INSEMINACIN ARTIFICIAL EN CUNICULTURA

DEPARTAMENTO I+D+I

INSEMINACIN ARTIFICIAL EN CUNICULTURA

INTRODUCCIN 1- INSTALACIONES Y ANIMALES 1.1 LABORATORIO 1.2 DEPARTAMENTO DE MACHOS 1.3 HIGIENE Y PROFILAXIS EN EL DEPARTAMENTO DE LOS MACHOS 1.3.1 Barrer, desinfectar, desinsectar, antimictico, quemar pelo y eliminacin de cadveres 1.3.2 Vaco sanitario y/o limpieza de jaulas 1.3.3 Extraccin de estircol 1.4 MANEJO DE LOS MACHOS 1.4.1 Alimentacin 1.4.2 Condiciones ambientales 1.4.3 Ubicacin y momento de extraccin 1.4.4 Controles sanitarios peridicos de los machos 1.4.5 Otras operaciones sanitarias 2- PREPARACN DE LAS DOSIS 2.1 VAGINA ARTIFICIAL 2.2 OBTENCIN DE LOS EYACULADOS 2.3 CONTRASTACIN SEMINAL 2.3.1 Valoraciones de rutina y procedimientos 2.3.2 Otras valoraciones en los centros de inseminacin 2.3.3 Valoraciones en laboratorios de apoyo 2.4 PREPARACIN DE LAS DOSIS PARA EL TRANSPORTE 2.5 ENTREGA DE LAS DOSIS 2.5.1 Clientes que inseminan sus propias conejas 2.5.2 Clientes que no inseminan sus propias conejas 2.6 APLICACIN DE LAS DOSIS 2.6.1 Sujecin 2.6.2 Inseminacin 2.6.3 Inoculacin de la hormona 3- SINCRONIZACIN DE LAS CONEJAS 3.1 Sincronizacin del celo 3.1.1 Sistemas hormonales 3.1.2 Sistemas de manejo 3.2 Induccin de la ovulacin

4- FACTORES DE INFLUENCIA EN LOS RESULTADOS EN I.A. 4.1 RAZA 4.2 ESTADO CORPORAL Y SANITARIO DE LA HEMBRA 4.3 RECEPTIBIDAD DE LA HEMBRA 4.4 CALIDAD SEMINAL 4.5 INSEMINADOR 4.6 CONDICIONES AMBIENTALES

INTRODUCCIN La produccin intensiva de conejo es bastante joven en comparacin con la produccin de cerdos, aves y ganado bovino. La cunicultura industrial se inicia a finales de los aos 70. Los 25 estados miembros de la UE producen 520000Tm de carne de conejo, cifra que representa el 50% de la produccin mundial. Italia (215000Tm), Espaa (120000Tm) y Francia (75000Tm) producen el 80% de dicha produccin. En Espaa el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin empieza a realizar encuestas nacionales referidas al sector cunicola a partir de 1984. Y empezamos a encontrar referencias sobre el uso de la inseminacin artificial (IA) en la encuesta de 2003. Actualmente las explotaciones cunicolas espaolas se caracterizan por ser de gran tamao (de 400 a ms de 800 plazas) y estar especializadas. En Espaa se calcula que hay 2680000 madres. El incremento del tamao y la especializacin de las explotaciones han dado lugar a la aparicin de un nuevo sistema de manejo reproductivo llamado MANEJO EN BANDAS, el uso del cual requiere en muchos casos de la IA. La organizacin reproductiva en bandas consiste en la agrupacin de las cubriciones o inseminaciones del conjunto de hembras reproductoras en un da determinado, esto permite alojar juntas a hembras que se encuentran en un mismo estado fisiolgico. Este sistema requiere de la sincronizacin del celo de las hembras y de la induccin de la ovulacin. La organizacin reproductiva en bandas y la IA posibilitan una mejora de la productividad de las explotaciones, ya que permiten reducir el tiempo dedicado a la reproduccin, una de las labores ms complejas en la produccin cuncola. El manejo en bandas reduce el tiempo invertido al ao por hembra y permite realizar vacos sanitarios regularmente. La inseminacin artificial tambin permite reducir el tiempo dedicado a la hembra e incrementar la disponibilidad de jaulas para madres hasta un 10%. Adems la IA se ha convertido en una importante herramienta de difusin gentica.

