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Concetti base
Nucleoside
base purinica o pirimidinica legata alla posizione 1 dellanello pentoso
Nucleotide
base azotata-pentoso-fosfato
Concetti base
La trascrizione comporta la sintesi di una catena di RNA che ha la stessa sequenza di un filamento di una doppia elica di DNA. Il filamento di DNA identico in sequenza allRNA chiamato filamento codificante
il filamento codificante ovviamente complementare allaltro filamento, che funge da stampo per la sintesi dellRNA, ed chiamato per questa ragione filamento stampo o filamento noncodificante.
La sintesi della catena di RNA catalizzata dallenzima RNA polimerasi. La trascrizione comincia quando la RNA polimerasi si lega ad una particolare regione di DNA, chiamata promotore, che si trova allinizio del gene.
fa parte della sequenza del promotore la prima coppia di basi trascritta in RNA, chiamata sito di inizio o punto di inizio della trascrizione.
Partendo dal sito di inizio, la polimerasi si muove lungo lo stampo sintetizzando lRNA, fino a che non raggiunge una sequenza chiamata terminatore
questazione definisce lunit di trascrizione, che si estende dal promotore al terminatore; lunit di trascrizione quindi una sequenza di DNA che viene espressa mediante la sintesi di una singola molecola di RNA
una unit di trascrizione pu codificare per pi di una proteina. Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
Concetti base
Le regioni pi vicine al promotore sono descritte come prossimali, mentre quelle pi lontane sono descritte come distali. Le sequenze precedenti al punto di inizio sono definite sequenze a monte; quelle dopo il punto di inizio (cio allinterno della sequenza trascritta) sono definite sequenze a valle. Per convenzione, le sequenze vengono scritte in modo che la trascrizione procede da sinistra (a monte) a destra (a valle). Ci equivale a scrivere lRNA nella solita direzione 53.
Spesso la sequenza di DNA scritta in modo da mostrare il filamento la cui sequenza la stessa dellRNA. Le posizioni delle basi sono numerate in entrambe le direzioni a partire dal punto di inizio, al quale assegnato il valore +1, e i numeri vanno poi aumentando verso valle. Procedendo verso la regione a monte, le posizioni sono numerate a partire da -1, ed aumentano allontanandosi dal punto di inizio. Il numero 0 non assegnato a nessuna base. Il prodotto della trascrizione chiamato trascritto primario: una molecola di RNA che si estende dal sito di inizio al terminatore, che inizia con lestremit 5 originale e che termina con lestremit 3 originale. Il trascritto primario sempre molto instabile. La trascrizione il primo stadio dellespressione genica. Le proteine regolatrici determinano se un particolare gene sar trascritto oppure no dalla RNA polimerasi. La prima (e spesso lunica) fase di regolazione dellespressione genica la decisione se trascrivere o no un gene. Come fa la polimerasi a trovare i promotori nel DNA?
questo un esempio particolare di una domanda pi generale: come fanno le proteine che legano specificamente il DNA (come gli enzimi di restrizizione) a distinguere il loro specifico sito di legame dalle altre sequenze?
Come interagiscono con la polimerasi le proteine regolatrici per attivare o reprimere la trascrizione? Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
La catena di RNA sintetizzata dallestremit 5 allestremit 3. Il gruppo 3-OH dellultimo nucleotide aggiunto alla catena reagisce con il nucleoside 5 trifosfato entrante, che perde i due fosfati terminali ( e ). Per la RNA polimerasi batterica, la velocit di sintesi di circa 40 nucleotidi/sec.
Elongazione
Terminazione
Nei batteri, una singola RNA polimerasi sintetizza tutto il mRNA e tutti gli rRNA ed i tRNA. Ci sono circa 7000 molecole di RNA polimerasi in una cellula batterica di E. coli e, di queste, tra i 2000 e i 5000 enzimi sono in fase attiva di sintesi.
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
Solo loloenzima pu iniziare la trascrizione. Il nucleo enzimatico ha una certa capacit di legare il DNA in maniera non specifica, su quello che viene chiamato sito di legame debole; il DNA in questo caso resta a doppia elica
il complesso a un sito del genere stabile, con unemivita di dissociazione di circa 60 minuti
Il fattore riduce la capacit di legare i siti deboli di 10.000 volte, e lemivita di dissociazione diventa meno di 1 secondo. Il fattore conferisce anche la capacit di legare specificamente i promotori: loloenzima riconosce un promotore circa 107 volte meglio di una sequenza non specifica.
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
Il complesso chiuso trasformato in un complesso aperto dalla fusione di una breve regione di DNA allinterno della sequenza legata dallenzima (il fattore coinvolto nella reazione). La serie di eventi che conduce alla formazione di un complesso aperto chiamata legame stretto. Lo stadio successivo lincorporazione dei primi due nucleotidi, con la successiva formazione del legame fosfodiesterico. Questo genera un complesso ternario, che contiene DNA, RNA ed enzima. Altri nucleotidi possono essere aggiunti senza che lenzima si muova, fino a generare una catena di RNA di 9 basi. Dopo laggiunta di ogni base, c una certa probabilit che la catena di RNA venga rilasciata, determinando un inizio abortivo, dopo il quale lenzima ricomincia dalla prima base. Superata la fase di inizio, il fattore non pi necessario e lenzima supera la transizione a complesso di elongazione ternario (enzima-DNA-RNA). Il parametro critico il tempo necessario a lasciare il promotore, di modo che unaltra polimerasi possa iniziare: il tempo minimo 1-2 sec.
