LMD Immunotechnologie Et Vaccinologie KSOURI H & HAJ SASSI F

2me Anne Biologie
LMD Immunotechnologie et Vaccinologie 2008-2009
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Fascicule labor par :
KSOURI Habib Haj SASSI Fayal
Anne 2008-2009
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Sommaire
PROTEINES RECOMBINANTES ET ANTICORPS MONOCLONAUX Les protines recombinantes ...6 Production des anticorps monoclonaux .18 Utilisation des anticorps monoclonaux comme outil danalyse .. 30 Utilisation des anticorps monoclonaux en thrapeutique humaine .49 Protomique : Principes et Applications .59
THERAPIE CELLULAIRE Bases fondamentales de limmunomodulation.....74 Cellules dendritiques .....86 Lymphocytes T rgulateurs ..94 Cellules souches msenchymateuses ....101 Nanotechnologies : Principes et Applications .109
ANIMAUX TRANSGENIQUES ET ANIMAUX KNOCKOUT Principes et Applications..118
VACCINOLOGIE Principes et bases immunologiques de la vaccination .136 Classification et mode de prparation des vaccins. Nouveaux vaccins ..151 Les bases pidmiologiques de la vaccination .161 Les stratgies de prvention vaccinale et leur surveillance ..167 Les maladies prvention vaccinale 176 3
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PROTEINES RECOMBINANTES ET ANTICORPS MONOCLONAUX
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Objectifs
1- Dfinir une protine recombinante. 2- Citer les principales tapes de production dune protine recombinante. 3- Citer les lments indispensables pour produire une protine dans E. coli. 4- Citer les techniques utilises pour augmenter la force des promoteurs. 5- Citer pourquoi on utilise un promoteur inductible. 6- Citer les facteurs dont doit tenir compte la construction du vecteur gntique. 7- Citer les principaux avantages et les principaux inconvnients de la production de protines recombinantes dans E Coli.
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LES PROTEINES RECOMBINANTES
1-
Dfinition : Les protines recombinantes sont des protines produites par des cellules dont l'ADN a
t modifi par recombinaison gntique. Au sens large, un systme de production adapt la fabrication d'une protine recombinante donne, est un processus biotechnologique qui s'appuie principalement sur :
l'emploi d'un vecteur d'expression (en gnral un plasmide ou un virus -pour les vecteurs eucaryotes-), jouant le rle de transporteur gntique du gne d'intrt codant pour la protine recherche ;
l'utilisation d'une cellule hte, charge d'excuter les instructions fournies par le gne d'intrt qui lui est insr, dans l'objectif de synthtiser la protine recherche ;
une phase de production proprement dite permettant de fabriquer les volumes de protines souhaits.
enfin, une sparation et extraction de la protine du milieu de culture, suivie par une purification de celle-ci.
Un systme de production de protines recombinantes est caractris par un couple constitu d'un vecteur d'expression et d'un hte (cellule ou organisme). 2Techniques mises en uvre : Une vaste gamme de systmes de production de protines recombinantes, c'est--dire de couples vecteurs-htes est aujourd'hui disponible, chacun d'eux prsentant des avantages et des inconvnients. Les htes les plus utiliss l'heure actuelle sont incontestablement la bactrie Escherichia coli, la levure Saccharomyces cerevisiae et les cellules CHO extraites des ovaires de hamster. 3Production des protines recombinantes : Lexpression des protines peut se faire dans un systme eucaryote (ovocyte de Xnope), ou procaryote Escherichia coli (E. coli), qui reste le premier hte utilis pour la fabrication de protines recombinantes. 6
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E. coli est un des organismes actuellement les mieux connus. Cette bactrie a plusieurs proprits intressantes pour tre utilise pour exprimer des protines en grandes quantits : elle est facile manipuler, elle pousse vite dans des milieux relativement peu chers et les souches de laboratoires sont inoffensives.
1) Ce qui est indispensable pour produire une protine dans E. coli. : Pour exprimer un gne dans E. coli, il doit tre insr dans un vecteur qui contient plusieurs lments : 1- Une origine de rplication, un marqueur slectionnable pour trier et maintenir les bactries ayant incorpores le vecteur, et un polylinker comme tous les plasmides servant de vecteur, 2- Un promoteur contrlable dont l'induction produira une grande quantit dARNm partir du gne clon, 3- Les squences responsables de la traduction telle qu'une squence de liaison au ribosome, ces squences doivent tre bien positionnes. a. Lorigine de rplication Le gne doit tre rpliqu dans la bactrie, autrement, on va le perdre trs rapidement. La mthode gnrale consiste linsrer dans un plasmide qui porte une origine de rplication.
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b. Les promoteurs Deux domaines en amont du site d'initiation de la transcription sont importants dans les promoteurs procaryotes. Le domaine -10 (Pribnow box, 5' T-A-T-A-A 3') et un domaine -35 (5' T-T-G-A-C-A 3'). Ces deux domaines sont en contact avec la RNA polymrase lors de l'initiation de la transcription. Deux caractristiques des promoteurs sont importantes pour lexpression des protines, la force du promoteur et son inductibilit : La force du promoteur : Les promoteurs bactriens sont relativement faibles pour les besoins de production. Pour les amliorer, des mutations ponctuelles ou des petites dltions ont t effectues au sein de ces promoteurs, ce qui a permis d'augmenter la transcription. Plusieurs techniques ont t utilises pour augmenter la force des promoteurs :
On peut liminer des rpresseurs. Ainsi Le promoteur Plac du gne lacZ dpend de
l'activation par la CRP/cAMP. Pour pouvoir tre utilis, ce promoteur doit tre mut afin que la rpression catabolique ne puisse pas s'exercer (le rle de la rpression catabolique est de ne pas utiliser le galactose en prsence d'autres sources de carbone, principalement le glucose), ainsi on pourra avoir une transcription en prsence de glucose.
La technique de choix pour augmenter la
force dun promoteur est dutiliser un promoteur spcifique dune RNA polymrase quon
Augmentation de la force du promoteur par utilisant la T7 RNA polymrase
surproduit dans la cellule. Le plus utilis est le promoteur de la protine 10 du phage T7. La transcription utilisant la T7 RNA polymrase est trs efficace. En effet, la polymrase utilise la plupart des nuclotides triphosphate de la cellule ce qui inhibe la transcription des gnes de l'hte. Elle est 5 fois plus rapide que les polymrases bactriennes. La transcription peut faire
plusieurs fois le tour du plasmide donnant un ARN trs grand. De plus, la T7 RNA polymrase est trs spcifique, elle ne reconnat pas les promoteurs de la bactrie, si bien qu'elle ne transcrit que le gne d'intrt. 8
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Linductibilit : Cest dire son contrle : le plus souvent on dsire utiliser un promoteur inductible
par exemple lorsque la protine est trs toxique pour la bactrie. Dans ce cas, la protine est produite en dbut de la culture et inhibe la croissance cellulaire. En utilisant un promoteur utilisant inductible, on cherchera inhiber la production au dbut de la phase de croissance des bactries puis lapproche de la phase stationnaire, on induira la production. On peut utiliser des inhibiteurs de la RNA polymrase. La T7 RNA polymrase est inhibe par le lysozyme. Si on introduit le gne codant pour le lysozyme sur un plasmide, la production de lysozyme inhibera le peu de T7 RNA polymrase produite en labsence dinduction. Par contre en prsence dinduction, linhibiteur sera en trop faible quantit induction. comparativement la T7 RNA polymrase surproduite. On peut ajouter lARN polymrase au moment de la production. Dans certains cas la protine exprime est toxique pour la bactrie. Or tous les promoteurs inductibles ont une activit basale faible, si bien que la protine est produite en faible quantit en l'absence d'induction (on dit que le promoteur fuit). Si la protine est trs toxique, on peut utiliser une autre stratgie pour produire la T7 RNA polymrase en utilisant un phage M13 produisant la re T7 RNA polymrase. On fait pousser les bactries puis avant de produire, on infecte les bactries par le virus. Le virus produit la T7 RNA polymrase puis le gne d'intrt est transcrit. Dautres stratgies sont aussi utilises / : la stratgie antisens.
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c. Les squences responsables de la traduction Chez les procaryotes, l'initiation s'effectue par reconnaissance d'une squence particulire (RBS, ribosome binding site). Cette squence est compose dune squence riche en purine (Shine-Dalgarno, RBS, AGGAGG) et du codon d'initiation qui doit tre proche, idalement l'extrmit 3' du RBS doit tre 6 bases de l'ATG. Donc, si on veut exprimer un clone provenant d'une cellule eucaryote dans une bactrie, il faudra incorporer cette squence en amont de l'ATG d'initiation. Gnralement, on mutagenise la squence du gne d'intrt au niveau de l'ATG en y incorporant un site de restriction tel que Nde I (CATATG). Ce site est prsent sur le vecteur 8 nuclotides en aval d'un site de liaison au ribosome. d. Les squences responsables de larrt de la transcription On peut dans certains cas ajouter en 3' du gne des squences responsables de l'arrt de la transcription. Au niveau d'un signal de terminaison, la polymrase libre la matrice et l'ARN monocatnaire nosynthtis. Chez E. coli, il y a deux sortes de terminaison, une terminaison intrinsque et une terminaison dpendante dune protine, la protine . Dans la terminaison intrinsque, la polymrase s'arrte quand elle synthtise une srie de rsidus U dans la mesure o elle a d'abord synthtise une squence auto-complmentaire capable de se replier. C'est le repliement, l'hlice en pingle cheveux, qui se forme rapidement dans cette rgion, qui est cruciale pour l'arrt de la transcription. La squence de la rgion auto-complmentaire peut varier. Lors de la terminaison dpendante, la protine reconnat une squence sur lARN nosynthtis et catalyse larrt de la transcription.
Dans certains cas, on ajoute une squence de terminaison indpendante en 3 du gne, il y a formation dune boucle qui termine la transcription. Cette boucle a un autre avantage, elle stabilise lARN en inhibant lactivit des 3 5 exonuclases qui ne dgradent que lARN simple brin. Toutefois ces squences ne sont indispensables et sont inefficaces pour larrt de transcription dans le cas dune production utilisant la T7 RNA polymrase.
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4-
Modifications post-traductionnelles des protines produites : Le choix du systme dexpression est principalement guid par les modifications que
la protine doit subir pour tre biologiquement active. Bien quil existe des techniques permettant le transfert rapide des gnes clons entre diffrents systmes dexpression, le vecteur gntique, utilis pour exprimer le gne recombinant, doit tre adapt lhte choisi. De mme, il est important de connatre le compartiment cellulaire dans lequel la protine dintrt se replie ou exerce son activit biologique naturelle. Selon que cette protine est cytoplasmique, membranaire ou se replie dans un compartiment extracytoplasmique
Le vecteur devra contenir des squences spcifiques permettant ladressage correct de la protine. ce stade, lutilisation doutils informatiques prdictifs facilite lanalyse de la structure primaire des protines en apportant des indications quant sa localisation cellulaire. Ainsi, la prsence dune hlice hydrophobe indique que la protine est insre dans une membrane, ou doit ventuellement la traverser au cours de sa biosynthse pour atteindre un compartiment cellulaire diffrent du cytoplasme dans lequel elle est synthtise. La construction du vecteur gntique devra donc tenir compte de tous ces lments indispensables ladressage correct de la protine dans lhte cellulaire. La glycosylation des protines oriente, videmment, vers une production extracytoplasmique dans les systmes 11
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dexpression eucaryote bien documents, comme les levures, les cellules de mammifres ou encore les cellules vgtales. Cependant, une modification post-traductionnelle souvent nglige au sein des structures protiques est la formation des ponts disulfures. Indpendamment du systme utilis, procaryote ou eucaryote, il nest pas rare que la protine soit produite dans un compartiment cellulaire inappropri ne permettant pas cette modification. La formation des ponts disulfures est catalyse par un complexe enzymatique doxydorductases prsent dans un compartiment mtaboliquement oxydant, qui est soit le priplasme pour les bactries Gram-ngative, soit le rticulum endoplasmique pour les cellules eucaryotes. Les protines possdant des ponts disulfures sont gnralement actives dans un milieu extracytoplasmique, et cette liaison covalente est le plus souvent ncessaire leur stabilit. Par consquent, la production des protines ponts disulfures dans lenvironnement rducteur du cytoplasme conduit le plus souvent des problmes de repliement.
5-
Contrle de la conformation des protines La production dune protine ayant pour objectif dobtenir celle-ci dans une
conformation proche de son tat natif, il est important de pouvoir contrler le produit final. Ce contrle final revt un caractre essentiel dans les cas o la protine recombinante est purifie aprs renaturation des corps dinclusion, ou dans le cas dune application thrapeutique, lobtention dune protine soluble ne signifiant pas toujours quelle est dans un tat natif. Un ensemble de techniques biochimiques comme llectrophorse et la chromatographie par gel filtration, ou biophysiques comme la spectromtrie de masse, sont conduites pour tester lintgrit, lhomognit et la qualit des structures protiques. Si la protine est produite afin de dterminer sa structure tridimensionnelle, par cristallographie aux rayons X ou par rsonance magntique nuclaire, lobtention de cette structure est une excellente validation du processus complet. Mais les tests dactivits biologiques qui dpendent de la protine dintrt, et qui sont par nature trs varis, reprsentent la meilleure sonde de la structure native. Conclusion et perspectives : ct du choix eucaryote versus procaryote, une troisime possibilit a t apporte rcemment par lamlioration des systmes acellulaires qui, fonds sur le couplage des ractions de transcription et traduction in vitro, ont aujourdhui des rendements de synthse 12
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levs. Bien quils soient onreux, ces systmes permettent la production de protines toxiques et offrent une flexibilit incomparable, par rapport aux systmes cellulaires, pour manipuler les paramtres dexpression. Enfin, le choix dun systme dexpression repose sur dautres critres comme sa simplicit dutilisation, le cot de production et de purification de la protine, la capacit de contrler le produit final et les modifications introduites, le temps requis du clonage du gne la protine purifie, et les contraintes rglementaires.
Exemples de protines recombinantes produites dans E.Coli : hormone de croissance humaine, insuline, interfrons, interleukine-2... Principaux avantages : sa gntique est trs bien connue. De nombreux vecteurs plasmidiques ont t construits et sont donc disponibles afin d'insrer et d'exprimer un gne tranger au sein de la bactrie. Elle est par ailleurs facile utiliser, se prte trs bien la culture de masse en fermenteur. Enfin, les taux d'expression obtenus sont levs, c'est--dire qu'elle permet de produire des quantits apprciables de protines (jusqu' plusieurs grammes par litre). Principaux inconvnients : scrtant mal les protines, il est souvent ncessaire de "casser" la bactrie afin de rcuprer la protine (ce qui induit des problmes de purification, ou de solubilisation et de renaturation..., quelquefois au dtriment des rendements). Autre inconvnient majeur : E. coli n'effectue pas les modifications post-traductionnelles des protines (en particulier la glycosylation, la carboxylation, etc.), qui constituent souvent une condition sine qua non d'activit de la protine. Enfin E. coli tant une entrobactrie, il est donc ncessaire de s'assurer de l'absence d'endotoxines dans les protines purifies.
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ADN recombinant et clonage de gnes
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Objectifs
1- Dfinir un anticorps monoclonal. 2- Citer les diffrentes tapes de production dun anticorps monoclonal par la technique des hybridomes. 3- Dfinir le terme hybridome. 4- Citer les techniques de purification des anticorps monoclonaux. 5- Dfinir un anticorps monoclonal murin, hybride et humanis. 5- Dfinir les termes HAMA et HAHA. 6- Citer les applications des anticorps monoclonaux.
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PRODUCTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX (LA TECHNIQUE DES HYBRIDOMES)
Introduction : Les anticorps monoclonaux (Ac Mo) sont des Ac qui ont t artificiellement produits contre un antigne (Ag) spcifique. Ils sont extrmement spcifiques en se liant leurs Ag cibls. En laboratoire, les Ac Mo sont produits partir de clones d'une cellule. C'est pourquoi ils s'appellent monoclonaux . Ceci signifie que tous les Ac produit par cette cellule sont exactement identiques. La qualit d'une prparation d'Ac pour des fins de dosages ou d'identification repose sur deux facteurs principaux, la spcificit et l'avidit (ou affinit). Tout d'abord, l'Ac ne doit ragir que contre la protine d'intrt pour viter les ractions croises avec d'autres protines susceptibles de la contaminer, c'est la spcificit. D'autre part, il doit ragir fortement avec cette protine et avoir une grande affinit pour elle, c'est l'avidit. En 1975, Khler et Milstein ont russi fabriquer des Ac Mo laide de la technique de lhybridome. Au cours des 25 dernires annes, les techniques de biologie cellulaire et molculaire se sont affines, si bien quil est devenu possible aujourdhui de fabriquer des quantits pratiquement illimites dAc Mo murins, chimres et humaniss pour de nombreuses applications cliniques, notamment dans la recherche, le diagnostic et le traitement des maladies. Les premires applications thrapeutiques ont fait appel des Ac Mo produits chez la souris (Ac murins). Les injections dAc murins provoquaient cependant des ractions immunes et entranaient la formation dAc humains anti-souris (Human Anti-Mouse Antibodies : HAMA). La dcouverte du fondement gntique de la diversit des Ac et la biotechnologie du DNA recombinant ont, par la suite, ouvert la porte aux formes partiellement humanises dAc murins. Les Ac Mo chimres, humaniss et entirement humains sont moins immunognes, et induisent beaucoup moins frquemment la formation dAc anti-immunoglobuline dans le cadre de la pratique thrapeutique. Ces Ac peuvent par consquent tre utiliss de manire rpte durant une priode prolonge. Les Ac Mo se sont ainsi largement imposs au cours des dernires annes dans le traitement de diffrentes formes de cancer, de certaines maladies rhumatismales ou auto-immunes, de mme que dans le contrle des ractions de rejet aprs greffe. 18
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1-
Immunisation des animaux : Certaines espces sont particulirement employes pour produire des Ac Mo: la souris,
le rat etc. ... . Le choix de l'animal repose sur divers critres. Si on doit produire beaucoup d'antisrum, on choisit alors un animal plus grand. D'autre part, si on veut un animal facile manipuler et lever en laboratoire, on se tournera vers des espces plus petites. Quoi qu'il en soit, il est trs important de choisir un animal qui est phylogntiquement le plus loign possible de la source de la protine avec laquelle on veut faire l'immunisation. En effet, une protine est d'autant plus antignique qu'elle ne ressemble pas une protine normalement prsente chez l'espce qu'on veut immuniser. Ainsi, si on veut prparer un Ac contre une protine de rat, on prfrera immuniser un cheval ou une chvre plutt qu'un autre rongeur (souris ou lapin). Il est aussi vident qu'on ne peut pas immuniser un animal contre une protine commune aux animaux de sa propre espce. Les souris sont particulirement employes pour la production d'Ac Mo. On peut injecter l'antigne de plusieurs faons, l'important est que l'antigne reste le plus longtemps possible dans l'organisme et arrive dans la circulation sanguine petit petit pour maximiser la production d'Ac. Les principales voies d'administration sont les voies sous-cutane, intradermique, ou intramusculaire. Pour ralentir la libration de l'antigne dans la circulation sanguine et activer la rponse immunitaire on combine gnralement l'antigne une mulsion appele adjuvant. Le plus connu est sans contredit l'adjuvant de Freund qui est compos d'huile minrale additionne d'un agent mulsionnant (adjuvant incomplet) et de particules de bacille inactiv de la tuberculose (adjuvant complet). D'autres produits sont plus rarement employs comme des sels d'alun, de l'albumine srique de buf mthyle, etc. Le systme immunitaire produit relativement facilement des Ac contre les grosses molcules comme les protines et les polysaccharides, on qualifie ces molcules d'immunognes. Cependant les molcules de petite taille (/ : hormones strodiennes, petits peptides, etc.) sont trs peu antigniques. On peut cependant produire des Ac contre de petites molcules qu'on appelle alors "haptnes". Il faut tout d'abord conjuguer ces petites molcules sur des vecteurs "carriers", des protines comme l'albumine. Ce complexe, une fois inject chez l'animal induira la formation d'Ac contre l'haptne en tant que tel et le vecteur. Aprs avoir dbarrass les Ac contre l'haptne proprement dit de ceux reconnaissant le vecteur, on peut alors utiliser ces anti-haptnes. C'est de cette faon qu'on peut prparer des Ac contre certaines hormones, mdicaments ou des petits peptides.
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Le srum contenant l'Ac recherch est appel antisrum. Il contient normalement plusieurs espces d'Ac diffrents (environ une dizaine de clonotypes) dirigs contre plusieurs pitopes (dterminants ou sites de liaison) du mme antigne, on appelle cette prparation polyclonale. Avec un tel mlange, une mme molcule d'antigne peut fixer en mme temps plusieurs Ac diffrents, chacun sur son pitope spcifique. On a dvelopp des techniques permettant d'isoler et de cloner des lymphocytes ne produisant qu'une espce molculaire (i.e. clonotype) d'Ac, ces Ac sont appels Mo. Ces Ac ne reconnaissent qu'un seul pitope de l'antigne.
2-
Prparation d'Ac Mo : Une prparation d'Ac Mo contient une seule espce d'Ac (clonotype) ne reconnaissant
qu'un seul pitope de l'antigne. Pour obtenir une telle prparation, on injecte tout d'abord l'antigne une souris. Aprs quelques jours, la rate contiendra un grand nombre de lymphocytes B produisant divers clonotypes. Les lymphocytes B ne peuvent pas prolifrer dans des cultures de cellules in vitro. Ces lymphocytes B de la rate peuvent quand mme tre isole et fusionner grce au polythylne glycol (PEG) avec des cellules de mylome, qui sont des cellules transformes, c'est--dire des lignes immortelles. Les souches de mylome utilises doivent tre des mutants n'ayant pas, soit la thymidine kinase (TKase), soit la HGPRTase, deux enzymes ncessaires la biosynthse de novo des nuclotides. Ces cellules ne peuvent se dvelopper et se multiplier qu'en produisant des nuclotides par les voies mtaboliques de rcupration des nuclotides. Ces voies sont inhibes par des antagonistes de l'acide folique comme l'aminoptrine. Ces mylomes mutants meurent dans un milieu contenant de l'aminoptrine o tout antagoniste de l'acide folique parce qu'ils sont incapables de biosynthtiser des nuclotides. En effet l'aminoptrine bloque la biosynthse via les voies de rcupration et la mutation empche le fonctionnement des voies de novo. Le milieu contient aussi de la thymidine et de l'hypoxantine (milieu HAT), les deux bases azotes qui constituent les points de dpart des voies de rcupration.
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Immunisation de la souris
Ablation de la rate Fusion des et extraction des Lymphocytes B
Microculture primaire
cellules splniques des cellules et mylomatoses en milieu HAT
Le rsultat de la fusion donnera un mlange contenant alors trois types de cellules. Des cellules de rate non fusionnes qui produisent des Ac, mais qui sont incapables de croitre in vitro. Des cellules transformes non fusionnes capables de se multiplier mais sont inhibes par l'aminoptrine. Enfin, des hybridomes, c'est--dire les cellules rsultant de la fusion des cellules transformes et des lymphocytes. Les hybridomes sont capables de se multiplier indfiniment car ils possdent le gnome des cellules transformes. De plus, comme ils possdent aussi le gnome des lymphocytes, les hybridomes sont capables de biosynthtiser des nuclotides par la voie de rcupration en utilisant la thymine et l'hypoxanthine du milieu. Donc seuls les hybridomes seront capables de prolifrer dans ce milieu et de produire des Ac. Evidemment la plupart des hybridomes ne produiront pas l'Ac recherch, il faut alors procder un criblage pour les isoler et les cloner. Pour isoler des clones ne produisant qu'une seule espce d'Ac, on a recourt la technique des dilutions limites ou la cytomtrie de flux. On dilue les hybridomes une concentration trs faible. On prpare des cultures avec de trs petits volumes. La dilution limite fait en sorte que les probabilits que ce trs petit volume contienne deux cellules sont extrmement faibles. On est donc quasi assur que les cellules obtenues dans chaque culture ne proviennent que d'une seule cellule initiale; ce sont donc des clones purs qui videmment, ne produisent qu'un seul clonotype d'Ac. Les clones produisant un Ac adquat peuvent ce moment tre identifis. Le rendement de cette mthode est videmment trs faible, et une trs faible fraction des hybridomes produiront un clonotype contre l'antigne.
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Sceening des microcultures primaires pour leur croissance. Tester les Ac utiles dans le surnagent des cultures cellules. Utiliser le srum de la souris immunise comme contrle positif. Le srum dune souris nave et le surnageant de culture des cellules mylomateuses fourniront les contrles ngatifs. Transfrer les cultures scrtant les Ac dans des Viaux de plus en plus grands, pour les expendre
Slectionner les hybridomes scrtant les Ac Mo voulus grce un trie par le cytomtre flux ou par dautres mthodes (dilutions limites)
Ces clones doivent tre alors l'objet de cultures massives pour produire des quantits suffisantes d'Ac. Mme si ces cultures massives peuvent tre faites in vitro, elles sont cependant plus souvent faites in vivo. Pour cela, on injecte ces cellules dans l'abdomen d'autres souris o elles prolifreront sous forme d'ascites. Ces ascites scrteront des Ac dans la cavit pritonale de ces souris. Ces Ac pourront ensuite tre rcuprs en prlevant le liquide ascitique.
On injecte ces cellules dans l'abdomen d'autres souris o elles prolifreront sous forme d'ascites. Ces ascites scrteront des Ac dans la cavit pritonale de ces souris. Ces Ac pourront ensuite tre rcuprs en prlevant le liquide ascitique
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Les techniques sont trs coteuses en termes d'installation, de ractifs, de temps et de main-duvre. Les Ac obtenus sont cependant extrmement spcifiques. Cependant, comme cette spcificit ne dpend que d'un seul pitope, les Ac Mo se fixent aussi fortement sur toute protine contaminante contenant cet pitope que sur l'antigne original. De plus, les techniques immunochimiques ncessitant la formation de prcipitines ou de gros complexes Ac-antigne sont inutilisables avec des Ac Mo.
3- Purification des Ac : Dpendant de l'usage prvu, on emploiera des prparations plus ou moins purifies d'Ac. Certaines applications n'exigent qu'un antisrum, d'autres ncessitent des Ac purs, mais la plupart auront des exigences entre ces deux extrmes. La technique de purification la plus souvent employe est la chromatographie d'affinit. Mais, avant, on peut procder une sparation brute des Ig des autres protines sriques (albumine, transferrine, etc.) par prcipitation diffrentielle au sulfate d'ammonium. Une
chromatographie d'change ionique est aussi possible, quoique moins employe. De plus en plus, on procde par chromatographie d'affinit avec la protine A ou la protine G comme ligand. Ce sont des protines de source bactrienne ayant la capacit de se fixer sur la rgion Fc des Ac. Une protine rcemment dcouverte, la protine L, se liant aux chanes k de certaines classes d'Ac, devient de plus en plus populaire. Ensuite, pour purifier l'Ac spcifique, on peut procder une chromatographie d'affinit avec l'antigne comme ligand. Seul l'Ac contre cette protine devrait s'attacher sur la colonne, toutes les autres protines du srum tant laves dans l'lut. On peut aussi utiliser des "peptides artificiels" ressemblant certains pitopes particulirement antigniques de l'antigne (ligands peptidomimtiques). Il ne reste qu' rcuprer l'Ac qui est ce moment pratiquement pur. Les colonnes de chromatographie classiques sont aussi en voie d'tre remplaces par des billes magntises de rsine sur lesquelles est li le ligand choisi. Le gros avantage de cette approche est la rapidit de sparation. Plutt que de laisser percoler divers tampons travers une colonne, on peut facilement rcuprer les billes magntises (et ce qui est li dessus) avec un aimant.
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La purification des Ac obtenus du liquide sascite se fait grce la chromatographie daffinit ou grce la technique des billes magntises
4-
De la souris lhomme: Ac Mo chimres, humaniss et entirement humains : Les techniques de la gntique permettent aux scientifiques de fabriquer des Ac Mo
humaniss (presque humain) en greffant un Ac humain sur un Ac d'une souris. Seulement la partie de l'Ac de la souris qui est critique la liaison de l'antigne cibl, demeure sans changement. Les Ac Mo humaniss sont humains environ 90%. Ils seront probablement moins rejets par le corps humain, et probablement plus efficaces. La recherche est axe maintenant sur la production d'Ac entirement humains partir de souris transgniques. Dans un premier temps, on sest mis produire des Ac Mo chimres. Ceux-ci sont constitus dune partie murine variable et dune partie humaine constante. La frquence dinduction dune rponse anti-Ac, a ainsi considrablement diminu, mais la formation de HAMA reste toujours un problme potentiel significatif. La poursuite systmatique des efforts de recherche a par la suite conduit au dveloppement dAc humaniss. Dans les Ac humaniss, toutes les squences dacides amins provenant de la souris sont remplaces par des squences humaines, lexception des Complementary Determing Regions (CDR) responsables de la formation de lantigne.
Ac Mo recombinants. Les squences de souris sont reprsentes en noir, les portions humaines en blanc.
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On esprait obtenir ainsi une rduction significative de limmunognicit encore associe aux Ac chimres. En pratique, on sest cependant trouv confront linduction de ractions Ac humains antihumains (HAHA), dont lincidence tait nanmoins relativement faible par rapport celle constate avec les Ac chimres. Lhumanisation des Ac murins ne se fait donc pas sans problmes, car les squences dacides amins situes entre les rgions CDR contribuent de manire non ngligeable laffinit des Ac. Il nest donc pas possible, dans lhumanisation de certains Ac, de conserver exclusivement les rgions CDR, et il faut souvent se rsoudre maintenir aussi certaines squences dAc murins dans les segments situs entre les zones CDR (Framework). Des Ac entirement humains ont t dvelopps au cours des dernires annes, afin de diminuer encore plus limmunognicit des Ac Mo thrapeutiques. Diffrentes mthodes ont t utilises: des souris porteuses dun dfaut immunitaire (severe combined immune deficiency, SCID) peuvent tre reconstruites laide de tissu foetal humain. Limmunisation de ces souris gnre des Ac humains. La plus grande partie des Ac humains est cependant produite in vitro par la mthode Phage- Display ou par lintermdiaire de souris transgniques produisant des Ac entirement humains. Limmunognicit des Ac thrapeutiques constitue un srieux problme qui limite en pratique leur utilisation rpte dans le traitement de diffrentes maladies. Limmunognicit des Ac Mo est due dabord la reconnaissance par le systme immunitaire des squences dacides amins trangres (squences murines). Cest la reconnaissance de ce phnomne qui a conduit au dveloppement successif dAc initialement chimres, puis humaniss et maintenant entirement humains. Il faut toutefois bien comprendre que mme les Ac entirement humains conservent, de par leur spcificit, une squence dacides amins unique (trangre) pour lorganisme. Cette squence contient le site de formation des Ac et est appele idiotype. Lorganisme peut donc rpondre la prsence de cette rgion idiotype des Ac entirement humains par la formation dAc humains antihumains (HAHA). On peut retenir, en rsum, que le dveloppement successif dAc chimres, humaniss, puis entirement humains a permis de diminuer significativement limmunognicit des Ac initialement murins. Si cette volution a autoris une utilisation thrapeutique de ces Ac dans de nombreuses maladies de lhomme ncessitant des applications rptes, on ne saurait considrer simplement le passage des Ac chimres aux Ac humaniss, puis aux Ac entirement humains, comme un progrs constant de la technique de traitement. Chacune de ces classes dAc provenant de procds de fabrication biotechnologique diffrents a ses
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avantages et ses inconvnients, quil sagit dexaminer au cas par cas, dans une perspective dexprimentation clinique.
5- Applications : Une fois injects dans des patients, les Ac Mo ont dclench une rponse du systme immunitaire, parce que le corps humain les a identifis comme substance trangre. Des injections rptes ont eu comme consquence le dgagement rapide de l'Ac des souris, qui l'a rendu inefficace. Dans certains cas, les deuximes ou les injections suivantes ont entran une raction d'hypersensibilit reprsentant un danger pour la vie. La gntique est utilise pour surmonter cet obstacle srieux. Etude approfondie des spcificits et idiotypes des immunoglobulines. Reconnaissance et sparation des diffrentes catgories cellulaires impliques dans la
rponse immune. Typage des cellules tumorales et lymphodes et localisation des tumeurs infra-cliniques Srodiagnostic des affections bactriennes et virales. Elimination cible des cellules tumorales ; inactivation et destruction de nombreuses
catgories cellulaires.
AUTRE METHODE POUR FABRIQUER DES AC MO : LA TECHNIQUE DU PHAGE DISPLAY
La prsentation la surface de phages de protines, le phage display, est un puissant outil de slection de protines combinatoires. Les phages peuvent prsenter leur surface des fragments d'anticorps scFv (single chain Fv), Fab et Fv. Un lment essentiel de cette technologie est la construction de banques combinatoires d'anticorps. Les domaines variables des immunoglobulines peuvent tre exprimes soit sous forme scFv dans les quels les domaines VH et VL rarrangs sont lies de manire covalente par un court peptide, soit sous forme de Fab. Avant tout isolement d'anticorps recombinants en utilisant la technologie du phage display, il est ncessaire de raliser des banques de phages prsentant des anticorps, ou plus exactement des fragments d'anticorps, de talles et de complexits convenables. Un des lments dterminants pour atteindre cet objectif est le choix de la source des gnes d'immunoglobulines.
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Pour amplifier par PCR les rgions V des diffrentes classes d'immunoglobulines, il est possible d'utiliser des lymphocytes d'individus immunises. En effet, de tels individus auront une rponse immunitaire qui aura multipli, par expansion clonale, les lymphocytes B possdant les rgions V irnpliques dans la rponse immunitaire dirige contre I antigne d'intrt. De faon naturelle, le rpertoire de ces individus est enrichi en immunoglobulines possdant une bonne affinit, augmentant ainsi la probabilit d'isoler un anticorps de haute affinit. Des banques peuvent galement tre assembles aprs amplification de gnes provenant d'individus non immunises ou nafs afin d'obtenir une diversit maximale. En effet chez des sujets nafs, des gnes d'immunoglobulines ne seront pas surreprsents, comme dans le cas d'individus fortement rpondeurs, offrant la possibilit d'amplifier et de cloner un vaste panel de gnes donnant naissance a une banque de phages plus uniforme. II faut noter ici que la constitution de banques a partir d'individus immunises ou nafs ne refltera jamais la diversit obtenue dans les lymphocytes qui est le rsultat de mcanismes de rarrangements, de mutations, d'insertions..., qui seront absents lors du clonage des seules rgions V. La diversit des banques (surtout naves) peut tre trs largement augmente en utilisant un grand nombre de donneurs. Une autre mthode d'obtention d'une banque possdant une grande diversit est d'en construire une, dite alors semi-synthtique, par mutation alatoire par PCR des rgions CDR. II est ainsi possible d'obtenir des anticorps qui auraient t limins par la slection naturelle. II est donc envisageable par cette technique d'isoler des anticorps qui n'ont jamais existe chez le donneur de lymphocytes. Dans la littrature, il a t dcrit de nombreuses banques obtenues par diverses rnthodes et d'aprs les rsultats, il sernble que la complexit de la banque soit un des lments clef pour I obtention d'anticorps de bonne affinit. Des phages exprimant des anticorps de spcificits intressantes peuvent tre isoles partir de banques selon un protocole schmatique liaison des phages sur I antigne d'intrt, limination, par lavages, des phages non fixes ou ayant une faible affinit, lution des phages avec dtermination du nombre de phages lus, infection dE.coli et multiplication des phages afin de produire la premire sous-
banque. Ces quatre tapes constituent un tour de bio-panning qui sera rpte plusieurs fois. Le nombre de phages mis en contact avec I antigne tant connu, te suivi du nombre de phages
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Clues aprs chaque tour de bio io-panning permet de rnesurer l'enrichissement en clones positifs 'enrichissement au cours des tapes de bio-panning. panning. Un des facteurs importants pour la russite de l'isolement d'anticorps est lantigne : la 'isolement grande majorit des expriences ont t faites l'aide d'antignes purifies fixes sur une surface 'aide de plastique (comme dans une raction ELISA classique). La puret et la conformation de I antigne vont jouer dans lobtention de clones positifs : si I antigne est peu reprsent, il obtention sera difficile voire impossible d'identifier des clones positifs car les phages prsentant des fragments d'irnmunoglobulines ne pourront tre enrichis lors des tours de slection su successifs. La conformation de lantigne fixe sur la surface plastique ne doit pas tre trop lo antigne loigne de la conformation de la molcule active si on veut viter l'obtention de clones reconnaissants de 'obtention pseudo-pitopes. Production dAc Mo en utilisant la technique du phage display
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Objectifs
1- Citer les diffrentes tapes de limmunolectrophorse. 2- Citer les principales tapes de la technique ELISA. ; 3- Citer le principe de lELISA sandwich. 4- Citer le principe des tests dagglutination quantitatifs. 5- Citer le principe des tests de Coombs. 6Citer et connaitre les principes des tests de purifications et
didentification des protines. 7- Citer et connaitre les principes des techniques de marquage et
dtection des antignes cellulaires et tissulaires.
