Actualizaciones en sanidad animal: La importancia del diagnstico en el control de la trichinellosis porcina

Ruiz, M .L; Castao Zubieta, M.R; Schapiro, J.H; Martinez, M .L.; Morici, G.E.; Castro, M .N.; Balbiani, G.; Cutull, Ch.; Caracostantogolo; J.L. y Eddi, C.S . Area de Parasitologa, Instituto de Patobiologa, CICVyA INTA Castelar, Argentina jcara@correo.inta.gov.ar

La trichinellosis es una enfermedad zoontica transmisible por los alimentos. En Argentina, donde es endmica, con notorio incremento en su incidencia y distribucin geogrfica, las infecciones humanas, resultan de la ingestin de chacinados crudos preparados con carne de cerdos infectados con larvas de Trichinella spiralis (Bolpe y col. 2001). Debido a la importancia de los cerdos en la transmisin de la enfermedad en nuestro pas, la presente actualizacin se centrar en la descripcin e interpretacin de las tcnicas de diagnstico para la deteccin directa de Trichinella spp. y de anticuerpos anti-Trichinella en la especie porcina. Los mtodos de diagnstico directo consisten en demostrar la presencia de larvas de primer estado (L1) de Trichinella spp. en tejido muscular por las tcnicas de triquinoscopa y de digestin artificial o enzimtica (DA). La DA es la nica tcnica de diagnstico de T. spiralis reconocida a nivel mundial, cuyo resultado negativo obtenido a travs de un procedimiento validado, permite liberar carne y derivados sin coccin previa, al consumo humano (Gamble y col., 2000) Los mtodos indirectos sugieren la presencia del parsito evidenciada por la respuesta humoral del hospedador. La infeccin por T. spiralis en el cerdo genera una fuerte respuesta inmune (Takahashi, 1997). Para la deteccin de anticuerpos anti-Trichinella las tcnicas ms difundidas son las de inmunofluorescencia indirecta (IFI), inmunoabsorcin enzimtica indirecta (ELISA indirecto) e inmunoelectrotransferencia o Western Blot (WB). Estas pruebas serolgicas poseen la capacidad de detectar mnimas cantidades de anticuerpos presentes en los sueros (sensibilidad) y en una muy alta proporcin de ensayos, solamente reaccionan ante anticuerpos inducidos por Trichinella spp. (especificidad). El inmunodiagnstico de trichinellosis se realiza mediante la utilizacin de dos tcnicas de manera complementaria: ELISA y WB. El suero con resultado positivo por ambas tcnicas sugiere que el animal est infectado. (Guarnera y col., 2007); (Ruiz y Martinez, 2007) Hasta aqu hemos mencionado mtodos directos e indirectos como herramientas para identificar la presencia de la Trichinella spp. a nivel de gnero, pero existen otras tcnicas que permiten identificar especies y genotipos, siendo de gran ayuda para determinar las fuentes de infeccin en las regiones del mundo donde coexisten especies que 1