1.- INSTALACIONES Y ANIMALES 1.1. Laboratorio El laboratorio tendr que estar sealizado con carteles y seales especficas referidas al uso de ropa adecuada (bata y zapatos), uso de pediluvio, La ropa de trabajo OBLIGATORIA en el laboratorio es la bata. La temperatura de trabajo estar alrededor de 25C. Estar prohibida la entrada al laboratorio de cualquier material que haya estado en la sala de machos, a excepcin de los tubos de recogida de eyaculados. Todos los residuos producidos a lo largo de la sesin de trabajo se depositaran en los contenedores para residuos biolgicos que se tengan contratados a un gestor de residuos. Ser importante llevar un registro del adecuado funcionamiento de los equipos (neveras, cmaras de conservacin, pH-metros, ) 1.2. Departamento de machos La sala de machos estar equipada con ventilacin forzada, calefaccin y coolings. Sera interesante tener un registro de temperatura y humedad diario. Los animales antes de entrar en la sala de machos pasarn un periodo de cuarentena. En la sala de machos estarn alojados en jaulas de reposicin o de produccin. Para entrar en la sala de machos ser OBLIGATORIO el uso de batas especficas para estos locales y calzado adecuado. En la entrada de la sala se colocar un pediluvio impregnado de solucin desinfectante. La sala de machos y el laboratorio estarn conectados por una doble ventada, por la que se introducirn los eyaculados. 1.3 Higiene y profilaxis en el departamento de los machos 1.3.1 Barrer, desinfectar, desinsectar, antimictico, quemar pelo y eliminacin de cadveres Estas operaciones se realizaran acorde a una planificacin descrita por el centro. A modo de ejemplo:
LUNES Barrer Desinfectar Quemar pelo Desinsectar Antimictico Eliminar cadveres MARTES MIERCOLES JUEVES VIERNES SBADO

- Barrer, desinfectar y eliminar cadveres son tareas que se realizarn diariamente. - Quemar pelo y desinsectar se realizaran dos veces por semana. La frecuencia de la desinsectacin depender de la poca del ao. - La administracin de antimictico se realizar una vez por semana.

1.3.2 Vaco sanitario y/o limpieza de jaulas Estas operaciones se realizaran acorde a las instrucciones del centro. A modo de ejemplo: - Se eliminar todo el pienso que quede en los comederos, se retirarn los reposa patas y se quemar el pelo de las jaulas y la nave. - Se aplicarn los productos de limpieza desincrustante y/o espuma de limpieza enzimtica (ej. TASHIA al 1-1.5% y ENZIMUS al 1%, respectivamente). stos se dejarn actuar 30 minutos y se aclararn con agua: - Se limpiaran los depsitos y tuberas de agua con leja, dejando actuar la leja unas horas. La eliminacin de la leja se realizar mediante aclarado con agua. El clarado finalizar cuando obtengamos agua limpia sin olor a leja. - Se desinfectarn las jaulas y la nave con algn producto apto (ej. GERMIFIN 10cc/l). 1.3.3 Extraccin de estircol A poder ser la limpieza ser diaria. 1.4. Manejo de los machos 1.4.1 Alimentacin Los machos se alimentaran con pienso comercial. La racin ser restringida a 180g/da y agua ad limitum. Se podr complementar la racin con un suplemento alimenticio una vez al mes. 1.4.2 Condiciones ambientales El ambiente de la sala de machos (luz, temperatura, humedad y ventilacin) tendr que estar controlado. - Fotoperodo de 16 horas de luz. - Temperatura controlada, la temperatura de confort se encuentra alrededor de 21C. El rango de temperaturas podr oscilar entre 15-28C. - Humedad controlada, el rango de humedad relativa se encuentra entre 50% y 60%. El rango de humedad relativa podr oscilar entre 55-80%. - Ventilacin del aire entre 20-40 cm/segundo 1.4.3 Ubicacin y momento de extraccin Des de los 2 meses de edad hasta los 5 meses los machos se alojarn en jaulas de reposicin. A partir de los 4.5 meses, los animales que superen una revisin sanitaria exhaustiva, se alojarn en jaulas de produccin. De los 5 meses a los 6-7 meses los machos sern entrenados para eyacular con vagina artificial. Este periodo servir para evaluar la aptitud y calidad seminal de los machos. En torno a un 10-30% de los machos no son tiles por diversas circunstancias entre las ms importantes se encuentran la inadaptacin a la vagina y una baja produccin y calidad del semen.

