TEMA 2:

1. INTRODUCCIÓN:

La Cronobiología utiliza métodos específicos para el análisis de los parámetros

que caracterizan los ritmos biológicos. Esta metodología está disponible en
diferentes programas de ordenador, sin embargo, es conveniente conocer su
fundamento matemático con el fin de poder ser críticos a la hora de interpretar
datos rítmicos.

Hay una necesidad de analizar los datos que obtenemos objetivamente

mediante la estadística, ya que ajustar la ecuación a ojo es muy impreciso.

Para este análisis, la cronobiología tiene metodología propia.

2. DISEÑO EXPERIMENTAL:

El diseño experimental en Cronobiología se fundamenta en el hecho de que

todas las variables biológicas muestran ritmos. En este apartado veremos cómo
varía la información que obtenemos de una variable a medida que tenemos en
cuenta la existencia de ritmos en dicha variable.

2.1 Influencia de los intervalos de muestreo (periodo con el que yo tomo los datos
en un individuo)
A continuación en una serie de gráficas seriadas observaremos la influencia que
tiene el intervalo de muestreo en los valores obtenidos.
Cuando nos encontramos ante una variable rítmica, la influencia de los intervalos
de muestreo es crucial. En el ejemplo elegido, una medida única nos serviría de
muy poco, aunque siempre la realicemos a las mismas horas. En una hora el valor
de la ACTH plasmática puede variar de 0 a 6,6 mU/ml y el de cortisol de 138 a 690
mU/ml.
2.1.-INFLUENCIA
DE LOS
INTERVALOS DE
MUESTREO SOBRE
LOS VALORES
OBTENIDOS:
Medida única

ACTH 8 h= 2,8 mU/l

Cortisol 8 h=276mU/l

ACTH 9 h= 6,6 mU/l

Cortisol 9 h=690mU/l

Valores de ACTH y cortisol

plasmático de una mujer
sana muestreada cada 20
2.1.-INFLUENCIA DE
LOS INTERVALOS
DE MUESTREO
SOBRE LOS
VALORES
OBTENIDOS:
1 medida cada 12 h

Valores de ACTH y cortisol

plasmático de una mujer
sana muestreada cada 20

2.1.-INFLUENCIA
DE LOS
INTERVALOS DE
MUESTREO
SOBRE LOS
VALORES
OBTENIDOS:
1 medida cada 6 h

Valores de ACTH y cortisol

plasmático de una mujer sana
muestreada cada 20 min

2.1.-INFLUENCIA DE
LOS INTERVALOS
DE MUESTREO
SOBRE LOS
VALORES
OBTENIDOS:
1 medida cada 3 h

Valores de ACTH y cortisol

plasmático de una mujer
sana muestreada cada 20
ACTH: la produce la hipófisis. Regula la producción de cortisol, producido por la
corteza suprarrenal.

Vemos que se obtiene la medida de ACTH y de cortisol en una mujer sana cada
20 minutos.

Es caótico. Si hacemos una medida única, no es válida. Sólo en una hora varía
mucho. E incluso en 20 minutos pasa de 0 a 7.
En el cortisol ocurre lo mismo. Una medida única en ritmos pulsátiles como éste no
es válida. Ritmo pulsátil: que varía mucho.

Así que para acercarnos más a la realidad vamos realizando más medidas.
Primero una cada doce horas, luego cada 6 y finalmente cada 3 horas.

A medida que vamos aumentando la frecuencia de muestreo, nos vamos

aproximando más a la situación real. Para un ritmo circadiano típico, se considera
aceptable la determinación de la variable cada 4 horas (6 valores en 24 h), si
bien un valor cada tres horas es más adecuado; sin embargo, para variables con
ritmos pulsátiles (ultradianos), como es el caso de la figura, la frecuencia de
muestreo debe aumentarse.

El cortisol aumenta la glucemia y baja la respuesta inmunológica. Por tanto,

cuando es bajo aumenta la respuesta inmune.