afectan a hospedadores domsticos y otras que afectan a hospedadores de la fauna silvestre. La base de la actual clasificacin de las especies del gnero Trichinella , fue establecida por pruebas de laboratorio que analizaban distintos patrones de alozimas. Estas son diversas formas de una misma enzima, que tienen distintas movilidades electroforticas y que corresponden a alelos alternativos en un mismo locus gentico. Entre 1992 y 2002, se describieron las caractersticas bioqumicas de las ocho especies y tres genotipos que hoy componen el gnero. (La Rosa y col., 1992), (Pozio y col., 1992) (Murrell y col., 2000); (Nagano y col., 1999), (Pozio y col., 2002) La introduccin de pruebas derivadas de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha simplificado la identificacin de los aislamientos de Trichinella spp. provenientes de diferentes hospedadores y regiones geogrficas y ha confirmado la taxonoma actual del Gnero. Su alta sensibilidad permite analizar larvas individualmente, lo que ha permitido demostrar que en las regiones donde coexisten varias especies o genotipos, pueden existir infecciones mixtas en un mismo hospedador (Pozio & Zarlenga, 2005; Pozio & Murrell, 2006). Las diferencias genotpicas, sumadas a la caracterstica de las larvas musculares de formar un quiste que se rodea o no de una cpsula de colgeno, permitieron disear la siguiente clasificacin de las especies y genotipos del gnero Trichinella (Pozio y Murrell, 2006): a) Especies encapsuladas T. spiralis, T. nativa, T. nelsoni, T. britovi y T. murrelli y tres genotipos cuya posicin taxonmica es an incierta (T6, T8, T9). b) Especies no encapsuladas T. pseudoespiralis, T. papuae y T. zimbabwensis. Los mamferos son susceptibles a todas las especies de Trichinella spp., los reptiles, solamente a T. papuae y T. zimbabwensis; en tanto que las aves son susceptibles nicamente a T. pseudospiralis (Pozio, 2001) En Sudamrica, hasta el momento, slo se han detectado infecciones por T. spiralis (Pozio, 2005). En la Argentina, la trichinellosis es una enfermedad de denuncia obligatoria. Los laboratorios de control bromatolgico municipal, de plantas faenadoras oficiales o privados, y los veterinarios privados deben comunicar al representante de la Direccin de Bromatologa de su respectivo municipio la deteccin de un resultado positivo. El municipio es responsable de la comunicacin a los organismos provinciales y nacionales. 1. MTODOS DE DIAGNSTICO DIRECTO

Los mtodos de diagnstico directo consisten en demostrar la presencia de larvas de primer estado (L1) de Trichinella spp. en tejido muscular

de huspedes susceptibles o en alimentos crudos preparados con esa materia prima. Los anlisis que se realizan en muestras de tejido muscular se limitan a la inspeccin post faena de las carnes utilizando las siguientes tcnicas: 1.1. Compresin o Triquinoscopa 1.2. Digestin Artificial o Enzimtica Los mtodos directos pueden detectar larvas de Trichinella spp. en cerdos, equinos y otros animales susceptibles, tan temprano como a los 17 das post infestacin. Este perodo coincide con el momento en que la larva muscular se hace infectiva para un nuevo husped ( Gamble y col., 2000). 1.1. TCNICA DE COMPRESIN (TRIQUINOSCOPA): Es un mtodo antiguo que an es utilizado en zonas donde no existen laboratorios con capacidad para practicar tcnicas de digestin enzimtica. El procedimiento consiste en la inspeccin ptica de muestras de tejido muscular (preferentemente diafragma) que se cortan en pequeos trozos en la direccin de las fibras y se colocan entre 2 vidrios gruesos que se comprimen desde los extremos mediante dos tornillos con tuerca mariposa, hasta quedar transparentes. Se observa con aumento de 40X en microscopio o triquinoscopio. La L1, aparece enrollada dentro de la fibra muscular y rodeada de una cpsula ovalada de aproximadamente 400 m a la altura de su eje. Cuando el material examinado corresponde a un animal con nivel alto de infeccin, se puede observar ms de una larva dentro de un mismo quiste muscular. El Manual de estndares para las pruebas diagnsticas y vacunas de la OIE (OIE 2004) indica que para cada animal, se deben tomar 28 muestras de 2 x 10 mm, totalizando un peso de 0,5 g de los sitios de predileccin, que en el cerdo son: diafragma, lengua y maseteros. Desventajas: Baja sensibilidad: el nivel de infeccin mnimo detectable es de 3 larvas por gramo de tejido analizado. Se necesita mayor tiempo para inspeccionar un nmero importante de muestras de cada carcasa, razn por la cual demorara los resultados en establecimientos de faena. Pueden obtenerse resultados falsos negativos debido a la distribucin irregular de los quistes en los tejidos y tambin por la posibilidad de encontrarse el animal muestreado en un estado inicial de la infestacin, con quistes cuya cpsula es poco evidente. En las regiones del mundo en que se ha diagnosticado la presencia de Trichinella pseudospiralis, T. papuae, y T. zimbabwensis, cuyos quistes no estn rodeados de la cpsula de colgeno que facilita la deteccin de las larvas del resto de las