1.4.4 Controles sanitarios peridicos de los machos Se realizar un control peridico del sistema respiratorio y digestivo, de la existencia de mal de patas y la presencia de estafilococos. Segn el estado de los animales se proceder al tratamiento de los sntomas o a su sacrificio. Se registrar el tratamiento, anotando el producto aplicado, la dosis y el animal. Las vas de aplicacin sern normalmente las que se detallan a continuacin: - va tpica, sustancias aplicadas en la piel - va enteral, sustancias aplicadas a travs del tubo digestivo (administracin por la boca o por el ano) - va parenteral, sustancias administradas a travs de la piel y/o mucosas (intradrmica, subcutnea, intramuscular, intravenosa) Los animales que se sacrifiquen o que hayan muerto tendrn que ser registrados. En el registro se apuntar la fecha, el animal y la razn de baja. 1.4.5 Otras operaciones sanitarias a- Desparasitar: El tratamiento contra parsitos internos se realizar administrando el producto (ej. VERMIPRAZOL o PANACUR) al agua de bebida y segn prescripcin del veterinario. b- Vacunaciones contra Mixomatosis y VHD: Todos los animales de reposicin sern vacunados contra la Mixomatosis con la vacuna de Mixomatosis heterloga. Das despus, los mismos animales, sern vacunados contra VHD. Los reproductores se revacunarn de Mixomatosis tres veces al ao. 2- PREPARACIN DE DOSIS Dentro de lo que es el trabajo propiamente dicho de extraccin debemos centrar nuestra atencin en obtener los eyaculados de la manera ms higinica y rpida posible, para ello, lo ideal es disponer de tantas vaginas como eyaculados obtengamos al da, al igual que deberemos contar con el nmero adecuado de tubos colectores. Si cada eyaculado es obtenido con una vagina artificial diferente, no habr contacto posible entre machos, por lo que las condiciones sanitarias sern optimas. Esto unido a medicaciones peridicas, harn que la carga bacteriana de los sementales sea mnima. Peridicamente se enviarn muestras a un laboratorio externo para efectuar un control de los eyaculados. Se realizar un anlisis microbiolgico estndar ms clamdias, micoplasmas y virus, segn instrucciones del veterinario. 2.1. Vagina artificial El uso de vagina artificial es el mtodo ms utilizado para la recogida del semen en conejo. Los modelos de vagina artificial ms utilizados constan en general de un cuerpo semi-rgido y un revestimiento interno o camisa (ltex o goma). El cuerpo semi-rgido presenta dos

oberturas de diferente tamao en la parte inferior, la obertura ms grande servir para colocar el tubo colector de eyaculado mientras que la ms pequea servir para llenar de agua la vagina. En el mercado existe un modelo de goma que se presenta como un cuerpo rgido con un nico orificio por el que se adapta el tubo colector. Este modelo, an teniendo la ventaja de evitar la presencia de agua en el momento de la extraccin, no ha tenido mucho xito debido a que conserva durante poco tiempo la temperatura.

La temperatura que mejor se adapta a la coleccin del semen es de 45-50 C. Para lograr este rango de temperaturas las vaginas, se almacenaran en una estufa a 55-60 C antes de su uso, ya que preparamos el macho y ste decide saltar sta caer unos 10C. Si la temperatura es demasiado baja el macho rehusar el salto. Por otro lado, si la temperatura es demasiado elevada, caemos en el riesgo de que el macho orine, contaminando el semen, o bien se produzca una balnitis por quemadura. El eyaculado se produce tanto por el estmulo de comprensin como por temperatura, y uno no sustituye al otro. Cuando llenamos la vagina cuidaremos especialmente la presin del agua que introducimos entre el material y el ltex. 2.2. Obtencin de los eyaculados La extraccin del semen, al igual que la monta natural, se realiza en la jaula del macho. Para la recuperacin de los eyaculados se puede usar una hembra como maniqu, tambin se podr utilizar el brazo de la persona encargada de hacer la extraccin siempre que esta tenga experiencia suficiente. El ritmo de extraccin normalmente utilizado es de dos extracciones por macho y semana (ritmo extensivo) con un intervalo de 15-20 minutos entre extracciones. En caso necesario se pueden realizar hasta 4 extracciones por semana (ritmo intensivo), dos das por semana y dos extracciones por da.

El tubo de recogida de los eyaculados ser un tubo de ensayo de plstico de un solo uso. La entrada de los tubos al laboratorio se har a partir de una ventada que conecta la sala de machos con el laboratorio.

2.3 Contrastacin seminal La contrastacin seminal se va a realizar a tres niveles: valoraciones de rutina en el centro, otras valoraciones en el centro y valoraciones en laboratorios de apoyo. 3.3.1 Valoraciones de rutina y procedimientos Lo primero que hacemos es introducir el semen en el Bao Mara a 37C, de esta manera evitamos el mayor riesgo para la viabilidad del semen, que son los choques trmicos. a- Valoracin macroscpica: Consiste en realizar una observacin visual y en determinar el aspecto, el color, el olor y el volumen.

1- Aspecto: el eyaculado puede presentar tapioca o tapn mucoso, orina, depsitos de carbonato clcico y sangre. 2- Color: el color ideal es blanco nacarado, que nos dar una imagen de densidad, el siguiente grado, ser blanco lechoso, y el tercero blanquecino semitransparente de aspecto poco denso. Tambin puede adquirir un color crema.

3- Olor: lo nico que requerimos es que no sea desagradable. Ser importante registrar si el macho no monta o si no se obtiene eyaculado despus de la monta. 4- Volumen: el volumen se medir mediante un tubo de ensayo graduado despus de haber eliminado la tapioca. b- Diluyente: Inmediatamente despus el eyaculado libre de orina, sangre y precipitados de carbonato clcico se diluir 1:5 en el mismo tubo de recogida.

