INGINERIA GENIC Ingineria genic poate fi definit drept ansamblu de metode i tehnici prin care este posibil manipularea

materialului genetic la nivel celular i molecular pentru a obine pe ci netradiionale produi utili omului i genotipuri noi, avnd la baz tehnologia moleculelor recombinate (hibride) de ADN. Ingineria genic se profileaz ca direcie tiinific i tehnologic n anii '70. Apariia ei a fost determinat, n primul rnd, de aprofundarea cunotinelor de genetic la nivel celular i molecular, de dezvoltarea cunotinelor privind materialul genetic al organismelor vii, i anume: descoperirea mecanismelor principale de transmitere a informaiei ereditare: transformaia (A.Avery, C.MacLeod, M.MacCarty, 1944) prin intermediul fragmentelor de ADN; sexducia (J.Lederberg, E.Tatum, 1946) prin conjugarea bacteriilor transducia (J.Lederberg, 1952) cu ajutorul fagilor; descoperirea structurii moleculei de ADN (J.Watson, F.Crick, 1953); descoperirea i izolarea enzimelor de restricie i legare a fragmentelor de ADN (H.Smith, 1970); descoperirea fenomenului transcripiei inverse a informaiei genetice de la ARN la ADN (H.Temin, S.Mizutani, D.Baltimor, 1970); descoperirea sintezei chimice a genelor (A.Kornberg, 1967; H.Khorana, 1970, 1976).

De facto ,anul apariiei ingineriei genice este considerat anul 1972, cnd n Universitatea din Stanford P. Berg, S. Cohen i H. Boier cu colaboratorii au elaborat primul ADN recombinat, ce coninea fragmente de ADN din virusul SV40, bacteriofag i E. coli. Scopul ingineriei genice aplicate const n elaborarea tipurilor de ADN recombinat, care prin introducerea n aparatul genic a organismului, i-ar conferi caracteristici deosebite, care le-ar favoriza aplicabilitatea.

1. BAZELE TEHNICO-MATERIALE ALE INGINERIEI GENICE Datorit cercetrilor de genetic molecular, a fost posibil cunoaterea structurii de profunzime a unor gene i genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei ADN-ului recombinat i la transferul de gene peste barierele de specie. Tehnica recombinrii genetice n vitro include trei etape principale: 1) extragerea sau sinteza chimic a ADN-ului din diferite specii; 2) construirea unei molecule hibride (recombinate) de ADN; 3) reintroducerea moleculei recombinate de ADN ntr-o celul vie pentru reproducerea i expresia ei (fig. 1).

Fig 1. Etapele principale ale ingineriei genice.

Extragerea ADN-ului se produce utilizndu-se o serie de enzime specifice, n primul rnd, cele de restricie, capabile s rup molecula de ADN n anumite locuri. Enzima de restricie extras din Escherichia coli Eco RI recunoate urmtoarea secven de nucleotide: G AATTC CTTAAG. Restrictazele reprezint instrumentul de baz al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unic de a tia molecula de ADN n anumite sectoare (loci). Prima restrictaz a fost obinut din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul i se folosea pentru fragmentarea ADN-ului virusului SV-40 i cartarea lui (Kelly, Smith, 1970). Nu toate restrictazele se utilizeaz n ingineria genic, ci doar acele care au urmtoarele proprieti: pot tia molecula de ADN n fragmente discrete; posed o specificitate de aciune nalt (taie molecula de ADN ntr-o anumit succesivitate site-ul de recogniie); pot forma, n rezultatul restriciei, margini lipicioase la capetele fragmentului de ADN (aceast proprietate nu este caracteristic tuturor restrictazelor); pot fi izolate relativ uor n stare pur din mediul incubaional. La repartiia ADN-ului este implicat ADN-ligaza, care poate lega unele fragmente de restricie. Acestea i alte enzime stau la baza obinerii moleculelor recombinate de ADN (fig.2). Pentru transferul genelor de la unele organisme la altele sunt utilizai vectorii (moleculele speciale de ADN ce transfer informaia genetic dintr-o celul n alta) reprezentai prin plasmide, virusuri, liposomi, ADN mitocondrial i ADN cloroplastic. Sistemele vectoriale, utilizate pentru transferul informaiei strine n celulele (organismele) - gazd, trebuie s corespund urmtoarelor cerine: inofensivitatea vectorului; multiplicarea rapid n celula-gazd i lipsa posibilitilor de multiplicare n celulele altor organisme; prezena unui numr restrns de situri de recogniie; prezena genelor marker pentru selectarea de clone dup moleculele recombinate de ADN; izolarea relativ uoar, clonarea i expresia n celulele (organismele) strine. n calitate de vectori, plasmidele au cptat o rspndire deosebit. Plasmidele reprezint nite molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot exista autonom i determin unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de conjugare, rezistena la antibiotice, agresivitatea. Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie s posede un numr restrns de regiuni sensibile la aciunea enzimelor de restricie. n acest caz, se poate realiza ruperea i apoi inseria de ADN exogen n plasmid. Primul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat pSC 101, realizat de S.Cohen (1973). Fig.2. Obinerea moleculelor recombinate de ADN: A) metoda ligazic;

