Abstracto El principal objetivo de nuestro estudio fue determinar el valor aadido de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnstico

de Histoplasma capsulatum en la prctica de rutina biolgica. No hay seal de amplificacin se observ con los 18 no-H.capsulatum cepas utilizadas para probar la especificidad del protocolo. El umbral de sensibilidad de la prueba de PCR en tiempo real fue de 10 fg de H. capsulatum ADN por microlitro, a prueba con una serie de dilucin de 10 veces del control positivo. Se analizaron 348 muestras de humanos que presenten para el diagnstico de rutina de las micosis sistmicas. PCR en tiempo real usando el sistema TaqMan fue evaluada frente a un examen microscpico directo y la cultura. Entre los 341 muestras sin inhibicin de la PCR (n = 7), de 66 aos dio positivo por la cultura, mientras que 74 dieron positivo por PCR en tiempo real. Sensibilidad de la prueba PCR en tiempo real se estim en 95,4% y una especificidad del 96,0% con respecto a la cultura, ampliamente considerado como el mtodo estndar de oro, sin embargo, el enfoque molecular, de hecho, producen una mayor sensibilidad y especificidad de los resultados. Por otra parte, para las 38 muestras que dieron negativo en el examen directo, pero positivo, por la cultura, el mtodo de cultivo tuvo un promedio de 31 das ms que el mtodo de PCR para generar resultados. El protocolo que aqu se presenta puede ser muy til para mejorar el diagnstico de rutina histoplasmosis. 2010 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

Palabras clave: Histoplasma capsulatum; Diagnstico; PCR en tiempo real, la cultura, las muestras de humanos

1. Introduccin Descrita por primera vez en 1906 por Darling (1906), la histoplasmosis es una enfermedad infecciosa causada por la inhalacin de hongos dimrficos Histoplasma capsulatum microconidias (Goodman y Larsh, 1967). Dos variedades de H. capsulatum son patgenas para los seres humanos: H. capsulatum var. capsulatum y H. capsulatum var. duboisii. Aunque la histoplasmosis es una micosis sistmica endmica del trpico localizadas en las Amricas y en partes de Asia y frica, varios casos se producen en reas no endmicas (Trigo, 2006). Esta enfermedad afecta principalmente a pacientes inmunodeprimidos, especialmente aquellos con VIH. Sin embargo, algunos casos de histoplasmosis diseminada

autor correspondientes. Servicio de Parasitologie-Mycologie Mdicale (LHUPM), Centre Hospitalier Andre Rosemon, BP 6006, rue des

flamboyanes, Cayenne, Guayana Francesa. Tel: +594-594-29-61-32; fax:. +594594-29-34-13.

E-mail: christine.aznar1 @ wanadoo.fr (C. Aznar).

0732-8893 / $ - ver frente a la materia 2010 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2009.10.010

en individuos inmunocompetentes se han descrito (Benavides et al, 2007;. Schestatsky et al, 2006;. Washington y Palacio, 2007).

H. capsulatum ha sido reportado en la Guayana Francesa ya 1952 (Floch, 1953). El nmero de casos de histoplasmosis diagnosticados ha aumentado cada ao desde 1990. Sesenta y tres casos nuevos se han diagnosticado en el Hospital Cayenne entre 2005 y 2007. Histoplasmosis y toxoplasmosis cerebral se ha convertido en la principal causa de mortalidad en los pacientes VIH (Couppie et al, 2006;. Lewden et al, 2004).. El examen microscpico directo y cultivo en Sabour-AUD medios de comunicacin son el mtodo estndar de oro para el diagnstico. Sin embargo, el examen microscpico requiere un buen nivel de experiencia. Por otra parte, el mtodo de cultivo es muy lento (hasta 4 meses) y es peligroso (debido a la presencia de esporas). Desarrollo en biologa molecular y la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) ha permitido la deteccin de H. capsulatum ADN. Varios protocolos de PCR anidada, incluyendo el uso de una serie de secuencias objetivo, se

