7,45 1,15 11,00 1,72 8,10 1,89 9,05 1,85 5,45 0,69 4,20 0,89 5,75 1,16 4,70 1,56 4,85 1,04 9,25 1,37 8,60 2,14 4,80 1,24 5,30 1,22 6,20 1,20 8,40 1,35 8,95 1,57 7,95 1,36 10,00 3,15 6,10 1,55 9,75 1,86 6,75 2,34

59

Continuao da Tabela 3.
Acessos
62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 101 102 103 104 105 106 107 108 110 111 112

Caracteres morfolgicos mdia e desvio padro CFr (mm)

9,35 0,95 9,78 0,85 11,66 0,63 9,15 0,80 8,96 0,79 9,52 0,74 9,43 0,93 9,31 0,72 9,03 1,10 9,02 0,61 8,66 0,72 9,14 0,74 9,27 0,82 8,33 0,77 9,69 0,76 9,94 0,79 9,57 0,72 9,73 0,81 8,35 0,50 8,80 0,49 8,13 0,64 10,09 0,69 10,25 0,63 9,45 0,95 7,76 0,56 8,45 0,63 10,67 0,73 11,17 1,10 13,42 1,08 12,32 0,68 8,67 0,77 10,49 0,75 9,25 0,49 11,60 1,61 9,17 0,69 8,43 0,43 8,15 0,74 9,57 1,08 8,67 0,57 8,87 0,99 8,72 0,80 8,44 0,82 9,03 0,82 10,05 1,11 9,29 0,95

LFr (mm)
7,47 0,87 8,79 0,87 8,99 0,66 6,75 0,62 6,96 0,68 8,45 0,90 7,52 1,01 6,73 0,68 7,00 0,92 7,33 0,69 7,16 0,81 7,03 0,79 6,39 0,68 7,26 0,99 8,04 0,80 8,04 0,86 7,61 1,05 7,85 0,82 7,08 0,72 8,67 0,60 7,48 0,75 7,73 0,73 6,75 0,75 6,35 0,88 6,30 0,68 7,27 0,71 7,72 1,10 8,58 1,27 8,34 1,20 10,24 0,80 7,67 0,72 7,39 1,04 7,21 0,63 8,90 1,12 6,67 0,81 7,02 0,68 7,88 0,75 7,56 0,96 7,52 0,57 6,90 0,82 6,85 0,70 7,20 0,83 9,03 1,27 7,40 1,08 6,71 0,56

NSem/fruto
1,55 0,76 2,80 0,83 2,20 0,77 2,40 0,68 1,20 0,41 1,75 0,79 1,55 0,69 1,60 0,68 1,55 0,69 1,75 0,85 1,60 0,68 1,55 0,69 1,45 0,60 2,40 0,82 2,90 0,72 2,35 0,67 2,45 0,83 2,50 0,69 3,05 0,83 3,05 0,89 2,35 0,74 1,70 0,47 2,45 0,69 2,25 0,79 2,80 0,70 2,85 0,74 2,25 1,02 1,90 0,91 1,50 0,69 2,00 0,72 2,50 0,76 2,20 0,70 3,00 0,72 2,50 0,89 3,20 0,77 1,35 0,49 1,70 0,57 2,10 0,79 2,25 0,91 1,50 0,69 1,35 0,59 2,60 0,60 2,40 0,88 2,25 0,85 1,07 0,26

CFo (cm)
3,04 0,85 3,06 0,59 2,49 0,39 2,99 0,71 3,61 1,64 2,97 0,46 3,72 0,60 2,88 0,38 3,07 0,38 3,49 0,83 3,48 0,58 2,86 0,67 2,79 0,41 3,42 0,41 3,38 0,50 3,48 0,39 4,43 0,80 4,13 0,54 4,65 0,76 4,43 0,41 2,68 0,40 4,62 0,65 4,39 0,74 5,26 1,22 4,52 0,62 2,65 0,91 4,15 0,88 3,93 0,41 9,58 0,82 9,72 1,04 3,67 0,72 3,47 0,63 3,96 0,46 9,61 1,00 5,70 0,74 4,79 0,53 4,78 1,12 4,95 0,42 4,12 0,58 3,61 0,46 4,15 0,75 2,76 0,40 7,87 1,23 6,34 0,78 7,45 1,06

LFo (cm)
1,50 0,49 1,60 0,24 1,35 0,32 1,44 0,24 1,80 0,55 1,28 0,21 1,47 0,32 1,52 0,18 1,32 0,20 1,68 0,44 1,83 0,33 1,46 0,34 1,27 0,19 1,30 0,20 1,52 0,24 1,52 0,20 1,55 0,20 1,65 0,23 1,83 0,38 1,73 0,30 1,44 0,23 2,20 0,51 1,80 0,43 2,21 0,60 2,25 0,42 1,83 0,62 1,92 0,32 1,94 0,34 2,80 0,37 2,80 0,37 1,76 0,43 1,61 0,36 1,81 0,30 2,40 0,34 2,49 0,35 1,73 0,21 1,91 0,56 1,76 0,29 1,52 0,22 1,35 0,23 1,46 0,14 1,45 0,26 2,98 0,47 2,10 0,35 2,79 0,37

C/LFo
2,08 0,39 1,93 0,35 1,93 0,44 2,07 0,34 1,95 0,40 2,37 0,43 2,58 0,37 1,91 0,18 2,35 0,25 2,11 0,34 1,94 0,36 1,97 0,27 2,24 0,43 2,68 0,54 2,28 0,46 2,32 0,35 2,88 0,53 2,52 0,33 2,58 0,33 2,62 0,41 1,88 0,20 2,17 0,41 2,49 0,39 2,40 0,23 2,04 0,28 1,63 0,99 2,15 0,39 2,09 0,44 3,48 0,54 3,50 0,36 2,15 0,49 2,20 0,31 2,21 0,23 4,06 0,52 2,32 0,35 2,78 0,25 2,55 0,34 2,87 0,41 2,74 0,35 2,71 0,35 2,85 0,42 1,93 0,29 2,66 0,28 3,09 0,55 2,68 0,25

NEsp/folha
7,40 2,01 7,40 1,98 5,25 0,62 3,35 1,42 3,20 1,58 6,60 1,27 6,40 1,67 8,00 1,12 5,70 1,30 4,85 0,99 6,70 1,34 2,60 1,70 8,70 1,75 6,50 1,28 3,35 1,42 7,60 1,23 5,05 1,28 7,00 1,12 8,60 1,53 8,00 1,12 6,90 0,91 9,05 1,32 9,60 1,93 9,45 2,60 9,75 0,72 7,80 0,94 6,43 1,91 6,85 2,08 17,95 2,78 16,10 2,79 8,90 1,25 5,45 1,10 9,40 1,82 17,55 2,82 8,95 1,90 9,80 1,70 6,45 3,27 7,65 1,69 10,05 2,42 2,75 1,21 3,10 2,10 4,60 0,99 14,90 2,17 8,65 2,08 18,60 2,64

CFr comprimento de fruto; LFr largura de fruto; Nsem/fruto nmero de sementes por fruto; CFo comprimento de folha; LFo largura de folha; C/LFo relao entre comprimento e largura de folha; Nesp/folha nmero de espinhos por folha.

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Atravs da distncia euclidiana, estimada com base nos sete caracteres morfolgicos avaliados, foi evidenciado que os acessos que apresentaram a maior dissimilaridade foram o 57 (M. ilicifolia), oriundo de Arroio Grande, e o 91 (M. aquifolium), de Farroupilha e os mais similares foram o 106 e o 107, ambos de Esmeralda, pertencentes espcie M. ilicifolia. Em anlise molecular, atravs de marcadores do tipo RAPD, Mossi (2003) tambm identificou, como era esperado, uma menor similaridade entre M. ilicifolia e M. aquifolium do que dentro das espcies. Dentro da espcie M. ilicifolia, o autor obteve um alto ndice mdio de similaridade (0,92). O carter que mais contribuiu para a divergncia entre os acessos foi o nmero de espinhos por folha, seguido de comprimento de folha e comprimento de fruto (Tabela 4). Estes caracteres permitiram separar os acessos em sete grupos distintos (Tabela 5). A taxa de erro aparente, de acordo com a anlise discriminante de Anderson, foi de 10,48%, existindo, portanto, consistncia entre a matriz de dissimilaridade e o agrupamento dos acessos pelo mtodo de Tocher. De modo geral, no ocorreu a formao de grupos especficos que reunissem acessos de uma mesma populao. A grande variabilidade existente dentro das populaes, principalmente para aqueles caracteres que mais contriburam para a divergncia entre os acessos, pode explicar este resultado. Uma alta variabilidade intrapopulacional tambm foi observada em espinheirasanta por Bittencourt (2000) e Mossi (2003), atravs de marcadores do tipo RAPD, e por Perecin e Kageyama (2002) e Steenbock (2003), atravs de anlise de isoenzimas. O maior grupo (1) reuniu a maioria dos acessos, totalizando 91 indivduos, todos pertencentes espcie M. ilicifolia. Os acessos 6 e 110, pertencentes, respectivamente s espcies M. ilicifolia e M. aquifolium, foram os nicos que ficaram em grupos isolados. Os acessos 90 e 91, ambos de Farroupilha e pertencentes espcie M. aquifolium, foram agrupados junto com o acesso 95 (M. ilicifolia), de Cachoeirinha. Este acesso apresentou valores semelhantes aos dos acessos de M. aquifolium, para os caracteres que mais contriburam para a divergncia entre os acessos (Tabela 3), o que justifica este agrupamento.

61

A distncia intra-grupo variou de 2,35 (grupo 3) a 3,74 (grupo 5). A presena no grupo 5 de dois acessos pertencentes a espcies diferentes 12 (M. ilicifolia) e 112 (M. aquifolium), explicam esta maior distncia. A distncia inter-grupos variou de 3,84 (grupos 3 e 6) a 7,98 (grupos 1 e 4). A maior distncia observada entre os grupos 1 e 4 justificada pela presena no grupo 4 de dois acessos de M. aquifolium (90 e 91), enquanto o grupo 1 constitudo somente por acessos de M. ilicifolia. O grupo 4 apresentou as maiores mdias para as variveis largura de fruto, comprimento e largura de folha, relao comprimento/largura de folha e nmero de espinhos por folha, o que refora a importncia da utilizao da morfologia foliar como parmetro para diferenciar as duas espcies de espinheira-santa. Caracteres morfolgicos de fruto e folha tambm foram utilizados para diferenciar espcies de pereira (Pyrus spp.) da sia (Kim, 2004). O autor, utilizando anlise multivariada, identificou a formao de seis grupos e, pelo tamanho do fruto, separou os acessos em dois grandes grupos. Apesar das diferenas morfolgicas apresentadas pelas duas espcies de espinheira-santa no que se refere morfologia foliar, importante que se considere que dois grupos, 4 e 5, apresentaram acessos tanto de M. ilicifolia quanto de M. aquifolium. Este fato indica uma proximidade gentica entre estas duas espcies, como tambm observada por Perecin e Kageyama (2002), atravs de anlise de isoenzimas, e Mossi (2003), atravs de marcadores RAPD. Tabela 4 Contribuio relativa dos caracteres morfolgicos para divergncia em matrizes de acessos de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Carter Comprimento de fruto Largura de fruto N de sementes/fruto Comprimento de folha Largura de folha Relao comprimento/largura de folha N de espinhos/folha S.j 15013,45 6566,28 2712,66 20819,61 2069,31 2183, 94 93472,60 Contribuio Relativa (%) 10,51 4,60 1,90 14,58 1,45 1,53 65,43

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Tabela 5 Agrupamento dos acessos de matrizes de espinheira-santa pelo mtodo de Tocher, com base em caracteres morfolgicos. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Grupo 1 2 3 4 5 6 7 Acessos 2-5, 7, 8, 10, 11, 13-16, 19-21, 23-35, 37-63, 65-89, 92-94, 102-108 e 111 1, 9, 36 e 101 17, 18 e 64 90, 91 e 95 12 e 112 6 110

Taxa de erro aparente, de acordo com anlise discriminante de Anderson (1958) 10,48%

Na anlise realizada com as mdias das populaes, foi observado que a maior dissimilaridade foi entre as populaes 8, de Arroio Grande, e a 19 de Farroupilha (Tabela 6). A espcie que ocorre na populao 8 M. ilicifolia, enquanto que na populao 19 M. aquifolium, o que explica esta grande divergncia, principalmente pelas diferenas na morfologia foliar. As populaes mais similares foram a 14, de Candiota, e a 20, de Arroio Grande, ambas localizadas na Regio Sul do Rio Grande do Sul e compostas somente por acessos de M. ilicifolia. Mossi (2003), utilizando marcadores do tipo RAPD, obteve uma similaridade mdia alta (0,83) entre populaes naturais de M. ilicifolia. A anlise de agrupamento pelo mtodo UPGMA permitiu a formao de um dendrograma em que as populaes foram reunidas em seis grupos distintos (Figura 1). A correlao cofentica (r) foi de 0,94, considerada alta, o que mostra a consistncia entre a matriz de dissimilaridade e o agrupamento das populaes representado pelo dendrograma. A populao 27 foi a mais distante, ficando em um grupo separado grupo 6. Esta populao representada pelo acesso 112, de Caxias do Sul, pertencente espcie M. aquifolium e que apresentou a maior quantidade de espinhos por folha carter que mais contribuiu para a divergncia. As populaes 18 e 19, ambas de Farroupilha, representadas respectivamente pelos acessos 90 e 91, foram

63

inseridas no mesmo grupo (5). As duas populaes so constitudas de acessos de M. aquifolium, foram coletadas no mesmo municpio e apresentam caractersticas semelhantes para aqueles caracteres que mais contriburam para divergncia, o que explica este agrupamento. O grupo 4 composto somente pela populao 21, de Cachoeirinha, a qual representada pelo acesso 95 (M. ilicifolia). Os acessos 90, 91 e 95 foram inseridos no mesmo grupo na anlise por acesso pelo mtodo de Tocher, e ficaram, entretanto, separados na anlise por populao, atravs do mtodo hierrquico de agrupamento. A populao 3, representada pelos acessos 17 e 18, de Piratini, ficou em um grupo parte grupo 3. Esta populao foi a que apresentou maior mdia para tamanho de fruto dentro da espcie M. ilicifolia (Tabela 7), o que pode explicar esta separao, considerando que o comprimento de fruto est entre os trs caracteres que mais contriburam para a divergncia (Tabela 4). A populao 23, representada pelo acesso 101 que apresentou a maior mdia para nmero de sementes por fruto , de Caxias do Sul, foi a nica no grupo 2. O grupo 1 abrangeu 20 populaes, sendo trs da Regio Nordeste do Rio Grande do Sul e 17 da Regio Sul do Estado. importante destacar que o nmero diferente de acessos por populao influenciou a anlise, principalmente devido alta variabilidade dentro de populaes. A localizao geogrfica no foi determinante para o agrupamento e separao das populaes com base em caracteres morfolgicos, uma vez que no grupo 1 foram agrupadas populaes tanto da Regio Sul quanto da Regio Nordeste do Estado. Somente o municpio de Farroupilha apresentou suas populaes em um mesmo grupo, ambas com acessos de M. aquifolium. Em anlise multivariada para diferenciar populaes de M. ilicifolia com base na composio qumica, Mossi (2003) observou que no houve relao entre o agrupamento com base nestas caractersticas com o agrupamento formado com base nas caractersticas dos ambientes em que estas populaes foram coletadas. Entretanto, o autor identificou que o agrupamento com base em marcadores do tipo RAPD estava relacionado com as caractersticas de ambientes de ocorrncia de M. ilicifolia, que em seu trabalho correspondeu aos campos do Sul do Brasil, Mata Atlntica e s Serras do Mato Grosso do Sul. O agrupamento com base em caracteres fenotpicos no permite, portanto, um agrupamento de acordo com a localizao geogrfica em populaes de 64

espinheira-santa. A grande variabilidade dentro das populaes e a influncia do ambiente nos caracteres morfolgicos e na constituio qumica nestas espcies, no permite uma adequada separao dos acessos ou das populaes de acordo com a sua localizao geogrfica. O fator ambiente foi importante nas avaliaes das matrizes neste trabalho, pois envolveram populaes em diferentes locais. As matrizes apresentam idades diferenciadas entre si, o que tambm contribui para este resultado. Alm disso, a anlise de dissimilaridade foi realizada com base na distncia euclidiana devido a ausncia de delineamento experimental , que menos informativa que a distncia de Mahalanobis, pois no leva em considerao as varincias e covarincias residuais que existem entre as caractersticas avaliadas (Cruz e Carneiro, 2003). Entre as populaes que apresentaram acessos de M. aquifolium, somente a 25 no foi separada no dendrograma. O fato de esta populao apresentar um acesso de M. aquifolium e seis de M. ilicifolia justifica a sua incluso no grupo 1, com outras populaes com somente acessos de M. ilicifolia. As demais populaes de M. aquifolium (18, 19 e 27) ficaram bem separadas no dendrograma, o que mostra a eficincia dos caracteres morfolgicos para anlise da diversidade em espinheira-santa. Utilizando marcadores do tipo RAPD, Mossi (2003) observou uma separao clara das espcies M. ilicifolia, M. aquifolium e M. evonymoidis atravs de anlise de agrupamento pelo mtodo UPGMA. O autor, ao identificar uma alta presena de fragmentos compartilhados entre M. ilicifolia e M. aquifolium, sugere uma proximidade filogentica entre estas espcies. Da mesma forma, Perecin e Kageyama (2002), em estudos com isoenzimas, identificaram a presena de alelos comuns entre estas duas espcies. Os autores sugerem a possibilidade de que M. ilicifolia e M. aquifolium no estejam completamente isoladas reprodutivamente.

