MANUALENE11A

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FORMACIN BSICA DISCIPLINARIA ACADEMIA DE BIOQUMICA MDICA I MANUAL DE LABORATORIO SEMESTRE ENERO JUNIO 2011
ALUMNO: PROFESORES TITULAR: LABORATORIO: LABORATORIO: LABORATORIO: PRCTICA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 AUTORIZACIN Grupo: 2CM
Laboratorio de Bioqumica Mdica 1
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FORMACIN BSICA DISCIPLINARIA
ACADEMIA DE BIOQUMICA MDICA I TITULARES DE GRUPO JUAN GUILLERMO ORDORICA VARGAS FRANCISCO JAVIER CASTAEDA IBARRA MIGUEL ANGEL ORDORICA VARGAS FELICIANO TAMAY CACH JOS GUADALUPE TRUJILLO FERRARA ALFREDO MONTIEL MRQUEZ MARTHA CECILIA ROSALES HERNNDEZ ARTURO DAZ MARTNEZ MARA DE LA LUZ VELZQUEZ MONROY SANDRA GISSELA MRQUEZ RAMREZ REYNA ELIZABETH BARBOSA CABRERA JESSICA ELENA MENDIETA WEJEBE IO STEPHANIE ZAMUDIO VEGA LETICIA ARACELI RAMREZ DURN EUNICE DALET FARFN GARCA LUZ MARA CHIRINO CASTILLO MARA DEL ROSARIO LEN REYES LABORATORIO CLAUDIA CAMELIA CALZADA MENDOZA ERNDIRA YADIRA CARRERA GARCA SANDRA CASELN CASTRO CRISTINA LOPEZ GLORIA ARGENTINA HERNANDEZ RAMOS MARIA TERESA LPEZ VENEGAS ARTURO RAMIREZ CRUZ ANAYETZIN TORRES RIVERA Auxiliares de Laboratorio: Jos Luis Martnez Vsquez Alex Hernndez Aguilar Julio Csar Aguilar Rentera
Manual Versin Enero de 2011 Editado por: Dra. Luz Mara Chirino Castillo y Dr. Arturo Daz Martnez
Laboratorio de Bioqumica Mdica 1 2
NDICE
No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 TEMA INTRODUCCIN AL LABORATORIO SOLUCIONES ELECTROLITOS Y pH SOLUCIONES REGULADORAS PROTENAS CINTICA QUMICA Y CATLISIS CINTICA ENZIMTICA GLCIDOS OXIDACIONES BIOLGICAS LPIDOS CIDOS NUCLEICOS Pgina: 4 9 16 19 24 32 40 46 52 58 62
1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA MDICA I
e revisan conceptos y procedimientos de importancia para el trabajo en el laboratorio. El alumno deber previamente haber ledo, entendido, comprendido, estar de acuerdo con, y sujetarse al Reglamento de la Academia de Bioqumica. Las actividades de laboratorio constituyen una parte importante del aprendizaje de la bioqumica mdica y complementan las actividades de la materia impartidas en el aula. Es obligacin del alumno la asistencia puntual, as como la participacin activa, la recoleccin de resultados de los experimentos y la entrega de reportes de los mismos. Es de la mayor importancia cumplir meticulosamente con las medidas de seguridad tanto en comportamiento, uniforme y accesorios como guantes, anteojos de proteccin o caretas transparentes, cubre bocas, bata larga, y otros como pre pipetas.
DISTRIBUCIN DE LOS ALUMNOS EJERCICIO 1 Antes de entrar al laboratorio, todos los alumnos debern portar, debidamente abotonada, su bata de laboratorio y tener listo su material de trabajo. a) Cuando el profesor lo indique, los alumnos colocarn su mochila en el lugar que les sea asignado. b) Siguiendo las instrucciones de su profesor, localice su mesa de trabajo e inmediatamente dirjase a ella. c) En su mesa, localice las tomas de corriente, desages, tuberas y sitios donde puede trabajar. d) Ubique la posicin de su mesa de trabajo con respecto de la mesa de la campana, instalaciones de seguridad, extintores, zonas de seguridad y rutas de evacuacin. e) Con base en la explicacin recibida, identifique el uso de cada una de las tuberas que encuentre en su mesa de trabajo y mrquelas con masking tape. Espere a que su profesor confirme que su etiquetado es correcto. f) Localice la posicin de las vlvulas de seguridad de cada tubera. 1. Dibuje un esquema de su mesa sealando la posicin de las tomas de corriente, desages y vlvulas de flujo. 2. Dibuje un esquema simple del laboratorio e indique en l las zonas de seguridad, la posicin del equipo de seguridad y marque la ruta de evacuacin desde su mesa. 3. En el esquema de la mesa de trabajo que elabor en el ejercicio anterior, marque la posicin de las vlvulas de seguridad.
EL VALE DE MATERIAL DE LABORATORIO EJERCICIO 2 a) Localice en la charola de material de laboratorio el vale, el cual es un documento que enlista el material que se le confa para la realizacin de cada prctica. De acuerdo con esta lista identifique y revise cuidadosamente cada una de las piezas, indicando en el vale cualquier defecto que encuentre. b) Rotule cada pieza identificada con una etiqueta de masking tape. Rena en la charola el material de nombre y/o empleo desconocidos, o de cuyo estado tenga duda, y pregunte a su profesor. Espere a que su profesor compruebe que su identificacin del material es correcta. c) Una vez revisado todo el material, complete los datos solicitados en el vale, (fecha, grupo, equipo, responsable, etc.) y entrguelo al personal tcnico de laboratorio. 1. Cul es el uso de cada una de las siguientes piezas de material de laboratorio? Pipeta Bureta Probeta Mortero Tubo de ensayo
MANEJO DEL MECHERO FISHER EJERCICIO 3 a) No encienda el mechero hasta que su profesor se lo indique. b) Si es necesario, conecte el tubo de plstico del mechero a la llave de gas, la que deber estar completamente cerrada, con la manija en posicin transversal respecto de la salida del gas. Recuerde que la tubera de gas es de color amarillo. c) Asegrese que el tornillo de control de flujo de gas est abierto ms o menos a la mitad de su capacidad total. El flujo de gas se disminuye girando el tornillo en el sentido de las manecillas del reloj y se aumenta en sentido contrario. d) Encienda el mechero aproximando la flama de un cerillo o encendedor al borde de la parte superior del mechero inmediatamente despus de abrir la llave de gas, lo cual debe hacerse lentamente, avanzndola hasta que est aproximadamente a 45 grados con el tubo del gas. Tenga cuidado de no acercar su rostro, pelo u objetos inflamables al mechero al momento de encenderlo ni cuando est encendido. Al usar el mechero no deber portar guantes clnicos hechos de ltex o polietileno, tenga cuidado, ya que son inflamables. e) Ajuste la cantidad de aire que entra, usando el arillo de control de flujo de aire, hasta que la flama tenga una zona central de color azul claro rodeada de otra de color azul oscuro o violeta. La parte ms caliente se encuentra en la punta de la zona interna. Cuando la combustin es incompleta, por falta de oxigeno, la flama tiene color amarillo. f) Deje el mechero encendido para usarlo en el ejercicio siguiente.
1) Elabore un esquema del mechero de FISHER, en el que se indique la posicin del tornillo de control de flujo de gas, el arillo de control de flujo del aire y la entrada del gas. COMO CALENTAR UN LQUIDO EN UN TUBO DE ENSAYO EJERCICIO 4 a) Todos los miembros del equipo deben usar los anteojos de proteccin. b) Llene el tubo de ensayo hasta un 20% de su capacidad con agua de la llave y sujtelo con las pinzas para tubo de ensayo. c) En caso necesario quitarse los guantes de ltex antes de iniciar el calentamiento d) Coloque el tubo sobre la flama del mechero, inclinado aproximadamente a 70 grados y cuidando que la flama caliente la parte superior del lquido. Nunca caliente un tubo de ensayo en el fondo o en posicin vertical porque se puede proyectar su contenido. e) Mueva el tubo cuidadosamente, sin sacarlo de la flama, para que el lquido se caliente de manera uniforme f) Durante el calentamiento dirija la boca del tubo hacia un lugar en que no se encuentre ninguna persona o material que se pueda daar. g) Jams mire directamente la boca de un tubo de ensayo que se est calentando, aunque est fuera de la flama del mechero. h) Contine el calentamiento hasta lograr que el agua hierva, sin proyectarse. i) Nunca caliente solventes orgnicos en tubo de ensayo directamente en la flama del mechero. Hgalo siempre en bao mara. 1. Elabore un esquema de la forma correcta de calentar un lquido en un tubo de ensayo. MANEJO DE REACTIVOS LQUIDOS EJERCICIO 5a a) Para manejar con seguridad los reactivos lquidos se usa siempre la pre pipeta. b) Despus de abrir un frasco de reactivo, coloque el tapn sobre la mesa en posicin invertida, para evitar contaminacin. c) Para extraer el lquido utilice una pipeta o un gotero limpios. Nunca vierta reactivos directamente del frasco para evitar escurrimiento. d) Usando la pipeta de 10 mL, transfiera 5 mL de agua de un vaso de precipitados a un tubo de ensayo. Repita la maniobra hasta que pueda realizarla con seguridad. 1) Describa la forma como ensambl su pre pipeta.
EJERCICIO 5b a) Prepare una serie de 4 tubos de ensayo. Numere los tubos del 1 al 4. Coloque en el tubo nmero uno 2.5 mL de agua. En el tubo nmero dos, 1.25 mL de agua. En tanto que en el tubo nmero tres deposite 0.8 mL de agua y en el tubo nmero cuatro, deposite 0.6 mL de agua. b) Utilice para cada tubo de ensayo una pipeta de capacidad adecuada. Repita este ejercicio hasta que pueda realizarlo con seguridad y precisin. 1. Elabore un esquema que describa este experimento. EJERCICIO 5c a) Monte el dispositivo de titulacin segn indicaciones de su profesor y aprenda a manejar con soltura y seguridad la llave de su bureta. Familiarcese con el procedimiento de dejar gotear el lquido de la bureta, en este caso agua, o dejar salir de la misma cantidades fijas como por ejemplo, de un mL cada vez, de 5 mL cada vez, etc. Asimismo, deber aprender a leer con precisin la escala de la bureta. 1. Elabore un esquema del dispositivo de titulacin. MANEJO DE REACTIVOS SLIDOS EJERCICIO 6 a) Prepare una charola de papel usando una hoja de papel limpio, de preferencia encerado. Esta charola se prepara doblando el papel aproximadamente a un centmetro de cada borde y colocndolos en ngulo recto para formar una pared en la periferia del papel. El tamao de la charola depende de la cantidad de reactivo a pesar. b) Encienda la balanza y espere a que se estabilice la lectura. Coloque la charola de papel en el plato de la balanza. Cuando se estabilice, por medio del botn de tarar, tare a cero la balanza. c) Abra el recipiente del reactivo y coloque la tapa sobre la mesa, boca arriba, para evitar la contaminacin. d) Por medio de esptula saque el reactivo del recipiente y colquelo sobre la charola de papel. Si se rebasa la cantidad deseada, regrese el exceso de reactivo al respectivo recipiente usando la esptula. Nunca regrese al recipiente original un reactivo que caiga fuera de la charola de papel o sobre la mesa. e) Pese la cantidad de cloruro de sodio que le indique su profesor y colquela en el sobre de papel que se le proporciona. Escriba en el sobre el nombre y la cantidad de reactivo que contiene. f) Cierre inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate o contamine. Asegrese de que la mesa y la balanza queden limpias. 1) Elabore un diagrama de la balanza, sealando la posicin del botn de encendido y apagado y del botn de tara.
TARAR TUBOS PARA CENTRIFUGAR EJERCICIO 7 a) En este ejercicio se usar la balanza de dos platillos. b) Coloque las pesas de medicin en la posicin de cero. Asegrese de que la aguja o fiel de la balanza est en posicin cero. Si no lo est, gire cuidadosamente las pesas de ajuste en el sentido que sea necesario hasta lograr el equilibrio. c) Coloque un frasco gerber en cada platillo, cuidando que el ms pesado quede del lado izquierdo. d) Deslice las pesas de medicin de la balanza hasta lograr que el fiel vuelva a la posicin de equilibrio. e) Coloque en cada frasco una camisa de la centrfuga con un tubo adecuado para centrifugar dentro. f) Usando una pipeta, aada agua de la llave entre la camisa y el tubo ms ligero hasta lograr que el fiel de la balanza regrese al equilibrio. 1) Elabore un esquema de la balanza de platillo sealando la posicin de las pesas de ajuste y las de medicin.
