Sunteți pe pagina 1din 10

IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE EFECTE CITOPATICE Direciile diagnosticului virusologic 1.

Izolare virala in: Culturi de celule Ou de gaina embrionat Animal de laborator 2. Detectia directa a : Particulelor virale EM , IEM Antigene virale ELISA, IF Genom viral PCR; Rt-PCR 3. Teste Serologice: a. Ac virus- specifici tip IgM b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgG Alegerea sistemului de izolare virala AVANTAJE DEZAVANTAJE

Animalul de laborator

Infectie naturala

Cost crescut

Oul de gaina embrionat

Cost scazut

Susceptibilitate variabila

Culturi de celule

Sensibilitate buna, disponibilitate

Susceptibilitate variabila, Infectie nenaturala

Definitie culturi celulare Metodologia propagarii in vitro a unui fragment de tesut sau a unor celule dispersate obtinute din tesuturi cu ajutorul unor enzime proteolitice si introduse intr-un mediu nutritiv capabil sa le asigure homeostazia si proliferarea. CLASIFICAREA CULTURILOR CELULARE CULTURI DE ORGAN = mentinerea in vitro a unor fragmente de organ in vederea pastrarii arhitecturii si functiei intacte a celulelor. Corona, rhinovirusurile nu cultiva decat pe culturi de trahee CULTURI DE CELULE DISPERSATE = provin din disocierea tesuturilor intr-o suspensie de celule prin tratare enzimatica asociata cu agitare mecanica. Se clasifica dupa timpul de supravietuire in vitro: CULTURI PRIMARE TULPINI CELULARE LINII CELULARE Culturi primare Direct din dispersia enzimatica a unui tesut proaspat recoltat Formeaza monostrat Celulele tind sa mentina caracteristicile organului din care deriva

Pot apare proprietati de suprafata noi (devin susceptibile pentru infectii virale noi) ex: v. polio care nu creste in rinichiul de maimuta intact , dar creste si distrugeaceleasi celule renale separate si aderente la sticla Se mentine in vitro timp limitat (3-5 pasaje) Tulpinile celulare Omogene, durata de viata 50-60 de pasaje V. respiratorii cresc foarte bine pe tulpini derivate din piele, intestin si amigdale Cariotipul cromozomial este cel de origine diploid Pot fi utilizate in producerea de vaccinuri virale si pentru diagnosticul virusologic Liniile celulare Populatii de celule derivate dintesut normal sau malign ce pot fi subcultivate un timp nelimitat Au caracter heteroploid (numar variabil de cromozomi) Nu pot fi folosite in producerea de vaccinuri din cauza instabilitatii genomului. Celule vii dispersate: -reflecta tesutul de provenienta TESUT EMBRIONAR TESUT ADULT

TESUT TUMORAL Mediu nutritiv: Sruri tamponate izotone Earle: 1)NaCl; 2) KCl; 3)MgSO4; 4)CaCl2; 5) NaH2PO4 6) D-glucoz; Sruri tamponate izotone Hanks: 1)NaCl; 2)KCl; 3)MgCl2 ; 4) MgSO4; 5) CaCl2; 6) KH2PO4; 6) Na2HPO4; 8) D-glucoz; Substante nutritive: Aminoacizi eseniali: 1) L-arginin; 2) L-cistin; 3) L-fenilalanin: 4) L-glutamin; 5) L-histidin; 6) L-izoleucin; 7) L-leucin; 8) L-lizin; 9) L-metionin; 10) L-tirozin; 11) L-treonin; 12) L-triptofan; 13) L-valin. SER DE VIEL 2-10%, n funcie de tipul de cultur folosit: factori de cretere i factori de adeziune Vitamine : 1) Colin HCl: 0,01g; 2) Acid folic: 0,01g; 3) Inozitol: 0,02 g; 4) Nicotinamid: 0,01 g; 5) D-pantotenat de calciu: 0,01 g; 6) Piridoxal HCl: 0,01 g; 7) Riboflavin: 0,001 g; 8) Tiamin HCl: 0,01 g. Antibiotice si antifungice: penicilin i streptomicin // griseofulvina SER DE VIEL 2-10% pentru cultivarea celulelor renale de maimu si liniei celulare ICRM23 se adaug 2% ser de viel, pentru cultivarea celulelor de embrion de gin i unele linii celulare (BSC, Vero, FL etc.), se adaug 5% ser de viel, pentru cultivarea celulelor embrionare de hamster, rinichi de hamster, alte linii celulare (KB, HeLa, Hep, etc.) se adaug 10% ser de viel.

