UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

LABORATORIO DE VIROLOGIA

ANA GABRIELA DE LA ROSA CARDENAS MATRICULA: 1421310 GRUPO 273

A. EXTRACCION DE RNA VIRAL

Introduccin Los rotavirus humanos son los principales agentes etiolgicos de gastroenteritis aguda infantil en pases desarrollados y en vas de desarrolloA travs de mtodos serolgicos y genticos se ha logrado identificar siete grupos virales (de A a G) que infectan tanto a animales como a humanos. Entre ellos,el grupo A es considerado el ms importante clnicamente por ser el ms frecuente como causa de diarrea aguda en infantes y nios jvenes . Muchas tcnicas han sido empleadas para la deteccine identificacin de los rotavirus humanos: microscopa electrnica,inmunoensayo enzimtico ELISA, neutralizacin, reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Esta ltima tcnica permite separar el genoma de RNA de los RVH en sus once segmentos, formando as patrones de migracin (electroferotipos) caractersticos para cada cepa de rotavirus. A pesar de la diversidad de los electroferotipos existentes, se han diferenciado dos patrones de migracin distintos: un patrn corto y un patrn largo, que se distinguen por la migracin electrofortica del segmento 11 del genoma viral. La tcnica de PAGE se utiliza como herramienta epidemiolgica y de diagnstico en distintas partes del mundo (McCrae, 1987). Objetivo Extraccin de RNA viral mediante el mtodo fenol-cloroformo. Material y mtodos. Materiales: I. SOLUCIONES, RECREATIVOS Y EQUIPOS: PBS 1 ltr 1.. Fosfato monosdico dihidratado (NaH2PO4.2H2O) 2,35 g 2.. Fosfato disdico anhidro (Na2HPO4)........................... 7,6 g 3.. Cloruro sdico......................................................................... 4,4 g 4.. Alcohol benclico.................................................................... 15 ml 5.. Agua destilada csp................................................................ 1000 ml Buffer de acetato de sodio 0.1M (pH 5,0) que contiene sulfato de sodio dodecyl (SDS) al 1%. 1,15g de acetato de sodio anhidro disuelto en 140ml de agua destilada (solucin 0.1M), luego se aaden 60ml de cido actico y 2g de SDS. Se ajusta a pH 5,0. Preparacin del cloroformo El cloroformo consiste de 24 partes de cloroformo y 1 parte de alcohol isoamlico

Tubos eppendorff Centrifuga Micropipetas Vortex

EXTRACCIN DEL RNA Todas las muestras de heces fueron tratadas con una solucin de acetato de sodio 0.1M que contena sulfato de sodio dodecyl (SDS) al 1%. Luego se le aadi un volumen igual de una mezcla de fenol-cloroformo y se agit vigorosamente por 3 minutos. La emulsin resultante se centrifug a 10.000 rpm por 20 minutos y del sobrenadante se separ 0.5l. El RNA encontrado en el sobrenadante se concentr por el mtodo de Sambrook , aadiendo etanol fro absoluto al sobrenadante en una relacin aproximada de 2:1 Luego se centrifug, y el RNA precipitado se resuspendi en 500l de la mezcla de disociacin, que consiste en tris-HCl 0.5M, pH 6,8, glicerina al 0.76%, SDS 20% y azul de bromofenol

B .SEPARACIN DE LOS SEGMENTOS DE RNA POR ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACILAMIDA La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos y +), en dependencia de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante tiempo prolongado.La polimerizacin se lleva a cabo con la utilizacin de sistemas catalticos redox como por ejemplo: Persulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED como agente reductor. Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN). Perxido de hidrogeno, sulfato de hierro y acido ascrbico.