2. SOLUCIONES
na solucin es un sistema homogneo monofsico, formado por dos o ms sustancias qumicas y presenta las mismas propiedades fisicoqumicas en todas sus partes. Est formada por un solvente (lquido) en el cual se dispersan molecularmente uno mas solutos (slidos). Cuando ambos son lquidos miscibles, se acostumbra nombrar solvente al que se encuentra en mayor cantidad. La relacin que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una solucin se llama concentracin. Para explicar concentracin necesitamos la definicin de mol. Un mol se define como el peso molecular en gramos de una sustancia, o sea la masa de una sustancia que contiene el mismo nmero de tomos o molculas que hay en 12 g de 12C. (6.022 x 1023 o Nmero de Avogadro). La masa molecular o peso molecular (PM) de una sustancia es la suma de los pesos atmicos de sus componentes; por ejemplo: PM del cido sulfrico (H2SO4): 98 g/mol. Con un mol podemos preparar una solucin 1 molar (1M) la cual contiene un mol de soluto en un litro de solucin. Si dividimos los gramos de un mol entre la valencia del compuesto, y diluimos hasta aforar a un litro tendremos una solucin 1 normal (1N). Existen varias formas de expresar la concentracin de una solucin. Las de uso ms frecuente son: MOLARIDAD (M). Nmero de moles de soluto en un litro de solucin. Un mol es el peso molecular expresado en gramos. MOLALIDAD (m). Nmero de moles de soluto en 1000 g de solvente. NORMALIDAD (N). Nmero de equivalentes qumicos de soluto en un litro de solucin. FRACCIN MOLAR (Xi). Nmero de moles de una sustancia en una solucin entre la suma de los moles de todos los componentes de la misma. PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solucin. Existen diferentes tipos: Porciento en peso (% p/p). Nmero de gramos de soluto en 100g de solucin. Porciento en volumen (% v/v). Nmero de mililitros de soluto en 100 mL de solucin. Porciento en peso-volumen (% p/v). Nmero de gramos de soluto en 100 mL de solucin. PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES Se pueden dividir en tres categoras: Constitutivas, Aditivas y Coligativas. Constitutivas: Dependen de la constitucin qumica de sus molculas, como la presencia de grupos funcionales, tipo y disposicin de los tomos, etc. Son propiedades constitutivas el carcter cido, bsico, oxidante, reductor, radioactivo, dulce, inspido, colorido, etc.
Aditivas: Dependen de la suma de las propiedades correspondientes a los constituyentes de la solucin. como la concentracin, densidad, viscosidad. Coligativas: Dependen del nmero de partculas por unidad de volumen. Son muy importantes para los procesos biolgicos e incluyen: a) Elevacin del punto de ebullicin b) descenso de la presin de vapor y/o del punto de congelacin c) presin osmtica d) as como las constantes crioscpica, y ebulloscpica, etc. DIFUSIN, SMOSIS, DILISIS. Difusin es el proceso fsico qumico por el cual las molculas, ya sea en estado de gas o lquido, tienden a distribuirse uniformemente por todo el espacio de que disponen formando un medio homogneo. En el caso de los gases, la difusin est sujeta a la Ley General de la Energa, la cual establece que la velocidad con que se mueve una partcula es inversamente proporcional a la raz cuadrada de su masa. Las propiedades dinmicas de las soluciones son: Difusin Simple y Difusin a travs de membranas (smosis y Dilisis). En los lquidos la velocidad de difusin es afectada por varios factores. Entre ellos tenemos: a) Naturaleza de la sustancia que difunde c)Tamao y concentracin de las partculas b) rea de difusin d) Temperatura
Graham hizo notar estos factores que influyen sobre la difusin y Fick, de acuerdo con los mismos estableci la siguiente relacin: dm v = ---dt dc = KQ ---ds
v = velocidad de difusin K = Constante de Difusin dm = cantidad de sustancia que difunde dt = tiempo que tarda en efectuarse la difusin dc = concentracin de la sustancia que difunde ds = espacio que recorre la sustancia al difundir.
As, la velocidad de difusin es directamente proporcional al gradiente de concentracin y al rea de seccin. A temperatura, gradiente de concentracin y rea constantes, cada sustancia tiene una velocidad de difusin caracterstica con
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relacin al peso molecular por lo que se incluye una constante K llamada constante de difusin. DIFUSIN SIMPLE (En lquidos) EXPERIMENTO 1 Llene casi completamente una probeta de 100 mL con agua de la llave y luego espolvoree, con un aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno sobre la superficie del agua y observe que ocurre. Anote sus observaciones. A continuacin caliente ligeramente la probeta en cualquier punto y nuevamente observe que ocurre al agregar calor. Anote sus observaciones. Una vez homogeneizado el colorante, la difusin se ha efectuado. 1) Es uniforme el descenso del colorante por la columna de agua? 2) Qu sucede si se calienta ligeramente un punto de la probeta? 3) Qu es disolucin, conveccin y difusin? DIFUSIN A TRAVS DE MEMBRANAS Cuando se interpone en el sistema una membrana dialtica, permeable al agua y a solutos cristaloides pero no a coloides, la sustancia sigue difundiendo como si la membrana no existiera dependiendo de los factores ya sealados, pero la naturaleza de la membrana ser un factor adicional. En estos casos, K recibe el nombre de constante de permeabilidad. Esta difusin es inversamente proporcional a su peso molecular. SMOSIS Y PRESIN OSMTICA Si dos soluciones de diferente concentracin estn separadas por una membrana semipermeable, el solvente de la solucin menos concentrada difunde a la de mayor concentracin. Esto se explica termodinmicamente porque la solucin diluida tiene una tendencia de escape o presin de vapor muy grande. Esta tendencia de escape o presin de vapor es muy baja cuando la solucin est concentrada. Este fenmeno es conocido como smosis y ejerce una presin osmtica, propiedad coligativa de gran importancia fisiolgica ya que interviene en la regulacin del volumen de sangre circulante, as como en la formacin o eliminacin de edemas tisulares, y es la razn por la cual el paciente diabtico elimina frecuentemente grandes cantidades de orina (poliuria). Esta ltima est ocasionada por la alta concentracin de glucosa en sangre y forma parte de la triada sintomtica clsica del diabtico: Polifagia, Polidipsia y Poliuria. MEDIDA DE LA PRESIN OSMTICA MTODO DIRECTO EXPERIMENTO 2 Esta medicin se lleva a cabo mediante el dispositivo llamado OSMMETRO. Este requiere de una membrana semipermeable y aunque las que ms se acercan a la perfeccin son las de ferrocianuro de cobre y las de pergamino, por ser ms fcil de conseguir, se utilizar una membrana dialtica de colodin (celulosa) que nos dar una medida aproximada de la presin osmtica.
El osmmetro consiste en un compartimiento que contiene una solucin de sacarosa 1M teida con rojo neutro y el cual es el cuerpo de una jeringa hipodrmica de 5 mL de capacidad y la cual presenta una banda de hule inferior que permite la fijacin de una membrana de celofn, humedecida previamente durante 5 a 10 minutos. Mientras que la banda superior sirve para sellar el orificio de llenado de la cmara. Por la parte correspondiente al pivote, se le agrega el trocar metlico de un catter el cual se introduce en el extremo de un capilar de polietileno. El extremo de esta cmara se sumerge en un vaso de precipitados con agua. Una vez hecho esto se marca el nivel de la sacarosa en el tubo capilar, leyendo cada 15 minutos el nivel ascendido hasta que se detenga el proceso. Anote sus resultados en la tabla. Nota: cualquier error en el montaje del osmmetro se manifestar por salida de solucin coloreada del dispositivo. Tiempo Altura min. mm 15 30 45 60 75 90 105 120
1) Grafique tiempo en las abscisas (eje x) ordenadas (eje y).
y altura en milmetros en las
CLCULO DE LA PRESIN OSMTICA
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La columna de sacarosa ejercer finalmente una presin que se opone al paso del agua (Presin Hidrosttica). Calculando sta, se puede conocer la presin osmtica ya que ambas son iguales. Esto se hace mediante la frmula: = h g = presin osmtica h = altura a la que asciende la solucin de sacarosa (en metros) = densidad de la solucin de sacarosa (1.088 g/mL), (convertirla a kg/m3) g = aceleracin debida a la gravedad (9.81 m/s2) Efectuando esta operacin encontramos la presin osmtica en Pascales. Para obtener atmsferas usamos la siguiente equivalencia: 1Pa 1Atm = --------------1.013 x 105 1) 2) 3) 4) Cundo deber detenerse el proceso osmtico? Depende slo de la altura la presin osmtica? Explique. Influye el radio del capilar en la presin osmtica? Explique. La sacarosa y el colorante dializan? PREPARACIN DE SOLUCIONES PORCENTUALES Experimento 3 Utilice la cantidad de NaCl que se proporciona en un sobre con el material, (rotulado en miligramos), prepare una cantidad determinada de solucin de NaCl al 2% considerando que la pureza del reactivo es de 100%. 1) Describa detalladamente los clculos que hizo para conocer la cantidad de agua destilada que es necesario aadir al NaCl del sobre para que la solucin sea al 2%. 2) Conserve esta solucin ya que se utiliza en el experimento 4 Considerando que la solucin de NaCl es al 2% calcule las concentraciones siguientes: Molaridad Normalidad MEq/ml mg/ml moles % Osmolaridad DILISIS Ejemplo de membranas dialticas son el celofn y el colodin. Se deber poner particular atencin al hecho de que este experimento es la base del tratamiento de pacientes renales descompensados por medio de dilisis, la cual es til tambin para
eliminar sustancias nitrogenadas, medicamentos en exceso o exceso de acidez en sangre. Mdicamente se refieren diversos tipos de dilisis de los cuales mencionaremos la Hemodilisis y la Dilisis peritoneal. EXPERIMENTO 4 Como antecedente de este experimento prepare dos tubos de ensayo, coloque en uno de ellos 2 mL de NaCl al 2% y 5 gotas de AgNO3 (nitrato de plata). Al otro tubo agrguele 2 mL de solucin de almidn al 1% y 2 gotas de solucin de Lugol. Observe la reaccin que ocurre en cada tubo. Rotlelos como testigo de cloruros y testigo de almidn respectivamente.
Humedezca por inmersin en agua destilada durante 10 minutos la seccin del tubo de colodin o celofn de aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm de dimetro y cierre un extremo atndolo con hilo de algodn. Llnelo con una mezcla de 1 mL de solucin de NaCl al 2% preparado en el experimento 3 y 10 mL de solucin de almidn al 1%. Ate cuidadosamente el otro extremo del saco y suspndalo en un vaso de precipitados con agua destilada. Se determinar la presencia de almidn y de cloruros en el lquido del vaso de precipitados que rodea al saco, a tiempo cero, a la hora y a las dos horas. Pasado este tiempo repita las dos pruebas en el lquido contenido en el saco. 1) Ha dializado el almidn a travs de la membrana? 2) Dializ el cloruro de sodio? 3) Explique este fenmeno. PREPARACION DE SOLUCIONES EXPERIMENTO 5 Prepare 100 mL de solucin 0.5M de cido actico (CH3-COOH) tomando como base los siguientes datos: El cido actico tiene un peso molecular de 60, la pureza del reactivo es de 99.7% y la densidad a 20C es de 1.06 g/mL. Una vez preparada consrvela para utilizarla en el experimento siguiente. 1) Describa detalladamente los clculos que hizo para conocer el volumen de cido actico concentrado que utiliz para preparar los 100 mL de dicha solucin. R = _________ mL de CH3-COOH. 2) Considerando que la solucin es 0.5M calcule las concentraciones siguientes: % (p/v) Normalidad mmoles/L
= = =
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gramos/L mEq % Os molaridad
= = =
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN POR TITULACIN EXPERIMENTO 6 En este experimento se utilizar la solucin de cido actico (CH3-COOH) (solucin problema) que se prepar en el experimento 5. En un matraz Erlenmeyer de 250 mL coloque 10 mL de la solucin de cido actico problema, midindolos con la mayor exactitud posible. Aada 2 gotas de fenolftalena y titule utilizando solucin de NaOH 0.2N. Recuerde que el punto de titulacin se observar cuando persista por ms de un minuto un ligero color rosa. 1) Cuntos mL de NaOH 0.2N gast para neutralizar los 10 mL de la solucin de cido actico? R = _________ mL 2) De acuerdo con los resultados que obtuvo y considerando que la solucin de NaOH es exactamente 0.2N. Cul es la verdadera normalidad del cido actico problema? 3) Escriba el concepto de titulacin cido-base.