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UTILISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX COMME OUTIL DANALYSE
INTRODUCTION De par leur extrme spcificit pour leur antigne, les anticorps monoclonaux constituent des outils diagnostiques trs utiles dans les domaines didentification, de purification et de quantification des antignes solubles ou particulaires. De plus la possibilit de conjuguer ces Ac des substances fluorescentes, radio-mettrices ou autres, permet de pousser le diagnostic in vivo.
1-
limmunodiffusion
1-1-Immunodiffusion radiale (mthode de Mancini) : Cette technique consiste couler une glose dans laquelle on fait incorporer un antisrum (Ac). Une fois la glose endurcie, on dpose au niveau des puits la solution contenant la protine (Ag) que lon veut doser. La diffusion de la protine dans la glose contenant lanti-srum cre une zone circulaire de prcipitation qui correspond la formation de complexes immuns (Ac-Ag). Le diamtre au carr de cette zone est proportionnel la concentration de la protine dans la solution analyser. On utilise des solutions talons o les concentrations de la protine en question sont connues et on dduit la concentration de la protine dans la solution analyse par extrapolation partir des diamtres des solutions talons.
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1-2- Immunolectrophorse : Cette technique combine une lectrophorse des protines (Ag) suivie dune diffusion des Ag (spars lectrophortiquement) et des anticorps. La solution antignique (srum, urines etc..) est spare au pralable par lectrophorse, dans des conditions non dnaturantes, puis elle diffuse dans un gel o lanticorps est incorpor. Cette extension de la migration durant llectrophorse permet une information additionnelle au sujet de la structure antignique. On dpose au niveau du second puits un chantillon tmoin qui sert de rfrence. Les diffrentes tapes sont entrecoupes par des lavages dans des solutions spciales pour dcrocher les protines fixes de faon non spcifique. Aux dernires tapes on utilise un colorant des protines pour visualiser les arcs de prcipitation, enfin on limine lexcs de colorant par une solution base dacide actique. 1- Dposer la solution contenant les protines (Ac) analyser dans les puits. 2- Faire migrer dans un champ lectrique. 3- Dposer les anti-srums correspondants au niveau de chaque rigole. 4- Laisser diffuser. 5- Colorer avec un colorant des protines (Amido-Schwartz). 6- Lire la plaque.
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1-3- immunofixation : Technique comparable limmunolectrophorse, mais qui prsente un avantage par rapport cette dernire : une sensibilit plus grande et un temps dexcution beaucoup plus court. Le milieu contenant lAc (srum) est dpos dans des puits au niveau de diffrentes pistes, on pratique ensuite une lectrophorse. Chaque piste est ensuite incube avec un Ac particulier anti-classe chanes lourdes et anti-classes chanes lgres (anti-srum) et la ligne de prcipitation est rvle par un colorant des protines. Les diffrentes tapes sont : 1-Dpt du srum et migration 2-Dpt des anti-srum anti : -IgG, -IgA, -IgM, -, -, et de lanti-srum total (ELP) et diffusion. 3- Rvlation : bande IgG monoclonale
2-
Radioimmunologie et immunoenzymologie : Les principales applications quantitatives des immunodosages sont l'ELISA :
"enzyme-linked immunosorbent assay" et le dosage radio-immunologique ou RIA "radioimmunoassay". Ces techniques sont assez semblables quant leurs principes. La diffrence majeure est la nature du signal mesur: radioactivit dans un RIA et activit enzymatique dans un ELISA. Dans un RIA les anticorps secondaires (ou la protine A ou la biotine) sont conjugus un atome radioactif (tritium, iode-125, etc.) tandis qu'une enzyme (phosphatase alcaline, peroxydase de raifort, etc.) est utilise dans un ELISA. On peut se servir de mthodes dites en phase liquide (ou homognes) ou en phase solide (ou par adsorption). Une technique plus rcente consiste utiliser des anticorps
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secondaires conjugus des microparticules aimantes, les complexes ternaires peuvent alors tre facilement spars des anticorps ou antignes primaires en excs (Imx = immunoparticles assay). Les RIA sont surtout de type phase liquide puisqu'il faut tre capable de les transfrer dans une fiole scintillation. Dans ces techniques l'emploi d'un agent bloquant est aussi de rigueur. Les techniques en phase solides peuvent procder par diffrents types d'adsorption: liaison directe, "en sandwich", ou en pont. Il faut se souvenir que, peu importe les types de liaison, il faut empcher l'adsorption sur la matrice solide des molcules qui ne doivent pas s'y attacher directement. Ceci vise diminuer autant que possible le bruit de fond. On utilise donc un agent bloquant. Pour bloquer ces sites, on peut saturer les sites libres avec un agent saturant aprs l'adsorption. On peut aussi mettre dans le milieu un agent de surface qui inhibe l'adsorption additionnelle de molcules, mais sans dtacher les molcules dj adsorbes. Dans ce dernier cas, un dtergent trs doux comme le "Tween 20" est employ. Pour la saturation des sites on peut utiliser une protine comme l'albumine, le collagne, etc. Les ELISA sont surtout de type phase solide. De nombreux lavages servent aussi diminuer le bruit de fond.
Plaque ELISA
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Enzyme + substrat
2-1- RIA directe :
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2-2-ELISA ou RIA comptitives:
2-3-ELISA ou RIA sandwich : La mthode sandwich utilise deux Ac diffrents qui ragissent avec lAg dont on veut mesurer la concentration. Une quantit fixe dun Ac (1) est attache une srie de supports solides / : puits de microtitration en plastique (plaque ELISA). Des solutions tests contenant des Ag une concentration inconnue ou des sries de solutions standards avec des concentrations connues sont dposes dans les puits. Les Ag non fixs sont limins par des lavages, et le second Ac (2) marqu (radioisotope ou enzyme) est dpos et il se fixe lAg qui sert de pont entre les Ac (1) et (2). Ainsi, plus il y a dAg dans les solutions standard ou les solutions tests, plus il y aura dAc (2) marqus fixs. Les rsultats obtenus partir des solutions standards sont utiliss pour construire une courbe de fixation de lAc (2) en fonction de la concentration de lAg. A partir de cette courbe on peut valuer la quantit dAg. Lutilisation de cette technique ncessite que les deux Ac reconnaissent des pitopes antigniques qui ne se chevauchent pas, sinon lAc (2) ne pourra pas se fixer sur lAg. Une des variantes de cette technique est reprsente par lutilisation dAg fixs au support solide (soit directement soit par lintermdiaire dun Ac lui mme attach ce support), dans le cas o on rechercherait dans le srum dun individu, des Ac spcifiques un Ag donn / : Ac anti-Ag de surface du virus de lhpatite B.
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3-
Electrosynrse et lectrophorse en fuse : Support: gel d'agarose dont le pH est choisi de telle sorte que l'anticorps soit charg
positivement et l'antigne ngativement. Technique: on applique un courant lectrique travers le gel, l'antigne et l'anticorps migrent l'un vers l'autre et prcipitent. Avantages: sensibilit 10 20 fois augmente par rapport l'immunodiffusion double. Les antignes peuvent tre quantifis en les soumettant une lectrophorse dans un gel soumettant contenant l'anticorps, selon la technique d'lectrophorse en fuse. Le pH est choisi de telle sorte que les anticorps soient immobiles et lantigne soit charg ngativement. Des lignes de prcipitation dlimitent la hauteur des fuses proportionnellement la concentration de l'antigne et les concentrations sont obtenues par extrapolation partir d'talons.
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4-
Agglutination :
4-1- Les tests dagglutination : aAgglutination-hmagglutination:
Quand lAg se trouve sous forme particulaire, la raction dun Ac avec lAg peut tre dtecte par agglutination de lAg. Si lAg est un globule rouge (GR), on utilise le terme dhmmaglutination. Le terme agglutinine est utilis pour dcrire les Ac qui agglutinent les Ag particulaires. Si lAg est un GR, le terme hmagglutinine est utilis. Tout les Ac peuvent thoriquement agglutiner les Ag particulaires, mais cest lIgM grce sa grande valence qui constitue la meilleure agglutinine. bles tests qualitatifs dagglutination : Ces tests peuvent tre utiliss pour mettre en vidence la prsence dun Ag ou dun Ac. LAc est mlang avec lAg particulaire et la positivit du test est indique par lagglutination des Ag particulaires (dtermination des groupes rythrocytaires).
c-
les tests dagglutination quantitatifs : Sont utiliss pour quantifier le niveau des Ac dirigs contre un Ag particulaire. Dans
ce test on effectue des dilutions sries de lchantillon analyser, on rajoute aprs un nombre fixe de GR ou de bactries ou dautres Ag particulaires et on dtermine la dilution maximale qui provoque une agglutination et on appellera cette dilution titre. Les rsultats seront indiqus comme la rciproque de la dilution maximale qui provoque une agglutination.
Leffet de zone : Dans certains cas o la concentration des Ac est leve (faibles dilutions), il ne se produit pas dagglutination. Lagglutination apparatra au fur et mesure que lchantillon est dilu. Ce fait de zone est d lexcs dAc rsultant dans la formation de petits complexes qui ne sassocient pas pour former une agglutination visible.
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4- 2- Hmagglutination passive : Les tests dagglutination utilisent uniquement les Ag particulaires. Cependant il est possible de fixer des Ag solubles la surface des GR, et dutiliser ces GR dans un test dagglutination pour des Ac dirigs contre cet Ag soluble. Le procd est le mme que les autres tests dagglutination.
4-3- Le test de Coombs (test antiglobuline) : atest de Coombs direct : La fixation dAc sur les GR ne rsulte pas toujours en une
hmagglutination (zone dexcs dAg ou dAc, empchement de lagglutination cause des charges lectriques prsents la surface des GR). Dans ces cas lAc est dit incomplet , et il sagit l dune dfinition purement fonctionnelle. Dans le but de dterminer la prsence de ces Ac non agglutinants sur les GR, on rajoute un second Ac (anti-immunoglobuline) dirigs contre lac fix la surface du GR. Cette anti-immunoglobuline provoque alors une agglutination des GR.
b-
test de Coombs indirect : Si on veut dterminer la prsence dAc dirigs contre un GR
particulier dans un srum et si en plus on veut tre sur de dtecter la prsence dAc non agglutinants, on pratique le test de Coombs indirecte. On incube les GR avec le srum, on fait un lavage pour liminer les Ac non fixs, et on rajoute une anti-immunoglobbuline qui ponte les GR.
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4-4- Test dinhibition de lhmagglutination : Le test dagglutination peut tre modifi de sorte pouvoir dterminer le taux des Ag solubles. Au cours de ce test, on mesure la capacit dun Ag soluble inhiber lagglutination de GR sensibilises par cet Ag par un Ac. Un taux fixe dAc dirigs contre lAg en question est mlang un taux fixe de GR sensibiliss par cet Ag. On rajoute lensemble diffrentes quantits de lchantillon dans lequel on veut analyser la prsence de lAg. Si lchantillon contient lAg, lAg soluble va entrer en comptition avec lAg fix sur la GR quand sa fixation de lAc, inhibant ainsi lagglutination des GR. Par des dilutions sries de lchantillon, on peut quantifier lAg prsent dans cet chantillon.
5-
Test de fixation ou de dviation du complment : Les ractions Ag-Ac conduisent la formation de complexes immuns qui activent la voie
classique du complment, cette raction peut tre exploite pour dterminer la quantit dAg ou dAc prsents. La raction de fixation du complment dtecte la prsence des anticorps : 1- Titrage du srum tester par des dilutions de 2 en 2. 2- Ajouter une quantit constante dantignes. Si le srum contient les anticorps recherchs, il se forme des complexes immuns (CI) 3-Le complment est ajout ensuite, la prsence des CI entrane une consommation du complment. 4- On ajoute les cellules indicatrices, qui sont des globules rouges (GR) recouverts dune dose subagglutinante dAc anti-globules rouges. La persistance dune activit du complment est mise en vidence par la lyse des globules rouges (La quantit de complment ajoute est choisie de faon ce quelle soit tout juste capable de lyser les GR en labsence de CI).
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6-
Purification et identification des protines : Les Ac peuvent tre utiliss pour purifier et identifier des protines partir de
solutions. 6-1 - Chromatographie daffinit : Permet de purifier des Ac de spcificit dtermine partir dun mlange htrogne (srum). On couple lAg un support inerte (billes de dextran) quon place dans une colonne travers laquelle on introduit la prparation dAc dans des conditions de temprature et de pH permettant la fixation des Ac. Les Ac dirigs contre les Ag restent fixer la colonne alors que les autres sont limins par lavages. Les Ac fixs sont lus de la colonne avec un tampon dlution qui dissocie les Ag des Ac.
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6-2- chromatographie changeuse dions :
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6-3- Immuno-blot (Western Blotting) : Cette technique est utilise pour dterminer la quantit relative et le poids molculaire dune protine prsente dans un mlange de protines ou dautres molcules. Le mlange est tout dabord soumis une sparation analytique par lectrophorse en gel de polyacrylamide en prsence de SDS (Sulfate Dodecyl Sodium) de telle sorte que la position finale des diffrentes protines dans le gel est fonction de leurs poids molculaires. La gamme des protines spares est ensuite transfre du gel vers un support membranaire (nitrocellulose) par capillarit (blotting) ou par lectrophorse. La membrane acquiert ainsi une rplique de la gamme des protines spares prsentes dans le gel. Durant ce transfert le SDS est dplac des protines, et les dterminants antigniques natifs se reconstituent lors du repliement des protines. La position dune protine donne peut tre alors dtecte par la fixation dAc marqus spcifiques de cette protine, fournissant de la sorte des renseignements au sujet de la taille et de la quantit de cette protine antignique. ETAPES DE LIMMUNO-BLOT
1- Electrophorse des protines, 2- Migration des diffrentes protines, 3- Transfert des protines sur nitrocellulose, 4- Immunomarquage par un anticorps spcifique de la protine recherche, 5- Visualisation des bandes correspondant la protine recherche.
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6-4- Elispot : ELISpot est un test d'immunologie bas sur la technique ELISA, technique immunoenzymatique permettant de dnombrer des cellules partir de leur scrtion. Son principe consiste capturer la scrtion de molcules par des cellules (anticorps ou cytokines) sur un support solide sensibilis. Aprs limination des cellules, l'immunocomplexe est rvl par une mthode ELISA utilisant un substrat chromogne insoluble, dont la prcipitation localise gnre des taches colores ou immunospots. LELISpot technique, grce sa haute sensibilit, sa reproductibilit et sa simplicit, reste de nos jours la technologie de rfrence pour la mesure des rponses spcifiques des lymphocytes T avec des applications dans de multiples domaines de recherche (dveloppement de vaccins, maladies infectieuses, allergies, tumeurs et maladies autoimmunes).
7-
Marquage et dtection des antignes cellulaires et tissulaires :
7-1- Immunofluorescence et immunohistochimie : Les Ac peuvent tre utiliss pour la distribution anatomique dun Ag dans un tissu ou lintrieur des compartiments cellulaires. Le tissu est dcoup en fines lamelles de quelques microns dpaisseur. La lamelle est alors incube avec un Ac marqu par un fluorochrome et spcifique de lAg recherch. Un microscope fluorescence est alors utilis pour localiser lAg en question par lintermdiaire de la fluorescence mise par lAc marqu et fix cet Ag, cest limmunofluorescence directe (IF). 43
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Dans limmunofluorescence indirecte (IFI), le premier Ac qui reconnat lAg est lui mme reconnu par un second Ac qui porte le fluorochrome. Cette technique est utilise dans les cas o on veut rechercher la prsence dans le srum ou les liquides biologiques dun individu, dAc dirigs contre un Ag connu prsent dans le tissu utilis. En plus des fluorochromes, les Ac rvlateurs peuvent tre marqus par / : des enzymes (peroxydase, phosphatase alcaline). Cette technique peut aussi tre utilise dans lisolement et/ ou lidentification dAg prsents sur, ou dans des cellules en suspension permettant ainsi de les classer. La lecture se fait grce un microscope fluorescence.
7-2- La cytomtrie en flux Cette technique permet didentifier, les lignes, les tapes de maturation, ltat dactivation dune cellule, par la dtermination de lexpression de diffrentes molcules prsentes la surface ou lintrieur de cette cellule. La cellule est colore par une sonde (Ac) spcifique pour ces molcules et marqu par un fluorochrome. Le cytomtre flux dtecte alors la quantit de fluorescence mise par la cellule qui a fix la sonde marque. Le FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorter = analyseur et trieur de cellules) est une variante du cytomtre de flux, qui permet de sparer les populations cellulaires selon le type et la quantit de fluorescence mise. La prsence de dflecteurs permet de sparer les cellules selon des champs magntiques dont la force et la direction varient en fonction de lintensit du signal de fluorescence mis.
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LMD Immunotechnologie et Vaccinologie 2008-2009 Principe du cytomtre flux
Aspect de limage des cellules Limage est donne selon 2 axes : Laxe des x pour la taille. Laxe des y pour la granulosit.
granulosit
Taille
7-3- Isolement des populations cellulaires par les billes magntises : Lisolement des populations lymphocytaires repose sur lutilisation d dAc, spcifiques de certaines structures qui se trouvent la surface de ces cellules (antignes de surface), ces anticorps sont associs des billes magntises. Les cellules possdant ces Ag se fixent sur les billes recouvertes danticorps, et les billes seront spares par un aimant.
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7-4- Marquage des cellules in vivo : (Immunoscintigraphie) Il sagit de marquer les cellules in vivo par des Ac Mo coupls des produits radioopaques par exemple, et dpister ainsi un tissu pathologique. C'est la dtection immunologique de tumeurs et de leurs mtastases par l'utilisation d'Ac marqus par des produits radioactifs dirigs contre les antignes tumoraux. Une tumeur est caractrise par les antignes qu'elle secrte. Certains antignes restent l'intrieur ou la surface des cellules, d'autres peuvent tre dverss dans la circulation. Le principe est d'utiliser des Ac Mo pour reconnatre ces antignes tumoraux.
Ces anticorps lis une substance radioactive vont se lier aux antignes tumoraux. Un examen scintigraphique du corps entier permettra de visualiser les diffrentes localisations de ces antignes tumoraux. Les mtastases, mme trs petites, pourront tre dtectes et ne le seraient pas par une autre technique. La rcidive locale d'un cancer galement.
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Objectifs
1- Citer et connaitre les mcanismes daction des anticorps monoclonaux. 2- Dfinir et citer le mcanisme daction dun anticorps bispcifique. 3- Dfinir un anticorps monoclonal murin, hybride et humanis. 4- Dfinir et indiquer le mcanisme de formation des HAMA et HAHA. 5- Citer les problmes poss par lutilisation des anticorps monoclonaux.
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UTILISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX EN THERAPEUTIQUE HUMAINE
1- Introduction :
Les anticorps monoclonaux (Ac Mo) sont des Ac qui ont t artificiellement produits contre un Ag spcifique. Ils sont extrmement spcifiques en se liant leurs Ag cibls. En laboratoire, les Ac Mo sont produits partir de clones d'une cellule. C'est pourquoi ils s'appellent Mo . Ceci signifie que chaque Ac produit par cette cellule est exactement identique. Ceci leur donne la spcificit d'optimisation collective d'action qui peut tre utilise dans le traitement et le diagnostic des maladies. La biotechnologie a jou un rle important dans la cration des Ac Mo. Deux principales techniques de la biotechnologie, la fusion de cellules et la culture de cellules, ont t utilises intensivement dans la production des Ac Mo. Les Ac Mo sont crs partir de la technologie de fusion de cellules (la cration de cellules hybridomes) et la technologie de culture de cellules (culture de cellules mylomateuses et hybridomes en laboratoire). Une fois injects dans des patients, les Ac Mo ont dclench une rponse du systme immunitaire, parce que le corps humain les a identifis comme substance trangre. Des injections rptes ont eu comme consquence le dgagement rapide de l'Ac des souris, rendu inefficace. Dans certains cas, les deuximes ou les injections suivantes ont entran une raction d'hypersensibilit reprsentant un danger pour la vie. La gntique est utilise pour surmonter cet obstacle srieux. Les techniques de la gntique permettent aux scientifiques de fabriquer des Ac Mo humaniss (presque humain) en greffant un Ac humain sur un Ac d'une souris. Seulement la partie de l'Ac de la souris qui est critique la liaison de l'Ag cibl, demeure sans changement. Les Ac Mo humaniss sont humains environ 90 pour cent. Ils seront probablement moins rejets par le corps humain, et probablement plus efficaces. Actuellement, la recherche est axe sur la production d'Ac entirement humains partir de souris transgniques. Cette introduction dune nouvelle gnration dAc a permis dentrevoir un potentiel clinique considrable touchant diffrents domaines de la mdecine : oncologie, cardio-vasculaire, rhumatologie, greffe Ce renouveau important des Ac Mo usage thrapeutique est non seulement li des stratgies dingnierie dAc mieux adaptes, mais galement une meilleure comprhension des mcanismes cellulaires et molculaires de
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pathologies (o une intervention thrapeutique laide dAc peut tre envisage), et une meilleure dfinition de molcules cibles.
2-
Mcanismes daction des Ac Mo :

Le mcanisme de base d'un Ac monoclonal est identique celui des Ac produits par le
corps humain. Cependant, lorsque des Ac Mo sont utiliss dans le diagnostic et le traitement de maladies, certaines substances sont souvent ajoutes pour leur donner leurs caractristiques thrapeutiques et diagnostiques. Ils peuvent galement tre utiliss seuls pour bloquer ou encourager certaines rponses du systme immunitaire. Lorsque des Ac Mo sont utiliss en thrapie, ils sont souvent attachs diffrents mdicaments ou toxines, qui sont ensuite livres aux cellules cibles sans nuire aux autres cellules du corps. Utiliss seuls, ils peuvent encourager le systme immunitaire du corps identifier certaines cellules comme tant trangre et lancer une attaque contre ces cellules. 2-1Mcanismes effecteurs immunotransmis : Les Ac Mo ne sont pas en soi cytotoxiques pour une cellule cible. Ils induisent en revanche des effets cytotoxiques (par ex. contre les cellules tumorales) par une interaction avec le systme du complment ou avec des cellules effectrices (lymphocytes T, monocytes, granulocytes, osinophiles, etc...
Mcanismes effecteurs des Ac Mo. Effets immunotransmis par lactivation de la cascade du complment par liaison de C1q lIgM membranaire ou des molcules dIgG (CDC) ou par le recrutement de cellules effectrices via des rcepteurs Fc (ADCC). Fonctions biorgulatrices par liaisons croises de rcepteurs cellulaires avec transduction directe designaux intracellulaires (par ex. signaux dapoptose) ou blocage de rcepteurs ou de ligands (par ex. rcepteurs du facteur de croissance).
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Mcanismes daction des Ac Mo thrapeutiques
Les effets cytotoxiques gnrs par lactivation de la cascade du systme du complment et par la cytotoxicit induite par le complment sont globalement dsigns par le terme de Complement-Dependent Cytotoxicity (CDC). Les mcanismes effecteurs qui font appel des cellules effectrices secondaires sont appels Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC). Lactivation de la cascade du complment et celle des cellules effectrices se fait par lintermdiaire de la partie Fc de lAc. La partie Fc de lIgG1 humaine est particulirement efficace dans lactivation de la cascade du complment et des cellules effectrices chez lhomme. La rgion constante de lIgG1 humaine est par consquent privilgie dans la fabrication des Ac Mo chimres et humaniss ayant pour objectif une cytotoxicit in vivo aussi puissante que possible 2-2Actions biorgulatrices : Les Ac Mo peuvent cependant aussi induire des effets thrapeutiques sans devoir activer des mcanismes effecteurs immunologiques. Les Ac Mo peuvent bloquer des rcepteurs cellulaires de surface ou neutraliser des ligands solubles (par ex. vascular endothelial growth factor [VEGF], TNF-, etc.). Les Ac peuvent aussi entraner la transduction directe de signaux intracellulaires par cross-linking de rcepteurs. Ceci peut induire, suivant le rcepteur, lapoptose immdiate de la cellule. Un exemple dAc monoclonal effet biorgulateur est le trastuzumab (Herceptin), qui se lie au rcepteur epidermalgrowth- factor family (HER-2/neu), facteur de croissance pithliale des cellules
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tumorales. Le blocage de ce rcepteur rduit le potentiel prolifratif des cellules qui expriment le HER-2/neu de manire excessive. Le Rituximab, un Ac Mo chimris, dirig contre la molcule CD20, est employ avec succs dans les lymphomes non Hodgkiniens. On notera nanmoins que les effets biorgulateurs sont souvent difficiles distinguer des effets immunotransmis. 2-3Immunoconjugus: Ac porteurs Le terme dimmunoconjugu est utilis pour dcrire des Ac Mo (ou dautres sousunits) utiliss comme porteurs de substances actives, par ex. des radio-isotopes, des toxines, des cytostatiques, des cytokines ou des cellules. Lactivit immunologique de ces Ac est alors sans importance. Les effets quils dveloppent sont ceux de la substance quils transportent. Les Ac Mo conjugus avec les radio-isotopes comme liode131, litrium90 paraissent trs prometteurs dans loptique des applications thrapeutiques. La fixation de lisotope lAc permet dappliquer un rayonnement relativement concentr sur le tissu tumoral. Lun des principaux avantages thrapeutiques de la radio-immunothrapie par rayons bta est que le rayonnement pntre de plusieurs millimtres dans la tumeur. Il nest donc pas ncessaire que lAg cible soit exprim dans chaque cellule tumorale. 2-4Autres formes dAc : Les Ac dits bispcifiques sont capables de reconnatre deux Ag diffrents. Leurs effets sont indpendants de la rgion Fc, si bien que ces molcules nactivent que trs peu le systme du complment et quainsi une partie des effets indsirables associs ce mcanisme peut tre supprime. Les Ac bispcifiques ne ncessitent ds lors pas la totalit des structures de la molcule dIg et peuvent tre rduits des fragments de Fab. Les combinaisons de deux ou trois chanes individuelles de Fab rsultent en des Ac bispcifiques de masse molculaire minime qui pntrent dans les tissus de manire optimale. Malheureusement, leur demi-vie in vivo est courte si on la compare celle des molcules structure IgG complte.
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3-
Ac monoclonaux chimres, humaniss et entirement humains : Lanticorps anti-CD3 (Orthoclone OKT3, muromonab- CD3) est un reprsentant de
la premire gnration. Il est utilis dans le traitement du rejet aigu aprs greffe dorgane et a t le premier anticorps monoclonal admis pour lusage thrapeutique chez lhomme. Lexprience clinique a montr que le muromonab-CD3 doit tre utilis en association avec dautres mdicaments immunosuppresseurs pour prvenir la rponse immunitaire contre lanticorps murin. Les anticorps HAMA peuvent nanmoins apparatre malgr lapplication simultane dune immunosuppression intensive. Contrairement au traitement limit dans le temps, propre aux rejets aigus de greffes, celui des maladies cancreuses ou auto-immunes ncessite des applications sur des priodes relativement prolonges pour obtenir leffet thrapeutique dsir de faon durable. La constatation selon laquelle la raction immunitaire du patient contre les anticorps de souris compromet lefficacit thrapeutique dans ces affections chroniques a conduit au dveloppement de stratgies visant diminuer limmunognicit des anticorps monoclonaux. 3-1- Ac monoclonaux chimres : Dans un premier temps, on sest mis produire des anticorps monoclonaux chimres. Ceux-ci sont constitus dune partie murine variable et dune partie humaine constante. La frquence dinduction dune rponse anti-anticorps, a ainsi considrablement diminu, ce qui a permis dadministrer ces mdicaments de manire rpte. Certains anticorps chimres, par ex. le rituximab (Mabthera) et le ctuximab (Erbitux) ninduisent que rarement la formation danti-anticorps, alors que dautres non. La formation de HAMA reste par consquent un problme potentiel significatif, mme si les anticorps monoclonaux chimres se sont aujourdhui solidement implants dans la pratique clinique. Ils exigent toutefois un suivi attentif et, le cas chant, ladministration concomitante de corticostrodes, voire parfois linterruption du mdicament. 3-2- Ac monoclonaux humaniss : Dans les anticorps humaniss, toutes les squences dacides amins provenant de la souris sont remplaces par des squences humaines, lexception des Complementary Determing Regions (CDR) responsables de la formation de lantigne. On esprait obtenir ainsi une rduction significative de limmunognicit encore associe aux anticorps chimres. En pratique, on sest cependant trouv confront linduction de ractions anticorps humains antihumains (HAHA), dont lincidence tait nanmoins relativement faible par rapport celle constate avec les anticorps chimres. Lalemtuzumab(Mab- Campath) induit 53
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des HAHA avec une incidence de lordre de 1,9% et le transtuzumab (Herceptin ) avec une incidence encore infrieurede0,1%. Dautres anticorps humaniss, tels que le daclizumab (Zenapax), induisent en revanche des HAHA avec une incidence atteignant 34%. Lhumanisation des anticorps murins ne se fait donc pas sans problmes, car les squences dacides amins situes entre les rgions CDR contribuent de manire non ngligeable laffinit des anticorps. Il nest donc pas possible, dans lhumanisation de certains anticorps, de conserver exclusivement les rgions CDR, et il faut souvent se rsoudre maintenir aussi certaines squences danticorps murins dans les segments situs entre les zones CDR (Framework). 3-3- Ac monoclonaux entirement humains : Des anticorps ont t dvelopps au cours des dernires annes, afin de diminuer encore plus limmunognicit des anticorps monoclonaux thrapeutiques. Diffrentes mthodes ont t utilises: des souris porteuses dun dfaut immunitaire (severe combined immune deficiency, SCID) peuvent tre reconstruites laide de tissu ftal humain. Limmunisation de ces souris gnre des anticorps humains. La plus grande partie des anticorps humains est cependant produite in vitro par la mthode Phage- Display ou par lintermdiaire de souris transgniques produisant des anticorps entirement humains. Plusieurs de ces anticorps exclusivement humains sont actuellement tests dans le cadre dessais cliniques de phase I III. Les anticorps entirement humains sont-ils ds lors suprieurs dans leurs applications thrapeutiques aux anticorps humaniss, et ces derniers sont-ils vraiment meilleurs que les anticorps chimres?
4-
Problmes poss par lutilisation des Ac Mo : Limmunognicit des anticorps thrapeutiques constitue un srieux problme qui
limite en pratique leur utilisation rpte dans le traitement de diffrentes maladies. Limmunognicit des anticorps monoclonaux est due dabord la reconnaissance par le systme immunitaire des squences dacides amins trangres (squences murines). Cest la reconnaissance de ce phnomne qui a conduit au dveloppement successif danticorps initialement chimres, puis humaniss et maintenant entirement humains. Il faut toutefois bien comprendre que mme les anticorps entirement humains conservent, de par leur spcificit, une squence dacides amins unique (trangre) pour lorganisme. Cette squence contient le site de formation des anticorps et est appele idiotype. Lorganisme peut donc rpondre la prsence de cette rgion idiotype des anticorps entirement humains par la formation danticorps humains antihumains (HAHA). Les anticorps ont fait leur apparition au 54
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cours de lvolution pour renforcer limmunognicit des protines trangres. Ils le font en se liant des rcepteurs Fc ou par lactivation de la cascade du complment. Ces fonctions contribuent conserver le caractre immunogne des anticorps, quils soient chimres, humaniss ou entirement humains (de par leur idiotype). Et, ce sont prcisment ces proprits des anticorps qui sont indispensables pour produire leffet thrapeutique qui consiste en la destruction des cellules cibles (par ex. tumorales). La fabrication dun anticorps avec une fonction effectrice maximale contre certaines cellules cibles, mais sans potentiel immunogne propre, constitue donc une vritable gageure. On dit souvent des anticorps monoclonaux quils prsentent une homologie de squence par rapport lIgG humaine de 75% pour les anticorps chimres, de 95% pour les anticorps humaniss et de 100% pour les anticorps entirement humains. Ces chiffres ne sont toutefois corrects que si lon part de lide que les anticorps humains et murins sont totalement diffrents. Dun ct, il existe des homologies de squences fortement conserves entre les anticorps humains et les anticorps murins. Dun autre ct, les anticorps entirement humains ne correspondent pas totalement la squence programme du gnome, puisquune mutation somatique efficace a lieu au cours de la maturation de laffinit de lanticorps.
Il est possible de produire : un anticorps humanis
monoclonal (zumab), ou totalement
humain
(mumab)
potentiellement
mieux tolr quun anticorps chimrique
(ximab).
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5-
Perspectives : Dautres approches dutilisation dAc Mo sont aujourdhui activement explores. Des
fragments dAc (anti-virus, anti-oncognes, anti-enzymes) ont t exprims dans des cellules tumorales, dans des cellules infectes par des virus, pour bloquer ou moduler les fonctions de protines intracellulaires ("Intrabodies"). A tout cela sajoutent des tudes intensives sur la stabilit et le repliement des Ac recombinants, quils soient sous forme monomrique, bispcifique, voire multimrique. Les recherches portent aussi sur loptimisation des proprits effectrices des rgions Fc, la production en masse dAc thrapeutiques par des plantes transgniques (mas) ou dans le lait danimaux transgniques (lapins, chvres et vaches) etc. Le dveloppement successif danticorps chimres, humaniss, puis entirement humains a permis de diminuer significativement limmunognicit des anticorps initialement murins. Si cette volution a autoris une utilisation thrapeutique de ces anticorps dans de nombreuses maladies de lhomme ncessitant des applications rptes, on ne saurait considrer simplement le passage des anticorps chimres aux anticorps humaniss, puis aux anticorps entirement humains, comme un progrs constant de la technique de traitement. Chacune de ces classes danticorps provenant de procds de fabrication biotechnologique diffrents a ses avantages et ses inconvnients, quil sagit dexaminer au cas par cas, dans une perspective dexprimentation clinique.