B) metoda terminal. Ca vector plasmidic, la plante se folosete plasmidul Ti (Tumour inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, care condiioneaz formarea tumorilor pe tulpinile a numeroase specii de plante dicotiledonate. A doua tehnic de introducere a unei gene ntr-o bacterie folosete ca vector un bacteriofag (fagul leambda - ), al crui genom (10-50 gene) integreaz gena strin. Ea se va sintetiza ntocmai ca i celelalte gene ale virusului, dac acesta din urm se va replica n celula bacterian. Pentru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regul, virusul tumoral SV40 i virusul papiloma bovin (BPV). Se crede c vectorii virali vor putea fi utilizai i la plante. Un tip particular de vectori reprezint liposomii, picturi foarte mici de lipide produse artificial, n care pot fi incluse gene, precum i diferite medicamente, enzime etc. Genomul mitocondriilor i cloroplastelor este similar celui bacterian i, ca urmare, se crede c el va putea fi utilizat pentru transferul unor gene la organismele eucariote. Celulelor utilizate n experimentele ingineriei genice le sunt naintate o serie de cerine care au menirea de a asigura securitatea investigaiilor tiinifice. Conform Regulilor despre molecule recombinate de ADN celulele-gazd trebuie s satisfac urmtoarele cerine: capacitatea sporit de implicare n investigaiile tiinifice; incapacitatea de sintez a anvelopei protectoare n afara laboratorului; capacitatea lizrii ADN-ului su n afara laboratorului; imposibilatatea transferului informaiei ereditare altor organisme; imposibilitaea polurii mediului nconjurtor n rezultatul transformrii i/sau transfeciei. n prezent, de rnd cu E. coli, n calitate de obiecte de studiu (celule gazd), se utilizeaz bacilul fnului (Bacillus subtilis), celulele de drojdii, culturile de celule i esuturi vegetale i animale, culturile de protoplati. Dup obinerea moleculelor recombinate de ADN, ele trebuie transferate n celulele (organismele) procariote sau eucariote pentru funcionarea lor ulterioar (replicarea i transmiterea informaiei ereditare). De menionat c, n cazul operrii cu genele organismelor eucariote, genele eucariotelor superioare, de regul, nu se manifest n celulele procariote, iar genele eucariotelor inferioare se manifest doar parial. Iat de ce, n aceste experimente se acord o deosebit atenie direciei transferului de informaie ereditar a moleculelor recombinate, adic: de la celula procariot n celulele pro- sau eucariote i invers, de la celula eucariot n eu- sau procariote. Moleculele recombinate ale procariotelor funcioneaz uor n celulele procariote (n calitate de repliconi). Sunt descrise i cazuri de funcionare a genelor procariotelor n celulele eucariotelor. K.Merril i colab.(1971), In.Hors i colab.(1975) au demonstrat posibilitatea transferului genei -galactozidazei din E. coli n fibroblastele umane ale unui bolnav de galactozimie cu ajutorul fagului (galactozimia este o boal autozomial recesiv ce provoac dereglarea metabolismului ca rezultat al lipsei enzimei 1-D-galactozo-1-fosfaturidiltransferazei). Expresia genelor eucariotelor n celulele procariote, de asemenea, este posibil. Devis (1976) a transferat gena histidinei drojdiilor n E. coli cu ajutorul fagilor. Astzi se obin pe scar larg produse ale organismelor eucariote n baza bacteriilor (hormoni, interferoni etc.). Informaia ereditar strin (a moleculei recombinate), care ptrunde n celula (organismul) gazd, este protejat pe diferite ci: metilarea ADN-ului (virusurile); transferul moleculei liniare de ADN n form circular (fagul ); blocarea sistemului de restricii al celulei-gazd (fagul T3); aciunea restrictazelor. n acelai timp, celula-gazd i protejeaz informaia ereditar prin diferite mecanisme: aciunea restrictazelor specifice; metilarea ADN; aciunea vecintii epigenetice; aciunea nespecific a nucleazelor celulare; protecia mecanic prin membranele celulare;

 aciunea proteinelor histonice i nehistonice; aciunea interferonului.