especies de Trichinella spp., la prctica de la triquinoscopa es an menos recomendable. La triquinoscopa y otros mtodos similares de compresin, no son recomendados como exmenes de rutina en los alimentos de origen animal que van a ser destinados a consumo humano (Gamble y col., 2000); no obstante, la posibilidad de llevarla a cabo en zonas donde no existen laboratorios que hagan el diagnostico por digestin enzimtica, es mucho mejor que no realizar ningn diagnstico (Murrel, 2006) 1.2.TCNICA DE DIGESTIN ARTIFICIAL O ENZIMTICA: Es un mtodo directo que permite el aislamiento, visualizacin y cuantificacin de larvas de Trichinella spp. en trozos de msculo o en fiambres crudos elaborados con carne de animales susceptibles de padecer la enfermedad (Montali y col. 1997). La digestin enzimtica trata de reproducir in vitro la digestin estomacal, con el objeto de liberar las larvas de Trichinella que pudieran hallarse dentro de quistes en el tejido muscular muestreado. La carne a diagnosticar, previamente molida, se sumerge en lquido de digestin compuesto por cido clorhdrico y pepsina (ambos al 1%) en agua destilada. Luego de 30 a 45 minutos a 44 a 46 C con agitacin continua, la cpsula que encierra al parsito es destruida y quedan en libertad las larvas de Trichinella . stas L1, son recuperadas mediante procesos de filtracin y sedimentacin y se observan al microscopio o triquinoscopio para su cuantificacin, expresando el resultado como nmero de larvas encontradas por gramo de muestra (L/g) (Ruiz y col, 2007) Las larvas de Trichinella spp. miden aproximadamente 1 mm de longitud y 0.03 mm de ancho. La caracterstica morfolgica ms distintiva es la presencia del esticosoma, una serie de clulas discoidales dispuestas alrededor del esfago, que ocupan la mitad anterior de la larva. Pueden tener diferentes apariencias: enrolladas sin motilidad: cuando el medio lquido en el que se encuentran est fro. enrolladas con motilidad: cuando el medio lquido se lleva a 40 grados centgrados. en forma de C sin motilidad: se consideran larvas muertas. En caso de duda, los parsitos deben observarse a un mayor aumento y deberan examinarse mayor cantidad de tejidos (Gamble y col., 2000). Desde 1999, Argentina adopt el mtodo de digestin artificial (DA) en forma obligatoria como tcnica de referencia para el diagnstico de T. spiralis en carnes porcinas y sus derivados destinados a consumo (Resolucin 740/99 SENASA). Adems es la tcnica exigida por los miembros de la Comunidad Econmica Europea (CEE) para el comercio 4

de porcinos y sus subproductos entre los pases de la CEE o con pases del tercer mundo. La Comisin Internacional de Trichinellosis (ICT) provee lineamientos generales para los mtodos de digestin artificial. Estos mtodos son recomendados para inspeccin individual de carcasas de cerdos, equinos o de animales de caza cuyas carnes sean destinadas a consumo humano (Gamble y col. 2000). Los laboratorios que diagnostican trichinellosis por el mtodo de digestin artificial, deben mantener un adecuado sistema de calidad para garantizar la sensibilidad del ensayo. Deben ser validados antes de autorizar su funcionamiento, empleando muestras conocidas positivas y negativas y posteriormente monitorear peridicamente su eficacia utilizando paneles de muestras en ensayos ciegos (pruebas de proficiencia) (Forbes & Gajadhar, 1999, Gajadhar & Forbes, 2001) La sensibilidad de los mtodos de diagnstico directos depende de la cantidad de muestra de tejido examinado y del msculo del que fueron obtenidos. Para determinaciones de rutina por digestin artificial en reas no endmicas, es recomendable utilizar 1 g de muestra por animal, pero es preferible utilizar 5 g por animal, sobre todo en reas endmicas: con 1 g se obtiene una sensibilidad de 3 l/g de tejido, en cambio, procesando 5 gramos, la sensibilidad se incrementa a 1 L/g de tejido (Gamble, 1996, Gamble y col., 2000) Envo de las muestras para diagnstico El tamao de muestra puede variar. Se pueden tomar muestras individuales de hasta 100 g por animal. Las muestras, deben tomarse a partir de los msculos ms frecuentemente infectados, segn la especie animal. Los msculos recomendados por la Comisin Internacional de Trichinellosis (ICT) (Gamble y col., 2000) son los siguientes: Cerdos: pilares del diafragma (zona de transicin entre la parte muscular y la tendinosa) o lengua. Caballos: lengua o msculos maseteros. Jabal: msculos del antebrazo o del diafragma. Zorros: diafragma, lengua, msculos flexores y extensores de los miembros anteriores. Los animales a muestrear deben estar identificados con medios confiables (Caravanas numeradas, tatuaje, chips). Las muestras no deben congelarse. Deben enviarse al laboratorio de diagnstico, en bolsas plsticas individuales, identificadas con marcador indeleble y acondicionadas en una caja de trmica con refrigerantes. Es muy importante que estn acompaadas de un protocolo con los siguientes datos: Nombre de la persona que las remite Nombre y ubicacin del establecimiento de origen de las muestras.