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L'utilisation des Ac Mo : pas si simple ! De nombreux travaux d'ingnierie cellulaire et molculaire ont t dvelopps afin de rsoudre les problmes poss par certaines des caractristiques intrinsques des Ac Mo, notamment pour pouvoir les utiliser in vivo. Il est frquent que l'affinit, l'isotype (la classe ou la sous-classe de l'Ac) ainsi que les proprits effectrices (fixation aux rcepteurs pour la rgion Fc ou RFc, fixation de la molcule C1q du complment) des Ac Mo obtenus ncessitent des modifications. Les Ac Mo sont par exemple susceptibles de se fixer de faon non spcifique par leur partie constante aux RFc prsents la surface d'un certain nombre de cellules du systme immunitaire. L'utilisation in vivo d'Ac Mo des fins diagnostiques (imagerie) ou thrapeutiques a t freine par ailleurs par la nature xnognique de la plupart des Ac utilisables, qui sont des Ac de souris. Peu d'Ac Mo humains ont pendant longtemps t disponibles (Ac anti-D, anti-toxine ttanique, anti-facteur rhumatode...). L'utilisation d'Ac Mo de souris en immunothrapie humaine conduit souvent l'apparition d'Ac humains anti-Ac de souris ("HAMA", pour "Human Anti-Mouse Antibodies"), phnomne pouvant s'accompagner de ractions d'hypersensibilit et de l'apparition de taux importants de complexes immuns en sus des capacits bloquantes de ces Ac vis--vis de lAc Mo. De plus, les proprits effectrices des Ac de souris injects chez lhomme ne sont pas optimales, mme sil ny a pas de barrire despce au sens strict. Ces problmes ont conduit l'laboration de techniques de manipulation in vitro des hybridomes producteurs d'Ac Mo et au dveloppement de techniques d'obtention d'Ac difficiles gnrer in vivo ou de techniques d'obtention d'Ac humains. Les manipulations in vitro d'hybridomes visent obtenir des Ac de meilleure affinit et/ou ayant des proprits effectrices modifies (absence de fixation au C1q, premire tape de l'activation de la voie classique du complment, qui aboutit la lyse des cellules-cibles, ou aux RFc, responsables de la capture de complexes immuns ou de la cytotoxicit-dpendante d'Ac ("ADCC", pour "AntibodyDependent Cell Cytotoxicity"). Ces manipulations reposent sur l'instabilit intrinsque des hybridomes producteurs d'Ac. Ceux-ci sont en effet susceptibles d'tre l'objet de mutations somatiques survenant avec une frquence leve dans les squences V, D, et J des gnes des rgions variables des chanes lourdes et lgres des Ac qu'ils produisent. In vitro, ces mutations peuvent aussi tre l'origine de la perte de ractivit d'un Ac Mo, accompagne ou non de l'acquisition d'une nouvelle spcificit antignique. Les hybridomes peuvent galement subir des dltions affectant les squences d'ADN codant pour les rgions constantes, ainsi que des commutations de classe ("switch"). Cette instabilit est l'origine tout la fois de nombreux problmes rencontrs par les utilisateurs non avertis d'hybridomes; cependant, elle a permis galement le dveloppement de techniques visant obtenir des ractifs aux proprits fonctionnelles amliores. L'utilisation conjointe de culture et de slection d'hybridomes en agarose, de dilution limite et d'ELISA permet en effet d'obtenir des hybridomes producteurs d'Ac prsentant les caractristiques souhaites.
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Objectifs
1- Dfinir la protomique. 2- Citer et dfinir les types de protomique. 3- Citer les technologies utilises en protomique. 4- Citer les facteurs pouvant altrer la qualit de lchantillon lors de la prparation dchantillons biologiques. 5- Citer le principe et les particularits de llectrophorse bidimensionnelle. 6- Citer les applications de la protomique.
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LA PROTEOMIQUE
Introduction & dfinition: La protomique est dfinie comme la caractrisation des processus biologiques et le dchiffrage des mcanismes contrlant lexpression gnique par la dtermination quantitative de lexpression des gnes au niveau protique. Il sagit dune tude systmatique des une protines base sur leur identification, leur quantification, leur caractrisation et ltude de leur(s) fonction(s). Le protome se dfinit comme lensemble des protines codes par un gnome. La protomique offre la possibilit d'identifier et de quantifier les protines e exprimes par une cellule un moment donn, dans un tissu donn et un environnement donn, divers tats de dveloppement, dans des contextes physiologiques et pathologiques varis. Une tude protomique permet de faire l'inventaire des protines dune cellule ou d'un tissu, dun cellule compartiment subcellulaire, les constituants dun complexe multi protique ou encore les multi-protique acteurs protiques dune voie de signalisation. La diffrence fondamentale entre protome et gnome est quun organisme possde gnome, une trs grande diversit de protomes alors qu'il ne renferme qu'un seul gnome. nde
De la gnomique la protomique Chez les procaryotes, le protome est une notion assez simple (un seul compartiment, un nombre restreint de protines, peu de modifications post traductionnelles). A l'oppos, un post-traductionnelles). vertbr suprieur renferme environ 200 tissus diffrents, dans des contextes 59
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dveloppementaux et physiologiques diffrents, sans compter les situations pathologiques, ce qui se traduit par l'existence de milliers de protomes. Il existe deux types dapproches en protomique, dune part, une approche de caractrisation systmatique du contenu protique dun chantillon et, dautre part, une approche plus cible didentification de protines dont le taux relatif diffre entre deux ou plusieurs chantillons biologiques. 1-protomique descriptive : Le premier point dtude de la protomique est lidentification exhaustive des protines exprimes par un organisme. Ceci a t possible grce au dveloppement simultan des techniques sparatives ainsi que des diffrents appareillages de spectromtrie de masse. Cette approche consiste sparer un mlange protique complexe sur un gel dlectrophorse, digrer les protines les analyser par spectromtrie de masse. Lapplication dune telle technologie de sparation des protines, couple la spectromtrie de masse a permis de raliser des cartes protiques de gel deux dimensions (2D), et donc la mise en place de bases de donns construites autour des gels 2D. Dautres techniques ont aussi t dveloppes afin de pouvoir identifier un plus grand nombre de protines. La technique des chromatographies successives permet daugmenter au maximum le nombre de protines identifies, et par la suite de sparer des mlanges trs complexes de protines avant de les identifier par spectromtrie de masse. 2-protomique diffrentielle et quantification : Le deuxime aspect important de lanalyse protomique est lanalyse diffrentielle qui consiste par exemple comparer les protomes de deux tats distincts (malade/sain ; traitement/pas de traitement ;) en observant lapparition, la disparition ou les variations des quantits des protines. Lapproche de quantification la plus classique consiste sparer les mlanges protiques sur des gels dlectrophorse bidimensionnelle et aprs coloration comparer les diffrences entre les gels. Les spots contenants les protines exprimes de faon diffrentielle seront analyss par spectromtrie de masse qui permet dsormais de raliser des analyses quantitatives.
1-
Les technologies utilises en protomique: Lanalyse protomique se rpartie en 2 tapes:
La premire tape consiste en une sparation des protines de lchantillon ou des
peptides issus de la digestion de ces protines. Elle repose sur diffrentes techniques lectrophortiques ou chromatographiques. 60
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La seconde tape concerne lidentification des protines ralise par la spectromtrie
de masse. Aprs la sparation et lidentification des protines vient la protomique fonctionnelle qui a pour buts : 1-1Ltude des fonctions biologiques des protines inconnues identifies. La dfinition des mcanismes biologiques cellulaire lchelle molculaire. La prparation dchantillons biologiques : La protomique, ncessite de travailler sur des chantillons biologiques de qualit. Lextraction de protines partir dun mlange complexe (biopsie cellulaire, cellules isoles, liquide physiologique...) est ralise laide de tampons appropris et dpend de la nature des protines qui font lobjet de ltude (protines cytosoliques, membranaires, nuclaires...). Lobjectif tant de maintenir les protines extraites en solution en pralable leur sparation. Les tampons dextraction sont ainsi constitus, sur une base saline (Tris, Hepes), de mlanges dagents rducteurs, de dtergents, voire de solvants organiques, dans des proportions variables. Ils sont gnralement supplments dinhibiteurs de protases et leur pH est ajust de manire approprie. Les facteurs pouvant altrer la qualit de lchantillon sont nombreux. Dune part, ceux qui peuvent perturber les tapes ultrieures de sparation de lchantillon et dautre part, ceux qui affecteront directement la qualit de lchantillon. Lors de lextraction de protines partir dun extrait biologique complexe, la mthodologie et les ractifs utiliss ont pour objectif de limiter les contaminations par des acides nucliques, des lipides et les sels ; ce type de composs pouvant perturber diffrents degrs une sparation par lectrophorse bidimensionnelle ou par chromatographie liquide. Le maintien dans le temps de la qualit dun chantillon est une proccupation majeure en protomique. Le temps de conservation entre la collecte ou la prparation de lchantillon et son utilisation dans le cadre dune tude doit tre valu et discut en pralable au lancement de cette tude et des protocoles stricts de conservation doivent tre tablis. En rgle gnrale, les chantillons biologiques sont conservs des tempratures trs basses (conglation 80 C au minimum, azote liquide). Aux chantillons complexes (extraits cellulaires, liquides physiologiques...) on rajoute des inhibiteurs qui limiteront la dgradation par des protases endognes. Les biopsies tissulaires sont congeler intacts dans lazote liquide ds leur prlvement sils doivent tre utiliss sous quelques semaines. Dans le cas dune conservation sur une longue dure, on procde une homognisation immdiate dans le tampon dextraction puis une conglation 80 C.
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Dans tous les cas, le protocole de prparation et de conservation des chantillons en pralable leur tude en protomique doit tre parfaitement standardis. La quantit de matriel ncessaire dpend de lapproche utilise ultrieurement pour la sparation des protines. Dans le cas dune sparation par lectrophorse bidimensionnelle dun mlange complexe (par exemple, extrait cellulaire) et coloration au nitrate dargent, 20 80 g de protines totales sont gnralement ncessaires et permettront didentifier par spectromtrie de masse la grande majorit des spots protiques visibles. Les approches sparatives en chromatographie liquide ncessitent des quantits allant de 50 100 g de protines totales. 1-2Llectrophorse bidimensionnelle : Principes et particularits: Llectrophorse bidimensionnelle permet la sparation des protines dun mlange complexe, extraites de tissus, de cellules ou dautres chantillons biologiques, selon deux proprits physicochimiques : le point isolectrique (pI) et la masse molculaire des protines, combinant ainsi deux principes de sparation lectrophortiques. Aprs leur migration sur gel, les protines peuvent tre rvles par diffrentes techniques de coloration, chacune ayant une sensibilit diffrente (limites de dtection allant de 200 fg 0,1 g de protines). Il peut sagir pour les rvlations les plus courantes de marquage mtabolique radioactif par incorporation de 35S, 14C, dune coloration au nitrate dargent, au bleu de Coomassie etc... Les techniques de colorations de gel les plus rpandues en protomique sont le nitrate dargent dans des variantes techniques compatibles avec la spectromtrie de masse (limite de dtection : ~1 ng) et le bleu de coomassie collodal (limite de dtection : ~ 30 ng).
Electrophorse bi-dimensionnelle (2D)

2 SDS PAGE - 2 Dimensions Sulfate Dodecyl Sodium Poly Acrylamide Gel Electrophoresis -
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Llectrophorse bidimensionnelle prsente toutefois certains dfauts. Elle est peu adapte la sparation des protines de haut poids molculaire, des petits peptides, des protines hydrophobes ou basiques. Elle prsente des difficults pour ltud des protines ltude membranaires. Les mthodes de coloration classiques sont peu linaires et ne permettent pas . datteindre une quantification fiable des protines fractionnes. En revanche, les techniques de coloration en fluorescence peuvent tre utilises en qua quantification. Les logiciels danalyse dimage lis llectrophorse bidimensionnelle : Plusieurs logiciels sont disponibles dans ce domaine. Les logiciels les plus usits ce jour au niveau international sont Image Master Platinum (GeneBio/GE Healthcare HealthcareAmersham Biosciences), PD-Quest (Bio-Rad), etc. ... Rcemment, les socits Genebio et . Amersham Biosciences ont travaill lintgration de leurs deux produits logiciels pour aboutir Image Master Platinum V5.0. Ceci est trs probablement le signe dune prochaine ablement uniformisation des techniques danalyse dimage en protomique. Lanalyse dimage qui permet de reprer les coordonnes x, y dun spot protique color sur gel est le prrequis indispensable lautomatisation de leur prlvement en vue de prlvement leur identification par spectromtrie de masse. Les tapes allant du prlvement dun spot protique, de sa digestion par une protase, de lextraction des peptides de digestion, jusquau dpt sur cible MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) ou en microplaques atrix pour analyse par spectromtrie de masse sont entirement automatisables.
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Analyse dun mlange de protines par lectrophorse bidimensionnelle et spectromtrie de masse. A. Le mlange de protines est spar par lectrophorse bidimensionnelle. B. Les taches dintrt, observes aprs coloration, sont digres pour donner des peptides. C. Ces peptides sont extraits puis analyss par spectromtre de masse. Cette analyse fournit le nom des protines prsentes dans le fragment de gel de dpart, ainsi que certaines des modifications posttraductionnelles portes par cette forme protique.
1-3- La chromatographie liquide : En raison des limites prsentes par llectrophorse 2D et de la difficult bien matriser la technologie, des approches alternatives ont t dveloppes, qui reposent sur la chromatographie liquide (LC) pour simplifier les mlanges analyser par spectromtrie de masse. Il sagit initialement de la chromatographie multidimensionnelle LCLC/ MS-MS (MSMS : spectrographie de masse en mode tandem) qui permet de construire les cartes comparables celles que produisent les gels deux dimensions. Lun des gros dveloppements technologiques actuels repose sur la combinaison chromatographie liquide spectromtrie de masse MS/MS en mode MALDI. Il fait appel, aprs digestion par une protase de lchantillon protique, au fractionnement des peptides de digestion par chromatographie liquide, puis leur dpt sur cible MALDI grce un automate directement connect en sortie de colonne chromatographique. La cible est ensuite lue sur un spectromtre de masse MALDI TOF/TOF et chaque peptide dpos est caractris en MS/MS. Un schma des tapes principales didentification de protines partir dun
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chantillon biologique complexe fractionn sur gel dlectrophorse est propos dans la figure ci dessous. 1-4- Les spectromtres de masse : Deux grandes approches sont utilises en protomique et concernent plusieurs configurations dquipement : la spectromtrie en mode MALDI-TOF : Un spectromtre de masse de type MALDI-
TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry) permet dobtenir une carte peptidique massique (mass fingerprint) qui reprsente la distribution des fragments peptidiques gnrs lors de la digestion de la protine tudie par une protase (la trypsine). Les peptides de digestion sont dposs sur une cible mtallique et co-cristalliss avec un compos chimique appel matrice . Sous leffet dun tir laser, lnergie transfre aux peptides par lintermdiaire de la matrice, permet leur ionisation. Ces peptides lectriquement chargs sont alors acclrs grce une haute tension applique sur une grille et envoys dans un tube de vol o ils volent jusqu un dtecteur. Les ions ayant une masse leve voleront plus lentement que les ions ayant une faible masse.
Empreinte digitale de la protine par la spectromtrie de masse MALDI-TOF

Les protines sont extraites et spares par llectrophorse 2D. Un spot est dcoup du gel, digr avec la trypsine et ionis par MALDI. La masse prcise des fragments protolytiques est dtermine par la spectrographie de masse TOF. Les peptides de digestion sont mesurs avec une prcision importante permettant de gnrer une empreinte digitale (mass fingerprint) de la protine. Cette dernire peut tre identifie en comparant la carte peptidique massique obtenue exprimentalement aux cartes peptidiques massiques thoriques gnres partir de chacune des squences prsentes dans les banques de donnes protiques, en effectuant une digestion virtuelle (in silico) de chacune de ces protines par la mme enzyme (trypsine).
La spectromtrie de masse en mode tandem (MS/MS) : Chaque peptide de digestion
trypsique peut tre fragment par collision avec un gaz (argon). Lanalyse des fragments obtenus (spectre MS/MS) permet de dterminer tout ou une partie de la squence en acides amins du peptide. Cette squence sera utilise pour tenter didentifier les protines partir des banques de donnes protiques et gnomiques. 65
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Le dernier n des instruments dans le domaine de la spectromtrie de masse MS/MS est le MALDI-TOF/TOF permettant lanalyse en mode tandem et donc le squenage des ions forms. Les derniers dveloppements en spectromtrie de masse ddie la protomique reposent sur lutilisation de la nanoLC-FT-MS, capable danalyser un mlange complexe de peptides lu dans le systme par chromatographie liquide haute performance. 2La protomique diffrentielle et quantitative : Lidentification de protines dans un chantillon biologique peut rsulter dune approche beaucoup plus cible, dite de protomique diffrentielle. Il sagit de ntudier que les protines dont le taux relatif varie dans un mme chantillon sous diverses conditions ou entre diffrents chantillons. Lapproche classique reposant sur lanalyse dimage de gels 2D provenant dchantillons comparer est toujours largement utilise. Elle fait appel des logiciels spcifiques qui permettront de mettre en vidence les protines dites diffrentielles. Ce type dapproche ncessite lutilisation de cohortes plus ou moins importantes de gels correspondant des rplicats dexpriences indpendantes. Des mthodes statistiques de comparaison dimage sont utilises.
Cartographie de lexpression protique utilisant llectrophorse 2D et la spectrographie de masse. Le but est de comparer le profil de lexpression protique entre des types cellulaires ou au niveau dun mme type cellulaire sous diffrentes conditions de croissance. Les protines sont extraites partir des diffrents types cellulaires par 2D SDS PAGE, le programme danalyse des images est utilis pour comparer lintensit des spots entre les gels et identifier les protines exprimes de faons diffrentes. La protine dintrt est alors extraite du gel, et est identifie par spectrographie de masse. La puissance de la mthode est accrue, si lidentification dun grand nombre de protines dans le gel est connue et est prsente dans une banque de donnes (dans ce cas linformation est obtenue sans recourir la spectrographie de masse).
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2-1-
La technologie 2D-DIGE: La technologie 2D-DIGE est base sur le marquage des protines totales
dchantillons comparer sur leurs rsidus lysine, par des cyanines fluorescentes spcifiques avant leur fractionnement. Les chantillons comparer sont ensuite mlangs en quantits gales et co-spars sur un seul et unique gel dlectrophorse bidimensionnelle haute rsolution. Ce gel est ensuite analys sur un scanner molculaire grce un logiciel dans le but didentifier et de quantifier lexpression des protines diffrentiellement exprimes entre les chantillons dintrt. 2-2La technologie ProteinChip (Ciphergen Biosystems) : La technologie ProteinChip associe deux principes danalyse des protines, la chromatographie daffinit par rtention et la spectromtrie de masse. La sparation des protines par chromatographie daffinit est ralise sur des barrettes ractives qui comportent plusieurs (8 16) plages actives ou spots. Ces spots sont constitus de surfaces chimiques (ioniques, hydrophobes, hydrophiles...) permettant la rtention slective des protines de lchantillon biologique. Les protines ainsi retenues sur ces surfaces sont ensuite directement analyses par insertion des barrettes dans un spectromtre de masse SELDITOF (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight) conduisant la dtermination de leur masse molculaire. Aprs calibration externe du systme laide de protines standard, les diffrents profils spectraux acquis sont analyss par la suite logicielle ProteinChip software. La technologie permet de comparer les profils obtenus dans des conditions identiques (quantit de protines charge, type de surface, conditions chromatographiques...) entre deux ou plusieurs chantillons. Il est ainsi possible de mettre en vidence des protines diffrentiellement exprimes entre chantillons.
- Lchantillon est dpos sur la puce protein-chip chantillon - La protine capture est retenue par affinit sur la plaque - On rajoute lEAM
(Energy Absorbing Molecules)
- Le SELDI lit la carte puce
Principe du SELDI 67
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AAnalyse de quelques protines de levure. B- 6566 chantillons de protines B(rpartis en 48 blocs) sont fixs puis hybrides sur une lame de microscope cot au nickel. C- Agrandissement de limage de lun des 48 blocs.
Contrairement aux deux approches prcdentes, la technologie ProteinChip ne permet pas directement lidentification des protines dintrt. Chaque protine dintrt est identifie par digestion trypsique et spectromtrie de masse, soit aprs migration de llut correspondant sur gel dlectrophorse monodimensionnel, dcoupage et digestion de la bande, soit directement aprs dpt et digestion sur une nouvelle barrette ractive qui sera alors analyse sur un spectromtre de masse plus rsolutif que le SELDI (par exemple, quadrupole-TOF quip dune source-adaptateur Ciphergen Biosystems).
Lune des applications majeures du systme Protein- Chip est lidentification de biomarqueurs circulants en pathologie humaine. En raison de limportante gamme dexpression dynamique des protines dans le srum humain qui gne lidentification de biomarqueurs protiques diffrentiels, Ciphergen Biosystems a dvelopp lEDM kit (pour expression difference mapping) qui permet dans des plaques de microtitration de 96 puits le 68
2me Anne Biologie
prfractionnement du srum brut sur billes changeuses danion sous diffrentes conditions de pH. Le srum est ensuite analys en 6 fractions indpendantes clarifies dans lesquelles sont rparties les protines majoritaires de ce fluide biologique (albumine, immunoglobulines, lipoprotines...). Il en rsulte un effet denrichissement des protines minoritaires dans chacune des six fractions chromatographiques.
3-
Applications de la protomique :
3-1-Recherche de marqueurs diagnostiques : Un des domaines de lanalyse protomique est celui des marqueurs diagnostiques et pronostiques. En effet, des marqueurs secondaires peuvent avoir un trs bon potentiel prdictif (par ex. : mise en vidence, dans le liquide cphalorachidien, de la 14-3-3 comme marqueur de la maladie de Creutzfeldt-Jakob). 3-2- Comprhension molculaire des maladies : Lanalyse protomique est souvent capable de fournir une description molculaire phnotypique des maladies. Ltude des phnomnes de transdiffrenciation pithliale dans certains cancers de la vessie en est un excellent exemple. Ltude des maladies virales, en particulier ltude des mcanismes mis en place par les virus pour dtourner la machinerie cellulaire leur profit. Au-del de la comprhension fondamentale, ce type dtude pourrait permettre didentifier des cibles cellulaires susceptibles dtre utilises pour un traitement des affections virales 3-3- Comprhension molculaire des relations hte-pathogne : Un cas particulier est reprsent par ltude des agents pathognes et de la rponse immunitaire induite. Ltude comparative des protomes dagents infectieux, en particulier bactriens ou parasitaires, pour identifier des corrlations entre protome et virulence, permettant par la suite de dfinir des cibles thrapeutiques potentielles. Ltude de la rponse immune induite au cours des infections est galement un domaine o lapport de lanalyse protomique est intressant. Il est ainsi possible de dterminer, par une approche protomique, la nature des protines de lagent pathogne induisant une rponse immunitaire. Ces protines reprsentent ensuite des cibles de choix pour le dveloppement de stratgies vaccinales 3-4- Etudes toxicologiques : En particulier pour les tudes toxicologiques visant comprendre les effets secondaires des mdicaments.
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Rfrences :
Adrian F. Ochsenbein. Anticorps monoclonaux comme substances thrapeutiques. Forum Med Suisse 2008;8(8):140143 Jean-Luc Teillaud. Les anticorps monoclonaux : de la recherche lutilisation therapeutique Unit INSERM 255, Universit Ren Descartes-Paris V, Universit Pierre et Marie Curie-Paris VI, Paris, France Jean-Henri Bezian, Daniel Moynet, Sylvie Comeau, Jean-Luc Chagnaud. Lingnierie des anticorps et ses applications. Revue Franaise des Laboratoires 2000; 327 : 105-9 Yvan Boublik. Production de protines recombinantes. Plate forme de production de protines CRBM UMR 5237 CNRS. Montpellier IFR 122 Mars 2008 JAMES D. MARKS. Monoclonal Antibodies from Display Libraries. Molecular Biology of B Cells, chp 32: 511-31. Elsevier Science 2004. Jacques Bellalou. Production de Protines Recombinantes dans E.coli : Aspects technologiques et protocoles valids pour des cultures en milieux haute densit. Module de Protines Recombinantes. Institut Pasteur. 3me journe du Rseau Montpellirain de protines Recombinantes 2006. Protein production and purification. Nature methods 2008; 2: 135-46 Jean-Michel Betton, Alain Chaffotte Repliement recombinantes. Mdecine- Sciences 2005 ; 21 : 613-7. et production de protines
Sylvain Dubucquoi. Raction antigne-anticorps : Applications pratiques. Jean-Claude Garaud. Prparation des anticorps. Abul K Abbas, Andrew H.Lichtman. Cellular and Molecular Immunology. Saunders Eds 2006. Frank C. Hay, Olwyn M.R. Westwood. Practical Immunology. Blackwell Science Fourth edition 2002. Yarmush, M. L., Toner, M. Biotechnology. The Biomedical Engineering Handbook:Second Edition. Ed. Joseph D. Bronzino Boca Raton: CRC Press LLC, 2000. Tristram G. Parslow, Daniel P. Stites MD, Abba I. Terr, John B. Imboden. Medical Immunology. Tenth Eds 2001.
70
2me Anne Biologie
Charles Pineau. La protomique : nouvelles approches en gnomique fonctionnelle Applications en Biologie de la Reproduction. mt mdecine de la reproduction 2006 ; 6 : 373-84. Maria Monti, Stefania Orru`, Daniela Pagnozzi, Piero Pucci. Functional proteomics Clinica Chimica Acta 2005 ; 357 : 140150 W. Boireau. Les Bases et Applications de la Protomique. Institut FEMTO-ST. Besanon 2006. Master relation hte-greffon. Pierre Lescuyer, Mireille Chevallet et Thierry Rabilloud. Lanalyse protomique : concepts, ralits et perspectives en thrapeutique. Mdecine sciences; 5: 2004, p. 587-592. Saurabh Sharma. Proteomics 2008. Roger L. Lundblad. Proteomics fact and fantasy. Chapel Hill, North Carolina. Timothy Palzkill. Proteomics. Baylor College of Medicine. Kluwer Academic publishers 2002. Expression des protines recombinantes. http://www.ipbs.fr/formation/biotech/msbm.pdf
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THERAPIE CELLULAIRE
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2me Anne Biologie
Objectifs
123-
Dfinir et citer le but de limmunomodulation. Prciser les voies de limmunomodulation. Citer les produits de limmunomodulation agissant au niveau de
linteraction rcepteur T-antigne. 45Citer le mcanisme daction de la CTLA4-Ig. Citer les principes gnraux et les applications des traitements
immunomodulateurs. 6Citer les problmes poss par ces biomdicaments.
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BASES FONDAMENTALES DE LIMMUNOMODULATION
1-
Introduction-Dfinition: Limmunomodulation se dfinit comme tant lensemble des processus qui permettent
dinterfrer avec les mcanismes dautorgulation qui dirigent le systme de dfense immunologique. Le but de limmunomodulation est en fait lapport dun traitement (immunothrapie) encore plus efficace et moins pourvoyeurs deffets indsirables. Ces processus intgrent aussi bien : les mdicaments, tels que les immunosuppresseurs qui ont t introduits ds les
annes 1960 dans les greffes. Ces produits inhibent ou attnuent la rponse immune en bloquant certaines voies dactivation des lymphocytes (ciclosporine A et inhibition de la prolifration des lymphocytes T). Les biomdicaments qui sont des produits issus de procdures de
fabrication par gnie biologique. Il sagit de crations artificielles cest-a-dire des molcules qui nexistent pas physiologiquement (Exemple : les anticorps monoclonaux antiTNF), soit des constructions qui miment une molcule de rgulation physiologique (ex : lIL1-Ra recombinant, le CTLA-4-Ig ou le rcepteur soluble du TNF). Des stratgies plus complexes de thrapie cellulaire utilisant : les cellules dendritiques, les lymphocytes T rgulateurs, les cellules souches msenchymateuses ., sont aussi dveloppes. Limmunothrapie cellulaire vise soigner les patients en stimulant leur systme immunitaire par injection de cellules appropries. En ralit, la thrapie cellulaire dpasse le cadre de limmunothrapie et entre dans le cadre de la thrapie cellulaire rparatrice (CSM et cardiologie: traitement des squelles de linfarctus du myocarde ; orthopdie: traitement de lostognse imparfaite etc. .). Limmunothrapie a fait des progrs considrables, mais elle na pu se concevoir de faon moderne quavec le dveloppement doutils biologiques nouveaux. Deux pr-requis sont donc ncessaires : Avoir la capacit de crer des outils "biologiques" efficaces, en particulier des
anticorps monoclonaux et des protines de fusion comme des rcepteurs solubles. Savoir identifier une cible thrapeutique trs spcifique pour agir directement sur la
maladie et si possible viter les dgts collatraux.
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2-
Les voies de limmunomodulation :
2 1- Linteraction rcepteur T-antigne : Les rgions hypervariables du rcepteur T interagissent avec le complexe form par une molcule du complexe majeur dhistocompatibilit et le peptide quelle prsente (complexe CMH/peptide). La rgion hypervariable CDR3 interagit directement avec certains acides amins des peptides associs aux molcules de classe I et de classe II. Les stratgies modifiant linteraction rcepteur TCMH/peptide sont ainsi susceptibles dinduire une tolrance en modulant lactivation T. 2-1-1- Anticorps monoclonaux : Il est possible de produire un anticorps monoclonal humanis (zumab) ou totalement humain (mumab) potentiellement mieux tolr quun anticorps chimrique (ximab).
Nomenclature des Biomdicaments
La modification de la structure de ces Ac peut renforcer laction thrapeutique. Ainsi, un anticorps monoclonal peut ne pas tre cytotoxique si sa fixation nactive pas le complment comme cest le cas avec une IgG4. Si une cytotoxicit nest pas souhaite, il est aussi possible de produire des anticorps ne comportant que le fragment Fab (dpourvu de fragment Fc), comme le certolizumab (anti-TNF). En pratique, il peut tre intressant dutiliser une molcule sans Fc car ce fragment est capable dactiver paradoxalement diffrentes cellules porteuses du Fc-R. Ces Ac peuvent agir de diffrentes manires, ainsi Il
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2me Anne Biologie
est possible dinduire une tolrance stable en interfrant avec le rcepteur T ou des structures qui lui sont associes (CD3, CD4, CD8). Le caractre invariable de ces molcules suppose une synchronisation du traitement avec lactivation des lymphocytes spcifiques par lantigne. Cet objectif est accessible plus particulirement dans les greffes, au cours desquelles lactivation des lymphocytes nest engage quau moment et au dcours de la greffe. Par contre dans les cas o lactivation des lymphocytes est dj engage (maladies auto-immunes), cet objectif est plus difficile raliser. Lutilisation danticorps monoclonaux anti-CD4 ( anti-CD8) conduit une tolrance dans certains modles. Le concept de tolrance dominante ou de suppression traduit dans ces modles lobservation que la tolrance, induite par ladministration au moment de lexposition lantigne danticorps ne lysant pas les cellules T, est maintenue en prsence de cellules naves qui sont elles-mmes tolrises. Il est ainsi possible de transfrer la protection des animaux non tolrants. Les mcanismes de tolrance dans ces modles ne sont pas univoques (anergie, modification du profil de scrtion des cytokines par les lymphocytes T). 2-1-2- Les immunoglobulines polyclonales intraveineuses (IgIV): Les IgIV sont composes dimmunoglobulines de types G (IgG) obtenues partir de plasmas provenant de plusieurs milliers de donneurs sains. Dans leur composition, les lots cliniques dIgIV reproduisent la distribution des diffrentes sous-classes dIgG. Le mode daction des IgIV est complexe, impliquant probablement et de faon non exclusive des mcanismes lis aux fragments Fc et/ou F(ab) des Ig. Les IgIV interagissent avec de nombreux composants du systme immunitaire, notamment les cytokines, le complment, les rcepteurs Fc et plusieurs molcules de surface de cellules
immunocomptentes. De plus, les IgIV interfrent avec des cellules effectrices du systme immunitaire (les lymphocytes T et B, les cellules dendritiques) et rgulent un large panel de gnes. 2-1-3- Peptides altrs : Lutilisation de peptides altrs crant de nouveaux complexes CMH/peptide permet aussi de moduler lactivation des lymphocytes T. Dans les peptides, le remplacement dacides amins interagissant avec le domaine variable du rcepteur T permet dobtenir des peptides antagonistes ou agonistes partiels dont laffinit dinteraction avec le rcepteur T est modifie. Il existe une hirarchie de rponses des lymphocytes T spcifiques caractrise par des seuils diffrents dexpression des gnes de plusieurs cytokines en fonction de lavidit dinteraction rcepteur T CMH/peptide. Ainsi lactivation des lymphocytes T peut-elle conduire, en fonction de lavidit dinteraction mise en jeu, une anergie (absence de 76
2me Anne Biologie
production dinterleukine-2 ou dinterleukine-3 et de prolifration, production conserve dinterfron et, particulirement pour les cellules Th2, dinterleukine- 4), une activation prfrentielle de cellules Th1 ou Th2 (dviation immune) ou lactivation complte des lymphocytes T (production dinterleukine-2, prolifration, apoptose). Linjection dun peptide modifi (ou de cellules dendritiques charges avec ce peptide) peut bloquer la progression de maladies auto-immunes exprimentales. Ces peptides induisent in vivo une apoptose secondaire lactivation des cellules T spcifiques, variable en fonction de laffinit de liaison du peptide. Les cellules T persistant aprs activation ont un profil Th1 lorsquest inject le peptide se fixant la molcule de classe II avec laffinit la plus faible, Th2 lorsquest inject le peptide se fixant avec la plus forte affinit. Les quantits dinterleukine-4 et dinterleukine-10 produites sont corrles laffinit de liaison du peptide. Laccroissement du signal transmis par le rcepteur T, secondairement laugmentation de la dose ou de laffinit de reconnaissance du peptide, module ainsi les voies de diffrenciation suivies par les lymphocytes T. Le niveau de signal module aussi lexpression de structures membranaires telles que B7.2 (CD86) sur les lymphocytes B. La voie dadministration du peptide est importante. Ladministration orale ou intranasale favorise lactivation de cellules T qui produisent de linterleukine 4 et surtout une cytokine inhibitrice, le TGF (transforming growth factor ). 2-2Co-signaux dactivation Des structures membranaires autres que celles directement impliques dans linteraction rcepteur TCMH/ peptide interviennent dans lactivation des lymphocytes T. Cette activation passe par la formation de conjugus avec la cellule prsentant lantigne, les structures impliques dans la signalisation se concentrant dans des microdomaines membranaires morphologiquement identifiables (rafts). Le conjugu est stabilis par linteraction de molcules dadhsion qui participent la signalisation. Une centaine de complexes CMH-peptides vont interagir avec un grand nombre de rcepteurs T dont lengagement par vagues successives permet, grce une signalisation prolonge, une activit transcriptionnelle suffisante la progression de la cellule dans le cycle cellulaire. Lengagement dun nombre minimum de rcepteurs T est ncessaire la transcription des gnes de cytokines et la prolifration T. Ce seuil dpend de la mise en jeu de structures de co-signalisation. Lagrgation des rcepteurs T induit sur le lymphocyte T lexpression du ligand de CD40 (CD154) qui interagit avec CD40 sur les prsentatrices, puis sur la cellule prsentant lantigne B7 (B7.1 ou CD80, B7.2 ou CD86). Linteraction B7-CD28 induit un second 77
signal qui accrot la transcription et stabilise les ARNm de linterleukine 2. Dans un deuxime temps, lexpression par le lymphocyte T activ de CTLA4 (CD152), qui interagit son tour avec B7, bloque la prolifration T. Ladministration danticorps, de ligands ou de rcepteurs solubles interfrant avec linteraction B7/CD28 bloque lactivation lymphocytaire dans diffrentes situations exprimentales. Lutilisation de la molcule CTLA4 couple un domaine constant dimmunoglobuline G (CTLA4 (CTLA4-Ig) qui en prolonge la demi-vie bloque le dveloppement de vie maladies auto-immunes induites par immunisation contre un autoantigne et prvient le rejet es de greffe allognique en induisant une anergie des lymphocytes T. Cette approche a t applique la greffe de moelle osseuse chez lhomme pour induire ex vivo une anergie des cellules de moelle osseuse spcifiques des alloantignes du receveur et prvenir la survenue es de ractions du greffon contre lhte. Une stratgie, efficace dans les modles exprimentaux ns lhte. de greffe allognique, est lassociation danticorps anti CD40L (qui diminu lexpression de anti-CD40L diminuent CD80 et CD86) et de CTLA4-Ig.