2. REALIZRILE INGINERIEI GENICE. Transferul de gene n celulele vegetale i animale. Tehnicile de recombinare genetic permit transferul genelor importante n celulele de plante i animale, iar n rezultat se obin plante i animale transgenice. Pentru transferul de gene la plante sunt utilizate bacteriile Agrobacterium tumerfaciens (descoperite n 1907 de E.Smith i C.Townsend), care provoac formarea unor tumori cancerogene (crown gall) pe tulpinile unor plante (la speciile din 93 de familii de dicotiledonate). Plasmidul Ti (tumor inducing) descoperit la A.tumefaciens cauzeaz tumori la plante prin transferul unui segment de ADN (ADN-T) din plasmid n celulele vegetale. Strategia pentru transferul genelor cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal include: introducerea segmentului de ADN-T ntr-un plasmid de E. coli; introducerea n plasmidul format a genei necesare i a genei marker (gena pentru rezisten la canamicin); introducerea plasmidului recombinat n Agrobacterium tumerfaciens; infecia cu A.tumerfaciens a plantelor respective; selectarea plantelor transformate (fig.4). Pentru realizarea transferului de gene n celula vegetal este utilizat metoda culturilor de celule i esuturi n vitro.

Fig.4. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal

3. EXPRESIVITATEA GENELOR N PLANTELE TRANSGENICE La studierea expresiei genelor strine n celulele vegetale savanii s-au ntlnit cu o serie de caracteristici noi. S-a constatat c clonele transgenice transformate prin construcia identic de ADN, obinute paralel n aceeai experien, se deosebesc esenial prin gradul de expresivitate a genei introduse. Gradul de expresivitate depinde de mai muli factori i-n special de faptul n care parte a cromatinei nucleului a nimerit gena introdus. Expresia transgenei, de regul sporete cnd nimerete n zona cromatinei active. La introducerea n genomul nuclear a construciei ADN adesea sufer modificri eseniale, ce duc la reducerea expresivitii genei. Deasemenea s-a constatat c aceste transformri nu trec fr urmri i pentru genomul gazdei. nc o problem important n ingineria genic a plantelor este cea a diminurii expresivitii genelor (gene silencing). S-a observat c la o bun parte din plantele transgenice gena introdus peste un timp i pierde expresivitatea, dei fizic se pstreaz. Deci plantele au caracteristica de a opune rezisten expresivitii ADN-lui strin. Aceast problem are o mare importan practic, deoarece la plantele de cultur modificate transgenele trebuie s funcioneze stabil. n acest fel se pot obine soiuri (sau hibrizi noi de plante) rezistente la boli i duntori, cu caliti nutriionale superioare (de exemplu, cu coninut ridicat de ulei, zahr, proteine, amidon, vitamine), tolerante la unele erbicide neselective i uor degradabile n mediu, precum i la factori de stres cum ar fi seceta, frigul, salinitatea Exemplu: Tolerana la erbicide a fost principala caracteristic a plantelor transgenice cultivate n anul 2006, urmat de rezistena la duntori. 13 milioane ha au fost cultivate (n SUA) cu porumb coninnd n acelai bob dou sau chiar trei transgene, ce confer diferite nsuiri (toleran la erbicide i rezisten la Ostrinia n. i Diabrotica v.). Reamintim c Diabrotica virgifera, aceast filoxer a porumbului, ce produce pagube foarte mari, se extinde cu rapiditate din Serbia i Ungaria n vestul i sudul rii noastre principalele zone de cultur a porumbului. Numai hibrizii modificai genetic fac fa acestui duntor extrem de periculos, tratamentele chimice fiind ineficiente. Suprafeele, la nivel mondial, pe care s-au utilizat n anul 2006 varieti (soiuri) modificate genetic reprezint, dup cum urmeaz: 64% din totalul de 91 milioane ha cultivate cu soia, 38% din totalul de 35 milioane ha de bumbac, 18% din 27 milioane ha de rapi, 17% din totalul de 148 milioane ha de porumb.

