Induccin de Mutantes en Escherichia coli

Laboratorio de Gentica Microbiana

Instituto Politcnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Introduccin
Mutacin.- Es un cambio en la secuencia nucleotidica del DNA y que es heredable. Mutante.- Organismo que sufri un una mutacin. Mutgeno.- Agente que provoca una mutacin. Los tipos de agentes mutagnicos se clasifican en: o o Mutgenos qumicos: son compuestos qumicos capaces de alterar las estructuras del ADN de forma brusca, como el cido nitroso, brominas y algunos de sus compuestos. Mutgenos fsicos: son radiaciones que pueden alterar la secuencia y estructura del ADN. Como la radiacin ultravioleta que origina dmeros de pirimidina (generalmente de timina), y la radiacin gamma y la alfa que son ionizantes. Mutgenos biolgicos: son aquellos organismos que pueden alterar las secuencias del material gentico de su hospedador; como algunos virus, bacterias y hongos.

Revertante.- Organismo regresa a su estado nativo tanto fenotpica y/o genotpicamente. Reversin.- es una segunda mutacin en la cual se regenera el fenotipo nativo. Hay dos tipos de reversin: o o Reversin genotpica. Reversin fenotpica.

La reversin genotpica se puede conseguir de dos maneras: o o o o o Retromutacin (en sentido).- consiste en recuperar la secuencia exacta de nucletidos en el ADN. Mutacin supresora.- es una mutacin secundaria que restaura total o parcialmente la funcin prdida. Retromutacin.- Consiste en recuperar la secuencia exacta de nucletidos en el ADN. A veces tambin se habla de retromutacin en sentido funcional, de manera, que se recupera la actividad enzimtica normal pero no se recupera la secuencia original de nucletidos en el ADN. Mutacin supresora.- Es una mutacin secundaria que restaura total o parcialmente la funcin prdida.

No todas las mutaciones son causadas por mutgenos. Hay "mutaciones espontneas", llamadas as debido a errores en la reparacin y la recombinacin del ADN. Hay que destacar que, gracias a las mutaciones, actualmente existe gran biodiversidad. Si no fuera por las variaciones que producen las alteraciones en el ADN, no habra variabilidad fenotpica, ni adaptacin a los cambios ambientales. Por lo tanto, las mutaciones tienen su parte positiva, ya que todo proceso biolgico tienes sus ventajas e inconvenientes.

Mutaciones puntuales son de 2 tipos: o Sustitucin de un nucletido por otro.

Se originan:

Mutacin silenciosa.- cuando el codn alterado contina codificando para el mismo aminocido y por lo tanto se sintetiza la misma protena. Mutacin de sentido errneo: cuando el codn alterado codifica para un aminocido diferente que puede alterar las propiedades de la protena, o incluso convertirla en no funcional. Mutacin sin sentido: cuando la sustitucin del nucletido produce un codn de terminacin de la cadena. El producto es una protena incompleta. o Mutaciones Por Corrimiento De Lectura en un gen.

Mutaciones de insercin.- cuando se aaden uno o ms nucletidos Mutaciones de delecin.- cuando se eliminan uno o ms nucletidos en un gen. Estos dos tipos de mutacin llevan a la formacin de protenas no funcionales.

Una caracterstica importante de las mutaciones puntuales es que estas pueden revertir (revertantes).

Resumen de los tipos de mutaciones gnicas

Tipos de mutaciones gnicas en el ADN Transiciones Transversiones En la protena Mutacin silenciosa Mutacin neutra Mutacin cambio de sentido Mutacin sin sentido Mutacin cambio de fase o pauta de lectura

Resultados y ejemplos en el ADN PuPu o PiPi: ATGC, GCAT, CGTA y TACG PuPi o PiPu: ATCG, ATTA, GCTA, GCCG, TAGC, TAAT, CGAT y CGGC En la protena Tripletes que codifican para el mismo aminocido: AAG(arg)CGG(arg) Tripletes que codifican para aminocidos equivalentes distintos. AAA(lys)AGA(arg). Ambos son aminocidos bsicos Aparece un nuevo triplete que codifica para un aminocido de distinto tipo. La protena pierde su funcin. Aparece un triplete de terminacin o FIN: CAG(gln)UAG(FIN) Adicin o delecin de un nico par de nucletidos o de varios pares de nucletidos, siempre que no sean mltiplo de tres.