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3. ELECTRLITOS y pH
uando una corriente elctrica circula por una solucin acuosa de cloruro de sodio (NaCl), hay una transferencia de materia, la cual consiste en partculas con carga llamadas iones. Los iones que se mueven hacia el nodo (polo positivo) son los aniones, los que migran hacia el ctodo (polo negativo) son los cationes y hay liberacin de hidrgeno y cloro, evidencia de la descomposicin del agua, proceso al cual se le llama electrlisis. Las sustancias que permiten el paso de la corriente se conocen como electrlitos y a los que no manifiestan esta propiedad como no electrlitos. A esta capacidad de dar paso a la electricidad se le conoce como conductancia. Los electrlitos de clasifican en fuertes y dbiles segn su potencia para conducir la corriente elctrica. Los electrlitos fuertes son los muy disociables como las sales minerales, los hidrxidos de metales alcalinos, y los cidos minerales. En los lquidos del organismo encontramos como ejemplo de electrolitos fuertes al cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl) y cloruro de calcio (CaCl2), entre otros. Son electrlitos dbiles la mayor parte de los compuestos orgnicos (como los cidos lctico, pirvico, etc.), y los compuestos nitrogenados. En el agua corporal hay muchos ejemplos de compuestos no electrlitos como glucosa, urea y creatinina. CONDUCTIVIDAD La conductividad de las soluciones electrolticas depende exclusivamente de las molculas disociadas, y por lo tanto depende del grado de disociacin y de la concentracin de los electrlitos presentes. Entre mayor sea la concentracin, mayor ser la conductividad, hasta un lmite determinado en el cual se hace constante y luego disminuye, explicndose esto porque cuando la concentracin de cationes y aniones es grande, interfieren entre s y en tal caso los cationes tienen una menor libertad para desplazarse debido a la interaccin con los aniones cercanos en la solucin y viceversa. Esta explicacin se puede aprovechar para explicar la fuerza inica de una solucin, ya que al no desplazarse libremente las molculas en la solucin, la concentracin activa o actividad de las soluciones es menor que la concentracin real, por lo tanto:
Cz
2
I = --------La fuerza inica (I) es la semisuma del producto de la concentracin
(C) del in por la valencia (z)al cuadrado. Se sabe que las fuerzas de atraccin entre iones de carga con signos contrarios disminuye rpidamente al crecer las distancias. En las soluciones concentradas, en
las que los iones se encuentran ms cercanos, se hacen mayores y por lo tanto la actividad se hace menor, en las soluciones muy diluidas la actividad y la concentracin efectiva son equivalentes entre s. ELECTRLISIS DEL AGUA EXPERIMENTO 1 Coloque un cristalizador sobre un fondo blanco y agregue 50 mL de solucin de NaCl al 10%. Introduzca en la solucin electrodos de carbn conectados a una fuente de energa como el puente de Wheatstone o una pila. Observe la formacin de gas, agregue entre los electrodos 5 gotas de azul de bromofenol como indicador y observe los cambios de coloracin en la solucin cercana a los electrodos. Intente captar el olor en cada electrodo y descrbalo. a) Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos. b) Esquematice el proceso de la electrlisis del agua. CONDUCCIN DE CORRIENTE EN ELECTRLITOS FUERTES Y DBILES EXPERIMENTO 2 Coloque la solucin de cido clorhdrico (HCl) 0.5M en un vaso de precipitados en cantidad suficiente para que tenga contacto con los electrodos en una tercera parte de su longitud. Introduzca los electrodos conectados a una fuente de energa y observe el paso de la corriente elctrica manifestado por la intensidad de la luz emitida por el foco. Observe tambin la intensidad luminosa con relacin a la distancia entre los electrodos, sin ponerlos en contacto. Repita el experimento usando cido actico (CH3COOH) 0.5M. Anote sus resultados. Solucin HCl CH3COOH 0.5M 0.5M Intensidad luminosa Variacin con la distancia
PREPARACIN DE SOLUCIONES DE pH CONOCIDO CON ELECTRLITOS FUERTES Y DBILES Los cidos o las bases se clasifican en dbiles o fuertes segn su grado de disociacin, as los electrlitos fuertes son los que estn ms disociados y por lo tanto la concentracin molar del in hidrgeno o del in hidroxilo en sus soluciones ser igual a la normalidad, lo que simplifica el clculo de su pH. pH = -log [H+] y pOH = -log [OH-]
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Adems en toda solucin acuosa: pH + pOH = 14 Pero en el caso de los cidos y bases dbiles, los cuales estn parcialmente disociados, adems de conocer la normalidad del cido o base, deber conocerse el grado de disociacin de la sustancia, o sea, la constante de disociacin cida Ka o bsica Kb, la cual es diferente para cada sustancia. En el clculo del pH se deber aplicar la frmula en la que se toman en cuenta la constante K de disociacin respectiva y la molaridad C de la solucin. pH = 1/2pKa 1/2log C y pOH = 1/2 pKb 1/2log C EXPERIMENTO 3 Empleando la frmula que corresponda, calcule las cantidades adecuadas para preparar 250 mL de cada una de las siguientes soluciones: De cido clorhdrico a partir de HCl al 37% de pureza y densidad de 1.18 g/mL. De pH = 1.3, 1.6 y 2 De cido actico a partir de CH3-COOH al 99.7% de pureza, densidad de 1.06 g/mL y pKa = 4.74. De pH = 3.02, 3.17 y 3.37 Prepare el par de soluciones que le indique su profesor y consrvelas para el siguiente experimento. ACIDEZ VERDADERA Y ACIDEZ DE TITULACIN EXPERIMENTO 4 Determine colorimtricamente (con papel indicador) el pH de cada una de las soluciones que prepar en el experimento anterior. A continuacin determine el pH potenciomtrico de cada una de ellas. Posteriormente, mida exactamente 20 mL de la solucin de HCl que prepar, colquelos en un matraz Erlenmeyer, aada 2 gotas de solucin de fenolftalena y titlela con NaOH 0.1N. A continuacin mida exactamente 20 mL de la solucin de CH3-COOH que prepar, colquelos en otro matraz Erlenmeyer, aada 2 gotas de solucin de fenolftalena y titlela con NaOH 0.1N. Con los datos obtenidos llene la tabla Soluci n
HCl CH3COOH teric o
PH
TITULACIN Gasto de NaOH 0.1N mL
concentracin
(N tit x gasto)/V
prob
Colorimtri co
Potenciomtric o
teric o
Experiment al
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4. SOLUCIONES REGULADORAS
las soluciones reguladoras se les pueden aadir cantidades relativamente grandes de cidos o lcalis sin alterar de manera significativa su pH. Esta accin amortiguadora se debe a la presencia en la solucin de un sistema formado por un cido o una base dbil y su sal correspondiente. Si se toma como ejemplo una solucin que contenga un cido dbil, al que representaremos por HA y su sal, representada por BA los hidrogeniones existentes en ella procedern nicamente de las molculas cidas, que se disocian como sigue: HA -- H + A
+ -
El equilibrio de la reaccin est dado por la siguiente ecuacin: [H ] [A ] --------------------- = Ka [HA] Donde Ka es la constante de disociacin del cido. De esta ecuacin se deduce que la concentracin de hidrogeniones es: Ka [HA] [H ] = -----------------+
[A ] La relacin entre estas dos constantes es, sin embargo, tan sensiblemente constante en condiciones ordinarias que podemos afirmar que la concentracin de Aes igual a la concentracin de la SAL. Sustituyendo una expresin por otra en la ecuacin anterior tenemos: [cido] [H ] = Ka --------------[Sal] Si se toman logaritmos negativos en ambos trminos de la ecuacin, (manipulacin matemtica para manejar nmeros muy pequeos o muy grandes), queda as: [cido] - log [H ] = - log Ka log --------------[Sal] Ahora bien, si -log [H ] es igual a pH, por analoga podemos decir que log de Ka es igual a pKa por lo que:
[cido] pH = pKa log --------------[Sal] Por otra parte por las leyes de los logaritmos, las expresiones log de ([cido]/[Sal]) y + log de ([Sal]/[cido]) son iguales y la segunda puede reemplazar a la primera, de tal modo que hechas todas las modificaciones la ecuacin queda finalmente como sigue: [Sal] pH = pKa + log ---------[cido] Esta ecuacin se conoce con el nombre de Ecuacin de Henderson Hasselbalch y nos indica que el pH de una solucin que contenga un cido dbil y su sal est determinado por el valor de pKa (constante para cada cido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentracin de la sal entre la concentracin del cido. Por ejemplo, el valor de la constante de disociacin Ka del cido actico es de 1.8 x10-5. El valor de su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solucin reguladora que posea iguales cantidades de cido actico y acetato de sodio en concentracin 0.1N, el pH de esa solucin sera de: 0.1N pH = 4.74 + log ---------- = 4.74 0.1N Adems de servir para la preparacin de soluciones de pH conocido, las soluciones reguladoras tienen dentro del organismo un papel de importancia capital que es el de evitar que aumente o disminuya de manera importante la concentracin de iones hidrgeno, ya que la vida humana es posible en lmites muy estrechos de pH, es decir, para la sangre arterial un pH de 7.40 y para sangre venosa y lquidos intersticiales 7.35. Este ltimo es menor por tener mas CO2 y por lo tanto mas H2CO3 producido metablicamente. Se sabe que los lmites mximos de pH en los que por algunos minutos puede permanecer el organismo sin sufrir muchas alteraciones son de 7.0 a 7.8. En los lquidos donde existen y actan al mismo tiempo varios sistemas amortiguadores, como sucede en la sangre, el cido o la base que entra es amortiguado por todos los sistemas presentes de manera proporcional a la eficacia de cada uno de ellos. La regulacin fisicoqumica tiene lugar en todos los medios que contienen reguladores, constituidos principalmente por cidos o bases dbiles y sus sales. Por ejemplo el de fosfatos H2PO4-/HPO4= con un pKa2 de 7.2 (o de 6.8 a la temperatura corporal), es el principal amortiguador intracelular. El principal amortiguador extracelular en la sangre y lquidos intersticiales es el sistema bicarbonato H2CO3/HCO3- con un pKa de 6.1.
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En el interior del eritrocito, adems del bicarbonato, el amortiguador de mayor importancia es el de hemoglobina reducida / oxihemoglobinato (HHb/HbO2). Otros sistemas son los de protenas y aminocidos. Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existen excesos de lcali cido ya que un cambio del pH afecta la estructura y la actividad de las protenas, la distribucin de otros iones entre las clulas y el lquido extracelular, la actividad de hormonas y frmacos, etc. APRECIACIN DEL PODER REGULADOR Y EFECTO DE LA CONCENTRACIN EXPERIMENTO 1 Disponga 3 series de 4 tubos de ensayo cada una. Numere los tubos de cada serie del 1 al 4. Coloque en los tubos nmero 1 de cada serie 5 mL de agua destilada hervida. En los tubos nmero 2 coloque 5 mL de solucin de cloruro de potasio (KCl) 0.5M En los tubos nmero 3 ponga una mezcla formada por 2 mL de solucin de fosfato dicido de potasio (KH2PO4) 0.01M y 3 mL de solucin de fosfato monocido disdico (Na2HPO4) 0.01M. En los tubos nmero 4 ponga 2 mL de solucin de KH2PO4 0.1M y 3 mL de solucin de Na2HPO4 0.1M.
1. A continuacin compruebe en la serie 1 que el pH de las soluciones es aproximadamente neutro, para ello agregue cinco gotas de indicador rojo de fenol (rosa), a cada uno de los tubos de la serie y observe el color caracterstico amarillo o rojo correspondiente a un pH de 6.8 a 8.2. 2. A los cuatro tubos de la serie 2 adicione cinco gotas de verde de bromocresol, indicador de zona cida. A continuacin agregue 10 gotas de HCl 0.01M al tubo nmero 1 y observe el cambio de color que se opera (de verde a amarillo). 3. Enseguida vea el nmero de gotas de la misma solucin de HCl 0.01M que es necesario agregar al tubo 2 de la serie en cuestin para igualar la coloracin (aunque no la intensidad) con el tubo nmero 1. 4. Ahora, cuente el nmero de gotas de solucin de HCl 0.1M que es necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloracin con el tubo nmero 1. (Cada una de estas gotas de HCl 0.1M equivale a 10 gotas de HCl 0.01M)
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1. 2. 3. 4.
Adicione a los cuatro tubos de la serie 3, cinco gotas de azul de timol, indicador de zona alcalina que vira de amarillo a azul fuerte correspondiendo a un pH 8.0 a 9.6). A continuacin agregue 10 gotas de solucin de NaOH 0.01M al tubo nmero 1 y observe tambin el cambio de coloracin (de amarillo a azul). Determine el nmero de gotas de la misma solucin de NaOH 0.01M que es necesario agregar al tubo nmero 2 de esta serie para que adquieran el mismo color del tubo nmero 1, (amarillo a azul). A continuacin, cuente el nmero de gotas de solucin de NaOH 0.1M que es necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloracin con el tubo nmero 1.