4. POSIBILITILE INGINERIEI GENICE Primele plante transgenice (plante de tutun cu gene din microorganisme) au fost obinute n anul 1983. Primele rezultate favorabile n cmp a cestor plante ( rezistente la infecia virotic a tutunului) au fost obinute n SUA . Dup susinerea testelor de toxicitate, alergice, mutagenice .a, primele produse transgenice au fost livrate pe pia n SUA n anul 1944. Acestea au fost roiile Flavr Savr , ce se caracterizau prin ncetinirea procesului de coacere, obinute de compania Calgen, precum i soia rezistent la ierbicide a companiei Monsanto. Deja peste 1-2 ani companiile specializate n biotehnologii au expus pieii un ir ntreg de plante modificate: roii, tutun, porumb, ridiche, rapi,soie, dovlecei, cartofi i bumbac. Firma american Monsanto comercializeaz deja plante transgenice (transformate) de cartof, rezistente la gndacul de Colorado. n ultimii ani, 5,8 mil. de fermieri au cultivat peste 52,6 mil. ha cu plante modificate genetic, ceea ce este cu 8,4 mil. ha (19%) mai mult fa de anul 2000. De la introducerea lor n cultur, n anul 1996, aceast suprafa a crescut, n ultimii ani, de peste 30 de ori, de la 1,7 mil. ha la peste 52,6 mil. ha Creterea an de an a suprafeelor cultivate cu plante modificate genetic ntr-un ritm nemaintlnit n domeniul tehnologiilor agricole reflect ncrederea n biotehnologie a celor 10,3 milioane de fermieri ce

au decis s cultive varieti transgenice, ca urmare a creterii productivitii, a efectelor benefice asupra mediului i sntii celor care lucreaz n agricultur.

a) Principalele specii de plante modificate genetic cultivate pe plan mondial sunt:

Soia 58,6 milioane ha (57% din suprafaa total de plante transgenice), cultivat n: SUA, Argentina, Brazilia, Canada, Paraguay, Uruguay, Romnia, Africa de Sud i Mexic. Porumbul 25,2 milioane ha (25%), cultivat n: SUA, Argentina, Canada, Africa de Sud, Uruguay, Filipine, Honduras i, pe suprafee mai mici, n ase state membre ale UE: Spania, Germania, Frana, Portugalia, Cehia i Slovacia. Bumbacul 13,4 milioane ha (13%), cultivat n: India, SUA, China, Argentina, Australia, Mexic, Africa de Sud i Columbia. Rapia canola 4,8 milioane ha (5%), cultivat n SUA i Canada. Lucerna tolerant la erbicide, plant peren modificat genetic, a fost cultivat pentru prima dat n anul 2006, n SUA (pe 80.000 ha). Alte specii de plante modificate genetic s-au cultivat pe suprafee mai mici (dovlecel i papaya n SUA, orez n Iran, garoafe n Olanda).

b ) Avantajele ntrebuinrii plantelor transgenice

n ciuda dezbaterilor aprinse pe seama acestui subiect, ce au avut loc n deosebi n unele ri din Uniunea European, milioane de fermieri att din rile industrializate, ct i din cele n curs de dezvoltare continu s-i extind suprafeele cultivate cu varieti transgenice, prin utilizarea acestora realizndu-se: combaterea mai eficient a buruienilor i duntorilor; reducerea input-urilor, respectiv a costurilor de producie; reducerea global a cantitilor de pesticide cu impact pozitiv asupra biodiversitii, contribuind n acest fel la protecia mediului; reducerea dependenei de pesticide convenionale, care au efecte nefaste asupra sntii cultivatorilor i a consumatorilor; mbuntirea calitii apelor freatice i de suprafa, prin reducerea reziduurilor de pesticide Utilizarea plantelor modificate genetic permite o flexibilitate a tehnologiei de cultivare, combaterea eficient a buruienilor i a duntorilor, asigurnd fermierilor un spor de producie de pn la 50%, uneori i mai mult, reducerea costului de producie, prin urmare creterea profitului (27 miliarde $, pe plan mondial, n perioada 1996-2005). Practicarea unei agriculturi bazate pe utilizarea plantelor modificate genetic are un impact pozitiv major asupra mediului (prevenirea polurii solului, a apelor freatice i de suprafa, protecia biodiversitii), reduce poluarea produselor agricole prin diminuarea consumului de pesticide convenionale (cu cca 224 milioane kg substan activ n perioada 1996-2005). Sistemul modern de agricultur no tillage (peste 95 milioane ha n anul 2005) const n cultivarea terenului fr nicio lucrare a solului, utiliznd ndeosebi plante modificate genetic tolerante la erbicide neselective. Principale avantaje: protecia solului mpotriva eroziunii i conservarea apei n sol (prin urmare, permite dezvoltarea unei agriculturi durabile), reducerea consumului de combustibil (cu pn la 80%), reducerea necesarului de for de munc i a timpului necesar efecturii lucrrilor. Plantele modificate genetic contribuie la diminuarea fenomenului de nclzire global. Numai n anul 2005 aceast tehnologie a permis reinerea n sol a cca 9 milioane tone CO2 (echivalentul scoaterii din circulaie a cca 4 milioane de autoturisme, datorit reducerii emisiilor de gaze de ser) prin reducerea