Existen en el mercado diferentes tipos de diluyentes. As, podemos hablar de diluyentes lquidos (ej. CUDIL), diluyentes en polvo o diluyentes en gel. El primero y el tercero tendrn que conservarse en la nevera, el segundo podr conservarse en un lugar fresco resguardado de la luz.

Antes de empezar la sesin de trabajo el diluyente se calentar a 37C en un bao mara. En la etiqueta del envase se apuntar la fecha de llegada al centro. El lote del diluyente se anotar en el registro de la produccin diaria de dosis. c- Valoracin microscpica: El microscopio estar equipado con una platina calefactora y atemperado a 37C. Tambin se dispondr de una placa calefactora para mantener los portaobjetos y cubreobjetos a 37C.

Se valoraran 4-5 campos de cada eyaculado. Las variables a evaluar sern: 1- Motilidad individual (***).- visin del movimiento progresivo rectilneo de los espermatozoides. La motilidad est correlacionada positivamente con la concentracin y el porcentaje de espermatozoides viables y negativamente con el porcentaje de formas anormales. El valor de esta variable, adems, va a depender de la temperatura de evaluacin y del tipo de diluyente. La observacin se podr realizar utilizando un microscopio de contraste de fase a 400 aumentos. Tambin se podr utilizar un microscopio de campo claro a 100 aumentos, en este caso la observacin se har mediante una cmara conectada a una pantalla de ordenador. Normalmente la valoracin se realiza de manera subjetiva a partir de una escala arbitraria de 10 niveles, registrando de 1 a 5. Actualmente existen sistemas ms objetivos para la evaluacin de la motilidad, son los llamados sistemas CASA. A pesar del anlisis objetivo que aportan estos sistemas, su uso no se ha generalizado debido a su elevado coste y a la necesidad de una buena estandarizacin y validacin de las mediciones. La eficacia y precisin de estos sistemas depender de la experiencia de los usuarios, del procesado inicial de las muestras y de la calibracin, validacin y estandarizacin del equipo. En la siguiente tabla se indica la equivalencia de la escala subjetiva y el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva.
Escala subjetiva 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 % Espermatozoides con motilidad progresiva 0% 1-10% 11-20% 21-30% 31-40% 41-50% 51-60% 61-70% 71-80% 81-90% 91-100%

2- Concentracin subjetiva.- se valora a partir de una escala arbitraria de 10 niveles, registrado de 1 a 5. 3- Espermatozoides muertos. Valorado con S (1) y No (0).

4- Aglutinados. Valorado con S (1) y No (0). 5- Sucio. Valorado con S (1) y No (0). 6- Restos. Valorado con S (1) y No (0) . 7- Formas anormales. Valorado con S (1) y No (0). 8- Gota citoplasmtica. Valorado con S (1) y No (0). 9- Movimientos raros. Valorado con S (1) y No (0). d- Eleccin de los eyaculados: Una vez realizadas las valoraciones se rechazaran los eyaculados que presenten las siguientes caractersticas: - alto nivel de suciedad y restos - motilidad individual < 2.5 - concentracin subjetiva <2 - espermatozoides muertos >50% - formas anormales ms presencia de gota citoplasmtica >20% Los eyaculados que superen estos niveles se unirn en un nico pool con el que se prepararn las dosis de inseminacin. La mezcla se realiza normalmente en botellas de vidrio Pirex de 250-500cc., que antes se habrn aclarado con diluyente. e- Medida objetiva de la concentracin: La medida objetiva de la concentracin se realizar sobre el pool de eyaculados. El contaje se puede realizar a partir de dos mtodos. 1- Cmara Thoma (u otra similar) La utilizacin de la cmara de Brker nos permite, adems de conocer la concentracin, determinar la presencia de formas anormales de los espermatozoides como son las gotas citoplasmticas proximales o distales y las colas en ltigo. El procedimiento es el siguiente: - Se realizar una dilucin 1:10 del pool: se aaden en un eppendorf 100l del pool ms 100l de glutaraldheido 2% ms 800l de diluyente. Si la lectura la de concentracin es inmediata la dilucin se puede hacer con agua: 100l del pool ms 900l de agua. - Acto seguido se toma una gota de la dilucin con una pipeta Pasteur para llenar la cmara de contaje que ha sido previamente montada. Se sita la pipeta entre el cubre y la cmara dejando que esta se llene por capilaridad y se deja reposar por espacio de un par de minutos tras los cuales se coloca en el microscopio.

- Una vez en el microscopio, es aconsejable colocar primero el objetivo 10x con objeto de localizar y situar la retcula y posteriormente pasar al 40x para contar los espermatozoides. - Se contaran 40 cuadros (dos diagonales) de cada una de las dos zonas de contaje de la cmara. El contaje se realizar con un microscopio de campo claro a 400 aumentos. Se contabilizarn aquellos espermatozoides cuyas cabezas se encuentren dentro de los cuadros y las que toquen los bordes superior o derecho, as como las esquinas superior e inferior derechas.