1) Qu indica el cambio de color en cada una de las series? 2) Cmo explicara usted la diferencia en las cantidades de cido y base que deben agregarse a los tubos 2, 3 y 4 de las series correspondientes para igualar la coloracin con el tubo 1? 3) Recuerde que cada gota de las soluciones 0.1M equivale a 10 gotas de las soluciones 0.01M.
CURVAS DE TITULACIN Existen sustancias de mucha importancia en bioqumica como son los aminocidos y las protenas los cuales tienen grupos titulables y que actan como anfolitos aceptando iones H+ o iones OH-. En este experimento se determinarn las curvas de titulacin de glicina con HCl y con NaOH. EXPERIMENTO 2 En un vaso de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solucin de glicina 0.1N, agregue una barra magntica y colquela sobre el agitador, tmeles el pH y titule, como se indica en la tabla, con NaOH 0.1N. En otro vaso de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solucin de glicina 0.1N, agregue una barra magntica y colquela sobre el agitador, tmeles el pH y titule, como se indica en la tabla, con HCl 0.1N.
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Agregar HCl 0.1N Glicina 0.1N 30 ml Acumulativo ml pH 0 0 2 2 3 5 4 9 5 14 5 19 5 24 1 25 1 26 1 27 1 28 0.5 28.5 0.5 29
Agregar NaOH 0.1N ml 0 2 3 4 5 5 5 1 1 1 1 0.5 0.5

Acumulativo
Glicina 0.1N 30 ml PH
0 2 5 9 14 19 24 25 26 27 28 28.5 29
Grafique dando a los valores acumulativos de HCl signo negativo y a los de NaOH signo positivo, en el eje de las x y el pH en el eje de las y. 1) En su grfica, identifique los valores de pK1 y pK2. 2) Calcule el punto isoelctrico sabiendo que: pK1 + pK2 pI = ------------2 PREPARACIN DE SOLUCIONES REGULADORAS EXPERIMENTO 3 Empleando la frmula de Henderson Hasselbalch, calcule los volmenes necesarios para preparar soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le indique su profesor, empleando fosfato dicido de potasio (KH2PO4) 0.1M y fosfato monocido de sodio (Na2HPO4) 0.1M (pK2 = 7.2); posteriormente preprelas y compruebe sus resultados midiendo el pH potenciomtrico. Explique la coincidencia o no, entre sus resultados y el clculo terico.
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5.PROTENAS
rincipales componentes del protoplasma y las membranas celulares, su nombre deriva del griego protos que significa primero, primordial o fundamental, contienen en su molcula C, H, O, N y en ocasiones P y S. El nitrgeno constituye aproximadamente el 16%; por hidrlisis dan como producto final aminocidos, los cuales varan en nmero, cantidad y posicin en cada protena. La protena est determinada por cuatro niveles estructurales La estructura primaria depende del nmero y secuencia de aminocidos unidos por enlace peptdico (-CO-NH-) covalente. En la estructura secundaria la cadena polipeptdica puede enrollarse formando estructuras helicoidales u otro tipo de conformacin, estabilizadas por puentes de hidrgeno La estructura terciaria es una cadena polipeptdica ya enrollada que adopta la conformacin ms estable, o sea, sufre un sper enrollamiento. La estructura cuaternaria puede estar constituida por ms de una cadena polipeptdica y en la asociacin de estas cadenas participan todos los tipos de enlaces qumicos, fuertes o dbiles, debido a lo cual adoptan una estructura tridimensional caracterstica que les da actividad biolgica. Existen muchos tipos de protenas en el organismo, cada una con una funcin especfica; algunas son estructurales, otras actan como catalizadores u hormonas, generan presin onctica para mantener el balance hidroelectroltico, son mecanismos genticos, de defensa, transportan gases, electrones, solutos a travs de la membrana, etc. La actividad de una protena depende de su conformacin espacial, por lo que agentes fsicos y qumicos que alteran los diferentes enlaces son capaces de anularla. Algunos de los agentes desnaturalizantes ms comunes son cidos o bases, detergentes, metales pesados, solventes orgnicos, alcaloides, calor, radiaciones ultravioleta, rayos x, ondas ultrasnicas, sales inorgnicas, sustancias orgnicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc. Las protenas desnaturalizadas pierden su actividad, modifican su solubilidad y precipitan. Tal como existen en la naturaleza se denominan protenas nativas. ALGUNAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS Las propiedades fisicoqumicas y biolgicas caractersticas de las protenas se deben a los aminocidos que las constituyen y las reacciones coloridas que se utilizan para su anlisis en realidad detectan la presencia de un aminocido especfico. Ensayaremos a continuacin algunas de ellas.
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REACCIN DE MILLN Es especfica para el grupo fenlico y por lo tanto, la dan positiva todas las sustancias que poseen esta funcin, como el fenol, cido saliclico, timol, tirosina y todas aquellas protenas que contengan tirosina. EXPERIMENTO 1 Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno, 2 mL de una de las soluciones siguientes: Tubo Protena (al 2%) 1 Peptona 2 Casena 3 Gelatina 4 Albmina Posteriormente aada 5 gotas del reactivo de Milln. Caliente ligeramente hasta que la solucin hierva. Precaucin!. La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparicin de un precipitado blanco el cual por accin del calor se vuelve rojo. La presencia de sales, as como soluciones muy alcalinas, pueden interferir en esta reaccin. 1) Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo. 2) Explique en qu consiste el reactivo de Milln y cul es el mecanismo que se ha propuesto para esta reaccin. REACCIN DEL BIURET Todas las molculas que contengan dos o ms uniones peptdicas, por lo tanto todas las protenas y pptidos no menores de 3 unidades, dan positiva la reaccin del biuret. El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba. Cuando una protena o un polipptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre (CuSO4) en solucin alcalina se produce un color caracterstico prpura o violeta. El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Esta reaccin nos sirve para diferenciar las protenas y pptidos de los aminocidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrlisis proteica, la reaccin ser negativa cuando la hidrlisis sea completa. EXPERIMENTO 2 Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 1 mL de las siguientes soluciones:
Tubo Protena (al 2%) 1 Peptona 2 Casena 3 Gelatina 4 Albmina Aada 2 mL de solucin de NaOH al 10% Precaucin! y 3 a 5 gotas de solucin de sulfato de cobre CuSO4 al 1%.
Agite los tubos y observe la reaccin que se produce en cada caso. La aparicin de una coloracin violeta o rosa en no ms de 20 minutos debe considerarse como prueba positiva. 1) Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo. 2) Se puede considerar la reaccin del biuret como caracterstica para todas las protenas? Por qu? 3) Escriba la reaccin. REACCIN XANTOPROTICA Esta reaccin se debe a la formacin de nitroderivados aromticos por reaccin del cido ntrico sobre grupos bencnicos que poseen algunos aminocidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptfano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas protenas que tengan aminocidos aromticos en su molcula. EXPERIMENTO 3 Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL de una de las siguientes soluciones: Tubo Protena (al 2%) 1 Peptona 2 Casena 3 Gelatina 4 Albmina
Aada 1 mL de cido ntrico (HNO3) concentrado con cuidado!, caliente ligeramente y observe una coloracin amarilla caracterstica. Deje enfriar esta solucin y aada cuidadosamente gotas de hidrxido de amonio (NH4OH) concentrado, hacindolas resbalar cuidadosamente por las paredes del tubo, para estratificar. En la interfase se observar un anillo naranja.
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1) Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo. 2) Se puede considerar esta reaccin general para todas las protenas? 3) Explique por qu se tie de amarillo la piel al contacto con el HNO3. REACCIN DE AMINOCIDOS AZUFRADOS Las protenas que contengan los aminocidos cistena y cistina cuando se tratan con lcalis concentrados, desprenden cido sulfhdrico H2S, el cual se puede reconocer por su olor fuertemente desagradable y caracterstico, o bien, por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de plomo (PbS). EXPERIMENTO 4 Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL de una de las siguientes soluciones: Tubo Protena (al 2%) 1 Peptona 2 Casena 3 Gelatina 4 Albmina Agregue 2 mL de hidrxido de sodio (NaOH) al 10%. Precaucin! Caliente ligeramente. Aada a todos los tubos 0.5 mL de solucin de acetato de plomo (Pb(CH3COO)2). Coloque los tubos en bao mara a ebullicin por 5 min. El oscurecimiento de la solucin o la formacin de un precipitado negro indica la presencia de aminocidos azufrados. 1) Anote sus resultados en la tabla al final del captulo. 2) Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado. 3) Qu sustancias pueden interferir en esta reaccin? REACCIN DE NINHIDRINA Es una de las reacciones ms sensibles para identificar aminocidos en general, ya que detecta una parte de aminocido en 1 500 000 partes de agua. Aminocidos y muchas aminas primarias dan un color violeta caracterstico. La prolina da coloracin amarilla. Por su sensibilidad esta reaccin se emplea para valoracin cuantitativa de aminocidos por colorimetra. La valoracin de aminocidos en orina, por ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en algunas enfermedades como hepatopatas, infecciones agudas o diabetes mellitus en las que se presenta hiperaminoacidemia, estas se ven acompaadas por aminoaciduria
paralela. Algunas enfermedades metablicas congnitas dan lugar a la eliminacin anormal de algunos aminocidos en la orina (p. ej. fenilcetonuria). EXPERIMENTO 5 Se utilizarn cuadros de papel filtro Whatman no. 1 de 2 x 2 cm, sobre los cuales se colocarn gotas de las siguientes soluciones: cuadro Sustanci a: 1 Glicina 2 Peptona 3 Gelatina 4 Casena 5 Albmin a Precaucin! Use guantes o pinzas para manipular el papel. Anote debajo de cada muestra el nombre del compuesto y adale una gota de solucin de ninhidrina en butanol al 0.1%. Coloque el papel en el horno a 110 C durante 5 minutos. Describa el aspecto de la reaccin 1) Anote sus resultados en la tabla al final del captulo. 2) Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado. 3) Qu sustancias dan positiva la reaccin de la ninhidrina, adems de las protenas, pptidos y aminocidos? Tabla de resultados de algunas propiedades qumicas de las protenas:
SUSTANCIA MILL ON GLICINA PEPTONA GELATINA CASENA ALBMINA BIURE T
REACCIN
XANTOPROTIC A AMINOCID OS AZUFRADOS NINHIDRIN A
ALGUNAS DE LAS PROPIEDADES FSICO QUMICAS DE LAS PROTENAS Muchas de las propiedades qumicas de las protenas son comunes a varias especies por que contienen el mismo tipo de aminocidos, por lo que para caracterizar una protena es necesario estudiar sus propiedades fisicoqumicas las
cuales dependen del peso molecular, de su carga elctrica neta y de la conformacin que adopte la molcula. DESNATURALIZACIN DE PROTENAS Cuando la estructura altamente ordenada de una protena se somete a la accin de agentes fisicoqumicos desnaturalizantes, queda reducida al llamado polmero estadstico o cadena de aminocidos y adems pierde toda actividad biolgica. A continuacin se consideran algunos de los agentes desnaturalizantes ms importantes como son los metales pesados, los cidos fuertes y el alcohol. PRECIPITACIN DE PROTENAS POR METALES PESADOS Las protenas cuando se encuentran en solucin a pH superiores a su punto isoelctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinatos insolubles. Tomaremos como ejemplo dos protenas, la peptona y la gelatina y observaremos su reaccin, en forma simultnea frente a los metales pesados : Hierro (Fe), Plata (Ag), Mercurio (Hg), y Plomo (Pb). EXPERIMENTO 6 Prepare una serie de 4 tubos de ensayo conteniendo 1 mL de peptona al 2% y rotlelos como P1 P4 (por peptona). Prepare otra serie de 4 tubos, sta vez con gelatina al 2%. Rotlelos como G1 G4 (por gelatina) y agregue lo que se indica en la tabla.
Anote sus observaciones en la misma, evaluando por medio de cruces (de x a xxx segn la turbiedad del precipitado). Serie Seri P eG Tubos: 1 2 3 4 1 2 3 4 Observaciones: Metal Pesado:
Agregar 2 gotas de solucin al 2% de:
Precipitado: Serie Serie P G
Con exceso: Serie Serie P G
FeCl3 AgNO3 HgCl2 Pb(CH3COO) 2
1) Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las protenas? 2) Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las protenas?