65

Tabela 6 Dissimilaridade entre populaes de espinheira-santa do Rio Grande do Sul, obtida a partir da distncia euclidiana, baseada nos caracteres morfolgicos comprimento e largura de fruto, nmero de sementes por fruto, comprimento e largura de folha, relao comprimento/largura de folha e nmero de espinhos por folha. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Pop. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27 1 0 1,21 3,74 1,24 2,34 2,67 1,58 2,76 2,06 2,13 1,43 1,93 2,33 1,91 1,44 0,91 2,32 6,30 6,68 1,63 3,81 2,30 2,65 1,89 2,12 4,66 0 3,49 1,49 2,76 2,66 2,62 2,70 2,14 2,42 1,79 2,02 2,41 2,69 2,06 1,26 2,45 5,74 6,41 2,52 3,95 3,27 1,99 1,99 2,53 3,81 0 3,48 3,58 2,99 4,62 5,06 3,28 4,04 3,10 2,90 3,27 3,35 3,27 3,90 1,87 5,08 5,37 3,31 4,33 5,00 3,99 3,28 3,73 5,63 0 1,75 1,76 1,79 2,08 1,17 1,08 1,26 1,20 1,22 1,70 1,60 1,77 2,09 6,65 7,03 1,56 4,05 3,39 1,99 1,45 1,58 4,96 0 1,30 2,65 3,48 1,40 2,04 2,56 1,92 2,01 1,66 1,49 2,45 2,68 6,64 6,95 1,70 3,15 3,63 2,52 1,63 1,17 5,68 0 3,23 3,32 1,55 1,85 2,55 1,61 1,35 2,02 2,21 2,89 2,25 6,58 6,90 2,20 3,64 4,41 2,16 1,37 1,79 5,68 0 2,60 2,46 2,03 1,79 2,47 2,56 1,96 2,12 2,25 2,98 7,59 7,72 1,62 4,73 2,59 3,54 2,72 2,35 5,83 0 2,59 1,78 2,60 2,54 2,32 3,52 3,42 3,19 3,73 8,18 8,75 3,29 5,98 4,77 2,90 3,26 3,31 5,61 0 1,70 1,86 1,25 1,58 2,14 1,51 2,22 2,43 6,47 7,07 1,87 4,00 3,92 2,09 2,00 1,58 5,03 0 1,93 1,56 0,89 1,98 2,42 2,71 2,57 7,61 7,87 1,98 4,74 4,07 2,43 1,86 2,02 5,87 0 1,66 1,81 1,79 1,91 2,15 1,57 6,43 6,63 1,56 4,45 3,27 2,85 2,17 2,18 5,01 0 1,22 2,07 1,70 2,23 1,85 6,72 7,27 1,64 4,39 3,82 2,63 1,98 2,31 5,48 0 1,91 2,41 2,87 1,96 7,17 7,40 1,96 4,58 4,33 2,37 1,67 2,07 5,80 0 1,75 2,51 1,82 6,76 6,59 0,89 3,52 2,99 3,14 1,55 1,48 5,94 0 1,40 2,31 6,05 6,55 1,24 3,26 2,58 2,87 2,04 1,77 5,04 0 2,85 5,92 6,60 2,16 3,51 2,28 2,67 2,24 2,43 4,26 0 6,01 6,00 1,85 4,12 3,79 3,27 2,07 2,61 5,56 0 2,76 6,81 4,85 6,70 6,03 6,23 6,39 4,18 0 6,91 4,87 6,81 6,67 6,34 6,48 5,69 0 3,85 2,71 3,31 1,97 1,83 5,89 0 3,91 3,84 3,11 3,13 5,22 0 4,66 3,56 3,52 5,72 0 1,93 2,20 4,01 0 1,49 5,14 0 5,18 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27

66

Pop 1 Pop 16 Pop 2 Pop 7 Pop 4 Pop 10 Pop 13 Pop 9 Pop 12 Pop 5 Pop 26 Pop 6 Pop 25 Pop 1 Pop 14 Pop 20 Pop 15 Pop 11 Pop 17 Pop 24 Pop 8 Pop 23 Pop 3 Pop 21 Pop 18 Pop 19 Pop 27

0.75

2.10

3.46

4.81

6.17

Figura 1 Dendrograma resultante da anlise de agrupamento de 26 populaes de espinheira-santa pelo mtodo UPGMA, obtido a partir da distncia euclidiana baseada em caracteres morfolgicos. Pelotas/RS, UFPel 2005.

67

Tabela 7 Mdia dos caracteres morfolgicos em populaes de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Caracteres CFr LFr NSem CFo LFo C/LFo NEsp (mm) (mm) (cm) (cm) 1 9,06 6,83 2,28 4,60 2,16 2,18 8,58 2 9,34 6,79 1,77 4,98 2,25 2,25 9,08 3 13,08 8,36 1,78 4,34 1,88 2,43 8,00 4 9,00 7,00 1,99 3,76 1,76 2,21 8,16 5 9,56 7,00 2,30 3,92 1,38 2,87 8,10 6 9,94 7,35 1,84 3,74 1,39 2,79 6,20 7 8,16 6,88 2,65 3,33 1,86 1,83 8,79 8 7,68 6,31 1,60 2,57 1,67 1,57 7,95 9 9,84 6,83 1,95 3,35 1,48 2,40 10,00 10 8,40 7,04 1,95 2,99 1,51 2,10 6,10 11 9,60 7,54 2,13 3,50 1,97 1,84 9,33 12 10,43 6,83 1,95 3,50 1,64 2,12 6,75 13 9,33 7,42 1,81 3,13 1,49 2,15 5,90 14 9,29 7,81 2,54 3,97 1,68 2,41 6,94 15 10,25 6,75 2,45 4,39 1,80 2,49 9,60 16 9,45 6,35 2,25 5,26 2,21 2,40 9,45 17 10,92 8,15 2,08 4,02 1,93 2,11 6,68 18 13,42 8,34 1,50 9,58 2,80 3,48 17,95 19 12,32 10,24 2,00 9,72 2,80 3,50 16,10 20 9,87 7,30 2,60 3,72 1,71 2,21 7,43 21 9,98 7,64 2,50 7,42 1,93 3,85 10,03 23 9,17 6,67 3,20 5,70 2,49 2,32 8,95 24 8,43 7,02 1,35 4,79 1,73 2,78 9,80 25 8,97 7,55 1,99 4,82 1,79 2,73 6,26 26 8,67 7,52 2,25 4,12 1,52 2,74 10,05 27 9,29 6,71 1,07 7,45 2,79 2,68 18,60 CFr comprimento de fruto; LFr largura de fruto; Nsem nmero de sementes por fruto; CFo comprimento de folha; LFo largura de folha; C/LFo relao entre comprimento e largura de folha; NEsp nmero de espinhos por folha. Pop.

68

4.4 CONCLUSES

Existe variabilidade para caracteres morfolgicos em matrizes de M. ilicifolia e M. aquifolium, principalmente para morfologia foliar. Os caracteres utilizados na anlise multivariada foram eficientes para separar os acessos e as populaes de espinheira-santa.

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4.5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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72

5. CAPTULO IV

VARIABILIDADE GENTICA PARA CARACTERES MORFOLGICOS E FISIOLGICOS EM PROGNIES DE ESPINHEIRA-SANTA (Maytenus ilicifolia E M. aquifolium)

5.1 INTRODUO

Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. e M. aquifolium Mart. so espcies autctones (nativas) e apresentam alto valor medicinal contra gastrite e lcera gstrica, com ao comprovada por Carlini (1988). M. ilicifolia apresenta ramos jovens tetra ou multicarenados, angulosos, enquanto M. aquifolium apresenta os ramos arredondados e achatados, lisos. Alm disso, M. ilicifolia apresenta a disposio das folhas nos ramos de forma helicoidal, enquanto que em M. aquifolium esta disposio paralela (Carvalho-Okano, 1992). Ambas espcies so algamas e compartilham alelos (Perecin e Kageyama, 2002). Pelo seu alto valor medicinal, tem sido amplamente utilizada pela medicina popular e a crescente demanda tem levado a um extrativismo predatrio, resultando em eroso gentica. Neste sentido, para preservar a variabilidade gentica, atravs da conservao ex situ, a Embrapa Clima Temperado implantou um banco ativo de germoplasma (BAG) de espinheira-santa. Os acessos foram caracterizados morfologicamente nas populaes naturais, atravs das matrizes (Mariot et al., 2003) e morfologicamente e fisiologicamente no banco de germoplasma, atravs das prognies (Mariot et al., 2004). 73

Existem poucos estudos com relao variabilidade gentica e estimativa de parmetros genticos para caracteres morfolgicos e fisiolgicos agronomicamente importantes em espinheira-santa. Estes estudos, possibilitados atravs de teste de prognies, servem de suporte para trabalhos de melhoramento e conservao de recursos genticos. A importncia de variveis quantitativas, como a produo de biomassa, para a seleo de materiais genticos superiores em M. ilicifolia foi destacada por Radomski e Scheffer (2004). Em teste de prognie, as autoras identificaram uma ampla variao para o crescimento em estatura em 44 prognies oriundas de diferentes populaes. Em trabalho desenvolvido com M. ilicifolia, Scheffer (2001) observou uma grande variabilidade para o tempo de emergncia das plntulas, o que pode indicar a existncia de um maior ou menor grau de dormncia nas sementes. A autora avaliou o crescimento entre prognies de espinheira-santa e observou uma grande variao dos 23 aos 38 meses perodos em que foram realizadas as avaliaes , tendo detectado ainda, uma alta herdabilidade para o carter estatura de planta. A taxa de crescimento de M. ilicifolia bastante lenta (Magalhes, 1992; Rachwal et al., 1997; Nicoloso et al., 2000). Este fator, aliado baixa viabilidade das sementes, frustrou as primeiras tentativas de cultivo de espinheira-santa (Magalhes, 2002). Neste sentido, estudos bsicos para produo de mudas so importantes para o desenvolvimento da atividade florestal e de programas de conservao (Monteiro e Ramos, 1997). A seleo de plantas com maiores taxas de crescimento e que possuam uma maior produo de biomassa pode, portanto, ser uma estratgia adequada em programas de melhoramento de espinheirasanta. Os caracteres de morfologia foliar tambm so importantes para a identificao de acessos de espinheira-santa, assim como para observao de aspectos relacionados produo de biomassa. Atravs de caracteres qualitativos de morfologia foliar, Radomski e Scheffer (2004) identificaram nove morfotipos foliares, sendo que no Rio Grande do Sul predominava o tipo oito folhas largas e curtas, coriceas, com espinhos longos distribudos ao longo de todo o limbo e nervuras muito pronunciadas na face abaxial. De acordo com Bernardi e Wasicki, 1959 apud Steenbock et al., 2003, folhas de M. ilicifolia 74

desenvolvidas a pleno sol eram menores, com espinhos nas margens em nmero reduzido, e apresentavam maior concentrao de taninos. Em plantas de espinheira-santa desenvolvidas em ambiente com alta luminosidade, Radomski et al. (2004) observaram que as folhas das plantas eram menores, com peso especfico maior, mais amareladas, mais espessas e com espinhos mais pronunciados, o que caracteriza formas tpicas de adaptao de plantas de sombra luz solar total. Ao estudar a variabilidade em M. ilicifolia em duas populaes de Santa Catarina, visando principalmente os aspectos voltados produo, Steenbock et al. (2003) observaram que apesar da biomassa foliar (nmero de folhas e rendimento) dos indivduos ter sido semelhante nas duas populaes, a disposio desta biomassa foi diferente. As plantas cuja populao se desenvolvia a pleno sol apresentaram rea foliar e peso de folhas menores do que as da outra populao, que era parcialmente sombreada. Ao avaliarem a morfologia foliar em matrizes de espinheira-santa coletadas em vrios locais no Rio Grande do Sul para comporem o BAG da Embrapa Clima Temperado, Mariot et al. (2003) observaram uma alta variabilidade para o comprimento e largura de folha e nmero de espinhos por folha. Alta variabilidade para caracteres de morfologia foliar tambm foi observada por Mariot et al. (2004) ao avaliarem as prognies de 68 acessos de espinheira-santa do BAG da Embrapa Clima Temperado. O objetivo deste trabalho foi identificar a variabilidade gentica e estimar parmetros genticos para caracteres morfolgicos e fisiolgicos em prognies de espinheira-santa, bem como a correlao entre estes caracteres.