Objetivo

Observar la separacin de los fragmentos de RNA obtenidos de la extraccin del material viral de rotavirus en gel de poliacrilamida 10% Preparacin del Gel Solucin Acrilamida-Bis Solucin 1.5 M tris-HCl pH Acrilamida 14.6 g 8.8 Bis-acrilamida 0.4 g Tris-base 18.5 g Agua desionizada 50 ml Agua desionizada 100 ml Ajustar a pH 8.8 con HCl almacenar a 4 C SDS al 10 % Solucin 0.5 M tris-HCl pH SDS 10 g 6.8 Agua desionizada 100 ml Tris-base 6g Agua desionizadas 100 almacenar a temperatura ambiente ml Ajustar a pH 6.8 con HCl almacenar a 4 C Persulfato de Amonio al 10% Persulfato de amonio 1g Agua dest. 10 ml (preparar slo lo necesario o guardar por 10 das a 4C) Muestra RNA viral + 3 l de la muestra de rna viral azul de Bromo fenol 2l azul de bromofenol Electroforesis Buffer de corrida Tris Base Glicina SDS 3 1X g 10 X 30 g .

1.44 g 1 g

14.4 g 10 1L g

Agua desionizada 1 L

Material y mtodos

B.1 Geles de poliacrilamida 10% Se realiz una electroforesis vertical en geles planos de poliacrilamida 10%, durante 1 hora a temperatura ambiente con una corriente constante 100v y 400mA.

C.TINCION DE PLATA PARA GEL DE POLIACRILAMIDA Introduccion Existen diferentes tipos de tincin, entre ellos la plata que es muy sensible y tiene la caracterstica de producir generalmente coloraciones carmelita o negro, sin embargo algunas protenas tienen colores caractersticos como las

lipoprotenas que tienden a colorearse de azul y algunas glicoprotenas que aparecen amarillas, carmelitas o rojas. Este efecto cromtico se ha demostrado que est dado por la difraccin de la luz en la plata. Se han desarrollado algunos procedimientos de tincin con plata para identificar ciertas protenas, con el empleo de combinaciones de tincin.

Objetivo Observar los fragmentos separados de RNA viral de rotavirus obtenidos de la electroforesis mediante tincin de plata.

Material y mtodos. Agua bidestilada

Solucin de nitrato de plata 12mM. AgNO3...........0.82g Agua destilada.......................................................400ml Preparar al momento de usar. Solucin reveladora. Solucin de hidrxido de sodio 0.75M que contiene formaldehdo 0.76%. NaOH...........7.5g Formaldehdo 0.76%............................................1.9ml Agua destilada....................................................250ml Disolver el NaOH en el agua destilada, despus agregar el formaldehdo. Se debe preparar al momento de usar. Tincin con plata El gel de poliacrilamida se transfiri a una solucin fijadora y se mantuvo por espacio de 30 min., se elimin esta solucin y se sustituy por una solucin de nitrato de plata al 1%, en la cual permaneci 30 min bajo condiciones de obscuridad; posteriormente, se elimin esta solucin y se realizaron 3 lavados con agua

bidestilada; en seguida se adicion una solucin reveladora donde permaneci el gel, hasta la aparicin de las bandas caractersticas del genoma segmentado de rotavirus. Para intensificar las bandas, se aadi una solucin de cido actico al 5%. Se realizaron de 2 a 3 lavados adicionales con agua bidestilada para eliminar el exceso de cido actico. Los geles se conservaron en agua bidestilada. RESULTADOS.

FIG.1 Gel de poliacrilamida 10% tenido con plata. Los resultados obtenidos por extraccin del rotavirus a partir de heces fecales y posterior corrida en PAGE se muestra en la figura 1.la segmentacin del genoma viral permite una separacin de los distintos fragmentos con un patrn nico de bandas. Esta tcnica es utilizada como prueba diagnstica de rutina, pues detecta genoma viral como su patrn de segmentacin especifica. El mtodo de PAGE permite identificar y determinar simultneamente al virus y su electroferotipo. Los resultados mostraron una similitud con la literatura consultada (*) Figura 2. Mostrando 11 segmentos gnicos. Se muestra una coinfeccion en las primeras bandas segn la lietaratura * Los posibles mecanismos para que se manifieste la modificacin del genoma viral y por lo tanto, la diversidad gentica revelados por los patrones electroforticos, pueden incluir la recombinacin entre cepas in vivo, sobre todo por las coinfecciones que puede presentar los individuos en la comunidad. Varios estudios han reportado la presencia de mezcla de electroferotipos de rotavirus en pacientes diarreicos. La evidencia sugiere que es significante la interaccin entre diferentes electroferotipos en pacientes coinfectados en condicin natural, por lo que es importante determinar las condiciones epidemiolgicas que apoyen tales fenmenos.