Cantidad de animales muestreados, y nmero de muestras de cada animal. Para la toma de muestras en frigorficos, es importante considerar aspectos diferenciales segn se trate de faenas de rutina o faenas compulsivas originadas en un foco. A. En faenas de rutina: Se toman como mnimo 50 g de los msculos recomendados. Esto permite realizar nuevos anlisis en caso de resultar alguna muestra positiva. En el cerdo, se extraen de los pilares del diafragma. Si no hubiere o no alcanzare el pilar del diafragma, se deber tomar parte del diafragma situada cerca de las costillas o del esternn, de la musculatura de la base de la lengua, de los msculos masticadores o de los intercostales (Montali y col., 1997). Las muestras se colocan en bandejas con cuadrantes numerados correlativamente, de acuerdo al orden que tengan las carcasas en la noria. Para carnes porcinas destinadas al consumo, se deben tomar submuestras de 5 g por animal y agrupar en lotes de 20 animales cada uno. Es conveniente que las muestras agrupadas no superen los 100 g ya que no resulta adecuado trabajar con mayor cantidad de muestra, pues se requerir material de vidrio de una capacidad superior, lo que provoca un manejo dificultoso. Si en las muestras agrupadas se encuentran larvas de Trichinella spp., se repite la tcnica con submuestras de 20 g por animal en grupos de 5 animales. Si uno de estos grupos vuelve a dar resultado positivo, se repite la tcnica en forma individual con 20 g de carne por animal para identificar el o los animales positivos. B. En faenas compulsivas de animales provenientes de un foco: Si los animales provienen de focos de trichinellosis se toman como mnimo submuestras de 10 g y muestras agrupadas de hasta 10 animales para realizar la tcnica de DA. Se sugiere esta cantidad para aumentar la posibilidad de deteccin de larvas. Ventajas con respecto a la Triquinoscopa: Se pueden analizar muestras agrupadas en forma simultnea acortando el tiempo de diagnstico (rutina de frigorficos). Posee mayor sensibilidad ya que se analiza una mayor cantidad de muestra.

La tcnica de digestin artificial nos permite tambin confirmar la presencia del parsito en los chacinados que provocaron brotes. Hay que tener en cuenta que si la muestra no se encuentra altamente parasitada, se deber llegar al agotamiento total de la pieza para emitir un resultado certero. Un diagnstico de ausencia de Trichinella spp. en 6

una determinada cantidad de muestra de chacinado relacionada con un brote, no certifica la ausencia del parsito en el resto de la misma ni habilita su comercializacin (Montali y col. 1997) Para jamn, bondiola y panceta, que estn elaborados solo con carne porcina, se analizan 50 g de muestra. En el caso de jamn crudo, la experiencia demuestra que la zona en donde se encuentra mayor cantidad de larvas es en la zona prxima al garrn ( Montali y col. 1997) 2. METODOS INDIRECTOS

