IX - NITROGNIO

Sonia Regina Souza 1/ & Manlio Silvestre Fernandes 2/

1/

Departamento de Qumica-Bioqumica, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro UFRRJ. BR 465, km 7, CEP 23890-000 Seropdica (RJ). soniabq@ufrrj
2/

Departamento de Solos, UFRRJ. manlio@ufrrj.br

Contedo
O NITROGNIO NA NATUREZA ........................................................................................................ 216 ABSORO DE NITROGNIO PELAS PLANTAS ............................................................................ 217 A Absoro de Amnio .................................................................................................................... 219 Transportadores de Amnio ..................................................................................................... 221 Absoro de Nitrato .......................................................................................................................... 222 Transportadores de Nitrato ...................................................................................................... 225 Absoro de Formas Orgnicas de Nitrognio por Plantas ................................................... 226 REDUO DO NITRATO ....................................................................................................................... 227 Nitrato Redutase ................................................................................................................................ 227 Nitrito Redutase ................................................................................................................................. 229 ACMULO E REMOBILIZAO DO NITRATO .............................................................................. 229 ASSIMILAO DO AMNIO ................................................................................................................ 232 Glutamina Sintetase .......................................................................................................................... 234 Glutamato Sintase .............................................................................................................................. 234 Glutamato Desidrogenase ............................................................................................................... 235 VISO GERAL DO METABOLISMO DE NITROGNIO .................................................................. 237 TOXIDEZ DE AMNIO EM PLANTAS ................................................................................................ 238 REMOBILIZAO DE NITROGNIO ................................................................................................. 241 Senescncia ........................................................................................................................................... 241 Enchimento dos Gros ...................................................................................................................... 243 LITERATURA CITADA ............................................................................................................................ 245

SBCS, Viosa, 2006. Nutrio Mineral de Plantas, 432p. (ed. FERNANDES, M.S.).

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O NITROGNIO NA NATUREZA
O N um dos elementos minerais requeridos em maior quantidade pelas plantas e o que mais limita o crescimento. Ele faz parte de protenas, cidos nuclicos e muitos outros importantes constituintes celulares, incluindo membranas e diversos hormnios vegetais. Sua deficincia resulta em clorose gradual das folhas mais velhas e reduo do crescimento da planta; inicialmente, em detrimento das reservas da parte area, a planta promove alongamento do sistema radicular, como uma tentativa de buscar o nutriente (Figura 1). O N 2 representa 78% dos gases da atmosfera; entretanto, a despeito dessa abundncia, h escassez desse nutriente em formas disponveis para as plantas, o que pode ser explicado pela extraordinria estabilidade do N2, que, ao contrrio de outras molculas diatmicas, como O 2, NO ou CO, praticamente no passvel de reaes qumicas em condies naturais. A ligao entre os tomos da molcula de N2 curta (0,1098 nm), o potencial de ionizao de 15,6 eV e a energia de dissociao de 224,5 kcal. Os eltrons do N2 esto em orbitais de baixa energia, e o mais elevado orbital molecular efetivamente preenchido um orbital , no centro da molcula. Nessas condies, a reatividade qumica da molcula extremamente baixa. Chatt & Leigh (1968) observaram: No existe nenhum agente oxidante que seja suficientemente forte para oxidar N2 em condies ambientais, nem mesmo fluoreto. Nenhum agente redutor que seja suficientemente forte para reduzir o N2 pode existir em meio aquoso, porque a gua seria preferencialmente reduzida, produzindo hidrognio.

Teores de N-NO 3 , mmol L-1

Figura 1. Folhas e razes de plantas de arroz cultivadas em soluo nutritiva com 0,0, 0,1 e 0,5 mmol L-1 de N-NO3-.

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Existe um aporte de N aos solos por meio do arraste, pela chuva, dos xidos de N produzidos na atmosfera por descargas eltricas. Entretanto, a maior parte do N disponvel nos solos para a nutrio de plantas obtida por meio de fixao biolgica um processo complexo que envolve a enzima nitrogenase presente em bactrias. A mineralizao dessas plantas fixadoras contribui para a disponibilidade de N mineral para as outras culturas. Embora a simbiose bactria-leguminosa seja o principal sistema responsvel pela fixao de N2, observou-se que a fixao biolgica de N2 (FBN) tambm pode ocorrer na rizosfera de gramneas. A fixao de N2, tanto simbitica quanto associativa, foi abordada no captulo VI, neste volume. Os estudos do N em plantas indicam uma tendncia para o mximo de economia, via complexo sistema de absoro, assimilao e remobilizao desse nutriente nos tecidos das plantas, de modo a evitar desperdcios. O desenvolvimento desses mecanismos, por meio de processos de seleo, indica progressiva adaptao das plantas a condies ambientais caracteristicamente deficientes em N.

ABSORO DE NITROGNIO PELAS PLANTAS

O N est disponvel no solo em diversas formas, incluindo amnio, nitrato, aminocidos, peptdios e formas complexas insolveis. As espcies vegetais diferem na sua preferncia por fontes de N, mas o absorvem principalmente sob formas inorgnicas, + como nitrato (NO3 ) ou amnio (NH4 ) (Williams & Miller, 2001). O NO3 absorvido pode ser reduzido a NH4 , por meio da ao seqencial das enzimas nitrato redutase e nitrito redutase. O NO 3 tambm pode ser acumulado no vacolo ou exportado para outras partes da planta. O transporte para as folhas ocorre via xilema, embora a redistribuio a partir das folhas para outros rgos ocorra predominantemente na forma de aminocidos, via floema. Essa redistribuio essencial para suprir os tecidos que no participam na assimilao de N. O NH4 absorvido ou o proveniente da reduo do NO3 imediatamente incorporado em esqueletos de C preferencialmente por meio das enzimas da via glutamina sintetase+ glutamato sintase (GS-GOGAT). Tanto a reduo do NO3 quanto a assimilao do NH4 requerem energia na forma de ATP e poder redutor, como o NADH, o NADPH e a ferredoxina reduzida, bem como esqueletos de C derivados do ciclo de Krebs, como o -cetoglutarato. Esses processos drenam tanto esqueletos de C quanto energia e doadores de eltrons, competindo com o metabolismo do C. Quando ocorre a assimilao do N nas razes, aminocidos so transportados para as folhas via fluxo transpiratrio, pelo xilema (Marschner et al., 1995). O N tambm pode ser transportado atravs da membrana plasmtica de certas clulas, em outras formas, como peptdios menores e as bases purinas e pirimidinas e seus derivados (Gillissen et al., 2000). Na natureza, as concentraes de NH 4 e de NO3 podem variar grandemente em funo de inmeros fatores inerentes a caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas do
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+ + +

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solo. As plantas desenvolveram ao longo de sua histria evolutiva, em suas membranas celulares, protenas transportadoras que permitem a aquisio desses nutrientes a partir de concentraes bastante variveis. As plantas absorvem o NO3- e o NH4+ em processos dependentes de energia. H uma bomba de prtons na plasmalema, P-H+ATPase, que hidrolisa ATP, bombeando H+ para fora da clula, o que cria um gradiente de potencial eletroqumico, que composto do potencial eltrico atravs da membrana () e da diferena de potencial qumico para o on NH4 + ou NO 3- ( NH4 + ou NO3-) entre o interior e o exterior da clula (ver item Assimilao do Amnio deste volume). O gradiente de prtons gera uma fora prton motriz, direcionando os H+ do exterior da clula para o citossol. O gradiente de potencial eletroqumico contribui favoravelmente para a entrada de ctions na clula, ao passo que os nions so absorvidos acompanhando o fluxo de prtons. Desse modo, a absoro do NH4+ passiva e acontece atravs de um transportador do tipo uniporte, enquanto a absoro do NO 3- um processo ativo secundrio, em simporte com 2 H+ (Figura 2). As protenas transportadoras de NO3- ou NH4+ podem ter maior ou menor afinidade pelo on transportado; desse modo, eles formam nas plantas os sistemas de absoro,

H H
+

Citossol ATP

Membrana Plasmtica

1 H H
+ +

ADP + Pi NH
+ 4

H H
+

NH

+ 4

NH4+ 3 NH4
+

NH4+

NO3

NO3 NO3
-

NO3

NH

+ 4

NH4

2H
-

NO3

NO3

NO

Figura 2. Absoro de nitrato (NO3-) e amnio (NH4+ ) atravs da membrana plasmtica. (1) bomba de prtons (P-H+ATPase); (2) transportador de NO3- (simporte) ; (3) transportador de NH 4+ (uniporte). (potencial eltrico atravs da membrana); NH4 + ou NO3(respectivamente, diferena de potencial qumico para o on NH4+ ou NO3-, entre o interior e o exterior da clula).

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que so denominados de: sistema de transporte de alta afinidade (HATS high affinity transport system) ou sistema de transporte de baixa afinidade (LATS low affinity transport system). A concentrao de 1 mmol L-1 de NH4+ ou NO 3- pode, de modo geral, ser tomada como um limite de concentrao abaixo do qual opera o sistema de alta afinidade (HATS), e acima do qual opera o sistema de baixa afinidade (LATS):

< [ 1 mmol L-1 ] > (NH4+ ou NO3 -)

Os transportadores de NO3- do sistema de alta afinidade so passveis de induo (iHATS), embora exista tambm um sistema de alta afinidade constitutivo (cHATS). Os sistemas de transporte de NO 3- de baixa afinidade (LATS) so todos constitutivos. Os sistemas de transporte de NH 4+ tambm so de alta (passveis de induo) e de baixa afinidade (constitutivos). A induo dos genes que codificam para as protenas transportadoras de NO3- do sistema iHATS estimulada pela presena de NO 3- no meio, ao passo que os sistemas transportadores de NH 4+ so induzidos pela ausncia de NH4+ no meio externo. As protenas transportadoras de NH4+ so codificadas por uma famlia multignica e apresentam ampla variao de padres de cintica de absoro; esse fato demonstra a plasticidade das plantas para a aquisio de formas reduzidas de N, que devem ter sido abundantes durante certo perodo na evoluo das plantas superiores. Por sua vez, a existncia de transportadores constitutivos na faixa do LATS e passveis de induo na faixa do HATS pode sugerir uma gradual, porm contnua, adaptao a condies ambientais caracterizadas pela passagem da predominncia de formas reduzidas para formas oxidadas de N e uma progressiva reduo na disponibilidade de N mineral em ambientes de terra firme. Dentro dessa linha de raciocnio, de se esperar que plantas adaptadas a ambientes de baixa disponibilidade natural de nutrientes, especialmente N, acionem com maior facilidade sistemas de transporte de alta afinidade.