FIGURA 2. Representacion esquematica de la particula de rotavirus, demostrando 11 segmentos gnicos y las protenas estructurales. Conslusion En trminos de adaptabilidad al laboratorio clnico, la tcnica basada en la extraccin del RNA rotaviral descrita por Herring et al. (1982), concentracin del RNA con etanol fro descrito por Sambrook et al. (1989), separacin del RNA por electroforesis en geles de poliacrilamida al 5% descrito por Chudzio et al. (1989) y la tincin con nitrato de plata descrita por Herring et al. (1982) es el mtodo mas recomendado por ser til, confiable y sensible para el diagnstico rotaviral y adems ofrece una alternativa para el diagnstico rpido de la infeccin por rotavirus, lo cual es indispensable para la orientacin del tratamiento.

AMPLIFICACION DEL GEN 4 DE ROTAVIRUS MEDIANTE PCR. La molcula de ADN es una estructura constituida por dos cadenas que codifican la informacin gentica de un organismo. Cada cadena es una secuencia de nucletidos. La lectura de esta secuencia de nucletidos proporciona la informacin gentica propia del organismo. Con la tcnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction= reaccin en cadena de la polimerasa) es posible obtener millones de copias de un fragmento del ADN (por ejemplo, de un gen de inters)

VP4 es la otra protena de superficie involucrada en la neutralizacin viral. La importancia que tiene en la penetracin del virus a la clula blanco, se debe a su sensibilidad a enzimas proteolticas, y esta es la razn de que los serotiposdeterminados por VP4 reciban el nombre de serotipos P (sensible a proteasa). Y es utilizada ampliamente en el diagnostico del mismo. Esta protena es codificada por el gen 4. Obejtivo. Amplificacin del gen 4 para diagnostico de rotavirus en muestras fecales. Material y mtodos. H2O 7.8 l Buffer. 1.5 l MgCl2(50mM).. 0.37 l Oligonucletidos forward (25mM) . .25 l Oligonucletidos reverse (25mM) .25 l dNTPs (2.5mM).. 2.0 l Taq DNA pol (5u/l) .0.1 l Muestra de DNA rotavirus...1.0 l En un tubo eppendorff se agregaron los reactivos mencionados previamente y se llevaron al termociclador a 94c por 2 minutos para la desnaturalizacin (se separan las dos hebras de las cuales est constituido), para el Alineamiento a 45C por 30 minutos (el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde). Para la Extensin a 72C por 40 seg (La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 3' 5', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende).) Elongacin final 72 por 10 minutos ( se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado) por ultimo a 4c para la conservacin ( para conservar la reaccin a corto plazao) todo esto a 30 ciclos. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Introduccion La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromolculas en una solucin. La electroforesis en agarosa permite separar molculas de DNA, cuando stas son sometidas a un campo elctrico y atradas hacia el polo opuesto a su carga neta.

