Prctica 7 Electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa

Objetivo: que el estudiante conozca un mtodo de anlisis de cidos nucleicos

Fundamento
Como se mencion en la Prctica 3 Electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida, la electroforesis es el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico. A diferencia de las protenas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los cidos nucleicos estn cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia el polo positivo, es decir, el nodo. Adems de la poliacrilamida, la agarosa puede se utilizada como soporte para la corrida electrofortica. La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna lquida. Esta caracterstica permite una fcil preparacin de una matriz porosa para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un amortiguador adecuado, se calienta y se chorrea sobre un molde particular. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto txico y adems permite el anlisis de cidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolucin es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentracin de agarosa tpicamente utilizada para electroforesis est entre el 0.5 % y el 2%. La concentracin a usar se escoge segn el tamao del cido nucleico a analizar. Esto porque la concentracin de agarosa define el tamao de los poros de la matriz, a mayor concentracin, menor el tamao de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarn al nodo ms lentamente que cidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razn de esto es que los cidos nucleicos de alto peso tardan ms tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de cidos nucleicos no linealizados, como plsmidos circulares en conformacin nativa, la migracin no solo depender del peso molecular sino tambin de otros aspectos como el grado de superenrrollamiento que ste poseea. Generalmente en una preparacin de plsmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molcula, la forma superenrrollada, la forma semi relajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s). Una electroforesis tpica consiste de los siguientes pasos:

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1. Preparar un gel de agarosa a la concentracin requerida 2. Mezclar las muestras a analizar con un amortiguador adecuado y un colorante (azul de bromofenol) el cual indica el frente de corrida de la electroforesis 3. Montar las muestras en el gel 4. Realizar la corrida electrofortica 5. Visualizar los cidos nucleicos. Para la visualizacin de los cidos nucleicos se utiliza un colorante fluorescente, el bromuro de etidio. Este colorante tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el ARN. Debido a esta propiedad es un agente mutagnico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de etidio generalmente se incorpora a la agarosa antes de chorrear el gel, o puede incorporarse luego de la corrida electrofortica. Algunos de los usos de la electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa son: determinar los tamaos moleculares de los cidos nucleicos, analizar los fragmentos cortados con enzimas de restriccin, comparar los tamaos entre s de distintos tipos de ADN y aislamiento y recuperacin de fragmentos de ADN purificados. En nuestro caso, lo utilizaremos para analizar la preparacin de plsmido que se realiz durante la Prctica 7 Aislamiento de ADN de plsmido.

http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel .html usted podr realizar una corrida electrofortica virtual de una muestra de
ADN que fue digerida con diferentes enzimas de restriccin.

En

el

sitio

web:

Materiales y reactivos
-Muestra obtenida en la Prctica 7 Aislamiento de ADN de plsmido. -Marcador de peso molecular. -Cmara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte, peines, tabla niveladora, burbuja niveladora, etc. -Solucin amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). La solucin se prepara 5X y se utiliza 0.5X. Para preparar 1 l de una solucin 5X TBE mezclar: 54 g de Tris Base, 27.5 g de cido brico, 4.7 g de EDTA sdico, llevar a 1 l con agua y autoclavar.

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de etidio es un agente mutagnico, utilice guantes para manipular cualquier material o solucin que contenga este qumico
-Amortiguador de muestra con azul de bromofenol -Tubos de 1.5 ml - Beaker o erlenmeyer de 125 ml -Micropipeta de 20 l con sus respectivas puntas -Lmpara de UV. Precaucin: la luz ultravioleta puede daar sus ojos. NUNCA observe un gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz. -Guantes

-Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. Precaucin: el bromuro

Procedimiento
Pesar la cantidad de agarosa requerida para obtener un gel de agarosa al 1%. El volumen final es de 30 ml. Disolver la agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.5x. Calentar en el microondas por 45 s, luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las partculas de agarosa translcidas. Se debe tener precaucin con los recipientes calientes ya que pueden causar quemaduras. Incorporar 1.25 l de bromuro de etidio a 10 mg/ml en la solucin caliente de agarosa y agitando con movimientos circulares. Precaucin: El bromuro de etilo es

un carcingeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la disolucin o tener contacto directo con esta. La punta que contiene bromuro de etidio debe ser descartada en un recipiente especial para descartar material contaminado con bromuro de etidio.