Une centaine de complexes CMH peptides vont interagir avec un grand nombre de CMH-peptides rcepteurs T dont lengagement par vagues successives permet, grce une signalisation prolonge, une activit transcriptionnelle suffisante la progression de la cellule dans le cycle transcriptionnelle cellulaire. Lengagement dun nombre minimum de rcepteurs T est ncessaire la transcription des gnes de cytokines et la prolifration T. Ce seuil dpend de la mise en jeu de structures de co-signalisation. Lagrgation des rcepteurs T induit sur le lymphocyte T signalisation. lexpression du ligand de CD40 (CD154) qui interagit avec CD40 sur les prsentatrices, puis sur la cellule prsentant lantigne B7 (B7.1 ou CD80, B7.2 ou CD86). Linteraction B7 B7CD28 induit un second signal qui accrot la transcription et stabilise les ARNm de 28 78
linterleukine 2. Dans un deuxime temps, lexpression par le lymphocyte T activ de CTLA4 (CD152), qui interagit son tour avec B7, bloque la prolifration T. Dautres i interactions importantes sont indiques sur la figure 3. Ladministration danticorps, de ligands ou de . rcepteurs solubles interfrant avec linteraction B7/CD28 bloque lactivation lymphocytaire dans diffrentes situations exprimentales. Lutilisation de la molcule CTLA4 couple un domaine constant dimmunoglobuline G (CTLA4 Ig) qui en prolonge la demi (CTLA4-Ig) demi-vie bloque le dveloppement de maladies auto immunes induites par immunisation contre un autoantigne auto-immunes et prvient le rejet de greffe allognique en induisant une anergie des lymphocytes T. Cette induisant approche a t applique la greffe de moelle osseuse chez lhomme pour induire ex vivo une anergie des cellules de moelle osseuse spcifiques des alloantignes du receveur et prvenir la survenue de ractions du greffon contre l lhte. Une stratgie, efficace dans les modles . exprimentaux de greffe allognique, est lassociation danticorps anti CD40L (qui diminuent anti-CD40L lexpression de CD80 et CD86) et de CTLA4 Ig. Lefficacit danticorps anti CTLA4-Ig. anti-LFA-1 (CD11a) et anti-ICAM-1 (CD54) a galement t rapporte. 1
2-3-
Le rseau des cytokines : Les nombreuses cytokines impliques dans lactivation initiale des lymphocytes et
lexpansion de la rponse immunitaire sont galement des cibles dintervention thrapeutique privilgies. Des mdicaments (corticodes, mthotrexate, sels dor, D pnicillamine, thalidomide) interfrent avec le rseau de cytokines. Lutilisation des interfrons, de linterleukine 2 ou de facteurs de croissance hmatopotiques fait aujourdhui pa partie de larsenal thrapeutique disponible en pathologie humaine. La polarisation de la rponse T vers la production prfrentielle de cytokines Th1 (IFN (IFN, TNF) ou Th2 (interleukines- 4, -5, -6, -10) contribue aux mcanismes de tolrance et est 10) 79
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utilise pour dvier des rponses immunitaires pathologiques. LIFN diminue les rponses Th2, linterleukine-4 et linterleukine-10 ont un effet inhibiteur sur les rponses Th1. Lexpression de rcepteurs de chimiokines distincts par les lymphocytes Th1 (CCR5, CXCR3) et Th2 (CCR3, CCR4) pourrait enfin contribuer de nouvelles voies thrapeutiques pour corriger les dsquilibres Th1/Th2 (antagonistes de chimiokines, anticorps antircepteurs). La tolrance orale est un exemple de dviation immune mettant en jeu une voie particulire dintroduction de lantigne. Elle conduit lactivation dans les plaques de Peyer de lintestin de cellules T spcifiques de lantigne qui produisent des cytokines inhibitrices (interleukine-4 et surtout TGF) en prsence de lantigne. Ces cytokines bloquent laction pathogne de lymphocytes Th1 spcifiques de lantigne mais aussi dautres antignes au sein dun organe o se dveloppe une raction inflammatoire. Dans des maladies autoimmunes, lintrt de cette approche est de permettre lutilisation dun autoantigne qui nest pas ncessairement la cible directe de la raction auto-immune.
Mcanismes immunologiques de lITSL (Immunothrapie sublinguale): lallergne est capt en quelques minutes par les DC de la muqueuse sublinguale qui migrent en quelques heures au niveau des ganglions drainants (chane cervicale/sous maxillaire) o ils stimulent les lymphocytes T nafs. Aprs activation, ces lymphocytes T circulent dans le sang et dans les tissus. Une hypothse est que ces lymphocytes T sont prfrentiellement diffrencis en lymphocytes T rgulateurs, capables dinhiber par production de cytokines (IL10 ou TGF) ou par contact cellulaire le recrutement et lactivation de cellules pro-inflammatoires (mastocytes, basophiles, osinophiles), ainsi 3Approches cellulaires de limmunomodulation : que la production dIgE, tout en stimulant la production dIgG4 ou dIgA. Une administration locale (sublinguale) rsulte donc dans linduction dune rponse lymphocytaire T systmique tablissant une tolrance spcifique de lallergne long terme.
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Bien que dans bons nombre de cas les voies de limmunomodulation sont les mmes, les approches utilisant les cellules (cellules dendritiques, lymphocytes T rgulateurs, cellules souches msenchymateuses CSM , leucocytes apoptotiques ) sont de plus en plus utilises dans le cadre de la clinique humaine. La thrapie cellulaire concerne les produits biologiques effet thrapeutiques issus de prparations de cellules vivantes humaines ou animales. Ainsi lutilisation des cellules dendritiques de patients atteints du cancer, mises en incubation avec des antignes tumoraux pour amplifier la rponse immune contre ces Ag a t utilise. Linterfrence des CSM dans la modification du profil de production cytokinique (diminution de la synthse des cytokines proinflammatoires TNF, IL-12 et IFN-) .. , et le rle des lymphocytes T rgulateurs ont t expriments entre autre dans le cadre des maladies auto-immunes et de la greffe.
44-1-
Principes gnraux et applications des traitements immunomodulateurs Bloquer une cytokine pro-inflammatoire (comme le TNF ou lIL-1) en utilisant un
anticorps monoclonal ou un rcepteur soluble. Les inhibiteurs du TNF sont des anticorps monoclonaux (adalimumab ou infliximab) ou des rcepteurs solubles (tanercept) qui ont dmontr leur efficacit dans la polyarthrite rhumatode, les spondylarthropathies, la maladie de Crohn, mais qui laissent prsager aussi une efficacit intressante dans dautres indications, comme les vascularites, les myosites, et mme des maladies comme les uvites, la sarcodose ou lamylose. 4-2Utiliser un inhibiteur capable de neutraliser une cellule. Le rituximab est un anticorps monoclonal dirig contre lantigne CD20 prsent la surface de certains lymphocytes B. Cet anticorps qui a t dj trs largement utilis dans les lymphomes B semble galement trs intressant dans les diffrentes maladies auto-immunes comme la polyarthrite rhumatode, mais peut-tre aussi le lupus, le syndrome de GougerotSjgren, les cytopnies auto-immunes et mme dautres affections, comme les vascularites ANCA et les cryoglobulinmies. 4-3Neutraliser lactivit dune cellule en inhibant ses capacits de prolifration. Labatacept est une protine de fusion (CTLA4 Ig) capable de bloquer les lymphocytes T, en particulier dans les maladies auto-immunes (polyarthrite rhumatode, lupus), mais aussi dans dautres situations comme le rejet de greffe dorgane.
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2me Anne Biologie
4-4-
Utiliser une protine recombinante ayant des pouvoirs anti-inflammatoires ou
immunomodulateurs. Linterleukine 10 recombinante a t utilise dans la polyarthrite rhumatode sans dmontrer toutefois une efficacit clinique suffisante. 4-5Bloquer un mcanisme important de linflammation comme le recrutement des
cellules pro-inflammatoires. Il est possible de dvelopper des inhibiteurs des chmokines ou des intgrines ou un inhibiteur de langiogense. 4-6Favoriser un mcanisme rgulateur comme lapoptose, ce qui peut permettre
dliminer des cellules auto-ractives anormalement actives. 4-7Induire une raction immunitaire rgulatrice par linjection dun peptide la manire
dune vaccination. Une des cibles les plus intressantes de cette approche est la rgulation des populations LT rgulatrices dans les maladies auto-immunes. 4-8Lutilisation de cellules : cellules dendritiques, lymphocytes T rgulateurs, cellules msenchymateuses etc , reprsente une nouvelle approche de
souches
limmunomodulation, encore en cours dvaluation du fait du pouvoir immunomodulateur trs large et de la manipulation peu aise de ces cellules.
5-
Quels sont les problmes poss par ces biomdicaments ? Contrairement aux molcules chimiques, lvaluation chez lanimal est difficile. Ces
molcules sont construites spcifiquement pour neutraliser une cible humaine qui est souvent diffrente ou inexistante chez lanimal. Lanalyse du profil efficacit/ tolrance est donc exprimentalement difficile. A titre dexemple, linactivation du gne du CD20 (souris Kock out) ne semble pas avoir de consquence sur la survie dune cellule humaine, alors que linhibition thrapeutique du CD20 (ex par le rituximab) est trs efficace dans les maladies auto-immunes. 5-1Ces mdicaments ont une action cible , mais les consquences cliniques peuvent
tre multiples. Par exemple, un anticorps monoclonal anti-TNF ne bloque que le TNF, mais cette molcule a de nombreuses actions cellulaires. Ainsi, un anti-TNF a de multiples actions qui expliquent probablement son effet spectaculaire, mais aussi certains effets indsirables. 5-2Les effets immunitaires des biomdicaments peuvent aussi se faire en cascade . Un
anticorps monoclonal anti-lymphocyte B peut inhiber les lymphocytes T dont lactivation dpend de leur collaboration avec les lymphocytes B. 82
2me Anne Biologie
5-3-
Le dosage des taux sriques ou tissulaires de ces molcules nest pas aise. En fait, ces
dosages sont particulirement compliques car ces molcules ont des similitudes avec des protines (immunoglobulines) et surtout leur fraction active peut tre fixe a sa cible et ainsi tre indosable ou au contraire circuler sous la forme dimmuns complexes. 5-4Ces molcules peuvent avoir des effets indsirables parfois svres (degr de
limmunosuppression). Globalement, le risque le plus connu est celui des infections qui existent avec tous les immunosuppresseurs (tuberculose latente rvle par les anti-TNF). 5-5 Dautres effets indsirables sont plus difficiles a prvoir, comme le suggre les
exemples suivants: De nombreux inhibiteurs cytokiniques (anti-TNF, anti-IL-1, anti-IL-6) se manifestent
par des cytopnies. Les anticorps monoclonaux anti-lymphocytes B ou T peuvent entrainer des dpltions
lymphocytaires parfois durables. Certaines molcules peuvent avoir des effets inattendus (anticorps monoclonal anti-
CD28 agoniste et ouragan cytokinique ). Le risque noplasique est une proccupation indiscutable. Il est possible quun
traitement anti-TNF puisse rvler un cancer latent dont le risque est plus lve chez certains patients (immunodprims, tabagiques).
Conclusion : Au total, le concept dimmunothrapie nen est probablement qu ses dbuts. Lavenir va se faire schmatiquement dans cinq directions : Le dveloppement de nouveaux outils biotechnologiques devra tenir compte des
caractristiques individuelles. En effet, la rponse thrapeutique un anticorps monoclonal ou un rcepteur soluble peut tre dtermin gntiquement comme cela a t dmontr pour le rituximab dans les lymphomes (rle des gnes codant pour les rcepteurs des fragments Fc des immunoglobulines).La biotechnologie pourrait aussi permettre de nouvelles modalits dadministration notamment en prolongeant la demi-vie par lutilisation du polythylne glycol ou dautres molcules. Lavenir permettra galement denvisager des vectorisations originales mimant des mcanismes de dfense physiologiques comme lARN interfrant. La recherche de nouvelles cibles thrapeutiques sera une tape importante car il faudra
dans chaque maladie connatre la cible la plus pertinente. Il sera mme envisageable dagir sur
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plusieurs cibles thrapeutiques simultanment ou successivement afin denrayer le plus profondment possible la maladie. La pertinence de cette stratgie reste dmontrer. La recherche de nouvelles indications sera une volution ncessaire et utile.
Cependant, chaque nouvelle indication ncessiterait une validation rigoureuse car les spculations exprimentales ne rsistent pas toujours lpreuve clinique. Ainsi, malgr des arguments thoriques sduisants, il a t dmontr rcemment dans le syndrome de GougerotSjgren primaire que les anti-TNF navaient pas vritablement dintrt clinique. Lvaluation de la tolrance en cas de traitement prolong ou rpt sera galement un
enjeu majeur car il est indispensable de dfinir le rapport bnfice/risque de ces nouveaux mdicaments. Ces modulateurs du systme immunitaire font craindre par dfinition des infections inattendues, mais aussi lapparition de cancers solides et de lymphomes. Il est indispensable dans ces affections inflammatoires chroniques dtre attentifs ce risque. Lvaluation des stratgies thrapeutiques est aussi une question essentielle. Lenjeu
des prochaines annes sera doptimiser la stratgie dutilisation des biothrapies en dterminant notamment sil y a intrt "frapper fort demble" pour rechercher le plus vite possible une rmission complte ou plutt dagir de faon progressive. Dans les maladies les plus chroniques, il sera indispensable de savoir quel est lintrt dun traitement continu par rapport un traitement squentiel. Les progrs de limmunothrapie sont fantastiques, mais le chantier de lvaluation est gigantesque car il va falloir dterminer maintenant "le bon traitement" pour "le bon malade" et "au bon moment" de sa maladie. Le nombre de paramtres susceptibles de varier selon les individus rend lquation complexe rsoudre.
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Objectifs
123Citer les deux tats et fonctions des cellules dendritiques. Citer les types et sige des de cellules dendritiques. Citer les mthodes dobtention des cellules dendritiques cellules
dendritiques mylodes. 4Citer les tapes de charge cellulaire par lantigne tumoral en cas
dutilisation thrapeutiques des cellules dendritiques.
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LES CELLULES DENDRITIQUES
1-
Introduction- rappel sur les cellules dendritiques : Linteraction entre les cellules de l'immunit inne et adaptative est indispensable pour
permettre une rponse immunitaire efficace. Cette interaction repose sur les cellules prsentatrices "professionnelles" et plus particulirement la cellule dendritique. La premire tape de la rponse immunitaire est toujours la mise en jeu presque instantane, ds lagression, de l'immunit inne. Cette tape va permettre, dans la plupart des cas, d'liminer rapidement des "agresseurs" mais galement d'informer trs vite les acteurs cellulaires (lymphocytes) de l'immunit adaptative. Cette coordination est assure par les cellules dendritiques (CD) qui sont prsentes dans les tissus sous forme immature. Les CD immatures ont comme fonction de "surveiller" le systme immunitaire pour empcher lapparition dune auto-immunisation (surveillance de la tolrance). Les CD peuvent "maturer" au contact dun agresseur pour devenir des cellules capables d'activer les lymphocytes. Si les CD tissulaires rencontrent un microbe au cours de leur "voyage", elles vont phagocyter "lagresseur" tout en recevant de sa part des "signaux" qui induisent leur maturation. Ces signaux sont transmis par des "petits bouts" de microbes, appels PAMPs (pathogen-associated molecular patterns), qui se fixent sur des rcepteurs spcifiques, appels PRR (pattern recognition receptor) dont certaines lctines ou les rcepteurs de type TLR (Toll-like receptor). Ces CD maintenant matures vont alors migrer vers les organes lymphodes secondaires pour y activer les lymphocytes T en leur prsentant les antignes microbiens. Le "drainage" de ces CD se fait par de petits vaisseaux lymphatiques vers un ganglion de proximit. 1-1Quest-ce quune cellule dendritique ? Un lignage original individualis ou un
phnotype associ un profil fonctionnel ?

Il sagit de cellules de ligne mylode ou lymphode qui, un moment donn, doivent prsenter lantigne et acquirent les proprits permettant de le faire. La fonction de ces cellules est de prsenter lantigne aux lymphocytes T et dactiver ces lymphocytes produire les cytokines et les capacits effectrices qui sont les leurs. Les cytokines ainsi produites peuvent tre de type Th1 (essentiellement IFN-) et induire lexpansion de la rponse cellulaire ou de type Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) favorisant la rponse anticorps.
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2me Anne Biologie
La rponse des cellules dendritiques semble due principalement lengagement de leurs PRR de surface, qui induit des circuits dactivation intracellulaire diffrents dans la cellule dendritique et une activation diffrente des lymphocytes T mis en contact des cellules dendritiques. La mise en uvre de lactivation diffre selon que les cellules dendritiques restent immatures ou incompltement matures et selon le fait que lantigne est capt par une lctine ou bien par un TLR. Selon la population active initialement et lenvironnement, le contrle par la cellule dendritique sera diffrent. Il est important de pouvoir matriser ce phnomne pour utiliser les cellules dendritiques ex vivo dans le cadre de limmunothrapie cellulaire ou les contrler in situ pour s'en servir comme adjuvants naturels dans un contexte de vaccination thrapeutique antivirale ou anti-tumorale.
Capacits fonctionnelles des DC mylodes en fonction du stade de maturation
1-2-
types de cellules dendritiques : Chez lhomme, schmatiquement, il existe 2 grands types de CD :
1-
Les CD mylodes (CD11c + CD14-) comprenant les cellules de Langerhans prsentes
dans lpiderme et les pithliums stratifis et les CD interstitielles du derme et des autres tissus. 2Les CD lymphodes ou plasmacytodes (CD11c CD123+) prsentes dans les
ganglions, la rate, la moelle osseuse et le thymus. Ces CD produisent de l'IFN qui a
87
2me Anne Biologie
diffrentes actions sur les lymphocytes T (cytotoxiques et mmoires) et sur les lymphocytes B. La CD est donc la cellule clef dinterface entre limmunit inne et adaptative. C'est "l'engagement" de ces TLR qui induit diffrentes fonctions de ces CD : elles vont migrer vers les organes lymphodes car elles vont exprimer des rcepteurs
qui les y attirent, elles expriment des molcules HLA et des molcules de co-stimulation pour pouvoir
dialoguer avec les lymphocytes T, elles produisent des cytokines qui activent les lymphocytes T (IL-12, IL-23) et les
protgent contre les lymphocytes T rgulateurs (IL-6).
Diffrents types de cellules dendritiques
1-3-
Fonctions physiologiques des cellules dendritiques : Les cellules dendritiques sont au cur de la rponse immune, elles interagissent ave
diffrents cellules effectrices de systme immunitaire (cellules NK, macrophage, lymphocytes T CD4+ et CD8+ et B) .Ce sont des cellules prsentatrices de lAg professionnelles
initiatrices des ractions immunitaires primaires Capturent, apprtent et prsentent les antignes aux lymphocytes T nafs Scrtent des cytokines : TNF, IL-1, IL-6, IL-10 // IL-12 rponse TH1 Peuvent aussi inhiber la RI: CD immatures tolrognes.
88
2me Anne Biologie
Les CD immatures induisent la tolrance
Les CD matures induisent la rponse immune 89
2me Anne Biologie
1-4- Rle en pathologie : Pathologies auto-immunes: Augmentation du nombre et de lactivation des DC : Psoriasis Arthrite Rhumatode Transplantation: Raction allognique primaire GVH? Tolrance? - Hypersensibilit de contact et asthme: Rle des LC qui peuvent capter des antignes (allergnes) et migrent vers les ganglions drainant pour induire une rponse immune 2DC et Virus : Rougeole: formation de cellules multinucles et syncitia; anomalie fonctionnelles des DC VIH.
Mthodes dobtention des CD mylodes : Les CD peuvent tre gnrer in-vitro partir des cellules souches hmatopotiques
CD34+ ou des monocytes. La mthode de rfrence est la diffrenciation de monocytes : 2-12-22-3Elutriation pour purification des monocytes Culture en RPMI-2% albumine humaine en prsence GM-CSF et IL-4 Maturation courte (6-8) avec cocktail Schuler (TNF, IL-1, IL-6, PGE2) ou activation
des TLR (TNF + poly (I:C)).
Diffrenciation de monocytes in vitro en cellules dendritiques
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2me Anne Biologie
3-
Utilisation thrapeutiques des cellules dendritiques: Selon leur stade de maturation et le contexte de leur activation, les cellules
dendritiques peuvent tre tolrognes ou immunognes. Du fait de leur rle majeur aussi bien au cours de limmunit inne que de limmunit acquise, les proprits immunognes des cellules dendritiques ont t utilises dans le traitement de certains cancers. Au cours du processus tumoral, les cellules tumorales vont entre autre agir sur les CD en scrtant des cytokines immuno-suppressives qui rendent ces CD tolrognes. La thrapie cellulaire du cancer passe dans ce cas par une immunomodulation de la CD pour la rendre la plus immunogne possible. Cette utilisation passe par diffrentes tapes, non encore bien standardises. 3-1Etapes de charge par lantigne tumoral : Il sagit de primer la cellule dendritique par lAg tumoral (le plus susceptible dinduire une rponse immune efficace, une fois prsenter aux lymphocytes T). Trois mthodes peuvent tre utilises : 123Mettre en contact la cellule dendritique avec lAg. Fusionner la cellule dendritique avec la cellule tumorale. Provoquer une diffrentiation de la cellule tumorale elle-mme en une CD.
LMC : leucmie mylode chronique ; LAM : leucmie aigue mylode
Etapes de charge par lAg 3-2Essais cliniques des cellules dendritiques : Aprs plusieurs tapes exprimentales, des essais cliniques ont t pratiqus chez lhomme (lymphomes, cancer du rein mtastas, mylome multiple et c...). Ces essais ont t
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2me Anne Biologie
pratiqus chez des patients un stade avanc de la maladie, ou rfractaire aux traitements usuels, ou en cas de masse tumorale importante. Il sagit de dvelopper une stratgie de vaccination anti-tumorale par les cellules dendritiques.
Vaccination par les cellules dendritiques
4-
Contrle de qualit :
Strilit (GRAM-) Puret (CD14+ : marqueur des monocytes <20%) Viabilit (> 70%) Stade de maturation (CD83+ : marqueur des CD matures > 60%) Tests fonctionnels: * Capacit de migration * Raction lymphocytaire mixte * Scrtion dIL-12
92
2me Anne Biologie
Objectifs
1Citer les mcanismes daction des lymphocytes T rgulateurs CD4+
CD25+. 23Citer les rles des lymphocytes T rgulateurs. Citer les arguments rvlateurs du rle des lymphocytes T rgulateurs
au cours du diabte auto-immun chez la souris NOD. 4Citer les tapes dobtention et de culture des lymphocytes T
rgulateurs.
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2me Anne Biologie
LES LYMPHOCYTES T REGULATEURS
11-1-
Introduction rappel : Origine et population des lymphocytes T rgulateurs : Les Lymphocytes T rgulateurs reprsentent une population indispensable maintenir
une certaine homostasie du systme immunitaire, en particulier en vitant l'apparition de populations lymphodes auto-ractives. Il existe diffrentes populations rgulatrices appeles Th3, T R1 et T Reg. Les lymphocytes rgulateurs naturels, caractriss par un phnotype CD4+ CD25+ sont prsents spontanment sans induction. Cette population est d'origine thymique. En effet, ces lymphocytes ont t slectionns dans le thymus selon leur affinit pour des auto-antignes, dont lexpression est rgule par des mcanismes trs originaux en particulier par un facteur appel AIRE. Cest ce facteur AIRE qui explique quapparaissent dans le thymus des lots de tissus "inattendus" (pancras, thyrode, glande salivaire) qui permettent dduquer les lymphocytes afin que ces structures soient prserves dune raction immunitaire "auto-agressive". Aprs leur ducation thymique, ces cellules vont migrer en priphrie o elles reprsentent peu prs 5% des lymphocytes circulants. La fonction des LT Reg CD4+ CD25+ dpend dun facteur de transcription spcifique appel Fox-P3. Aujourd'hui, il existe de nombreux exemples impliquant ces populations de LT reg dans la survenue de maladies inflammatoires et auto-immunes.
LT reg naturels et inductibles 94
2me Anne Biologie
1-2- Mcanismes daction des L T rgulateurs : Ils agissent essentiellement par contact cellulaire, notamment par la voie de costimulation inhibitrice B7/CTLA-4. Bien qu'elles puissent produire de faibles quantits d'IL10 et de TGF" ces cytokines n'ont probablement pas d'efficacit inhibitrice majeure. Les mcanismes par lesquels les LTreg contrlent lmergence de maladies autoimmunes sont trs mal connus. Des expriences rcentes ralises in vivo montrent que ces cellules pourraient bloquer lactivation des LT auto-ractifs et inhiber ainsi leur prolifration et/ou leur diffrenciation en cellules effectrices pathognes. Des expriences in vitro ont galement montr que les LTreg sont des cellules suppressives trs puissantes capables dinhiber lactivation des LT CD4+ et CD8+ en bloquant leur prolifration et leur diffrenciation. Plusieurs mcanismes daction pourraient donc tre impliqus dans la prvention, par les LTreg, de maladies auto-immunes.
22-1-
Rles des lymphocytes T rgulateurs : Rles bnfiques : Prvention des maladies auto-immunes Inhibition des rponses allergiques Inhibition des rponses allogniques : Maladie de greffon contre lhte GVHD : (greffe de moelle osseuse) Rejet de greffe (transplantation dorgane)
95
2me Anne Biologie
linfectabilit. 2-2-
Relation mre-ftus
Pas dpuisement du systme immunitaire, limitation de linflammation, baisse de
Rles dltres : Inhibition des rponses anti-tumorales. Rponses anti-infectieuses diminues (parasites et virus).
3-
Problmatique dutilisation des T reg en thrapie cellulaire Population rare. Slection par marqueur de surface. Expansion des T reg Prserver lintgrit fonctionnelle des T reg
4-
Utilisations thrapeutiques des lymphocytes T rgulateurs : Le but est de gnrer des lymphocytes T suppresseurs pour des approches de thrapie
cellulaire et gnique : Contrle de la maladie du greffon contre lhte (GVHD) 96
2me Anne Biologie
4-1-
Traitement des maladies auto-immunes Contrle du rejet de greffe dorganes Utilisation des T reg pour le contrle de la GVHD : Lors de la greffe de moelle osseuse, le rle des cellules du greffon (les Lymphocytes
T) est triple : Effet anti-infectieux (antiviral +++) : (GVI : raction greffon contre infection) Effet anti-tumoral : (GVL : raction greffon contre la leucmie) Effet anti-hte : (GVHD : raction du greffon contre lhte) Le but est dutiliser leffet des T reg pour empcher la survenue de GVHD.
HSC : cellules souches hmatopotique; host cell : cellule de lhte
Rle des T reg dans le contrle de la GVHD Les LTreg naturellement prsents dans le greffon mdullaire retardent spontanment lapparition de la GVHD. Ladministration, au moment de la greffe, dun grand nombre de L Treg syngniques permet de prvenir ou de retarder considrablement la survenue dune GVHD. Cet effet est obtenu aussi bien avec des LTreg frachement purifis quavec des cellules obtenues aprs leur multiplication in vitro. La dcouverte des LTreg ouvre donc un vaste champ non seulement dinvestigations exprimentales, mais probablement de perspectives thrapeutiques. 4-2Utilisation des T reg dans le traitement des maladies auto-immunes : Malgr les mcanismes de dltion clonale la base de la tolrance centrale, il persiste des LT fonctionnels qui reconnaissent des antignes du soi. Ces LT auto-ractifs , sils sont activs, exposent au risque de maladies auto-immunes. Ce processus est contrl par des LT 97
2me Anne Biologie
rgulateurs qui empchent laction des LT auto-ractifs potentiellement pathognes, prvenant ainsi lmergence de maladies auto-immunes. les LT CD4+ exprimant de faon constitutive la chane du rcepteur de linterleukine-2 (CD25) (soit 7-10 % des LT CD4+) jouent un rle majeur dans la prvention des maladies auto-immunes. En effet, lorsque lon provoque un dficit spcifique en LT rgulateurs CD4+CD25+ (LTreg) chez des rongeurs qui ne dveloppent pas normalement de maladies auto-immunes, un syndrome auto-immun touchant de nombreux organes apparat. Par ailleurs, un dficit en LTreg aggrave considrablement le diabte auto-immun des souris NOD (non-obese diabetic) qui dveloppent de faon spontane cette maladie. Ces donnes indiquent que les LTreg exercent en permanence un contrle de lauto-immunit. Les Ly Treg ont rcemment t dcrits chez lhomme o ils prsentent des proprits remarquablement similaires celles qui ont t caractrises initialement chez les rongeurs. On peut donc esprer traiter certaines maladies auto-immunes en induisant une tolrance immune grce ladministration de LTreg. Cest effectivement ce qui se produit chez lanimal: ainsi, nous avons montr que chez des souris NOD (non obese diabetic) dveloppant un diabte exacerb par la cration dun dficit en LTreg, ladministration de ces cellules avant lapparition du diabte clinique en retarde lexpression voire prvient la maladie.
La pertinence clinique de ces rsultats se trouve renforce par lobservation rcente que des patients atteints de diabte auto-immun ont un dficit en LTreg. Ds lors, linjection de fortes doses de LTreg autologues chez des personnes pr-diabtiques pourraient arrter le processus auto-immun, bloquer la destruction des cellules scrtrices dinsuline et prvenir le diabte. De grandes quantits de cellules pourraient tre obtenues par la multiplication abondante ex vivo des Ly Treg, prlevs au pralable chez le patient. 98
2me Anne Biologie
55-15-2-
Production des lymphocytes T rgulateurs : Problmatique dutilisation des LTreg en thrapie cellulaire : Population rare Slection par marqueur de surface Expansion des LTreg Prserver lintgrit fonctionnelle des LTreg Conditions de grade clinique (GMP) Obtention et culture des LTreg humains : Slection positive sur la base de lexpression forte du CD25 Expansion ex vivo durant 21 jours en condition de grade clinique Etude de leffet de la rapamycine: Immuno-supresseur bloquant les T effecteurs et/ou
favorisant les LTreg Suivi de la fonction suppressive des LTreg: expression de FOXP3 et test de
suppression.
99
2me Anne Biologie
Objectifs
1Dfinition, caractristiques et origines des cellules souches
msenchymateuses. 2Citer certaines lignes produites in vitro partir des cellules souches
msenchymateuses. 3Connatre certaines proprits immunomodulatrices des cellules souches
msenchymateuses. 4Connatre certaines proprits rparatrices des cellules souches
msenchymateuses.
100
2me Anne Biologie
CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES
Dfinition : La moelle osseuse (MO) contient au moins deux types de cellules souches, les cellules souches hmatopotiques (CSH) et les cellules souches msenchymateuses (CSM). Les CSM donnent les cellules de lappareil locomoteur (ostocytes, tnocytes, chondrocytes), les adipocytes et les cellules stromales mdullaires qui assurent le soutien de lhmatopose. Cellules prognitrices multipotentes non hmatopotiques sont : - Prognitrices : cellules souches - Multipotentes: capables de se diffrencier en cellules de tissus dorigine msodermique et sont retrouver prfrentiellement au sein des cellules stromales mdullaires. - Non hmatopotiques: cellules ne donnant pas naissance aux 3 lignes sanguines Les CSM possdent deux proprits particulires : Lautorenouvellement : La diffrentiation :
101
2me Anne Biologie
2-
Origine des CSM : Principalement la moelle osseuse, o elles reprsentent aux alentours de 0.01%
0.001% des cellules. Dautres tissus peuvent aussi renfermer ces CSM/ : Tissus adipeux, Sang de cordon, Villosit chorioniques du placenta, Membrane ou liquide amniotique, Foie ftal. Le nombre des CSM dcrot avec lge.
3-
Phnotype des CSM : lheure actuelle, il nexiste pas de marqueur membranaire spcifique des CSM.
Plusieurs antignes de surface ont t utiliss dans le but denrichir les populations de CSM. La slection de cellules Stro-1 positives permet dobtenir dix 20 fois plus de colony forming units-fibroblast (CFU-F) qu partir de la moelle non slectionne. Le rcepteur de basse affinit du facteur de croissance neuronal (low affinity nerve growth factor receptor [LNGFR] ; CD271) permet disoler des CSM ayant des capacits prolifratives dix 1000 fois suprieures celles de CSM isoles par adhrence au plastique. De la mme faon, les antignes CD200, SSEA-4 et CD49a ont t dcrits comme des marqueurs prcocement exprims sur les CSM mdullaires. Malgr labsence de marqueurs spcifiques, il est aujourdhui admis que les CSM prsentent les caractristiques phnotypiques suivantes : elles expriment les antignes de surface CD105 (SH2), CD73 (SH3/SH4), CD90, CD44, CD29, CD146. En revanche, elles nexpriment pas les marqueurs de cellules hmatopotiques CD34, CD45, CD14. ltat basal, les CSM expriment avec une faible densit les molcules HLA de classe I, mais nexpriment pas les antignes HLA de classe II, ni les molcules de costimulation CD80, CD86 et CD40. Il est donc potentiellement envisageable, en dehors dapplication clinique en situation autologue, de transplanter les CSM dans une situation dallogreffe avec incompatibilit HLA. Les CSM se caractrisent galement par la synthse de facteurs de croissance et de cytokines (M-CSF, IL-6, IL-11, IL-15, SCF, VEGF) impliqus dans la rgulation de lhmatopose, les interactions cellulaires, langiognse, la modulation de la rponse immunitaire.
4-
Plasticit des CSM : La plasticit est dfinit comme tant la capacit dune cellule dun lignage de se
diffrencier en un tissu de spcificit diffrente. Les CSM sont des progniteurs de nombreux lignages cellulaires du tissu conjonctif. In vitro, cette cellule est capable de donner naissance des cellules stromales, support de 102
2me Anne Biologie
lhmatopose, et de se diffrencier en adipocyte, en ostoblaste, en myoblaste, en chondrocyte. Dans des conditions de culture in vitro particulires, les CSM peuvent galement se diffrencier en cellules des lignes endodermiques ou neuro-ectodermiques, comme les neurones, les hpatocytes, lendothlium, en cardiomyocytes, en cellules productrices dinsuline. De telles cellules souches pluripotentes ont t identifies dans la MO et sont connues sous les noms de multipotent adult progenitor cells (MAPC), marrowisolated adult multilineage inducible cells (MIAMI,) ou very small embryonic-like stem cells (VSEL).
5-
Production des SCM : Une fois le matriel de dpart prlev, les conditions de culture doivent tre dfinies.
Les CSM sont des cellules normales adhrentes qui prsentent une inhibition de contact. Ainsi, plusieurs paramtres sont critiques : la densit densemencement, le nombre de passages (de rensemencement), le milieu de culture et les facteurs de croissance utiliss. La puretdu matriel initial nest pas un paramtre limitant car il a t montr que lon pouvait slectionner ces cellules grce a` leur proprit dadhrence sur le plastique de culture (les cellules hmatopotiques ny adhrent pas pour leur grande majorit). 103
2me Anne Biologie
Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC)
Production et pluripotence des cellules souches msenchymateuses
6-
Utilisation des CSM : Pr-requis avant applications cliniques des CSM :
Connaissances prcises des voies de diffrenciation preuves de la prise de greffe et de la fonctionnalit modles animaux pertinents des pathologies pouvant tre traites par les CSM procds de production des CSM chelle clinique et en accord avec les GMP (Conditions de grade clinique)
6-1- Proprits immunomodulatrices : Les premires donnes dmontrant, in vitro, les capacits des CSM inhiber lactivation et la prolifration des lymphocytes T drivent dtudes ralises avec des CSM mdullaires humaines, de primates non humains, ou de rongeurs. Linhibition de la prolifration T semble dpendre, au moins en partie, de contacts entre les deux populations cellulaires, conduisant la production de cytokines inflammatoires comme lIFN- ou lIL-1 Les CSM pourraient agir par inhibition des divisions des cellules T actives, mme aprs addition dIL-2 exogne. Les CSM sont capables de moduler la rponse immunitaire en induisant une population de cellules T rgulatrices (Treg). Linhibition de la prolifration cellulaire T tait dpendante de la synthse, par les lymphocytes T, dINF- et dau moins lune des trois autres cytokines suivantes : TNF-, IL-1 ou IL-1. Laction des cytokines 104
2me Anne Biologie
pro-inflammatoires dans limmunosuppression induite par les CSM est lie laction des chmokines et de loxyde nitrique .Les chmokines vont provoquer la migration des cellules T proximit des CSM, la prolifration lymphocytaire tant dans le mme temps inhibe par loxyde nitrique. Les CSM inhibent la prolifration et lactivation des lymphocytes B, et modulent la diffrenciation, la production danticorps et la chmotaxie de ces mmes lymphocytes B. Linhibition des fonctions B est dpendante de facteurs solubles librs par les CSM. Les CSM peuvent inhiber la maturation des DC drives de monocytes en rgulant ngativement lexpression des antignes CD11c, CD83, des molcules du CMH de classe II et celle des molcules de costimulation. De mme, une diminution de la production de cytokines pro-inflammatoires (TNF-, IFN- et IL-12) et une augmentation de la production dIL-10 (anti-inflammatoire) ont t observes. Il est donc probable que les CSM inhibent la diffrenciation des DC et conduisent lmergence de DC immatures.