75

5.2 MATERIAL E MTODOS

Foram avaliadas as prognies de 93 acessos de espinheira-santa oriundos de populaes do Rio Grande do Sul do banco ativo de germoplasma da Embrapa Clima Temperado. Por se tratarem de espcies algamas, as prognies so de irmos maternos. A relao dos acessos e os locais de origem encontram-se na Tabela 1. Sementes coletadas entre os meses de outubro de 2002 e janeiro de 2003 foram semeadas em fevereiro de 2003 em sacos de polietileno preto, com dimenses de 10 x 17 cm, em telado na Embrapa Clima Temperado. O substrato utilizado foi areia, esterco bovino curtido e terra, na proporo de 1:1:1. Foi colocado sombrite 50% o qual permaneceu entre fevereiro e abril de 2003 para permitir um melhor desenvolvimento das mudas na fase inicial. Em abril de 2003 as mudas foram transferidas para casa-de-vegetao para permitir o melhor desenvolvimento das plantas no inverno. Durante o perodo em que as plantas permaneceram na casa-de-vegetao, foi aplicada uma soluo nutritiva composta por KH2PO4 e uria, na dosagem de 10ml/planta. As aplicaes foram feitas semanalmente, durante seis semanas, a partir de setembro de 2003. Em novembro de 2003, as plantas foram transplantadas para canteiros em rea de telado, uma vez que o recipiente em que se encontravam estava pequeno e dificultava o desenvolvimento do sistema radicular. Foram utilizados canteiros de alvenaria, com dimenses de 7,67 x 0,85m. A adubao constou de esterco bovino (50kg/canteiro), adubo NPK 10-20-10 (0,0625kg/canteiro) e nitroclcio (0,272kg/canteiro). O clculo de adubao foi baseado em anlise de solo e recomendao para a cultura da erva-mate que uma espcie nativa que consta no manual de recomendaes de adubao e calagem para os estados 76

do Rio Grande do Sul e Santa Catarina (Sociedade Brasileira de Cincia do Solo, 1997) , uma vez que no existe recomendao para a espinheira-santa. Os caracteres morfolgicos e fisiolgicos avaliados nas prognies foram: 1 Dias da semeadura emergncia (DSE); 2 Estatura de planta (Estat): avaliado em cm, aos 360 dias aps a semeadura; 3 Dimetro base do caule (DBC): avaliado em mm, com auxlio de um paqumetro digital, aos 360 dias aps a semeadura; 4 Nmero de folhas/planta (NF): avaliado aos 180 dias aps a semeadura; 5 Taxa de crescimento em estatura (CreEST): avaliado em cm/dia, a partir da diferena entre a estatura aos 360 dias e a estatura aos 90 dias, dividido por 270 dias (Est360 Est90/270); 6 Taxa de crescimento em dimetro base do caule (CreDBC): avaliado em mm/dia, a partir da diferena entre o dimetro aos 360 dias e o dimetro aos 90 dias, dividido por 270 dias (DBC360 DBC90/270); 7 Comprimento de folha (CFo): avaliado em cm; 8 Largura de folha (LFo): avaliado em cm; 9 Nmero de espinhos/folha (NEsp). As duas primeiras avaliaes referentes a estatura de planta, dimetro base do caule e nmero de folhas por planta, foram realizadas quando as plantas estavam em saquinhos de polietileno e as duas ltimas avaliaes para estatura de planta e dimetro base do caule, quando as plantas encontravam-se nos canteiros. Os dados referentes aos caracteres de morfologia foliar foram baseados na mdia de trs folhas, retiradas da parte inferior, mediana e superior de cada planta. Para maior homogeneidade das varincias e para atender a pressuposio de normalidade na anlise, os dados das variveis estatura de planta, dimetro da base do caule e crescimento em estatura foram transformados para raiz quadrada e dias da semeadura emergncia, para o logaritmo de base 10 dos dados originais (log10). O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com quatro repeties e cinco plantas por parcela. Os dados foram submetidos anlise 77

de varincia, atravs do programa estatstico SAS, verso 8.2 (SAS Institute, 2000) e comparao entre mdias atravs do teste de Scott e Knott (Scott e Knott, 1974), com auxlio do programa GENES (Cruz, 2001). Os componentes da varincia, bem como os parmetros genticos, foram estimados conforme descrito por Vencovsky e Barriga (1992), baseado em mdia de parcelas, sendo que o modelo matemtico, em que o valor Yij, referente observao da i-sima famlia, do j-simo bloco, dado por: Yij = + Gi + Bj + ij, em que: : mdia geral; Gi: efeito da i-sima famlia; Bj: efeito do j-simo bloco; ij: efeito aleatrio ambiental existente entre parcelas; Para este trabalho, os acessos do banco ativo de germoplasma de espinheira-santa foram considerados como pertencentes a uma metapopulao, em que interessava saber o efeito de cada acesso, representado por uma famlia de irmos maternos. Os acessos foram, portanto, considerados como fixos e as estimativas dos componentes da varincia foram calculadas atravs das seguintes frmulas:
2 QMG QME ; 2 = QMG ; em que: P 2 E = QME ; G = r r

2 2 E corresponde varincia de ambiente; G corresponde varincia 2 gentica; P corresponde varincia fenotpica; QME corresponde ao
quadrado mdio do erro; QMG corresponde ao quadrado mdio de gentipos e r corresponde ao nmero de repeties. A partir destes dados foram estimados os parmetros genticos
2 herdabilidade com base na mdia de parcelas ( h ) que referente a

herdabilidade ampla , coeficiente de variao gentico (CVG) e relao entre

CVG e CVE (coeficiente de variao do erro experimental) ( b ), atravs das

seguintes frmulas:
2 100. G QMG QME CVG ; em que representa a h = ; CVG = ; b= QMG CVE
2

mdia geral do carter. Foram estimadas ainda as correlaes fenotpicas entre os caracteres por meio do coeficiente de Pearson (r), tendo a significncia sido testada pela

78

estatstica t, conforme descrito por Carvalho et al. (2004). Esta anlise foi realizada com auxlio do programa GENES (Cruz, 2001).

79

Tabela 1 Origem dos acessos de espinheira-santa (M. ilicifolia e M. aquifolium). Pelotas/RS, UFPel 2005.
Populao 1 2 3 4 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 24 25 26 28 Total geral Acesso 1-7 8-16 18 19-20, 24-26, 28, 30-39, 41 44-54 55,56; 86,87 57 59 60 e 92 61 62-64, 66-69, 71-75 76-83 84 85 88-89 90* 91* 93-94 95 101 102 103,104; 106, 107, 110*,111 105 113* Total 7 9 1 17 11 4 1 1 2 1 12 8 1 1 2 1 1 2 1 1 1 6 1 1 93 Municpio Encruzilhada do Sul Encruzilhada do Sul Piratini Piratini Piratini Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Candiota Candiota Hulha Negra Pelotas Arroio Grande Farroupilha Farroupilha Arroio Grande Cachoeirinha Caxias do Sul Vacaria Esmeralda Vacaria So Marcos

* Acessos pertencentes espcie M. aquifolium

80

5.3 RESULTADOS E DISCUSSO

Os dados permitiram identificar a existncia de variabilidade gentica para todos os caracteres avaliados em prognies dos acessos de espinheirasanta, o que pode ser observado pela alta significncia mostrada atravs do teste F na anlise de varincia e pela comparao entre as mdias dos acessos (Tabelas 2 e 3). Os coeficientes de variao foram baixos para a maioria dos caracteres, sendo considerados mdios para nmero de folhas por planta e crescimento em dimetro base do caule, o que mostra a boa preciso do experimento. O carter dias da semeadura emergncia (DSE) apresentou um intervalo de variao de 23,14 a 66,53 dias, tendo os acessos sido divididos em seis grupos diferentes (Tabela 3). Os 18 acessos que apresentaram emergncia mais rpida so todos pertencentes espcie M. ilicifolia e oriundos de populaes localizadas em municpios da Metade Sul do Rio Grande do Sul (sete de Piratini, dez de Encruzilhada do Sul e um de Hulha Negra). Entre os seis acessos, tambm pertencentes espcie M. ilicifolia, que apresentaram maior nmero de dias para emergncia, trs eram da Metade Sul (dois de Piratini e um de Pelotas) e trs eram da Regio Nordeste do Estado (um de Vacaria e dois de Esmeralda). Uma grande variao no tempo de emergncia tambm foi identificada em prognies de M. ilicifolia por Scheffer (2001). A autora sugere que este fato pode estar associado existncia de um maior ou menor grau de dormncia nas sementes. Alm disso, as condies edafo-climticas em que as plantas matrizes se encontram tambm influenciam na qualidade fisiolgica da semente (Salisbury e Ross, 1992).

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Tabela 2 Resumo da anlise da varincia para nove caracteres morfofisiolgicos em espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
DSE (dias) QMG CV (%) GLResduo Mdia
1
1

Estat (cm)

DBC (mm)

NF

CreEST (cm/dia) 0,007** 8,88 251 0,82 x 10

-1

CreDBC (mm/dia) 5,1x10 ** 17,19 256 1,63 x 10

-2 -5

CFo (cm)

LFo (cm)

NEsp

0,034** 4,07 250 39,97

1,82** 7,81 249 25,06

O,202** 7,38 253 5,07

2

7,07** 11,93 252 7,67

4,40** 7,21 253 5,85

0,29** 7,30 251 2,46

4

29,59** 7,26 252 14,82

Dias da semeadura a emergncia; estatura de planta; dimetro base do caule; nmero de 5 6 folhas/planta; taxa de crescimento em estatura; taxa de crescimento em dimetro a base do 7 8 9 caule; comprimento de folha; largura de folha; nmero de espinhos/folha. ** Significativo a 1% de probabilidade de erro pelo teste F.

A estatura de planta variou de 10,45 a 51,63cm (Tabela 3) e os acessos foram divididos em cinco grupos diferentes. Os acessos que apresentaram uma maior magnitude para este carter so todos oriundos da Regio Nordeste do Estado, sendo quatro de Esmeralda, um de Caxias do Sul e um de Vacaria. Com exceo do acesso 110 que pertence espcie M. aquifolium, os demais so da espcie M. ilicifolia. Os acessos de menor estatura so oriundos de Piratini (dois), Pelotas (um) e Vacaria (um). Uma grande variao na estatura de planta tambm foi identificada por Scheffer (2001) em M. ilicifolia, com variao de 2,2 a 13,2cm aos 11 meses de idade, valores bem abaixo dos apresentados neste trabalho, em que as plantas foram avaliadas aos 360 dias. Esta diferena se deve ao fato do experimento da autora ter sido realizado em tubetes, com espao reduzido para o desenvolvimento do sistema radicular. No mesmo trabalho, em teste de prognie no campo em dois municpios do Paran, a autora identificou uma estatura mdia de 35,3cm aos 23 meses e 40,4cm aos 38 meses em Ponta Grossa; e 25,9cm aos 23 meses e 44,0cm aos 38 meses em So Jos dos Pinhais. Rachwal et al. (1997), em trabalho realizado com M. ilicifolia a campo, observaram uma variao na estatura de planta de 13 a 95 cm aos 25 meses de idade e de 18 a 136 cm aos 37 meses. J Magalhes et al. (1992), para esta mesma espcie, identificaram uma estatura mdia de 25 cm entre as melhores plantas, com um ano de idade, o que corresponde mdia

82

identificada neste trabalho em um perodo semelhante, considerando, entretanto, todos os acessos, sem seleo das melhores plantas. O carter dimetro base do caule variou de 2,43 a 8,06 mm e os acessos foram divididos em quatro grupos diferentes (Tabela 3). Com exceo do acesso 32, de Piratini, todos os que apresentaram os maiores dimetros so de Esmeralda, sendo que o acesso 110 pertence espcie M. aquifolium, enquanto os demais pertencem M. ilicifolia. Os acessos que apresentaram os menores valores para este carter so todos oriundos da Metade Sul do Estado, com exceo do acesso 102, de Vacaria. Uma grande variao para este carter tambm foi observada por Scheffer (2001), em plantas de M. ilicifolia cultivadas em tubetes aos 11 meses de idade, que foi de 0,6 a 2,6mm. Para esta mesma espcie, cultivada em sacos de polietileno, Nicoloso et al. (2000) identificaram um dimetro mdio de 0,75mm aos 135 dias aps a semeadura. A maior estatura e dimetro do caule observado nas prognies de acessos oriundos da Regio Nordeste do Estado correspondem ao que foi identificado nas plantas matrizes daquela Regio, que, diferentemente das outras regies em que foram feitas coletas, eram plantas de porte arbreo, com estatura e dimetro base do caule maiores. O nmero de folhas por planta variou de 3,66 a 12,01, tendo os acessos sido divididos em seis grupos (Tabela 3). O acesso 30, de Piratini, e os acessos 104 e 111, de Esmeralda, apresentaram os maiores valores para este carter, enquanto os acessos 51, de Piratini, 59, de Arroio Grande e 85, de Pelotas, mostraram menor quantidade de folhas por planta. Para esta mesma espcie, Magalhes et al. (1992) identificaram para mdia das melhores plantas, aos 6 meses, 9,5 folhas/planta, valor que foi superior ao encontrado neste trabalho, para o mesmo perodo (180 dias). Em estudo comparativo entre duas populaes naturais de M. ilicifolia, Steenbock et al. (2003) no observaram diferena no nmero de folhas por planta. Este carter pode ser importante para seleo de plantas com maior biomassa, o que desejvel no melhoramento de plantas medicinais.

83

Tabela 3 Variao e grupos de acessos formados a partir da comparao entre mdias em nove caracteres morfofisiolgicos em espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Grupo A* B C D A B C D E A B C D A B C D E F A B C D Carter/Variao DSE (dias) 61,94 66,53 40,40 52,25 32,80 39,30 23,14 30,80 Estat (cm) 40,45 51,63 29,35 37,35 20,30 28,43 15,45 20,18 10,45 14,61 DBC (mm) 6,86 8,06 5,01 6,57 3,85 4,89 2,43 3,72 NF
4 3 2 1

Acessos 20, 51, 85, 102, 106 e 107 19, 48, 45, 44, 13, 71, 53, 37, 62, 41, 78, 46, 103, 79, 105, 38, 63, 77, 73, 39, 91, 87, 35, 57, 61, 31, 55, 82, 72, 80, 111, 86, 113, 74, 75, 60 95, 104, 69, 101, 110, 81, 52, 49, 83, 64, 76, 94, 24, 36, 67, 68, 54, 56, 88, 92, 25, 89, 66, 93, 90, 7, 4, 1, 14, 3 10, 84, 16, 11, 33, 15, 5, 6, 12, 50, 18, 2, 34, 30, 9, 8, 28, 32 111, 101, 110, 104, 105, 107 90, 77, 95, 103, 69, 106, 76, 60, 67, 91, 81, 113, 10 64, 71, 88, 2, 75, 73, 93, 89, 79, 83, 8, 9, 3, 15, 55, 28, 84, 78, 11, 68, 50, 16, 24, 92, 49, 57, 62, 80, 32, 94, 61, 66, 4, 6, 56, 74, 14, 52, 63, 30, 12, 25, 87, 82, 36, 26, 37, 86, 31, 59, 46, 39, 38 34, 44, 72, 47, 45, 48, 54, 13, 7, 18, 33, 1, 53, 5, 41, 51, 35 85, 19, 20, 102 32, 110, 111, 104, 107 14, 15, 30, 50, 106, 64, 28, 13, 25, 95, 24, 103, 105, 101, 84, 67, 83, 16, 36, 12, 1, 89, 88, 49, 2, 113, 47, 10, 11, 86, 91, 69, 31, 87, 55, 66, 68, 72, 56, 46, 71, 45 61, 33, 92, 6, 93, 90, 38, 52, 63, 44, 73, 8, 37, 76, 48, 9, 60, 94, 78, 81, 3, 41, 4, 57, 77, 34, 19, 5, 39, 53, 62, 54, 75, 82, 51, 74, 35, 18 7, 80, 59, 20, 79, 85, 102 30, 111, 104 101, 110, 95, 20, 28, 18, 103 8, 11, 12, 68, 6, 89, 105, 2, 66, 9, 75, 88, 92, 90, 63, 107, 32, 16, 67, 106, 64, 37, 24, 25, 94, 19, 1, 76, 15, 56, 93, 10, 49 14, 31, 33, 34, 3, 38, 73, 77, 84, 7, 52, 69, 91, 41, 5, 36, 61, 72, 46, 4, 60, 54, 39, 74, 113, 57, 86, 26, 55, 13, 62, 35, 78, 81, 80 50, 87, 79, 83, 45, 44, 48, 82, 102, 71, 47, 53 85, 51, 59 111, 101, 110, 104, 105, 107 77, 103, 106, 69, 95, 60, 90, 76, 91, 67, 81, 10, 113, 71 64, 88, 79, 2, 75, 73, 93, 83, 3, 28, 55, 89, 84, 9, 15, 50, 8, 68, 24, 78, 57, 16, 62, 80, 32, 11, 59, 49, 4, 92, 94, 52, 56, 26, 61, 14, 66, 30, 74, 87, 63, 37, 12, 6, 25, 82, 36, 31, 86, 38, 39, 46 34, 44, 45, 47, 72, 48, 13, 54, 53, 18, 33, 7, 1, 51, 5, 41, 35, 85, 19, 20, 102