En un trabajador nocturno, el pico del cortisol está desfasado doce horas.

2.2. Muestreos longitudinales y transversales:

Transversal: diferentes sujetos son muestreados en tiempos distintos. Es en

poblaciones.
Longitudinal: a un mismo sujeto se le muestrea a lo largo del tiempo. Es en
individuos.
Se ha determinado cada
cierto tiempo una variable
MUESTREOS LONGITUDINALES en un sujeto a lo largo de
cinco ciclos. A partir de
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 esta información se puede
caracterizar
perfectamente el ritmo de
esa variable en un
individuo.

Ej longitudinal: es el que
vamos a usar en prácticas.
Medimos la frecuencia
cardiaca a una persona
durante 2 semanas.
Pero no conocemos el ciclo de la población. Para eso utilizamos los transversales,
que se aplican a poblaciones.

MUESTREOS TRANSVERSALES
Se ha determinado Sujeto 1
cada cierto tiempo
una variable en cinco
Sujeto 2
sujetos a lo largo de un
ciclo. A partir de esta
información se puede
Sujeto 3
caracterizar el ritmo de
esa variable en una
población. Pero no es Sujeto 4
fiable ya que podría
variar con los días con
Sujeto 5
un ciclo infradiano.

Sujeto 6

2.3. Influencia de los ritmos

2.3.-INFLUENCIA DE LOS anuales:

RITMOS ANUALES La realización de medidas a la

misma hora no evita la
influencia de los ritmos
La realización de
biológicos. Es decir, una
medidas a la misma variable puede tener un ciclo
hora no evita la distinto en primavera, verano,
influencia de los ritmos otoño e invierno. Si existe un
biológicos ritmo anual, habrá por tanto
que hacer varias medidas, no
nos vale con hacerlo a la misma
hora.

Ej: hacemos las medidas en

Otoño, y aplicamos un
tratamiento en invierno
basándonos en los resultados
de otoño. Pero no es válido.
Tendríamos que hacer otro
grupo control en invierno.
2.4. Efecto de desincronización en sujetos:

2.4.- EFECTO DE LA
DESINCRONIZACIÓN
ENTRE SUJETOS
Izqda. Sujetos
sincronizados
Decha. Sujetos
desincronizados

Izquierda: los individuos estaban sometidos al mismo ciclo de luz-oscuridad.

Hacemos la media, y nos da un ritmo circadiano perfecto.

Derecha: Antes no se regulaba los ciclos de luz-oscuridad a los animales de

laboratorio, cada uno tenía un ciclo distinto. Cuando calculamos la media, nos
sale una línea horizontal, con unos errores muy grandes. No es que no exista el
ritmo, es que no están sincronizados.

3. ANÁLISIS GRÁFICO DE LOS RITMOS:

3.1. Cronograma: es la representación en función del tiempo de los datos tal y

como se han obtenido del individuo. Permite formarse una idea de los
procedimientos que se deberán utilizar para su posterior análisis matemático. A
nivel individual, existe una gran variabilidad.

Cortisol: las comidas producen liberaciones de cortisol, al igual que los exámenes
estresantes.
 3.1.-CRONOGRAMAS INDIVIDUALES
Representación de los valores en función del tiempo

Valores cortisol plasmático de

sujetos sanos, adultos
muestreados cada 20 min

3.2. Plexogramas: una variable medida durante varios días en un mismo sujeto
(longitudinal), conocemos su período. Ahora calculamos la media y la desviación
estándar de cada uno de estos ciclos sucesivos. Finalmente se representa una
onda media obtenida a partir de los diferentes ciclos individuales. Es decir, es
como si “plegáramos” la serie longitudinal

3.2.- Plexograma
Valor

Tiempo
3.3. Actograma o double-plot: es una técnica gráfica que permite la realización
de numerosos análisis de una serie temporal. Consiste en la representación de los
valores de una variable, un ciclo debajo del anterior y así sucesivamente para
todos los ciclos estudiados. Además, se suelen repetir los datos de cada ciclo en
dos columnas, una al lado de la otra, con el fin de visualizar mejor los
componentes rítmicos no sincronizados. En ordenadas se representan los días y en
abcisas las horas del día.
Las líneas amarillas representan movimiento o actividad. A mayor altitud, mayor
actividad. Donde no hay líneas, no hay actividad. Es decir, el animal está en
reposo.