Objetivos Producir una mutacin utilizando algunas tcnicas Analizar algunos parmetros para caracterizar el proceso de mutacin como la relacin dosis respuesta. Caracterizar el dao producido mediante al uso de algunos mutgenos como la luz ultravioleta y la hidroxilamina, mediante pruebas de reversin.

Resultados Tratamiento con Hidroxilamina

Tabla No. 1 Resultados de la seccin dos, con el tratamiento de Hidroxilamina 0 0.2 0.4 0.6 Equipo Concentracin (M)
8 10 12 14 UFC /ml % Sobrevivencia UFC /ml % Sobrevivencia UFC /ml % Sobrevivencia UFC /ml % Sobrevivencia 3.5x10^8 100% 3.7x10^6 100% 2.7x10^8 100% 9.25x10^6 100% 2.37x10^8 67.71% 3.45x10^6 93.24% 2.5x10^8 92.59% 5.35x10^7 578.37% 7.7x10^8 21.69% 1.95x10^6 52.70% 2.62x10^8 97.03% 4.9x10^6 52.97% 3.19x10^8 8.99% 1.88x10^6 50.81% 1.69x10^8 62.59% 2.53x10^7 273.51%

0.8

8.25x10^6 2.32% 8.8x10^5 23.78% 0.78x10^8 28.88% 1.96x10^6 21.18%

Porcentaje de sobrevivencia con HA. Equipo 8 Equipo 10

120 % de Sobrevivencia 100 80 60 40 20 0 0.00 0.50 1.00 1.50 Concentracion de Hidroxilamina (M)

120% % de Sobrevivencia 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0 2 4 6 Concentracion de hidroxilamina(M)

Equipo 12
120 % de Sobrevivencia % de Sobrevivencia 100 80 60 40 20 0 0.00 0.50 1.00 1.50 Concentracion de hidroxilamina (M) 700 600 500 400 300 200 100 0 0.00 0.50

Equipo 14

1.00

1.50

Concentracion de hidroxilamina (M)

Figura 1. Graficas de porcentaje de sobrevivencia contra Concentracin de Hidroxilamina

Tratamiento con luz ultravioleta Tabla No. 2 Resultados de la seccin dos, con el tratamiento de UV Tiempo(seg) 0 15 30 45 UFC /ml % Sobrevivencia UFC /ml % Sobrevivencia UFC /ml % Sobrevivencia UFC /ml % Sobrevivencia 1.39x10^-3 100% 3.58x10 100%
9

Equipo 9

60 3.25x10^-5 23% 1.0x10 0.27%

7

9.3x10^-4 66.76% 3.15x10 88%

9

3.01x10^-4 21.69% 2.58x10 72%

9

2.22x10^-4 15.97% 2.2x10 6.14%

8

11

13

2.9x10^7 100% 8.36 x10^9 100%

7x10^8 2416.7% 5.4 x10^8 6.46%

9.6x10^7 331% 8.7 x10^8 5.85%

6.88x10^8 2372.41% 1.62x10^10 193.30%*

1.6x10^7 55.17% 3.34 x10^8 3.99%

15

Equipo 15. Dato con * quiere decir que el tubo con cultivo irradiado a este tiempo se cay de la gradilla y se moj el algodn

Porcentaje de sobrevivencia con UV Equipo 9 Equipo 11

120 100 80 60 40 20 0 -20 0 % de Sobrevivencia

% de Sobrevivencia

120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 Tiempo (minutos) 60 80

20

40 Tiempo (minutos)

60

80

Equipo 13
3000 % sobrevivencia 2500 2000 1500 1000 500 0 0 20 40 Tiempo (minutos) 60 80 % sobrevivencia 250 200 150 100 50 0 -50 0 20

Equipo 15

40 Teimpo (minutos)

60

80

Figura 2. Graficas de porcentaje de sobrevivencia contra tiempo de exposicin con luz UV