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utilizado para caracterizar el ADN de H. capsulatum (Bialek et al. 2002a, 2002b; Bracca et al, 2003;. Maubon et al, 2007).. Sin embargo, el riesgo de contaminacin antes era elevada, sobre todo con la PCR anidada. Hoy en da, con la tecnologa en tiempo real PCR, el riesgo de esto y los tiempos de reaccin se reducen al mnimo.Por otra parte, en tiempo real PCR aumenta la sensibilidad y especificidad, y tambin permite la cuantificacin de ADN. Hemos desarrollado un protocolo de PCR en tiempo real usando el sistema TaqMan, como sondas TaqMan se puede utilizar en todas las mquinas de PCR en tiempo real, a diferencia de LightCycler (Roche Molecular Biochem-micos, Meylan, Francia) sondas. Adems, no existen informes anteriores de las sondas TaqMan se utiliza para la deteccin de H. capsulatum. Los cebadores y la sonda elegida se han probado con cepas de hongos y diversas muestras clnicas. 2. Materiales y mtodos 2.1. Especificidad analtica Hemos utilizado 20 cepas de hongos proporcionada por el LHUPM (Cayenne Hospital) y la Coleccin de Hongos Pasteur (Instituto Pasteur, Pars) para la prueba de especificidad (muestras por triplicado) (Tabla 1). 2.2. Sensibilidad analtica H. capsulatum var. capsulatum cultivos positivos fueron recogidos con una punta y se coloc en un microtubo que contiene 200 l de agua estril. El ADN fue extrado (ver el ADN

la extraccin de ms abajo) y estandarizado a 100 mg / ml mediante la medicin de la absorbancia a 260 nm con un espectrofotmetro-eter (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Las muestras se diluyeron en serie de 10 veces para obtener soluciones que van desde 100 ng de 0,1 fg de ADN genmico de H. capsulatum por microlitro. La umbral de sensibilidad de la PCR en tiempo real (ver detalles ms abajo) se analiz mediante la ejecucin de estas soluciones de ADN por triplicado. 2.3. Sensibilidad y especificidad clnicas Un total de 348 muestras clnicas (lavado broncoalveolar [n = 43], la biopsia heptica [n = 30], biopsias intestinales [n = 31], la sangre entera [n = 48], la mdula sea [n = 108], los ganglios linfticos [ n = 25], el lquido cefalorraqudeo [n = 55], y la biopsia cutnea [n = 8]) recogidos en el diagnstico de las micosis sistmicas entre 2004 y 2007 en la Unidad de Micologa (LHUPM) se incluyeron en este estudio. Las muestras fueron examinadas directamente (tinta china y May-Grunwald Giemsa se utiliza). Las muestras se dividieron en dos grupos: los sometidos a la extraccin de ADN y por lo tanto se almacenan a 4 C y los sometidos a la cultura. Muestras de ADN fueron analizados prospectivamente para 2005 a 2007; ADN del ao 2004, se almacenan a -80 C, se llevaron a cabo a posteriori. Las muestras fueron cultivadas en agar Sabouraud con cloranfenicol y la gentamicina, con y sin cicloheximida. Los cultivos se incubaron a 30 o 37 C durante un mximo de 8 semanas. 2.4. Extraccin de ADN 2.4.1. Cepas Colonias de hongos fueron recogidos con una punta y se coloca en un microtubo que contiene 200 l de agua estril. Se extrajo el ADN con la sangre DNeasy y el kit de tejido (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, despus de proteinasa K de incubacin, todas las muestras fueron sometidas a tres ciclos de congelacin a -80 C durante 10 minutos y hervir durante 10 minutos. Este paso se aplic para romper las paredes celulares de los hongos. Muestras de ADN fueron normalizados a los 2 mg / ml mediante la medicin de la absorbancia a 260 nm con un espectrofotmetro (Eppendorf).