11,34 12,01 9,50 10,35 7,85 9,30 6,46 7,60 5,41 6,25 3,66 4,85 CreEst (cm/dia) 1,43 1,79** 0,95 1,24 0,66 0,92 0,38 0,65
5

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Continuao da Tabela 3.
Grupo A B C D Carter/Variao CreDBC (mm/dia) 2,33 2,64*** 2,04 2,18 1,64 2,02 0,73 1,57 CFo (cm) A B C D E F 11,75 10,30 10,64 8,15 8,69 6,44 7,18 5,82 6,23 4,86 5,79 LFo (cm) A B C D E A B C D E F G H
1
8 7 6

Acessos 32, 111, 110, 104, 107 14, 50, 15, 106, 13, 30, 28, 64, 25 24, 103, 105, 67, 101, 95, 16, 84, 12, 83, 36, 47, 89, 49, 88, 10, 86, 2, 69, 31, 11, 113, 87, 26, 55, 68, 71, 66, 91, 72, 56, 46, 45 38, 61, 33, 73, 63, 44, 92, 52, 37, 76, 93, 48, 6, 78, 90, 60, 8, 41, 81, 94, 3, 9, 39, 77, 4, 57, 19, 34, 74, 53, 62, 51, 5, 35, 75, 54, 59, 82, 1, 18, 7, 20, 80, 79, 85, 102 91 90, 113 95, 110 101, 15, 16, 84, 6, 14, 105, 79, 80, 83 82, 9, 8, 10, 106, 13, 104, 76, 36, 72, 11, 85, 107, 89, 111, 81, 12, 28 3, 75, 78, 38, 88, 103, 92, 64, 2, 32, 93, 50, 31, 24, 61, 62, 37, 47, 87, 25, 66, 71, 49, 45, 26, 51, 46, 60, 77, 86, 30, 63, 94, 34, 67, 18, 33, 41, 5, 54, 68, 4, 48, 55, 35, 102, 7, 39, 69, 19, 59, 56, 44, 52, 53, 20, 1, 57, 74, 73 91 90 83, 89, 81, 113, 82, 85, 87, 86, 110, 76, 93, 13, 94, 72, 92, 56, 101, 88, 9, 84, 15, 32, 14, 51, 71, 11, 63, 66, 37, 12, 31, 55, 69, 1, 79, 80, 28, 6, 16, 95 36, 62, 78, 10, 105, 60, 47, 45, 49, 57, 77, 61, 34, 75, 33, 50, 59, 18, 68, 8, 48, 64, 35, 41, 104, 24, 46, 38, 4, 54, 44, 30 73, 52, 106, 102, 2, 5, 111, 25, 39, 103, 74, 67, 7, 107, 26, 53, 3, 20, 19 91 113, 90 110 95, 102, 9, 105, 10, 104 12, 15, 103, 84, 111, 101, 60, 32, 11, 8, 83, 2, 59, 25, 16 6, 106, 75, 31, 41, 20, 28, 50, 85, 80, 107, 30, 39, 62, 74, 13, 14, 56, 86, 78, 69 89, 51, 82, 94, 77, 5, 87, 26, 24, 72, 55, 1, 67, 3, 88, 36, 37, 33, 61, 64, 92, 57, 79, 81, 18, 68, 54, 44, 35 19, 76, 34, 63, 93, 48, 4, 38, 49, 46, 47, 45, 7, 73, 71, 53, 66, 52
2 3 4

3,82 3,44 2,48 2,95 2,24 2,47 1,96 2,19 NEsp

9

28,04 23,86 24,75 21,91 17,71 19,57 15,81 17,43 14,43 15,62 13,09 14,22 10,80 12,72

Dias da semeadura emergncia; estatura de planta; dimetro base do caule; nmero de 5 6 folhas/planta; taxa de crescimento em estatura; taxa de crescimento em dimetro base do 7 8 9 caule; comprimento de folha; largura de folha; nmero de espinhos/folha. *Os grupos diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 1% de probabilidade de erro. -1 **Dados multiplicados por 10 -2 ***Dados multiplicados por 10

85

A taxa de crescimento em estatura mostrou uma variao de 0,38 a 1,79 x 10-1cm/dia e os acessos foram divididos em quatro grupos diferentes (Tabela 3). Todos os acessos que apresentaram maior magnitude para este carter so oriundos da Regio Nordeste do Estado, sendo quatro de Esmeralda, um de Vacaria e um de Caxias do Sul. Apenas o acesso 110, neste grupo, pertencente espcie M. aquifolium. Com exceo do acesso 102, de Vacaria, todos os que apresentaram menores valores para o crescimento em estatura so oriundos da Metade Sul do Estado e todos pertencem espcie M. ilicifolia. Estes resultados so comparveis aos observados para o carter estatura de planta. Em teste de prognies com M. ilicifolia cultivadas em campo experimental em dois municpios do Paran, Scheffer (2001) avaliou a estatura de plantas aos 23 e aos 38 meses, tendo observado um aumento mdio de 5,1cm nas plantas cultivadas em Ponta Grossa e 18,1cm nas de So Jos dos Pinhais. Considerando que o perodo compreendido entre as duas avaliaes foi de aproximadamente 450 dias (15 meses), a taxa mdia de crescimento foi 0,11 e 0,40 x 10-1cm, respectivamente para os dois locais. Em avaliao dos mesmos gentipos de Ponta Grossa, Radomski e Scheffer (2004) observaram um incremento mdio em estatura de 31,8cm, entre os 23 e os 75 meses de idade das plantas, o que representa uma taxa de crescimento aproximado de 0,20 x 10-1cm, neste perodo. Rachwal et al. (1997), identificaram um incremento mdio na estatura de plantas de M. ilicifolia, em 12 meses, de 22cm, o que corresponde a uma taxa de crescimento de 0,6 x 10-1cm. Estes valores esto abaixo do observado neste trabalho, que foi de 0,82 x 10-1cm. J Magalhes et al. (1992), em fase de produo de mudas de M. ilicifolia em casa-de vegetao, em um perodo de 225 dias, identificaram uma variao na estatura mdia entre as melhores plantas que corresponde a uma taxa de crescimento de 0,95 x 10-1cm, valor mais alto do que o identificado neste trabalho. Os autores observaram que at o stimo ms as plantas apresentaram uma taxa baixa de crescimento, tendo ocorrido um maior incremento a partir do oitavo ms. Eles sugerem que este comportamento parece ser prprio da fisiologia da espcie e que talvez o aumento no fotoperodo tenha influenciado na induo do crescimento vegetativo. Alm disso, no transplante de mudas, as plantas requerem um longo perodo para o restabelecimento do sistema radicular, em detrimento do crescimento da parte

86

area. Devem ser consideradas, alm das diferenas genticas entre as plantas avaliadas por estes autores e as deste trabalho, as diferenas de ambiente e de idade das plantas contribuindo para estes resultados. Para o carter taxa de crescimento em dimetro base do caule, foi observada uma variao de 0,73 a 2,64 x 10-2mm/dia, tendo os acessos sido divididos em quatro grupos diferentes (Tabela 3). Com exceo do acesso 32, de Piratini, todos os que apresentaram os maiores valores para este carter so de Esmeralda, sendo que o acesso 110 pertence espcie M. aquifolium, enquanto os demais so M. ilicifolia. Os acessos que apresentaram os menores valores para crescimento em dimetro so todos oriundos da Metade Sul do Estado, com exceo dos acessos 90 de Farroupilha e 102, de Vacaria. Estes resultados so comparveis aos observados para o carter dimetro base do caule. Para os caracteres de morfologia foliar foi evidenciada uma ampla variabilidade (Tabela 3). O carter comprimento de folha variou de 4,86 a 11,75cm, a largura de folha de 1,96 a 3,82cm e o nmero de espinhos por folha de 10,80 a 28,04, tendo sido formados para cada um destes caracteres, respectivamente, seis, cinco e oito grupos diferentes. O acesso 91, de Farroupilha, pertencente espcie M. aquifolium, foi o que apresentou folhas maiores e com maior nmero de espinhos por folha. Os acessos de M. aquifolium se destacaram para estes caracteres. Estes resultados esto de acordo com os apresentados por Carvalho-Okano (1992). Segundo a autora, M. aquifolium apresenta comprimento e largura de folha variando, respectivamente, de 6 a 19 cm e de 2 a 6 cm, enquanto M. ilicifolia apresenta uma variao de 2,2 a 8,9 cm para comprimento de folha e de 1,1 a 3 cm para largura de folha. Uma alta variabilidade para caracteres de morfologia foliar em espinheira-santa foi identificada em matrizes (Mariot et al., 2003) e prognies (Mariot et al., 2004) do banco ativo de germoplasma da Embrapa Clima Temperado. Nas prognies, o acesso 91, oriundo de Farroupilha, da espcie M. aquifolium, j havia sido identificado pelos autores como o que apresentava maiores folhas e com maior nmero de espinhos. Segundo Radomski e Scheffer (2004), no Rio grande do Sul predominam plantas de M. ilicifolia com folhas largas e curtas, coriceas, com espinhos longos distribudos ao longo de todo o limbo. Esta caracterizao

87

importante para a descrio de acessos de M ilicifolia, entretanto, o fato de envolver caracteres qualitativos e em populaes de apenas dois municpios do Rio Grande do Sul, dificulta a comparao com os resultados deste trabalho. Vrios autores observaram que plantas desenvolvidas em pleno sol apresentam folhas menores (Bernardi e Wasicki, 1959 apud Steenbock et al., 2003; Steenbock et al., 2003; Radomski et al, 2004). Ainda, segundo Bernardi e Wasicki, 1959 apud Steenbock et al., 2003, folhas de M. ilicifolia desenvolvidas a pleno sol apresentavam espinhos nas margens em nmero reduzido. Neste trabalho no foi comparado tamanho de folhas em diferentes condies de luminosidade, entretanto, nos locais de coleta, foram observadas plantas em pleno sol com folhas grandes. As prognies avaliadas neste trabalho somente ficaram em condies de sombreamento na fase inicial de desenvolvimento, entre maro e abril de 2003, passando a maior parte do tempo em pleno sol. Acessos como o 91, que oriundo de matriz que apresentava folhas grandes, mostraram na prognie folhas tambm grandes, o que evidencia um forte fator gentico controlando estes caracteres e no somente o ambiente. Deste modo, o tamanho de folha pode ser um carter importante para a seleo no melhoramento de espinheira-santa, caso exista uma alta correlao positiva com a concentrao de princpios ativos. As varincias de ambiente foram baixas e as varincias genotpicas foram altas para todos os caracteres, o que resultou em uma elevada herdabilidade com base na mdia de parcela (Tabela 4). A expresso fenotpica , portanto, fortemente controlada pelo fator gentico, o que importante para a seleo de gentipos superiores em programas de melhoramento. Alm disso, os resultados mostram a eficincia na conservao ex situ de espinheira-santa em bancos de germoplasma, devido a importante variabilidade identificada nos acessos. Scheffer (2001) tambm identificou uma alta herdabilidade para o carter estatura de planta em M. ilicifolia. O coeficiente de variao gentico foi baixo para o carter dias da semeadura emergncia e alto para os demais caracteres (Tabela 4) conforme a comparao com trabalhos desenvolvidos por Sebbenn et al. (1998 e 1999), com outras espcies florestais nativas , e os coeficientes de variao devido ao erro experimental foram baixos (Tabela 2) para todos os caracteres,

o que proporcionou um quociente b alto para as variveis analisadas, entre 88

1,17 e 2,48 (Tabela 4). Segundo Vencovsky e Barriga (1992), quando este quociente atinge valor igual ou maior que 1,0 na experimentao com prognies de irmos maternos, indica uma situao favorvel para seleo. Como a espinheira-santa uma espcie algama (Scheffer, 2001; Perecin e Kageyama, 2002), mas com sistema misto de fecundao (Perecin et al.,

2004), as prognies so de irmos maternos, portanto, os valores de b

apresentados neste trabalho so indicadores da potencialidade para seleo de gentipos superiores para todos os caracteres analisados. Os valores maiores para este quociente so mais favorveis para a seleo. Com valores do coeficiente de variao gentico acima de 7% para estatura em cabreva (Myroxylon peruiferum), Sebbenn et al. (1998) consideraram este parmetro como de alta magnitude. Segundo os autores, este resultado devido ao fato de que a populao foi composta por prognies de quatro populaes naturais diferentes, ocasionando um incremento na variabilidade gentica, o que tambm corresponde ao evidenciado neste trabalho, em que as prognies so oriundas de matrizes de vrios locais diferentes. Em trabalho desenvolvido com a espcie arbrea Pterogyne nitens, Sebbenn et al. (1999) tambm observaram altos valores para o coeficiente de variao gentico para estatura e dimetro altura do peito (10 a 20%), o que, segundo os autores, revela a eficincia na estratgia de conservao ex situ da espcie. Ainda foi destacado neste trabalho de Sebbenn et al. (1999), que a conservao in situ pode ser inviabilizada em populaes que se encontram fragmentadas e constitudas por pequeno nmero de exemplares. A conservao ex situ multipopulacional seria uma estratgia interessante nesta situao, em que seria includo o maior nmero possvel de famlias e de populaes oriundas de vrias localidades, para tornar mais eficiente o programa de conservao. Esta foi a estratgia de conservao da variabilidade gentica de espinheira-santa adotada neste trabalho, atravs da implantao do banco ativo de germoplasma na Embrapa Clima Temperado, uma vez que a maioria das populaes amostradas era pequena. As estimativas dos parmetros genticos nas prognies mostram que uma parcela importante da variabilidade gentica foi detectada para caracteres de interesse agronmico, o que pode ser til em programas de melhoramento. Este

89

resultado evidencia a eficincia na estratgia de conservao do germoplasma de espinheira-santa. Existem poucas informaes sobre parmetros genticos baseados em caracteres morfo-fisiolgicos em espinheira-santa. Estes so importantes para definio de estratgias para o melhoramento gentico. Por ser uma espcie de crescimento lento, a seleo de gentipos com crescimento mais rpido pode ser um parmetro importante a ser considerado. Considerando, ainda, que o aumento da biomassa uma caracterstica importante no melhoramento de plantas medicinais (Oliveira, et al., 2003), o nmero de folhas por planta e o tamanho das folhas devem ser considerados na seleo. Os parmetros genticos estimados neste trabalho indicam a eficincia no processo de seleo para todos os caracteres avaliados.

2 Tabela 4 Estimativa dos componentes da varincia E (varincia de ambiente), 2 (varincia gentica) e 2 (varincia fenotpica)
G P

e dos parmetros genticos herdabilidade com base na 2 mdia ( h ), coeficiente de variao gentico (CVG) e relao entre CVG e coeficiente de variao do erro experimental (CVE) ( b ) para nove caracteres em prognies de espinheirasanta. Pelotas/RS, UFPel 2005.