Frecuencia de Mutacin Tabla 3. Frecuencia de mutacin con tratamiento de HA y luz UV Frecuencia de mutacin HA 8 9 10 11 12 13 14 15 10 8 -log de la FM 6 4 2 0 ----3.29 x 10 ^-9 -4 x 10 ^-3 -Concentracin (M) ----0.8 -0.4 -UV 0.0060244 0.0106 ------Tiempo (min) 60 30 -------

Equipo

12

EQUIPO

14

Figura 3. Curva dosis-respuesta de tratamiento con hidroxilamina 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0

Frecuencia de Mutacin

EQUIPO

Figura 4. Curva dosis-respuesta de tratamiento con Irradiacin UV

Determinacin del tipo de mutacin producido por hidroxilamina (bsqueda de Revertantes): Mutgeno Estreptomicina 9- aminoacridina Nitrosoguanidina 5-Bromouracilo Hidroxilamina Efecto No hubo reversin Se presento reversin por mutgeno Se presento reversin por mutgeno No hubo reversin No hubo reversin

Discusin Se utilizo la cepa de Escherichia coli W3350, a la cual se someti a dos tratamientos uno con radiacin UV y otro con Hidroxilamina. En el tratamiento con la hidroxilamina se someti la cepa a diferentes concentraciones del mutgeno, se expusieron los microorganismo durante una 30 min a diferentes concentraciones de HA, envueltos en papel aluminio esto para evitar que la fotoliasa se active y con esto poder aumentar el ndice de mutacin. El tipo de mutacin no fue dirigida especialmente a un gen sino a en general a todo el cromosoma pero se tomo como indicador el fenotipo la utilizacin de lactosa en el medio por lo que las clulas se cultivaron en el agar Mc Conkey, ya que en este medio las bacterias que sufrieron una mutacin en el gen que codifica para la Beta-galactosidasa, se vieron de color blancas ya que al no haber utilizado la lactosa, no la fermentaban y por tanto no haba vire del indicador mientras que las a si lo fermentaban se vieron color rosas intenso. En las graficas se indica que entre mayor es la concentracin del mutgeno menor es la sobrevivencia de las cepas, con excepcin del equipo 14 en donde a las concentraciones 0.2 y 0.6 M de HA, l por ciento de sobrevivencia fue mayor al 100 por ciento lo que india un error, en al momento de la siembra o en las diluciones. En el tratamiento con radiacin UV, el tiempo de exposicin marcaba la probabilidad de formar organismos mutantes, ya que entre mayor tiempo de exposicin a la luz mayor nmero de mutaciones, en los quipos 9 y 11 las graficas presentaron la tendencia esperada que entre mayor tiempo de exposicin a la radiacin menor ser el porcentaje de sobrevivientes, mientras que en los quipos 13 y 15 sus graficas no presentan concordancia a lo esperado por lo que se puede deducir que no se irradia adecuadamente las placas o simplemente las diluciones en esos tubos no fue la correcta. Aunque en el equipo 15 en el tubo del tiempo 45 se cay de la gradilla el tapn de algodn por lo que pudo existir una contaminacin y por esto la presencia del error en ese punto. Despus de haber realizado la modificacin del fenotipo en la cepa se trato por medio de una reversin, con ayuda de otros mutgenos la restauracin del fenotipo nativo, y fueron pocas las celular que revirtieron, se presento una reversin con los agentes 9-aminoacridina y Nitrosoguanidina ya que causan transversiones y transiciones en el DNA de forma bidireccional y mientras que la hidroxilamina no presento ya que es una agente intercalante y solo en unidireccional y la estreptomicina por que impide el desarrollo de la clula modificando la subunidad 30S de l ribosoma.

Conclusin

La frecuencia de mutacin aumenta con forme la dosis del mutgeno es ms alta La hidroxilamina es un mutgeno que forma transiciones en el DNA A mayor concentracin de Hidroxilamina mayor numero de mutantes La radiacin UV forma dmeros de pirimiditas La radiacin UV es ms eficiente para producir una mutacin en un organismo.

Referencias http://gefmdarwin.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderfiles/mutamigra2.pdf http://biologia.uab.es/genomica/swf/mutacion.htm http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm Jimnez Snchez, Alfonso, Jimnez Martnez, Juan. Gentica Microbiana. Editorial Sntesis. Madrid, 1998, Pg. 233-257