PRECIPITACIN DE PROTENAS POR EFECTO DE CIDOS FUERTES Los cidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las protenas formando productos de desnaturalizacin insolubles conocidos como metaloprotenas. EXPERIMENTO 7a Coloque en 4 tubos de ensayo numerados, 3 mL de las siguientes soluciones: peptona, gelatina, casena y albmina al 2% y aada un volumen igual de cido tricloroactico (CCl3COOH) al 5%. 1) Anote sus resultados al final del captulo. 2) Cmo puede explicar el efecto desnaturalizante del cido tricloroactico y en general de cualquier cido? EXPERIMENTO 7b Prepare dos tubos de ensayo y mrquelos como orina normal y orina de paciente nefrtico, coloque en ellos 3 mL de la orina correspondiente. Agregue enseguida, resbalando cuidadosamente por la pared del tubo, para estratificar, 2 mL de la mezcla HNO3 metanol. 1) Observe lo que ocurre en la interfase y describa 2) Qu explicacin le da al fenmeno? PRECIPITACIN DE PROTENAS POR EFECTO DEL ALCOHOL EXPERIMENTO 8 Coloque en tubos de ensayo numerados, 2 mL de las siguientes soluciones: peptona, casena, gelatina y albmina al 2%, estratificando cuidadosamente, agregue 3 mL de alcohol de 96 (CH3CH2OH) y observe que ocurre en la interfase. 1) Observa turbidez en todos los tubos? 2) Anote sus resultados en la tabla: Agente cido tricloroactico (CCl3COOH) al 5% Sustancia Peptona Gelatina Casena Albmina
Alcohol de 96 (CH3CH2OH)
DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO Las protenas al igual que los aminocidos son molculas anfotricas. Es decir, pueden reaccionar con cidos o con lcalis. En medio cido las protenas se combinan con los iones hidrgeno y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberan protones y quedan con carga negativa. El pH en el cual una protena no posee carga
elctrica neta se denomina punto isoelctrico, a este pH la protena presenta su mnima solubilidad y generalmente precipita, teniendo adems una viscosidad mxima, propiedades que tomaremos en cuenta para el siguiente experimento. EXPERIMENTO 9 Prepare una serie de 9 tubos de ensayo siguiendo las instrucciones de la tabla: Aada primero la casena, posteriormente el agua y al final el cido actico. Agite todos los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitacin que se produce en cada tubo inmediatamente y despus de 15 y 30. 1) Anote sus observaciones en la tabla valorando con cruces. 2) Calcule el pH terico de cada tubo, aplicando la ecuacin de Henderson Hasselbalch y antelo en la tabla.
Tubo Casena al 5% en acetato de sodio 0.1N m l Agua destilada m l cido actico 1N m l cido actico 0.1N m l cido actico 0.01N m l pH terico Observacin a los 15 minutos Observacin a los 30 minutos 1 1 8. 4 0. 6 2 1 7. 8 1. 2 3 1 8. 8 0. 2 4 1 8. 5 0. 5 5 1 8. 0 1. 0 6 1 7. 0 2. 0 7 1 5. 0 4. 0 8 1 1. 0 8. 0 9 1 7.4 1.6 -
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6. CINTICA QUMICA Y CATLISIS
e acuerdo con la Ley de Accin de Masas, la velocidad de una reaccin qumica depende de la concentracin de las sustancias que intervienen en la reaccin. Esta Ley establece que: La magnitud de una reaccin es proporcional a la masa activa de las sustancias reaccionantes presentes en ese momento. El trmino masa activa significa la concentracin molecular o sea, la cantidad presente por unidad de volumen. Si reaccionan:
V1
A + B C + D
V2
La velocidad V1 con que reaccionan A y B para producir C y D depende de la concentracin de cada reactivo y de la afinidad que tengan para reaccionar entre s, pero como esto se puede considerar constante, podemos decir que: V1 = k1[A][B] La velocidad V2 con que reaccionan C y D para producir A y B depende a su vez, de la concentracin de C y D y de la afinidad. Por lo tanto podemos decir tambin que: V2 = k2[C][D] Cuando se alcanza el equilibrio qumico, las dos velocidades son iguales. Es decir: V 1 = V2 Sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos: k1[A][B] = k2[C][D] k1 [C][D] ---- = --------k2 [A][B] Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante podemos decir que: [C][D] keq = --------[A][B] Que es la expresin matemtica de la Ley de Accin de Masas y keq se conoce como Constante de Equilibrio.
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COMPROBACIN DE LA LEY DE ACCIN DE MASAS EXPERIMENTO 1 En un vaso de precipitados de 600 mL de capacidad, aada 100 mL de agua destilada, 1 mL de solucin de sulfocianuro de amonio (NH4SCN) 0.2M y 1 mL de solucin de cloruro frrico (FeCl3) 0.2M en HCl 0.1N mezclando hasta lograr la homogeneidad. Observar la aparicin de una coloracin roja, debida a la formacin de sulfocianuro frrico (Fe(SCN)3). En cuatro vasos gerber, coloque en cada uno 25 mL de la mezcla reaccionante anterior, despus de haber agitado hasta completa homogeneidad, enseguida agregue a cada vaso los reactivos descritos en la tabla siguiente: Reactivo Vaso 1 2 3 4 FeCl3 0.2M en HCl 0.1N ml 0.5 1.0 -Testigo NH4SCN 0.2M 0.5 1.0 -ml NH4Cl ml --5.0 --
1) Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado. 2) Observe la intensidad de la coloracin en cada vaso y de acuerdo a la Ley de Accin de Masas y al principio de Le Chatelier trate de explicar sus resultados. VELOCIDAD DE UNA REACCIN QUMICA El orden de la reaccin, tiene mas importancia que el tipo, cuando se estudia la cintica, ya que nos indica la relacin entre la velocidad y la concentracin de los reactivos, por lo que se clasifican en: Reacciones de orden cero. Su velocidad no es afectada por la concentracin. Est determinada por algn otro factor limitante como absorcin de luz, velocidad de difusin, etc. Reacciones de primer orden. Su velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin de una de las sustancias reaccionantes Reacciones de segundo orden. Su velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin de dos sustancias reaccionantes. Reacciones de tercer orden. Su velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin de tres sustancias reaccionantes. La mayor parte de las reacciones enzimticas se caracterizan por seguir el modelo correspondiente a las reacciones de primer orden. Matemticamente la reaccin puede representarse as:
dc ----- = Ke dt
dt = tiempo dc = concentracin del material velocidad de reaccin Ke = constante especfica de
Si representamos por a la concentracin inicial de material y por x la cantidad que ha reaccionado en el tiempo t, la expresin a-x significa concentracin del material en el tiempo t. La ecuacin anterior puede expresarse en funcin de a, x y t y al integrarla nos queda: 2.303 a Ke =------------ x log -------t (a x) Cuando se ha completado la descomposicin de la mitad del material, la ecuacin se simplifica y queda: 2.303 (log 2) Ke =------------------------t1/2 Donde t1/2 es el perodo de vida media, es decir, el tiempo necesario para que se descomponga la mitad de una cantidad dada de material reaccionante. VELOCIDAD DE DESCOMPOSICIN DEL H2O2 EXPERIMENTO 2 Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, 5 mL de una solucin problema de perxido de hidrgeno (H2O2)y 2 mL de cido sulfrico (H2SO4) (1:6). Caliente la mezcla hasta casi ebullicin PRECAUCIN! y as en caliente, titule con una solucin de permanganato de potasio (KMnO4) 0.01M. El punto final de la titulacin lo observar cuando persista un ligero color rosa, por exceso de la solucin de permanganato. El H2SO4 y el calentamiento tienen por objeto impedir la formacin de MnO2. Haga esta determinacin por duplicado y haga el promedio de las dos determinaciones. A continuacin prepare una mezcla de 50 mL de sangre desfibrinada al 0.06% y 50 mL de la solucin problema de perxido de hidrgeno. A los 5, 10, 20, 30 y 40 minutos tome alcuotas de 10 mL y transfiralos a un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, aada 2 mL de solucin de H2SO4 (1:6) caliente hasta casi ebullicin y titule con una solucin de permanganato de potasio (KMnO4) 0.01M en la forma ya explicada. 1) Escriba las reacciones qumicas que se han efectuado. 2) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:
Tiempo/s KMnO4 0.01M/mL (a x)

0 300 600 1200 1800 2400
moles/L log a/(a-x)
Ke
Para calcular la Ke a cada tiempo debe utilizar la ecuacin: 2.303 a Ke = ------------ x log -------t (a x) 1) Determine el orden de reaccin grficamente. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN QUMICA Desde hace muchos aos se saba en forma emprica que la velocidad de muchas reacciones aumenta al aumentar la temperatura. Arrhenius encontr una relacin que expresa matemticamente la forma como la temperatura afecta la velocidad de una reaccin, la cual est dada por la siguiente ecuacin: d(ln K) E ----------- = ---------dt RT2 La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de velocidad de una reaccin es inversamente proporcional al cuadrado de la temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases. E es la energa de activacin. Actualmente se considera que para que las molculas puedan reaccionar deben ser primero activadas, es decir, requieren una cantidad de energa E. Integrando entre lmites la ecuacin de Arrhenius: K2 E (t2 - t1) log ------- = ------------K1 2.3 (R t1 t2) K2 log ----- = K1
E (t2 - t1) --------------------2.3 (1.99) (t1 t2)

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K2 log ------- = K1
0.219E (t2 - t1) ---------------------(t1 t2)
Si consideramos que E = 1200 caloras al aumentar la temperatura de 22C a 32C, tendramos: K2 0.219 x 1200 x (305 - 295) log ------ = --------------------------------------- = 0.29 K1 (295 x 305) K2 antilog log ------- = antilog 0.29 K1 K2 ------- = 2 K1 Esto quiere decir que por cada 10C de aumento la velocidad de la reaccin se duplica. En la mayor parte de las reacciones se observa este aumento bajo ciertas temperaturas lmites. EXPERIMENTO 3 Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad 0.25 g de yoduro de potasio (KI) y aada 25 mL de solucin de H2SO4 1:6. Agite hasta disolucin completa y agregue agua destilada hasta completar 50 mL. Esta solucin se denominar Solucin de cido yodhdrico HI y se utilizar en este experimento y en el siguiente. Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL y agregue los reactivos segn la tabla que se muestra a continuacin:
solucin HI Na2S2O3 0.02N Almidn vaso ml ml gotas 1 5 1.5 5 2 5 1.5 5 25 C 2 3 5 1.5 5 40 C 2 4 5 1.5 5 60 C 2 5 5 1.5 5 90 C 2
Preincubar 5 minutos a: 5 C H2O2 al 0.2% ml 2
Deber medir con la mayor precisin posible el tiempo desde el momento de aadir el H2O2 al 0.2% hasta el momento en que aparece sbitamente un color azul intenso. 1) Escriba las reacciones qumicas que se han efectuado. 2) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. Temperatura C 5 25 40 60 90 Tiempo de aparicin del color azul en segundos:
3) Trace la grfica de 1/tiempo de reaccin en las ordenadas contra la temperatura en las abscisas. EFECTO DE LA [H+] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN QUMICA Se sabe que muchas reacciones qumicas son afectadas por el pH del medio, las molculas deben ser activadas para que puedan reaccionar, el pH cido favorece la ionizacin y el estado inico se puede considerar como un estado activado. EXPERIMENTO 4 Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL de capacidad y numrelos del 1 al 5 y agregue los reactivos segn se indica en la tabla siguiente: Vaso 1 Solucin HI Na2S2O3 0.02N Almidn H2O destilada HCl 0.01N HCl 0.1N HCl 1N HCl 2N H2O2 al 0.2% ml ml gotas ml ml ml ml ml ml 5 1. 5 5 5 2 5 1. 5 5 5 5 5 2 2 2 2 5 2 3 5 1. 5 5 4 5 1. 5 5 5 5 1.5 5
1) Resuma sus resultados en la siguiente tabla: [H ] 1 x 10-7 1 x 10-2 1 x 10-1 1 2

+
Tiempo de reaccin en segundos:
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2) Segn sus resultados trace una grfica con el 1/tiempo en segundos en las ordenadas y la concentracin de H+ en las abscisas. VELOCIDAD DE REACCIN Y CATALIZADORES La velocidad de una reaccin qumica es afectada por la presencia de sustancias extraas, catalizadores, que son capaces de acelerar la reaccin al disminuir la cantidad de energa de activacin necesaria. Actualmente se considera que el catalizador se combina con el sustrato formando un complejo intermediario inestable y altamente reactivo. Supongamos la reaccin: A + B AB Esta reaccin en condiciones normales se efecta muy lentamente pero si se aade un catalizador C apropiado, tenemos: A + B + C (AC) + B AB + C Estas reacciones son rpidas y el catalizador puede ser usado una y otra vez. Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgnica o bien sustancias orgnicas complejas producidas por las clulas que son denominadas enzimas. EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGNICO SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRLISIS DE LA SACAROSA La sacarosa es un disacrido no reductor, pero al hidrolizarse, cada molcula libera una molcula de glucosa y una de fructosa, ambas reductoras. Basndose en esto es posible visualizar y cuantificar la hidrlisis de la sacarosa midiendo la concentracin de azcares reductores con algn reactivo apropiado. EXPERIMENTO 5 Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solucin de sacarosa al 0.05M. Un tubo quedar como testigo y al otro se agregarn 3 gotas de cido sulfrico (H2SO4) (1:6). Se ponen ambos tubos en bao mara a ebullicin durante 15 minutos, complete el volumen si es necesario. Emplearemos el reactivo de Fehling para lo cual el tubo que contiene el H2SO4 se neutraliza con 1 ml hidrxido de sodio (NaOH) al 10% y posteriormente se aaden 2 mL de la solucin A y 2 mL de la solucin B del reactivo de Fehling mezclndolos perfectamente y se colocan en bao mara a ebullicin por 5 minutos al cabo de los cuales se sacan del bao y se dejan enfriar y se observa si existe un precipitado rojo de xido cuproso (Cu2O) en ambos tubos. 1) Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador? Por qu?
EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLOGICO (ENZIMA) SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRLISIS DE LA SACAROSA Una de las principales diferencias entre los catalizadores inorgnicos y las enzimas es que los primeros solo son capaces de acelerar un proceso con temperaturas altas, mientras que las enzimas son capaces de hacerlo a temperaturas considerablemente ms bajas. Para esta prctica emplearemos sacarasa, tambin conocida como invertasa o fructofuranosidasa la cual es una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas. Acta hidrolizando los azcares que contienen fructosa. As hidroliza la estaquiosa (tetrasacrido), la rafinosa (trisacrido), y alcanza su mxima velocidad con la sacarosa (disacrido). Se puede medir la hidrlisis observando el cambio en la rotacin ptica o valorando el poder reductor de los productos obtenidos. EXPERIMENTO 6 Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solucin de sacarosa 0.05M y 1 mL de solucin reguladora de acetato de sodio 0.05M a pH de 4.7 Un tubo quedar como testigo y al otro se le agregan 0.2 mL de la solucin de invertasa (solucin enzimtica). Despus de mezclar bien el contenido de ambos tubos se colocan en bao mara a 40C durante 15 minutos; cuando se ha completado el tiempo se les agregan a ambos tubos 2 mL de la solucin A y 2 mL de la solucin B del reactivo de Fehling, mezclndolos perfectamente. Se colocan en bao mara a ebullicin por 5 minutos al cabo de los cuales se sacan del bao y se dejan enfriar. Observe si existe un precipitado rojo de xido cuproso Cu2O en ambos tubos. Compare este experimento con el anterior y explique que sucede.
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7. ENZIMAS
a vida depende de diversos catalizadores orgnicos denominados enzimas: (del griego en = en, zymo = fermento). La mayor parte de las reacciones biolgicas seran cinticamente insignificantes si no fuera por ellas. De naturaleza proteica, son muy sensibles a cualquier cambio en temperatura, pH, fuerza inica, adicin de sales, presencia de agentes oxidantes o reductores, presencia de metales pesados, etc. Al desnaturalizarse se inactivan. NATURALEZA QUMICA DE LAS ENZIMAS Son protenas simples o complejas. Su parte protenica se denomina apoenzima. Si su parte no proteinica se separa fcilmente se le denomina coenzima. Las coenzimas estn relacionadas con las vitaminas y no catalizan por s mismas, ya que se transforman durante la reaccin en que intervienen y requieren de otra enzima para regenerarse. Por otra parte, cuando se encuentra firmemente unida por enlace covalente, no es posible separarla por dilisis y se le denomina grupo prosttico. Varios factores afectan la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas. Algunos de ellos son: temperatura, pH, concentracin de sustrato, concentracin de enzima e inhibidores.
Temperatura Al incrementar la temperatura, se incrementa la energa cintica, lo que ocasiona una mayor probabilidad de colisiones efectivas. La velocidad de las reacciones qumicas aumenta. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura ptima, en la cual catalizan con una velocidad mxima. PH La actividad de la mayora de las enzimas depende del pH debido a la participacin de iones [H+] o iones [OH+] en las reacciones, adems que se afecta la carga de los grupos funcionales. La mayora de las enzimas tienen un pH ptimo en el cual su actividad es mxima. Concentracin de la enzima La velocidad de una reaccin aumenta en proporcin directa a la concentracin de la enzima que la cataliza. La interaccin enzima substrato cumple la Ley de Accin de Masas. Se emplea con frecuencia la velocidad de una reaccin como medida de concentracin de la enzima manteniendo fija la concentracin de substrato. Concentracin de sustrato Si se trabaja con una concentracin fija de enzima la velocidad inicial de reaccin aumenta al incrementar la concentracin del sustrato. Con el tiempo se alcanza un mximo cuando la enzima se satura y la adicin de ms sustrato ya no influye sobre la velocidad. Inhibidores
FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
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EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA La temperatura ptima para la gran mayora de enzimas de animales homeotermos, est alrededor de 37C. Por cada 10 grados centgrados de incremento en la temperatura se duplica la velocidad, esto se conoce como la relacin de vant Hoff, o coeficiente de temperatura QT10. Pero esto ocurre nicamente si no se rebasa la temperatura de desnaturalizacin, ya que cerca de los 60 C la mayor parte de las enzimas se inactivan y se ocasiona una disminucin marcada en la actividad cataltica, hecho que se aprovecha en la tcnica de pasteurizacin. EXPERIMENTO 1 Se prepara una serie de siete tubos como sigue:
Reactivos Sustrato almidn 8 mg/mL 1 m --L Solucin reguladora de fosfatos m --0.02M, pH = 7 L Agua destilada m 5 L Preincubar 5 minutos a 25C Enzima (sol. de amilasa) m L --2 0.5 1.5 3 5C 0.5 Tubo 3 4 0.5 0.5 1.5 3 25 C 0.5 1.5 3 40 C 0.5 5 0.5 1.5 3 50 C 0.5 6 0.5 1.5 3 60 C 0.5 7 0.5 1.5 3 92 C 0.5
Conserve la solucin de amilasa en bao de hielo. Todos los tubos se agitan muy bien y se colocan en sus respectivos baos dejndolos durante 15 minutos al final de los cuales se les agrega, 1 mL del reactivo de cido 3,5 dinitrosaliclico (este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azcares reductores). Se agitan bien y se colocan en bao mara a ebullicin por 10 minutos despus de lo cual se enfran y se leen en el espectrofotmetro a 540 nm, empleando el tubo no. 1 como blanco. Con los datos obtenidos grafique la densidad ptica en las ordenadas y la temperatura en las abscisas. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Tubo Temperatura Absorbancia 1 25 C Blanco 2 5 C 3 25 C 4 40 C 5 50 C 6 60 C 7 90 C EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
El pH es uno de los factores que ms afectan la actividad de las enzimas, por desnaturalizacin, o bien afectando su carga elctrica. El pH ptimo es aquel en el cual ciertos grupos funcionales poseen la carga apropiada para asegurar la formacin del complejo ES. Para la mayora de las enzimas la activi dad ptima se encuentra entre los valores de pH de 6 a 8. Sin embargo, para la pepsi na del jugo gstrico es mxima a un pH de 1.5 que es muy cido, o para la fosfatasa alcalina que se encuentra en huesos y otros rganos y cuyo pH optimo es de 9.5. EXPERIMENTO 2 Prepare una serie de 6 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla: Reactivos Tubo 1 2 3 4 5 6 Sustrato (sol de almidn 8 mg/mL) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sol. reguladora al pH indicado 7 5 6 7 8 9 mL 4.5 4 4 4 4 4 Enzima (sol de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Mezcle e incube a 40C por 15 minutos Terminado este lapso todos los tubos se agitan y se les agrega 1 mL de reactivo de cido dinitrosaliclico. Calintelos en un bao de agua hirviendo por 10 minutos. Este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azcares reductores. Determine la concentracin del azcar reductor liberado, leyendo la densidad ptica en el espectrofotmetro a 540 nm (Puede ser necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 veces con agua antes de leer). 1) Basndose en sus resultados diga Cul es el pH ptimo de la amilasa? 2) Qu azcar se libera en la hidrlisis de este polisacrido? 3) Resuma sus resultados en la siguiente tabla y trace con ellos la grfica correspondiente (D.O. contra pH) pH y ACTIVIDAD ENZIMTICA TUBO pH D.O. 1 7 2 5 3 6 4 7 5 8 6 9 EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA Y DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN
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Actualmente se acepta que la reaccin enzimtica se efecta a travs de la formacin de un complejo enzima sustrato, lo cual puede representarse en forma muy simplificada as: S + E [ES] P + E Si [E] es la concentracin total de enzima y [ES] es la enzima combinada, entonces [E ES] es la concentracin de enzima libre. Recordando la Ley de Accin de Masas, tenemos: V1 = K1 [E ES] [ES]; V2 = K2 [ES]; V3 = K3 [ES] La velocidad de formacin (Vf) del complejo [ES] depende de V1 mientras que la velocidad de degradacin (Vd) depende de V2 + V3. Por lo tanto en el equilibrio tenemos: Vf = Vd es decir: V1 = V2 + V3 Sustituyendo sus valores nos queda: K1[E ES] [S] = K2[ES] + K3[ES] Dividiendo ambos miembros entre K1 y [ES] nos queda: K1[E ES] [S] (K2 + K3)[ES] ---------------------------- = -----------------------------K1[ES] K1[ES] Simplificando: [E ES] [S] (K2 + K3) --------------------- = ------------------ = KM constante de Michaelis [ES] K1 La constante de Michaelis Menten se utiliza como una medida de la afinidad entre la enzima y el sustrato, aunque no es propiamente la constante de afinidad. La constante de Michaelis Menten (KM) se define como la concentracin de sustrato cuando la reaccin adquiere la mitad de su velocidad mxima. Cuando esto sucede: [E ES] = [ES] Y por lo tanto, sustituyendo: KM = [S] EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO Si en una reaccin enzimtica se mantiene constante la concentracin de la enzima y todos los dems factores que pueden modificar la actividad, se observa experimentalmente que al aumentar la concentracin del sustrato, aumenta progresivamente la velocidad de la reaccin hasta llegar a un mximo (velocidad mxima) despus del cual ya no se afecta la velocidad aunque se trabaje a concentraciones ms altas de sustrato. En algunas enzimas se observa incluso una disminucin en la actividad si se aumenta demasiado la concentracin de sustrato. EXPERIMENTO 3 Prepare una serie de 8 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla: Tubo Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8 Sustrato (almidn 8 mg/mL) mL 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 7.5 7.5
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. Sol reguladora de fosfatos 0.02M pH = 7
7.0 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 0.0 0.5 Sol de enzima (amilasa) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 Mezcle bien los tubos e incube a 40C por 15 minutos Transcurrido este tiempo aada a todos los tubos, con objeto de detener la reaccin enzimtica, 1 mL del reactivo del cido 3,5 dinitrosaliclico; caliente por 10 minutos en bao mara a ebullicin para desarrollar color. Enfre y lea cada tubo en el espectrofotmetro a 540 nm empleando el tubo no. 8 como blanco. 1) Anote sus lecturas en la siguiente tabla:
tubo 1 2 3 4 5 6 7 [sustrato] mg/mL 0.5 1 2 3 4 5 7.5 Absorbancia
mL
1) Basndose en sus resultados, trace la grfica correspondiente: actividad contra concentracin de sustrato en mg 2) Determine el valor de KM para el sistema almidn/amilasa en estas condiciones. KM = __________ mg de almidn/mL EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA Durante mucho tiempo se pens que los catalizadores eran sustancias que actuaban por presencia debido a las concentraciones tan pequeas necesarias y a que podan recuperarse inalterados al final de la reaccin. Sin embargo, se sabe que la velocidad de reaccin de acuerdo a la Ley de Accin de Masas depende de su concentracin de tal manera que la velocidad es directamente proporcional a la concentracin de enzima, lo que se expresa como: V = K[E] As que la grfica que se obtiene al expresar la velocidad de reaccin en funcin de la concentracin de enzima es una recta con pendiente positiva.