A Absoro de Amnio
Evidncias indicam que o on amnio (NH 4+) a forma absorvida pelas plantas e no o gs amnia (Ludewig et al., 2002). A amnia (NH3) uma base fraca (pK = 9,25); desse modo, como o citossol tem em mdia pH 7,2, aproximadamente todo o N-amoniacal nesse compartimento est na forma protonada de NH4+. A absoro de NH 4+ feita por um sistema bifsico. Quando os nveis de NH4+ no meio externo (soluo nutritiva ou soluo do solo) so baixos, opera um sistema de
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absoro de alta afinidade (HATS), mediado por uma protena transportadora do tipo uniporte e que mostra cintica de saturao. J em concentraes elevadas de NH4+ no meio externo entra em funcionamento o sistema de baixa afinidade (LATS), sendo a concentrao de 1 mmol L-1 de NH4 + o limite abaixo do qual opera o sistema de alta afinidade (HATS), e acima do qual opera o sistema de baixa afinidade (LATS). HATS e LATS so protenas integrais, com 12 hlices que atravessam a membrana, separadas por uma regio hidroflica em dois domnios de seis hlices. Na faixa de absoro do sistema de alta afinidade (HATS) os valores da velocidade mxima (Vmx) diminuem, enquanto os da constante de Michaelis-Menten (Km) aumentam, acompanhando o aumento dos teores de N-NH4 + na soluo externa, o que levou Wang et al. (1993) a concluir que esses parmetros cinticos resultam da combinao dos dois mecanismos de absoro (sistema de alta afinidade + baixa afinidade). Em milho, milheto e cevada o sistema de alta afinidade mostrou cintica de saturao em plantas que foram cultivadas sob concentraes externas de NH4 + entre 0,1 e 1,0 mmol L-1. Em arroz, foi observada velocidade de absoro de NH4+ (Vmx) em torno de 5,2 e 5,4 mol g -1 h-1 (peso de razes frescas) (Kronzucker et al., 1998). Baptista et al. (2000) observaram, em duas variedades de arroz, valores de Km de 0,51 e 0,58 mmol L-1, quando se utilizaram 20 mg L-1 de N-NH4+ na soluo nutritiva. Quando as plantas foram submetidas a 80 mg L-1 de N-NH4+, o Km aumentou para 3,5 e 4,5 mmol L-1, respectivamente. Wang et al. (1993) estimaram o influxo lquido de NH4+ em arroz (influxo-efluxo) em 1,32, 6,08 e 10,16 mol g-1 h-1 (peso de matria fresca, quando sob concentraes externas de NH4 + de 2, 100 e 1.000 mol L -1, respectivamente). Em tomate, Ludewig et al. (2002) observaram que o Km do transportador HATS para NH4+ variou em funo do potencial de membrana, sendo muito menor (4 vezes) a -140 mV do que a -40 mV. semelhana do que ocorre com a absoro de outros ctions, como o K+, vrios fatores afetam a absoro de NH4+. H ento um sistema de transporte que positivamente influenciado pela ao da luz (ocorre duplicao no total absorvido, em relao a plantas no escuro) e negativamente influenciado por inibidores metablicos e hipoxia. Alm disso, preciso levar em considerao que a absoro de NH4+ passvel de inibio por feedback. Com o aumento dos teores de NH4+ na soluo externa (0,002 a 1 mmol L-1), aumenta o efluxo de NH4+ das razes, de modo que o influxo lquido pode cair de 89 % em plantas sob 0,002 mmol L-1 de NH4+ para 80 % em plantas sob 1 mmol L-1 de NH4+. Um processo de efluxo contnuo de NH4+ sugerido como uma caracterstica do processo de absoro de N-NH4 + por plantas. O NH4+ absorvido por razes de arroz pode tambm ser compartimentalizado, acumulando no vacolo. Wang et al. (1993) observaram que, em 30 min, cerca de 20% do NH4+ absorvido acumulou no vacolo, enquanto 41 % do total permaneceu no citoplasma, 19 % foi assimilado e 20 % saiu das razes para o meio externo por efluxo.
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Transportadores de Amnio Estudos moleculares identificaram uma famlia de genes que codificam para os transportadores de amnio (AMT, ammonium transporter) e que operam na membrana plasmtica das plantas (Figura 3). Esse grande nmero de transportadores de uma mesma famlia permite ao organismo adequar-se s mltiplas condies de concentrao de NH4 + no meio externo e aumenta a eficincia da planta como um todo. O sistema AMT de transporte de NH4+ em plantas especfico. Por exemplo, os ons K , Rb+ e Cs+ no interferem na absoro do NH4+. O sistema AMT do tipo uniporte, e o transporte de NH4+ passivo (a favor do gradiente de potencial eletroqumico gerado pelas P-H+-ATPases da membrana) (Figura 2).
+

Os membros da famlia de transportadores AMT1 so responsveis pelo transporte de alta afinidade em plantas (HATS), e os AMT2, pelo transporte de baixa afinidade (Figura 3). Em Arabidopsis, um dos transportadores codificados por essa famlia de multigenes, o AtAMT1;1, parece ser responsvel pela absoro de NH4+ quando o N est em baixas concentraes no meio externo. Foi observado em Arabidopsis que a deficincia de NH4+ no meio resulta em rpido incremento da transcrio do gene AtAMT1. Essa transcrio diminui rapidamente com o aumento de NH 4+ no meio. A queda nos nveis do RNA mensageiro do gene que codifica para o transportador AtAMT1 parece ser causada principalmente pelo acmulo de glutamina nos tecidos. O nmero de transportadores da famlia AMT em arroz muito maior do que em Arabidopsis e em tomate, o que indica que cada planta forma o seu sistema de transporte de acordo com as presses seletivas a que foi submetida (Loqu & von Wren, 2004). O sistema de transporte de NH 4+ de alta afinidade (HATS) mostra cintica de saturao, com Km tipicamente abaixo de 100 mol L-1. Como mencionado anteriormente, a atividade desses transportadores depende do gradiente de potencial eletroqumico gerado atravs da membrana plasmtica.

AMT1 HATS < 1 mmol L-1 AMT AMT2 LATS > 1 mmol L-1

AMT1.1 AMT1.2 AMT1.3 AMT1.4 AMT1.5

AMT2.1

Figura 3. Famlias de transportadores de NH4+ (AMT, ammonium transporter), de alta (AMT1) e baixa afinidade (AMT2).

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Quando plantas so submetidas deficincia de NH4+, o AtAMT1;1 o transportador que mais aumenta de atividade, enquanto AtAMT1;2 e AtAMT1;3 mantm-se constantes, o que mostra que, sob deficincia, o transportador de maior afinidade que transcrito. O sistema de transporte de baixa afinidade (LATS) aparentemente no saturvel e no indica ser passvel de regulao por produtos do metabolismo de N. O gene do primeiro transportador de NH4+ a ser isolado foi o AtAMT1;1, em Arabidopsis thaliana. Depois foram isolados em Arabidopsis os genes de outros membros da famlia AMT1: AtAMT1;2, AtAMT1;3, AtAMT1;4 e AtAMT1;5. Um outro gene, o AtAMT2;1, tambm j foi identificado. Genes homlogos ao AMT foram localizados em arroz: OsAMT1;1, e em tomate: LeAMT1;1/ LeAMT1;2/ e LeAMT1;3. Ludewig et al. (2002) demonstraram que o gene LeAMT1;1 de tomate codifica para uma protena transportadora do tipo uniporte (AMT1;1). A existncia desses diversos sistemas de transporte de NH4+, controlados por vrios genes, uma indicao da importncia da nutrio amoniacal para as plantas. Embora os genes AMT1 sejam normalmente expressos nas razes das plantas, os genes que codificam para os transportadores AMT1;1 e AMT1;2 tambm so expressos na parte area, o que mostra a importncia desses transportadores no processo de reassimilao do NH4+ produzido na parte area das plantas, principalmente como conseqncia da fotorrespirao. O influxo de NH4+ em plantas mostra uma variao circadiana. O mximo de absoro ocorre ao fim do perodo luminoso, e uma queda acentuada no ritmo de absoro ocorre aps o incio do perodo escuro (von Wirn et al., 2000).