Fonctions immunomodulatrices des CSM
Immunomodulation induite par les CSM. TGF- : transforming growth factor beta ; PGE2 : prostaglandin E2 ; IDO : indoleamine 2,3-dioxygenase ; HGF : hepatocyte growth factor ; IFN- : interfron gamma ; TNF-: tumor necrosis factor alpha ; M-CSF : macrophage-colony stimulating factor ; IL-6 : interleukin 6 ; IL-12 : interleukin 12.
105
2me Anne Biologie
Les rsultats prliminaires valuant lintrt des CSM dans le contrle de GVH aigus rsistantes aux traitements immunosuppresseurs sont lorigine de lutilisation potentielle des CSM dans certaines maladies auto-immunes rsistant tous les traitements pralables. De plus, lutilisation des CSM autologues, vise immunosuppressive ou
immunomodulatrice adjuvante en clinique humaine, constitue un outil thrapeutique en cours dinvestigation et de dveloppement. 6-2- Proprits rparatrices : Lensemble des donnes exposes ci-dessus montre lintrt des CSM et des ADSC en thrapie cellulaire, que ce soit en situation autologue ou mme allognique. Un certain nombre dessais cliniques a dailleurs dj` t ralise. Ils couvrent plusieurs domaines thrapeutiques, la rparation osseuse, lhmatologie et la rparation cardiaque. Le premier essai rapport concernait trois enfants atteints dostogense imparfaite traits par greffe de MO allognique. Cet essai dmontrait que la greffe amliorait, au moins de faon transitoire, les signes cliniques de la maladie. Le mme groupe a ensuite dmontr que linjection de CSM allogniques purifies pouvait accrotre le bnfice obtenu par la greffe de moelle chez ces mmes patients, confirmant la possibilit dexploiter le potentiel ostognique des CSM. En dehors du cadre des maladies hrditaires du tissu squelettique, les CSM ont t utilises dans la rparation de grandes pertes de substances osseuses post-traumatiques. Les CSM cultives en prsence de fibroblast growth factor 2 permettaient, en association avec une matrice, la reconstruction osseuse. Aucune complication na t observe chez les patients traits. Le second essai, rapport, concerne 12 patients atteints dune maladie dgnrative neurologique et musculaire (leucodystrophie et maladie de Hurler) traits par des CSM allogniques injectes par voie veineuse. Il avait t observ pour quelques patients une amlioration infraclinique. lheure actuelle, un seul article dans la littrature rapporte lutilisation de CSM chez lhomme pour le traitement de patients atteints de maladies auto-immunes. Une patiente atteinte de sclrodermie systmique svre, rfractaire aux traitements conventionnels, a t traite par une injection intraveineuse de CSM allogniques. Trois mois aprs injection des CSM, une diminution significative du nombre dulcrations a t observe. six mois, la circulation sanguine au niveau des mains et des doigts semblait significativement amliore, la pression partielle doxygne transcutane tait augmente. Ce rsultat encourageant est un argument pour dvelopper des essais cliniques de phase III dans cette pathologie et dans certaines maladies auto-immunes rsistantes aux traitements pralables. 106
2me Anne Biologie
Thrapie cellulaire: 1- Rparer une fonction dficiente 2- Reconstitution du tissu d'origine 3- Reconstitution d'un tissu autre que celui d'origine (plasticit)
107
2me Anne Biologie
Objectifs
12Dfinir les nanosciences. Citer et expliquer les deux grandes approches qui coexistent dans le
domaine des nanotechnologies. 34Reconnatre les objectifs de la nanotechnologie. Reconnatre les applications de la nanotechnologie.
108
2me Anne Biologie
LES NANOTECHNOLOGIES
Introduction, dfinitions :
Les nanosciences regroupent lensemble des recherches ayant pour objectif la synthse et ltude de nano-objets (10-9 m) dous de proprits spcifiques que celles-ci soient physiques, chimiques ou biologiques. Les nanosciences par construction sintressent des objets physiques de taille de lordre de grandeur. Le nanomtre vaut un milliardime de mtre (10-9 m). On qualifie de nanomtrique des objets dont la taille sera comprise entre une centaine de nm et quelques nanomtres. Pour fixer les ides, on se trouve dans la zone de taille immdiatement suprieure celle des atomes ou des molcules qui constituent la matire quelle soit vivante ou inerte. Typiquement, un atome a une taille de lordre du dixime de nanomtre (en moyenne 0,3 nm). Dans un nanomtre on aligne donc environ trois atomes et, dans une sphre de 2 ou 3 nanomtres, on place environ un millier datomes. Un objet nanomtrique sera donc constitu dun petit nombre datomes ou molcules. On peut considrer que lambition des nanosciences sera de fabriquer, caractriser et manipuler les objets les plus petits que lhomme puisse concevoir. Les objets classiques macroscopiques sont constitus dun nombre impressionnant de molcules ou atomes. Il convient toutefois de remarquer que ces objets nanomtriques nont de sens quinsrs ou parties dobjets plus grands (de la taille du micromtre) eux mmes inclus dans des dispositifs manipulables lchelle humaine.
109
2me Anne Biologie
Les nanotechnologies sont nes en 1981 avec l'apparition d'un nouveau type de microscope (le microscope force atomique) qui permet non seulement dobserver les atomes et les molcules lunit, mais aussi de les dplacer. En 1991, la manipulation d'atomes de carbone disposs en forme de tube a permis de fabriquer les premiers nanotubes six fois plus lgers que lacier et 100 fois plus rigides. Ils servent la fabrication de nano-seringues mdicales de trs haute prcision. En bioinformatique, les biopuces utilisent les
nanotechnologies. Et les recherches en robotique sorientent, entre autres, vers la fabrication de nanorobots qui pourraient tre envoys dans le corps dun homme malade pour dlivrer des mdicaments la molcule prs. 1Mthodologie : Les nanosciences ont mis au point ces mthodes dinvestigation au cours des dernires annes. Lutilisation de microscopes force atomique (AFM) a mme permis de manipuler individuellement des atomes et de les ranger selon des dispositions prcises. Les composants des organismes vivants sont galement de taille micromtrique voire submicromtrique. Les cellules, units fonctionnelles du vivant sont des globules de quelques m de diamtre. A lintrieur des cellules, des ractions chimiques seffectuent au sein de compartiments de quelques nanolitres. Le passage lintrieur des cellules de composs (mdicaments, mdiateurs chimiques, mtabolites, etc) se fait par laction de pores de quelques nanomtres de taille. Les agresseurs des cellules (bactries, virus) sont galement des entits de la taille micro, voire nanomtrique. Par exemple, lenveloppe du virus de la grippe est constitue dun assemblage de plusieurs macromolcules protiques et fait quelques 100 nm de diamtre. Oprant des chelles identiques selon parfois des lois communes, il est naturel que les nanotechnologies rencontrent les sciences biologiques pour former ce que lon appelle les nanobiotechnologies.
Deux grandes approches coexistent dans le domaine des nanotechnologies : La premire qualifie de Top-Down cest--dire du haut en bas consiste
miniaturiser par les moyens de rduction de taille des dispositifs existants. Une approche inverse qualifie elle de Bottomup du bas vers le haut consiste
assembler (ou faire sauto assembler) des motifs atomiques ou molcules afin de constituer des objets nanomtrique
110
2me Anne Biologie
2-
Outils de la nanotechnologie :
Les outils de manipulation molculaire existent mais ne sont accessibles que dans le
domaine de la recherche fondamentale mettant en jeu une instrumentation complexe telle que les microscopes effet tunnel ou force atomique. 2-1Le microscope effet tunnel : Le microscope effet tunnel est l'origine un instrument permettant la visualisation (l'imagerie) d'une surface de matriau avec une prcision atomique. Cet instrument fut dvelopp au dbut des annes 1980. L'lment le plus important est une pointe mtallique positionne au-dessus de l'chantillon analyser. Le mouvement de cette pointe est command par des tubes pizolectriques permettant un dplacement trs prcis dans les trois dimensions de l'espace. Une tension lectrique est applique entre la pointe et l'chantillon. Lorsque la pointe est suffisamment proche de la surface de l'chantillon sans toutefois tre en contact avec elle, un courant d'lectrons s'tablit par effet tunnel (mcanisme de conduction lectrique). L'amplitude du courant tunnel varie trs fortement en fonction de la distance sparant la pointe de la surface du matriau analyser. Typiquement, cette distance est de l'ordre de 0,1 1 nm. La pointe effectue un balayage dans le plan X-Y parallle la surface. Durant ce balayage, la position de l'chantillon selon l'axe Z (altitude) est ajuste afin de maintenir constant le courant tunnel. En enregistrant l'altitude de la pointe pour chaque position balaye dans le plan X-Y, il est possible d'tablir une cartographie de surface de l'chantillon. Le microscope effet tunnel
Le microscope effet tunnel peut galement tre utilis pour la manipulation d'atomes. Par exemple, en modulant la tension entre la pointe et l'chantillon, il est possible
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2me Anne Biologie
d'extraire un seul atome, de le dposer sur la pointe, puis de le replacer sur la surface un emplacement choisi. 2-2- Le microscope force atomique : Le microscope force atomique opre sur un mode sensiblement diffrent de celui du microscope effet tunnel. Une pointe trs fine est usine l'extrmit d'une poutre de 2 3 mm de longueur. La pointe est positionne au contact intime de la surface observer. Comme dans le cas du microscope effet tunnel, la pointe effectue un balayage dans le plan X-Y parallle l'chantillon. En recueillant les mouvements de dflexion de la poutre l'aide d'un faisceau laser, une cartographie de surface de l'chantillon caractriser peut tre tablie avec une rsolution de l'ordre du nanomtre. Le MFA peut bouger des atomes individuels avec une pointe spciale et peut graver : litographie
Microscope force atomique 3-
Les objectifs des nanobiotechnologies :

On ne connat la structure tri dimensionnelle fine que de quelques milliers de
3-1- La recherche post-gnomique :
protines. Parmi limmense rpertoire des protines (300.000 protines), seules quelques 112
2me Anne Biologie
centaines (300 peut-tre) sont des cibles pour les mdicaments couramment utiliss. La nanobiotechnologie constitue un des moyens qui nous permettra de connatre de faon plus dtaille ce monde des protines de la cellule que lon nomme le protome. 3-2- La recherche pharmaceutique : Les nouveaux mdicaments rellement innovants sont rares car de plus en plus difficiles trouver et dvelopper. Plusieurs centaines de milliers de molcules doivent tre testes in vitro pour quune poigne soit slectionne pour tre teste in vivo. Des barrires nombreuses se dressent au cours des essais cliniques devant les candidats mdicaments qui doivent prouver leur efficacit et leur scurit. On voit donc lintrt de pouvoir multiplier les essais in vitro grce des dispositifs alliant miniaturisation et paralllisation des analyses afin de se mettre en situation de tester encore plus de composs et donc de se donner le plus de chances de trouver le ou les rares bons candidats mdicaments. A cot de cette recherche de nouvelles molcules, une utilisation rationnelle des mdicaments pourrait se faire en slectionnant grce leur profil gntique, par exemple, les patients qui auraient le plus de chance de bnficier dun traitement, voire didentifier prcocement les patients qui risqueraient de prsenter des effets adverses aux mdicaments. Le profil de cellules cancreuses pourrait tre tabli par les mthodes issues des nanobiotechnologies afin didentifier le ou les thrapeutiques les plus appropries pour combattre ces cellules. De faon simple, on peut donc envisager que lapport des nanotechnologies se fera selon trois axes : mieux voir, cest--dire mieux diagnostiquer, mieux soigner et mieux compenser les dficits.
4-
Applications de la nanotechnologie :
4-1- Mieux voir pour amliorer le diagnostic :

4-1-1- mieux voir in vivo :
Une application de la miniaturisation la mdecine est dj concrtise et utilise. Il sagit dune capsule permettant de raliser des endoscopies. Dans une endoscopie classique , seule une partie de lintestin grle est accessible via un endoscope pouss, par la bouche, travers lestomac, dans des conditions peu agrables pour le patient. Afin de remdier ces inconvnients, on a mis au point une capsule contenant une minuscule camra vido couleur dont la taille est celle dune grosse glule que le patient avale et qui parcourt son appareil digestif en totalit.
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2me Anne Biologie
Les images sont transmises par radio, mesure de leur acquisition, un rcepteur, botier lectronique de la taille dun baladeur muni dune antenne que le patient porte sur une ceinture. Elles sont alors enregistres et stockes. Quant la glule, elle sera vacue par les voies naturelles.
4-1-2- Mieux voir in vitro : biopuces ADN, protines, cellules :
a-
Les puces ADN sont dj trs oprationnelles :
Le principe consiste positionner de faon slective sur un support solide (verre, plastique, silicium) des arrangements ordonns de fragments dacides nucliques obtenus par synthse chimique (les sondes). Chaque arrangement est spcifique de lexpression dun gne donn. Lchantillon sur lequel porte lanalyse est trait chimiquement pour en extraire le matriel produit par expression dun gne ; il sagit dun acide nuclique appel ARN messager (ARNm). Ces ARNm cibles sont en quantit suprieure quand un gne est activ. Ils ont la proprit de se lier aux sondes fixes sur le support. On suit la liaison plus ou moins intense entre la sonde et les ARNm par des mthodes physiques telles que la fluorescence aprs marquage chimique des ARNm cibles par des colorants fluorescents.
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2me Anne Biologie
La fabrication de ces puces utilise des outils ou mthodes dvelopps pour les nanotechnologies par exemple la lithogravure.
Une fois une srie de gnes connus pour leur relation avec une maladie, il est possible davoir recours des puces dites basse densit qui couvrent un nombre plus rduit de gnes (quelques centaines) mais qui sont particulirement adaptes au suivi dun grand nombre de patients ce qui est ncessaire dans le cas de diagnostics de masse. Le concept des puces ADN va stendre dautres macromolcules dintrt biologique : Il sagit des protines ou des polysaccharides. En effet, de nombreuses actions biologiques se droulent en raison de linteraction entre des protines et/ou entre des protines et des sucres (ractions immunitaires par exemple). Cet exemple des puces montre donc que la dtermination dun trs grand nombre de mesures biologiques (plusieurs dizaines de milliers) sur un seul chantillon de taille
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2me Anne Biologie
rduite est possible alors que la rgle commune est plutt de ntre capable que de faire des mesures en quantits limites sur des chantillons dont on dispose dun volume important. A mesure que ces oprations se banalisent, on tente de rduire la dimension des appareillages pour travailler sur des quantits de produit toujours plus faibles (microlaboratoires). bUn dveloppement intressant se situe dans le domaine du dveloppement
des nez lectroniques : Ces dispositifs allient un systme de dtection spcifique de molcules organiques en milieu gazeux et un systme sophistiqu de traitement du signal. Le systme de
dtection peut tre une surface nanostructure dun matriau aux proprits semi conductrices. Linteraction dune molcule organique avec la surface peut en modifier la conductance. Des particules de diamtre contrl de matriaux semi-conducteurs ont galement la particularit dmettre de la lumire selon une longueur donde trs prcise contrairement aux colorants classiques qui sont de grosses molcules organiques. Ces dernires sont fluorescentes selon une gamme tendue de frquences. On peut ainsi en faisant varier uniquement la taille des nanoparticules dobtenir une palette de couleurs. Ces nanoparticules une fois fixes sur des molcules dintrt biologiques peuvent servir en suivre le trajet dans des cellules vivantes ou dans des organismes. 4-2Mieux soigner :
4-2-1- La vectorisation des mdicaments : Un mdicament ne vaut que par sa capacit atteindre sa cible cest dire tre prsent la bonne concentration au bon endroit. Par ailleurs, le mdicament idal ne se sgarerait pas dans les mandres du corps, se diluant et donc perdant en partie de son activit. Lide est denfermer le principe actif du mdicament dans des sphres minuscules de quelques nanomtres de diamtre obtenus par structuration de polymres chimiques. A labri dans sa coquille le mdicament peut voyager sans tre dtruit dans lorganisme et en fonction des proprits et/ou de la structure des nanoparticules atteindre spcifiquement tel ou tel organe ventuellement tel ou tel compartiment dans la cellule. Certains essais reposent actuellement sur des encapsulations lintrieur de structures nanomtriques tels que les fullernes structures sphriques constitues de 60 atomes de carbone ou de nanotubes de carbone.
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4-2-2- Lactivation des nanoparticules des mdicaments anti-cancereux : Les nanomdicaments nanobiodrug associent une nanoparticule inerte une molcule qui, du fait de son affinit pour certaines cibles, joue un rle de tte chercheuse acheminant la nanoparticule dans les cellules vises en loccurrence les cellules tumorales. Leffet thrapeutique cest--dire la destruction mcanique des cellules tumorales par la nanoparticule est ensuite obtenue par application dun champ magntique. Les nanoparticules pourraient galement, terme, tre actives soit par laser (pour les cancers superficiels) soit par rayons X (pour les tumeurs profondes). 4-2-3- les nanoparticules base de fer (injectes puis chauffes) : Rcemment, une tumeur maligne crbrale dun malade a t limine par ces mdecins par injection de nanoparticules magntiques base de fer (les cellules cancreuses
absorbent plus rapidement les nanoparticules que les cellules saines). Sous anesthsie
gnrale, les nanoparticules ont t chauffes grce un champ magntique extrieur : lhyperthermie liquide magntique. Elle repose sur le fait que les cellules humaines sont dtruites par une lvation de temprature 45 pendant deux ou trois heures.
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2me Anne Biologie
Nanoparticules pour la dtection et destruction de tumeurs (or, fer)
4-3-
Compenser les dficits acquis ou congnitaux :

Certaines parties du corps humain (organes, cellules) se dgradent au cours du temps,
voire sont altres ds la naissance. Il est lgitime desprer trouver au travers des nanotechnologies les moyens de compenser partiellement ou totalement ces dficits. Lingnierie tissulaire se dfinit comme lutilisation de cellules et de biomatriaux pour le maintien ou la rparation/reconstruction de tissus et dorganes, ainsi que pour dvelopper et tester des nouveaux mdicaments. Elle peut sappliquer des tissus trs divers : peau, vaisseaux sanguins, tendons, ligaments, cartilage, os, vessie, foie, pancras, valvules cardiaques, corde dorsale, corne Elle fait appel trois types de techniques : Limplantation de cellules (autologues, allogniques, xnogniques), suite leur
amplification in vitro ; Limplantation de tissus reconstruits in vitro partir des cellules et des scaffolds
(chafaudages molculaires) ; La rgnration de tissus in situ avec des smart biomatriaux/nanofibres.
4-3-1- Les neuroprotheses : En premier lieu, on pensera notamment aux possibilits offertes par la connexion entre un dispositif lectronique et des cellules vivantes (cellules nerveuses ou neurones) qui pourront peut-tre un jour servir restaurer une connexion nerveuse rompue par un accident ou une maladie, voire remplacer un organe sensitif. Une neuroprothse pourrait un jour aider des personnes paralyses aprs une lsion de la moelle pinire retrouver une autonomie partielle. Des rseaux de microlectrodes implantes dans diverses zones du cortex moteur seraient relis une neuropuce situe dans le 118
2me Anne Biologie
crne. En imaginant un mouvement du bras paralys, la personne enverrait des signaux la neuropuce, qui les convertirait en signaux de frquence radio et les transmettrait un petit ordinateur portable. Ce dernier les transformerait en commandes et les enverrait une puce implante dans le bras de la personne. Cette deuxime puce stimulerait les nerfs ncessaires pour effectuer le mouvement imagin. 4-3-2- La reconstruction de la corne artificielle : Vise reconstruire une corne artificielle partir des protines humaines recombinantes de la matrice extracellulaire et des cellules pithliales, stromales et endothliales issues des cellules souches adultes. 4-3-3- Lingnierie cutane : Construction dune peau semi-artificielle. Conclusion : Travailler dans le domaine des nanotechnologies consiste : Travailler aux chelles atomiques, molculaires et macromolculaires, dans un ordre de grandeur allant approximativement de 1 100 nanomtres, afin de comprendre, de crer et dutiliser des matriaux, des dispositifs et des systmes possdant des proprits et des fonctions fondamentalement nouvelles en raison de leur taille rduite. La nanotechnologie prsente un champ trs large, touchant tous les aspects de la vie (physique, chimie, biologie, mdecine, informatique, lectronique, etc), mais son application prsente certains risques non encore bien dtermins (les nanoparticules peuvent endommager le cerveau ; les nanoparticules dor peuvent traverser le placenta de la mre au ftus etc.).
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2me Anne Biologie
Rfrences :
Stphanie Graff-Dubois, Sophie Sibril, Sriramulu Elluru, Vir-Singh Negi , Sandrine Delignat , Luc Mouthonet al. Utilisation des immunoglobulines polyclonales intraveineuses dans les pathologies auto-immunes et inflammatoires Transfusion Clinique et Biologique 2007 ; 14 : 6368 L. Van Overtvelt, T. Batard, R. Fadel, P. Moingeon. Mcanismes immunologiques de limmunothrapie sublinguale spcifique des allergnes Revue franaise dallergologie et dimmunologie clinique 2006 ; 46 : 713720. J. Bousquet, E Demoly L'avenir des immunothrapies. Rev Fr Allergol Immunol Clin 2000 ; 40 : 706-12 Jean Sibilia Naissance et dveloppement de limmunothrapie cible : La rvolution des biomdicaments Revue du Rhumatisme 2007 ; 74 : 42-51 John DE VOS Applications thrapeutiques des Cellules Souches Msenchymateuses. Institut de Recherche en Biothrapie 2007 ; CHU de Montpellier INSERM U847 Olivier Lambotte. Bases fondamentales de limmunomodulation des systmes de communication immunologiques au contrle du systme de dfense. Service de Mdecine Interne CHU Kremlin Bictre 2007. Keiya Ozawa, Kazuya Sato, Iekuni Oh, Katsutoshi Ozaki, Ryosuke Uchibori, Yoko Obara, Yuji Kikuchi, Takayuki Ito, Takashi Okada, Masashi Urabe, Hiroaki Mizukami , Akihiro Kume. Cell and gene therapy using mesenchymal stem cells (MSCs). Journal of Autoimmunity 2008; 30: 121-127. P. Bourin, M. Gadelorge. Les espoirs des cellules souches msenchymateuses en mdecine rparatrice. Transfusion Clinique et Biologique 2007 ; 14 : 120-126. J. Larghero, L. Vija, S. Lecourt, L. Michel, F. Verrecchia, D. Farge. Cellules souches msenchymateuses et immunomodulation : vers de nouvelles stratgies immunosuppressives pour le traitement des maladies auto-immunes ? La Revue de mdecine interne 2009 ; 30 : 287299 Jacques Banchereau and A. Karolina Palucka. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature Reviews Immunology 2005; 4:296-306. L. Zitvogel et al. Immunological aspects of cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology 2008; 8: 59 -67. Claude Leclerc. Lapport des nouvelles technologies en vaccinologie. Mdecine Science 2007 4 : 945-50.
120
2me Anne Biologie
Christian Boitard. Immunomodulation. Mdecine Sciences 2000 ; 16 : 1340-5. J.P. Abastado. Limmunothrapie cellulaire : complexit du systme immunitaire et dveloppement industriel. Bull Cancer 2003 ; 90: 789-94. Nathalie CHAPUT. Les cellules dendritiques Dcembre 2007. Karin Tarte. Les cellules dendritiques matures et immatures : Mthodes dobtention, tude critique UF SITI- Rennes Novembre 2005. Benot Salomon. Les lymphocytes T rgulateurs CD4+ CD25+ : vers immunomodulation thrapeutique ? Mdecine Sciences 2002, 11 : 1066-1068. une
Benoit Lussier. Les nanotechnologies. Direction de la recherche et des technologies 2003. Jean-Louis Lorrain et Daniel Raoul. Office parlementaire d'valuation des choix scientifiques et technologiques rapport sur Nanosciences et progrs mdical 20032004.
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2me Anne Biologie
ANIMAUX TRANSGENIQUES ET KNOCKANIMAUX KNOCK-OUT
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2me Anne Biologie
Objectifs
12-
Dfinir les termes, souris transgnique et souris knock-out . Dcrire brivement la transgnse par microinjection dADN dans luf
fcond. 3Citer les tapes de la mutagnse dirige par recombinaison homologue
en utilisant des cellules souches embryonnaires. 45Citer les tapes de production de souris knock-out. Connatre les applications pratiques dcoulant de lutilisation des,
souris transgnique et souris knock-out .
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2me Anne Biologie
UTILISATION DE SOURIS TRANSGENIQUES ET DE SOURIS AVEC UN DEFICIT GENIQUE CIBLE GENE KNOCKOUT MICE
Introduction :
Ces mthodes permettent dtudier les effets fonctionnels des produits des gnes in vivo. Il sagit de crer :
1-
Des souris qui surexpriment un gne particulier au niveau dun ou de diffrents
tissus : cest la souris transgnique . La cration de souris transgniques repose sur lutilisation de squences ADN trangres appeles transgnes , quon introduit au niveau des pronucle dufs de souris fertilises, ces ufs sont ensuite implants chez des souris pseudo-gestantes.
2-
Des souris chez qui ont a altr de faon cible un gne, pour inhiber sa fonction :
cest la gene knockout mice = souris knockout ou KO : Le moyen de sassurer de la fonction relle dun gne est de bloquer se gne et de noter in vivo les modifications physiologiques qui en dcoulent. Il sagit dans ce cas de crer des souris KO pour un gne particulier, en provoquant des mutations cibles ou en altrant le gne dont on veut tudier la fonction.
1- Animaux transgniques: 1-1- Dfinition : La transgnse est une technique consistant introduire un ou plusieurs gnes dans des cellules menant la transmission du gne introduit, ou transgne, aux gnrations successives. Un animal transgnique est un animal dont le gnome a t modifi par insertion dADN tranger, de manire ce que cet ADN soit transmis sa descendance. La technique employe est la transgnse par microinjection dADN dans luf fcond. La premire souris transgnique, conue grce cette technique, a vu le jour dans 1982 (scrtion de lhormone de croissance). Depuis lors, dautres techniques dinsertion dADN dans le gnome des animaux sont apparues comme la mutagnse dirige par recombinaison homologue en utilisant des cellules souches embryonnaires. 124
2me Anne Biologie
1-2- Technique : 1-2-1- Transgnse par microinjection dADN dans luf fcond : On peut intgrer un transgne alatoirement dans le gnome d'un organisme. Pour ce faire, on injecte le transgne en solution aqueuse directement dans le pronuclus mle du zygote (stade une cellule). Des squences ADN trangres transgnes sont introduites dans les pronucli dufs de souris fertilises, ces ufs sont ensuite implants dans les oviductes de femelles pseudo-gestantes. Si quelques centaines de copies du transgne sont injectes dans ces pronucle, peu prs 25% des souris qui naissent sont transgniques. Comme lintgration du transgne a lieu souvent avant la rplication de lADN, 75% parmi ces descendants porteront le transgne dans lensemble de leurs cellules, y compris les cellules germinales. Dans la majorit des cas cette intgration ne perturbe pas les fonctions normales. Chaque souris portant le transgne est un htrozygote partir duquel des lignes homozygotes peuvent tre obtenues.
Cration danimaux transgniques par microinjection dADN dans les oocytes 125
2me Anne Biologie
1-2-2- Mutagnse dirige par recombinaison homologue en utilisant des cellules souches embryonnaires : De nombreuses mthodes ont t dveloppes mais, dans tous les cas, la modification doit tre effectue au dpart dans des cellules types pouvant donner naissance des cellules germinales fonctionnelles, spermatozodes ou ovocytes. Les cellules les plus frquemment utilises ce jour sont les cellules ES (embryonic stem cells /cellules souches embryonnaires) pour : leur capacit produire des recombinaisons homologues haute frquence la facilit de leur utilisation en culture in vitro la possibilit de passer d'une culture in vitro au dveloppement embryonnaire in vivo
aprs incorporation dans un hte. Pour fabriquer des souris portant une anomalie ou une mutation cible du gne, un vecteur est insr da faon altrer le gne au niveau dune ligne cellulaire souche embryonnaire murine (ES). Les cellules ES sont des cellules pluripotentes qui drivent dembryons de souris qui peuvent tre propages et induites la diffrentiation en culture ou qui peuvent tre incorpores dans des blastocystes de souris, qui seront ultrieurement implants chez une mre pseudo-gestante. La progniture des cellules ES se dveloppe normalement au niveau des tissus matures qui expriment les gnes exognes qui ont t transfects dans les cellules ES. Ainsi, le vecteur utilis pour altrer un gne particulier est insr dans les cellules ES, et les colonies dans les quelles les recombinaisons homologues ont eu lieu (sur un chromosome) sont slectionnes comme dcrit plus bas. La prsence de la recombinaison dsire est vrifie par lanalyse de lADN par Southern-blot et lhybridation ou la PCR. Les cellules ES slectionnes sont injectes dans les blastocystes, qui sont implants chez des femelles pseudo-gestantes. La progniture sera chimrique pour une anomalie ou une mutation htrozygote. Ainsi, certains tissus driveront des cellules ES et dautres partir des blastocystes normaux restants. Les tapes de la mutagnse dirige par recombinaison homologue en utilisant des cellules souches embryonnaires, sont : La mthode la plus courante consiste cloner un marqueur de slection dans la
squence codante du gne tudi. Le vecteur est linaris l'aide d'enzymes de restriction et de phosphorylation Le plasmide est introduit par lectroporation dans les cellules ES; o aura lieu
l'vnement de recombinaison homologue. 126
2me Anne Biologie
Les cellules sont tales sur des cellules nourricires (fibroblastes), ncessaires la
croissance des cellules ES, et un poison, la gnticine, qui empche les cellules ES n'ayant pas intgr le marqueur de slection (ici: nomycine) de se dvelopper.
Diffrentes tapes de la cration de souris gntiquement modifies via les cellules ES
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2me Anne Biologie
Test didentification des souris chimriques par le pelage
2- Animaux knockout : 2-1- Dfinition : Un animal knockout est un animal dans lequel on introduit spcifiquement par recombinaison homologue une modification dans la structure codante du gne ou dans ses lments rgulateurs afin d'inhiber ou de modifier le fonctionnement du gne dans l'organisme tudi. 128
2me Anne Biologie
2- 2- Technique : La technique de fabrication des souris KO repose sur le phnomne des recombinaisons homologues. Si un gne exogne est insr dans une cellule (par exemple par lectroporation), il peut sintgrer au hasard dans le gnome de cette cellule. Cependant, si le gne contient des squences homologues au gne endogne, il se recombinera et remplacera de faon prfrentielle les squences endognes. Pour slectionner les gnes qui ont subis une recombinaison homologue on utilise une stratgie de slection base sur des mdicaments. Le fragment dADN homologue qui doit tre insrer dans une cellule est plac dans un vecteur contenant typiquement un gne de rsistance la nomycine (no) et un gne de thymidine kinase virale (tk). Ce vecteur est construit dune faon telle que le gne de rsistance la nomycine sinsre toujours dans lADN chromosomique, alors que le gne tk est perdu chaque fois que se produit une recombinaison homologue (par opposition dune insertion au hasard). Le vecteur est introduit dans des cellules qui seront cultives dans un milieu contenant de la nomycine et du ganciclovir, un mdicament qui est mtabolis par la thymidine kinase pour produire un produit ltal. Les cellules dans les quelles le gne est intgr au hasard seront rsistantes la nomycine mais tues par le ganciclovir. Par contre, les cellules dans les quelles une recombinaison homologue a eu lieu seront rsistantes aux deux mdicaments, car le gne tk na pas t incorpor. Cette slection positive-ngative assure du fait que le gne insr dans les cellules survivantes a subit une recombinaison homologue avec les squences endognes. La prsence de lADN insr au milieu du gne endogne perturbe souvent les squences codantes et abolie lexpression et /ou la fonction du gne. De plus, les vecteurs peuvent tre dsigns de sorte que les recombinaisons homologues conduisent la dltion dun ou de plusieurs exons du gne endogne. La slection des souris chimriques se fait grce au test: didentification des chimres par le pelage : Croisement d'une souris chimrique avec une souris de la mme ligne que les souris dont proviennent les femelles pseudogestantes.
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2me Anne Biologie
Insertion au hasard
NB: Les recombinaisons homologues sont rares. Le plus souvent, il se produit des recombinaisons non spcifiques (ou illgitimes). D'autres stratgies permettent d'carter les souches de cellules ES ou une recombinaison non homologue s'est produite. Etapes de production de souris KO 1) Construction du vecteur de recombinaison. 2) Introduction du vecteur cible par lectroporation dans les cellules ES (embryonic stem cells /cellules souches embryonnaires). 3) Slection des recombinants : Test de confirmation de l'vnement de recombinaison homologue : PCR : amplification de l'ADN avec des amorces appropries. Southern-bot : hybridation de l'ADN par une sonde radioactive. Squenage. 4) Souris knockout : Lobtention de souris chimriques repose sur 2 mthodes : injection in vitro de cellules ES slectionnes dans le blastocyste (retir d'une femelle auparavant) et transfres dans une femelle en pseudo-gestation dans un agrgat de morula en suspension o les cellules ES se dveloppent elles-mmes en morula.
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2me Anne Biologie
3- Souris knock-in : Dans ce cas au lieu duniquement dinvalider le gne cibl (souris KO), on le remplace par un autre gne dintrt dont on veut tudier la fonction.
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2me Anne Biologie
4- Applications : 4-1- Souris transgniques : La grande valeur de cette technique est quelle peut tre utilise pour pouvoir exprimer un gne quelconque au niveau dun tissu particulier. Ainsi, on peut fixer les squences codantes de ce gne aux squences rgulatrices qui guident normalement lexpression de certains gnes de faon spcifique au niveau dun tissu. Les transgnes peuvent aussi tre exprims sous le contrle de promoteurs qui sactivent sous laction de certains produits (antibiotiques, hormones). Dans ce cas, la transcription du transgne peut tre contrle par ladministration du produit inducteur. Les souris gntiquement modifies permettent, grce une modification gntique donne, de dcouvrir le rle jusque l inconnu d'un gne particulier d'tudier comment un gne peut affecter la progression d'une maladie. Grce des souris transgniques surexprimant un certain gne, les chercheurs peuvent tudier le rle de ce gne dans le dveloppement d'une maladie, et procder des exprimentations thrapeutiques, avant de passer aux exprimentations humaines.
4-2- Souris knock-out: Les souris knockout vont nous permettre de comprendre le(s) fonction(s) du gne qui nous intresse (nt) en tudiant: les fonctions d'un lment de rgulation les effets de la modification des fonctions d'un gne la modification de l'expression de certains gnes (hybridation in situ,...) les malformations ventuelles de l'animal mut (hybridation in situ, examens
histologiques, examens morphologiques, etc.) une analyse comportementale de la souris mute. Crations de modles pathologiques animaux permettant : Daborder une vritable exprimentation physio-pathologique Valider un gne candidat Vrifier quune mutation est pathogne Corriger une dficience gntique
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2me Anne Biologie Rfrences :
Laurence Canaple, Techniques post-gnomiques ou comment rendre visible lexpression de gnes chez le petit animal ? Techniques post-gnomiques Ou Comment rendre visible lexpression de gnes chez le petit animal ? IGFL, ENS lyon. IGFL, ENS lyon 2008. Christophe FERRAND. ANIMAUX TRANSGENIQUES : Le modle KNOCK-OUT (KO). INSERM E0119 - UPRES 2284 Etablissement Franais du sang Bourgogne/FrancheComt 2006. Abul K Abbas, Andrew H.Lichtman. Cellular and Molecular Immunology. Saunders Eds 2006. Frank C. Hay, Olwyn M.R. Westwood. Practical Immunology. Blackwell Science Fourth edition 2002.