consumului de combustibili fosili ca urmare a diminurii numrului de lucrri ale solului i a tratamentelor cu insecticide i erbicide. De mare actualitate este problema reducerii consumului de combustibili fosili i nlocuirea treptat a acestora cu biocombustibili (biodiesel i bioetanol).Cultivarea plantelor transgenice (soia, porumb), tolerante la erbicide neselective,ofer o mare perspectiv n acest domeniu.

c) Efecte colaterale ale utilizrii plantelor transgenice:

Un prim contrargument mpotriva consumului plantelor modificate genic este prezena n multe din ele a genelor rezistente la antibiotice. Se presupune c aceste gene rezistente pot trece n timpul digestiei n endo- microflor, precum i n cea patogen, provocnd rezistena microbilor la aceste antibiotice, dar posibilitaea realizrii acestui proces este aproape minim i nu s-a depistat n cadrul numeroaselor experimente. Un alt contrargument prezint plantele transgenice de cultur rezistente la ierbicide, care n timpul polenizrii ar putea transmite aceste gene buruienilor nrudite, care s-ar transforma n buruieni imposibil de le nimicit (superweeds). Dei procentul realizrii acestui fenomen este destul de mic, totui inginerii genici fac tot posibil pentru a exclude acest fapt. Astfel, pentru a diminua acest contrargument, inginerii ncearc s introduc n aceste plante nu numai una, dar mai multe gene rezistente la diferite tipuri de ierbicide. Deasemenea sunt tratate din aspect negativ i plantele transgenice cu gene de insecticide, deoarece se consider c ele ar putea cauza la insectele parazite rezistena la aceste insecticide. Din aceast cauz, la fel se practic introducerea mai multor gene concomitent. nc o problem a plantelor transgenice cu gene de insecticide este c polenul acestor plante poate nimici i insectele folositoare, care se nutresc cu acest polen. Datele experimentale ntradevr confirm acest problem, cu toate c e greu de vorbit de volumul daunelor provocate. Autoritile i instituiile de cercetare trebuie s se implice mai mult n informarea corect i pe scar larg a publicului privind riscurile i beneficiile aplicrii acestor tehnologii moderne i utilizrii produselor obinute prin biotehnologie. Precizm faptul c alimentele i furajele modificate genetic sunt supuse unei evaluri tiinifice exigente de ctre instituiile abilitate (FDA, EPA i USDA n SUA, EFSA n UE etc) pentru a preveni orice risc pentru sntatea oamenilor i animalelor sau pentru mediu, asociat introducerii pe pia a acestor produse. Prin urmare, nu moratoriul, ci evaluarea tiinific este rspunsul la ngrijorrile manifestate de activitii anti-OMG vizavi de biosecuritate. FAO, OMS, OCDE i alte organizaii internaionale consider produsele obinute din plantele modificate genetic la fel de sigure ca i cele convenionale Agricultura, n forma ei tradiional, dispare, se distruge biodiversitatea; chimia, n structura ei esenial, ptrunde n produsele agricole, oricare ar fi acestea. Aa se face c, n ultimii ani, n SUA, soia, roiile i bumbacul pot fi modificate genetic, pot fi cultivate liber mai ales pentru export; n Frana a fost autorizat cultura porumbului transgenetic; n Rusia ncep s fie la mod cartofii modificai genetic; n China, orezul transgenetic etc. Comunitatea European are nc dubii asupra culturilor transgenetice, dar nu rmne surd la argumentele celor aflai n lupt cu malnutriia. Foametea afecteaz astzi aproape un miliard de oameni. Promotorii revoluiei genetice susin c noile culturi vor avantaja mai cu seam ranii sraci, fr posibiliti de modernizare real a gospodriilor lor. i ntr-adevr : n SUA (cel mai mare productor mondial de porumb i de soia), 55% din producia de porumb i 90% din cea de soia este obinut din varieti modificate genetic. Fermierii americani i transport producia de pe teren la siloz cu camioane de 25 t, iar ranii romni cu crua. Analiznd toate aceste date, este absolut evident c viitorul totui va aparine plantelor transgenice, iar incadrarea lor n agricultura fiecrei ri va surveni n timpul apropiat...