Absoro de Nitrato
A absoro de NO 3- ativa, ou seja, ocorre contra um gradiente de potencial eletroqumico, e uma ampla variao de Km aparente foi observada para espcies vegetais distintas, indicando diferenas de presso seletiva nos diversos ambientes em que essas espcies vivem. Epstein (1972) cita a alga marinha Skeletonemas notatum, cujo Km aparente para NO3- de 0,4 mol L-1, enquanto em arroz (O. sativa), uma planta de terra firme, o Km aparente de 0,6 mmol L-1. Experincias feitas com diferentes concentraes externas de NO 3- demonstraram que a absoro de NO3- mediada por dois sistemas de transporte atravs da membrana plasmtica, ambos co-transportadores (Glass et al., 1992; Siddiqi et al., 1990), ou seja, a absoro de NO3- bifsica. O primeiro seria um sistema de transporte de NO 3- de baixa afinidade (LATS), que se torna funcional sob condies de elevadas concentraes externas de NO3- (> 1 mmol L-1). O outro um sistema de absoro de alta afinidade (HATS), que funcional em concentraes menores que 1 mmol L-1. Esses sistemas so aditivos. O sistema de baixa afinidade (que opera a elevadas concentraes de NO 3- ) constitutivo (cLATS), enquanto o de alta afinidade (que opera a baixas concentraes de NO3 -) passvel de induo pelo substrato NO3- (iHATS).
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Em baixas concentraes externas, o sistema de absoro de alta afinidade saturvel. Em cevada, esse sistema de alta afinidade mostra Km aparente na faixa de 10 a 100 mol L-1. Em milho, foi observado Km aparente de 50 mol L-1 para o sistema de alta afinidade. Estudos feitos em cevada por Siddiqi et al. (1990) mostraram que na faixa de concentrao externa que vai de 5 mol L-1 a 0,5 mmol L-1 o transporte de NO3 obedece cintica de Michaelis-Menten, mostrando saturao com o aumento na concentrao externa de NO3 . No sistema de baixa afinidade ([NO3-] > 1 mmol L-1) a velocidade de absoro de NO3 aumenta linearmente com o aumento da concentrao externa. A soma dos dois sistemas mostra claramente a existncia de um sistema bifsico para a absoro de NO3 . Embora o sistema LATS no mostre cintica de saturao, muito pouco provvel que se trate de um sistema passivo de transporte. Clculos feitos por Crawford (1995) mostram que, com potencial de membrana de -110 mV e concentrao externa de 2 mmol L-1, para que houvesse transporte passivo de NO 3 , a concentrao citosslica desse on deveria estar em torno de 28 mol L-1. Na prtica, as concentraes citosslicas obtidas experimentalmente so milhares de vezes maiores. Em Arabidopsis, LATS transporta NO3 a velocidades que variam de 4 a 700 mol g-1 h-1 (peso de razes frescas). O sistema LATS foi caracterizado como constitutivo e insensvel a inibidores metablicos. A absoro de NO 3 controlada por feedback. Teores elevados de NO2 , NH4+ e aminocidos livres no citossol inibem a absoro de NO 3 . Em citros, a absoro de NO 3 foi fortemente afetada pelo pH do meio externo. Aumentos do pH externo de 4,0 para 7,0 reduziram drasticamente a absoro de NO3 . Por outro lado, quando as razes de citros foram submetidas a inibidores de P-H+-ATPases (DCCD ou DES), tambm observaram-se redues significativas na absoro de NO3 (Cerezo et al., 2000). Fried et al. (1965), usando NH4+ e NO 3 marcados (15N), observaram que o arroz absorve NH4+ mais rapidamente medida que o pH da soluo nutritiva aumenta, situando-se o pH timo em torno de 8,5. Para NO 3 , entretanto, foi observada absoro mais rpida medida que o pH diminua, situando-se o pH timo em torno de 4,0. Para qualquer dos nveis intermedirios entre esses dois valores, no entanto, a absoro de NH4 + pelas plantas era sempre maior que a de NO3 . Por exemplo, a um pH de 5,5, as -1 razes de arroz absorvem 300 g g de N do tecido seco, quando NH4+ foi usado, ao passo que, quando se usou NO3 , as razes absorveram apenas 68 g g -1 de N do tecido seco. O pH da soluo externa (de 4,5 a 9,0) teve pouco efeito sobre a absoro de NH4+ via sistema de alta afinidade (0,1 mmol L-1 de NH4+), mas teve efeito acentuado sobre a absoro de NH4+ pelo sistema de baixa afinidade (pH acima de 6,0). Por sua vez, a reduo do pH para 3,0 resultou numa reduo drstica da absoro de NH4+ tanto pelo sistema de alta como de baixa afinidade. Nielsen & Schoerring (1998) observaram que no espao livre aparente da parte area de colza ocorria queda de 30 % nos teores de NH4 + com a variao de cada unidade de pH entre 5,0 e 8,0.
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Mesmo em pH 4,0, quando a absoro de NO3- atinge o seu mximo, se NH4+ e NO 3 estiverem em concentraes equimolares, as plantas ainda absorvem de 5 a 10 vezes mais N como NH4+ do que como NO3-. Syrett (1956) observou que clulas de clorela, quando expostas a altas concentraes de N, tanto na forma de NH4+ como na de NO3-, absorveram 4 a 5 vezes mais N no primeiro caso. A absoro de NH4+ por plantas , portanto, mais rpida do que a de NO3 sob amplas condies de variao ambiental. Em cevada, foi observada a absoro de NO 3- de 1,8 a 2,1 mol g-1 h-1 de N no tecido fresco sob condies normais de nutrio. Entretanto, plantas submetidas previamente deficincia de N mostraram velocidades de absoro de NO 3 (Vmx) de 9,6 a 10,1 mol g -1 h-1 no tecido fresco (Sidiqqi et al., 1990). Em algodo, Aslam et al. (1997) observaram que, medida que a concentrao de NO3 na soluo externa era aumentada de 0,05 at 1,00 mmol L-1 , as velocidades de absoro de NO3 variavam desde 2,0 at 7,0 mol g-1 h-1 no tecido fresco. Em trigo, foram observadas velocidades de absoro de 2,0 a 2,6 mol g-1 h-1 no tecido fresco, dependendo de haver ou no pr-induo do sistema de transporte pela presena de NO 3- no meio. A velocidade de absoro de NO3 - varia no apenas com a espcie estudada, mas tambm depende da concentrao externa de NO3 , da pr-incubao (com NO3 ) dos sistemas transportadores e de controles (inibio) por feedback exercidos no apenas pela concentrao interna de NO 3 , mas tambm por substncias resultantes do metabolismo de N-NO3 nas plantas. A absoro de NO 3 causa inicialmente uma despolarizao no potencial da membrana (). Essa despolarizao inicial seguida de repolarizao e, em alguns casos, at de uma hiperpolarizao. Esse ltimo efeito deve-se ao estmulo que a despolarizao inicial causa sobre os mecanismos de extruso de prtons atravs das P-H+-ATPases. A despolarizao inicial deve-se ao fato de que a absoro de NO 3 um + processo termodinamicamente ativo. um simporte, com uma relao 2H /NO 3 (Figura 2). Em algumas plantas essa despolarizao inicial pode ser pequena (da ordem de 10 mV ou menos), mas em cevada foram observadas despolarizaes da ordem de 40 mV poucos minutos aps a exposio das plantas ao NO3- externo e antes de se observar o estmulo atividade das H+-ATPases e a conseqente extruso de H +. Os efeitos de NO3 sobre o potencial da membrana () podem ser observados na faixa de pH que vai de 4,4 a 7,0. Em pH = 8,0 as plantas no mais responderam presena de NO3 no meio externo. Quando o pH da soluo foi reajustado para 6,0, a atividade eltrica das membranas reapareceu aps 30 min (McClure et al., 1990). Esses pesquisadores mostraram que o transporte de NO3 em razes de milho foi sendo inibido medida que o pH da soluo externa aumentava de 4,4 at 8,0. Acima de pH = 8,0 o transporte de NO3 cessou completamente. Alm disso, em pH = 8,0 as razes no apresentaram variao no potencial da membrana em resposta concentrao externa de NO3 .
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Esses resultados contribuem para demonstrar que a fora prton motriz (p) realmente responsvel pelo transporte de NO3- atravs das membranas. Isso explica em parte por que a velocidade de absoro de NO 3- aumenta medida que o pH da soluo externa diminui. preciso considerar que, do ponto de vista energtico, o primeiro passo para a absoro de NO 3- ser a extruso ativa de H+ pelas bombas de prtons da membrana plasmtica (P-H+-ATPases), de modo que seja criado um gradiente de H+ (H+) entre o apoplasma e o interior da clula. Considerando como vlida a relao 1 H+: 1 ATP, sero necessrios 2 mol de ATP para cada mol de NO3- absorvido (Figura 2). preciso levar em conta, entretanto, que nesses clculos de custos energticos de absoro de nions a concentrao relativa dos nions dentro e fora da clula tem papel fundamental (ver captulo V neste volume). Mudanas no pH do meio devidas absoro de ons por razes de cevada foram constatadas por Hoagland & Broyer (1940). As observaes de vrios pesquisadores indicam que a absoro diferencial de nions ou ctions resulta em aumento ou reduo do pH do meio, respectivamente (Moore, 1974). Na absoro de excesso de nions (NO3no caso), o sistema de co-transporte 2H+/NO3- resulta no aumento do pH da soluo externa. No caso especfico do N, variaes drsticas no pH foram observadas quando arroz foi cultivado em soluo nutritiva em que N estava presente na forma amoniacal (Karim & Vlamis, 1962); esses autores s conseguiram obter crescimento das plantas quando um excesso de CaCO 3 foi includo na soluo nutritiva. A mesma tcnica foi empregada por Fernandes (1974), usando concentraes elevadas de N-NH 4+ (150 mg L-1) em soluo nutritiva. Variaes de pH de 6,1 a 4,3 foram observadas em laboratrio (resultados no publicados), quando arroz (4 plantas por 2 L de soluo nutritiva) foi mantido por 90 h em uma soluo nutritiva com 5 mg L-1 de N-NH4+. As variaes de pH (aumento) obtidas + quando NH4 foi substitudo por NO3 no foram to elevadas. Transportadores de Nitrato A absoro de NO3- feita por meio de sistemas de absoro de alta (HATS) e baixa afinidade (LATS). Os transportadores do tipo LATS so constitutivos, enquanto o sistema de absoro de NO3- de alta afinidade (HATS) tem um componente constitutivo (cHATS) e um outro passvel de induo (iHATS). Cada um dos trs sistemas propostos para a absoro de NO 3 (cHATS, iHATS, LATS) pode consistir, ou no, de diversos transportadores, geneticamente diferentes. Transportadores do tipo cHATS e iHATS podem ser expressos simultaneamente e responder ao aumento das concentraes externas de NO3- com aumento de atividade (upregulation). A induo do sistema iHATS pode ser feita tanto por NO 2- como por NO3-. Foi observado em cevada que o sistema iHATS pode aumentar sua atividade em at 30 vezes em relao ao cHATS, como resposta ao aumento da concentrao externa de NO3 . Estudos moleculares em Arabidopsis localizaram uma famlia de transportadores de NO 3- codificada pelos genes NRT (Nitrate transporter). Nessa famlia, os genes NRT1 codificam para os transportadores do sistema de baixa afinidade e os genes NRT2 para
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os sistemas de alta afinidade. Em Arabidopsis, dois membros da famlia NRT2, AtNRT2.1 e AtNRT2.2, corresponderiam ao sistema iHATS, enquanto AtNRT2.3, AtNRT2.4, AtNRT2.5, AtNRT2.6 e AtNRT2.7 corresponderiam ao sistema cHATS (Figura 4). A expresso dos genes para NRT2 estimulada pela presena externa de NO3 - e reprimida pela presena interna de glutamina. Entretanto, h um gene, AtNRT2;5, que, ao contrrio dos outros, inibido pela adio de NO3 (Okamoto & Okada, 2004).