Cmara de Thoma
= 4 spz

- Clculo de la concentracin del pool 1:5 .1) N spz / 80 casillas * 1 casilla / 2.5x104 mm3 * 103 mm3 / 1 cm3 2) {(Diagonal 1 + Diagonal 2 + Diagonal 3 + Diagonal 4) / 2} La concentracin total se obtendr multiplicando por 5 la concentracin obtenida del pool. 2- Ncleo Counter SP100 El procedimiento es el siguiente: Se realizar una dilucin 1:20 del pool: se aaden en un eppendorf 50l del pool ms 1000l de reactivo SP-100. Seguidamente se carga el cassette de lectura, se introduce en el Ncleo Counter y se lee la muestra. El resultado corresponde directamente a la concentracin del pool. La concentracin total se obtendr multiplicando por 5 la concentracin obtenida del pool. 3) En algunas ocasiones en lugar de calcular la concentracin objetiva y diluir el pool a una concentracin fija, se pueden diluir los eyaculados en funcin de su calidad y despus realizar el pool: 1. Eyaculados de gran motilidad y alta concentracin, les asignaremos las ms altas diluciones, segn autores hasta 1/15. Nosotros recomendamos diluciones mximas 1/10, es decir, por cada parte de semen, 9 de diluyente siempre atemperado. 2. Eyaculados con buena motilidad: Dilucin 1/8. 3. Eyaculados con motilidad >= 75% con poco oleaje. Dilucin 1/6. f- Dilucin definitiva y conservacin: Las dosis de inseminacin son de 0.5ml por coneja, cada dosis tendr que contener un mnimo de 15x106 spz.

Conociendo el volumen del pool y su concentracin se puede calcular el volumen final del pool teniendo en cuenta que la concentracin final de este ha de ser de cmo mnimo 30x106 spz/ml. - Clculo de las dosis a elaborar: Volumen pool x Concentracin pool = Volumen final x Concentracin final Volumen final = Volumen pool (ml) x Concentracin pool (spz/ml) 30x106 (spz/ml) El volumen de diluyente que necesitaremos aadir ser el resultado de restar volumen final menos volumen del pool. Volumen final x 2 = Dosis producidas Ej.: Partimos de un volumen del pool de 250 ml con una concentracin del pool de 60x106 (spz/ml). La concentracin final que deseamos es de 30x106 spz/ml Volumen final = (250 x 60x106)/ (30x106) = 500ml Dosis totales producidas = 500 x 2 = 1000 dosis Volumen de diluyente a aadir = 500 - 250 = 250ml El diluyente se tendr que aadir suavemente y tendr que estar a una temperatura similar a la del pool. Una vez el pool se ha diluido a la concentracin final se coger una muestra para realizar una lectura de la motilidad individual del pool. Inmediatamente despus de la dilucin definitiva el semen se guarda en la cmara de conservacin a 18C. 2.3.2 Otras valoraciones en los centros de inseminacin Esta valoraciones normalmente se realizan sobre el pool de eyaculados y sobre machos jvenes. En el primer caso son unas medias que se pueden valorar a posteriori y sirven para tener informacin adicional sobre la calidad del pool. En el segundo caso sirven para ampliar la batera de variables para la valoracin de su calidad seminal. a- Viabilidad y normalidad morfolgica: Este test se realiza a partir de una tincin vital. La tcnica se basa en la capacidad que tiene la membrana plasmtica del espermatozoide de evitar la incorporacin de determinados colorantes cuando se encuentra ntegra. Existen varios tipos de tincin (ej. Eosina-Nigrosina, Tripn Azul, ). Para la realizacin de este test se mezclar una gota muestra (pool o eyaculado) con una gota de colorante, se realizar una extensin de la muestra sobre un portaobjetos y se dejar secar al aire. La valoracin

se realizar sobre 150 espermatozoides con un microscopio de campo claro a 1000 aumentos b- Test de endosmosis celular (HOST, hiposmotic swelling test) (integridad funcional de la membrana) Este es un test de funcionalidad espermtica. Evala la integridad de la membrana plasmtica, mediante el mtodo de Jeyendran y col. (1984) para espermatozoides humanos. En conejo Bled y col. (2007) y Amorim y col. (2008) evalan la prueba hipoosmtica en semen fresco de conejo. El test se basa en la capacidad de responder a cambios osmticos que tienen los espermatozoides. Dicha capacidad est relacionada con la capacidad funcional de la membrana (funcionamiento de los canales inicos, intercambiador Na+/H+, ). As pues, estas clulas sometidas a un medio hipoosmtico incorporaran agua del medio mientras que si el medio es hiperosmtico liberarn agua al exterior. Este comportamiento se dar siempre y cuando la membrana del espermatozoide no presente daos. La prueba de endosmosis consiste en someter a los espermatozoides a un medio hipoosmtico (60 mOsm/Kg). Si la clula presenta intactas sus membranas se producir una entrada de agua desde el medio que quedar incorporada en la cola, permaneciendo sta hinchada y enroscada. El resultado de este test ser entonces la proporcin de los espermatozoides con cola enrollada respecto el total de espermatozoides contados. % endsmosis = (n spz. enrollamiento de la cola / total de spz. contados) * 100

Diferentes subtipos de respuesta identificados por Jeyendran y col. en la especie humana (J. Reprod. Fertil., 70:219, 1984.)