Caracteres DSE
1

Estat

DBC

NF

CreEst

CreDBC

CFo

LFo

NEsp

2 E 2 P
2 G 2 h

0,0042 0,0075 0,0085 0,88 5,46 1,34

0,1495 0,4185 0,4559 0,92 13,07 1,67

0,0273 0,0436 0,0504 0,86 9,33 1,26

2

0,8379 1,5584 1,7678 0,88 16,27 1,36

0,0006 0,0015 0,0017 0,91 13,78 1,55

3

0,000008 0,000011 0,000013 0,85 20,16 1,17

0,1783 1,0546 1,0992 0,96 17,54 2,43

0,0321 0,0649 0,0729 0,89 10,37 1,42

4

1,1597 7,1070 7,3969 0,96 17,98 2,48

CVG (%)
1

Dias da semeadura emergncia; estatura de planta; dimetro base do caule; nmero de 5 6 folhas/planta; crescimento em estatura; crescimento em dimetro base do caule; 7 8 9 comprimento de folha; largura de folha; nmero de espinhos/folha.

90

Foram evidenciadas correlaes altamente significativas entre alguns caracteres (Tabela 5). O carter dias da semeadura emergncia apresentou uma correlao significativa e negativa com os caracteres dimetro base do caule e nmero de folhas por planta, ou seja, quanto maior a velocidade de emergncia, maiores os valores para estes caracteres, que esto relacionados ao crescimento. Os caracteres estatura de planta, dimetro base do caule, nmero de folhas por planta, taxa de crescimento em estatura e taxa de crescimento em dimetro base do caule apresentaram correlaes altamente significativas e positivas entre si (Tabela 5). As altas correlaes so um aspecto positivo para seleo indireta em programas de melhoramento, conforme descrito por Carvalho et al. (2004). Para estes caracteres, relacionados ao crescimento, foram consideradas altas as correlaes entre estatura e taxa de crescimento em estatura e entre dimetro base do caule e taxa de crescimento em dimetro base do caule, o que era esperado, pois a estatura e o dimetro do caule foram utilizados para o clculo da taxa de crescimento. As demais correlaes entre os caracteres relacionados com o crescimento foram consideradas mdias. Em programas de melhoramento, cujo objetivo seja a obteno de plantas com maior taxa de crescimento, a seleo dever ser com base na estatura e/ou no dimetro base do caule, caracteres que apresentaram alta herdabilidade. Entretanto, importante destacar que este mesmo resultado pode variar devido a interaes com o ambiente, que no foram mensuradas neste trabalho. O comprimento de folha e o nmero de folhas por planta, caracteres que podem ser importantes para seleo, se estiverem relacionados com o aumento da biomassa, apresentaram uma correlao positiva e altamente significativa com estatura de planta, dimetro base do caule e crescimento em estatura (Tabela 5). Estas correlaes, entretanto, no so consideradas fortes. Os trs caracteres de morfologia foliar apresentaram correlaes positivas e altamente significativas entre si, o que tambm foi evidenciado por Mariot et al. (2004) ao avaliarem a variabilidade para morfologia foliar em prognies de espinheira-santa. Como o produto final de interesse em espinheira-santa a biomassa de folhas, estratgias de seleo com base nos caracteres nmero de folhas e comprimento de folha seriam de maior

91

importncia. A forte correlao observada entre comprimento e largura de folha permite a seleo indireta de plantas com folhas maiores a partir de avaliaes do primeiro carter.

Tabela 5 Estimativa dos coeficientes de correlaes de Pearson entre os caracteres morfo-fisiolgicos avaliados em prognies de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
DSE1 Estat DBC NF
4 5 2

Estat 0.58 * 0.49 * 0.99 * 0.57 * 0.44 * 0.22 0.39 *

DBC

NF

Creest

Credbc

CFo

LFo

-0.12 -0.34 * -0.43 * -0.08 -0.26 -0.09 -0.11 -0.07 0.53 * 0.58 * 0.97 * 0.27 * 0.13 0.25
2

Creest CFo LFo

1

0.47 * 0.49 * 0.18 -0.08 0.25 0.59 * 0.40 * 0.17 0.38 *

3

Credbc6 7
8 9

0.24 0.07 0.24 0.67 * 0.82 *

4

NEsp

0.49 *

Dias da semeadura a emergncia; estatura de planta; dimetro a base do caule; nmero de 5 6 folhas/planta; crescimento em estatura; crescimento em dimetro a base do caule; 7 8 9 comprimento de folha; largura de folha; nmero de espinhos/folha. *Significativo a 1% de probabilidade pelo teste t.

92

5.4 CONCLUSES

Foi evidenciada variabilidade para os caracteres morfolgicos e fisiolgicos em espinheira-santa. Existe potencial para seleo em programas de melhoramento, com possibilidade de uso de seleo indireta. A estratgia mais adequada para conservao ex situ manter acessos de vrias populaes em banco de germoplasma.

93

5.5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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96

6. CAPTULO V

DIVERGNCIA GENTICA ENTRE ACESSOS DE ESPINHEIRA-SANTA COM BASE EM CARACTERES MORFOLGICOS E FISIOLGICOS DAS PROGNIES

6.1 INTRODUO

Maytenus ilicifolia e M. aquifolium, pertencentes famlia Celastraceae e popularmente conhecidas como espinheira-santa, so espcies nativas do Brasil que apresentam alto valor medicinal no tratamento de gastrite e lcera gstrica (Di Stasi, 2004). Dentre os gneros de Celastraceae ocorrentes no Brasil, Maytenus e Celastrus so os nicos que apresentam frutos capsulares e sementes envolvidas completamente por um arilo branco (Carvalho-Okano e Leito Filho, 2004). Maytenus um gnero predominantemente americano, caracterizado pelo hbito arbustivo ou arbreo. As caractersticas que diferenciam as duas espcies de espinheira-santa so a presena de ramos jovens tetra ou multicarenados, angulosos em M. ilicifolia, enquanto que em M. aquifolium os ramos so arredondados ou achatados, lisos. Alm disso, a disposio das folhas nos ramos em M. ilicifolia de forma helicoidal e em M. aquifolium paralela (Carvalho-Okano, 1992). Devido ao extrativismo intenso nas populaes naturais, que tem levado a uma perda na variabilidade gentica, a espinheira-santa considerada prioritria para conservao (Vieira, 1999). Com o propsito de

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conservar a variabilidade gentica destas espcies, a Embrapa Clima Temperado implantou um banco ativo de germoplasma de M. ilicifolia e M. aquifolium, em que acessos oriundos de diferentes locais foram coletados, caracterizados e conservados (Mariot et al., 2003; Mariot et al., 2004). A caracterizao permite que seja estimada a divergncia gentica entre os acessos do banco de germoplasma, atravs de anlises multivariadas. Este estudo possibilita que se conhea melhor o germoplasma disponvel, facilitando o trabalho de conservao. Anlises multivariadas para estimar a divergncia gentica com base em caracteres morfolgicos e/ou fisiolgicos tm sido utilizadas em germoplasma de espcies medicinais. Com base nas anlises de componentes principais e variveis cannicas, Mathur et al. (2003) agruparam 27 acessos da espcie Bacopa monnieri (brahmi) em sete grupos. Os autores obtiveram um agrupamento diferente atravs do dendrograma, com base na distncia generalizada de Mahalanobis (D2). Utilizando 18 variveis quantitativas, Mathur et al. (2003) agruparam 16 acessos de centela (Centella asitica) em nove grupos, com base na anlise de componentes principais e variveis cannicas. Atravs de um dendrograma construdo com base na distncia de Mahalanobis (D2), os autores identificaram a formao de quatro grupos maiores. Este estudo revelou a existncia de dois morfotipos diferentes em C. asiatica. Em espinheira-santa, estudos da divergncia gentica foram realizados atravs de marcadores moleculares do tipo RAPD (Bittencourt, 2000; Mossi, 2003), isoenzimas (Scheffer, 2001; Perecin e Kageyama, 2002; Steenbock, 2003) e metablitos secundrios (Mossi, 2003). Em todos os trabalhos foi identificada uma maior variabilidade dentro de populaes do que entre populaes, o que esperado para espcies de fecundao cruzada. Foi destacado por Perecin et al. (2004) que, apesar da grande riqueza allica encontrada em M. ilicifolia e M. aquifolium, atravs de anlise de isoenzimas, o nmero de alelos com baixa freqncia muito alto, o que deve ser motivo de preocupao. Segundo os autores, estas espcies possuem muitos alelos que podem ser classificados como raros, os quais so mais facilmente perdidos quando comparados aos alelos mais comuns. Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a divergncia gentica em germoplasma de espinheira-santa, e agrupar os acessos atravs

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de anlises multivariadas, com base em caracteres morfo-fisiolgicos avaliados nas prognies.

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6.2 MATERIAL E MTODOS

Foram avaliadas as prognies de 89 acessos de espinheira-santa oriundos de populaes localizadas no Estado do Rio Grande do Sul do banco ativo de germoplasma da Embrapa Clima Temperado. Alguns acessos no foram avaliados devido a problemas de homogeneidade nas anlises de varincia. A relao dos acessos e os respectivos locais de origem encontramse na Tabela 1. Sementes coletadas entre os meses de outubro de 2002 e janeiro de 2003 foram semeadas em fevereiro de 2003 em sacos de polietileno preto, com dimenses de 10 x 17 cm, em telado, na Embrapa Clima Temperado. O substrato utilizado constou de areia mdia, esterco bovino curtido e terra, na proporo de 1:1:1. Foi colocado sombrite 50% o qual permaneceu entre fevereiro e abril de 2003 para permitir um melhor desenvolvimento das mudas na fase inicial. Em abril de 2003 as mudas foram levadas para casa-de-vegetao para permitir o melhor desenvolvimento das plantas em condies de temperaturas mais altas. Durante o perodo em que as plantas permaneceram na casa-de-vegetao, foi aplicado uma soluo nutritiva composta por KH2PO4 e uria, na dosagem de 10ml/planta. As aplicaes foram feitas semanalmente, durante seis semanas, a partir de setembro de 2003. Em novembro de 2003, as plantas foram transplantadas para canteiros em rea de telado, uma vez que o recipiente em que se encontravam estava pequeno em relao ao tamanho da planta, dificultando o desenvolvimento do sistema radicular. Os canteiros utilizados eram de alvenaria, com dimenses de 7,67 x 0,85m. A adubao constou de esterco bovino (50kg/canteiro), adubo 10-20-10 (0,0625kg/canteiro) e nitroclcio (0,272kg/canteiro). O clculo de adubao foi baseado em anlise de solo e

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recomendao para a cultura da erva-mate que uma espcie nativa que consta no manual de recomendaes de adubao e calagem para o Rio Grande do Sul e Santa Catarina (Sociedade Brasileira de Cincia do Solo, 1997) , uma vez que no existe recomendao especfica para a espinheirasanta. Os caracteres morfolgicos e fisiolgicos avaliados nas prognies foram: 1 Dias da semeadura emergncia (DSE); 2 Estatura de planta, em cm: avaliada aos 90 (Est1), 180 (Est2), 270 (Est3) e 360 (Est4) dias aps a semeadura; 3 Dimetro base do caule, em mm: avaliado, com auxlio de um paqumetro digital, aos 90 (DBC1), 180 (DBC2), 270 (DBC3) e 360 (DBC4) dias aps a semeadura; 4 Nmero de folhas/planta: avaliado aos 90 (NF1) e 180 (NF2) dias aps a semeadura; 5 Taxa de crescimento em estatura (CreEST), em cm/dia: avaliada a partir da diferena entre a estatura aos 360 dias e a estatura aos 90 dias, dividido por 270 dias (Est360 Est90/270); 6 Taxa de crescimento em dimetro base do caule (CreDBC), em mm/dia: avaliada a partir da diferena entre o dimetro aos 360 dias e o dimetro aos 90 dias, dividido por 270 dias (DBC360 DBC90/270); 7 Comprimento de folha (CFo), em cm; 8 Largura de folha (LFo), em cm; 9 Nmero de espinhos/folha (NEsp). Os dados referentes aos caracteres de morfologia foliar foram baseados na mdia de trs folhas, retiradas da parte inferior, mediana e superior de cada planta. Para maior homogeneidade das varincias e para atender a pressuposio de normalidade na anlise, os dados das variveis Est4, DBC4 e CreEST foram transformados para raiz quadrada, Est1 para Est11,5 e, DSE, para o logaritmo de base 10 dos dados originais (log10). O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com quatro repeties e cinco plantas por parcela. Os dados foram submetidos anlise de varincia para cada um dos caracteres e anlise de varincia multivariada atravs do programa estatstico SAS, verso 8.2 (SAS Institute, 2000). Atravs

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deste programa, foram obtidas a matriz de varincias e covarincias residuais e as mdias dos acessos. Foram ento estimadas, com auxlio do programa GENES (Cruz, 2001), as variveis cannicas. Esta anlise possibilita visualizar a similaridade entre indivduos em grficos de disperso bi ou tridimensionais, alm de verificar a importncia relativa dos caracteres no estudo da diversidade (Cruz e Regazzi, 2001). Esta tcnica tem a vantagem de manter o princpio do processo de agrupamento com base na distncia de Mahalanobis (D2), que leva em considerao as correlaes residuais existentes entre caracteres. Para anlise de dissimilaridade foi utilizada a distncia de Mahalanobis, sendo
2 a distncia entre o par de acessos i e i definida pela expresso Dii ' = ' 1 ,

em que ' corresponde diferena entre as mdias do par de acessos para uma determinada caracterstica e 1 a matriz de varincias e covarincias residuais, conforme descrito por Cruz e Carneiro (2003). Esta anlise foi realizada com auxlio do programa GENES (Cruz, 2001). Este programa fornece, alm da matriz de dissimilaridade, a contribuio relativa dos caracteres para a divergncia, conforme Singh (1981). Atravs da matriz de dissimilaridade dos acessos foi feita a anlise de agrupamento pelo mtodo de otimizao de Tocher, conforme descrito por Cruz e Carneiro (2003). A consistncia do agrupamento foi verificada atravs da anlise discriminante de Anderson (Anderson, 1958). Foram estimadas ainda as correlaes fenotpicas entre os caracteres por meio do coeficiente de Pearson (r), tendo a significncia sido testada pela estatstica t, conforme descrito por Carvalho et al. (2004). Esta anlise foi realizada com auxlio do programa GENES (Cruz, 2001).

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Tabela 1 Origem dos acessos do banco ativo de germoplasma de espinheira-santa (M. ilicifolia e M. aquifolium). Pelotas/RS, UFPel 2005.
Populao 1 2 3 4 6 7 8 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 24 25 26 28 Total geral Acesso 1-7 8-16 18 19, 20, 24, 25, 28, 30, 31, 33-39, 41 44-46, 48-54 55,56; 86,87 57 60 e 92 61 62-64, 66-69, 71-75 76-83 84 85 88-89 90* 91* 93-94 95 101 102 103,104; 106, 107, 110*,111 105 113* Total 7 9 1 15 10 4 1 2 1 12 8 1 1 2 1 1 2 1 1 1 6 1 1 89 Municpio Encruzilhada do Sul Encruzilhada do Sul Piratini Piratini Piratini Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Arroio Grande Candiota Candiota Hulha Negra Pelotas Arroio Grande Farroupilha Farroupilha Arroio Grande Cachoeirinha Caxias do Sul Vacaria Esmeralda Vacaria So Marcos

* Acessos pertencentes espcie M. aquifolium

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6.3 RESULTADOS E DISCUSSO

Foi evidenciada significncia a 1% de probabilidade de erro, pelo teste F, para todos os caracteres na anlise de varincia (Tabela 2). Os coeficientes de variao foram baixos para a maioria dos caracteres, sendo considerados mdios para estatura aos 90 (Est1), 180 (Est2) e 270 dias (Est3), nmero de folhas por planta aos 90 (NF1) e 180 dias (NF2) e crescimento em dimetro base do caule (CreDBC), o que mostra a boa preciso do experimento. Foi observado um incremento em estatura ao longo das avaliaes, de 2,9cm entre os 90 e 180 dias, 9,09cm entre os 180 e 270 dias e 10,29cm entre os 270 e 360 dias aps a semeadura, o que corrobora os resultados obtidos por Magalhes et al. (1992) em trabalho desenvolvido com M. ilicifolia. Os autores observaram que at o stimo ms as plantas apresentaram uma taxa baixa de crescimento, tendo ocorrido um maior incremento a partir do oitavo ms. Eles sugerem que, alm dos fatores inerentes fisiologia da espcie, o aumento no fotoperodo tenha influenciado na induo do crescimento vegetativo. Este fator tambm pode ter influenciado nos resultados observados neste trabalho, pois o crescimento em estatura comeou a ter um maior incremento aps os 180 dias (Figura 1), que corresponde ao ms de setembro, quando o fotoperodo est em ascendncia. Em plantas de M. ilicifolia com idade maior do que as avaliadas neste trabalho, Radomski e Scheffer (2004) observaram um aumento mdio em estatura de 31,8cm, entre os 23 e os 75 meses.