EXPERIMENTO 4 Prepare una serie de 6 tubos siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla: Reactivo Tubo 1 2 3 4 5 6 Sustrato de almidn 8 mg/mL mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sol reguladora de fosfatos 0.02M pH = 7 mL 1 1 1 1 1 1
mL 5 4.9 4.8 4.6 4.2 3.4 Preincubar a 40C durante 5 minutos Sol enzima (amilasa) mL 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 Despus de mezclar el contenido de los tubos, se colocan a bao mara a 40C por 15 minutos. Pasado este tiempo aada a cada tubo 1 mL del reactivo de cido 3,5 dinitrosaliclico. Se colocan los tubos en bao mara a ebullicin por 10 minutos. Enfre y lea la intensidad del color como densidad ptica en el espectrofotmetro a 540 nm, empleando el tubo no. 1 como blanco. 1) Con sus resultados trace una grfica con los valores de Absorbancia en las ordenadas y la concentracin de enzima expresada en mg/mL en las abscisas, segn la siguiente tabla: Concentracin de enzima mg/mL 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 2) Interprete la grfica obtenida. Absorbancia
Agua
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8. GLCIDOS
os glcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehdicos o cetnicos reales o en potencia de alcoholes polivalentes que poseen en su molcula uno o ms carbonos asimtricos. Estos compuestos se encuentran presentes en todos los seres vivos, en cantidades variables, desempeando importantes funciones estructurales y energticas. Debe recordarse que todas las propiedades qumicas de los glcidos dependen de sus grupos funcionales, o sea, grupos alcohol y grupo carbonilo (aldehdico o cetnico). Los glcidos se clasifican, segn el nmero de compuestos hidrocarbonados simples que los constituyen, en 3 grupos; monosacridos, oligosacridos y polisacridos. Los monosacridos no se pueden desdoblar por hidrlisis en compuestos ms sencillos. A su vez se subdividen, segn el nmero de carbonos que contengan, en: triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, etc. Los oligosacridos, por hidrlisis, dan pocas molculas de monosacridos. En la naturaleza existen varios disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa etc.) y unos cuantos trisacridos, tetrasacridos y pentasacridos libres. Se pueden obtener por sntesis qumica en el laboratorio o por degradacin hidroltica de polisacridos. Los oligosacridos poseen propiedades fsicas similares a las de los monosacridos. Los polisacridos, por hidrlisis dan muchas molculas de monosacridos. Desde el punto de vista fisiolgico se dividen en dos grupos; polisacridos estructurales y polisacridos de reserva. Entre los primeros tenemos en vegetales: la celulosa, los cidos pcticos y las hemi celulosas. En animales los ms importantes son los llamados mucopolisacridos, tales como el cido hialurnico y el condroitin sulfato, abundantes en varios tejidos y lquidos como el cuerpo vtreo del ojo, el cordn umbilical, el lquido sinovial, tendones, cartlagos, etc. Entre los polisacridos nutrientes o de reserva los ms importantes son, en vegetales, los almidones e inulina y en animales, el glucgeno. PROPIEDADES FSICAS DE LOS GLCIDOS Los glcidos reciben este nombre debido a que la mayor parte de ellos se caracterizan por tener sabor dulce. Sin embargo, esta propiedad la presentan solamente los mono y oligosacridos, ya que los polisacridos son generalmente inspidos. Otras propiedades que nos permiten diferenciar glcidos de bajo peso molecular (monosacridos y oligosacridos) de los de elevado peso molecular (polisacridos), son su solubilidad en agua y su capacidad para cristalizar. ESTRUCTURA CRISTALINA EXPERIMENTO 1 Examine al microscopio los siguientes glcidos: glucosa, sacarosa, almidn y celulosa y haga los esquemas respectivos.
1) Cules de estos glcidos tienen estructura cristalina? Por qu? PROPIEDADES QUMICAS DE LOS GLCIDOS Las propiedades qumicas de los glcidos dependen de sus grupos funcionales. Todos los glcidos poseen en su molcula grupos alcohol y grupos carbonilo, ya sean aldehdicos o cetnicos. Sin embargo, en algunos glcidos estos grupos pueden estar bloqueados y por lo tanto, su reactividad qumica estar ausente. Una caracterstica qumica de los aldehdos y cetonas es su carcter reductor, todos los monosacridos u oligosacridos que tengan libre el grupo aldehdico o cetnico sern reductores, mientras que los polisacridos y oligosacridos que tengan bloqueados estos grupos sern no reductores. Todos los glcidos formados por varios azcares (oligo o polisacridos) se pueden hidrolizar por accin enzimtica o de cidos dando como producto final los monosacridos y liberando los grupos reductores bloqueados. Existen varias reacciones qumicas que se utilizan para la identificacin de los glcidos, algunas son generales y otras son especficas para determinar tipo o incluso especficas para cada azcar. Entre las ms utilizadas tenemos: FORMACIN DE OSAZONAS Esta reaccin es una de las de mayor utilidad para la identificacin de azcares por ser especfica para cada azcar. La dan positiva tanto los monosacridos como los disacridos reductores sirviendo para identificarlos el tiempo que tardan en formar la osazona correspondiente, la forma cristalina de ellas, la solubilidad en caliente o en fro y los puntos de fusin. EXPERIMENTO 2 Se colocan en un tubo de ensayo 0.1 g del carbohidrato problema que corresponda a su equipo, el cual encontrar en su material de la charola o bien ser proporcionado por su maestro, se agregan 0.2 g de clorhidrato de fenilhidracina, 0.3 g de acetato sdico cristalizado y 4 mL de agua, se agita y se tapa el tubo con un tapn de papel procurando que no quede muy cerrado y se coloca en bao mara hirviendo, agitando ocasionalmente y observando el tiempo que tardan en aparecer los precipitados y si lo hacen en fro o en caliente. La glucosa, fructosa y galactosa precipitan en caliente, pero la maltosa y la lactosa en fro por lo que despus de 20 minutos de calentamiento se deben retirar del fuego. 1) Observe al microscopio los cristales de la osazona preparada por usted y las preparadas por sus compaeros de grupo. 2) Haga un esquema de los cristales. 3) Por qu la glucosa, la manosa y la fructosa dan la misma osazona? 4) Escriba la reaccin que se efecta.
REACCIN DE MOLISCH UDRANSKY Es una reaccin general para todos los glcidos, ya que el cido sulfrico concentrado que contiene, hidroliza y deshidrata a los azcares obtenindose furfural o hidroximetil furfural como producto final. Estas sustancias son capaces de reaccionar con el alfa naftol formando un compuesto colorido (violeta). Esta prueba es una de las ms sensibles, la dan positiva soluciones de glucosa al 0.001%. Sin embargo, la reaccin no es especfica, ya que la dan positiva los aldehdos, las cetonas, y algunos cidos orgnicos tales como el frmico, oxlico, ctrico, etc. EXPERIMENTO 3 Coloque en una gradilla 6 tubos de ensayo, ponga en cada uno 3 mL de cada una de las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4 5 6 Solucin Formaldehd o Glucosa Fructosa Arabinosa Sacarosa Almidn Resultado: color violeta Clasificaci n
Aada a todos los tubos, 2 gotas de reactivo de Molisch (solucin de alfa naftol al 5% en alcohol). Mezcle bien. Posteriormente aada a todos los tubos, 1 mL de cido sulfrico concentrado, estratificando (inclinando el tubo y dejando resbalar el cido por las paredes). La reaccin es positiva si aparece en la interfase un anillo de color violeta. 1) Diga cual de estas soluciones da positiva la reaccin. 2) Se puede considerar como una reaccin til para diferenciar un glcido de otro? Por qu? 3) Qu utilidad puede tener la reaccin de MolischUdransky? 4) Escriba la reaccin que se efecta. REACCIN DE FEHLING La mayor parte de las pruebas para el anlisis cualitativo y cuantitativo de azcares se basan en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no sea especfica de ellos. Se sabe que los azcares reductores son capaces de reducir diversos iones metlicos como el cobre, bismuto, mercurio, plata, etc. , cuando se encuentran en solucin alcalina.
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Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los reactivos son estables, existe poca interferencia con otras sustancias, las reacciones son sensibles y puede usarse la misma reaccin para un anlisis cualitativo o cuantitativo. EXPERIMENTO 4 En 5 tubos de ensayo se colocan 2 mL de la solucin A y 2 mL de la solucin B del reactivo de Fehling, y a cada tubo se le agregan 3 gotas de cada uno de los siguientes azucares: Tubo 1 2 3 4 5 Solucin Glucosa Fructosa Arabinosa Sacarosa Almidn Resultado: Clasificacin rojo azul reductor no reductor
Se colocan los tubos en bao mara a ebullicin y se mantienen por 3 minutos, al cabo de los cuales se dejan enfriar (no deben enfriarse con agua fra) y se observan. El mecanismo de reaccin se lleva a cabo debido a que algunos compuestos orgnicos que contienen uno o ms grupos alcohlicos en su molcula, en este caso el tartrato de sodio, reaccionan en solucin alcalina con los hidrxidos metlicos, formando un complejo soluble, el cual se disocia muy poco, pero los iones que deja en libertad son suficientes para que produzcan las reacciones de coloracin. La formacin de este complejo es esencial para que se produzca un precipitado con la mayor parte de los metales pesados. 1) Qu azucares dan positiva la reaccin de Fehling? 2) Explique por que algunos azcares dan negativa la reaccin. 3) Mencione 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la reaccin de Fehling y no sean azcares. 4) Escriba la reaccin que se efecta. REACCIN DE BARFOED El reactivo de Barfoed es una solucin de acetato cprico en cido actico y, una vez ms, se determina la capacidad de los azcares para reducir el in cprico a cuproso (Cu2O). Esta reaccin sirve para diferenciar un monosacrido de un disacrido, ya que los primeros a los tres minutos reducen el reactivo y los disacridos necesitan mas tiempo para que se lleve a cabo la reaccin de reduccin, mas o menos unos 15 minutos. EXPERIMENTO 5
Se colocan 4 tubos de ensayo y a cada uno se le agregan 3 mL del reactivo de Barfoed y 1 mL de una de las siguientes soluciones de glcidos:
Tubo 1 2 3 4
Solucin Glucosa Arabinosa Lactosa Maltosa
Resultado minutos
Clasificacin
monosacrido disacrido
Se colocan en bao mara observando y anotando el tiempo que tarda en aparecer el precipitado rojo de xido cuproso. 1.) Escriba la reaccin que se efecta.
REACCIN DE BIAL Esta reaccin sirve para diferenciar pentosas de hexosas, este reactivo consiste en una solucin de orcinol (5-metilbenceno-1,3-diol) en cido clorhdrico (HCl) concentrado con una pequesima cantidad de cloruro frrico (FeCl3). El fundamento de esta reaccin, igual que la reaccin de Molisch, la de Seliwanoff y otras, se basa en la produccin de furfural o hidroximetil furfural cuando se calienta con cidos concentrados y la reaccin de estos con otras sustancias dando productos coloridos, en este caso las pentosas dan color azul y las hexosas dan color amarillo o caf. EXPERIMENTO 6 En tubos de ensayo se colocan 3 mL del reactivo de Bial PRECAUCIN! Aada 0.2 mL de las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 Solucin Glucosa Arabinosa Agua Resultado
Azul amarillo
Clasificacin
pentosa hexosa
Caliente los tubos ligeramente sobre la llama del mechero, hasta que se inicie la ebullicin, retire de la flama, diluya cada tubo con 10 mL de agua destilada y agregue 2 mL de butanol. Agite los tubos, deje reposar y haga su observacin. 1) Explique las diferencias observadas. REACCIN DE SELIWANOFF
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Esta reaccin sirve para diferenciar aldosas de cetosas. Las cetosas reaccionan rpidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El reactivo es una solucin de resorcinol (Benceno-1,3 diol) 0.05% en HCl 1:3 recin preparado. Este compuesto es el que se condensa con el furfural o sus derivados dando productos coloridos. EXPERIMENTO 7 En 3 tubos de ensayo se coloca 1 mL de los azcares que se mencionan abajo y agregue a cada tubo 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff y caliente en bao a ebullicin exactamente 60 segundos. Anote sus resultados y contine calentando observando el cambio de color a intervalos de 1 minuto durante 5 minutos. Tubo 1 2 3 Solucin Glucosa Fructosa Agua
Resultado minutos
- de 5
+ de 5
Clasificacin cetosa Aldosa
Las cetosas dan una coloracin rojo fuego y las aldosas la dan muy dbil y muy lentamente 1) Observ alguna diferencia en las soluciones? 2) Escriba la reaccin que se efecta. REACCIN DEL LUGOL El reactivo de lugol es una solucin de yodo en yoduro de potasio. Este reactivo reacciona con algunos polisacridos como los almidones, glucgeno y ciertas dextrinas formando un complejo de inclusin termolbil que se caracteriza por ser colorido, dando un color diferente segn las ramificaciones que presenta la molcula. EXPERIMENTO 8 En un tubo de ensayo se colocan 2 mL de solucin de almidn, en otro se colocan 2 mL de glucgeno. Adales una gota de lugol y anote el color producido en cada uno de los tubos. El tubo que contiene el almidn se calienta a ebullicin y se deja enfriar nuevamente observando lo que ocurre con la coloracin. 1) Por qu el complejo almidn yodo es termolbil? 1) Se puede considerar la reaccin del Lugol caracterstica para cualquier polisacrido?