Tabla 1 Las cepas analizadas Tensin A. fumigatus Candida albicans Candida dubliniensis Candida parapsilosis Origen LHUPM, Cayenne LHUPM, Cayenne LHUPM, Cayenne LHUPM, Cayenne Coleccin no. PCR en tiempo real resultado Negativo Negativo Negativo Negativo

Candida tropicalis Malassezia globosa Blastomyces dermatitidis Chrysosporium indicum C. neoformans var. neoformans Cryptococcus amylolentus Cryptococcus laurentii H. capsulatum var. capsulatum H. capsulatum var. duboisii Malassezia furfur Penicillium marneffei Penicillium roqueforti Rhodotorula rubra Saccharomyces cerevisiae Sporothrix schenckii Trichosporon spp.

LHUPM, Cayenne LHUPM, Cayenne Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin Pasteur Hongos Coleccin UMIP 973,68 UMIP 1.393,82 UMIP 1.173,78 UMIP 2.091,92 UMIP 2.258,94 UMIP 632,61 UMIP 638,61 UMIP 1.634,86 UMIP 560,56 UMIP 1.404,82 UMIP 2.257,94 UMIP 1.432,83 UMIP 1.934,90 UMIP 660,63

Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positiva Positiva Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

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2.4.2. Muestras Todas las muestras de los pacientes fueron centrifugadas a 3000 g durante 10 minutos. Se extrajo el ADN de 200 l de pellet aislados despus de la centrifugacin, de 200 l de capa leucocitaria aislados de la sangre entera, y de 25 mg de cada muestra para biopsia, con el mismo protocolo descrito anteriormente. ADN se eluy con 200 l de tampn de elucin, y 5-l alcuotas fueron trasladados a la mezcla de PCR. 2.5. PCR en tiempo real H. capsulatum cebadores especficos y la sonda TaqMan fueron seleccionados de la regin espaciador transcrito interno del complejo de genes rRNA (GenBank adhesin no. AB055231) (Martagon-Villamil et al., 2003). Los cebadores y sondas fueron diseados utilizando Primer Express Software versin 3.0 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia). Primer secuencias fueron HcITS-167F 5'AACGATTGGCGTCTGAGCAT-3 'un d H I c-2 TS 29 R 5'-GAGATCCGTT G TT-GAAAGTTTTGA-3 ', y la sonda se HcITS-188P 5'-6-FAM-AGAGCGATAATAATCC -MGB-3 '. La sonda TaqMan fue marcado con el colorante fluorescente de 6 carboxyfluor-escein al extremo 5 'y un extintor no fluorescentes, junto con una carpeta de surco menor en el extremo 3' (Applied Biosystems). En tiempo real las reacciones de PCR se llevaron a cabo en dos ejemplares en los volmenes finales de 25 l con 1 TaqMan PCR Universal Master Mix con uracilo-N-glycosylase (Applied Biosystems), 0,9 mmol / L de cada cebador, 0,25 mmol / L de la sonda, 5 l de ADN, y 3 l de TaqMan exgenos control positivo interno (Exo IPC), que contiene ADN especficas y cebadores y la sonda correspondiente (Applied Biosystems). Se utiliz el IPC Exo kit para controlar la ausencia de inhibidores en el tubo reactiva. Todas las reacciones se llevaron a cabo durante 45 ciclos en el 7300 del sistema en tiempo real PCR (Applied Biosystems). De sensibilidad y especificidad clnicas, las muestras se realizaron por duplicado. 2.6. Anlisis de los datos