Los mtodos indirectos sugieren la presencia del parsito evidenciada por la presencia de anticuerpos especficos. Estas pruebas se basan en el reconocimiento de un antgeno de Trichinella por parte de los anticuerpos anti-Trichinella formando inmunocomplejos. Los antgenos estn adsorbidos en una fase slida por ejemplo un porta objeto, una placa de poliestireno, o una membrana de nitrocelulosa. Las sustancias marcadoras para revelar la presencia de los inmunocomplejos son enzimas o colorantes fluorescentes, y la seal emitida es detectada mediante microscopio de fluorescencia o espectrofotmetros. Las tcnicas ms utilizadas para detectar la presencia de anticuerpos anti -Trichinella son: Inmunofluorescencia indirecta (IFI), Inmunoabsorcin enzimtica indirecta (ELISA indirecto) Inmunoelectrotransferencia o Western Blot (WB).

El inmunodiagnstico se utiliza para detectar animales reactores positivos en las piaras. La deteccin de IgG anti-Trichinella en sueros de cerdos puede considerarse como una herramienta estratgica en los programas de vigilancia epidemiolgica. Su aplicacin continuada puede ser de utilidad para establecer reas de riesgo en las que se deberan intensificar las medidas de control. 2.1. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI): Es una tcnica capaz de detectar complejos antgeno-anticuerpo usando anticuerpos anti-inmunoglobulina porcina marcados con colorantes fluorescentes como el Isotiocianato de fluorescena. Estas sustancias al ser excitadas con luz de longitud de onda del rango ultravioleta 190-380nm, emite luz visible que se observa como fluorescente en un microscopio de fluorescencia El proceso consta de dos etapas: en la primera se fijan sobre un portaobjetos los antgenos que constituyen el substrato conocido especfico . Puede realizarse a partir de un corte de tejido muscular infectado o bien a partir de larvas musculares de T. spiralis fijadas 7

sobre un portaobjetos con acetona a 20C, sobre el cual se coloca el suero del animal a analizar. Si la reaccin es positiva, se producir la formacin del complejo antgeno-anticuerpo. En la segunda etapa se enfrenta una anti-inmunoglobulina porcina marcada, con el complejo citado y se produce una reaccin fluorescente visible en el microscopio de fluorescencia . (Venturiello y col., 1998) Se considera : suero reactivo ( positivo) cuando hay presencia de fluorescencia y suero no reactivo o negativo cuando hay ausencia de fluorescencia. Ventajas: Es sensible y rpida. Es econmica si se posee el microscopio de fluorescencia.

La inmunofluorescencia indirecta se visualiza en forma ms brillante que la deteccin directa debido a que varias anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada una de las molculas de antgenoanticuerpo formadas en la primera etapa. Desventajas: Se necesita un microscopio de fluorescencia. Tiene menor especificidad que el ELISA y el WB. 2.2 ELISA Indirecto: El ensayo inmunoenzimtico ELISA indirecto se basa en el uso de: Antgeno de T. spiralis inmovilizado sobre una fase slida (placa de 96 pocillos) Sueros con anticuerpos provenientes de animales infectados que se utilizan como controles positivos Sueros controles negativos de animales no infectados Sueros problema Un suero anti-especie marcado con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica pudiendo ser revelada mediante la adicin de un substrato especfico que en accin con la enzima producir un color observable a simple vista y/o cuantificable por un lector de ELISA.

Inicialmente se utilizaban antgenos de extractos somticos de las larvas musculares lo que resultaba en un ELISA de baja especificidad (Ruitenberg y col., 1974). Durante la dcada del 80 se desarroll la metodologa para la obtencin de antgenos de excrecin secrecin (ES) obtenidos a partir de metabolitos de las larvas musculares de Trichinella en cultivos in vitro. Estos antgenos corresponden a un grupo de glicoprotenas