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Tabela 2 Resumo da anlise da varincia para 16 caracteres morfofisiolgicos em prognies de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Amplitude DSE 23,14 66,53 2 Est1 (cm) 1,17 4,83 Est22 (cm) 2,06 9,78 Est32 (cm) 5,02 24,95 Est42 (cm) 10,45 51,63 3 DBC1 (mm) 0,45 0,92 3 DBC2 (mm) 0,73 1,61 3 DBC3 (mm) 1,16 3,60 3 DBC4 (mm) 2,43 8,06 4 NF1 1,58 5,69 4 NF2 4,41 12,02 5 CreEST (cm/dia) 0,38 1,79 x 10-1 CreDBC6( mm/dia) 0,73 2,64 x 10-2 CFo7 (cm) 4,86 11,75 8 LFo (cm) 1,96 3,82 9 NEsp 10,80 28,04 GLResduo para todos os caracteres: 219
1

Mdia 40,11 2,91 5,81 14,90 25,19 0,68 1,22 2,48 5,07 4,01 7,68 0,82 x 10-1 1,60 x 10-2 5,88 2,47 14,78

QMG 0,03* 9,10* 7,19* 40,17* 1,66* 0,04* 0,14* 0,60* 0,17* 2,15* 5,93* 0,64 x 10-3* 0,43 x 10-5* 4,62* 0,29* 27,78*

CV (%) 4,03 17,83 13,08 14,32 7,28 4,90 9,34 10,32 6,96 14,81 11,32 8,11 15,74 6,56 6,76 6,64

DSE dias da semeadura emergncia; Est1, Est2, Est3, Est4 estatura de planta, 3 respectivamente, aos 90, 180, 270 e 360 dias; DBC1, DBC2, DBC3, DBC4 dimetro base 4 do caule, respectivamente, aos 90, 180, 270 e 360 dias; NF1, NF2 nmero de folhas por 5 6 planta, respectivamente, aos 90 e 180 dias; CreEst crescimento em estatura; CreDBC 7 8 crescimento em dimetro base do caule; CFo comprimento de folha; LFo largura de 9 folha; NEsp nmero de espinhos por folha. *Significativo a 1% de probabilidade de erro pelo teste F.

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Assim como a estatura, foi observado um aumento no dimetro base do caule ao longo das avaliaes, de 0,54mm entre os 90 e 180 dias, 1,26mm entre os 180 e 270 dias e 2,59mm entre os 270 e 360 dias aps a semeadura (Tabela 2 e Figura 1). Uma variao de 0,6 a 2,6mm para este carter foi observada por Scheffer (2001) em plantas de M. ilicifolia cultivadas em tubetes, aos 11 meses de idade. Para esta mesma espcie, Nicoloso et al. (2000) identificaram um dimetro mdio de 0,75mm aos 135 dias aps a semeadura, em plantas cultivadas em sacos de polietileno. Houve um aumento de 3,67 folhas por planta entre os 90 e os 180 dias aps a semeadura (Tabela 2). O aumento evidenciado para este carter acompanhou o crescimento em estatura entre os 90 e 180 dias (Figura 1), o que tambm foi observado por Magalhes et al. (1992) em trabalho desenvolvido com M. ilicifolia. Os autores observaram um maior incremento para este carter a partir do oitavo ms. Aos 6 meses, identificaram uma mdia de 9,5 folhas por planta, valor maior do que o identificado neste trabalho para o mesmo perodo (180 dias).

30 25 20 15 10 5 0 1 90 2 180 3 270 4 360 Dias aps a semeadura Est DBC NF

Figura 1 Variao mdia para os caracteres estatura de planta (Est), dimetro base do caule (DBC) e nmero de folhas por planta (NF) em espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.

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Atravs da anlise de variveis cannicas, foi observado que as trs primeiras variveis responderam por 70,66% da variao total (Tabela 3). Atravs dos escores das trs primeiras variveis cannicas foi elaborado um grfico de disperso tridimensional que mostra a formao de trs grupos para os acessos de espinheira-santa (Figura 2). Os acessos 90, de Farroupilha, e 76, de Candiota, pertencentes respectivamente s espcies M. aquifolium e M. ilicifolia, foram agrupados juntos; o acesso 1, de Encruzilhada do Sul, ficou em um grupo isolado e os demais acessos foram inseridos em um grupo maior. Os acessos 90 e 76 apresentaram mdias semelhantes (dados no apresentados) para os caracteres que mais contriburam para a divergncia gentica entre os acessos de espinheira-santa, com base nos autovetores, na anlise de variveis cannicas (Tabela 3) e pela estatstica de Singh (1981) (Tabela 5), o que explica este agrupamento. Os caracteres que mais contriburam para a divergncia gentica, com base nos autovetores, foram estatura de planta aos 360 dias (Est4), seguido de dimetro base do caule aos 360 dias (DBC4) e NF2 (Tabela 3). A grande diferena entre os acessos da Regio Nordeste do Estado em relao aos demais para Est4 e DBC4, explica a maior importncia destes caracteres para a divergncia gentica. Os caracteres relacionados ao crescimento, so, portanto, importantes para a diferenciao dos acessos de espinheira-santa com base na anlise de prognies, alm de serem importantes para seleo em programas de melhoramento, pois a espinheira-santa considerada uma espcie de crescimento lento (Magalhes et al., 1992; Rachwal et al., 1997; Nicoloso et al., 2000). Os acessos 90, 76 e 1, que ficaram separados dos demais na anlise de variveis cannicas, no apresentaram as maiores mdias para os caracteres que mais contriburam para a divergncia gentica (ver Tabela 3 do captulo IV). Os caracteres de menor importncia so aqueles cujos coeficientes de ponderao (autovetores) so de maior magnitude, em valor absoluto, nas ltimas variveis cannicas (Cruz e Regazzi, 2001), o que corresponde ao crescimento em estatura (CreEST) e crescimento em dimetro base do caule (CreDBC) (Tabela 3). Estas variveis apresentaram uma correlao positiva e altamente significativa com os caracteres que mais contriburam para a divergncia gentica atravs da anlise de variveis cannicas (Tabela 4), o

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que corroborado pela afirmao de Cruz e Carneiro (2003), de que as variveis que esto correlacionadas com outras consideradas no estudo, apresentam coeficientes de grande magnitude nos ltimos autovetores.

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Tabela 3 Estimativas dos autovalores ( j ) associados s variveis cannicas e respectivos coeficientes de ponderao (autovetores) de 16 caracteres morfo-fisiolgicos em prognies de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.

j
0,0606 0,0347 0,0100 0,0060 0,0045 0,0040 0,0035 0,0033 0,0032 0,0030 0,0030 0,0029 0,0028 0,0027 0,0024 0,0021
1

j (%)
acumulada 40,65 63,94 70,66 74,69 77,76 80,45 82,84 85,12 87,27 89,31 91,32 93,25 95,13 96,93 98,57 100,0 DSE

Caracteres/Autovetores
1

Est1

Est2

Est3

Est4

DBC1

DBC2

DBC33 -0.335 0.583 -0.801 -0.426 1.995 1.387 0.226 0.095 0.192 0.635 -0.459 0.369 -0.511 -0.527 -0.146 0.170

DBC43 3.999 -15.515 0.489 0.231 1.782 1.374 0.769 0.033 -0.063 0.715 -0.408 -0.442 -0.432 0.121 -2.177 -0.106

NF14 -0.761 -0.593 -1.745 -0.640 -1.150 -0.019 -0.642 -0.628 0.738 -0.584 0.809 -0.534 0.801 -0.030 -0.505 -0.166

NF24 0.908 0.346 2.516 0.189 0.886 -0.284 -0.111 0.005 -0.238 0.134 -0.213 0.381 0.237 0.106 -0.219 0.489

CreEst5 41.106 1.990 -2.409 1.260 0.790 0.469 -0.070 0.492 -0.209 0.149 0.760 -0.138 -0.468 1.868 -0.147 6.598
3

CreDBC6 -3.957 14.590 -0.397 0.217 -1.858 -2.049 -0.415 0.647 0.217 -0.625 0.888 -0.097 1.066 -0.036 2.394 -0.338

CFo7 -0.119 -0.104 0.290 0.350 0.668 0.095 -0.286 0.448 -0.889 -0.258 1.245 -0.225 -0.500 1.056 -0.536 0.816

LFo8 0.029 0.245 -0.192 0.383 -0.531 -0.174 -0.344 -0.081 0.130 0.540 -0.087 0.595 0.494 -0.847 -0.020 0.379

NEsp9 0.141 -0.149 0.348 -0.460 -0.600 0.187 1.223 -0.427 0.703 -0.070 -0.443 -0.034 -0.016 -0.723 -0.271 -0.764

-0.304 -0.188 -0.337 -0.907 -0.584 -0.720 -0.597 -0.078 0.263 0.621 0.075 0.130 0.260 0.347 -0.263 -0.395

3.457 0.531 0.548 0.769 0.246 0.735 0.487 0.495 -0.131 0.033 -0.764 0.281 0.646 0.950 -0.903 -0.006
2

0.136 -0.127 -2.013 -1.524 0.863 -1.988 0.358 0.621 0.376 -0.742 0.287 0.059 -0.129 -0.407 1.210 1.252

0.046 0.066 0.288 1.707 -0.821 -0.133 -0.448 -1.145 -0.892 0.315 0.518 0.888 -0.666 -0.681 -0.886 -1.435

-42.480 -2.300 2.400 -1.309 -1.282 -0.415 0.174 -0.838 0.584 -0.168 -1.549 -0.808 0.459 -1.180 0.712 -5.818

-0.338 1.627 -0.057 -0.487 -0.186 0.009 -0.107 -0.454 -0.404 0.364 0.086 0.479 0.085 0.388 1.439 -0.494

-0.030 0.076 0.662 0.067 -1.660 0.135 -0.885 0.512 0.912 0.304 -0.129 -0.169 -0.400 0.544 0.063 -0.096

DSE dias da semeadura emergncia; Est1, Est2, Est3, Est4 estatura de planta, respectivamente, aos 90, 180, 270 e 360 dias; DBC1, DBC2, DBC3, DBC4 dimetro 4 5 base do caule, respectivamente, aos 90, 180, 270 e 360 dias; NF1, NF2 nmero de folhas por planta, respectivamente, aos 90 e 180 dias; CreEst crescimento em 6 7 8 9 estatura; CreDBC crescimento em dimetro base do caule; CFo comprimento de folha; LFo largura de folha; NEsp nmero de espinhos por folha.

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Acesso 1 M. ilicifolia (Encruzilhada do Sul) Acesso 76 M. ilicifolia (Candiota) Acesso 90 M. aquifolium (Farroupilha)

Figura 2 Grfico de disperso dos acessos de espinheira-santa em relao s trs primeiras variveis cannicas, com base em 16 caracteres morfo-fisiolgicos avaliados nas prognies. Pelotas/RS, UFPel 2005.

110

Os caracteres estatura de planta, dimetro base do caule e nmero de folhas por planta, em todos os perodos, e crescimento em estatura e em dimetro base do caule apresentaram correlaes positivas e altamente significativas entre si (Tabela 4), o que, aliado s anlises de importncia relativa dos caracteres para divergncia gentica (Tabela 3), permite o descarte de algumas variveis para caracterizao de acessos de espinheirasanta em banco de germoplasma, como CreEST, CreDBC, Est3, Est2 e dimetro base do caule aos 180 dias (DBC2). Em trabalho desenvolvido com cupuauzeiro, visando seleo de descritores para caracterizao de germoplasma, Alves et al. (2003) observaram que a eliminao de variveis de menor importncia identificadas na anlise de componentes principais no ocasionou perda significativa de informao da variabilidade gentica. Da mesma forma, este trabalho permite a indicao de descritores importantes para caracterizao de germoplasma de espinheira-santa, como Est4, DBC4 e NF2 caracteres de maior importncia para a divergncia gentica. O carter dias da semeadura emergncia (DSE) apresentou correlaes negativas e altamente significativas com Est1, Est2 e Est3 (Tabela 4). A baixa correlao com Est4, mostra que a velocidade de emergncia das plantas deixou de apresentar relao linear com o crescimento em estatura aps os 270 dias contados a partir da semeadura , o que pode ser observado tambm pela no significncia identificada no coeficiente de correlao com o carter CreEst. Os caracteres de morfologia foliar apresentaram correlaes positivas e altamente significativas entre si, o que tambm foi evidenciado por Mariot et al. (2004) ao avaliarem a variabilidade gentica para morfologia foliar em acessos de espinheira-santa. O carter comprimento de folha (CFo) no apresentou correlaes significativas apenas com os caracteres DSE, NF1, NF2 e CreDBC. A varivel largura de folha (LFo) apresentou correlaes significativas alm dos demais caracteres de morfologia foliar apenas com Est1 e DBC1. J o carter nmero de espinhos por folha (NEsp), no apresentou correlaes significativas apenas com os caracteres DSE, DBC4, NF1, NF2 e CreDBC. O nmero de espinhos por folha, por apresentar correlao positiva e significativa com comprimento de folha, tambm o apresentou com os caracteres estatura, dimetro base do caule e CreEst.