De importan deosebit este calitatea serului de viel utilizat, care trebuie testat n prealabil. Condiii necesare pentru pstrarea n via a celulelor din cultura celular:

pH adecvat temperatur constant atmosfer cu 10% CO2 condiii aseptice

Obtinerea unei culturi celulare -se prelev esutul surs n condiii aseptice - se fragmenteaz esutul n buci, se spal cu soluie salin tamponat - disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea n soluie de tripsin 0,25% -suspendarea celulelor n mediu nutritiv -controlul viabilitii celulelor cu coloraie vital albastru de tripan - repartizarea celulelor in volume egale n flacoane de culturi celulare -incubare n poziie culcat - urmrirea formrii culturii cu microscopul invers Subcultivarea culturilor celulare Dup 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizeaz substanele nutritive, sursele de energie, se acidific mediul. Pentru meninerea celulelor n via, acestea trebuie pasate, subcultivate. Celulele se detaeaz de pe peretele flaconului cu soluie de tripsina si EDTA , se centrifugheaz, se spal cu soluie salina tamponata i se resuspendeaz n mediu nutritiv. Se verific viabilitatea celulelor, se numr celulele i se ajusteaz la concentraia optim. Se repartizeaz volume egale n flacoane de cultur celular. Culturile primare pot fi subcultivate de cteva ori, 3-5x. Tulpinile celulare pot fi subcultivate de mai multe ori, 50-60x. Liniile celulare pot fi subcultivate la infinit.

Culturi provenite din celule - normale: celulele se ataeaz de peretele flaconului, se multiplic pn acoper peretele flaconului, realizeaz o cultur monostrat - tumorale: se multiplic i dup acoperirea suprafeei disponibile, cresc n mai multe straturi i n suspensie

CELULELE TRANSFORMATE Sunt linii celulare care au suferit o modificare stabila, spontana sau prin expunere la diferiti agenti (virali, chimici, radiatii), modificare care este mentinuta indefinit prin cultivare in vitro sau transplant in vivo. Sunt morfologic distincte si se dispun dezordonat Inoculate la animale produc tumori Multiplica haotic: nu au inhibitie de contact, nu adera la substratul de izolare Cerinte nutritive mici, se divid la concentratii mici de ser fetal de vitel Prezinta antigene de suprafata diferite de celulele normale Prezinta modificari cromozomiale, cariotip aneuploid

Inocularea virusurilor n culturile celulare Se arunca mediul nutritiv i se introduce suspensia viral. Incubare 1 or (adsorbtia virusurilor n celulele receptive). Se adaug mediu de ntreinere, se incubeaz. n 3-5 zile apar modificrile survenite n cultura celular. Izolare: urmrirea efectelor citopatice = ECP

EFECTE CITOPATICE SINCITIAL: HIV, v rujeolos, VRS PICNOTIC LITIC: enterovirusuri INCLUZIONAR: Intranuclear acidofil: papovavirusuri Intranuclear bazofil: adenovirusuri Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v vaccina Mixt: v herpetice, v rujeolos

ECP SINCITIAL
Bindin g

Reverse transcription

Fusio n

Integration Transcription
RNA export Genomic RNA Nuclear localization

Endocytosi s Lysosome

Splicing

Uncoating

mRN A

Modification Translation

Budding

Assembl y

Maturation

INCLUZII CITOPLASMATICE (RABIE) Sus - neuron fara incluzii Negri Jos neuron cu incluzii Negri (col HE)

INCLUZII INTRANUCLEARE (BOALA CU INCLUZII CMV)

HSV corpii Cowdry tip A

Infectia CU adenovirusuri se multiplica in nucleu unde proteinele capsidare, produse in exces, formeaza incluziile intranucleare

Reovirus

HPV

ECP picnotic litic