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2me Anne Biologie
VACCINOLOGIE
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2me Anne Biologie
Objectifs
123-
Dfinir la vaccination. Dfinir les diffrents types dimmunisation. Comment seffectue la neutralisation de leffet pathogne des micro-
organismes par la rponse immune humorale vaccinale. 4Citer les caractristiques de la rponse primaire contre les vaccins
inactivs entiers ou les vaccins inactivs protines purifies. 5Connatre le rle des lymphocytes T auxiliaires (helpers) CD4+ dans la
rponse immune cellulaire au vaccin. 6789Citer les caractristiques de la rponse anamnestique. Citer les facteurs lis lhte et qui influenant la vaccination. Connatre les contre-indications gnrales de la vaccination. Citer les objectifs de la vaccinologie.
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2me Anne Biologie
PRINCIPES ET BASES IMMUNOLOGIQUES DE LA VACCINATION
Introduction Gnralits : La vaccination est maintenant devenue un rite tendu la quasi-totalit des populations humaines. Cette pratique a dbut de manire empirique. En Asie centrale, au dbut du second millnaire, lhomme savait dj se protger de la variole en imprgnant ses muqueuses nasales avec des squames recueillies chez des malades et attnues par une conservation dans un macrt de plantes. Une seconde tape, toujours empirique, fut franchie grce Edward Jenner la fin du XVIIIe sicle. Jenner a russi imposer sa mthode de vaccination variolique parce que I utilisation de la vaccine, agent de la variole de la vache, tait moins inquitante pour la population.
La troisime tape est pasteurienne. En maitrisant le processus d'attnuation, Louis Pasteur a su faire voluer une technique empirique en une mthode de prvention base sur une dmarche scientifique, ouvert la voie la vaccination de masse et dress les bases d'une nouvelle discipline, la vaccinologie.
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2me Anne Biologie
Depuis, le laboratoire a fait connaitre des progrs spectaculaires la vaccinologie, tant il est vrai que cette dernire a su intgrer et faire voluer positivement un nombre considrable d'autres disciplines, bactriologie, virologie, immunologie, gnomique, protomique ou bioinformatique... Lobjectif de la vaccination est de permettre lindividu de dvelopper une protection active spcifique vis--vis dun agent infectieux, avant toute exposition cet agent infectieux, en utilisant les ressources naturelles de limmunit anti infectieuse. Limmunit est la capacit ne pas payer le tribut pathologique de linfection. Les processus qui permettent de protger lindividu des infections sintgrent dans le systme immunitaire, qui a la capacit de reconnaitre le soi du non-soi et de contribuer a assurer lintgrit de lorganisme. Les agents infectieux pntrent dans lorganisme, expriment leur virulence par leur capacit dinvasion et de prolifration ; certains de leurs composants (exemple : paroi des bacilles a Gram ngatif) ou de leurs produits (exemple : exotoxines ttaniques ou diphtriques) participent a leur pathognicit. Le systme immunitaire reconnait les Ag des agents infectieux. Il sagit des molcules de lagent pathogne capables de dterminer une raction immunitaire. Ils sont dits immunognes et activent diverses ractions immunitaires dont certaines sont protectrices par leur capacit neutraliser lagent infectieux ou son pouvoir pathogne. Les vaccins miment certaines des caractristiques immunognes des agents infectieux en induisant les mmes dfenses immunitaires protectrices avant tout contact avec lagent pathogne ; la vaccination exploite la mmoire du systme immunitaire et sa ractivit plus grande lors dun contact ultrieur avec lagent infectieux permettant de prvenir des manifestations pathologiques.
1-
Rappels dimmunologie :
1.1. Immunit inne : non spcifique Les composants de limmunit naturelle reconnaissent des structures caractristiques des microbes qui sont absentes des cellules des mammifres. IL sagit des motifs molculaires associs aux pathognes (PAMPs : pathogen-associated molecular pattern) qui sexpriment la surface des organismes procaryotes. Ces PAMPs sont reconnus par des rcepteurs prsent la surface de nombreuses cellules phagocytaires/ : macrophage, cellule dendritique immature, il sagit des rcepteurs reconnaissant les motifs molculaires (PRPs : Pattern recognition receptors) dont les 137
rcepteurs Toll-like (TLRs) responsable de la transmission du signal dactivation des cellules like phagocytaires (transduction du signal) qui se traduit entre autre par la synthse de cytokines transduction pro-inflammatoires et de chemokines. inflammatoires
Rponse immune inne
1.2. Immunit spcifique: Deuxime ligne de rponse un agresseur Dveloppement dune rponse T-dpendante associe une composante molculaire dpendante
(Ac synthtiss par les cellules B) : Rponse mdiation humorale = Ac sriques Lymphocytes CD4 et B. Reconnaissance dune sous sous-fraction appeles Ag (principalement des protines):
Rponse mdiation cellulaire Lymphocytes CD4 et CD8 T cytotoxiques. Cette rponse est rapidement rappele en cas de rinfection: cellules mmoires 138
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Rponse immune spcifique La rponse immune est toujours du mme type (IgM), sans mmoire en cas dAg Tindpendant. En cas dAg T-dpendant, cette rponse devient de type Ig G (ou autre), et elle possde une mmoire.
22-1-
Immuno-prvention anti-infectieuse vaccination : Dfinition: Un vaccin est une prparation antignique qui a pour but dinduire chez la personne
ou lanimal quon vaccine, une rponse immunitaire spcifique dun agent pathogne capable de le protger contre linfection naturelle ou den attnuer les consquences 2-2Cette protection = (immunit spcifique) Immunisation passive : Sans que le systme immunitaire ne soit stimul par un Ag 139
Transfert de srum (Ig) ou des cellules immunocomptentes dun individu immunis
un individu non immunis. 2.2.1. Immunisation passive naturel : naturelle Immunit transfre de la mre au ftus (certains germes), ou au nouveau n (allaitement). 2.2.2. Immunisation passive artificiellement acquise : injection de gammaglobulines (individus ou danimaux immuniss) Lutilisation dIg dorigine humaine prfrable : * * 2-3(Ig htrologues) protection immdiate, dure limite, risques !! (Ig homologues) risque de transmission du HIV.
Transfert passif dimmunit mdiation cellulaire (cellules) Immunisation active : Cest une immunit obtenue en rponse une exposition lAg
2.3.1. Immunisation active acquise naturellement: Exposition agents pathognes : manifestations cliniques aboutissent rponse immune protectrice contre ces agents. 2.3.2. Immunit acquise de faon artificielle: Injection de pathognes vivants ou tus ou par certains de leurs composants/:
microorganismes vivants attnus, microorganismes entiers tus, constituants microbiens ou toxines inactives.
3-
Immunologie de la vaccination : Tout comme linfection naturelle, la vaccination induit une rponse immunitaire
mdiation humorale ou cellulaire. Cette rponse variera en fonction de deux paramtres : le type de vaccin administr (vivant ou inactiv) et les facteurs relis lhte.
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3-1- Rponse immunitaire humorale induite selon le type de vaccin administr : Les vaccins stimulent la production dAc protecteurs. La mesure du titre des Ac est le moyen le plus utilise en pratique pour valuer limmunisation induite par les vaccins (exemple : Ac anti-HBs pour la vaccination contre lhpatite B). Ce sont des immunoglobulines. Les Ac ont la proprit de reconnaitre des structures antigniques ou pitopes le plus souvent situes a la surface de lagent infectieux et de sy fixer spcifiquement par leur site Ac . La neutralisation de leffet pathogne peut seffectuer de diffrentes faons : certains Ac sassocient aux structures de surface de lagent pathogne ou aux toxines secrtes par le pathogne, inhibant leur fixation et leur pntration dans les cellules cibles ; dautres activent le complment pour lyser des bactries ; certains vont armer des phagocytes ou des lymphocytes et les rendre capables de lyser des cellules infectes. Les Ac sont produits par les plasmocytes issus de lactivation des lymphocytes B aprs une succession de ractions cellulaires provoques par les stimulations antigniques. Certains Ag ont la capacit dactiver directement les lymphocytes B, il sagit le plus souvent dAg denveloppe polyosidiques, tels les Ag de pneumocoque (cest la raction thymoindpendante), mais la plupart des Ag (en particulier protiques) requirent la prsence de lymphocytes T auxiliaires pour induire des Ac (raction thymo-dpendante). Des Ac de mme spcificit peuvent appartenir diffrentes classes ou isotypes (IgG, IgA, IgM) selon leur cintique et site de production. Ils peuvent tre libres dans le plasma (IgG, IgM surtout) ou dans les liquides biologiques prsents au niveau des muqueuses (IgA essentiellement), ou fixs la surface de certaines cellules (lymphocytes ou cellules phagocytaires). La quantit et la rpartition des diffrents isotypes voluent en fonction du dlai qui suit la stimulation antignique. Les IgM sont immdiatement prsentes lors de linfection et augmentent avant les IgG et les IgA. La production des IgG et des IgA ncessite aussi la prsence de cellules T auxiliaires, dont la spcificit et laffinit pour lAg, et donc lefficacit protectrice, sont plus leves. Les Ac voluent au cours de la vie : les nouveau-ns ont un registre dAc relativement limite, qui saccroit a loccasion des contacts avec le milieu extrieur (y compris avec la flore microbienne rsidente et les viroses de lenfance). Les nourrissons sont relativement dpourvus en IgG2 (qui joueraient un rle important dans les dfenses contre les infections a pneumocoque, par exemple). 3.1.1. Vaccin vivant : Aprs ladministration dune dose dun vaccin vivant, une infection se produit et elle est habituellement cliniquement inapparente. Limmunit fait suite cette infection. Elle peut tre mesure par un dosage des Ac sriques. 141
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La rponse immunitaire humorale et la protection confre par le vaccin vivant semblent de mme nature et de mme intensit que celles qui suivent linfection naturelle. 3.1.2. Vaccin inactiv entier ou vaccin inactiv protines purifies : Deux types de rponses correspondent au vaccin inactiv selon quil sagit du premier contact de lorganisme avec lAg de type protique ou de contacts ultrieurs avec le mme Ag.
Les caractristiques de la rponse primaire sont les suivantes : Une priode de latence relativement longue avant lapparition dAc; Une intensit faible (habituellement insuffisante pour confrer une protection efficace); Une dure courte; Une composition principalement dIgM. Par comparaison, la rponse secondaire ou anamnestique, la suite dune nouvelle exposition, est plus rapide, plus forte et plus durable; elle comprend surtout des IgG. 142
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La quantit injecte, la rptition des doses et lintervalle entre celles-ci sont des facteurs importants de succs avec un vaccin inactiv. Ainsi, une deuxime stimulation antignique trop rapproche de la premire peut tre inefficace, du fait de llimination de lAg par les Ac sriques encore prsents une forte concentration; do limportance de respecter lintervalle minimal entre les doses. 3.1.3. Vaccin polysaccharidique : Les polysaccharides stimulent directement les lymphocytes B et non les lymphocytes T (surtout stimuls par les protines), rsultant en une production dAc, sans cellules mmoire. Cest pourquoi on parle dune rponse indpendante des lymphocytes T. La conjugaison, qui est le couplage du polysaccharide une protine, induit une rponse immunitaire dpendante des lymphocytes T trs tt dans la vie. Les Ac produits sont plus fonctionnels que ceux induits par le vaccin polysaccharidique non conjugu, et leur affinit pour les Ag bactriens s'amliore avec le temps. La rponse immunitaire induite par un vaccin conjugu sapparente donc la rponse induite par un vaccin inactiv entier ou un vaccin inactiv protines purifies. 3-2- Les ractions cellulaires : 3-2-1- Les cellules prsentatrices dAg : (CPA) appartenant a la ligne des macrophages, cellules dendritiques, sactivent en prsence de lagent pathogne ou du vaccin, captent les bactries a dveloppement extracellulaire et les dgradent en peptides dans leurs phagolysosomes : certains vont se lier spcifiquement aux Ag de classe II du complexe majeur dhistocompatibilit (CMHII). Les CPA captent galement les cellules infectes ou dtruites par les virus ou bactries dveloppement intracellulaire dont les peptides constitutifs sassocient aux Ag de classe I du CMH (CMHI). 3-2-2- Les lymphocytes T auxiliaires : (Ta =Th : T helper) CD4+ reconnaissent les peptides antigniques associes aux molcules HLA de classe II a la surface des CPA grce a un rcepteur pour lAg, le rcepteur des cellules T (TCR). Les Ta sont galement stimules par linterleukine 1 (IL-1) et par une srie dautres molcules produites par les macrophages sensibilises. Il sensuit une production (dite autocrine) par le lymphocyte T CD4+ de diverses interleukines ayant pour fonction dactiver tous les composants du systme immunitaire : lIL-2, facteur de croissance des lymphocytes T, stimule la prolifration des lymphocytes T CD4+ et CD8+ cytotoxiques ; linterfron gamma contribue notamment a lactivation des fonctions bactricides des cellules monocytaires, macrophagiques et des fonctions antivirales des lymphocytes T CD4+ et CD8+ effecteurs. Les Ta CD4 + favorisent galement la diffrenciation des lymphocytes B en plasmocytes et la commutation isotypique des Ac. 143
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Certains de ces lymphocytes T vont persister et seront le support de la mmoire immunitaire T dpendante. 3-2-3- Les lymphocytes T cytotoxiques : (Tc) CD8+ reconnaissent les peptides prsents par les molcules de classe I du CMH la surface de toutes les cellules nucles de lorganisme. Seules les cellules infectes peuvent prsenter les peptides issus de lagent infectieux sur ces molcules du CMH de classe I. Ces lymphocytes Tc sont ainsi susceptibles de dtruire in vivo toutes les cellules infectes par des virus ou des bactries dveloppement intracellulaire. Leur rponse aux Ag viraux et leur potentiel cytolytique sont stimuls par les LTa CD4+ (cytotoxicit T dpendante). 3-2-4- Les lymphocytes B : comportent des immunoglobulines, ou Ac, de surface, capables de distinguer les Ag infectieux. Apres internalisation de ces Ag, ces lymphocytes B vont exprimer a leur surface un peptide antignique associe au CMHII. Les lymphocytes Ta CD4 + reconnaissent ces structures antigniques prsentes a la surface de ces lymphocytes B et favorisent ainsi la slection clonale et la conversion de lymphocytes B producteurs dIgM en producteurs dIgG ou IgA, puis la diffrenciation de ces lymphocytes B en plasmocytes secrtant des Ac (surtout au dbut IgM). Une maturation daffinit aboutit a la production dAc IgG ou IgA, proprit qui sera conserve dans les cellules B a mmoire : celles-ci permettront, a loccasion dun nouveau contact (vaccinal ou avec lagent infectieux naturel), une rponse secondaire plus rapide, plus adapte et plus efficace, sous forme dIgG ou dIgA. 3-3- La rponse anamnestique : La vaccination tire parti de la mmoire immunitaire. Lors de la premire inoculation dun Ag, les cellules effectrices T apparaissent et samplifient trs rapidement : ce sont des cellules a vie courte (quelques jours), dont la population est maximale au bout dune semaine pour disparaitre en deux a six semaines, laissant la place a des cellules T mmoires dont le nombre maximal deux a six semaines aprs linoculation, se rduit ensuite trs lentement et reste gnralement dtectable pendant plusieurs annes. Au contraire, la rponse humorale apparait lentement (de deux plusieurs semaines) et est peu protectrice au dbut, principalement due aux IgM de faible affinit. Le nombre des cellules B mmoire est maximal de faon tardive, au bout de dix a quinze semaines, avant de diminuer lentement : certaines sont dtectes plus dun an et demi aprs linoculation. Les cellules B mmoires sont le support de la rponse anamnestique en Ac. Lors dun nouveau contact avec lagent infectieux ou certains de ses Ag, les cellules B sont rapidement ractives, ainsi que les cellules T mmoires, qui participent galement a la ractivation de la 144
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rponse immunitaire en Ac. Lors de ce nouveau contact, le dlai de la rponse Ac se raccourcit ; le titre des Ac augmente trs rapidement, atteignant des taux plus levs : ce sont des IgG et des IgA de mme spcificit, mais daffinit demble maximale et a haut pouvoir protecteur. La mmoire immunitaire T intervient galement en favorisant la raction anticipe et intense (phnomne allergique de Koch) observe lors dune seconde inoculation dune mycobactrie. Les cellules T CD4 et CD8 mmoire donnent trs rapidement naissance a des taux levs de nouvelles cellules effectrices auxiliaires ou cytotoxiques. Ainsi, par la vaccination, on cherche a avertir lindividu, a lui permettre une mise en place plus rapide de moyens de dfenses spcifiques (Ac spcifiques, ractions cellulaires adaptes) afin danticiper sur le dveloppement de linfection et de le protger. 3-4Facteurs relis lhte :
3-4-1- Age : Pendant les 2 ou 3 premiers mois de vie, le systme immunitaire est relativement
immature. Toutefois, il est en mesure de gnrer une rponse immunitaire relativement complte, tant humorale que cellulaire. Une exception cependant, les lymphocytes B du nourrisson sont incapables de rpondre aux Ag T indpendants comme les polysaccharides, jusqu lge de deux ans environ. Cependant, la capacit de rponse du systme immunitaire du nourrisson est trs importante, celui-ci a la capacit de rgnrer jusqu deux millions de lymphocytes T CD4+ chaque jour. Les Ac maternels, transmis passivement lenfant in utero ou par lallaitement, peuvent avoir un effet inhibiteur sur la rponse immunitaire.
La qualit et lintensit de la rponse humorale obtenue chez le nourrisson sont troitement lies la persistance des Ac maternels spcifiques et leur efficacit protectrice, qui sont trs variables dune infection lautre. Les calendriers de vaccination tiennent compte de ces facteurs. 145
La capacit de dvelopper une bonne rponse immunitaire sattnue au cours du dvelopper
vieillissement, car le pool des plasmocytes non diffrencis diminue avec le temps. Malgr tout, les personnes ges rpondent relativement bien la vaccination. 3.4.2. Facteurs gntiques : Certaines personnes rpondent mieux que dautres au vaccin. Cela est en partie li des dterminants gntiques tels que les systmes sanguins ABO et les Ag HLA. minants 3.4.3. Immunodficience : Quelle soit acquise ou hrditaire, limmunodficience diminue gnralement la rponse immunitaire, que ce soit limmunit humorale ou cellulaire. 3.4.4. Malnutrition : Ce facteur amne surtout une diminution de limmunit cellulaire. Altration physiologique de limmunit avec lge
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4-
Contre-indications gnrales aux vaccins :
4-1- Contre-indications gnrales aux vaccins vivants : Les maladies aigus modres ou svres, avec ou sans fivre. Les ractions allergiques de type anaphylactique tant une des composantes du vaccin
qu une dose antrieure soit du mme vaccin, soit dun autre vaccin ayant une composante identique. La carence ou linterfrence immunitaire: Un dficit immunitaire (selon le degr du dficit immunitaire); la leucmie, le lymphome ou une autre affection noplasique gnralise pouvant altrer les mcanismes immunitaires; les traitements avec des agents immunosuppresseurs (corticostrodes, ou autres agents dprimant la rponse immunitaire). Selon limportance de l'immunosuppression value sur une base individuelle (clinique ou laboratoire), par le mdecin traitant; linfection par le VIH et le SIDA (certains vaccins vivants sont contre-indiqus pour les personnes infectes par le VIH). La grossesse.
4-2- Contre-indications gnrales aux vaccins inactivs : Les maladies aigus modres ou svres, avec ou sans fivre. Les ractions allergiques de type anaphylactique tant une des composantes du vaccin
qu une dose antrieure soit du mme vaccin, soit dun autre vaccin ayant une composante identique. 5Objectifs de la vaccinologie : Amliorer les vaccins disponibles. Optimiser leur utilisation. Dvelopper de nouveaux vaccins. Mettre au point des stratgies vaccinales adaptes l'pidmiologie des maladies et de
leur impact sur la sant et lconomie. Prendre en charge les problmes logistiques et les conditions locales de la mise en
uvre des vaccinations.
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RECOMMANDATIONS GNRALES POUR BIEN APPLIQUER LES NOTIONS DIMMUNISATION Age auquel les produits immunisants sont administrs : Les facteurs qui influencent les recommandations au sujet de lge auquel un vaccin est administr sont : linteraction antagoniste potentielle entre la rponse du systme immunitaire et le transfert passif danticorps maternels; la capacit dun individu dun ge donn dvelopper une rponse immunitaire (maturit du systme immunitaire); le risque, li lge, de dvelopper la maladie ou ses complications. Une dose administre un ge moindre que lge minimal recommand peut conduire une rponse immunitaire sousoptimale et ne devrait pas tre compte comme partie dune primovaccination. Ainsi, cette dose devra tre redonne lge prvu initialement, la condition de respecter lintervalle minimal entre deux doses dun mme vaccin, partir de la dose administre trop prcocement. Intervalles entre les doses dun mme vaccin : Plusieurs vaccins requirent au moins deux doses pour donner une protection adquate ainsi quun rappel priodique pour maintenir cette protection leve. moins dindications contraires (voir les chapitres spcifiques), les doses administres des intervalles minimaux moindres que ceux qui sont recommands peuvent conduire une rponse immunitaire sous-optimale et ne devraient pas tre comptes comme partie dune primovaccination. Ainsi, ces doses devront tre redonnes en calculant lintervalle minimal ou recommand prvu initialement, partir de la dose administre trop prcocement. Par exemple, si la 3e dose de Pentacel a t administre lge de 6 mois et la 4e dose 11 mois, lintervalle minimal nest pas respect, puisquil sest coul 5 mois aprs la 3e dose plutt que 6 mois, qui est lintervalle minimal. La 4e dose nest pas considre comme valide et doit tre reprise de 6 12 mois (intervalles minimal et recommand) plus tard, soit lge dau moins 17 mois. Cette dose reprise sera considre comme la 4e dose valide de la primovaccination. On poursuivra la vaccination par la suite en respectant les intervalles recommands. Lorsquun intervalle minimal respecter entre ladministration de 2 doses de vaccin est dun mois, on reconnat gnralement que cet intervalle quivaut 4 semaines (28 jours). En gnral, on ne doit pas recommencer une primovaccination interrompue, mais la continuer l o on sest arrt, peu importe le temps coul depuis la dernire dose, mme si cet intervalle se chiffre en annes. Intervalles entre des vaccins diffrents : La plupart des antignes courants peuvent tre administrs simultanment. Les vaccins inactivs peuvent tre administrs en mme temps ou nimporte quand avant ou aprs un vaccin vivant ou un vaccin inactiv. Des vaccins vivants diffrents devraient tre administrs simultanment ou au moins 4 semaines (28 jours) dintervalle. Une baisse defficacit du vaccin contre la varicelle a t dmontre lorsque lintervalle entre les vaccins RRO et varicelle tait insuffisant. Le vaccin oral contre la typhode peut tre administr le mme jour quun autre vaccin vivant ou peu importe lintervalle entre ces vaccins, lexception du vaccin oral contre le cholra (voir les chapitres spcifiques). tant donn que le RRO modifie lhypersensibilit la tuberculine (anergie ou hypoallergie temporaire), le test cutan la tuberculine (TCT) devra tre fait avant, en mme temps ou au moins quatre semaines aprs ladministration du RRO. Il est possible que dautres vaccins vivants injectables, tels que les vaccins contre la varicelle et la fivre jaune, faussent de la mme faon linterprtation des rsultats du TCT. Si lon doit administrer un vaccin vivant injectable et que lon doive effectuer un TCT, ce dernier test doit tre fait avant, en mme temps ou au moins quatre semaines aprs la vaccination. Les vaccins vivants administrs par voie orale nont probablement aucun effet sur la rponse au TCT. Intervalles entre les immunoglobulines (IG), les autres produits sanguins et les vaccins : Les vaccins inactivs peuvent tre administrs le mme jour que les immunoglobulines et les autres produits sanguins ou nimporte quand avant ou aprs, sans altrer la rponse immunitaire. Les vaccins contenant des virus vivants de la rougeole ou de la varicelle devraient tre donns au moins deux semaines avant les immunoglobulines ou au plus tt trois mois aprs ladministration des immunoglobulines, car limmunisation passive peut affecter la rponse ces vaccins (voir le tableau suivant). Si ces intervalles ne sont pas respects, il faut administrer de nouveau les vaccins selon les recommandations du tableau. Ladministration dimmunoglobulines ninterfre pas avec la rponse immunitaire aux autres vaccins vivants.
Note : Les anticorps monoclonaux humaniss contre le virus respiratoire syncitial, le palivizumab (Synagis), ne sont pas des produits sanguins et ninterfrent pas avec la rponse aux vaccins, quils soient vivants attnus ou inactivs.
Intervalles entre les vaccins et les dons de sang : Cette prcaution vise liminer compltement la possibilit thorique que la personne vaccine ait pu tre en incubation de la maladie contre laquelle elle a reu le vaccin, au moment o elle la reu. titre indicatif, la priode dinterdiction la suite de ladministration dun vaccin vivant attnu est de quatre semaines, sauf pour le vaccin contre la varicelle (trois mois) et le vaccin BCG (six semaines). la suite de ladministration de vaccins inactivs, la priode est de 2 semaines, sauf pour les vaccins contre lhpatite B (4 semaines) et celui contre la rage qui a t administr en postexposition (52 semaines). Ces diffrentes priodes ne sont pas dfinitives et peuvent tre modifies.
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Objectifs
12-
Citer les principales caractristiques des diffrents types de vaccin. Connaitre les nouveaux modes de prparation et les nouvelles
formulations des vaccins. 34Citer les diffrents lments constitutifs dun vaccin. Citer les principales tapes du dveloppement des vaccins
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CLASSIFICATION ET MODE DE PREPARATION DES VACCINS
Introduction : Un vaccin est une prparation antignique, drive dun agent pathogne spcifique (ou apparente celui-ci), capable dinduire, chez un sujet rceptif, une rponse immunitaire protectrice vis--vis de cet agent. On diffrencie : les vaccins vivants attnus, qui induisent aprs une dose unique, une immunit proche de celle qui succde une infection naturelle au prix dune infection asymptomatique ou peine apparente. les vaccins inertes, dpourvus de tout pouvoir infectant, mais capables de provoquer, en gnral aprs plusieurs doses successives, une rponse immunitaire protectrice. Ce sont soit, des vaccins inactivs complets contenant la totalit des corps bactriens, soit des particules virales ou des fractions antigniques (toxines dtoxifies, antignes capsulaires ou membranaires).
11-1-
Classification des vaccins : Les vaccins attnus : Les vaccins attnus sont des agents vivants (bactries) ou rplicatifs (virus, bactries)
qui crent une infection minima. Trs proche de linfection naturelle, leur administration provoque une rponse stimulant tout le registre de la rponse immunitaire spcifique. Le mode dintroduction est important. Certains vaccins sont injectables, inocules par voie intramusculaire ou sous-cutane (rougeole) ou encore intradermique (BCG). Ladministration muqueuse serait, par sa capacit induire des taux levs dIgA muqueuses, la voie la plus approprie pour les vaccins vivants attenues des infections des voies respiratoires ou digestives (exemple : vaccin poliomylitique, vaccin contre les rotavirus, vaccin grippal par voie nasale). Cependant, les dfenses locales ou dorigine maternelle peuvent sopposer a la pntration du vaccin (exemple : anticorps maternels/vaccin rougeoleux) ; des virus naturels de mme famille peuvent interfrer avec le virus vaccinal (exemple : entrovirus/vaccin poliomylitique oral). Les vaccins attnus ne sont pas dpourvus de risques infectieux (rversion du virus poliomylitique oral, BCGites, vaccine gnralise), notamment chez les immunodprims,
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qui peuvent devenir porteurs chroniques (vaccin poliomylitique oral) ; de ce fait, ils sont en principe contre-indiques sur ce terrain. 1-2Les vaccins inactivs : Les vaccins inactifs sont exempts de tout risque infectieux. Plusieurs injections, par voie intramusculaire ou sous-cutane, sont ncessaires pour obtenir une immunisation suffisante et il faut pratiquer des rappels (exemple : vaccin poliomylitique injectable). Les vaccins germes entiers ont une ractognicit leve : leur immunognicit est souvent bonne, mais ils peuvent parfois induire des effets indsirables (exemple : vaccin coquelucheux entier). La dtermination de sous-units vaccinantes correspond a la recherche dune capacit
de stimulation plus prcise par les antignes dominants du pathogne, et de moins deffets secondaires ; mais leur immunognicit est souvent moins grande. Les vaccins inactivs protiques activent les L Ta, les LT et B mmoire. Une nouvelle
injection dclenche une ascension des IgG protectrices et une activation cellulaire durable. Les anatoxines ttaniques ou diphtriques en sont le meilleur exemple. Les antignes polyosidiques ne peuvent activer les lymphocytes T auxiliaires et
induisent une rponse thymo-indpendante, a cellules B productrice danticorps IgM et IgG spcifiques. Mais les cellules a mmoire B et T ne pouvant se mettre en place, la rponse immune est de courte dure : leffet de rappel est faible ou nul ; lefficacit de ces vaccins est faible chez les enfants de moins de 2 ans. Les vaccins conjugus, obtenus en assemblant des polyosides trs spcifiques a une
protine porteuse, permettent de produire une rponse plus intense et plus durable, thymoindpendante. Cela a pu tre ralis, par exemple, avec le vaccin Haemophilus influenzae b : le PRP de surface est conjugue a la toxine ttanique detoxifiee ( immunogne T universel ) pour obtenir une immunognicit trs grande. De mme, cette approche dantignes conjugues a t utilise pour les nouveaux vaccins meningococciques et pneumococciques. 1-3Vaccination et cancer :
1-3-1- Principe de la vaccination anti-tumorale: Il sagit didentifier les antignes tumoraux (sur)exprims par les cellules tumorales (antignes associs aux tumeurs) et par la vaccination renforcer la rponse immunitaire spcifique du patient Cinq catgories dantignes associs au cancer sont des cibles potentielles pour le vaccin thrapeutique/ : certains Ag viraux (EBV, HBV, HCV, HPV) ; Ag dactivation
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(MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1) ; Ag de diffrenciation (PSA, tyrosinase, Gp100, alphafoetoprotine) ; Ag surexprims (Her-2/neu, Muc-1) ; Ag cods par des gnes muts (P53 mute, TCR) 1-3-2- Objectif: Stimuler le systme immunitaire du patient rfractaire au traitement classique afin dactiver spcifiquement ses dfenses contre la tumeur et ses mtastases Peuvent agir diffrents stades: - limiter le dveloppement tumoral - prvenir les rcurrences - liminer les cellules tumorales non tues par les traitements conventionnels 1-3-3- Vaccins prventifs contre virus cancrignes : 2Vaccin contre lhpatite B : (adnocarcinome hpatique) Vaccin contre le papillomavirus : (cancer du col de lutrus) Adjuvants et conservateurs : Des adjuvants sont souvent ncessaires pour potentialiser la raction immunitaire induite par des vaccins inactifs ou sub-unitaires. De nombreux vaccins sont adsorbs sur hydroxyde ou phosphate daluminium. Ces adsorbants agiraient en maintenant lantigne a proximit du site dinjection et en activant les cellules prsentatrices favorisant la reconnaissance immune et la production dinterleukines. De nombreux autres adjuvants sont utiliss. Des conservateurs sont utiles pour maintenir la qualit biologique des vaccins et pour les rendre aptes a supporter des variations physiques / : la chaleur. Vaccins anti-viraux
* Contrindiqus en cas dimmunosuppression : ** centres agres
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Vaccins anti-bactriens
33-1-
Modes de prparation des vaccins : Anciens modes :
3-1-1- Vaccins bactriens germes entiers : Vaccins inactivs (chaleur, formol, phnol) base de cultures bactriennes/: Typhode, , Cholra, Coqueluche. Ces vaccins prsentent une grande ractognicit et immunognicit variable. 3-1-2- Mise au point des anatoxines : Par transformation des toxines sous l'effet du formol et de la chaleur : diphtriques (1923) ; ttaniques (1926). 3-1-3- Attnuation par culture en srie : Le BCG, souche de mycobactrium bovis utilise pour limmunisation contre la tuberculose : Calmette et Gurin: (1927). Souche 17D du virus de la fivre jaune (passages sur cerveau de souriceau puis sur oeuf embryonn) Theiler (1936). 3-1-4- Attnuation par passage sur cultures cellulaires : Possibilit de cultiver les virus en dehors dun hte vivant technique mise profit pour la premire fois par J. SALK pour prparer un vaccin (vaccin trivalent inactiv contre la poliomylite : 1954). Autres vaccins : rougeole, oreillons, rubole, varicelle 3-1-5- Vaccins polyosidiques : Capsule des bactries constitues de sucres (polyosides) : Meningo A et C, Pneumo- S. typhi, H. influenzae b : E.C. Gotschlich (1970) : immunognes partir de 15 mois (anticorps protecteurs); pas de mmoire immunitaire.
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Conjugaison des polyosides une protine porteuse : R. Schneerson et J. Robins (1980): immunognes ds les premires semaines de vie; effets rappel. 3-2Nouveaux modes de production des vaccins :
3-2-1- Gnie gntique : La premire tape consiste identifier le gne de lagent pathogne codant la protine immunogne. Ltape suivante consiste linsrer dans le gnome dune cellule animale, dune levure, dune bactrie ou dun virus. Il existe des lors deux possibilits dapplication : La synthse in vitro des fractions antigniques insres : aprs purification et
extraction, elles constitueront la matire premire des vaccins. Ce procd est aujourdhui largement utilis pour la production industrielle (vaccins contre lhpatite B et les papillomavirus). Llaboration de vaccins rplicables recombinants : le virus attnu de la vaccine, par
exemple, peut servir de porteur pour une squence nuclotidique produisant lpitope dsire. Lors de la rplication virale dans les cellules de lhte, on obtient une production antignique. Ces vaccins font lobjet dtudes intensives, mais ne sont pas encore commercialises. 3-2-2- Synthse chimique : Les techniques modernes ont permis dtablir la squence complte des acides amines de certains peptides vaccinaux et leur synthse in vitro pour des prparations vaccinales qui ne sont pas encore valides. 3-2-3- Les virus rassortants : Les virus rassortants font partie de la gamme des nouveaux vaccins pour les virus gnome fragment (grippe, rotavirus) : on hybride un virus apathogne avec une souche potentiellement pathogne, dont on slectionne les fragments du gnome codant les antignes protecteurs. 3-2-4- Les vaccins ADN nu : Il sagit de lintroduction dans les cellules (eucaryotes) de lhte dun fragment dADN compose des gnes des protines immunognes et dun promoteur viral ncessaires a lexpression de ces squences. Cette technique pourrait permettre de raliser plus facilement des vaccins actifs contre des agents bactriens dveloppement intracellulaire, des virus ou des cellules cancreuses, mais son immunognicit reste faible et son efficacit nest pas dmontre.
155
2me Anne Biologie
3-3-
Nouvelles formulations : Il sagit plus de systmes dencapsulation, dadressage (gographique; exemple:
muqueuses) de libration contrle, etc., que dadjuvants proprement dits, bien que: Ces dispositifs tendent optimiser la rponse immunitaire; ils ont donc une fonction
dadjuvantation. Ils incluent souvent des adjuvants.
3-3-1- Les systmes particulaires : Emulsions, micro particules, ISCOMs, virosomes, VLP (virus-like particles) sont des structures dont la dimension est proche de celle des agents infectieux et qui sont donc ingrs efficacement par les APC. 3-3-2- Les systmes bio-adhsifs : Ils sont dvelopps de faon, par exemple, retenir la prparation vaccinale dans la muqueuse nasale pour promouvoir la vaccination par voie nasale. ISCOMs (Immunostimulating complexes)
3-3-3- Les dispositifs non invasifs : Les arosols, Les injecteurs sans aiguille, les injecteurs usage unique Deux voies sont aujourdhui activement explores Des rseaux daiguilles minuscules Limmunisation trans-cutane avec des patchs
Pour tre complet, il faut citer la vaccination par voie alimentaire avec des aliments (tomates, bananes) transgniques.