Absoro de Formas Orgnicas de Nitrognio por Plantas

Em plantas superiores, a capacidade de absorver formas orgnicas de N (N-orgnico) foi estudada por Virtanen & Linkola (1946). No entanto, esses estudos foram limitados a certos grupos de plantas, leguminosas entre elas. Foi observado que alguns aminocidos, quando usados como nica fonte externa de N, causavam crescimento anormal em plantas. Em geral, as formas orgnicas de N no so consideradas como fonte direta importante de N para as plantas, em condies de cultivos de campo. A absoro de aminocidos feita via simporte, com prton, e depende, portanto, da formao de gradientes de H+ e gerao de fora prton motriz pelas P-H+-ATPases. Tambm existe a sugesto de que plantas como o arroz possam absorver diretamente protenas (Yamagata & Ae, 1999). Nsholm et al. (1998) observaram a absoro de N-orgnico por rvores e arbustos de florestas boreais. Esse mecanismo seria importante nessas regies, onde a baixa temperatura impede a mineralizao do N-orgnico. Glicinas marcadas no C e no N foram absorvidas pelas plantas e usadas como fonte de N para o crescimento. Aparentemente, esse processo mediado pela micorrizao.

NRT2
cHATS

NRT2
HATS

NRT2.3 NRT2.4 NRT2.5 NRT2.6 NRT2.7 NRT2.1 NRT2.2

[NO3-] < 1 mmol L-1 NRT NRT1

LATS

NRT2
iHATS

[NO3-]

> 1 mmol

L-1

NRT1.1 NRT1.2

Figura 4. Sistemas de absoro de NO 3- (NRT: Nitrate transporter) de alta (NRT2) e baixa afinidade (NRT1). cHATS (constitutivos); e iHATS (induzveis).

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Okamoto & Okada (2004) observaram o efeito positivo de fontes de N-orgnico (farelo e palha de arroz) no crescimento de sorgo e arroz, enquanto milho e milheto so menos afetados e respondem melhor ao N-mineral. Esses autores sugerem que as necessidades de N do sorgo podem ser supridas com a absoro de protena da soluo do solo e que o arroz tambm poderia recorrer a essa fonte complementar, quando h deficincia de N-mineral no solo.

REDUO DO NITRATO
O nitrato a principal fonte de N para a maioria das plantas, especialmente para cereais e culturas granferas. As plantas no assimilam N em alto estado de oxidao; desse modo, quando NO 3 + absorvido, ele s ser assimilado se for primeiro reduzido a NH4 .
+ -

A converso de NO3 em NH4 ocorre em duas etapas, por meio de uma reduo que requer oito eltrons. O N passa do estado de oxidao (+5) para (-3). Inicialmente ocorre no citossol a reduo do NO3- a NO3 com o uso de dois eltrons, transferidos das coenzimas NADH ou NADPH, catalisadas pela enzima nitrato redutase (NR). Em seguida, o NO 2 transportado para os cloroplastos nos tecidos + fotossintetizantes ou para os plastdios nas razes, sendo ento reduzido a NH4 , por meio da enzima nitrito redutase (NiR), com transferncia de seis eltrons doados pela ferredoxina reduzida (Figura 5).
-

Nitrato Redutase
A nitrato redutase (EC. 1.6.6.1) a primeira enzima na via de reduo de NO 3 pelas plantas e representa a etapa limitante e reguladora desse processo (Beevers & Hageman, 1969; Campbell, 1988, 1999).
-

C l o ro p l a st o (plastdeo) Citossol

Figura 5. Reduo do nitrato (NO 3- ) a nitrito (NO2-) no citossol pela enzima nitrato redutase e do NO2- a amnio (NH4+) por meio da nitrito redutase no cloroplasto (plastdeo).

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Nas plantas superiores, algas e fungos, as NRs so consideradas enzimas solveis localizadas no citoplasma (Hageman & Bellow, 1990; Kleinhofs & Warner, 1990), embora tenha sido identificada em razes de milho e cevada uma forma de NR ligada membrana plasmtica. Essa isoforma da NR ancorada na face externa da membrana plasmtica referida como um possvel sensor para o NO3- (Forde & Clarkson, 1999). A NR encontrada em muitas plantas e rgos, principalmente quando NO3 a fonte de N. A atividade da NR pode ocorrer no citoplasma tanto de razes como de folhas (Hageman & Bellow, 1990); normalmente, a atividade da enzima NR alta nas folhas. No entanto, segundo Campbell (1999), algumas plantas tm pouca ou nenhuma atividade da NR nas folhas, havendo maior atividade nas razes. A NR pode tambm ser encontrada em um tipo de clula particular, como ocorre em folhas de plantas C4, onde a enzima est localizada somente nas clulas da bainha vascular. A NR um homotetrmero formado por dois dmeros simtricos. Cada tetrmero ativo, em baixas concentraes da enzima, dissocia-se em dmeros ativos, sem que ocorra perda significativa de atividade, sugerindo que a associao/dissociao no exerce papel na regulao da atividade da enzima. Dois eltrons so necessrios para a reduo do NO3 a NO2 pela NR; esses eltrons podem ser fornecidos pelo NADH ou NADPH. O NADH o principal doador de eltrons para a NR na maior parte das plantas superiores e algas eucariticas, enquanto somente os fungos utilizam NADPH. Entretanto, algumas plantas superiores (arroz, milho, cevada, soja) e algumas espcies de algas podem utilizar tanto o NADH quanto o NADPH como doador de eltrons para a NR, sendo chamadas de plantas NAD(P)H-NRs biespecficas (Kleinhofs & Warner, 1990). Todas as NRs eucariticas contm trs grupos prostticos na proporo estequiomtrica de 1:1:1, por subunidade: flavina adenina dinucleotdeo (FAD), citocromo b557 e co-fator Mo (molibdnio associado com a pterina, formando complexo molibdopterina). Segundo Kleinhofs & Warner (1990), o fluxo de eltrons na NR ocorre da coenzima NAD(P)H atravs do FAD, citocromo b557 e co-fator Mo, chegando finalmente ao NO3-, que reduzido a NO2- (Figura 6).
-

Figura 6. Esquema da transferncia de eltrons na enzima nitrato redutase. Os eltrons doados pelo NAD(P)H so transferidos pelo FAD, citocromo b557 e co-fator molibdnio-pterina at chegarem ao NO3-, que ento reduzido a NO 2-.

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Como a NR est localizada no citoplasma, a fonte primria de poder redutor para a formao de NADH (forma reduzida) seria proveniente da degradao de acares (Beevers & Hageman, 1969), provavelmente por meio da via glicoltica durante a oxidao do gliceraldedo 3-fosfato a 1,3 bisfosfoglicerato, que catalisada pela enzima gliceraldedo 3-fosfato desidrogenase citosslica (Klepper et al., 1971). Em tecidos fotossintetizantes, o poder redutor requerido para a atividade da NR parece ser derivado do NADPH produzido nos cloroplastos pela etapa luminosa da fotossntese. Atravs de sistemas especiais de transporte de eltrons entre o cloroplasto e o citossol, os eltrons do NADPH reduzem o NAD+ citoplasmtico a NADH, que, dessa maneira, poder ser usado pela NR e outras reaes de reduo do citossol (Hageman & Bellow, 1990; Oaks & Yamaya, 1990).

Nitrito Redutase
O NO 3 produzido pela reao da nitrato redutase txico, devendo, portanto, ser prontamente metabolizado. A reduo do NO 2- a amnio ocorre pela ao da enzima nitrito redutase (NiR), que transfere seis eltrons de seis molculas de ferredoxina + reduzida (Fdred) para o NO2 , produzindo NH4 (Figura 5). A NiR est localizada nos cloroplastos da parte area ou nos plastdios das clulas radiculares. Nos cloroplastos (presena de luz) a ferredoxina reduzida produzida por meio da cadeia de transporte de eltrons da fotossntese, enquanto nas clulas radiculares + NO 2- reduzido a NH4 pela NiR localizada nos plastdios, de maneira anloga que acontece no tecido foliar. Entretanto, como no pode ser produzida diretamente, por meio da fotossntese, a ferredoxina que ser utilizada pela NiR presente nas razes (ou na parte area no escuro) reduzida pelos eltrons doados pelos NADPH, gerados por meio da Via das Pentoses-fosfato. Sthr et al. (2001) descreveram a atividade cataltica de uma enzima ancorada na membrana plasmtica, que reduz NO2 a xido ntrico (NO) nas razes de fumo. Esses estudos sugerem que a enzima nitrito:NO redutase deve atuar concomitantemente com a NR da plasmalema, para converter NO3 externo em NO; este, por sua vez, atravessa a membrana plasmtica e atua como intermedirio na sinalizao por NO3 . Em mamferos, o papel do NO est estabelecido como uma molcula sinalizadora importante (ver captulo VIII neste volume). Na verdade, o NO, por si s, capaz de induzir genes que respondem a NO3-.
-

ACMULO E REMOBILIZAO DO NITRATO

De maneira geral, o NO 3 absorvido pela clula pode ser:
-

Reduzido e assimilado no local de absoro. Acumulado no vacolo da clula que o absorveu, atravessando o tonoplasto por
um canal de NO 3 .
-