111

Tabela 4 Estimativa dos coeficientes de correlaes de Pearson entre 16 caracteres morfo-fisiolgicos avaliados em prognies de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.
DSE1 Est1 Est2 Est3 Est4
2 2 2 2 3 3 3 3

Est1 0.84* 0.68* 0.50* 0.60* 0.62* 0.53* 0.35* 0.60* 0.41* 0.43* 0.29* 0.40* 0.28* 0.31*

Est2

Est3

Est4

DBC1

DBC2

DBC3

DBC4

NF1

NF2

CreEst

CreDBC

CFo

LFo

-0.46* -0.52* -0.39* -0.13 -0.51* -0.64* -0.30* -0.29* -0.61* -0.43* -0.08 -0.20 -0.10 -0.10 -0.07 0.86* 0.60* 0.61* 0.78* 0.69* 0.50* 0.70* 0.62* 0.55* 0.43* 0.40* 0.15 0.37* 0.80* 0.48* 0.66* 0.82* 0.66* 0.70* 0.67* 0.78* 0.64* 0.30* 0.01 0.29*
2

DBC1 DBC2 DBC3 DBC4 NF1

4 4

0.37* 0.37* 0.72* 0.61* 0.49* 0.49* 0.99* 0.61* 0.43* 0.22 0.39* 0.59* 0.48* 0.43* 0.64* 0.49* 0.33* 0.30* 0.55* 0.39* 0.51* 0.66* 0.50* 0.66* 0.62* 0.32* 0.43* 0.34* 0.10 0.33* 0.75* 0.72* 0.67* 0.71* 0.76* 0.38* 0.07 0.36* 0.53* 0.54* 0.62* 0.97* 0.28* 0.12 0.27 0.80* 0.46* 0.47* 0.25 0.02 0.25 0.48* 0.51* 0.16 -0.11 0.26 0.63* 0.39* 0.17 0.37* 0.25 0.06 0.25
3

NF2

CreEst5 CreDBC6 7 CFo LFo

1

8 9

0.68* 0.83* 0.50*

NEsp

DSE dias da semeadura emergncia; Est1, Est2, Est3, Est4 estatura de planta, respectivamente, aos 90, 180, 270 e 360 dias; DBC1, DBC2, DBC3, 4 DBC4 dimetro base do caule, respectivamente, aos 90, 180, 270 e 360 dias; NF1, NF2 nmero de folhas por planta, respectivamente, aos 90 e 180 5 6 7 8 9 dias; CreEst crescimento em estatura; CreDBC crescimento em dimetro base do caule; CFo comprimento de folha; LFo largura de folha; NEsp nmero de espinhos por folha. *Significativo a 1% de probabilidade pelo teste t.

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O carter Est4, assim como na anlise de variveis cannicas, tambm foi considerado o mais importante atravs da estatstica de Singh (1981), seguido de CreEst, DBC4 e NF2 (Tabela 5). O carter que menos contribuiu para a divergncia gentica, por esta anlise, foi o DBC1, seguido de LFo e CFo. A menor importncia do DBC1 pode ser explicada pelo fato desta avaliao ter sido feita aos 90 dias, quando as plantas ainda no apresentavam muita discrepncia para este carter. Alm disso, o crescimento da espinheirasanta bastante lento, principalmente para dimetro do caule. Este resultado refora a utilizao dos caracteres Est4, DBC4 e NF2 para diferenciao de acessos de espinheira-santa. Como a estatstica de Singh (1981) no leva em considerao as correlaes entre as variveis para discriminao do grau de importncia dos caracteres para divergncia gentica, a varivel CreEst foi considerada a segunda de maior importncia. Entretanto, ela pode ser descartada, pela alta correlao que apresenta com o carter Est4. Atravs da anlise de dissimilaridade, com base na distncia de Mahalanobis (D2), foram identificados como mais similares os acessos 61 e 78 (0,16), respectivamente oriundos de Arroio Grande e Candiota, municpios localizados na Metade Sul do Estado (dados no apresentados). Estes acessos apresentaram mdias semelhantes para os caracteres que mais contriburam para a divergncia gentica, o que explica esta maior similaridade. Os mais dissimilares foram os acessos 1, de Encruzilhada do Sul, e 90, de Farroupilha (5,97), pertencentes, respectivamente, s espcies M. ilicifolia e M. aquifolium. Estes acessos apresentaram mdias bastante diferentes para os caracteres que mais contriburam para a divergncia gentica. Ao estudar a divergncia gentica em espinheira-santa com base em marcadores do tipo RAPD, Mossi (2003) identificou uma maior dissimilaridade entre M. ilicifolia e M. aquifolium e um elevado ndice mdio de similaridade (0,92) dentro da espcie M. ilicifolia. A matriz de dissimilaridade permitiu o agrupamento dos acessos de espinheira-santa atravs do mtodo de otimizao de Tocher (Tabela 6). Foram formados 3 grupos, sendo que o primeiro abrange a maioria dos acessos. Os acessos 90 (M. aquifolium) e 1 (M. ilicifolia), respectivamente oriundos de Farroupilha e Encruzilhada do Sul, ficaram em grupos a parte. A taxa de erro aparente, de acordo com a anlise discriminante de Anderson (1958), foi de 1,12%, o que mostra a consistncia no agrupamento, ou seja,

113

98,88% dos acessos foram agrupados corretamente. Nesta anlise foi sugerido que apenas um acesso, o 76, foi agrupado erroneamente, devendo ser inserido no grupo 2, juntamente com o acesso 90. Este resultado est de acordo com o agrupamento evidenciado na disperso grfica com base nos escores das trs primeiras variveis cannicas (Figura 2). No foi observada uma separao entre as duas espcies de espinheira-santa com base nos caracteres avaliados neste trabalho. Dos quatro acessos de M. aquifolium, apenas o 90 foi separado dos demais, entretanto, junto com o acesso 76 (M. ilicifolia), o que evidencia a proximidade gentica entre as duas espcies. Perecin e Kageyama (2002) tambm destacaram a proximidade filogentica entre estas espcies ao identificarem o compartilhamento de alelos entre M. ilicifolia e M. aquifolium, em trabalho com isoenzimas,

Tabela 5 Contribuio relativa dos caracteres morfo-fisiolgicos para divergncia gentica em prognies de espinheira-santa, de acordo com a estatstica de Singh(1981). Pelotas/RS, UFPel 2005.
Carter Dias da semeadura emergncia Estatura 1 Estatura 2 Estatura 3 Estatura 4 Dimetro base do caule 1 Dimetro base do caule 2 Dimetro base do caule 3 Dimetro base do caule 4 Nmero de folhas por planta 1 Nmero de folhas por planta 2 Crescimento em estatura Crescimento em dimetro Comprimento de folha Largura de folha Nmero de espinhos por folha S.j 28,75 30,21 31,64 37,55 1304,13 3,55 26,58 46,19 258,43 31,72 62,23 761,78 61,87 22,97 20,93 30,17 Valor em % 1,04 1,09 1,15 1,36 47,27 0,13 0,96 1,67 9,37 1,15 2,26 27,61 2,24 0,83 0,76 1,09

114

As anlises multivariadas foram eficientes e concordantes para a separao dos acessos de espinheira-santa com base em caracteres morfolgicos e fisiolgicos avaliados nas prognies. A separao dos acessos em apenas trs grupos, entretanto, revela que, para os caracteres avaliados nas prognies, no foi detectada uma grande variabilidade gentica. Estas tcnicas de anlise so ferramentas importantes para caracterizar germoplasma, pois permitem descrever e agrupar um conjunto de acessos, levando em considerao simultaneamente vrias caractersticas e a relao existente entre elas (Rojas, 2003). Neste sentido, os trabalhos envolvendo a caracterizao morfolgica e fisiolgica em espinheira-santa sero mais eficientes dentro do banco ativo de germoplasma.

Tabela 6 Agrupamento dos acessos de espinheira-santa pelo mtodo de Tocher, com base em caracteres morfo-fisiolgicos avaliados nas prognies. Pelotas/RS, UFPel 2005.
Grupo Acessos 61, 78, 73, 64, 67, 69, 55, 75, 68, 56, 63, 46, 36, 2, 57, 92, 94, 48, 4, 49, 35, 6, 52, 53, 45, 24, 5, 88, 62, 44, 25, 72, 41, 11, 7, 74, 3, 77, 54, 16, 15, 84, 83, 43, 14, 80, 81, 34, 60, 105, 31, 103, 33, 37, 86, 8, 66, 13, 12, 89, 101, 87, 106, 82, 51, 107, 104, 39, 50, 110, 18, 9, 95, 111, 113, 91, 85, 19, 30, 20, 28, 102, 76 90 1

93, 10, 79, 38,

2 3

Taxa de erro aparente, de acordo com anlise discriminante de Anderson (1958) 1,12%

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6.4 CONCLUSES

Foi observada variabilidade gentica entre os acessos para os caracteres avaliados nas prognies. As variveis estatura aos 360 dias, dimetro base do caule aos 360 dias e nmero de folhas aos 180 dias foram as mais importantes para a caracterizao de prognies de germoplasma de espinheira-santa. A maior dissimilaridade foi evidenciada entre um acesso de M. ilicifolia e outro de M. aquifolium. Os caracteres morfo-fisiolgicos utilizados na anlise multivariada foram eficientes para separar os acessos de espinheirasanta.

116

6.5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALVES, R.M.; GARCIA, A.A.F.; CRUZ, E.D. et al. Seleo de descritores botnico-agronmicos para caracterizao de germoplasma de cupuauzeiro. Pesquisa Agropecuria Brasileira, v.38, n.7, p.807-818, 2003. ANDERSON, T.W. An introduction to multivariate statistical analysis. New York: John Wiley & Sons, 1958. 242p. apud CRUZ, C.D.; CARNEIRO, P.C.S. Modelos Biomtricos Aplicados ao Melhoramento Gentico. Viosa: Editora da UFV, 2003. 585p. BITTENCOURT, J.V.M. Variabilidade gentica em populaes naturais de Maytenus ilicifolia por meio de marcadores RAPD. Curitiba, 2000. 58p. Dissertao (Mestrado em Agronomia), Faculdade de Agronomia, UFPR, 2000. CARVALHO, F.I.F; LORENCETTI, C.; BENIN, G. Estimativas e implicaes da correlao no melhoramento vegetal. Pelotas: Ed. da UFPel, 2004. 142p. CARVALHO-OKANO, R. M. Estudos taxonmicos do gnero Maytenus Mol. emend. Mol. (CELASTRACEAE) do Brasil extra-amaznico. Campinas-SP. 1992. 253 p. Tese (Doutorado em Cincias Biologia Vegetal), UNICAMP, 1992. CARVALHO-OKANO, R.M.; LEITO FILHO, H.F. O gnero Maytenus Mol. emend. Mol. (Celastraceae) no Brasil extra-amaznico. In: REIS, M.S.; SILVA, S.R. (organizadores). Conservao e uso sustentvel de plantas medicinais e aromticas: Maytenus spp., espinheira-santa. Braslia: IBAMA, 2004. 204p. CRUZ, C.D. Programa Genes: aplicativo computacional em gentica e estatstica. Viosa: Editora da UFV, 2001. 648p. CRUZ, C.D.; CARNEIRO, P.C.S. Modelos Biomtricos Aplicados ao Melhoramento Gentico. Viosa: Editora da UFV, 2003. 585p. CRUZ, C.D.; REGAZZI, A.J. Modelos biomtricos aplicados melhoramento gentico. Viosa: Ed. da UFV, 2 ediao, 2001. 390p. ao

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DI STASI, L.C. Aspectos qumicos e farmacolgicos da espinheira-santa: uma anlise da utilidade dos dados. In: REIS, M.S.; SILVA, S.R. (organizadores). Conservao e uso sustentvel de plantas medicinais e aromticas: Maytenus spp., espinheira-santa. Braslia: IBAMA, 2004. 204p. MAGALHES, P.M.; FIGUEIRA, G.M.; PEREIRA, B.; et al. Conservao da espcie Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. (espinheira-santa) atravs da tcnica de propagao de sementes. Revista do Instituto Florestal, v.4, p.519-522, 1992. MARIOT, M.P.; BARBIERI, R.L.; SINIGAGLIA, C.; et al. Dissimilaridade entre gentipos de Maytenus ilicifolia (espinheira-santa) de uma populao do Rio Grande do Sul. In: II Congresso Brasileiro de Melhoramento de Plantas, 2326/04/2003. Anais. Porto Seguro, SBMP, 2003. CD Rom. MARIOT, M.P.; CORREA, F.; BARBIERI, R.L. Variabilidade para morfologia foliar em espinheira-santa. In: XIV Encontro de Geneticistas do Rio Grande do Sul, 12-14/07/2004. Anais. Canoas, ULBRA, 2004. CD Rom. MATHUR, S.; SHARMA, S.; KUMAR, S. Description of variation in the Indian accessions of the medicinal plant Centella asiatica (L.) Urban. Plant Genetic Resources Newsletter, n.135, p.47-52, 2003. MATHUR, S.; SHARMA, S.; GUPTA, M.M. et al. Evaluation of an Indian germplasm collection of the medicinal plant Bacopa monnieri (L.) Pennel by use of multivariate approaches. Euphytica, v.133, p.255-265, 2003. MOSSI, A. J. Variabilidade gentica e de compostos volteis e semivolteis em Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. So Carlos-SP, 2003. 101p. Tese (Doutorado em Cincias Ecologia e Recursos Naturais), Centro de Cincias Biolgicas e da Sade, Universidade Federal de So Carlos, 2003. NICOLOSO, F.T.; FORTUNATO, R.P.; ZANCHETTI, F.; et al. Recipientes e substratos na produo de mudas de Maytenus ilicifolia e Apuleia leocarpa. Cincia Rural, v.30, n.6, p.987-992, 2000. PERECIN, M.B.; KAGEYAMA, P.Y. Variabilidade isoenzimtica em populaes naturais de espinheira-santa Maytenus aquifolia Mart. e M. ilicifolia Mart. ex Reiss. e suas implicaes para o manejo da conservao. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.4, n.2, p.80-90, 2002. PERECIN, M.B.; STEENBOCK, W.; REIS, M.S. Gentica de populaes de espinheira-santa. In: REIS, M.S.; SILVA, S.R. (organizadores). Conservao e uso sustentvel de plantas medicinais e aromticas: Maytenus spp., espinheira-santa. Braslia: IBAMA, 2004. 204p. RACHWAL, M.F.G.; CURCIO, G.R.; MEDRADO, M.J.S. Desenvolvimento e produo de massa foliar de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia) a pleno sol, em cambissolo hmico no municpio de Colombo-PR. Boletim de Pesquisa Florestal, n.35, p.91-93, 1997.