4-
Aux limites de la vaccination et de la vaccinologie :
4-1- La prise en compte des diffrences individuelles : On peut imaginer que pour des raisons de scurit et/ou defficacit, on se dirige lavenir vers : Un typage individuel 156
2me Anne Biologie
Des vaccins plus ou moins la carte Cette question est dj pose en termes de mdicament et prise en compte par certains
groupes industriels. Elle soulve de difficiles problmes au niveau des dveloppements cliniques qui pourraient tre partiellement levs Au niveau rglementaire Au niveau analytique et technique
4-2- Lextension de la vaccination limmunothrapie : Dans le domaine dit prventif lorsquune part importante de la population est
infecte de faon non symptomatique : Vaccinations thrapeutiques contre les agents infectieux en dveloppement pour le SIDA notamment Vaccinations thrapeutiques contre les maladies auto-immunes. Vaccination contre les maladies dgnratives du systme nerveux Vaccinations anti-drogues ??? Anti-cholesterol ??? etc.
157
2me Anne Biologie
Information complmentaire sur la composition des vaccins Les vaccins qui sont actuellement distribus au Canada contiennent plusieurs composantes diffrentes (voir le tableau suivant) : Les antignes provoquant limmunit active : Il peut sagir dun vaccin monovalent (un seul antigne), polyvalent (plusieurs antignes dun agent infectieux) ou combin (plusieurs antignes de plusieurs agents infectieux). Les milieux de culture : Les vaccins sont fabriqus sur diffrents milieux de culture. Les plus frquemment utiliss pour ce faire sont les suivants : les protines bovines, les cellules dembryons de poulet, les oeufs embryonns de poule, les cellules diplodes humaines (ex. : MRC 5) et les levures. Le produit final peut contenir certaines protines ltat de traces. Le liquide de suspension : Selon les vaccins, il peut varier du salin ou de leau strile un liquide protinique plus complexe. Les agents de conservation ou les antibiotiques : Ils servent viter la prolifration bactrienne dans le vaccin. Les principaux agents de conservation sont les suivants : le formaldhyde, le phnol, le 2-phnoxythanol et le thimrosal. Enfin, les principaux antibiotiques sont la nomycine et la polymyxine B. Les agents de stabilisation : Les principaux agents de stabilisation sont : lalbumine bovine ou le srum bovin, lalbumine humaine, la glatine, la glycine, le lactose, le sorbitol, le sucrose ou le saccharose. Les polysorbates 20 ou 80 (ou Tween 20 ou 80) sont des surfactants qui assurent lhomognit du produit. On peut retrouver des agents de stabilisation dans certaines prparations gteau ou comme mulsifiant dans certains cosmtiques ou produits pharmaceutiques. Les adjuvants : Les adjuvants sont utiliss pour renforcer le pouvoir immunisant du vaccin afin dobtenir une meilleure rponse srologique et dassurer une immunit plus durable, avec une quantit plus faible dantignes et un plus petit nombre de doses. Les adjuvants agissent en prolongeant la prsence des antignes au site dinjection. Cela permet leur libration sur une priode de temps variable ainsi que lactivation des cellules prsentatrices dantignes (ex. : cellules dendritiques et macrophages) et la scrtion de certaines cytokines. Lorsquun vaccin contient des sels daluminium (en gnral, phosphate ou hydroxyde daluminium), il doit tre administr par voie intramusculaire, car lcoulement dans les tissus sous-cutans du sel daluminium peut causer une raction inflammatoire importante, des nodules sous-cutans et mme parfois des abcs striles. Dautres adjuvants pourraient tre aussi utiliss, comme lmulsion huile-eau MF59. Les composantes comprises dans les trois dernires catgories, aussi appeles excipients, sont des substances inactives par elles-mmes pour ltablissement de la rponse immunitaire recherche, mais elles facilitent la prparation et ladministration dun vaccin. Elles servent aussi de vhicules transportant le principe actif. 158
2me Anne Biologie
PRINCIPALES ETAPES DU DVELOPPEMENT DES VACCINS
Plusieurs annes sont ncessaires pour dvelopper un vaccin. En rsum, les principales tapes sont les suivantes. La comprhension de la maladie : savoir la reconnatre; tablir des mthodes diagnostiques valides et fiables; identifier lagent pathogne et localiser sa prsence dans la nature; documenter lpidmiologie; connatre la physiopathologie et les mcanismes de dfense immunitaire du corps humain. La comprhension de lagent pathogne : comprendre ses proprits biochimiques et bien le caractriser; connatre sa capacit de se reproduire en culture cellulaire; analyser ses proprits gntiques et ses antignes; identifier un modle animal qui saura reproduire linfection chez les humains. Le dveloppement de diffrents candidats de vaccins (tudes prcliniques) : analyser les capacits dinactivation ou dattnuation de lagent pathogne; slectionner et purifier lantigne appropri susceptible de stimuler la rponse immunitaire; slectionner ladjuvant appropri; slectionner le dosage et la squence appropries; dmontrer la stabilit, linnocuit et limmunognicit chez les modles animaux; produire des lots pilotes. Ltude clinique chez les humains : raliser des tudes de phase I : cette phase vise dterminer linnocuit de diffrentes doses chez un nombre restreint de volontaires sains; raliser des tudes de phase II : cette phase vise dterminer si le vaccin est scuritaire et immunogne chez un nombre plus important de volontaires sains (habituellement, plus de 100); raliser des tudes de phase III : cette phase vise dterminer si le vaccin est scuritaire, immunogne et efficace pour prvenir la maladie chez un nombre important dindividus (plusieurs milliers) faisant partie de la population cible. La production du vaccin des fins commerciales. Lhomologation du produit par un organisme rgulateur Les tudes aprs implantation de programmes qui visent documenter la scurit et lefficacit sur le terrain du vaccin (parfois aussi appeles tudes de phase IV).
159
2me Anne Biologie
Objectifs
123-
Citer lintrt et les limites des enqutes sro-pidmiologiques. Dfinir les termes limination et radication des maladies infectieuses. Connatre limpact de limmunit acquise sur lindividu et sur la
collectivit.
160
2me Anne Biologie
BASES EPIDEMIOLOGIQUES DE LA VACCINATION
Introduction : La vaccination est le plus bel outil que l'homme ait invente pour lutter contre les maladies infectieuses. Au cur de la confrontation entre l'homme et l'agent pathogne, la vaccinoIogie en explore logiquement les deux facettes, microbiologique et immunologique. Mais elle tend son champ d'action au del, en cancrologie ou dans le domaine de I allergie. La vaccinologie possde dsormais une dimension pdagogique, sociale et politique. Elle s'exerce dans un cadre rglementaire continuellement rvis. Avant de commercialiser un vaccin, le fabriquant doit absolument raliser des essais cliniques vaccinaux, au cours desquels le laboratoire jouera un r1e important pour vrifier linnocuit et l'immunognicit vaccinale.
1-
Surveillance pidmiologique et microbiologique : Une fois le vaccin commercialis et administr grande chelle dans la population
gnrale, la surveillance pidmiologique et microbiologique de la maladie cible est essentielle pour s'assurer de l'impact de la stratgie choisie. Par exemple, l'utilisation du vaccin antipoliomy1itique par voie orale impose la dtection systmatique de mutants vaccinaux rvertants dans l'environnement ou chez les sujets atteints de paralysie flasque. 1-11- Evaluation de la diversit gntique infraspcifique des microorganismes : aTechniques de typage molculaire : Cette valuation permet de mieux apprhender les modifications pidmiologiques qui suivent la mise en place d'un programme de vaccination. II est en particulier ncessaire d'identifier et de dterminer l'volution dans le temps des gnotypes associes une haute virulence. Dans le cadre de la mise en place de la vaccination anti-pneumococcique, laugmentation de l'incidence des infections pneumococciques dues d'autres srotypes que ceux contre lesquels le vaccin protge a pu tre observe; dans ce cas, seul le typage molculaire permet de diffrencier lmergence de souches appartenant au mme gnotype (switch capsulaire) de la slection de nouveaux gnotypes. bTechniques immunosrologique : Les tudes sro-pidmiologiques des maladies prvention vaccinale rpondent des objectifs spcifiques. Cependant, la variabilit de l'immunognicit vaccinale devrait tre
161
2me Anne Biologie
mieux prise en compte lavenir. Les facteurs gntiques qui contrlent la rponse immunitaire un antigne vaccinal seront aussi analyss.
Enqutes sro-pidmiologiques
Permettent : destimer la proportion de sujets rceptifs didentifier les populations risque dorienter les dcisions concernant les rappels ou les stratgies de rattrapage Limites : performance des tests, dtermination du seuil de protection, contribution Difficult destimer la proportion de sujets ayant chapp la maladie et la vaccination. de limmunit cellulaire Indispensable dans un contexte dlimination
2-
Evaluation de lefficacit et de la scurit des stratgies vaccinales : Les experts consults pour la mise en place de cette rglementation doivent s'appuyer
sur des donnes objectives leur permettant d'valuer au mieux le rapport bnfice-risque pour un vaccin donn. Pour russir le maintien de taux de couverture vaccinale levs dans la population et pour russir la mise en place de nouveaux vaccins, il est essentiel de documenter scientifiquement lefficacit et la scurit des stratgies vaccinales. Le laboratoire est la structure qui prsente probablement le meilleur rapport cout-efficacit pour atteindre cet objectif. Chaque vaccination a des objectifs anti-infectieux spcifiques. Ses indications prennent en compte la pathologie et la pathognie de linfection correspondante, son pidmiologie et les autres possibilits daction prventive disponibles (hygine, antibioprophylaxie). Elles seront envisages sparment en fonction de lagent infectieux qui constitue la cible de la vaccination correspondante. Lefficacit dun vaccin est vrifie suivant une procdure exprimentale qui se rapproche de celle des mdicaments. Son efficience sera juge sur son impact dans la lutte contre la maladie infectieuse vise. Un vaccin contribue assurer la prvention individuelle (exemple : vaccination ttanique), mais cest la protection de la collectivit qui lemporte dans llaboration des programmes de vaccination vis--vis des maladies a transmission interhumaine (exemple : rougeole) : limmunit de groupe permet mme des sujets non immunises dviter la 162
2me Anne Biologie
contamination condition que la couverture vaccinale de la population soit suffisante ( 95 % pour la rougeole). Le portage est diminu grce a certains vaccins bactriens (Haemophilus influenzae b, Neisseria meningitidis C et Streptococcus pneumoniae) ce qui contribue rduire le risque de contamination des sujets contacts non immuniss. La vaccination permet llimination dune maladie infectieuse dun pays ou dune rgion (lintroduction du micro-organisme dans la population ne donne lieu aucune chane de transmission). Avec lradication, cest la disparition mondiale et dfinitive dune maladie infectieuse qui est obtenue (exemple : variole). On peut esprer radiquer une infection dont lagent infectieux est unique et stable, le rservoir exclusivement humain, le portage limite, limmunit acquise solide, avec un vaccin facile a administrer. La combinaison de valences vaccinales dans une mme suspension injectable permet de rduire le nombre des injections et donne la possibilit dimmuniser rapidement vis--vis de nombreux risques infectieux. Lutilisation de ces vaccins combins, dont lefficacit dans limmunisation vis--vis de chaque risque infectieux doit tre contrle, contribue au succs dune politique de vaccination telle quelle est propose chacun par le calendrier des vaccinations.
3-
Impact de limmunit acquise sur lindividu et sur la collectivit : Limmunit acquise naturellement ou artificiellement par la vaccination joue un rle
important dans lpidmiologie des maladies transmissibles par leffet individuel ou collectif quelle entrane. 3-1- Effet individuel : Limmunit protge lindividu contre une rinfection, et la protection est spcifique. Toutefois, cette protection nest pas ncessairement permanente. Il arrive parfois que les personnes vaccines ne dveloppent pas une immunit protectrice. 163
2me Anne Biologie
3-2- Effet collectif : La transmission dune maladie contagieuse est directement relie la proportion des sujets rceptifs cette maladie dans la communaut. La transmission diminue lorsque le nombre de personnes immunes augmente. Lorsque ce nombre devient assez important, lagent infectieux cesse de circuler dans la population. Cela amne donc un effet protecteur lensemble de la population, incluant les personnes non vaccines. Cet effet est limmunit de groupe ou de masse (herd immunity). Elle constitue la base des programmes de vaccination de masse. Dans une population o un certain nombre dindividus sont protgs, il y a un seuil critique au-dessous duquel une pidmie risque dapparatre et un autre seuil au-del duquel la maladie steindra, faute dun nombre suffisant de sujets rceptifs susceptibles de la transmettre. Ces seuils varieront selon linfection en cause, son taux dattaque et, dans le cas de maladies vitables par la vaccination, du taux de couverture vaccinale de la population. Les objectifs des programmes dimmunisation peuvent tre de plusieurs ordres. Ils sont dtermins en fonction de facteurs tels que lefficacit des vaccins disponibles, la capacit datteindre les populations cibles et lpidmiologie de la maladie : Un premier objectif peut tre lradication, cest--dire aucun cas dans le monde. La
variole a t dclare officiellement radique par lOMS en 1980. Un deuxime objectif est llimination de la maladie qui est labsence de transmission
soutenue (endmique) de la maladie. On est en situation dlimination si le potentiel pidmique est suffisamment faible pour quen moyenne, un cas induise moins dun cas secondaire (cas de la poliomylite sur plusieurs continents). le troisime objectif peut tre de contrler la maladie, au niveau de la mortalit ou de
la morbidit (ex. : coqueluche). Spcificits de la vaccination Lutilisation large chelle induit des effets collectifs indirects, au del du bnfice direct de protection des sujets vaccins. Peut tre prjudiciables par modification dfavorable de lpidmiologie de la maladie par la vaccination : Pour les maladies transmission strictement inter-humaine Diminution du nombre de cas => diminution risque dinfection pour les sujets non vaccins (immunit de groupe) Dplacement de la maladie vers des ges o elle est plus svre Remplacement de "srotypes" vaccinaux par "srotypes" non vaccinaux Ces effets peuvent tre bnfiques Diminution de l'incidence pour les sujets non vaccins ou non vaccinables limination dune maladie sans atteindre 100 % de couverture 164
165
2me Anne Biologie
Objectifs
1-
Citer les sources dinformation qui contribuent la surveillance
pidmiologique. 2Citer les maladies prvention vaccinale ncessitant une dclaration
obligatoire. 345Citer les lignes directrices relatives limmunisation. Connatre les rgles dor du vaccinateur. Citer les recommandations gnrales pour bien appliquer les notions
dimmunisation. 6Citer les modalits de surveillance dun programme vaccinal.
166
2me Anne Biologie
LES STRATEGIES DE PREVENTION VACCINALE ET LEUR SURVEILLANCE
1-
Les modalits de la surveillance pidmiologique : Longtemps assimile la dclaration obligatoire qui en constituait le principal pilier,
la surveillance pidmiologique a vu ses modalits se diversifier, pour mieux prendre en compte les caractristiques spcifiques de chaque maladie surveiller (essentiellement frquence et gravit) ainsi que les modalits de leur diagnostic et de leur prise en charge (essentiellement diagnostic clinique ou biologique, maladie vue en ville ou lhpital). La surveillance pidmiologique repose actuellement sur plusieurs sources dinformation, une mme maladie pouvant tre surveille par plusieurs systmes, ce qui facilite lvaluation de la performance de chacun des systmes. 1-1La dclaration obligatoire : Elle concerne les maladies justiciables de mesures de contrle au niveau international, national ou local. Actuellement, vingt-six maladies sont incluses dans la liste des maladies devant tre dclares aux mdecins inspecteurs de sant publique des Directions dpartementales des affaires sanitaires et sociales. 1-2Les rseaux de mdecins Sentinelles : Il sagit essentiellement du rseau sentinelles, qui sappuie sur des mdecins gnralistes communiquant chaque semaine travers un rseau tlmatique le nombre de cas concernant sept maladies infectieuses quils ont diagnostiques dans leur clientle. 1-3Les rseaux de laboratoires de microbiologie : Il sagit de rseaux de laboratoires de virologie ou de bactriologie, publics et privs, qui fournissent de manire volontaire et rgulire des informations sur les micro-organismes identifis ou les srologies positives ralises lors de leurs activits. Ils peuvent tre gnralistes, sintressant plusieurs virus ou bactries, ou spcialiss, sintressant un agent pathogne prcis. 1-4Les Centres nationaux de rfrence (CNR) :
Il sagit le plus souvent de laboratoires hospitalo-universitaires ou de recherche. Ils sont gnralement spcialiss pour un agent pathogne prcis. Leur mission est multiple : contribution la surveillance pidmiologique, alerte par lidentification de cas
groups lis un agent unique, 167
2me Anne Biologie
1-5-
expertise par ltude fine des souches et les activits de typage, surveillance des rsistances aux antimicrobiens, conseils pour les techniques de diagnostic Les dclarations obligatoires des causes de dcs : Constituent une autre source intressante de donnes de surveillance.
2-
Les spcificits de la surveillance des maladies vitables par vaccination : Les diffrentes fonctions de lpidmiologie peuvent tre illustres dans le cadre des
maladies vitables par vaccination. Cest cependant lpidmiologie descriptive qui est essentielle dans le processus de gestion des programmes de vaccination. Les donnes de surveillance pidmiologique sont indispensables, au moment de la mise sur le march de nouveaux vaccins, pour dcider de la pertinence et des modalits les plus adaptes de leur intgration dans le calendrier vaccinal. Au stade du suivi des programmes de vaccination mis en uvre, les donnes de surveillance pidmiologique permettent de sassurer de lefficacit de la vaccination et dadapter, le cas chant, le calendrier de vaccination en fonction des rsultats observs. titre dexemple, la recommandation dintgrer la vaccination hpatite B dans le calendrier de routine de lenfant dans tous les pays, y compris ceux o le taux de portage de lantigne HBs est faible, sest appuye sur lincapacit des stratgies de vaccination cibles sur des groupes risque rduire de manire significative, dans les pays industrialiss, lincidence de linfection par le virus de lhpatite B. De mme, la vaccination des adolescentes contre la rubole a eu un impact limit sur lincidence des infections ruboleuses durant la grossesse, ce qui a conduit lensemble des pays industrialiss opter, dans un second temps, pour une stratgie de vaccination gnralise du nourrisson.
3-
Les diffrentes modalits de suivi des maladies vitables par vaccination : Les modalits de suivi des maladies correspondant aux vaccins inclus dans le
calendrier vaccinal figurent au tableau I. Toutes les maladies pour lesquelles il existe une obligation ou une recommandation de vaccination gnralise font lobjet dune surveillance pidmiologique permettant dvaluer limpact de la mise en uvre de la politique. La dclaration obligatoire concerne les maladies prvention vaccinale suivantes : la tuberculose, la diphtrie, le ttanos, la poliomylite, les infections invasives mningocoque et lhpatite B aigu, la rougeole et lhpatite A.
168
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169
2me Anne Biologie
4-
Les rseaux de surveillance : La rougeole, les oreillons, les syndromes grippaux (ainsi que la varicelle, non incluse
dans le calendrier vaccinal) sont surveills par le rseau Sentinelles. La grippe est galement surveille par le rseau des praticiens participant aux groupements rgionaux dobservation de la grippe. Les infections ruboleuses durant la grossesse sont suivies par un rseau de laboratoires de virologie. Pour chaque cas identifi, des informations complmentaires sont recueillies auprs du clinicien. Dans le cadre de llimination de la poliomylite, la surveillance de la circulation des entrovirus par des rseaux de laboratoires de virologie a t renforce et le Rseau de surveillance des entrovirus a t mis en place. Les malades atteints dune coqueluche et hospitaliss sont suivis par un rseau Sentinelles pdiatrique hospitalier associant cliniciens et bactriologistes. Les infections invasives Haemophilus influenzae b, mningocoque et pneumocoque, sont suivies par un rseau de laboratoires de microbiologie hospitaliers.
Lignes directrices relatives limmunisation : Les services de vaccination devraient tre facilement accessibles, tant au niveau
gographique quaux niveaux organisationnel et temporel. Les vaccinateurs devraient profiter de toutes les consultations cliniques pour
senqurir du statut vaccinal des personnes et, au besoin, les vacciner. En ce sens, ils devraient donner aux personnes linformation pertinente sur les vaccins recommands. Les vaccinateurs devraient informer les personnes en termes clairs des risques et des
avantages du vaccin qui sera administr. Les vaccinateurs ne devraient reporter ou refuser la vaccination quen prsence de
contre-indications relles. Les vaccinateurs devraient administrer toutes les doses vaccinales auxquelles la
personne est admissible chaque consultation. Les vaccinateurs devraient consigner toutes les donnes sur la vaccination de faon
exacte et complte. Les vaccinateurs devraient signaler de faon rapide et exhaustive les manifestations
cliniques graves ou inhabituelles pouvant tre lies la vaccination ainsi que tous les cas de maladie pouvant tre prvenus par un vaccin, conformment aux exigences de la loi sur la sant publique.
170
2me Anne Biologie
Les vaccinateurs devraient suivre les rgles qui se trouvent dans le document Guide
des normes et pratiques de gestion des vaccins lintention des vaccinateurs-mdecins et infirmires. Les vaccinateurs devraient conserver le Protocole dimmunisation jour et le rendre
facilement accessible partout o des vaccins sont administrs. Les vaccinateurs devraient tre forms adquatement et se tenir constamment au
courant des recommandations rcentes en matire dimmunisation. Les vaccinateurs devraient utiliser un systme de relance. Les vaccinateurs devraient mettre en place des mcanismes pour valuer
priodiquement la qualit de leurs dossiers de vaccination. Les vaccinateurs devraient participer lvaluation de la couverture vaccinale.
Rgles dor du vaccinateur : Bien connatre les produits immunisants que lon administre. Toujours se rappeler quaucun vaccin nest totalement efficace ou sr. Respecter les
normes de conservation et les rgles dutilisation afin de minimiser les risques associs la vaccination et doptimiser son efficacit. Se rappeler que tous les produits immunisants peuvent tre administrs en mme
temps, sauf sil y a interaction. Ne pas utiliser le muscle fessier pour administrer un vaccin, le rserver pour les
immunoglobulines. De faon gnrale, respecter le calendrier recommand. Lutilisation des intervalles
minimaux doit tre rserve aux situations o la protection est requise rapidement. Administrer de nouveau la dernire dose lorsque l'intervalle minimal n'est pas respect
entre deux doses de vaccin. Toujours donner des doses compltes. Respecter un dlai dattente dau moins 15 minutes la suite de ladministration dun
ou de plusieurs produits immunisants. En gnral, ne pas reprendre une primo-vaccination, mais la poursuivre l o elle a t
arrte, peu importe le temps coul depuis la dernire dose. Profiter de toutes les occasions pour mettre jour limmunisation. Sassurer que sa propre immunisation est jour.
171
2me Anne Biologie
77.1.
Recommandations gnrales pour bien appliquer les notions dimmunisation : Age auquel les produits immunisants sont administrs : Les facteurs qui influencent les recommandations au sujet de lge auquel un vaccin
est administr sont : linteraction antagoniste potentielle entre la rponse du systme immunitaire et le transfert passif danticorps maternels; la capacit dun individu dun ge donn dvelopper une rponse immunitaire
(maturit du systme immunitaire); le risque, li lge, de dvelopper la maladie ou ses complications. Une dose
administre un ge moindre que lge minimal recommand peut conduire une rponse immunitaire sous-optimale et ne devrait pas tre compte comme partie dune primovaccination. Ainsi, cette dose devra tre redonne lge prvu initialement, la condition de respecter lintervalle minimal entre deux doses dun mme vaccin, partir de la dose administre trop prcocement. 7.2. Intervalles entre les vaccins : 7.2.1. Intervalles entre les doses dun mme vaccin : Plusieurs vaccins requirent au moins deux doses pour donner une protection adquate
ainsi quun rappel priodique pour maintenir cette protection leve. moins dindications contraires (voir les chapitres spcifiques), les doses
administres des intervalles minimaux moindres que ceux qui sont recommands peuvent conduire une rponse immunitaire sous-optimale et ne devraient pas tre comptes comme partie dune primo-vaccination. Ainsi, ces doses devront tre redonnes en calculant lintervalle minimal ou recommand prvu initialement, partir de la dose administre trop prcocement. Par exemple, si la 3e dose de Pentacel a t administre lge de 6 mois et la 4e dose 11 mois, lintervalle minimal nest pas respect, puisquil sest coul 5 mois aprs la 3e dose plutt que 6 mois, qui est lintervalle minimal. La 4e dose nest pas considre comme valide et doit tre reprise de 6 12 mois (intervalles minimal et recommand) plus tard, soit lge dau moins 17 mois. Cette dose reprise sera considre comme la 4e dose valide de la primo-vaccination. On poursuivra la vaccination par la suite en respectant les intervalles recommands. Lorsquun intervalle minimal respecter entre ladministration de 2 doses de vaccin
est dun mois, on reconnat gnralement que cet intervalle quivaut 4 semaines (28 jours). En gnral, on ne doit pas recommencer une primo-vaccination interrompue, mais la
continuer l o on sest arrt, peu importe le temps coul depuis la dernire dose, mme si cet intervalle se chiffre en annes. 172
2me Anne Biologie
7.2.2. Intervalles entre des vaccins diffrents : La plupart des antignes courants peuvent tre administrs simultanment. Les vaccins inactivs peuvent tre administrs en mme temps ou nimporte quand
avant ou aprs un vaccin vivant ou un vaccin inactiv. Des vaccins vivants diffrents devraient tre administrs simultanment ou au moins
4 semaines dintervalle. Une baisse defficacit du vaccin contre la varicelle a t dmontre lorsque lintervalle entre les vaccins RRO et varicelle tait insuffisant. Le vaccin oral contre la typhode peut tre administr le mme jour quun autre vaccin vivant ou peu importe lintervalle entre ces vaccins, lexception du vaccin oral contre le cholra. tant donn que le RRO modifie lhypersensibilit la tuberculine, le test cutan la
tuberculine (TCT) devra tre fait avant, en mme temps ou au moins quatre semaines aprs ladministration du RRO. Il est possible que dautres vaccins vivants injectables, tels que les vaccins contre la varicelle et la fivre jaune, faussent de la mme faon linterprtation des rsultats du TCT. Si lon doit administrer un vaccin vivant injectable et que lon doive effectuer un TCT, ce dernier test doit tre fait avant, en mme temps ou au moins quatre semaines aprs la vaccination. Les vaccins vivants administrs par voie orale nont probablement aucun effet sur la rponse au TCT. 7.2.3. Intervalles entre les immunoglobulines (IG), les autres produits sanguins et les vaccins : Les vaccins inactivs peuvent tre administrs le mme jour que les
immunoglobulines et les autres produits sanguins ou nimporte quand avant ou aprs, sans altrer la rponse immunitaire. Les vaccins contenant des virus vivants de la rougeole ou de la varicelle devraient tre
donns au moins deux semaines avant les immunoglobulines ou au plus tt trois mois aprs ladministration des immunoglobulines, car limmunisation passive peut affecter la rponse ces vaccins. Si ces intervalles ne sont pas respects, il faut administrer de nouveau les vaccins. Ladministration dimmunoglobulines ninterfre pas avec la rponse immunitaire aux
autres vaccins vivants. Modalits de surveillance dun programme vaccinal

Les 4 questions auxquelles il convient de rpondre : - le programme est-il correctement appliqu (mesure de la couverture vaccinale) ? - le vaccin utilis protge-t-il les sujets vaccins (mesure de lefficacit vaccinale) ? - le vaccin est-il bien tolr (suivi des effets secondaires) ? - la vaccination a t-elle leffet attendu en termes de rduction de lincidence ou de la mortalit de la maladie (surveillance pidmiologique) ou de la rceptivit de la population la maladie (tudes sro-pidmiologiques) ?
173
Mesure de limpact pidmiologique Au moins un systme de surveillance pour toute maladie faisant lobjet dun programme de vaccination Bass sur des outils trs varis : Dclaration obligatoire (DO) Centres Nationaux de Rfrence (CNR) Rseaux de laboratoires de microbiologie volontaires Rseau de mdecins gnralistes ou spcialistes volontaires Choix fonction de lhistoire des caractristiques de la maladie (frquence, gravit, ic) du niveau de contrle atteint / souhait
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Objectifs
En se rfrant au calendrier vaccinal de la Rpublique Tunisienne et au texte du cours, dgager les particularits (mode dadministration, politique vaccinale, recommandations) de chaque vaccin.
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2me Anne Biologie
MALADIES A PREVENTION VACCINALE
Introduction : Plusieurs maladies infectieuses peuvent tre prvenues par ladministration de vaccins. Ces vaccinations doivent rpondre un organigramme bien tablit. Certains vaccins sont obligatoires et entrent dans le cadre du calendrier vaccinal, dautres seront administrs selon les circonstances.
I-
Vaccins obligatoires : (calendrier vaccinal)
1-
La vaccination par le BCG et tests tuberculiniques : La lutte contre la tuberculose est fonde sur le dpistage des cas, la prise en charge et
le traitement des malades, en particulier des malades contagieux, et la vaccination par le BCG. Celle-ci a pour but principal de protger les jeunes enfants des formes graves de la tuberculose prcoce, en particulier les mningites tuberculeuses. 1-1- Caractristiques du vaccin : Le vaccin BCG drive dun isolat de Mycobacterium bovis qui a perdu sa virulence par attnuation au moyen de 230 passages sur pomme de terre bilie glycrine. La prparation initiale de Calmette et Gurin, mise au point en 1921, a t largement distribue de par le monde et na t modifie que dans ses mthodes et conditions de culture. Il en rsulte cependant de grandes variations dans les caractristiques des vaccins du march actuel. 1-2- Mode dadministration, schma de vaccination: Le vaccin se prsente en flacon de poudre lyophilise, reconstituer avec 1 ml de solvant. Aprs reconstitution, une dose de 0,1 ml contient 200 000 800 000 UFC (units formant colonies). Le vaccin reconstitu est inject par voie intradermique. Chez lenfant de plus de 1 an et les adultes, le volume injecter est de 0,1 ml. Chez le nourrisson de moins de 1 an, le volume de vaccin injecter est de 0,05 ml. Le site dinjection recommand est la partie postro-externe du bras, lunion des tiers moyen et suprieur. Aprs reconstitution, le vaccin doit tre utilis dans les quatre heures.
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1-3- Politique vaccinale, lgislation, recommandations : La vaccination est obligatoire pour lenfant qui entre en collectivit, et donc au plus tard 6 ans, lentre lcole primaire. Elle sapplique galement certaines catgories professionnelles. La vaccination antituberculeuse BCG na pas lieu dtre ralise chez les personnes dont lintradermo-raction la tuberculine est positive. Il ny a pas lieu de revacciner une personne ayant eu une premire vaccination, mme en cas dintradermoraction la tuberculine ngative. La technique vaccinale de rfrence se fait par voie intradermique, selon une posologie adapte lge.
2-
La vaccination contre lhpatite B : Avec plus de 350 millions de porteurs chroniques du virus de lhpatite B (VHB) et 2
millions de morts par an, lhpatite B reprsente lun des principaux problmes de sant publique dans le monde. Pourtant, elle est accessible depuis plus de vingt ans une prophylaxie efficace par la vaccination. 2-1- Caractristiques des vaccins : La premire gnration de vaccins contre lhpatite B, dorigine plasmatique, a t supplante par des vaccins obtenus par recombinaison gntique. Les vaccins contre lhpatite B : Le Vaccin Genhevac B Pasteur, lEngerix B etc . Les vaccins combins :
Le vaccin combin contre lhpatite B et lhpatite A Twinrix Les vaccins sont tous adsorbs sur hydroxyde daluminium. Le vaccin hexavalent doit permettre une augmentation de la couverture vaccinale du nourrisson contre lhpatite B, en sintgrant dans les recommandations du calendrier vaccinal. 2-2- Mode dadministration, schma de vaccination: Les vaccins sont administrs par voie intramusculaire, dans la cuisse chez les nourrissons et dans le muscle deltode chez les adultes et les enfants. Les vaccins peuvent tre administrs suivant un schma classique de trois doses (de type 0-1-6 mois). Au-del de ces trois injections, il nest plus ncessaire deffectuer des rappels systmatiques, la diminution du titre des anticorps anti-HBs sous le seuil de 10 mUI/ ml ne signant pas labsence de protection. Cependant, pour les professionnels de sant ou autres professionnels de la sant publique, ainsi que chez les personnes haut risque dexposition, cette attitude doit tre module en fonction de lge lors de la primovaccination. 177
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Chez les insuffisants rnaux chroniques dialyss, une srologie annuelle est recommande, avec rappel ds que le taux des anticorps descend au-dessous du seuil protecteur. Un schma adapt certains cas particuliers, incluant trois doses rapproches et une quatrime dose un an plus tard, peut tre propos lorsquune immunit doit tre rapidement acquise : tudiants non vaccins des filires mdicales et paramdicales, dpart imminent pour un sjour prolong en zone de moyenne ou de forte endmie. Une vaccination contre lhpatite B commence avec lun des trois vaccins recombinants actuellement sur le march peut tre poursuivie avec un autre de ces trois vaccins. 2-3- Immunisation des nouveau-ns de mre porteuse chronique de lantigne HBs : Limmunisation du nouveau-n doit tre systmatique chaque fois que la recherche obligatoire de lAgHBs chez la mre au 6me mois de grossesse a t positive, ou que le rsultat de lexamen nest pas connu laccouchement. La vaccination doit tre commence le jour de la naissance et poursuivie suivant le schma 01-6 mois. Une injection intramusculaire de 100 UI dimmunoglobulines anti-HBs est pratique le jour de la naissance dans un site corporel diffrent. Lefficacit de cette prvention doit tre value partir de lge de 9 mois, au mieux un quatre mois aprs la dernire dose vaccinale, par une recherche dantigne et danticorps anti-HBs. En effet, si limmunognicit du vaccin chez le nouveau-n est dmontre depuis longtemps, lefficacit de cette srovaccination nest pas totale : 10 15 % des nouveau-ns de mre positive pour lAgHBs et lAgHBe sont infects. Une tolrance immunitaire, induite par de faibles doses dADN du VHB transmises in utero, pourrait tre en cause, mais plus probablement, pour certains, une contamination in utero. Dautres checs ont t imputs la slection de mutants dchappement dcrits au Japon, Singapour, en Gambie, en Chine, au Sngal, mais aussi en Europe. 2-4- Politique vaccinale, recommandations, lgislation et conduites tenir spciales : Vaccination systmatique de tous les enfants avant 13 ans, en privilgiant la vaccination du nourrisson, ainsi que la vaccination des groupes risque. La vaccination est recommande partir de lge de 2 mois (sauf pour les enfants ns de mre antigne HBs positif, chez lesquels elle doit tre pratique imprativement la naissance, associe ladministration dimmunoglobulines anti-HBs). Un schma vaccinal unique en trois injections, du type 0-1-6, qui respecte un intervalle dau moins un mois entre la premire et la deuxime injection, et un intervalle compris entre cinq et douze mois entre la deuxime et la troisime injection, est recommand. Un schma adapt certains cas particuliers, incluant trois doses rapproches et une quatrime dose un an plus 178
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tard, peut tre propos lorsquune immunit doit tre rapidement acquise (tudiants non vaccins des filires mdicales et paramdicales, dpart imminent pour un sjour prolong en zone de moyenne ou de forte endmie). Au-del des trois injections de ce schma initial, les rappels systmatiques de vaccin contre lhpatite B ne restent recommands que dans des situations particulires. Possibilit dassocier dautres vaccins.
3-
La vaccination contre la diphtrie : Lexotoxine de Corynebacterium diphtheriae, bacille de Klebs-Lffler, ou de
Corynebacterium ulcerans est responsable des manifestations cliniques de la diphtrie. 3-1- Caractristiques du vaccin : Lanatoxine est produite en traitant une prparation de toxine par le formaldhyde qui la transforme en anatoxine immunogne, mais sans toxicit. concentration normale (D)/ : Infanrix Tetra, Infanrix Quinta, etc ; une dose de vaccin contient au moins 30 units internationales danatoxine diphtrique adsorbe sur sels daluminium ; DTPolio. 3-2- Mode dadministration: La dose est de 0,5 ml injecter par voie intramusculaire. 3-2- 1-Vaccination des nourrissons et des personnes de moins de 16 ans : Le vaccin diphtrique est lun des composants du vaccin pentavalent DTC Polio Hib recommand pour la primo-vaccination des nourrissons ds lge de 2 mois, avec trois doses au moins un mois dintervalle entre chaque dose. Cette primo-vaccination est complte par un rappel, effectu un an aprs la troisime dose de vaccin, soit 16-18 mois. Rappels ultrieurs : une dose de rappel, contenant les anatoxines diphtrique et ttanique et le vaccin poliomylitique, est recommande 6 ans, entre 11 et 13 ans (associe la valence coqueluche acellulaire). 3-2-2- Vaccination des personnes de plus de 16 ans : Les vaccinations doivent tre effectues avec une anatoxine concentration faible, moins concentre que lanatoxine utilise chez lenfant en raison du risque de ractions graves si le sujet est dj immunis. La primo-vaccination comporte deux doses au moins un mois dintervalle entre chaque dose, suivies dune troisime 6 12 mois aprs la deuxime, par voie sous-cutane profonde ou intramusculaire. Pour le rappel, une seule dose de vaccin faiblement titr en anatoxine est ncessaire.