Para la realizacin de esta tcnica test se procede de la siguiente manera:

- Se incuban 50l de semen diluido (1:5) en 150l de solucin hiposmtica de citrato sdico de 60 miliosmoles (dilucin 1:3) en un bao mara a 37C durante 30 minutos a T ambiente. - Despus, se colocan 25 l de solucin incubada al bao mara en un extremo de un porta-objetos, se aaden 25 l de solucin de eosina-nigrosina y se mezclan. - Finalmente se realiza una extensin sobre el resto del portaobjetos. Tanto los portaobjetos como la eosina-nigrosina se atemperan antes de utilizarse. - Se deja secar al aire. - Se cuentan entre 100 y 150 espermatozoides bajo microscopio de campo claro a x1000 aumentos. c- Test de resistencia osmtica (O.R.T) Este es otro test de funcionalidad espermtica. Consiste en someter a los espermatozoides a un medio hipoosmtico. En este caso los espermatozoides con integridad de membrana se caracterizarn por tener un alto porcentaje de normalidad acrosmica. Para la realizacin de este test se procede de la siguiente manera: - Se incuban 0.2ml de semen diluido en 3ml de solucin isoosmtica de citrato sdico de 300 miliosmoles en un bao mara a 37C durante 15 minutos (A). - Se incuban 0.2ml de semen diluido en 3ml de solucin hiposmtica de citrato sdico 180 miliosmoles en un bao mara a 37C durante 120 minutos (B). - Finalizado el periodo de incubacin, se fija la muestra: 25l de muestra con 25 l de la solucin de glutaraldhido. - Despus, se colocan 25 l de solucin incubada al bao mara en un extremo de un porta-objetos, se aaden 25 l de solucin de eosina-nigrosina y se mezclan. - Finalmente se realiza una extensin sobre el resto del portaobjetos. Tanto los portaobjetos como la eosina-nigrosina se atemperan antes de utilizarse. - Se deja secar al aire. - Se cuentan entre 100 y 150 espermatozoides bajo microscopio de campo claro a x1000 aumentos. - El resultado de este test se calcular de la siguiente manera:

O.R.T. = (% A + % B) / 2 Segn el resultado de la frmula las muestras se clasificarn en 5 categoras.Muy buenas Buenas Regulares Malas Muy malas >71% 64-71% 54-63% 46-53% <45%

Dao

Normal

Engrosado

Daado

Daado

Daado

Perdiendo

Perdido

d- pH 2.3.3 Valoraciones en laboratorios de apoyo a- Pruebas microbiolgicas Para controlar la contaminacin del semen, peridicamente se enviarn muestras a un laboratorio externo para efectuar un control de los eyaculados. Se realizar un anlisis microbiolgico estndar ms clamdias, micoplasmas y virus, segn instrucciones del veterinario. b- Adems de las pruebas microbiolgicas se pueden realizar pruebas bioqumicas y pruebas biolgicas. Estas dos ltimas se deberan realizar cuando el centro de inseminacin presente problemas de produccin y calidad seminal y de fertilidad. Con dichas pruebas se completarn los anlisis realizados en el centro con otros ms complejos (ej.: estado de condensacin de la cromatina, niveles de zinc del plasma seminal, ). 2.4 Preparacin de dosis para el transporte Las dosis preparadas se almacenaran en tubos de plstico con una capacidad de 50ml. Estos tubos servirn para transportar y aplicar las dosis.

2.5 Entrega de dosis Existen dos tipos de clientes, en funcin de estos la entrega ser diferente. 2.5.1 Clientes que se inseminan sus propias conejas Las dosis se sirven en la puerta del centro juntamente con las cnulas, agujas y jeringas que necesiten. Las dosis y el resto de material se encontraran dentro de la nevera de transporte a 18C. 2.5.2 Clientes que no inseminan sus propias conejas Del transporte de las dosis y del material, as como de las aplicaciones se encargar el personal del centre de inseminacin. Las neveras de transporte irn equipadas con un termmetro de mxima y mnima temperatura para controlar que la nevera est a la temperatura adecuada adems de las posibles variaciones de temperatura durante el transporte. 2.6 Aplicacin de dosis Antes de comenzar tenemos que preparar el material a utilizar, de una manera cmoda y accesible, normalmente utilizando una mesa con ruedas en la que acomodaremos el semen, las cnulas limpias y las esterilizadas, la hormona y en caso de decidir utilizarlo, el can de inmovilizacin para las conejas. Se ha de evitar que existan variaciones trmicas durante la inseminacin. La inseminacin es un acto mecnico que no reviste mayor dificultad. Podemos distinguir varios pasos. 2.6.1 Sujecin Existen varias formas de sujetar la coneja, cada uno en su explotacin deber decidir cual es la forma que mejor se adapta a su manejo. a- Inseminacin con la coneja en vertical:

Se sujeta a la coneja por la parte cervical con una mano y por la zona inguinal con la otra mano (como si se fuera a realizar una palpacin). b- Inseminacin con la coneja en posicin inversa: La principal ventaja es que la coneja no adopta ninguna posicin defensiva por lo que la inseminacin es ms rpida y sencilla. Igualmente sern necesarias dos personas para realizar las inseminaciones. c- Utilizacin del can: Introduciremos las conejas en el can en posicin vertical con la cabeza hacia el interior. El manejo se simplifica, mantenindose la coneja inmvil. Una sola persona puede realizar la inseminacin de una forma sencilla.

2.6.2 Inseminacin Se inseminarn las conejas que estn en perfecto estado sanitario y sean receptivas (vulva roja). En las granjas que tengan un sistema de manejo en banda nica se inseminaran todas las conejas que presenten buen estado sanitario. La aplicacin es de 0.5ml. Existen tres tipos de cnulas para de aplicar las dosis: a- Cnula dura curvada con jeringa: Desde el tubo colector y mediante la jeringa se cargar la cnula con 0.5ml. Introduciremos la cnula con gran suavidad con la curvatura dirigida hacia la parte dorsal, es decir hacia el techo de la vagina. Segn vaya introducindose, girar espontneamente, introducindose entonces con facilidad. Introduciremos la cnula en el interior de la coneja, tanto como podamos. Notaremos que hace tope, entonces retiraremos la cnula ligeramente, y presionaremos el mbolo de la jeringa para depositar el semen. Se suele decir que lo ideal es que la cnula penetre en el interior de la coneja, alrededor de 15 cm, si bien, depende de la edad y tamao del animal, como es lgico. Para extraer la cnula, tiraremos con suavidad de sta, y al igual que al introducirla notaremos que se produce medio giro y sale sin la mayor dificultad. Comprobar as mimo la no presencia de sangre o pus en el extremo de la cnula, indicativo de infeccin o lesin.

Tomaremos nota, bien en la ficha de la coneja, bien en un cuaderno aparte, de todas las incidencias que creamos dignas de inters y que con el tiempo nos pueden servir de gran ayuda. Las cnulas utilizadas son las tradicionales de plstico con la punta curvada, de un solo uso.

b- Cnula dura con pistola: Las cnulas utilizadas son de plstico y totalmente rectas, con una longitud menor que las cnulas tradicionales. En este caso la cnula se coloca en la pistola y se carga con 0.5ml mediante consecutivos disparos de la pistola.

c- Cnula blanda: Las cnulas son de plstico blando, rectas y con un mbolo. Estas cnulas se utilizan cuando las dosis son preparadas con diluyente gel. Las cnulas ya vienen cargadas con la dosis seminal desde el centro de insenimacin. 2.6.3 Inoculacin de la hormona Inmediatamente despus de la inseminacin, procederemos a la inyeccin va intramuscular de la hormona que desencadenar la ovulacin (Fertagyl 0,2 ml). Por muy bien que demos los pasos anteriores, si la coneja no ovula, no conseguiremos los resultados deseados. Algunas especies producen una hormona denominada luteolisina, responsable de la ruptura del cuerpo lteo en caso de no sobrevenir la gestacin. En el caso de la coneja, esta funcin no est muy desarrollada por lo que siempre que se produzca ovulacin, y no haya fecundacin, entrar en un estado que se denomina de pseudogestacin, por lo que es recomendable no intentar una nueva inseminacin hasta 21 das despus, momento en que