Absorvido nas razes e enviado para a parte area, onde pode ser reduzido e
assimilado, ou acumulado no vacolo celular.
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Quando o NO3 absorvido no citossol, ele induz a atividade da enzima NR. Desse modo, o nitrato pode ser reduzido a NO2 pela NR; a seguir, o NO2 reduzido pela NiR + a NH4 , que precisa ento ser assimilado em molculas orgnicas por meio das enzimas Glutamina Sintetase (GS) e Glutamato Sintase (GOGAT). Todo esse processo de reduo e assimilao necessita de energia, poder redutor e esqueletos de C, que, em algumas situaes, esto em concentraes limitantes na clula (escuro, senescncia, baixa taxa fotossinttica, estresse, etc.). Nessas condies, o NO3 absorvido pode ser enviado para outras clulas ou acumulado no vacolo, passando pelo tonoplasto atravs de um canal de NO3- (Figura 7). A remobilizao do NO3 acumulado no vacolo, com seu retorno ao citossol, envolve a participao de um transportador de NO3 , do tipo simporte, com um prton e depende de um gradiente eletroqumico que gerado pelas bombas de prtons presentes no tonoplasto: a V-H+ATPase e a pirofosfatase (H+PPase). No citossol, o NO3 atua como um desacoplador das unidades Vo e V1 das V-H+ATPase (ver captulo V neste volume); assim, esta enzima s atua bombeando prtons para o interior do vacolo, na ausncia de NO3 no citossol, quando ento a sua atividade permite a sada do nitrato que esteja acumulado no vacolo (Figura 8). Na clula, pode se considerar que h dois reservatrios (pools) de nitrato separados espacialmente: o reservatrio metablico ou pool indutor (de curta durao - ligado regulao do nvel da NR) e o reservatrio de reserva ou pool substrato (de existncia mais longa - ligado ao suprimento de substrato) (Heimer & Filner, 1971; Ferrari et al., 1973). O pool indutor refere-se ao NO3- presente no citossol, enquanto o pool substrato o NO3 acumulado nos vacolos.
-

Figura 7. Viso geral da absoro de nitrato e amnio; reduo, exportao e acmulo de nitrato; assimilao de amnio. T (tonoplasto) e MP (membrana plasmtica). (1) P-H+-ATPase; (2) transportador de NO3 (simporte); (3) transportador de NH4+ (uniporte); e (4) canal de NO3 .

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Figura 8. Viso geral da remobilizao de nitrato do vacolo. (5) V-H+-ATPase; (6) H +-PPase; e (7) transportador de NO3 (simporte: H+/NO3 ).

Ferrari et al. (1973) verificaram em clulas de tabaco que o NO3- acumulado no pool substrato podia ser utilizado pela planta, porm era incapaz de substituir o NO3- do pool indutor em sua capacidade de induzir sntese de novo de NR, ou aumentar a atividade da NR j existente. O excesso de NO3 no citossol (pool indutor) passa rapidamente para o vacolo (pool de reserva), atravs de um canal inico no tonoplasto (Satter & Moran, 1988; Hedrich & Schroeder, 1989). Segundo Siddiqi et al. (1989), o fornecimento de N exgeno pode restaurar o fluxo de NO3 no citoplasma e, assim, aumentar a atividade da NR. A NR uma enzima passvel de induo pelo substrato (NO 3-). Numerosos estudos comprovaram aumento da atividade dessa enzima aps suprimento de NO3 s plantas. O NO3 tanto induz os genes para a NR (NIA) como os genes para a NiR(NII). Sommers et al. (1983), utilizando imunoeletroforese com anticorpos especficos para NR, encontraram em plantas aumento da atividade da NR induzida por NO3 , que corresponde a um aumento da protena-NR. Esses resultados indicam que o NO3 induz a expresso gnica que culmina com a sntese de novo da protena-NR. Posteriormente, quando o NO3 foi removido das plantas, a atividade da NR e a protena-NR diminuram, demonstrando que a NR no permanece quando o sinal-nitrato para a induo removido. Evidncias indicam que a luz no tem papel direto na atividade da NR (Campbell, 1999). A influncia da luz poderia ser devido a um efeito geral na sntese de protena e no diretamente na NR. De acordo com Campbell (1988), a luz no influencia a expresso gnica para a NR, uma vez que o RNA mensageiro (RNAm) para a NR no est presente em altos teores em plantas crescidas luz, a menos que NO3 seja fornecido. Desse modo, a luz no capaz de exercer influncia nos nveis de RNAm para a NR, a menos que o nitrato j tenha
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ativado o gene que codifica a NR. H evidncias de que o NO3- desencadeia a expresso gnica para a NR (e provavelmente para genes relacionados, como o da NiR), enquanto a luz influencia o nvel de expresso desses genes, alm de fornecer energia para a reao. Em milho, foi verificado que a induo da protena-NR inativa ocorreu em resposta luz, na presena de baixos teores de NO3-; no entanto, a expresso total da atividade enzimtica requereu altas concentraes de NO3- (Oaks et al., 1982). Quando plantas de milho fertilizadas com NO3 - foram transferidas da luz para o escuro, a atividade da NR atingiu nveis baixos, em um perodo de 12 h. No escuro, o NO3 - direcionado para o pool de reserva, nos vacolos, devido deficincia de poder redutor produzido na fotossntese. Em um curto perodo aps a transferncia das plantas da luz para o escuro, a protena-NR no diminuiu, embora a atividade da NR tenha diminudo em 30 %. A atividade da NR foi restabelecida com o retorno das plantas luz. Esses resultados indicam a existncia de um mecanismo de inativao reversvel para a regulao da NR. Em condies de baixa energia, a NR ativa pode ser fosforilada e ligada a uma protena regulatria denominada 1433, formando um complexo inativo que pode ser direcionado destruio da NR. Entretanto, se for restabelecido o nvel energtico, a protena 1433 se desligaria da NR e a enzima posteriormente defosforilada voltaria sua atividade normal. A NR fosforilada tambm ativa.

ASSIMILAO DO AMNIO
Embora o NO3- e o NH4 + possam ser absorvidos pelas plantas, a assimilao do N somente ocorre sob a forma reduzida (NH4+). Esse NH4+ pode ser diretamente absorvido pela clula atravs de um transportador do tipo uniporte na membrana plasmtica ou ser formado pelas reaes do metabolismo, como a fotorrespirao e a reduo do NO 3(Figura 7). At os anos 70 acreditava-se que em plantas o NH 4+ era incorporado em molculas orgnicas, por meio da enzima glutamato desidrogenase (GDH-EC.1.4.1.3), via aminao redutiva direta do -cetoglutarato. Embora a glutamina sintetase (GS-EC.6.3.1.2) fosse conhecida, ela no era considerada importante, porque o N era assimilado na posio amida, formando glutamina. Entretanto, em 1971, Tempest et al. (1971) detectaram uma nova enzima em bactria, que catalisava a transferncia redutiva do grupo amida da glutamina para o -cetoglutarato, resultando na produo de duas molculas de glutamato. Esta enzima foi denominada glutamato sintase (GOGAT), (NADH-GOGATEC.1.4.1.13). Finalmente, Lea & Miflin (1974) demonstraram em cloroplastos a existncia de uma GOGAT diferente da encontrada em bactria, que era dependente de ferredoxina reduzida, que foi denominada Fd-GOGAT e que catalisava reao similar da NADH-GOGAT bacteriana.

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O significado da descoberta da GOGAT que, em cooperao com a GS, ela fornece uma rota alternativa para a sntese de glutamato a partir de NH4+ e -cetoglutarato. Esse sistema foi chamado via GS-GOGAT (Miflin & Lea, 1977). Amnio inicialmente incorporado em glutamato, por meio da GS, formando glutamina (o N incorporado est na posio amida da glutamina), e ento transferido, pela ao da GOGAT, para o C-alfa do -cetoglutarato, formando duas molculas de glutamato. Uma caracterstica tpica da via GS-GOGAT de assimilao de NH4+ sua natureza cclica, em que o glutamato ao mesmo tempo substrato e produto da assimilao (Figura 9). Aps a descoberta da via GS-GOGAT, verificou-se que a enzima GDH no tinha o papel principal na assimilao de NH4+ em plantas superiores (Miflin & Lea, 1977; Kumar & Abrol, 1990; Lancien et al., 2000). Diversas evidncias apontam para a glutamina sintetase como a principal enzima na assimilao de NH 4+ pelas plantas:

A glutamina sintetase tem menor Km para o NH4+ (Km de 50 mol L-1) do que a

GDH (Km de 5 a 70 mmol L-1); portanto, mesmo em baixas concentraes de NH4+ a GS ativa (Lea & Miflin, 1974).
-

A glutamina o primeiro produto formado quando se usa N marcado (NH4+ ou

NO 3 ) (Magalhes et al., 1990).

Inibidores de GS bloqueiam a assimilao de NH4+.

Fdox ou NAD+

Fdred ou NADH

Figura 9. Esquema representativo da via glutamina sintetase-glutamato sintase (GS-GOGAT) para a assimilao de amnio. (Fdox = ferredoxina oxidada; e Fdred = ferredoxina reduzida).