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3-3- Politique vaccinale : recommandations, lgislation et conduites tenir spciales : La vaccination diphtrique est obligatoire. Les personnels de sant doivent recevoir un rappel tous les dix ans. La vaccination est conseille aux voyageurs en zones dendmicit. Vaccination des personnes en contact troit avec un cas de diphtrie : Toutes les personnes en contact troit avec un cas de diphtrie doivent recevoir une dose de vaccin, sauf si lon peut prouver une vaccination avec au moins trois doses, dont la dernire date de moins dun an. Les personnes non ou incompltement vaccines recevront ultrieurement les doses additionnelles pour complter leur protection vaccinale.
4-
Vaccination anti-ttanique : Le ttanos est une infection aigu due aux exotoxines produites par un bacille
anarobie Gram positif, le Clostridium tetani. Cette bactrie est ubiquitaire, commensale du tube digestif des animaux. Elle persiste dans les djections animales et dans le sol sous forme sporule, extrmement rsistante. La source tant tellurique et inpuisable, lradication du ttanos est impossible. Elle pntre dans lorganisme via une plaie cutane. Quand les conditions danarobiose sont runies, il y a alors, au site de la plaie, germination des spores et production de toxines. Dissmines dans la circulation gnrale, ces toxines vont interfrer avec les neurotransmetteurs et entraner, aprs une priode dincubation de quatre vingt et un jours, une atteinte neuromusculaire avec contractures, spasmes musculaires et convulsions 4-1-Caractristiques des vaccins : Le vaccin ttanique est produit en traitant une prparation de toxine par le formaldhyde, qui la transforme en anatoxine (immunogne, mais sans toxicit). 4-1-1- Vaccin monovalent adsorb : Vaccin ttanique adsorb (Vaccin ttanique Pasteur) : une dose de vaccin contient au moins 40 Units internationales (UI) danatoxine ttanique adsorbe sur hydroxyde daluminium. 4-1-2- Vaccins combins non adsorbs : Le vaccin DTPolio, le vaccin Ttagrip titre 40 UI. 4-1-3- Vaccins combins adsorbs : Infanrix Tetra, Tetravac acellulaire, Infanrix Quinta, Pentavac, etc 4-2- Mode dadministration, schma de vaccination : La dose est de 0,5 ml administrer par voie intramusculaire.
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4-2-3- Vaccination des nourrissons et des enfants : Le vaccin ttanique est lun des composants des vaccins pentavalents et hexavalent recommands pour la primo-vaccination des nourrissons. La primo-vaccination comporte trois doses de vaccin partir de 2 mois, avec au moins un mois dintervalle entre chaque dose. Cette primo-vaccination est complte par un rappel, effectu un an aprs la troisime dose de vaccin, soit 16-18 mois. En cas de contre-indication de la valence coqueluche et chez les enfants partir de 6 ans, le vaccin DTPolio doit tre utilis. Rappels ultrieurs : une dose de rappel contenant les anatoxines diphtrique et ttanique et le vaccin poliomylitique est recommande 6 ans, entre 11 et 13 ans (associs la valence coqueluche acellulaire pour cette dernire tranche dge), puis entre 16 et 18 ans. 4-2-3- Vaccination des personnes de plus de 18 ans : La primo-vaccination comporte deux doses administres au moins un mois dintervalle, suivies dun troisime 6 12 mois aprs la deuxime, par voie intramusculaire. Un rappel est ncessaire tous les dix ans. 4-3- Politique vaccinale : recommandations, lgislation et conduites tenir spciales : La vaccination ttanique est obligatoire pour les enfants de moins de 18. Elle est obligatoire chez les militaires depuis la loi du 14 aot 1936. La vaccination ttanique est galement obligatoire pour toutes les personnes qui, dans un tablissement ou organisme public ou priv de prvention ou de soins, exercent une activit professionnelle les exposant des risques de contamination. La vaccination dun professionnel nest complte que si elle satisfait au rythme des rappels mentionns dans le calendrier vaccinal (tous les dix ans). Des rappels sont recommands lensemble de la population, 6 ans, 11 13 ans, 16-18 ans, puis tous les dix ans.
5-
La vaccination contre la coqueluche : La coqueluche est une maladie respiratoire trs contagieuse due au bacille de Bordet-
Gengou ou Bordetella pertussis. Elle est largement rpandue dans le monde et sa gravit tient des complications (bronchopneumonies, complications neurologiques) et son risque de mortalit (300 000 dcs annuels dans le monde daprs lOMS), en particulier chez le nourrisson de moins de 6 mois. 5-1Caractristiques des vaccins : Les vaccins acellulaires sont composs dun ou de plusieurs antignes purifis (anatoxine et adhsines) de Bordetella pertussis.
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5-2-Mode dadministration: Le vaccin est administr de prfrence par voie intramusculaire. 5-3- Politique vaccinale, recommandations : Primo-vaccination 2, 3 et 4 mois, un rappel 16-18 mois et un rappel 11-13 ans. Compte tenu de la recrudescence des cas de coqueluche observe chez de trs jeunes nourrissons contamins par des adolescents ou de jeunes adultes, un rappel est recommand, entre lge de 11 et 13 ans et doit tre pratiqu avec un vaccin coquelucheux acellulaire, en mme temps que le troisime rappel diphtrie, ttanos et polio. La vaccination coquelucheuse est recommande dans le cadre de risques professionnels : personnel mdical et paramdical des maternits, des services de nonatologie, de tout service de pdiatrie prenant en charge des nourrissons gs de moins de 6 mois, etc.
6-
La vaccination contre la poliomylite : Les trois types de poliovirus responsables de la maladie (srotypes 1, 2 et 3)
appartiennent au genre des entrovirus. Le rservoir est humain, constitu par les personnes infectes, le plus souvent de faon inapparente. La transmission se fait soit directement par contact avec les matires fcales ou les scrtions pharynges dune personne infecte, soit indirectement par ingestion de produits souills, le virus pouvant rsister plusieurs semaines dans le milieu extrieur. 6-1- Caractristiques des vaccins : 6-1-1- Le vaccin simple : Le vaccin inactiv contre la poliomylite est commercialis sous le nom dImovax Polio. Le vaccin contient une dose vaccinante de vaccin poliomylitique inactiv de types 1, 2 et 3. Il existe aussi vaccin poliomylitique attnu oral. 6-1-2- Les vaccins combins : Le vaccin poliomylitique inactiv est prpar partir des trois types de virus poliomylitiques, cultivs sur ligne cellulaire continue et inactivs par le formol. Les combinaisons du vaccin poliomylitique inactiv comprennent : Infanrix Hexa (6 valences) ; Infanrix Quinta, Pentavac (5 valences) etc . 6-2- Mode dadministration: Le vaccin poliomylitique inactiv est administr par voie sous-cutane ou intramusculaire la dose de 0,5 ml; les combinaisons sont administres par voie intramusculaire.
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6-3- Politique vaccinale, lgislation et recommandations : Le vaccin inactiv a t recommand, pour viter les accidents paralytiques lis la vaccination orale. Lutilisation du vaccin oral est rserve aux situations pidmiques. 6-3-1- Vaccination des nourrissons et des enfants : Le vaccin inactiv est lun des composants des vaccins pentavalents ou hexavalents recommands pour la vaccination du nourrisson ds lge de 2 mois. La primo-vaccination comporte trois injections un mois dintervalle. Une dose de rappel est ncessaire un an aprs la troisime injection de primo-vaccination. Rappels ultrieurs : un rappel est recommand 6 ans, 11 ans, puis entre 16 et 18 ans. 6-3-2- Vaccination des personnes de plus de 18 ans : La primo-vaccination comporte deux injections un mois dintervalle, suivies dune troisime dose six douze mois aprs la deuxime dose. Un rappel est ncessaire tous les dix ans lge adulte. Un contrle et une rgularisation de la situation vaccinale doivent tre faits pour tous les voyageurs, tout particulirement ceux voyageant en zone dendmie. 6-3-3- Conduite tenir en cas dpidmie : Aprs un cas mme suspect de poliomylite virus sauvage, la mise jour du statut vaccinal laide du vaccin inactiv doit tre ralise pour toutes les personnes vivant dans lentourage du cas. La vaccination complte doit tre administre aux personnes jamais vaccines, ou dont le statut est inconnu.
7-
La vaccination contre la rougeole : La rougeole demeure lun des grands flaux infectieux mondiaux encore responsable
chaque anne, daprs lOMS, denviron un demi-million de dcs denfants. 7-1- Caractristiques du vaccin : Tous les vaccins actuels sont des vaccins vivants attnus. Le vaccin rougeoleux existe sous forme simple Rouvax. Il est associ aux vaccins contre les oreillons et la rubole sous forme de vaccins trivalents : le vaccin ROR Vax et le vaccin Priorix. 7-2- Mode dadministration: Le vaccin se prsente sous forme de poudre. La suspension vaccinale est reconstitue en injectant le solvant dans le flacon de poudre. Linjection se fait par voie sous-cutane. 7-3- Politique vaccinale, recommandations : La vaccination contre la rougeole, associe aux vaccinations contre la rubole et les oreillons, est recommande chez tous les nourrissons lge de 12 mois.
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Une seconde dose de vaccin triple associant rougeole, rubole et oreillons est recommande au cours de la deuxime anne, cest--dire entre 13 et 24 mois. La vaccination rougeoleoreillons-rubole est aussi recommande auprs de certains groupes risque : Les nourrissons gards en collectivit doivent tre vaccins ds lge de 9 mois avec
un vaccin triple, dans le but dviter les rougeoles qui peuvent tre graves cet ge et les pidmies dans ces collectivits. Il est recommand dadministrer la seconde dose entre 12 et 15 mois, car 10 30 % des nourrissons ont encore des anticorps maternels anti-rougeoleux prsents lge de 9 mois et la vaccination est, dans ce cas, inefficace. Si le vaccin monovalent a t utilis, lenfant devra alors recevoir les deux injections de vaccin triple ncessaires pour une immunit efficace contre les oreillons. Le vaccin rougeoleux peut tre utile pour protger un sujet non immun aprs un
contage de rougeole, mais seulement dans les 72 heures qui suivent ce contage. La vaccination peut tre envisage loccasion dune pidmie. Une vaccination post-exposition peut tre ralise auprs de nourrissons gs de 6 8 mois avec un vaccin monovalent (lenfant devra alors recevoir par la suite les deux doses de vaccin trivalent conformes aux recommandations du calendrier). Ces mesures concernent les contacts proches.
8-
La vaccination contre la rubole : Toute la gravit de la rubole tient la possibilit dune contamination ftale par le
virus chez une femme non immune, infecte durant la grossesse. 8-1- Caractristiques des vaccins : Les vaccins contre la rubole sont tous fabriqus partir de souches de virus ruboleux vivants attnus. Il existe des prsentations du vaccin isol ou associ : le vaccin rubole monovalent est commercialis sous le nom de Rudivax. Les vaccins associs contre la rubole, la rougeole et les oreillons sont ROR Vax et Priorix. 8-2- Mode dadministration : Isol ou associ, le vaccin se prsente sous forme dune poudre. Il est reconstitu avec 0,5 ml deau pour prparation injectable et peut tre administr par voie intramusculaire ou sous-cutane. 8-3-Politique vaccinale, recommandations : Deux doses de vaccin contre la rubole sont maintenant recommandes aux enfants des deux sexes, en association avec les vaccins contre la rougeole et contre les oreillons.
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La premire dose de vaccin trivalent est recommande 12 mois (et non plus partir de 12 mois) et la deuxime dose au cours de la deuxime anne, soit entre 13 et 24 mois (respecter un intervalle dau moins un mois entre deux injections). Pour les nourrissons entrant en collectivit avant 12 mois, il est recommand dadministrer lge de 9 mois le vaccin contre la rougeole, les oreillons et la rubole. Dans ce cas, la deuxime dose est recommande entre 12 et 15 mois et suffit. Il est recommand un rattrapage pour les jeunes filles et les femmes en ge de procrer. La vaccination contre la rubole est recommande pour les jeunes femmes non vaccines, sans srologie pralable. Si la srologie prnatale de la rubole est ngative ou inconnue, la vaccination doit tre administre immdiatement aprs laccouchement (avant la sortie de la maternit). Labsence dune mise en uvre satisfaisante de cette mesure est responsable dune proportion importante des ruboles congnitales malformatives. Le vaccin contre la rubole nest pas transmis du sujet vaccin un sujet non immun. Il ny a donc pas de risque de transmission entre un vaccin rcent et une femme enceinte.
9-
La vaccination contre les oreillons : Les oreillons sont dus un paramyxovirus dont le rservoir est strictement humain. La
maladie est le plus souvent bnigne, mais certaines complications peuvent ncessiter une hospitalisation. 9-1-Caractristiques des vaccins : Deux souches de vaccin vivant attnu sont essentiellement utilises dans le monde : la souche Jeryl Lynn et la souche Urabe. Le vaccin est toujours combin aux valences rougeole et rubole. Les souches utilises dans les vaccins combins rougeole-oreillonsrubole actuellement commercialiss (ROR Vax et Priorix) sont respectivement la souche Jeryl Lynn et la souche RIT4385 drive de Jeryl Lynn. Le vaccin contient au moins 5 000 units infectantes par dose. 9-2- Mode dadministration: Le vaccin se prsente sous forme de poudre. La suspension vaccinale est reconstitue en injectant le solvant dans le flacon de poudre. Linjection se fait par voie sous-cutane. 9-3- Politique vaccinale, recommandations : Une vaccination efficace ncessite ladministration de deux doses et leffet conjugu dune couverture vaccinale insuffisante et dune exposition plus faible dans lenfance (du fait de la moindre circulation du virus) expose la survenue de cas chez ladolescent ou ladulte jeune. Or, dans cette population, le risque de complications de type orchite ou ovarite et de 185
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leurs ventuelles consquences sur la fertilit est plus frquent. Lobjectif du plan dlimination de la rougeole et de la rubole congnitale nest pas dliminer les oreillons ; il est cependant probable que le calendrier vaccinal, qui comporte deux doses de vaccin trivalent, et les niveaux de couverture vaccinale requis par le plan permettront galement une limination de la circulation du virus des oreillons. Le calendrier de vaccination contre les oreillons est maintenant identique, chez lenfant g de 12 mois, celui de la vaccination contre la rougeole et la rubole. Dans le cadre du programme OMS dlimination de la rougeole et de la rubole congnitale, la premire dose de vaccin trivalent est recommande 12 mois (et non plus partir de 12 mois) et la deuxime dose au cours de la deuxime anne, soit entre 13 et 24 mois ; il est ncessaire de respecter un intervalle dau moins un mois entre deux injections. Pour les nourrissons entrant en collectivit avant 12 mois, il est recommand dadministrer lge de 9 mois le vaccin contre la rougeole, les oreillons et la rubole. Dans ce cas, la deuxime dose est recommande entre 12 et 15 mois et suffit.
10-
La vaccination triple rougeole-oreillons-rubole : Lassociation des vaccins contre la rougeole, les oreillons et la rubole sous forme de
vaccin combin permet de simplifier le geste vaccinal et dtendre la protection confre. Cela est dautant plus important que ces trois maladies font lobjet dobjectifs dlimination au niveau europen. 10-1- Caractristiques des vaccins : Deux vaccins triples sont disponibles : Le vaccin ROR Vax et le vaccin Priorix. 10-2- Mode dadministration : Ces vaccins se prsentent sous forme de poudre. La suspension vaccinale est reconstitue en injectant le solvant dans le flacon de poudre. Linjection se fait par voie souscutane. 10-3- Politique vaccinale, recommandations : La primo-vaccination est recommande lge de 12 mois chez tous les enfants. Une seconde dose de vaccin triple associant rougeole, oreillons et rubole est recommande au cours de la deuxime anne, cest--dire entre 13 et 24 mois (en respectant un intervalle dau moins un mois entre deux injections). Elle peut cependant tre rattrape plus tard. Il ny a aucun risque vacciner un enfant qui aurait eu prcdemment une ou deux de ces maladies ou aurait dj t vaccin ; il sera en outre protg contre les autres maladies.
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Les nourrissons entrant en collectivit doivent tre vaccins ds lge de 9 mois
avec un vaccin trivalent. Quand la vaccination est effectue entre 9 et 11 mois, il est recommand dadministrer la seconde dose entre 12 et 15 mois. Les personnes de plus de 25 ans non vaccines et sans antcdents de rougeole (ou
dont lhistoire est douteuse), dont la srologie est ngative et qui exercent des professions de sant, en formation, lembauche ou en poste, en priorit dans les services accueillant des sujets risque de rougeole grave, doivent recevoir une dose de vaccin trivalent. Les voyageurs non vaccins et sans antcdents de rougeole doivent recevoir une
dose de vaccin triple ; le risque doit tre valu par le mdecin vaccinateur. Le vaccin rougeoleux peut tre utile pour protger un sujet non immun aprs un contage de rougeole, mais seulement dans les 72 heures qui suivent ce contage. La vaccination contre la rubole est recommande pour les jeunes femmes en ge de procrer non vaccines.
II-
Autres vaccins :
1-
La vaccination contre le cholra Le cholra est une maladie infectieuse aigu strictement humaine, due aux souches de
Vibrio cholerae du srogroupe O1 ou O139, qui produisent une puissante entrotoxine thermolabile. Cette toxine cholrique provoque une diarrhe aqueuse profuse entranant une dshydratation dont lintensit conditionne le pronostic vital. 1-1Caractristiques du vaccin : Le vaccin disponible est constitu de Vibrio cholerae O1 (biotype classique et El Tor, srotypes Inaba et Ogawa) tus par la chaleur ou par le formol, et de la sousunit B de la toxine cholrique obtenue par recombinaison gntique (vaccin WC/rBS pour Whole cell/recombinant B subunit). 1-2Mode dadministration, schma de vaccination: La vaccination consiste en ladministration per os de deux doses (adultes et enfants gs de 6 ans et plus) ou trois doses de vaccin (enfants de 2 6 ans) au moins huit jours dintervalle. 1-3Politique vaccinale, recommandations : Ds 1973, lOMS a demand que la vaccination contre le cholra ne soit plus exige daucun voyageur. Sa prescription nest habituellement pas justifie pour les voyageurs chez lesquels le respect des mesures dhygine (hygine alimentaire, lavage des mains) reste la
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meilleure des prventions. Seuls les personnels de sant allant travaille auprs de patients ou en priode dpidmie pourraient en bnficier.
2-
La vaccination contre la grippe : La grippe est une infection respiratoire aigu trs contagieuse, cosmopolite,
saisonnire. Elle est due un virus non spcifique de lhomme, Myxovirus influenzae, dont il existe trois types, A, B et C, tous pathognes, sans immunognicit croise entre eux. Le type A est le plus virulent et le plus pidmiogne. La grippe est une maladie paradoxale, souvent considre comme bnigne par le grand public, car elle est confondue avec des affections pseudo-grippales relevant dautres agents tiologiques, alors quelle est responsable dun nombre lev de dcs, mme au cours des priodes dites inter-pidmiques. Elle constitue donc un problme majeur de sant publique, contre lequel la vaccination reste le principal outil de lutte. 2-1- Caractristiques des vaccins : Les vaccins utiliss sont des vaccins inactivs prpars partir de virus cultivs sur ufs de poule embryonns exempts du virus de leucose aviaire, fragments, inactivs, purifis et concentrs. Les vaccins sont composs soit dantigne de surface du virus grippal, soit de virion fragment. Ils contiennent les souches de virus grippal choisies chaque anne en fonction des donnes pidmiologiques, selon les recommandations de lOMS. 2-2- Mode dadministration, schma de vaccination: Les vaccins classiques sans adjuvants, ayant tous la mme composition, sont les suivants : Agrippal, Vaxigrip etc . Le vaccin est administr par voie intramusculaire aux doses suivantes : Enfants de 6 35 mois : une dose de 0,25 ml. Adultes et enfants gs de plus de 36 mois : une injection de 0,5 ml. Pour les enfants de moins de 8 ans nayant pas t infects ou vaccins auparavant, une seconde dose devra tre injecte au moins quatre semaines plus tard. Un vaccin comportant un adjuvant base de squalne, Gripguard, est recommand pour certains types de patients de 65 ans et plus, en particulier chez les sujets risque de complications associes. 2-3- Politique vaccinale, recommandations : La politique vaccinale vise protger les personnes pour lesquelles la maladie reprsente un danger : personnes ges de 65 ans et plus ; personnes atteintes dune des pathologies suivantes : affections bronchopulmonaires chroniques, dont asthme, dysplasie broncho-pulmonaire et mucoviscidose ; cardiopathies congnitales mal tolres, insuffisances cardiaques graves et valvulopathies graves ; drpanocytoses, thalasso-drpanocytose ; 188
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diabtes insulino-dpendant ou non insulino-dpendant ne pouvant tre quilibrs par le seul rgime ; dficits immunitaires cellulaires (chez les personnes atteintes par le VIH, lindication doit tre faite par lquipe qui suit le patient) ; personnes sjournant dans un tablissement de sant de moyen ou long sjour, quel que soit leur ge ; enfants et adolescents (de 6 mois 18 ans) dont ltat de sant ncessite un traitement prolong par lacide actylsalicylique (essentiellement pour syndrome de Kawasaki compliqu et arthrite chronique juvnile) etc . Lors des pandmies, on constate une mortalit leve chez des sujets sans facteurs de risque identifiables, jeunes ou femmes enceintes. Mais la vaccination grippale est galement recommande aux personnes susceptibles de dissminer le virus, notamment les professionnels de sant, le personnel dinstitutions spcialises et tout professionnel en contact rgulier et prolong avec des sujets risque etc ; elle peut aussi tre justifie pour toutes les personnes dsirant viter lindisponibilit conscutive une grippe. Une forte incitation du personnel soignant vise prvenir la grippe chez des personnes exposes des malades infects, mais aussi des grippes nosocomiales chez les patients.
3b:
La vaccination contre les infections invasives Haemophilus influenzae de type
Les infections Haemophilus influenzae de type b sont frquentes et graves chez les nourrissons et les jeunes enfants avant 5 ans. Le caractre invasif est li une capsule et seules les souches dHaemophilus influenzae b capsules sont responsables des infections svres, alors que les souches non capsules (non b) sont la cause dotites et de surinfections bronchiques. La capsule dHaemophilus influenzae de type b est un polyoside, le polyribosylribitolphosphate ou PRP, qui est lorigine des vaccins Haemophilus influenzae b. Les vaccins Haemophilus ont pour but de prvenir les redoutables formes invasives, tout particulirement les infections mninges, mais nont pas dimpact sur les otites Haemophilus. De plus, ils permettent de diminuer le portage pharyng chez les vaccins et, donc, de diminuer la circulation de Haemophilus influenzae b dans la population. 3-1- Caractristiques des vaccins : La gravit des infections Haemophilus influenzae de type b a justifi la recherche dun vaccin efficace, dont le support est le constituant polyosidique de la capsule du type b. La virulence de cette bactrie est lie au polyribosyl- ribitol-phosphate (PRP) capsulaire, or, ce vaccin ne procurait pas non plus deffet rappel, quel que soit lge. En conjuguant le vaccin PRP des protines, on obtient un meilleur pouvoir immunogne ds les premiers mois de la vie et une rponse immunitaire thymo-dpendante. Quatre vaccins conjugus sont 189
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actuellement disponibles dans le monde et parfaitement tudis / : le vaccin conjugu PRP-T, conjugu lanatoxine ttanique Act-Hib, Hiberix etc . 3-2- Mode dadministration: Le vaccin est reconstitu en injectant la suspension du vaccin combin dans le flacon de poudre du vaccin Haemophilus influenzae de type b conjugu. Il doit tre administr immdiatement aprs reconstitution. Linjection se fait par voie intramusculaire. 3-3- Politique vaccinale, recommandations : Le vaccin Haemophilus influenzae PRP-T est recommand ds lge de 2 mois, en primo-vaccination, en association avec un vaccin DTCP. On pratique trois injections un mois dintervalle ( 2, 3 et 4 mois), avec un rappel 18 mois. Pour les enfants non encore vaccins entre 6 et 12 mois, deux injections de vaccin monovalent suffisent, et le rappel est ncessaire. Pour les enfants gs de 1 5 ans, une seule injection suffit. La vaccination des cas contacts : En cas de contact avec un cas de maladie invasive
(famille ou crche), une vaccination doit tre mise en uvre (schma adapt lge). 4La vaccination contre les infections invasives mningocoque : Depuis lintroduction du vaccin contre Haemophilus influenzae de type b dans limmunisation de lenfance, Neisseria meningitidis se partage avec Streptococcus pneumoniae la responsabilit de la grande majorit des mningites purulentes. Le mningocoque est une bactrie strictement humaine qui ne survit pas dans lenvironnement et dont le rservoir est le nasopharynx de lhomme. La plupart des sujets infects sont des porteurs sains (5 10 % de la population). Il existe deux principes vaccinaux diffrents: les vaccins mningococciques polyosidiques (non conjugus), et les vaccins mningococciques polyosidiques C conjugus. 4-1- Les vaccins mningococciques polyosidiques : 4-1-1- Caractristiques des vaccins : Ces vaccins sont composs de polyosides purifis de la capsule de Neisseria meningitidis : A et C commercialis sous le nom de Vaccin mningococcique A + C polyosidique . Le vaccin ttravalent A, C, Y, W135 commercialis sous le nom Menomune; ce vaccin est rserv lusage hospitalier et aux centres de vaccination habilits effectuer la vaccination amarile. 4-1-2- Mode dadministration, schma de vaccination, conservation : Les vaccins mningococciques polyosidiques se prsentent sous forme de poudre et de solvant et se reconstituent extemporanment. Ils sinjectent par voie intramusculaire ou sous190
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cutane. Ces vaccins sont peu efficaces chez le nourrisson, comme tout vaccin polyosidique non conjugu. Il est conseill de les utiliser seulement partir de lge de 24 mois, sauf contage ou situation particulire. Une personne vaccine est considre comme protge dix jours aprs la vaccination et pour trois ans. Cette dure est plus courte pour les enfants vaccins avant 24 mois. 4-1-3- Recommandations : La faible immunognicit chez le nourrisson et labsence de la valence contre le srogroupe B limitent considrablement les indications de ces vaccins polyosidiques. En cas de contage avec une infection mningococcique A ou C, il est recommand de vacciner, une fois le srogroupe connu, les sujets contacts appartenant lentourage proche du malade et les sujets contacts qui se retrouvent rgulirement et de faon rpte dans la collectivit frquente par le malade, pendant les semaines qui suivent le dernier contact. Le vaccin pourra tre administr aux sujets gs de 6 mois ou plus pour le mningocoque A et gs de 18 mois ou plus pour le mningocoque C. Le Vaccin mningococcique A + C polyosidique : Pour le personnel professionnel. Les autorits sanitaires peuvent dcider dune campagne de vaccination dans des zones dlimites o lincidence du mningocoque du srogroupe C est particulirement leve (cas groups ou pidmie). Pour les voyageurs, le vaccin est recommand en cas de rsidence ou de randonnes dans les zones risques ( ceinture mningitique en Afrique). Depuis 1988, lArabie saoudite exige que les plerins se rendant La Mecque aient t pralablement vaccins. Le vaccin ttravalent A, C, Y, W135 est recommand pour ces plerins en raison dun important contage par des souches du srogroupe W135. 4-2- Les vaccins mningococciques polyosidiques C conjugus : 4-2-1- Caractristiques des vaccins : Les vaccins conjugus disponibles sont : Meningitec, Meninvact, etc. . Ces vaccins sont adsorbs sur sels daluminium. 4-2-2- Mode dadministration, schma de vaccination, conservation : Les vaccins mningococciques C conjugus se prsentent sous forme dune suspension injectable (Meningitec, Neisvac) ou dune poudre et dun solvant (Meninvact, Menjugate). Ils sinjectent par voie intramusculaire. Lavantage de ces vaccins est li la conjugaison, qui permet dtre efficace ds le plus jeune ge et induit une immunit T dpendante, avec possibilit de rponse anamnestique. Le schma vaccinal est variable selon lge: Nourrissons de moins de 1 an : 191
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deux doses de 0,5 ml, injectes au moins deux mois dintervalle partir de lge de 2 mois. Il est recommand quune dose de rappel soit administre aprs la primo-vaccination. Enfants partir de 1 an, adolescents et adultes : une injection unique de 0,5 ml. 4-2-3- Recommandations : Entre 2 mois et 2 ans : le vaccin mningococcique C conjugu est recommand pour
les groupes risque suivants : les enfants porteurs dun (e) : dficit en properdine, asplnie anatomique ou fonctionnelle, dficit en fractions terminales du complment ; les sujets contacts dun cas dinfection mningocoque du srogroupe C; les sujets vivant dans les zones dlimites o lincidence du mningocoque du srogroupe C est particulirement leve. Au del de 2 ans : Lutilisation du vaccin polyosidique ttravalent (A, C, Y, W135) est
recommande pour les enfants porteurs dun dficit en properdine, ou ayant une asplnie anatomique ou fonctionnelle, ou souffrant dun dficit en fractions terminales du complment. Lutilisation de lun ou lautre vaccin mningococcique polyosidique ou conjugu C est recommande pour les sujets contacts dun cas dinfection mningocoque du srogroupe C. Lutilisation dun vaccin mningococcique polyosidique ou conjugu C est recommande, pour les sujets vivant dans les zones dlimites o lincidence du mningocoque du srogroupe C est particulirement leve.
5-
La vaccination contre les infections invasives pneumocoque : Les infections Streptococcus pneumoniae sont dune grande frquence, surtout aux
ges extrmes de la vie. La pneumonie pneumocoque est lune des premires causes de dcs chez lenfant dans les pays en dveloppement. Dans les pays industrialiss, le pneumocoque constitue la premire cause de mningites bactriennes chez lenfant de moins de 2 ans. Chez le nourrisson et le sujet g, la mortalit des infections pneumocoque reste leve. Dautres groupes risque, tels que les drpanocytaires homozygotes, les personnes splnectomises et les personnes souffrant dinfections VIH au stade sida, peuvent aussi dvelopper des formes svres, voire mortelles. On dispose de deux principes vaccinaux pneumococciques diffrents : le vaccin polyosidique conjugu et le vaccin polyosidique non conjugu. 5-1-Caractristiques du vaccin : (vaccin polyosidique non conjugu) La virulence de Streptococcus pneumoniae est lie en grande partie sa capsule de nature polyosidique. Les polyosides capsulaires du pneumocoque induisent chez la souris et chez lhomme une rponse thymo-indpendante, cest--dire que ces antignes ne peuvent se 192
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fixer que sur les rcepteurs des lymphocytes B matures pour induire une rponse anticorps. Cette rponse se caractrise par la synthse dIgM, mais aussi dIgG2 et dIgA. Malheureusement, chez lenfant de moins de 2 ans, limmaturit immunologique explique la faible antignicit du vaccin polyosidique dans cette tranche dge. Le vaccin polyosidique Pneumo 23 contient 25 g de polyoside purifi de vingt-trois srotypes. Chez ladulte, la rponse en anticorps aprs une injection est variable suivant les srotypes. 5-2- Mode dadministration, schma de vaccination: Le vaccin doit tre administr en une seule injection par voie sous-cutane ou intramusculaire. Lintervalle entre deux injections ne doit pas tre infrieur cinq ans (il existe un risque de raction locale importante en cas dinjections rapproches). Chez le sujet immunodprim ou asplnique, o le risque dinfections graves est majeur, un intervalle de trois ans entre deux injections est conseill. 5-3- Politique vaccinale, recommandations : Pour les personnes de plus de 5 ans, la vaccination pneumococcique avec le vaccin polyosidique 23 valent est recommande, tous les cinq ans, chez les sujets suivants : splnectomiss, drpanocytaires homozygotes, patients atteints dun syndrome nphrotique, insuffisants respiratoires, patients alcooliques avec hpatopathie chronique, insuffisants cardiaques, ayant des antcdents dinfection pulmonaire ou invasive pneumocoque. Cette vaccination doit tre propose, lors de leur admission dans des structures de soins ou dhbergement, aux sujets ci-dessus qui nen auraient pas encore bnfici. En cas de splnectomie programme, le vaccin sera administr au moins deux semaines avant lintervention. La prophylaxie par pnicilline associe demeure ncessaire pour les malades drpanocytaires et les asplniques.
6-
La vaccination contre la rage : La vaccination contre la rage a t la premire vaccination mise au point aprs
linoculation de la vaccine par Jenner. Cest dailleurs en hommage Jenner que Pasteur a adopt le terme de vaccination pour son procd de traitement aprs exposition contre la rage. En effet, le traitement antirabique aprs exposition met profit la dure de lincubation de la maladie, gnralement longue, pour immuniser le patient contre le virus qui lui a t inocul. Le traitement antirabique aprs exposition correspond une course de vitesse entre le virus et le systme immunitaire du patient contamin. Cest dans cette optique que la srothrapie est associe au traitement vaccinal dans les contaminations svres.
193
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6-1- Caractristiques des vaccins : Tous sont inactivs. Le vaccin inactiv produit sur culture cellulaire de ligne continue Vero utilisant la souche Wistar Pitman Moore 1503 3M est le Vaccin rabique Pasteur. Lactivit protectrice du vaccin est suprieure ou gale 2,5 UI par dose humaine. Il se prsente sous forme dune poudre en flacon et dun solvant en seringue prremplie (0,5 ml). Le vaccin inactiv produit sur cellules dembryon de poulet utilisant la souche Flury LEP est le vaccin Rabipur. Lactivit protectrice du vaccin est suprieure ou gale 2,5 UI par dose humaine. Il se prsente sous forme dune poudre en flacon et dun solvant en ampoule avec ou sans seringue jetable (1 ml). 6-2- Mode dadministration: La vaccination contre la rage est pratique par voie intramusculaire, dans le deltode chez lenfant et ladulte ou dans la face antrolatrale de la cuisse chez le bb.
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D : Diphtrie ; C : Coqueluche ; HBV : Hpatite virale B ; BCG : Bacille de Calmet et Guerin ; T : Ttanos ; VPO : Vaccin Poliomylitique Oral ; O: Oreillon
195
2me Anne Biologie Rfrences :
Odile Launay. Introduction la vaccinologie clinique Centre dInvestigation Clinique de vaccinologie Cochin-Pasteur Hpital Cochin, Paris DESC maladies infectieuses, 18
octobre 2007
Direction gnrale de la sant Comit technique des vaccinations Guide des vaccinations Edition 2006. Eds inpes Direction gnrale de la sant Comit technique des vaccinations Guide des vaccinations Edition 2008 Eds inpes Une nouvelle politique vaccinale: Vaccination de ladulte J Gaillat Service des maladies infectieuses CH rgion dAnnecy 2008 Philippe KOURILSKY. Concevoir et developper de nouveaux vaccins. COLLGE DE FRANCE - Chaire Dimmunologie Molculaire ; Cours n5 Anne : 2004/2005. Guide Canadien d'immunisation. Principes gnraux dimmunologie et dimmunisation 2004. Guide Canadien d'immunisation. Principes gnraux dimmunologie et dimmunisation 2008. O. Romain. Quoi de neuf en vaccinologie ? Journal de pdiatrie et de puriculture 2007, 20 : 91-97. N. Gurin. Histoire de la vaccination : de lempirisme aux vaccins recombinants. La Revue de mdecine interne 2007; 28 : 3-8. Jean-Louis Koeck. Lapport du laboratoire en vaccinologie. Revue Franaise des Laboratoires 2006 ; 381 :21-22.
196

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