En la parte izquierda de la gráfica podemos ver que el animal empieza a tener

actividad a las ocho de la mañana. Pero este ciclo tiene una tendencia a
desviarse a la derecha o a la izquierda. Por eso debemos representar 2 días
consecutivos, para ver cuál es la tendencia de deriva.
3.4. Mapa de fases: Los mapas de fases se utilizan para visualizar rápidamente la
organización temporal de un conjunto de variables. A lo largo de un ciclo
completo se representan las acrofases (máximo valor de función sinusoidal que
describe el comportamiento de la variable) junto con su intervalo de confianza al
95%. Las variables se representan una debajo de la otra.
Como antes, la franja amarilla significa actividad, y la azul reposo. Representa los
máximos de las funciones o ACROFASE. Acrofase = momento en que ocurre el
máximo.
La máxima fuerza en la mano ocurre hacia la mitad del período de actividad.
La ACTH debe estar antes del cortisol. Si está al revés, algo va mal.

3.4.-Mapa de fases
de diferentes
variables humanas
Diagrama de acrofases: En otras ocasiones interesa visualizar el comportamiento
de una variable a lo largo del tiempo, sobre todo cuando puede haber cambios
en la sincronización de la misma (vuelos transmeridianos, jet lag...). En el ejemplo
se ha representado la acrofase de la temperatura corporal de un sujeto que viaja
frecuentemente desde Minnesota hasta Europa Central. La diferencia horaria es
de 7 horas. Observe cómo la adaptación a un vuelo hacia el Este requiere
aproximadamente unas dos semanas (2 días por hora de desfase), por el
contrario, en poco más de una semana se produce la resincronización en los
vuelos hacia el Oeste. Esto se debe a que le cuesta acortar el ciclo.
El cambio en la temperatura se produce por el cambio horario. Y la
resincronización es de unos dos días por cada hora de cambio horario.
Diagrama de acrofases de temperatura oral determinada antes, durante y después de
12 vuelos transoceánicos en el mismo sujeto.
3.5. Cronodesmos:

El cronodesmos es una forma de representación gráfica de los valores de

referencia de una variable teniendo en cuenta la existencia de un ritmo biológico
en la misma. Loa valores de referencia (mínimos y máximos de una persona sana)
se han conseguido a partir de miles de observaciones. Si definimos estos valores
en función de la hora del día, obtenemos el cronodesmos.
Conocida la hora en la que se ha tomado la muestra y la sincronización del sujeto
es posible reducir la variabilidad de los valores de referencia clásicos. Según el
cronodesmos para el cortisol, los valores 2 y 3 son anormales(o bien tiene
hipercortisolismo u horario nocturno), mientras que el valor 1 está dentro de los
límites de normalidad (los límites de la normalidad son las curvas punteadas, y la
curva negra son los valores medios). De acuerdo con los valores de referencia
clásicos, los valores 2 y 3 estarían dentro de la normalidad, mientras que el 1 sería
superior a los valores normales.
4. ANÁLISIS MATEMÁTICO Y ESTADÍSTICO DE LOS RITMOS:

1. Media móvil unidimensional: Cuando hay muchos puntos y no se ve un patrón

definido, cogemos 3 datos, por ejemplo. Y hacemos la media de éstos (1º, 2º y 3º),
y la pintamos en una nueva gráfica donde estaría el 2º. Ahora hacemos la media
de 2º, 3º y 4º, y la pintamos donde estaría el 3º. Y así sucesivamente. Obtenemos
una gráfica mucho más suave.