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Glutamina Sintetase
A enzima Glutamina Sintetase (GS) incorpora NH4+, formando glutamina, por meio da ligao do NH4+ ao grupo carboxlico do glutamato, usando energia fornecida pelo ATP: NH4+ + L-glutamato + ATP L-glutamina + ADP +Pi A glutamina sintetase de plantas superiores apresenta-se como uma protena octomrica (constituda de oito subunidades) (Stewart et al., 1980) ou tetramrica (quatro subunidades) (Mack, 1998) ativa. H duas isoformas de GS: a GS1, localizada no citossol, e a GS2, localizada nos cloroplastos e outros plastdios. Estudos moleculares indicam que a GS1 codificada por uma pequena famlia formada por dois a cinco genes, enquanto h um nico gene que codifica a GS2 (Ireland & Lea, 1999). Hirel & Gadal (1980) demonstraram a existncia de trs isoformas de GS em arroz: duas isoformas foram identificadas nas folhas: GS1 citosslica e GS2 cloroplstica; e nas razes foi encontrada uma isoforma citosslica denominada GSr. As enzimas GS1 e GSr so codificadas por dois genes GS1: OsGS1 e OsGSr. Entretanto, aps o seqenciamento do genoma do arroz, um terceiro gene para GS1 foi descoberto (OsGS1;3), o que levou substituio da nomenclatura OsGS1, OsGSr para, respectivamente, OsGS1;1, OsGS1;2 (Ishiyama et al., 2004). A proporo relativa das isoformas cloroplsticas e citosslicas influenciada por vrios fatores, inclusive o estdio de desenvolvimento e as condies ambientais, como a luz. Hirel & Gadal (1980) observaram atividade da GS2 baixa ou ausente em folhas estioladas. Contudo, quando o tecido foi se tornando verde, a GS2 aumentou rapidamente, via sntese de novo, enquanto a GS1 diminuiu. Esses resultados sugerem que a GS2 estaria restrita aos tecidos verdes e que a GS1 estaria presente de forma mais generalizada em folhas, razes e sementes. Foi demonstrado que o NH 4 produzido durante a fotorrespirao reassimilado nos cloroplastos pela GS2. Wallsgrove et al. (1979) isolaram mutantes de cevada deficientes em GS2 cloroplstica e observaram que eles acumularam concentraes txicas de amnio devido fotorrespirao, o que enfatiza o papel da GS2 na assimilao do + NH4 liberado na fotorrespirao. Entretanto, algumas plantas, como o espinafre e o fumo, no contm a GS citosslica (GS1) (McNally et al., 1983), o que sugere que todo o + NH4 produzido na clula vegetal pode ser assimilado pela GS2.
+

Glutamato Sintase
Em plantas existem enzimas glutamato sintase (GOGAT) que podem utilizar NADH (NADH-GOGAT) ou ferredoxina (Fd-GOGAT) como doadores de eltrons. Ambas as isoformas promovem a transferncia redutiva do grupo amida da glutamina para o cetoglutarato, formando duas molculas de glutamato: L-glutamina + -cetoglutarato + NADH ou Fdred 2 L-glutamato + NAD+ ou Fdox
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Uma das duas molculas de glutamato formado pode retornar via GS-GOGAT, enquanto a outra pode ser usada nas reaes biossintticas (Miflin & Lea, 1976) (Figura 9). Os anticorpos contra NADH-GOGAT no reconhecem Fd-GOGAT e vice-versa, indicando que as duas GOGAT so protenas imunologicamente distintas (Suzuki et al., 1982). A glutamato sintase (GOGAT) foi detectada em plastdios tanto em razes como em folhas (Wallsgrove et al., 1979; Suzuki & Gadal, 1982). Nas folhas, Fd-GOGAT a forma predominante da enzima, encontrada no estroma dos cloroplastos. Ela especfica para ferredoxina reduzida, sendo inativa com NADH como doador de eltrons (Lea & Miflin, 1974; Suzuki & Gadal, 1982). A Fd-GOGAT presente em razes similar, mas no idntica, foliar. A isoforma NADH-GOGAT est localizada principalmente em tecidos no-verdes, como razes, ndulos e cotildones em desenvolvimento (Chen et al., 1990). Em tecidos verdes, NADH-GOGAT muito menos ativa que a Fd-GOGAT (Matoh et al., 1980). A Fd-GOGAT foi a principal forma de glutamato sintase encontrada nas folhas verdes de arroz (Suzuki & Godal, 1982; Yamaya et al., 1992), ao passo que alta atividade de NADH-GOGAT foi detectada em folhas que ainda no tinham emergido e, portanto, no estavam verdes e expandidas (Yamaya et al., 1992). No entanto, parece que, uma vez atingida a expanso total da folha, a atividade e o contedo de protena NADH-GOGAT diminuem, sugerindo que a expresso do gene para NADH-GOGAT em folhas de arroz reduzida com a idade da folha e que ocorre degradao da protena NADH-GOGAT (Yamaya et al., 1992). Nos cloroplastos, a ferredoxina utilizada pela Fd-GOGAT produzida por meio da fotossntese. Na raiz, a ferredoxina no pode ser reduzida pelas reaes luminosas da fotossntese, mas sim por NADH ou NADPH proveniente da oxidao de acares, que por sua vez a mesma fonte de poder redutor para o NADH-GOGAT (Hageman & Bellow, 1990).

Glutamato Desidrogenase
A enzima glutamato desidrogenase (GDH) promove a aminao redutiva reversvel do -cetoglutarato, formando glutamato. Foram detectadas duas isoenzimas da GDH: uma localizada na mitocndria e dependente de NADH (E.C.1.4.1.2 - NADH-GDH) como doador de eltrons e outra nos cloroplastos que utilizam a coenzima NADPH (E.C.1.4.1.4 - NADPH-GDH). A enzima mitocondrial est associada membrana da mitocndria. A GDH est presente tanto nas razes quanto nas folhas, utilizando como doador de eltrons NADH ou NADPH: NH4+ + -cetoglutarato + NAD(P)H + H+ L-Glutamato + H2O + NAD(P) + A afinidade da GDH pelo NH4+ baixa, com Km variando de 5 a 70 mmol L -1, de acordo com a localizao da enzima no tecido vegetal (Miflin & Lea, 1977). O Km pelo -cetoglutarato de 3,3 mmol L-1 e, pelo glutamato, de 7,3 mmol L-1, na rota de desaminao.
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O maior Km apresentado pela GDH para o NH 4 em relao a GS (Km = 50 mol L-1) demonstra que a GDH no estaria atuando no sentido da aminao, pois a GS seria a + enzima mais apropriada, devido sua maior afinidade pelo NH4 (menor Km). Lewis et al. (1983) verificaram que nas razes de cevada os ons NH4+ absorvidos do solo eram assimilados, exclusivamente, por meio da via GS/GOGAT e que a GDH teria somente papel limitado nesse processo. Esses resultados indicam que a GDH das plantas superiores seria importante na reao de desanimao oxidativa do glutamato e no na aminao do -cetoglutarato a glutamato. Foi observada maior atividade da GS nas regies de crescimento radicular, enquanto a atividade da GDH foi consideravelmente maior nas partes mais velhas da raiz (Luxov, 1988). Simpson & Dalling (1981) observaram que, durante o perodo de enchimento dos gros, a atividade da GS e da GOGAT na folha bandeira de arroz diminui. A atividade da GDH permaneceu constante durante o mesmo perodo. No entanto, a enzima atingiu um pico de atividade aos 25 dias aps a antese. Esse pico coincidiu com o perodo do rpido declnio na atividade da GS. Boggie et al. (2000) observaram em tomate que GS estava presente quase que exclusivamente nos frutos verdes, ao passo que a GDH se encontrava apenas nos frutos mais maduros, sugerindo um modelo recproco de atividade entre GS e GDH durante o amadurecimento e a senescncia do fruto de tomate. Aumentos na GDH, no perodo tardio da senescncia, foram observados em ptalas de tulipa senescentes e em folhas destacadas e senescentes de Lolium (Thomas, 1978). Tem sido observado que GDH a enzima do metabolismo de N que freqentemente atinge mais alta atividade durante a senescncia (Frith et al., 1978; Ragster & Chrispeels, 1981; Laurire & Daussand, 1983). De acordo com Robinson et al. (1992), as mudanas na atividade da GDH, observadas em folhas senescentes, poderiam estar relacionadas com a diminuio da fotossntese desses tecidos e, portanto, ligadas disponibilidade de C. Desse modo, a enzima glutamato desidrogenase pode atuar no sentido de (Figura 10): a) Desaminao: catalisando a oxidao do glutamato a -cetoglutarato e fornecendo, assim, esqueleto de C para o ciclo de Krebs. b) Aminao: incorporando NH4 e formando glutamato. Em cultura de clulas de cenoura, foi observado que a GDH era ativa na oxidao do glutamato, mas no na aminao redutiva do -cetoglutarato, que ocorreria somente via GS/GOGAT (Robinson et al., 1990). Em outro experimento, esses autores observaram relao inversa entre a atividade da GDH e o suprimento de carboidrato (sacarose) ao meio de cultura. Sahulka & Lis (1980) tambm constataram aumento da atividade da GDH em resposta limitao de sacarose em razes de ervilha. Esses resultados evidenciam o papel primrio da GDH na desaminao do glutamato, fornecendo, assim, esqueletos de C para que o ciclo de Krebs funcione, sob condies de limitao de C (Srivastava & Singh, 1987; Yamaya & Oaks, 1987; Oaks & Yamaya, 1990; Robinson et al., 1990, 1992).
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Figura 10. Atividade da enzima glutamato desidrogenase (GDH). Aminao: incorporando amnio e formando glutamato; e desaminao: catalisando a oxidao do glutamato a -cetoglutarato, liberando amnio.

Sob esse ponto de vista, poderia se supor que a chamada induo da atividade da + GDH por NH4 , observada por diversos autores (Kar & Feierabend, 1984; Jain & Shargool, 1987; Shargool & Jain, 1987; Srivastava & Singh, 1987), estaria na verdade acontecendo + devido diminuio de esqueletos de C e no pelo aumento de NH4 no tecido da planta. A GDH est, portanto, envolvida em uma importante funo anaplertica, unindo o metabolismo do C e do N nas plantas superiores.