El DNA est compuesto por cuatro nucletidos que tienen carga negativa y peso molecular similar. Por lo tanto, la aceleracin impuesta por la fuerza elctrica es igual para cualquier molcula de cido nucleico. La diferencian velocidad de migracin estar dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea por la forma y tamao de la molcula de DNA. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molcula, entonces las distintas molculas tendrn una velocidad que slo depender de su tamao, es decir, de su longitud en pares de bases. Objetivo. Observar la presencia de la amplificacin del gen-4 mediante un gel de agarosa al 1.5%. Material y mtodos. Disolucin TAE 50x modificado para kit de purificacin de DNA de geles de AGAROSA Sol 1X; 40 mM Tris-Acetato ph 8.0; 0,1mM de EDTA Notas Buffer concentrado para hacer el tampn en el que correr las electroforesis de cidos nucleicos, la diferencia es que es para extraer de el gel fragmentos de DNA que se podrn utilizar para reacciones de secuenciacin directamente. Receta Tris puro -----------------------------------------------------------------242 g cido actico glacial puro -------------------------------------------57,1 ml E.D.T.A. 0.5M, Ph 8 --------------------------------------------------10 ml Hidrxido sdico puro 1----------------------------------------------a Ph 8 H2O------------------------------------------------------------------------a 1 L Disolver la agarosa en TAE. Calentar en el microondas por 45 s, luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las partculas de agarosa translcidas. Se monta la cmara de electroforesis y se colocan las muestras de la amplificacin del gen -4 de rotavirus junto con un marcador de peso molecular. La Se electroforesis se realiza a 100 V, 50 miliamperios durante 30 minutos aproximadamente Posteriormente se llevo a teir el gel en Bromuro de Etidio, y se observo en un transluminador UV.

Resultados.

Se observaron las bandas del gen-4 al compararlo con la literatura mostro gran similitud indicando que Esta protena cuyo peso molecular es de 88 KDd, presenta 775 aminocidos en la mayora de las cepas humanas y 776 en las cepa% animales (aunque se han encontrado cepas de bovino que presentan una secuencia ms corta de 772 residuos de aminocidos), constituye las proyecciones de ia superficie del virin que se aprecian por microscopa electrnica (Kantharidis y col., 1987; Prasad y col. 1988; Lui y col., 1988; Gorziglia y col., 1988).

Bandas de amplificacin del gen-4 de Rotavirus.

FIGURA 3. Gel de agarosa 1.5% teido con bromuro de etidio y visto con UV .Se observan las bandas obtenidas despus de la amplificacin del gen-4 de muestras fecales de rotavirus.

Figura 4. Gel de agarosa mostrando electroferotipos largos de Rotavirus en el Centro Hospitalario Pereira Rossell de uruguay. Conclusin. La ventaja de PAGE y electroforesis en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio, es su sensibilidad y tambin por el hecho de que provee informacin acerca de las cepas de rotavirus que circulan en una comunidad y de las mezclas electroforticas, que no pueden ser detectadas por ensayos comerciales.

BIBLIOGRAFIA BASTARDO, J. (1993). Rotavirus y Gastroenteritis: Una Resea con Enfasis en la Epidemiologa., Inmunidad y Tratamiento de la Enfermedad. Editado por la Coordinacin de Publicaciones del Rectorado de la Universidad de Oriente, Cuman, Estado Sucre, Venezuela,pp 210. BLACKLOW, N. AND GREENBERG, H. (1991). Viral gastroenteritis, Review Article. New. Engl. J. Med., 325:252-264. CHUDZIO, T., KASATIYA, S., IRVINE, N. AND SANKAR-MISTRY, P. (1989). Rapid screening test for the diagnosis of rotavirus infection. J. Clin. Microbiol., 21:753-758. DOLAN, K., TWIST, E., HORTON-SLIGHT, P., FORRER, C., BELL, L., PLOTKIN AND CLARK, H. (1985). Epidemiology of rotavirus electropherotypes determined by a simplified diagnostic technique with RNA analysis. J. Clin.Microbiol., 21:753-758. VARIABILIDAD DE ELECTROFEROTIPOS Y SEROTIPOS G y P DE ROTAVIRUS EN CASOS DE GASTROENTERITIS INFANTIL.. Q.B.P. JUAN FCO CONTRERAS CORDERO Infeccin intrahospitalaria por rotavirus en salas generales de pediatra del Centro Hospitalario Pereira Rossell Marcos Delfino , Marie Boulay . http://www.medvet.una.ac.cr/carrera/mva505_Practica7.pdf http://www.ops.org.bo/textocompleto/rnsbp88270201.pdf