Si sigue sin salirnos un patrón definido, podemos coger 5 para hacer la media, por
ejemplo. Pero siempre saltándonos 1.

4.-Análisis matemático y estadístico de

los ritmos (I): Media móvil unidimensional

Procedimiento para calcular la media móvil

de 3 datos Yi=(xi-1+xi+xi+1)/3
De n datos Yi=(xi-n+...+xi+...+xi+n)/(2n+1)

2. Métodos de análisis en el dominio de la frecuencia: vamos a intentar ajustar

una función sinusoidal a una ecuación. El método del cosinor, por ejemplo, usa la
función sinusoidal y la estadística.

4.1. Ajuste a una función sinusoidal: El ajuste de una función sinusoidal a una
variable que muestra un comportamiento rítmico permite su caracterización
matemática.

„ Y(t)= M + A cos((360/T)t-φ)
‹ Y(t)= valor de la variable en el tiempo t (ej: tª a las 10)
‹ M= valor medio de la función
‹ A= Amplitud de la oscilación
‹ T= periodo de la oscilación
‹ Φ= es el desplazamiento de fase con respecto a un valor de
referencia (por ejemplo, el origen)
Las tres tes de la cronobiología:

T = período de un ritmo.
t = tiempo
Tau = período de ritmo endógeno/ de curso libre.

Ritmo endógeno: ritmo del animal cuando todo permanece constante.

4.1.-Ajuste a una función sinusoidal

Y(t)= cos t

Y(t) 0

-1 0 90 180 270 360

En las sucesivas imágenes se desarrollará de forma progresiva la función sinusoidal

utilizada en el método del COSINOR.

1º: tenemos un conjunto de datos y queremos encontrar la ecuación de la

función sinusoidal que se ajuste a esos datos.

Una función seno y coseno va adoptando valores positivos y negativos y se va

repitiendo cada período.

cos0º =1 cos90º = 0
Hemos representado en la gráfica la variable en función del tiempo, y la función
coseno. El tiempo se expresa en grados (24 horas son 360º)

Pero en la función coseno, los valores oscilan periódicamente entre +1 y -1. Sin
embargo los valores que queremos ajustar en el ejemplo oscilan entre +3 y 0. Por
tanto su amplitud será de 1,5. así que multiplicamos la función coseno por la
amplitud de 1,5 para ajustarla. Ahora la función coseno tiene de A 1,5 y -1,5.

4.1.-Ajuste a una función

sinusoidal
Y(t)= A*cos t El
1,5 COSINOR
poblacional
permite
inferir los
parámetros
estadísticos
Y(t) de un
población a
partir de
una
muestra

-1,5
0 90 180 270 360
2º: Pero no podemos tener datos negativos. Así que lo que vamos a hacer para
hacer positiva la función es sumar a todos los puntos el valor medio de los valores
reales. Como oscilaban entre 0 y 3, el valor medio es 1,5.

4.1.-Ajuste a una función

sinusoidal
Y(t)=M+ A*cos t
3

Mesor
Y(t) 1,5

0
0 90 180 270
3º: Cuando sumamos a A+cos t la media o Mesor conseguimos desplazar hacia
valores positivos la función. Ahora la media de la función y la de nuestros datos es
la misma (1,5). Sin embargo, para conseguir que la ecuación pase por los valores
reales de la variable utilizada en nuestro ejemplo hace falta desplazar la función
hacia la derecha, para ello hemos de introducir un factor corrector en la
ecuación, el desfase.
Así que le restamos el desfase y hacemos el coseno de eso.

4.1.-Ajuste a una función

sinusoidal
Y(i)=M+ A*cos (t-φ)
3

Y(i) 1,5 Mesor

0
0 90 180 270 360
Pero nuestra función coseno no trabaja con unidades de tiempo, sino con grados.
Así que debemos poner el tiempo en grados.