VISO GERAL DO METABOLISMO DE NITROGNIO

O fornecimento de energia ou poder redutor para o funcionamento das enzimas do metabolismo de N acopla o metabolismo de N ao de C em trs vias (Quadro 1):

Utilizao de esqueletos de C: como a GDH ou GOGAT. Utilizao de doadores de eltrons: como para a NR, NiR, GOGAT e GDH. Utilizao direta de energia: como a GS.
Nas folhas, essas interaes ocorrem s expensas dos produtos primrios da fotossntese [ATP, NAD(P)H, Ferredoxina] e competem com a reduo de C. Por sua vez, nas razes, os carboidratos armazenados ou translocados servem como substrato para a produo de energia e fonte de C para a assimilao de N.
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Quadro 1. Principais enzimas do metabolismo do nitrognio e seus doadores de eltrons ou energia

Enzima Nitrato redutase (NR) Nitrito redutase (NiR) Glutamina sintetase (GS) Glutamato sintase (GOGAT) Glutamato desidrogenase (GDH) NO 3 - NO2 NO 2 NH 4 + Glutamato + NH 4+ Glutamina -cetoglutarato + Glutamina 2 Glutamato -cetoglutarato + NH 4+ Glutamato Reao Doador de eltrons ou energia NADH; NAD(P)H Ferredoxina ATP Ferredoxina; NADH NADH; NAD(P)H

TOXIDEZ DE AMNIO EM PLANTAS

Vrios estudos demonstram que o NH4 pode ser txico para as plantas. Algumas + delas so muito sensveis toxidez por NH4 , mesmo em pequenas concentraes -1 (2 mmol L ), pois ela afeta tanto a fisiologia como a morfologia das plantas. Embora as plantas s vezes consigam metabolizar grandes quantidades do NH4 , liberadas pela fotorrespirao, sem mostrar sinais da toxidez, a nutrio de plantas com + NH4 via sistema radicular pode afetar negativamente o metabolismo vegetal, quando + comparada s plantas sob nutrio ntrica ou sob combinao de NH4 e NO3 . A absoro de excesso de NH4+ interfere no balano de gua nas plantas, reduzindo o fluxo de gua das razes para a parte area, de modo que plantas no tolerantes acabam + murchando. Alguns sintomas de toxidez de NH4 , como folhas secas enroladas, podem ser reflexo do aumento da resistncia ao movimento radial da gua em plantas sob + nutrio amoniacal. Os nveis de exsudao em plantas de tomate tratadas com NH4 sofrem rapidamente reduo de at 60 %, quando comparadas com plantas sob nutrio ntrica. Alguns dos efeitos da toxidez por NH4+ podem ser revertidos por NO3 . Sintomas de deficincia de K foram observados em plantas sob nutrio amoniacal, mas a concluso foi de que esse efeito foi devido reduo na exsudao e no perda de K nas razes. O K tem ao importante na ativao das enzimas de assimilao de N + quando o NH4 est em concentraes txicas nos tecidos das plantas. Plantas de tomate que tinham apresentado leses devido absoro de excesso de NH4+ tiveram essas leses inibidas pelo K. A produtividade de milho sob nutrio amoniacal aumentou com a aplicao de doses crescentes de K. Outros sintomas de toxidez de NH4 podem incluir a clorose, a necrose e at a morte + das plantas. O aparecimento desses sintomas depende da concentrao de NH4 nos tecidos, da relao NH4+/ NO 3 e da concentrao de outros nutrientes. Em experimento com mistura de NH4+: NO 3 o feijo foi a planta mais severamente afetada pelo aumento da concentrao de NH4+, em relao ao NO3 , ao passo que repolho, melo e milho + tiveram o peso das folhas secas reduzido pelo NH4 . Todas essas plantas apresentam + reduo no teor de Ca com o aumento nos teores de NH4 .
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Para seu funcionamento, as enzimas de assimilao de NH 4 requerem energia, doadores de eltrons e esqueleto de C, para incorporao do on. Quando se adicionou -cetoglutarato a plantas de tomates cultivadas sob nutrio amoniacal, foi constatado aumento no crescimento e nos teores de aminocidos livres e reduo nos sintomas de + toxidez. A assimilao de NH4 formando glutamina pela ao da GS (relao C/N 5:2) ou glutamato pela ao da GDH (relao C/N 5:1) representa um dreno de esqueletos de C. Britto et al. (2001), trabalhando com uma planta mais tolerante ao NH4 (arroz) e outra mais sensvel (cevada), identificaram na cevada um mecanismo de exsudao ativa + + de NH4 como uma das causas provveis da toxidez de N-NH4 . De acordo com esses autores, a cevada, ao contrrio do arroz, no mostra alta capacidade de regulao do potencial da membrana () com a absoro de NH4+ (principalmente por mecanismo de alta afinidade HATS). Como resultado, a cevada acumula concentraes excepcionalmente elevadas de N-NH4+ no citossol. Parte deste NH4+ sofreria ento efluxo, contra a tendncia termodinmica dominante, que seria de fora para dentro. O resultado desse processo seria um gasto excessivo de energia (aumento de 41 % nas taxas de respirao) com efeitos negativos sobre o metabolismo das plantas e conseqente reduo do peso. O arroz, entretanto, mostra um eficiente sistema de controle do potencial da membrana (potencial menos negativo) e, conseqentemente, acumula concentraes menores de NH4+ no citossol (Wang et al., 1994; Britto et al., 2001), bem como concentraes mnimas de exsudao de NH4+. Esse mecanismo poderia ser uma das razes da tolerncia do arroz ao NH4+. Devido ao fato de a assimilao de NH 4+ ocorrer basicamente nas razes e requerer grandes quantidades de carboidratos, plantas sob nutrio amoniacal mostram reduo na taxa de crescimento das razes. Quando houve reduo do suprimento de N s razes de milheto em soluo nutritiva, por sete dias, as razes mostraram aumento de peso de 24 %, enquanto, simultaneamente, as folhas tiveram reduo no peso de 24 %. Essa reduo no peso da parte area das plantas foi atribuda a um redirecionamento dos carboidratos que seriam usados na assimilao do N, uma vez que so necessrios 5 mol de glicose para a fixao de 8 mol de N. O acmulo de N-amino e N-amida uma das caractersticas de plantas sob excesso de N amoniacal. Na presena de elevadas concentraes de NH4+, asparagina e glutamina podem responder por mais de 80 % do total de N-amino/N-amida livre. O teor de N+ amino/N-amida livre pode aumentar de 10 a 20 vezes como resposta toxidez do NH4 . Situaes de estresse devido ao excesso de absoro de N em plantas submetidas a condies desfavorveis de crescimento, como baixa luz e alta temperatura, mudam a relao de N-amino/N-amida em plantas, conforme pode ser observado em experimento com arroz (Quadro 2). A acumulao de NH 4 em plantas pode ocorrer tanto devido ao aumento absoluto + + na disponibilidade de NH 4 quanto devido ao aumento relativo do NH4 como conseqncia de um dficit de esqueleto de C, ou seja, a uma deficincia dos cetocidos para sntese de N-amino e N-amida. esta sntese de N-amino/N-amina que reduz o + excesso de NH 4 livre nos tecidos.
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Um dficit de carboidratos pode ocorrer como resultado direto da reduo da fotossntese devido queda de radiao fotossinteticamente ativa na superfcie do dossel (como acontece em dias nublados ou devido ao auto-sombreamento em dossis formados por plantas com excesso de folhas decumbentes), ou pode ser um efeito indireto em razo do consumo excessivo de C na respirao (como, por exemplo, sob condies de alta temperatura Britto et al., 2001). Pode ocorrer, entretanto, uma combinao negativa de vrios fatores, como concentraes elevadas de NH4+, reduo da radiao incidente e temperatura elevada (Figura 11).
Quadro 2. Efeitos de baixa luz (17,3 Klux) e alta temperatura (35 C) na composio de aminocidos e razo N-amino e N-amida em plantas de arroz submetidas a duas doses de nitrato e amnio (20 e 150 mg L-1)
Aminocido N-NO3 20 mg L - 1 N N-NH 4 + 20 mg L -1 N do total 150 mg L -1 N

150 mg L - 1 N

_ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ % __ _ _ _ __ _ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __

_ _ __ _ __ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _ __ _ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ _ __ _ _ _ __ _ _ _ __ _

Aspartato Glutamato Asparagina Glutamina Relao N-amino/N-amida Total de aminocidos (mmol kg-1 matria fresca)

10,6 25,1 3,9 12,3 5,17 12,80

5,1 16,3 11,2 21,5 2,06 17,93

1,4 5,5 26,7 54,7 0,23 124,50

2,3 5,0 12,5 70,5 0,20 173,00

Fonte: Adaptado de Fernandes (1974).

Matria fresca, g

(a)

(b)

y Y = 3,7798x -0,3468 R 2 = 0,89

1

y Y = 1,6729x -0,2437

R 2 = 0,67

0 0 100 200 300 400 500 0 20 40 60 80 100 120

N-amino, mmol kg-1

3

N-amnio, g kg -1 (c) y Y = 2,838x-0,1688

Acar, %

R2 = 0,65

1 0 0 100 200 300 400 500

N-amino, mmol kg -1

Figura 11. Relaes entre os teores de N-amino e matria seca (a); N-amnio e matria fresca (b); e N-amino e acares solveis (c) em arroz cultivado com alta dose de N-NH 4+ (150 mg L-1).

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Em comunidades vegetais formando dossis densos, s vezes apenas a parte superior do dossel recebe a radiao incidente total e capaz de realizar o seu potencial fotossinttico. Em situaes como essas, o dossel como um todo pode apresentar nveis elevados de respirao medida que a temperatura do ar aumenta. O resultado uma situao de estresse devido combinao de baixa fotossntese e alta respirao, que resulta na queima de quantidades elevadas de carboidratos, na absoro de nutrientes devido energia disponvel por meio da respirao, ao mesmo tempo em que diversas rotas do metabolismo de N so bloqueadas em decorrncia da reduo no suprimento de esqueletos de C. Isso mostra que na aplicao de fertilizantes nitrogenados devem ser levados em considerao todos os fatores que afetam a fisiologia das plantas. Sem esse tipo de considerao pode acontecer que, aplicando N na agricultura em doses que aparentemente seriam consideradas adequadas, pode-se na verdade levar rapidamente a condies de toxidez de NH 4+ ou ao acmulo de excesso de NO3- nos tecidos.