La sensibilidad diagnstica se define como la fraccin de las muestras correctamente identificados con H. capsulatum por PCR en tiempo real en comparacin con el aislamiento a travs del mtodo estndar de oro. La sensibilidad fue calculada como el nmero de verdaderos positivos / (nmero de verdaderos positivos + nmero de falsos negativos). Especificidad diagnstica se define como la fraccin de falsos positivos identificados por las muestras de PCR en tiempo real con respecto al aislamiento a travs del mtodo estndar de oro. La especificidad fue calculada como el nmero de verdaderos negativos / (nmero de verdaderos negativos + nmero de falsos positivos). Si la reaccin de PCR se inhibi, el resultado fue reportado como tal y muestras, 71 (20,4%) dieron positivo para H. capsulatum var. capsulatum y 277 (79,6%) fueron negativas para H. capsulatum var.capsulatum (Tabla 2). Entre las 277 muestras que resultaron negativas para H. capsulatum var. capsulatum por la cultura, de 36 aos dio positivo a otros microorganismos (3 Cryptococcus neoformans, 5 Pneumocystis carinii, un Paracoccidioides brasiliensis, 19 Candida albicans, Candida spp 4., 1 Aspergillus fumigatus, un Aspergillus flavus, un Leishmania braziliensis, y un Leishmania infantum). Entre las 71 muestras que dieron positivo por la cultura, 38 (53,5%) fueron negativas en el examen directo. La duracin media de la cultura de H. capsula-tum entre estas 38 muestras fue de 31,9 das ( 18,4 das, con perodos que duran desde el da 1 al 80). 3.2. PCR en tiempo real los resultados: la especificidad y la sensibilidad analtica En tiempo real especificidad de la PCR se analiz con diversas cepas de hongos suministrada por la Coleccin de Hongos Pasteur y la Unidad de Micologa del LHUPM (Tabla 1). Slo H. capsulatum var. capsulatum y H. capsulatum var. cepas duboisii dio positivo, y no se observaron seales de las cepas de ADN. Este ensayo fue del 100% especfico para la deteccin de H. capsulatum a partir de otras cepas de hongos cultivados. Se analiz la sensibilidad de TaqMan PCR probando varias diluciones del control positivo (de 100 ng a 0,1 fg de H. capsulatum ADN por microlitro). El umbral de sensibilidad fue de 10 fg de H. capsulatum ADN por microlitro, lo que representa el 50 fg de ADN por ensayo (Fig. 1 A). Los anlisis de sensibilidad se realizaron en dplex con el IPC para reproducir las condiciones rutinarias de diagnstico. La pendiente de la curva fue de -3,25, y la correlacin de coeficiente de correlacin fue 0,998 (Fig. 1 B). 3.3. PCR en tiempo real los resultados en comparacin con otros mtodos: especificidad clnica y la sensibilidad Entre las muestras de 348 pruebas de PCR en tiempo real, siete ejemplares (2%) contenan inhibidores que inhiben la reaccin de amplificacin (5 dieron positivo por la cultura y 2 dieron negativo). De los restantes 341 muestras (Tabla 2) que se sometieron a PCR sin inhibiciones, 327 (95,9%) proporcionaron resultados similares, ya sea probada por cultivo o PCR en tiempo real.

Tabla 2

La deteccin de H. capsulatum por la cultura Sabouraud y PCR en tiempo real

las muestras no se incluyeron en los clculos.

Micologa

resultados (n = 348)

PCR en tiempo real

resultados (n = 348)

Muestras

interpretable (n = 341)

3. Resultados 3.1. Los resultados obtenidos por la cultura Un total de 348 muestras clnicas se analizaron con el mtodo estndar de oro de la cultura en agar Sabouraud. De estos 348
Positivos (71) Positivo 63 66 3 negativo Con inhibidores de la 5

Negativos (277) 11 275 positivos 264 negativos Con inhibidores de la 2

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Fig. 1. La deteccin de H. capsulatum var. capsulatum utilizando PCR en tiempo real con la sonda TaqMan. La sensibilidad de la H. capsulatum en tiempo real PCR. (A) TaqMan trama de amplificacin (muestras por triplicado) de 10 veces diluciones en serie que corresponde a entre 100 ng y 0,1 fg de ADN H. capsulatum por microlitro. (B) La curva de nivel correspondiente, en representacin de regresin lineal para el ciclo umbral (Ct) en comparacin con los valores de concentracin de la muestra logaritmo. La pendiente, interseccin y coeficiente de regresin se muestran.