relacionadas con un peso molecular aproximado 45-55 kDa (Gamble y col., 1983). Se ha determinado que el uso de antgenos ES de larvas musculares aumenta la especificidad de los resultados obtenidos respecto a los antgenos de adultos o de los antgenos somticos (Murrell y col.,1986, Nowakowski, 2004). Varios autores han reportado la utilizacin con xito del test indirecto de ELISA con antgeno ES para el diagnstico en varias especies animales (Murrell y col. 1986; Gamble y col.,1997; Pozio y col 2002b) Fue a partir de estas investigaciones, que se concentraron los esfuerzos para lograr un antgeno purificado ES que pudiera cumplir con el requerimiento indispensable de lograr una mayor sensibilidad y especificidad en el diagnstico. Los resultados de ensayos experimentales indican que la prueba de ELISA utilizando antgeno ES de T. spiralis inicia la deteccin de anticuerpos anti-Trichinella en cerdos inoculados experimentalmente entre los 21 y 56 das post-inoculacin. (Van Knapen y col., 1980, Gamble y col., 1983, Gamble, 1996, Ribicich, y col. 2000) Ventajas: La prueba de ELISA se caracteriza por presentar alta sensibilidad, especificidad, rapidez y economa. Es verstil, robusta, de simple realizacin. Permite realizar numerosas muestras a la vez. Se puede realizar sin necesidad de faenar al animal. La muestra de eleccin es el suero sanguneo, pero tambin hay reportes sobre la utilizacin de lquido muscular con resultados equivalentes a los obtenidos con sueros sanguneos (Beck y col., 2005) La sensibilidad del ELISA indirecto es del orden de 0,01 l/g. Esto significa que es capaz de detectar los anticuerpos inducidos por un nivel de infeccin de una larva en 100 g de carne. Desventajas: Puede presentar resultados falsos negativos. Puede presentar resultados falsos positivos.

Se pueden mencionar distintas causas que explicaran la aparicin de resultados falsos negativos o falsos positivos: El perodo ventana: es un lapso durante el perodo temprano de la infeccin con Trichinella , en el cual los anticuerpos especficos no pueden ser detectados en el animal infectado. Este perodo se extiende durante los 17 das post infeccin (tiempo en que la larva se hace infectiva) y dependiendo de la dosis infectante, puede llegar hasta el da 40 p.i. (Nckler y col., 2005)

La respuesta tarda es una aparicin demorada de los anticuerpos debida a bajos niveles de infeccin o a factores del hospedador asociados con un mal estado nutricional, edad, o simple variabilidad individual (Nckler y col., 2005). La inmunidad cruzada es causa de la aparicin de resultados falsos positivos y se debe a la presencia de anticuerpos generados contra nematodes del tubo digestivo, especialmente Ascaris suum y Trichuris suis. El empleo del antgeno de ES, en reemplazo de los antgenos somticos totales originalmente utilizados redujo la proporcin de falsos positivos por inmunidad cruzada (Gamble y col., 1983) 2.3 INMUNOELECTROTRANSFERENCIA o Western Blot ( WB):

Esta tcnica se basa en la deteccin de la unin de: anticuerpos anti T. spiralis presentes en el suero de cerdos positivos con bandas polipeptdicas especficas obtenidas por electroforesis del antgeno ES

En un primer paso se obtiene el fraccionamiento del antgeno ES en bandas de distinto peso molecular mediante su siembra en un gel de poliacrilamida que se somete a electroforesis ( SDS PAGE Fig. 1) Las protenas inmunognicas especficas de T. spiralis se ubican en un triplete de bandas localizadas de 42 a 60 KDa. La totalidad de las bandas obtenidas en el gel, se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y esta, luego de un bloqueo para evitar reacciones inespecficas, se pone en contacto con sueros porcinos. La unin antgeno anticuerpo se visualiza mediante el uso de anticuerpo anti cerdo unido a peroxidasa y la posterior incubacin con substrato para obtener un compuesto coloreado en el lugar ocupado por el complejo. Si el lugar ocupado por los anticuerpos en la membrana coincide con el triplete de bandas especficas, el suero problema se considera positivo (Fig. 2) (Ruiz y col., 2007) El resultado positivo obtenido por un suero en esta prueba, es imprescindible para confirmar el resultado positivo obtenido por el mismo suero en la prueba de ELISA.