REMOBILIZAO DE NITROGNIO
Senescncia
Grande parte dos nutrientes nas folhas durante o seu crescimento e desenvolvimento so transferidos, durante a senescncia desse tecido, para os rgos reprodutivos ou em crescimento. A senescncia culmina com a morte foliar; no entanto, esse estgio s atingido aps os processos da senescncia remobilizarem os nutrientes para outras partes da planta. Na fase inicial da senescncia principia a hidrlise das protenas cloroplsticas e os aminocidos liberados podem ser exportados para as regies reprodutivas, como os gros em crescimento. Os cloroplastos so desmontados no incio da senescncia, enquanto as mitocndrias permanecem funcionais. A perda da atividade fotossinttica acontece paralelamente degradao de protenas e RNA mensageiros, enquanto N, P e outros nutrientes so transferidos das folhas (Buchanan-Wollaston et al., 2003). A remobilizao de N, P e K em folhas de Arabidopsis foi de 80 % durante a senescncia (Himmelblau & Amasino, 2001). Em plantas C3, mais de 75 % do N celular total est localizado nos cloroplastos foliares (Peoples & Dalling, 1988). As principais substncias cloroplsticas que contribuem para a perda total de protenas foliares durante a senescncia so a Rubisco e o complexo coletor de luz pertencente ao fotossistema II (Matile et al., 1997). O complexo coletor de luz faz parte das membranas tilacides e formado de protenas e pigmentos, principalmente clorofilas. A degradao, nos cloroplastos, das protenas das membranas tilacides associadas s clorofilas requer o simultneo catabolismo das clorofilas. A desmontagem dos complexos pigmentos-protenas causa a liberao de clorofilas que so potencialmente perigosas, pois podem causar danos foto-oxidativos. As clorofilas devem ento ser degradadas at formas no-reativas por meio de pelo menos cinco reaes enzimticas (Hstensteiner & Feller, 2002).
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Os produtos finais do catabolismo das clorofilas, denominados catablitos de clorofila no-fluorescentes, so depositados nos vacolos, sem que ocorra a remobilizao do N dessas molculas (Hinder et al., 1996; Tommasini et al., 1998). Portanto, o N das clorofilas no exportado das folhas senescentes, permanecendo nas clulas na forma de catablitos tetrapirrlicos lineares, que so produzidos pela abertura do anel porfirnico decorrente da introduo de O por uma oxigenase. Esses derivados tetrapirrlicos so ento transportados ativamente atravs de carreadores do tonoplasto e se acumulam no vacolo (Tommasini et al., 1998). Desse modo, a degradao das clorofilas no tem por objetivo mobilizar nutrientes, mas sim detoxificar os compostos de clorofila altamente reativos que so liberados dos complexos protenas-pigmentos constituintes das membranas tilacides dos cloroplastos. Durante a senescncia, as enzimas envolvidas na assimilao de N e C so degradadas e os aminocidos derivados de seu catabolismo so exportados via floema com ou sem modificaes. A atividade das enzimas envolvidas no metabolismo do N diminui durante a senescncia da planta. Em geral, a atividade da nitrato redutase (NR) perdida primeiro, enquanto a glutamina sintetase (GS), a glutamato sintase (GOGAT) e a glutamato desidrogenase (GDH) permanecem ativas por um perodo mais longo (Storey & Beevers, 1978). A degradao da Rubisco rpida e serve como fonte de N para o desenvolvimento dos gros (Mae et al., 1983, 1985; Makino et al., 1984). Em plantas C3, como o arroz, a Rubisco contribui com cerca de 50 % do total de protena solvel das folhas (Feller, 1990). No processo de remobilizao de N, durante a senescncia, quando as protenas + foliares so degradadas, o N liberado na forma de NH4 reassimilado e convertido principalmente nas amidas glutamina e asparagina, que so translocadas para os rgos em crescimento e desenvolvimento (Ghosh et al., 1995; Nakasathien et al., 2000). Apesar de o glutamato ser o aminocido em maior proporo nas folhas de arroz, durante a senescncia o teor de glutamato diminui acentuadamente e as concentraes de sua amida, a glutamina, aumentam (Kamachi et al., 1991). Segundo Hayashi & Chino (1990), a glutamina contribui com 42 % do total de aminocidos na seiva do floema de arroz, tornando-se o principal aminocido de transporte durante o desenvolvimento dos gros. A glutamina sintetase (GS) a mais provvel enzima para a formao de glutamina, nos tecidos senescentes (Miflin & Lea, 1977; Oaks & Hirel, 1985). No entanto, como acontece com a Rubisco, a atividade da GS tambm diminui durante o perodo reprodutivo (Simpson & Dalling, 1985; Hayashi & Chino, 1990; Kamachi et al., 1991, 1992; Souza et al., 1999). Entretanto, como a GS no tecido vegetal est presente em pelo menos duas isoformas: a GS1, localizada no citossol, e a GS2, localizada no cloroplasto (Oaks & Hirel, 1985), a queda na atividade da GS observada durante a senescncia pode ser atribuda
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diminuio da isoforma GS2, que, como outras protenas cloroplsticas, sofre hidrlise preferencial durante esse perodo. Em cloroplastos isolados observou-se que a GS2 mais suscetvel hidrlise e degrada mais rapidamente do que a Rubisco e outras enzimas de assimilao de C (Mitsuhashi & Feller, 1992; Thoenen & Feller, 1998). A GS1 citosslica, por sua vez, se mantm constante e pode at aumentar ligeiramente durante a senescncia (Makino et al., 1983; Kamachi et al., 1991, 1992). A GS1 converte glutamato em glutamina, aumentando assim a eficincia de transporte de N, pois a glutamina carreia dois N por cinco C. Yamaya et al. (2002) detectaram imunocitologicamente protena GS1 citosslica em folhas senescentes de arroz, especificamente em clulas companheiras importantes para o carregamento do floema. Esses resultados contribuem para caracterizar a importncia da GS1 para a formao de compostos de N a serem exportados das folhas senescentes. Ela pode ser tambm a responsvel pela converso de glutamato e NH4+ em glutamina. Segundo Buchanan-Wollaston & Ainsworth (1997), a GS1 citosslica est envolvida na remobilizao de compostos nitrogenados, pois a expresso de genes que codificam para a GS1 aumenta durante a senescncia. Entretanto, pode haver controle ps-traducional da GS1 por fosforilao, o que protege a enzima da degradao, e tambm podem ocorrer interaes com protenas 1433, que aumentam a atividade da GS1 (Finnemann & Schoerring, 2000). Enquanto a GS1 citosslica permanece ativa por mais tempo, a GS2 plastidial perdida nas folhas de cereais na fase inicial da senescncia, juntamente com outras protenas cloroplsticas. Dessa maneira, durante o perodo reprodutivo, apesar de a atividade da GS total (GS1 + GS2) diminuir, a atividade da GS1 remanescente transferida para os tecidos em crescimento.

Enchimento dos Gros

Durante o enchimento dos gros, h duas fontes de N para a planta: o N absorvido do solo e o N remobilizado dos tecidos vegetativos (Ta & Weiland, 1992). Inicialmente, o N mobilizado das folhas e caules como parte do processo de envelhecimento (senescncia), mas o N disponvel no solo tambm absorvido. No entanto, se esses dois processos so incapazes de sustentar a demanda de N dos gros, ento ocorre acelerao no processo de senescncia, com aumento da remobilizao do N das folhas e, em menor extenso, do caule (Borrel & Hammer, 2000). Durante a fase de enchimento dos gros, os fotossintetatos produzidos so canalizados primariamente para as sementes em enchimento, sendo o suprimento via razes limitado. Ta & Weiland (1992), usando 15N para medir a taxa de remobilizao de N sob condies de campo, em milho, observaram que as folhas e os caules forneceram cerca de 45 % do N remobilizado durante o enchimento dos gros, enquanto as razes contriburam com cerca de 10 %.
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Portanto, os nutrientes absorvidos pelas razes no so suficientes para suprir as necessidades de enchimento dos gros; os nutrientes so ento translocados das folhas para os rgos em crescimento, ocorrendo a senescncia rpida das folhas. Dessa forma, a reposio de nutrientes poderia manter a taxa de fotossntese por um tempo maior e se refletir em aumento da produo de gros. A manuteno do metabolismo das folhas parece importante para garantir o melhor enchimento dos gros. Del Molino (1992) observou em trigo que, aps a antese, os gros so o principal dreno para o N das folhas; portanto, a senescncia foliar que ocorre durante o enchimento dos gros tem grande importncia para a produo de gros e contedo de protena. Yang et al. (2000) observaram que fertilizao nitrogenada pesada atrasou a senescncia em trigo e resultou em lento enchimento dos gros e baixo ndice de colheita. Esse atraso na senescncia pode ser revertido se as plantas forem submetidas, durante o estgio tardio de enchimento dos gros, a uma retirada controlada da umidade do solo, que promove, assim, a remobilizao de assimilados pr-armazenados para o enchimento dos gros e aumento da produo. Em condies de estresse abitico, como seca e deficincia de N, a remobilizao dos tecidos vegetativos torna-se particularmente importante para o crescimento dos gros (Ta & Weiland, 1992). Uma vez que as folhas contribuem com a maior parte dos substratos nitrogenados para o enchimento dos gros, o aumento na concentrao total de aminocidos foliares, particularmente glutamato, aspartato e suas amidas glutamina e asparagina, pode ter sido responsvel pelo aumento no contedo de protena nos gros de dois gentipos de soja que receberam 30 mmol L-1 de N (Nakasathien et al., 2000). Barneix & Guitman (1993) tambm observaram que a biossntese de protena em gros de trigo dependente da quantidade de aminocidos nas folhas e que o aumento nos teores de aminocidos foliares poderia intensificar a exportao de aminocidos para os gros. Segundo Masclaux et al. (2000), a taxa de senescncia e remobilizao foliar est relacionada ao status de N e relao fonte-dreno. Em trabalho com arroz, Souza et al. (1998) observaram que a taxa diria de perda de N entre a antese e a coleta final da parte area de uma variedade tradicional Piau (9,94 mg dia-1 de N) foi cerca de duas vezes maior do que a de uma variedade melhorada IAC-47 (4,66 mg dia-1 de N). Para a variedade Piau, o N perdido da parte area correspondeu a 75 % do N-acumulado nos gros, e na IAC-47, a 42 %. De acordo com esses resultados, a variedade tradicional Piau apresenta maior eficincia de remobilizao do N acumulado na planta, o que pode indicar um processo de adaptao a condies de disponibilidade sazonal de N, como acontece nos trpicos. As plantas de ambas as variedades, quando receberam N suplementar durante o enchimento dos gros, apresentaram uma taxa diria de perda de N da parte area menor do que a das plantas sem suplementao nitrogenada, indicando que, quando h uma fonte externa de N, a planta utiliza menos de suas reservas vegetativas para o enchimento dos gros.
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LITERATURA CITADA
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