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7. DISCUSSO GERAL

O fato da espinheira-santa ser uma espcie considerada ameaada, com prioridade para coleta e conservao (Vieira, 1999), e por apresentar alto valor medicinal para o tratamento de gastrite e lcera gstrica (Carlini, 1988), motivou o trabalho de resgate de germoplasma em populaes no Estado do Rio Grande do Sul. Foi ento implantado, na Embrapa Clima Temperado, um banco ativo de germoplasma de M. ilicifolia e M. aquifolium. As populaes em que foram realizadas coletas para este trabalho apresentavam poucos indivduos, tendo sido coletado o mximo de matrizes possvel, conforme proposto por Brown e Marshall (1995) e Morales (1999) em situaes em que as populaes so pequenas. Esta mesma recomendao descrita por Querol (1993) para espcies em risco de extino. Esta estratgia permite uma melhor representao dos genes que ocorrem com freqncias mais altas. As coletas iniciaram nos municpios da Metade Sul do Estado e terminaram na Regio Nordeste, acompanhando a tendncia das plantas de entrarem em estdio de maturao primeiro nos locais de maior latitude, o que tambm foi observado por Scheffer (2001). Este fato evidencia a influncia do fotoperodo na reproduo da espcie. A populao em que foi coletado o maior nmero de matrizes foi a 4, de Piratini, com um total de 24 indivduos. A distribuio de M. ilicifolia no estado bastante ampla e M. aquifolium, que de ocorrncia rara, ficou mais restrita Regio Nordeste do Estado. Os locais em que foram encontradas as matrizes de espinheira-santa eram na maioria campo e beira de mata, meio-sombreado ou ensolarado, diferente da ocorrncia relatada por Scheffer (2001), Mossi (2003) e Radomski et al. (2004). Os locais de ocorrncia de espinheira-santa descritos por estes

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autores referem-se a populaes em ambientes que no esto sujeitos s atividades agrcolas, ao contrrio dos locais em que foram feitas coletas para este trabalho, que eram, na maioria, propriedades rurais. A maioria das matrizes era arbustiva, sendo que as plantas que apresentavam maior estatura estavam localizadas na Regio Nordeste do Estado. Da mesma forma, as prognies mais altas so de acessos oriundos desta regio, o que, aliada elevada herdabilidade, evidencia a forte influncia do fator gentico sobre este carter. Scheffer (2001) tambm observou valores altos de herdabilidade para estatura de planta. Resultado semelhante tambm foi observado para o carter dimetro base do caule. Em avaliao do estdio de maturao dos frutos dentro de cada planta, foi observado que a maioria das matrizes era homognea. Entretanto, atravs da comparao entre plantas dentro da populao, ficou evidenciada uma variao quanto ao estdio de maturao dos frutos, o que tambm foi observado por Negrelle et al. (1999). Os autores observaram, ainda, a presena de flores e frutos com diferentes nveis de maturao num mesmo ramo. Esta caracterstica tambm foi observada neste trabalho, entretanto, em baixa proporo. Esta variao quanto ao estdio de maturao caracterstico de espcies silvestres. O conhecimento etnobotnico fundamental quando envolve plantas medicinais, pois o conhecimento tradicional considerado a base para seleo de plantas para anlise em laboratrio (Elisabetsky e Costa-Campos, 1996). Neste trabalho, foi observado que a maioria das pessoas que contriburam para o estudo etnobotnico, utiliza a espinheira-santa para problemas digestivos, o que coincide com a ao farmacolgica cientificamente comprovada para gastrite e lcera gstrica , o que no foi observado por Soares et al. (2004), para as mesmas espcies, em estudo etnobotnico realizado em So Joo do Polsine, RS. Nas propriedades em que foram realizadas as coletas era comum o uso da planta na forma de ch das folhas. O nome popular cancorosa foi o que predominou entre os informantes. Embora tenha aumentado o uso de recursos genticos conservados em bancos de germoplasma em programas de melhoramento, provvel que o nvel de utilizao ainda deva continuar sendo muito baixo (Morales, 1999). Segundo o autor, a utilizao de germoplasma somente dever aumentar se,

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alm das informaes de passaporte e outras de controle burocrtico, o material gentico disponibilizado apresentar informaes genticas e utilitrias, relacionadas com a adaptao ao ambiente, potencial gentico, conhecimento etnobiolgico, potencial industrial e scio-econmico. Fica claro, portanto, que os trabalhos em recursos genticos no podem se limitar coleta e conservao de germoplasma, mas caracterizao e estudos genticos que dem suporte para que os melhoristas escolham aqueles acessos que apresentam potencial gentico para utilizao nos programas de melhoramento. Neste trabalho, a caracterizao e os estudos genticos realizados em germoplasma de espinheira-santa com base em caracteres morfo-fisiolgicos fornecem informaes importantes para este propsito. Com relao caracterizao do germoplasma de espinheira-santa, foram avaliados caracteres morfolgicos nas matrizes, e morfolgicos e fisiolgicos nas prognies, tendo sido identificada variabilidade para todos os caracteres analisados. Estas avaliaes permitiram realizar estudos de divergncia gentica atravs de anlises multivariadas. As anlises de dissimilaridade mostraram resultados diferenciados para matrizes e prognies. Enquanto na avaliao das matrizes os acessos mais similares foram o 106 e 107, e os mais dissimilares, o 57 e o 91, nas prognies, os mais similares foram o 61 e o 78, e os mais dissimilares, o 1 e o 90. A nica concordncia foi que, em ambas as anlises, a maior dissimilaridade foi entre um acesso de M. ilicifolia e outro de M. aquifolium, oriundo de Farroupilha. Dentre os caracteres avaliados, apenas os referentes morfologia foliar foram utilizados tanto para matrizes quanto para prognies. importante destacar a influncia do fator ambiente, que foi mais importante nas avaliaes das matrizes, pois envolveram populaes em diferentes locais, enquanto as prognies foram avaliadas em um experimento com delineamento, em apenas um local. Alm disso, as matrizes apresentam idades diferenciadas entre si e esto em um estdio de desenvolvimento diferente do que o das prognies. Enquanto que, para as matrizes, a anlise de dissimilaridade foi realizada com base na distncia euclidiana devido a ausncia de delineamento experimental , para as prognies, foi atravs da distncia de Mahalanobis. Esta ltima mais importante, pois leva em considerao as varincias e covarincias residuais que existem entre as caractersticas avaliadas (Cruz e Carneiro, 2003).

122

O agrupamento dos acessos com base nas avaliaes das matrizes e das prognies foi diferente. Enquanto para as matrizes houve a formao de sete grupos, para as prognies foram formados apenas trs grupos, o que no permite evidenciar uma grande variabilidade gentica, pelo menos para os caracteres analisados. Alm dos fatores relacionados ao ambiente e diferenas quanto ao estdio de desenvolvimento das plantas descrito anteriormente, importante destacar que, para as prognies, foram avaliados 16 caracteres e, para matrizes, apenas sete, o que contribui para explicar os agrupamentos diferenciados. O carter estatura de planta aos 360 dias foi o que mais contribuiu para a divergncia gentica nas prognies, enquanto que, para as matrizes, o nmero de espinhos por folha foi o mais importante para explicar a variao. Pela estatstica de Singh (1981), a contribuio relativa do carter nmero de espinhos por folha nas matrizes foi maior (65,43%) do que da varivel estatura de planta aos 360 dias para as prognies (47,27%). Atravs da anlise discriminante de Anderson (1958), foi observado que o agrupamento dos acessos com base em caracteres avaliados nas prognies foi mais consistente do que o agrupamento com base em caracteres avaliados nas matrizes, o que era esperado, pelo maior nmero de caracteres avaliados e pelo fato das prognies terem sido avaliadas com a utilizao de delineamento experimental. Nas prognies, 98,88% dos acessos foram agrupados corretamente, enquanto que, nas matrizes, este ndice foi de 89,52%. Este fato refora a importncia de se utilizar um maior nmero de caracteres para anlise da divergncia. Apesar da maior importncia da distncia de Mahalanobis para separao dos acessos, quando se trata de avaliaes em bancos de germoplasma, em situaes em que no se dispe de dados com repeties, ou que no se tem um delineamento experimental, a distncia euclidiana a mais empregada em estudos de divergncia gentica e para agrupamento dos acessos (Carvalho et al., 2003). Esta situao corresponde avaliao das matrizes realizada neste trabalho. Em ambas as anlises foi evidenciado o agrupamento de acessos de M. ilicifolia e M. aquifolium em um mesmo grupo, o que foi mais intenso na avaliao das prognies, em que apenas um acesso (90) de M. aquifolium foi separado, entretanto, com a possibilidade de se agrupar com o acesso 76 (M. ilicifolia), de acordo com a anlise discriminante de Anderson (1958). Este fato

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mostra que existe uma proximidade gentica entre as duas espcies de espinheira-santa, como tambm observado por Perecin e Kageyama (2002), ao identificarem o compartilhamento de alelos entre M. ilicifolia e M. aquifolium atravs de anlise de isoenzimas, e por Mossi (2003), em estudo utilizando marcadores do tipo RAPD. O acesso 110 foi o nico da espcie M. aquifolium que ficou separado, em um grupo a parte, no agrupamento dos acessos, com base na avaliao das matrizes. Entretanto, na avaliao das prognies, este mesmo acesso ficou no grupo maior, em que predominam acessos de M. ilicifolia. No foi evidenciada uma separao das populaes de acordo com a localizao geogrfica, o que tambm foi observado por Mossi (2003) em anlise de agrupamento com base na composio qumica de espinheirasanta. Entretanto, este mesmo autor observou que agrupamentos formados com base em marcadores do tipo RAPD estavam relacionados com as caractersticas de ambientes de ocorrncia de M. ilicifolia. No agrupamento com base nas mdias das populaes, foi evidenciada uma separao das populaes constitudas somente por acessos de M. ilcifolia daquelas constitudas exclusivamente por acessos de M. aquifolium. Assim, as populaes 18 (acesso 90) e 19 (acesso 91) foram agrupadas juntas e a populao 27 (acesso 112) ficou em um grupo a parte. Todas pertencem espcie M. aquifolium e foram as mais divergentes. A populao 25, entretanto, que composta por um acesso de M. aquifolium (110) e seis de M. ilicifolia, foi agrupada junto com populaes de M. ilicifolia. A utilizao da mdia das populaes para a estimativa dos ndices de dissimilaridade para posterior anlise de agrupamentos explica os resultados encontrados para o agrupamento das populaes. A alta variabilidade gentica intrapopulacional, caracterstica de espcies algamas, foi observado em espinheira-santa por Bittencourt (2000) e Mossi (2003), atravs de anlise com marcadores do tipo RAPD e por Scheffer (2001), Perecin e Kageyama (2002) e Steenbock (2003), atravs de anlise de isoenzimas. Esta alta variao intrapopulacional explica a no formao de grupos especficos com acessos de uma mesma populao nas anlises de agrupamento, como foi observado neste trabalho. A alta herdabilidade observada para todos os caracteres no teste de prognies evidencia o forte controle do fator gentico sobre o fentipo. Os

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coeficientes de variao genticos (CVG) foram altos para todos os caracteres exceto para dias da semeadura emergncia , o que explicado pelo fato dos acessos serem oriundos de populaes de diversos locais, o que promove uma ampliao da variabilidade gentica, como tambm observado por Sebbenn et al. (1998), ao avaliarem a estatura de planta em cabreva (Myroxylon peruiferum). Estes altos valores para CVG, aliados aos baixos valores para os coeficientes de variao devido ao erro experimental (CVE),

proporcionaram ndices maiores que 1,0 para o quociente b em todas as

variveis analisadas, o que, de acordo com Vencovsky e Barriga (1992), um bom indicador para seleo em prognies de irmos maternos. Este resultado importante para a seleo com base em caracteres relacionados com o crescimento, pois a espinheira-santa considerada de crescimento lento (Magalhes, 1992; Rachwal et al., 1997; Nicoloso et al., 2000). Existe uma grande variabilidade para caracteres de morfologia foliar em espinheira-santa, o que tambm foi observado por Radomski e Scheffer (2004) em trabalho desenvolvido com M. ilicifolia. As autoras identificaram nove morfotipos de espinheira-santa, com base na morfologia foliar. Ficou evidenciada, neste trabalho, a grande importncia dos caracteres relacionados morfologia foliar para a divergncia entre os acessos de espinheira-santa, com base na avaliao das matrizes. importante salientar que esta variao entre os acessos fenotpica, pois no foi possvel identificar a contribuio da variao gentica e do ambiente na avaliao das matrizes. O nmero de espinhos por folha e o comprimento de folha foram os que mais contriburam para divergncia nesta anlise, respectivamente com 65,43% e 14,58%. Entretanto, na avaliao das prognies, a contribuio destes caracteres foi muito baixa. Este fato no descarta a importncia da utilizao dos caracteres de morfologia foliar para caracterizao de acessos de espinheira-santa, pela alta variabilidade que apresentam e pela possibilidade, conforme observado por Buffa Filho et al. (2002), de associao com a presena e concentrao de metablitos secundrios, como os triterpenos. O tamanho de folha e o nmero de folhas por planta em espinheira-santa, caso apresentem relao com o aumento da biomassa e maior concentrao de metablitos secundrios que tenham ao farmacolgica, podem ser caracteres importantes de se considerar na seleo em programas de melhoramento. Os altos valores para

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 herdabilidade e para o ndice b evidenciados neste trabalho mostram a

eficincia na seleo para estes caracteres. Foi observado que os acessos de M. aquifolium apresentam maiores valores para os caracteres de morfologia foliar, principalmente para comprimento de folha e nmero de espinhos por folha, tanto na avaliao das matrizes quanto das prognies. Este fato, aliado elevada herdabilidade apresentada, evidencia que o fator gentico exerce um forte controle sobre o fentipo para estes caracteres. Entretanto, foi destacado por Bernardi e Wasicki (1959) apud Steenbock et al. (2003), Steenbock et al. (2003) e Radomski et al. (2004) a influncia do sombreamento e exposio solar sobre a morfologia foliar em M. ilicifolia. Segundo estes autores, quando expostas luz solar, as folhas so menores do que em condies de sombreamento. Neste trabalho, as mudas ficaram em condies de sombreamento atravs do uso de sombrite 50% por aproximadamente 30 dias, da emergncia at a entrada na casa-de-vegetao, ficando a maior parte do tempo expostas ao sol. No foi evidenciada a formao de folhas menores por estarem nesta condio. Talvez este fato esteja relacionado com o estdio de desenvolvimento das plantas. Seria necessrio um experimento para avaliar os caracteres de morfologia foliar em diferentes condies de sombreamento e exposio luz solar total, em vrios estdios de desenvolvimento das plantas, para maior consistncia quanto ao efeito destes fatores em folhas de espinheira-santa. Os resultados apresentados neste trabalho mostram a eficincia do processo de conservao ex situ de espinheira-santa em banco de germoplasma. Atravs da manuteno in vivo de acessos no campo, parte da variabilidade gentica de M. ilicifolia e M. aquifolium do Rio Grande do Sul est sendo preservada. Alm disso, informaes genticas importantes relativas caracterizao morfo-fisiolgica foram obtidas, o que contribui para o conhecimento da variabilidade gentica existente, bem como para futuros programas de melhoramento destas espcies.

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8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS (Introduo Geral e Discusso Geral)

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Anexo I - Planilha de coleta de recursos genticos de espinheira-santa. Pelotas/RS, UFPel 2005.

Tipologia do local ( I Taxonomia Espcies: Maytenus ilicifolia e M. aquifolium Famlia: Celastraceae Data da coleta: _______________ Entrada n: __________________ Nome local: _________________ IV Caractersticas do material Hbito de crescimento ( ) 1-arbrea 2-arbustiva 3-semi-arbustiva VI Usos Uso principal ( ) - parte da planta ( ) Uso secundrio ( ) - parte da planta ( ) Uso 1-medicinal 2-industrial 3-ornamental 4-cerimonial 5invasora 6-nenhum 7-Outros Parte da planta 1-semente 2-flor 3-fruto 4-talo 5-folha 6-raiz 7-crtex 8planta inteira 9-nenhuma 10-outras Avaliaes das matrizes Altura:__________ Dimetro do caule:______ Cor do fruto:_________ Outras: _____________ Uso medicinal especfico e forma de uso ________________ ________________ ________________ VII-Coleta Material coletado e quantidade ( )____ ( )_____ 1-semente 2-fruto 3-estaca 4-planta inteira 5-outros V Informante Atividade ( ) 1-Agricultor 2-Bilogo 3-Melhorista,eng. agr 4-curandeiro 5-mdico 6-habitante Caractersticas ( ) 1-No agricultor 2-pequeno agricultor 3-mdio agricultor 4-fazendeiro Propriedade da terra ( ) 1-posseiro 2-proprietrio 3-arrendatrio 4-outros Relao produo/mercado ( ) 1-Subsistncia 2-mista 3-100% comercial 4-no produz para mercado II Geografia Local de coleta: Municpio: ______________ Latitude: _______________ Longitude: ______________ Altitude: ________________ III Ecologia Orografia ( ) ) Tipo de solo ( 1-Arenoso 2-Lodoso 3-Argiloso 4-Orgnico 5-Pedregoso 6-Outros Insolao ( ) 1-Ensolarado 2-Meio sombreado 3-Sombreado 4-Outros )

1-Plano 2-Topo 3-Encosta 4-Topo arredondado 5-Declive ngreme 6-Declive mdio 7-Terrao 8-Declive suave 9-Depresso aberta 10-Depresso fechada 11-Outros (especificar)

1-Campo 2-Beira de caminho 3-Beira de gua doce 4-Pntano 5-Beira de mata 6-Pastagem 7-Interior de mata 8-Jardim 9-Horta familiar 10-Depresso fechada 11-Pomar 12-Outros (especificar)