T-------------------360
t--------------------X
X=(360/T)*(t- φ)
X=(360/24)*(t- φ)

Si al valor de t (expresado en grados) le restamos el valor del desfase (también en

grados) la ecuación definida por nuestra ecuación pasará por los valores reales.
4.1.-Ajuste a una función sinusoidal
„ Y(t)= M + A cos((2π/T)t-φ)
‹ Y(t)= valor de la variable en el tiempo t
‹ M= valor medio de la función
‹ A= Amplitud de la oscilación
‹ T= periodo de la oscilación
‹ Φ= es el desplazamiento de fase con respecto a un valor de
Calcular Y(t) para M= 2; A=1; T=24 h y φ=6 h, representar los
valores de Y(t)
Y(t)= 2+1*cos [(360/24)*(t-6)]
4
t=0.......Y=2
t=6........Y=3
2 t=12.......Y=2
t=18.......Y=1
t=24.......Y=2
0
0 6 12 18

En muchas ocasiones los datos de una variable se ajustan bien a una sinusoide.
Ello permite obtener una serie de parámetros que describen objetivamente el
ritmo de la variable. M es el valor medio de la función. A, es la amplitud o la
diferencia entre el máximo (o mínimo) valor de la función y la media. T es el
periodo del ciclo, este valor ha de ser previamente conocido para poder resolver
la ecuación. Φ es el desplazamiento de fase, indica el tiempo que pasa desde t=0
hasta el momento en que la función ajustada alcanza el valor máximo.
4.2. Método del COSINOR:

4.2.- METODO DEL

COSINOR (F. Halberg)
Ejemplo práctico. Recuento
de linfocitos en sangre
venosa de voluntarios sanos
(6 hombres y 6 mujeres de
20-28 años)

Y=3000+700*Cos[(360/24)*(t-2)

Periodo Acrofase

Amplitud

MESOR

El método del COSINOR fue propuesto por Halberg hacia el 1979. Este método
consiste en ajustar los datos a una función sinusoidal y posteriormente representar
los resultados gráficamente según unas determinadas normas. Para aplicar este
método es necesario conocer previamente el periodo del ritmo. Este método se
puede aplicar a datos que no han sido muestreados de modo regular (aunque
siempre es conveniente hacerlo). El método permite calcular los valores de los
parámetros que se han visto anteriormente en el ajuste de una sinusoide y
además permite conocer cuales son sus intervalos de confianza. Con este
método, M recibe el nombre de MESOR (Mean Estimated Statistic Over- Rhythm),
Φ se conoce como acrofase (la fase más alta) y A continua siendo la amplitud.

Si sólo tenemos valores del horario diurno, la media nos sale menor. Pero estas
funciones aunque les quitemos una parte nos ajustan la misma función.

MESOR: media de la función

Media: media de los datos reales

Rango = (media+amplitud; media-amplitud)

El desfase es de dos horas porque como referencia se toman las 0 horas(12 de la

noche), y no el origen. Por tanto aquí el desfase es la distancia del valor máximo
de la función a las 0 horas.
 Representación
Acrofase
polar del
COSINOR

Amplitud

En el método del cosinor los valores de amplitud y de acrofase se representan en

forma vectorial sobre un círculo horario, en el cual el círculo completo representa
un intervalo de tiempo equivalente al periodo de la función (normalmente 24 h).
El origen del vector se encuentra en el centro del círculo, su módulo se
corresponde a la amplitud y su orientación va determinada por la acrofase. El
vector apunta al momento del ciclo en el cual tiene lugar la acrofase. El vector se
halla incluido dentro de una elipse de confianza que es la región en la cual se
encontrará el extremo del vector con un 95% de probabilidad. Las tangentes a la
elipse, trazadas a partir del centro del círculo, delimitan un intervalo de tiempo
que es el intervalo de confianza de la acrofase. Una elipse que cubra el origen
del vector indica que el ritmo no es estadísticamente significativo ya que cabe la
posibilidad de que existan vectores con amplitud cero (es decir, que no haya
ritmo). En esta representación el mesor se debe dar numéricamente.