Ventajas: Presenta alta especificidad. Desventajas: Es laboriosa Es costosa. 10

3. TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR PARA GENOTIPIFICACIN. La caracterizacin molecular ha provisto la informacin sobre especies y genotipos que permiti confirmar la actual clasificacin taxonmica. Hoy se la emplea para identificar el genotipo de los aislamientos que se llevan a cabo en distintas regiones y hospedadores. Las tcnicas que se han empleado para la tipificacin de las cepas de Trichinella spp., son: a) Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP): Esta tcnica se basa en la diferenciacin de distintos organismos que poseen polimorfismos en sus molculas de ADN en distintos sitios de corte reconocidos por endonucleasas de restriccin. Este mtodo en combinacin con la tcnica de PCR permiti la diferenciacin de 9 genotipos de Trichinella (Nagano y col., 1999) b) Amplificacin aleatoria de polimorfismos de ADN (RAPD): Es una variante de la PCR que utiliza cebadores diseados en base a secuencias aleatorias y de corta longitud en una reaccin de amplificacin bajo condiciones no especficas. Result ser una herramienta til en la identificacin a nivel especie de los genotipos de Trichinella (Prez-Martin y col, 2000). c) Sondas de ADN: Son secuencias nucleotdicas de tamao variable que se unen especficamente por complementariedad a la regin de ADN que se 11

quiere localizar aplicando la tcnica de Southern Blot. Mediante la utilizacin de sondas especficas de ADN obtenidas de distintos genotipos de Trichinella se logr diferenciar algunos genotipos como : T. spiralis y T. murrelli, (Zarlenga y col., 1991), (Snyder y col., 1993), T. nelsoni y Trichinella . T8 (La Rosa y col., 2000) e identificar por primera vez a T. pseudospiralis (Lindsay y col., 1995) d) Polimorfismos de la conformacin de las cadenas simples (SSCP): Esta tcnica se basa en la conformacin diferencial que adopta un fragmento de ADN monocatenario y que se detecta por un cambio de movilidad en una electroforesis en gel de poliacrilamida. Una mutacin puntual en un fragmento de ADN analizado puede evidenciarse mediante una variacin en el patrn de migracin de sus cadenas simples. El anlisis empleando esta metodologa permite comprobar la variabilidad intraespecfica entre individuos de una misma especie de Trichinella (Gasser y col, 1998). e) Multiplex PCR: Consiste en la amplificacin simultnea en una misma reaccin del sector genmico de inters. En un solo tubo de reaccin pueden incluirse 5 pares de cebadores que permiten diferenciar 9 genotipos de Trichinella . La tcnica de multiplex PCR de secuencias repetidas del ADN ribosomal es ampliamente utilizada para la identificacin de Trichinella a nivel especie (Zarlenga y col., 1999). CONCLUSIONES: En Argentina, la tcnica de digestin enzimtica se aplica de rutina en los establecimientos habilitados para faena de cerdos y en los frigorficos que faenan equinos para exportacin. Su aplicacin asegura que los cerdos que se comercializan en los centros densamente poblados o que se utilizan en la preparacin industrial de fiambres crudos de consumo masivo, no sean fuente de transmisin de trichinellosis. El porcentaje de cerdos positivos a trichinellosis provenientes de criaderos comerciales es menor al 1%. El circuito de tenedores de cerdos para subsistencia y de cra familiar es el que origina brotes con mayor frecuencia. Esto se debe a las deficientes condiciones sanitarias y de manejo y a la utilizacin de la carne, sin diagnstico previo, para la produccin casera de chacinados (Caracostantogolo y col., 2007) Esta falta de diagnstico previo tiene orgenes mltiples, entre los que se pueden citar: La falta de conocimiento de la poblacin sobre la enfermedad, su forma de transmisin y la existencia del diagnstico.