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Figura 1. Esquema de cmo ensamblar el soporte para chorrear el gel de agarosa. Tomado de: BioRad. Manual de instrucciones de la cmara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. Rev A. El soporte para chorrear el gel debe estar limpio y seco, se ajusta en el molde portagel o tabla niveladora y se colocan los peines que generarn los pozos para aplicar las muestras (ver Figura 1). Cuando la agarosa alcanza los 5060 C aproximadamente se vierte en el centro de la bandeja para gel evitando la formacin de burbujas. Se deja reposar, el gel tarda de 2040 minutos para solidificar a temperatura ambiente. Una vez solidificado el gel se quitan los peines, sujetndolo con ambas manos y jalando cuidadosamente hacia arriba. Posteriormente se translada el soporte para el gel hasta la cmara de electroforesis, colocando los pozos mas cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro) debido a que las muestras migrarn hacia el nodo (de color rojo) durante la electroforesis (ver Figura 2). Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm.

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Figura 2. Esquema de cmo se ensambla la cmara de electroforesis. Tomado de: BioRad. Manual de instrucciones de la cmara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. Rev A. Para preparar las muestras aada en un tubo de 1.5 ml: 5 l de agua destilada desionizada 5 l de su preparacin de plsmido 2 l de amortiguador de la muestra Para preparar el marcador del peso molecular, aada en un tubo de 1.5 ml: 7 l de agua destilada desionizada 3 l del marcador de peso molecular (MPM) 2 l de buffer de la muestra Con una micropipeta de 20 l con punta aspirar la muestra preparada previamente. Colocar la micropipeta en forma perpendicular al gel de agarosa, e introducirla hasta el fondo del pozo liberando su contenido mientras se va sacando lentamente la punta del pozo. Tome nota del orden en que se colocaron las muestras y el marcador de peso molecular. El volumen de los pozos depende del tipo de peine usado y del espesor del gel. En el Cuadro 1 se indican las caractersticas los peines disponibles. Pregunte a su instructor qu tipo de peine su utilizar en esta ocasin.

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Cuadro 1. Caractersticas de los peines de altura fijos para el Sistema Sub-Cell GT y Wide Mini-Sub Cell GT Nmero pozos 1 2 4 10 10 15 15 20 20 30 de Grosor (mm) Ancho (mm) 1.50 1.50 1.50 0.75 1.50 0.75 150 0.75 150 150 106.43 50.29 26.42 9.87 9.87 5.52 5.52 4.84 4.84 2.69 Capacidad volumen (l) 800.0 377.0 200.0 37.0 74.0 20.7 41.4 18.2 36.4 20.2 de

Para iniciar la corrida electrofortica, colocar la tapa, asegurndose que los electrodos estn en contacto y conectados a la fuente de poder. Encienda la fuente de poder. La Se electroforesis se realiza a 100 V, 50 miliamperios durante 30 minutos aproximadamente. Finalizada la electroforesis, apagar la fuente de poder, se destapa la cmara y se retira el soporte para gel de la cmara, sosteniendo con los dedos los bordes para evitar que el gel se caiga. Examine el gel bajo la lmpara de luz ultravioleta para determinar la posicin de las bandas en el gel.

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Resultados
Con la ayuda de su instructor, interprete lo que observa bajo la luz ultravioleta. Indique cuntas bandas observa en su preparacin de plsmido y a qu corresponden. Pregunte acerca de la calidad de la preparacin segn se pueda juzgar de la electroforesis. Si lo desea, puede tomar una fotografa.

Bibliografa
-BioRad. Manual de instrucciones de la cmara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. Rev A -Facultad de Medicina UNAM, Departamento de Bioqumica. Bioqumica y Biologa Molecular. Objetivos del curso y manual de prcticas de laboratorio. Mc Graw-Hill Interamericana Editores, Mxico, 2000. http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.html visitado en enero del 2010. La redaccin de esta prctica fue realizada con la colaboracin de la Dra. Laura Ramrez.

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