Tomando como referencia las 0 horas, coinciden desfase y acrofase. Por eso se
hace así, porque es más cómodo. Por tanto si hay un desfase de 6 horas, la
acrofase es 6.

Con este reloj sabemos:

- Error de la estimación (elipse)
- Amplitud
- Hora de acrofase
 Parámetros del análisis
MESOR del COSINOR Amplitud

Periodo

Válido con muestreo discontinuo

MESOR no es igual a la media aritmética
VENTAJAS DEL
ANÁLISIS DEL
COSINOR

La acrofase no es igual al
La amplitud no es igual al pico máximo
rango de datos

El método del COSINOR se utiliza preferentemente para el análisis de ritmos

circadianos, especialmente en el campo de la medicina. Está especialmente
adaptado a las medidas biológicas en las que frecuentemente no se dispone de
datos muestreados a intervalos regulares.
 EJEMPLOS DE
CRONOGRAMAS
INDIVIDUALES Y
MEDIO. ANÁLISIS
DEL COSINOR
POBLACIONAL

El cosinor poblacional tiene como finalidad la representación de las

características rítmicas de una población de individuos. En este caso el vector es
el valor medio de los vectores individuales y la elipse de confianza viene
determinada por la nube de puntos determinada por los extremos de los vectores
individuales. También podemos determinar si dos ritmos son significativamente
diferentes, para ello basta con comprobar si las dos elipses de confianza se
superponen en alguna zona o no. En este último caso se concluye que los ritmos
son diferentes.

3. Métodos de análisis convencional: ANOVA.

El tiempo es la variable independiente siempre, sirve para comparar muchos

datos.
4. Periodograma de la CHI cuadrado (Sokolove y Bushell):

El periodograma es un procedimiento estadístico específico de cronobiología que

permite el conocimiento del periodo/os significativos de una serie temporal
determinada. Dada una serie temporal, el periodograma calcula para un rango
dado de periodos, los valores medios obtenidos al resolver una matriz resultado de
seccionar la serie de datos de acuerdo con el periodo ensayado. El periodo más
significativo es aquel que hace que la variación de las medias sea máxima. Este
tipo de periodograma requiere un muestreo regular de los datos y disponer de
información sobre unos 10 ciclos completos.

Ej: cada cuatro números se repite. Así que T es 4 (lo sabemos intuitivamente)

Procedimiento matemático:

Ponemos los números de 3 en 3, de 4 en 4 (T=4). Lo ponemos en columna y

calculamos la media de cada columna.

Representamos las medias. Cuanto más me alejo de período verdadero, más

horizontal me sale la línea. Por eso, cuanto más me acerco al período mayor me
sale la amplitud, y el período será el que me de el pico más alto.
5. Análisis de Fourier:

Análisis matemático y estadístico de

los ritmos (V). Análisis de Fourier
H1

H2

Espectro de potencia
H1
H2 H3
H3
H4
H3
H3
H5

El análisis de Fourier establece que una función periódica se puede descomponer

en la suma de infinitas funciones sinusoidales de frecuencias armónicas a la
frecuencia fundamental. El primer armónico es el periodo fundamental (T) (ej: 24);
el segundo tendrá como periodo T/2; el tercero T/3 y así sucesivamente. Cada
uno de los armónicos tendrá un amplitud dada que, tras una pequeña
trasformación matemática, podrá ser trasladada a una gráfica conjunta
conocida como espectro de potencia y nos dará una información muy valiosa
sobre la descomposición espectral de la serie temporal.

Con este método conseguimos ajustar la función de forma perfecta. Y a partir de

cualquier armónico puedo sintetizar la onda original. También sirve para
comparar huellas digitales.