Las 36 muestras que fueron negativas para H. capsulatum por la cultura, pero positivo para otras cepas de hongos fueron negativos por PCR en tiempo real. Las discrepancias se encontraron en 14 muestras: 3 dio positivo por la cultura y la negativa por PCR en tiempo real, y 11, a pesar de negativas por la cultura y el examen directo, dio positivo por PCR en tiempo real (Tabla 3).
Tabla 3

Los datos de las muestras con resultados discrepantes (cultivo negativo, PCR en tiempo real positiva)

Muestra (n = 11) de microorganismos de otros pacientes

Otras muestras del mismo paciente

Resultados micolgicos (-) y PCR (+) De mdula sea (n = 4)

Sexo, edad (aos) a

detectado

Naturaleza

Resultados micolgicos (Examen microscpico / cultura)

PCR en tiempo real

F, de 25 aos M, 26 M, 39 M, 42

No No No No No No No No No No No

La biopsia del hgado De sangre entera De mdula sea La capa leucocitaria De mdula sea De mdula sea La biopsia del hgado de mdula sea Ganglios linfticos Biopsia de colon La capa leucocitaria

(-/+) (-/+)

(+) nt b

(+/+) (-/+) (+/+) (-/+) (-/+) (-/+) H. capsulatum positiva histologa H. capsulatum positiva histologa (-/+)

(+) nt nt nt Presencia de inhibidores nt nt (+)

El lquido cefalorraqudeo (n = 2) Ganglios linfticos (n = 3)

F, de 47 aos M, 47 F, de 32 aos F, de 55 aos M, 63

Biopsia de colon (n = 1) La capa leucocitaria (n = 1)

una

F, de 45 aos M, 34

M = masculino, F = femenino.

nt = no ensayado.

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La sensibilidad y especificidad se calcul un 95,4% y 96,0%, respectivamente. El valor predictivo negativo (VPN) y el valor predictivo positivo (VPP) fueron del 98,9% y 85,1%, respectivamente. 4. Discusin

Diagnstico actual de la histoplasmosis se puede hacer con diversas tcnicas, tales como el examen directo, la cultura, la prueba de antgeno, o biologa molecular. En los casos de diseminacin durante la infeccin por el VIH, la prueba ms contributivo (97% de sensibilidad, 85% de especificidad) es actualmente la identificacin de los antgenos de histoplasma en muestras de orina o de sangre(de trigo, 2003). Esta prueba tambin es til para el diagnstico de los ltimos casos pulmonares y la meningitis. Por desgracia, esta tcnica es cara (80 dlares EE.UU. por prueba) y slo est disponible en los Estados Unidos (Couppie et al., 2006). Recientemente se han desarrollado, PCR en tiempo real requiere de una sola pasada sin necesidad de anlisis en gel de agarosa y, de hecho, la muestra se analiza sin necesidad de abrir el tubo de PCR, lo que reduce significativamente los riesgos de contaminacin si se compara con la PCR anidada. Los resultados tambin se obtienen menos de 3 h, resultando muy til para el diagnstico de enfermedades humanas. La rapidez de anlisis en tiempo real PCR sobre la cultura hace un poderoso mtodo PCR diagnstico complementario. Por lo tanto, PCR en tiempo real ofrece ventajas significativas sobre la PCR anidada (Bialek et al. 2002a, 2002b; Maubon et al, 2007) en trminos de la cantidad de tiempo para el anlisis y la contaminacin cruzada.. Varios protocolos en tiempo real PCR se han desarrollado para detectar H. capsulatum. Estos mtodos incluyen SYBR tinte verde(Imhof et al, 2003;.. Martagon-Villamil et al, 2003) o LightCycler sonda de sistemas basados en (. Buitrago et al, 2006), pero los protocolos de uso de sondas TaqMan an no se han reportado . LightCycler sondas no son compatibles con todos los actuales sistemas de tiempo real PCR, por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo TaqMan de amplificacin, lo que podra ser utilizado en todas las mquinas de PCR en tiempo real. Adems, slo unos pocos protocolos moleculares han sido probados con muestras clnicas (Bialek et al, 2002a, 2002b;. Bracca et al,. 2003, Buitrago et al, 2006;. Imhof et al, 2003).. Hemos diseado y probado una sonda TaqMan ensayo basado en varias cepas de hongos y muestras clnicas. No hay seal de amplificacin se obtuvo con el 18 noH. capsulatum cepas de hongos. Esta especificidad se observ con LightCycler sondas de prueba diferentes cepas de hongos (Buitrago et al, 2006;.. Martagon-Villamil et al, 2003), que demuestran la utilidad de ITSADNr regin para el diagnstico. El umbral de sensibilidad de nuestro ensayo fue de 10 fg de H. capsulatum ADN por microlitro, la cual fue similar a la que se inform anteriormente (Buitrago et al., 2006). Por otra parte, la alta sensibilidad observada se obtuvo con el sistema TaqMan y el IPC funcionamiento en dplex. La sensibilidad de nuestro protocolo de PCR se estima en 95,4% con respecto al mtodo de cultivo. Tres muestras, que dieron positivo por la cultura, dieron negativo por PCR en tiempo real, aunque no inhibidor de PCR se detect en la reaccin (IPC seales eran normales). Sin embargo, excepcionalmente, los volmenes de pellets de estas tres muestras tenan menos de 50 mL.

