Determinacin de Coliformes Totales y Fecales:

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaz de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua se halla exenta de organismos productores de enfermedades.

Procedimiento:
Vamos a seguir el mismo mtodo para la determinacin de los dos tipos de Coliformes, lo nico que variar ser la temperatura de incubacin de cada determinacin, que para los Coliformes Totales ser de 37 C y para los fecales ha de ser de 44 C.

Prueba presuntiva:
Para determinar estos Coliformes se va a utilizar el medio de cultivo BGBB (dispuesto en tubo), que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de los Coliformes a la vez que permite que stos crezcan sin restriccin, se distribuye el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno de medio de cultivo y echando 10 ml de el agua a la primera serie de tubos, 1 ml de agua a la segunda serie, y 0,1 ml a la tercera. Colocaremos en cada tubo

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una campana Durham para recoger el gas producido y al medio de cultivo se le habr aadido un indicador cido-base. Estos tubos se incuban a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales durante 24 horas. Los Coliformes son lactosa positiva, es decir, son capaces de fermentar a la con produccin de cido y gas, estos signos sern los que buscaremos. La reaccin ser positiva cuando se produce desprendimiento de gas en

la campana Durham por lo menos en un 10% de su capacidad, y el medio vira a color amarillo debido a formacin de cido. Una reaccin positiva por dbil que sea, indicar la presencia y coliformes y habr que hacer las pruebas confirmativas de IMViC. Se aplicar la tcnica del nmero ms probable (NMP).

Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine:

En los tubos donde se introdujo 0,1 ml de agua problema, o resultados positivos en la prueba presuntiva ,se introduce un asa de siembra estril y se toma una porcin que va a sembrarse en estra en una placa Petri con medio EMB Levine. El EMB Levine contiene eosina y azul de metileno que inhiben parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos, adems la combinacin de azul de metileno y eosina permitirn diferenciar microorganismos lactosa positiva de los negativos. Se incuban los tubos 24 - 48 horas a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales. Los Coliformes apareceran como violetas oscuros y si hubiera microorganismos lactosa negativos apareceran como colonias incoloras.

Pruebas IMViC:
Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, pueden identificarse a travs de una serie de pruebas bioqumicas, que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metablica. Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificacin, uno de los ms

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conocidos y utilizados corresponde al IMViC que se desarroll para clasificar especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aerbicas o anaerbicas facultativas, Gram negativos, bacilares, no esporgenas que producen cido y gas durante la fermentacin de la lactosa). Consiste en las siguientes pruebas: - Indol: El triptfano, aminocido suministrado por una peptona adecuada, se descompone en indol por accin de algunos microorganismos. La prctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando est en presencia de agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de kovacs que produce una coloracin al reaccionar con l. Se coge con un asa de siembra, colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptona. Se incuba horas a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales, 24-48 horas, pasado el tiempo de incubacin se sacan los tubos de la estufa y se les aade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y se deja reposar.

Si aparece una coloracin roja indica que la prueba es positiva, el microorganismo produce indol. - Rojo de metilo: Esta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampn fosfato. Debido a la acidez producida, el medio virar de amarillo a rojo considerando la prueba positiva al aadir un reactivo. El procedimiento es el mismo que el del indol, con la diferncia que, en vez de aadir indol de kovacs, aadimos Rojo de Metilo.

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- Voges Proskauer: Algunas bacterias producen acatilmetilcarbimol (producto intermedio en la degradacin de la glucosa de los hidratos de carbono), que en presencia de KOH y aire, se oxida para dar diacetilo, que reacciona con -naftol y un producto de descomposicin de la arginina de la peptona, para producir un color rojo. En un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias aparecidas en las placas EMB Levine. Se incuba a 37 44 C 24-48 horas, luego se aade 1 mL de reactivo de Voges Proskauer,que contiene -naftol y KOH, se aade seis gotas de reactivo omehara y dos de reactivo de Barry, se agita, se deja reposar 10-15 minutos y si aparece una coloracin roja la prueba es positiva. - Citrato: Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como nica fuente de carbono. En un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons, se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estra. Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la produccin de amonaco que lo alcaliniza), el microorganismo es citrato positivo.

Tincin de Gram:
La coloracin de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciacin morfolgica y taxonmica de las bacterias. Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos segn retengan o no el colorante de base usado en la tincin, que es el violeta de genciana o el cristal violeta: Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma teido uniformemente de color azul o violeta. Las bacterias Gram negativas se tien de rojo por el colorante usado como contrastador, fuchina, safranina.

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La diferencia entre unas y otras radica en la composicin qumica de la

pared celular y su permeabilidad. La pared de las Gram negativas es ms delgada y presenta un contenido en lpidos, grasas, diez veces superior que el de las Gram positivas, lo cual dificulta la tincin y la retencin del colorante en el citoplasma. Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos una tincin diferencial, a continuacin observamos con el microscopio.

Resultado de la determinacin:
Se han obtenido idnticos resultados tanto en la determinacin de coliformes totales como fecales y stos han sido:

Prueba presuntiva:
En los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la produccin de cido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior. Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos,2 de los 3 sundos y 1 de los 3 ltimos (viraje del medio y gas); con estos datos vamos a las tablas del nmero ms probable (NMP) y tenemos: Ms de 20 u.f.c. por cada mL de agua problema. Como sta prueba ha sido positiva, realizaremos las pruebas confirmativas, de haber resultado negativas las primeras, daramos por terminado el anlisis.

Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine:

Tras la incubacin han aparecido colonias de color violeta, tal y como se esperaba. Se pasa a las pruebas de IMViC para determinar el microorganismo existente.

Anlisis Microbiolgico del agua Pruebas IMViC:

- Indol: Aparece un anillo rojo bordeando al tubo: Indol positivo:el microorganismo produce indol. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. - Rojo de Metilo: Tras la incubacin de cuatro das, se aade el reactivo y el tubo se colorea de rojo: Rojo de metilo positivo; el microorganismo produce acidez en su crecimiento. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias,

resultado negativo y resultado positivo a la derecha. - Voges-Proskauer: El microorganismo no produce acetilcarbimol al aadirle el reactivo que se detecta con la aparicin del color rojo, en este caso el resultado es negativo, (tubo del medio). En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. - Citrato: Tras la incubacin se observa que el microorganismo no ha crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color, por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato.

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El viraje del color del medio se debera a una produccin de amonaco que alcalinizara el medio y se habra detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. El resultado de las pruebas IMViC son: ++--; con esta combinacin vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia Coli. I M VI C Escherichia Coli + + - -

Tincin de Gram:
Con esta prueba, hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caractersticas y es el mayor indicador de contaminacin fecal en el agua.