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 Las grandes distancias hasta los centros poblados donde un profesional veterinario podra hacer el diagnostico por triquinoscopa o digestin artificial. La inexistencia de playas de faena municipales en las que los tenedores o criadores de cerdos puedan faenar sus animales con diagnstico de trichinellosis y de otras enfermedades La faena domiciliaria que, adems de las razones anteriores, se practica por razones culturales atvicas. El diagnstico directo es la forma segura para evitar que la poblacin humana enferme, pero es de difcil aplicacin en el circuito de cra familiar o para subsistencia que, por sus condiciones deficientes de manejo y sanidad, es el ms riesgoso (Caracostantogolo y col., 2007) Las instalaciones, instrumental, material de vidrio y reactivos de laboratorio necesarios para hacer el diagnostico por digestin artificial de un numero apreciable de muestras por da, tienen un valor aproximado a los 3000 dlares. El costo de los reactivos para analizar muestras individuales de 20 gramos es de 2 dlares. Esto significa que, instalar y mantener en funcionamiento un laboratorio municipal, es mucho ms barato y econmico que solventar los gastos en servicio hospitalario, el dao econmico a las personas que acarrea la imposibilidad de trabajar debido a la enfermedad y las costas de los juicios contra la municipalidad que pueden originarse por un brote de trichinellosis. Mediante la utilizacin del diagnstico serolgico para vigilancia epidemiolgica, se puede : Detectar zonas de riesgo de trichinellosis, Hacer estudios locales para detectar los factores de riesgo Operar los cambios necesarios para disminuir el riesgo, a travs de la promocin de mejoras en las prcticas de crianza y en las condiciones de vida de los tenedores de cerdos para subsistencia.

Los kits diagnsticos comerciales son importados y de alto precio. Por esta razn la elaboracin de antgeno de ES para las pruebas de ELISA y Western Blot en porcinos, se est llevando a cabo en el Instituto de Patobiologa del INTA Castelar. Su utilizacin para el procesamiento de muestreos se hace, a modo experimental, con la participacin de los profesionales del SENASA, de las direcciones de ganadera provinciales, de bromatologa municipales y de las ctedras de parasitologa de las facultades de veterinaria. El mejoramiento del control de la trichinellosis depende de: La mejora en la capacidad operativa para extender el mbito de aplicacin del diagnstico directo e indirecto.

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 Una adecuada interrelacin de las instituciones involucradas en salud humana y animal La promocin de buenas prcticas sanitarias y de manejo.

El diseo de campaas de informacin eficientes a travs de los medios masivos, de las instituciones educativas en todos los niveles y de los programas de extensin y promocin social. El compromiso de los profesionales veterinarios privados y la existencia de programas sanitarios que los incluyan como actores interesados. El firme compromiso de las autoridades sanitarias para asegurar un programa de control eficiente, que tenga como objetivo la erradicacin de esta importante zoonosis. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Beck, R.; Gaspar, A.; Mihaljevic, .; Marinculic, A.; Stojcevic, D.; Brstilo, M. 2005. Evaluation of ELISA for detection of Trichinella antibodies in muscle juice samples of naturally infected pigs. Veterinary Parasitology.132: 91-95 Bolpe, J., Montali, G., Caminoa, R., Pouzo, M., 2001. Epidemiological surveillance and control of trichinellosis in Buenos Aires province. Xth ICT Conference, Aug 2000. Parasite, Vol 8, 2, S236-S239. Caracostantogolo, J.; Steffan, P.; Dillon, J.; De La Sota, M.; Belgrano, D.; Veneroni, R.; Ruiz, M.; Schapiro, J.; Castao, R.; Martinez, M.; Morici, G.; Balbiani, G.;Castro, M. y Eddi, C. (2007) Mejoramiento del control de la trichinellosis en Argentina: Proyecto TCP ARG 3003 entre la FAO y el Gobierno Argentino. En Mejoramiento del control de la trichinellosis. FAO Amrica Latina y el Caribe. Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin, Roma 2007. ISBN 878-92-5 305737-5. Pag. 5-66. Forbes L.B. & Gajadhar A.A. (1999). A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat. J. Food Prot., 62, 1308-1313.) Gajadhar A.A. & Forbes L.B. (2001). An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety with example data on trichinellosis. Vet. Parasitol., 103, 133-140.) Gamble H.R. (1996). Detection of trichinellosis in pigs by artificial digestion and enzyme immunoassay. J. Food Prot., 59, 295-298.

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