Entre las 275 muestras que resultaron negativas para H. capsulatum por la cultura, 264 fueron negativas y 11 muestras fueron positivas por PCR en tiempo real, dando una especificidad del El 96,0%. Se recogieron muestras de los otros pacientes en los que estas 11 muestras fueron tomadas, estas muestras dieron positivo por la cultura y la PCR en tiempo real (Tabla 3). Por lo tanto, entre las 341 muestras analizadas, no inespecfico seales en tiempo real PCR se obtuvieron. Por otra parte, entre las 36 muestras que dieron negativo para H. capsulatum por la cultura, pero fueron positivas para otras cepas de hongos, no se observaron seales de PCR. Especificidad calculada sin los 11 resultados anormales por lo tanto se estima en 100%, con respecto a la cultura. Estas 11 muestras tomadas de H. capsulatum pacientes positivos podran ser clasificados como falsos negativos por el anlisis de la cultura y verdaderos positivos por PCR en tiempo real, por lo que, en base a nuestros resultados, el mtodo estndar de oro ya no puede ser el mtodo de cultivo, sino que puede ser PCR en tiempo real. Nuestros resultados tambin ponen de relieve la especificidad y la sensibilidad se muestra mejor por PCR en tiempo real sobre el mtodo de cultivo. Slo haba tres falsos negativos muestras por PCR en tiempo real, mientras que 11 muestras resultaron ser falsos negativos por el mtodo de cultivo. Slo unos pocos estudios han evaluado en tiempo real de la tcnica de PCR para la deteccin de H. capsulatum en muestras biolgicas. Buitrago et al. encontr que el 70% de la sensibilidad, el 10 de sueros positivos y el 100% de especificidad entre los 25 pacientes sin histoplasmosis. MartagonVillamil et al. detectado tres muestras clnicas de los pacientes con cultivo positivo. Debido a que tanto los mtodos de prueba aqu son imperfectos, en el LHUPM, PCR en tiempo real se utiliza en paralelo con el mtodo de cultivo, si las pruebas de H. capsulatum a travs del mtodo directo es negativo. La ganancia de tiempo presentado por PCR en tiempo real, en los casos de resultados positivos, hace que este mtodo un mtodo complementario til para cultivo directo.Entre las 38 muestras que dieron negativo en el examen directo, pero positivo, por la cultura, la duracin media para el cultivo de H. capsulatum fue de 31,9 das ( 18,4 das, desde el da 1 a 80). Como resultado, los anlisis en tiempo real PCR se puede completar en un da. Por lo tanto, el tiempo medio terico adquirido a travs de PCR en tiempo real, en comparacin con las muestras de falsos negativos examinado directamente, puede ser de una media de 31 das. Por el contrario, negativos resultados en tiempo real PCR debe llevar los bilogos y los mdicos se centran sus investigaciones en otras enfermedades, lo que tambin ahorra tiempo. Nuestro tiempo real a travs de la tcnica de PCR de alta especificidad y sensibilidad disminuye la demora en la obtencin de resultados en comparacin con el mtodo de cultivo, y por lo tanto, podra ser muy adecuado para el seguimiento teraputico de los pacientes con histoplasmosis pulmonar, cerebral, y difundido. Reconocimiento Este estudio fue financiado por Gilead Sciences (Foster City, CA).

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