los cuerpos lteos habrn regresado naturalmente. De otra manera y aunque sincronicemos las conejas, no se producir la ovulacin por lo que la tasa de fertilidad no ser la mejor. 3- SINCRONIZACIN DE LAS HEMBRAS E INDUCCIN DE LA OVULACIN La preparacin de la coneja para la inseminacin es muy importante en inseminacin artificial. 3.1 Sincronizacin del celo El control del celo pretende estimular el crecimiento folicular ovrico y la receptividad de la hembra. Existen varios sistemas para sincronizar el celo: 3.1.1 Sistemas hormonales a- Utilizacin de PMSG: Pincharemos la coneja con entre 25 y 40 UI de PMGS, 48 horas antes del momento de la inseminacin. La utilizacin reiterada de altas dosis de PMSG puede desencadenar la formacin de anticuerpos que interferirn en los parmetros reproductivos a partir del 4 o 5 parto. 1.1.2 Sistemas de manejo a- Utilizacin del FLUSHING: Cuando hablamos de flushing, hablamos de estimular la libido de la coneja de una manera natural, normalmente mediante la utilizacin de estmulos alimenticios o lumnicos. Los mejores resultados se obtienen mediante una combinacin de ambos sistemas. Alimentacin: Suministraremos a las conejas del lote a inseminar un alimento ms energtico (ej. Propilenglicol) la semana anterior a la inseminacin. Tambin se suelen dar vitaminas y minerales en el agua (agregado de vitamina E, selenio y fsforo) . Luminosidad: Facilitaremos a las conejas a inseminar 16 horas de luz durante la semana previa a la inseminacin. b- BIOESTIMULACIN: Este mtodo consiste en un control de la lactancia, la hembra tiene un acceso restringido al nido, entrando nicamente una vez al da para alimentar a los gazapos. Esta limitacin de acceso se realiza desde el parto hasta el momento de la inseminacin. Otro mtodo de bioestimulacin usado en algunas ocasiones consiste en desplazar o agrupar a las hembras antes de la inseminacin. c- RITMO DE PRODUCCIN: Utilizacin de los ritmos ms favorables a la receptividad (ex. 11 das post parto).

3.2 Induccin de la ovulacin La induccin de la ovulacin se realiza a partir de mtodos hormonales y es totalmente necesaria en el conejo cuando de aplica la tcnica de la IA, debido a que la hembra presenta ovulacin inducida por el coito. El sistema ms utilizado, es la inyeccin intramuscular de hormona GnRH inmediatamente despus de la inseminacin. 4- FACTORES DE INFLUENCIA EN LOS RESULTADOS EN I.A. 4.1 Factores ligados a la hembra 4.1.1 Raza La lnea gentica de la hembra utilizada influir sobre los resultados de fertilidad y prolificidad. 4.1.2 Estado corporal y sanitario La coneja, como es lgico, deber mantener un estado de carnes correcto, ni delgada ni engrasada. Generalmente, en explotaciones en las que se puede introducir el manejo de piensos diferenciados entre gestacin y lactacin, el estado de carnes suele ser mejor. Es importante tener en cuenta que cuando utilizamos ritmos no intensivos, de cubricin el da 11-12 post parto, la lactacin puede influir negativamente en el estado de carnes de las reproductoras. Antes de inseminar tambin ser necesario tener en cuenta el estado sanitario general de la hembra: problemas respiratorios o digestivos, mal de patas importante y existencia de mamitis. 4.1.3 Receptividad de la hembra Podemos aceptar en principio que la fertilidad depender del grado de receptividad de las hembras. Se ha demostrado una relacin directa entre el grado de receptividad y el color y turgencia de la vulva: cuanto ms rojo y mayor turgencia mayor es la frecuencia de ovulacin, debido a que los folculos preovulatorios estn en su mejor momento y listos para su ruptura. La receptividad de las hembras va a depender de: - la poca del ao - la edad y estado fisiolgico - la sincronizacin - dosis de la hormona - uso correcto del flushing o bioestimulacin - horas transcurridas desde la sincronizacin (48 horas) - nmero de gazapos que se estn amamantando - estado fisiolgico (nulparas, primiparas, multparas lactantes y no lactantes).

4.2 Factores ligados al macho La calidad seminal va a presentar variaciones de tipo estacional, variaciones entre razas y variaciones entre individuos y variaciones en funcin del manejo. As pues, la motilidad y la concentracin de las dosis seminales influyen en gran medida los resultados de fertilidad y prolificidad. Tambin se ha observado un efecto negativo de las anomalas morfolgicas sobre la fertilidad. 4.2.1 Raza La produccin y calidad seminal y la fertilidad van a variar en funcin de la lnea gentica utilizada como macho. 4.2.2 Edad El momento ms adecuado para iniciar la produccin de semen es a las 27-30 semanas de edad. 4.2.3 Ritmo de extraccin El ritmo ideal es 2 veces por semana con un intervalo entre eyaculados de entre 15 y 30 minutos. 4.2.4 Ambiente La temperatura y humedad ambiental influyen en la temperatura del animal y esta puede actuar negativamente sobre la espermatognesis y maduracin seminal. 4.2.5 Alimentacin Para mejorar la produccin y calidad seminal de los machos una vez al mes se puede incorporar al agua de bebida vitamina E u xido de zinc, o bien emplear un pienso con mayores aportes alimenticios. 4.3 Inseminador El efecto inseminador, es decir, la persona que realiza las inseminaciones, tiene gran importancia en esta especie. Se pueden encontrar una diferencia de hasta 10 puntos en fertilidad en la misma explotacin, mismo da y mismas dosis seminales. 4.4 Condiciones ambientales Cualquier alteracin de las condiciones ambientales, se ver reflejada en los parmetros reproductivos. Tanto las altas temperatura como los cambios bruscos de temperatura as como las corrientes producidas por deficientes sistemas de ventilacin influyen drsticamente en la fertilidad.