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
Nella trasnsizione da inizio ad elongazione, lenzima perde contatto con la regione da -55 a -35, quindi le paia di basi coperte dalla polimerasi diventano 60
la parte distale del promotore coinvolta nel legame iniziale della polimerasi, ma non negli stadi successivi
Quando la catena di RNA raggiunge i 15-20 nucleotidi, c una ulteriore transizione e lenzima copre a questo punto 30-40 paia di basi
non si sa se lenzima che cambia conformazione o se il DNA che assume una struttura pi estesa.
Il problema risolto grazie allassociazione reversibile tra il fattore e il nucleo enzimatico. Quando il fattore si associa al nucleo enzimatico, loloenzima lega il promotore. Terminata la fase di inizio, il fattore si dissocia (30% dei casi) o cambia la sua associazione (70% dei casi) con il nucleo enzimatico, che adesso mantiene la sua affinit non specifica per il DNA e pu effettuare lelongazione. Terminata lelongazione, il nucleo enzimatico viene rilasciato e pu riassociarsi con un altro il fattore per ricominciare un nuovo ciclo. Il fattore ha un dominio che riconosce il DNA al promotore. Di per se, non lega il DNA, ma quando loloenzima forma un legame stretto, lega il DNA a monte del sito di inizio: la regione N-terminale blocca la regione di legame al DNA nel fattore libero, ma quando lega il nucleo enzimatico, la regione di legame al DNA pu agire.
Il promotore
Linformazione per la funzione del promotore fornita dalla sequenza del DNA: la sua struttura il segnale (min 12 bp)
il caso delle sequenze di DNA la cui funzione quella di essere riconosciute da proteine, i cosiddetti siti cis-agenti; al contrario le regioni che vengono espresse aquistano un significato solo dopo che linformazione stata trasferita in un altro acido nucleico o in una proteina.
Ogni sequenza essenziale dovrebbe essere presente in tutti i promotori: si dice che la sequenza conservata. Ci sono 4 caratteristiche conservate nei promotori batterici
il sito di inizio: una purina (>90% dei casi), spesso CAT; la sequenza -10: T80A95T45A60A50T96; la sequenza -35: T82T84G78A65C54A45; la distanza tra la sequenza -35 e la sequenza -10.
Mutazioni in gi:
sequenza -35: riducono la formazione del complesso chiuso
ma non bloccano la conversione a complesso aperto
Sequenza -35: dominio di riconoscimento. Sequenza -10: dominio di srotolamento (ricco in A.T).
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
La tecnica dellimpronta
La tecnica dellimpronta utilizzata per determinare quale parte di un acido nucleico coperta da una proteina ad esso legata. Una variante della tecnica della impronta consiste nel trattare il complesso DNA-proteina con reagenti che modifichino una base, di modo che successivamente il corrispondente legame venga rotto
si pu legare la proteina al DNA e poi vedere quali basi sono protette da modificazione
alcune bande possono aumentare in intensit, identificando siti in cui il legame della proteina ha creato una conformazione pi esposta
si pu modificare il DNA e poi legare la proteina; le molecole che (a causa della modificazione) non hanno legato la proteina vengono recuperate e analizzate.
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
I punti di contatto a monte della sequenza -10 si trovano tuti dallo stesso lato della doppia elica: allinizio la polimerasi contatta la doppia elica da un lato solo; poi lenzima comincia lo srotolamento e siti che originariamente si trovavano dallaltro lato (a valle della sequenza -10) entrano in contatto con lenzima.
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Elongazione
Terminazione
La terminazione
terminatori rho-dipendenti
il nucleo enzimatico necessita del fattore rho () per terminare la trascrizione.
La struttura dei terminatori intrinseci presenta due caratteristiche peculiari (entrambe necessarie per la terminazione):
una struttura secondaria a forcina
contiene una regione ricca in G.C alla base
La polimerasi rallenta o si ferma (circa a 60 secondi) quando ha trascritto la sequenza che forma la forcina. La serie di U necessaria per la dissociazione della RNA polimerasi durante larresto alla forcina
se si accorcia le serie di U, la polimerasi si ferma, ma non termina la trascrizione.
Le sequenze ricche in A.T sono importanti sia nellinizio che nella terminazione rho-indipendente della trascrizione.
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
La terminazione rho-dipendente
Rho una proteina essenziale di E. coli, che funziona solamente nella reazione di terminazione; agisce come un esamero di 6 subunit identiche (non un tetramero come scritto su alcuni testi pi vecchi). Circa le met dei terminatori di E. coli sono rho-dipendenti. La caratteristica di un terminatore rho-dipendente una sequenza lunga 50-90 basi, che si trova a monte del sito di terminazione. Caratteristica tipica di queste sequenze che i residui C sono molto frequenti mentre i residui G sono piuttosto rari. Lefficienza di un terminatore rho-dipendente aumenta con la lunghezza della regione ricca di C e povera di G.
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
La terminazione rho-dipendente
Rho ha una attivit di ATPasi, dipendente dalla presenza di un poliribonucleotide lungo pi di 50 basi. Probabilmente rho lega la catena di RNA in elongazione o allestremit 5 o su alcune specifiche sequenze esposte. Successivamente, rho trasloca lungo la catena di RNA e, infine, raggiunge la RNA polimerasi. Rho ha una attivit di elicasi 5-3 (lenergia fornita dallidrolisi di ATP) e questo suggerisce che possa direttamente srotolare librido DNARNA nella bolla di trascrizione
alternativamente, rho potrebbe interagire con la RNA polimerasi causando indirettamente il rilascio della catena di RNA.