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9. OXIDACIONES BIOLGICAS
l ser vivo utiliza y transforma la energa del medio ambiente. A estos procesos qumicos y fsicos se les denominaba respiracin. Sin embargo para evitar ambigedades con el proceso de entrada y salida de aire a y desde los pulmones, se aplica el concepto bioqumico de bioenergtica, incluyendo este termino los procesos fotosintticos. Todos los procesos qumicos que constituyen la bioenergtica conducen a la oxidacin de sustancias denominadas metabolitos hasta CO2 y H2O. Por regla general todas las reacciones de oxidacin son exergnicas, es decir, liberan energa y lo hacen en forma violenta como cuando se quema un pedazo de madera. Sin embargo un organismo viviente debe poseer un mecanismo que le permita capturar y almacenar esta energa liberada de forma gradual y controlada a temperaturas corporales. Una de las maneras en que se aprovecha involucra la participacin de enzimas especficas capaces de catalizar la conversin del ADP en ATP (reaccin endergnica).
REACCIONES DE OXIDO REDUCCIN Un compuesto qumico puede oxidarse de diferentes maneras. La oxidacin tpica es aquella en la cual el oxgeno se une a un compuesto (oxigenacin). Otra forma de oxidacin es la prdida de hidrgeno (deshidrogenacin). Tambin se oxida un compuesto cuando pierde electrones o cuando gana valencias positivas. Ejemplos de oxidaciones Oxigenacin 2Cu + O2 2CuO Deshidrogenacin H2S S0 + H2 Prdida de electrones o -1e ++ ganancia de valencia positiva Fe Fe+++ Siempre que se efecta una oxidacin, simultneamente se efecta una reduccin. Es decir, cuando un compuesto se oxida, otro forzosamente debe reducirse. Como son fenmenos que ocurren simultneamente se denominan fenmenos de xido reduccin o reacciones REDOX.
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OXIDACIN POR PRDIDA DE ELECTRONES EXPERIMENTO 1 Coloque en un matraz provisto de tapn con vlvula de BUNSEN, 0.5 g de fibra de hierro (Fe) y 5 mL de H2SO4 al 10%. Caliente a ebullicin y observe la disolucin parcial del Fe. Deje enfriar y diluya el sulfato ferroso (FeSO4) obtenido, con 50 mL de agua destilada. La vlvula deja escapar el hidrgeno, pero impide la entrada de aire evitando as la oxidacin de la sal ferrosa formada mediante la siguiente reaccin: Fe + H2SO4 FeSO4 + H2 Para comprobar la presencia de sales ferrosas Se coloca en una cpsula de porcelana 1 mL de solucin de sulfato ferroso y unas gotas de ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]). La obtencin de una coloracin o precipitado de color azul indicar la presencia de sales ferrosas. En otra cpsula de porcelana coloque 1 mL de la solucin de sulfato ferroso y unas gotas de sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5%. La aparicin de un color rojo intenso indicar la presencia de sales frricas. A continuacin se oxidar la sal ferrosa a sal frrica, Para lo cual se colocan en un matraz erlenmeyer 10 mL de la solucin de sulfato ferroso y 3 mL de H2SO4 al 10%, caliente a ebullicin y, en caliente, agregue gota a gota una solucin de permanganato de potasio (KMnO4) 0.1M hasta que persista un color rosa plido. Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal frrica, repita las reacciones con ferricianuro de potasio K3[Fe(CN)6] al 0.5% y sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5%. 1) Resuma sus resultados (color observado) en la siguiente tabla: Solucin Sulfato ferroso Sulfato frrico K3[Fe(CN)6] KSCN
2) Escriba las reacciones de identificacin que se han efectuado en cada caso. 3) Si el KMnO4 es capaz de oxidar al sulfato ferroso, Qu compuesto se reduce?. 4) Escriba la reaccin de oxido reduccin que se ha efectuado.
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OXIDACIN POR DESHIDROGENACIN EXPERIMENTO 2 La accin de una sustancia reductora como el hidrosulfito de sodio (NaHSO3), forma leucobases (incoloras) cuando acta sobre colorantes oxidados como el azul de metileno (indicador de oxido reduccin). El proceso inverso (oxidacin por prdida de hidrgeno) se puede realizar en diferentes condiciones y determinar el tiempo de reaccin. Prepare una serie de 5 tubos de ensayo y numrelos. Aada a cada uno 5 mL de una solucin diluida de azul de metileno. A todos los tubos agrgueles gota a gota una solucin recin preparada de hidrosulfito de sodio y cuente el nmero de gotas necesario para decolorar completamente la solucin de azul de metileno. El tubo 1 quedar como testigo en reposo, hasta que recupere su color. El tubo 2 se colocar en bao mara a ebullicin, hasta que recupere su color. El tubo 3 se agitar enrgicamente a temperatura ambiente, hasta que recupere su color. Debe anotarse, de los tubos 1 a 3, el tiempo necesario para recuperar el color azul Al tubo nmero 4 sin agitarlo y a temperatura ambiente, se le agregarn gotas de perxido de hidrgeno (H2O2) al 0.4%. Y finalmente al tubo nmero 5 se le agregarn gotas de cloruro frrico (FeCl3) al 1% Debe anotarse, de los tubos 4 y 5 el nmero de gotas necesario para reoxidar al azul de metileno. 1) Resuma sus resultados en la siguiente tabla Tubo 1 testigo
Tiempo de reoxidacin del azul de metileno o nmero de gotas 2 calor 3 temp. amb. 4 H2O2 5 FeCl3
2) Escriba la reaccin qumica que se ha efectuado en cada caso. REACCIONES DE OXIDO REDUCCIN BIOLGICAS La rapidez y la suavidad con que se realizan las oxidaciones biolgicas, llevndose a cabo en medio acuoso, a pH generalmente neutro y a bajas temperaturas, son caractersticas de procesos catalizados por enzimas. Warburg fue uno de los primeros investigadores que trat de explicar las oxidaciones biolgicas suponiendo una activacin del oxgeno. Actualmente se sabe
que en los tejidos existe un sistema de enzimas que contienen hierro, mediante el cual el oxgeno molecular se activa y acta como un agente oxidante. Wieland Consideraba que el proceso bsico en la oxidacin de los metabolitos es la activacin del hidrgeno por la accin de enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales transportan el hidrgeno a diferentes aceptores que pueden ser el oxgeno u otros agentes oxidantes. Szent Gyrgyi concili las dos teoras al suponer que es necesaria la activacin del hidrgeno y tambin la del oxgeno. Keilin supuso que interviene como eslabn intermediario el citocromo. Sin embargo, las oxidaciones biolgicas no son tan sencillas, pues se ha comprobado que en la oxidacin de cada metabolito interviene una gran cantidad de aceptores de hidrgeno. La glucosa es el ms comn de los metabolitos debido a que es una molcula altamente reducida. Cuando se oxida y pierde sus hidrgenos, la liberacin de energa de oxidacin no se realiza en forma brusca, sino que intervienen varios transportadores de hidrgeno y se inicia por la accin de una deshidrogenasa especfica que no reacciona directamente con el oxgeno sino que requiere de intermediarios como el NAD+, flavoprotenas y citocromos. DESHIDROGENASA SUCCNICA (DHS) La deshidrogenasa succnica cataliza la siguiente reaccin:
OBTENCIN DE LA FRACCIN MITOCONDRIAL DEL HGADO DE RATN EXPERIMENTO 3 Cuando el tejido heptico se dispersa en soluciones isotnicas, el ncleo y las mitocondrias permanecen relativamente inalterados y pueden separarse con facilidad por centrifugacin diferencial. Al ratn recin sacrificado se le extrae el hgado y se mantiene en hielo hasta el momento de utilizarlo. Pese el hgado obtenido y fraccinelo finamente con las tijeras y prepare cuidadosamente un homogeneizado en un mortero previamente enfriado, aadiendo 6 volmenes de cloruro de potasio (KCl) 0.15M fro, por cada gramo de hgado. Utilizando la centrifuga automtica refrigerada, centrifugue el homogeneizado en fro a 500 rpm por 15 minutos Separe el sobrenadante y centrifguelo a 3000 rpm por 15 minutos
Separe este segundo sobrenadante y consrvelo en fro anotando en la etiqueta SOBRENADANTE DE HGADO. El residuo se suspende en 6 mL de KCl 0.15M y se conserva tambin en fro anotando en la etiqueta correspondiente SUSPENSIN DE HGADO. reactivos
Prepare una serie de tubos de ensayo, numrelos y aada los correspondientes de acuerdo con las instrucciones de la siguiente tabla. Tubo 1 Reactivo Azul de metileno 0.002M 2 3 4 5 0.3 0.5 --1.0 --0.5 6 0.3 0.5 0.5 0.5 --0.5
m 0.3 0.3 0.3 0.3 l Succinato de sodio 0.1M m --- 0.5 0.5 --l Malonato de sodio 0.1M --- 0.5 --m --l Agua destilada m 1.5 1.0 0.5 1.5 l Suspensin de hgado m 0.5 0.5 0.5 --l Sobrenadante de hgado m ------- 0.5 l Mezclar bien el contenido de cada tubo Vaselina m 0.5 0.5 0.5 0.5 l Incubar por 30 minutos a 37C 40C
0.5
0.5
Una vez agregada la vaselina no agitar el contenido de los tubos e incubar en bao mara a 37C y hacer lecturas en los tiempos sealados, anotando en el siguiente cuadro el grado de coloracin, con cruces (de una a tres). 1) Resultados Tubo 1 Tiempo 0 min. 10 min. 20 min. 30 min. 2 3 4 5 6
2) En cual de las fracciones de hgado deben encontrarse las mitocondrias y por qu? 3) Describa como acta el malonato de sodio en esta reaccin.
4) Explique sus resultados sobre la base del anlisis del contenido de cada tubo. LOCALIZACIN Y DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA CITOCROMO - OXIDASA La citocromo oxidasa es la ltima enzima de la cadena respiratoria y es la responsable de la activacin del oxgeno para oxidar a los citocromos. Tanto los citocromos como la citocromo oxidasa son metaloprotenas (porfirinas). La citocromo oxidasa se caracteriza por su elevada sensibilidad al cianuro (CN) y al monxido de carbono (CO). En el ao de 1885 Ehrlich report la reaccin del indofenol. Observ que inyectando alfa naftol y dimetil-para-fenilendiamina en animales se formaba en los tejidos una sustancia azul llamada azul de indofenol. La enzima se denomin indofenol-oxidasa, pero posteriormente se ha podido comprobar que esta enzima slo oxida al citocromo c, el cual a su vez oxida al indofenol; por lo cual ahora se le conoce como citocromo oxidasa EXPERIMENTO 4 Prepare una serie de 10 tubos de ensayo y numrelos. Aada a cada uno los reactivos de acuerdo a las instrucciones de la tabla siguiente: Tubo m l Dimetil-para-fenilendiamina al 0.15% m l Agua destilada m l KCN al 0.01% NO PIPETEAR m 0.5 mL = 10 gotas l Sobrenadante de hgado m l Suspensin de hgado m l
Alfa naftol al 0.15% en etanol al 10%
Reactivo
1 0. 5 0. 5 1. 0
2 --0. 5 1. 5
3 0. 5 --1. 5 --1. 0 ---
4 0. 5 0. 5 2. 0 -------
-- --1. 1. 0 0 -- ---
5 0. 5 0. 5 0. 5 0. 5 1. 0 ---
6 0. 5 0. 5 1. 0 ----1. 0
7 --0. 5 1. 5 ----1. 0
8 0. 5 --1. 5 ----1. 0
9 0. 5 0. 5 2. 0 -------
10 0. 5 0. 5 0. 5 0. 5 --1. 0
Agite los tubos ocasionalmente, observe la aparicin del azul de indofenol y anote sus resultados en la siguiente tabla: Tubo 5 6 7
Tiempo min. 1 0 10 20
10
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30 1) Escriba la reaccin de formacin del azul de indofenol. 2) Explique por qu no se us vaselina en este experimento. 3) Explique sus resultados sobre la base del anlisis del contenido de cada tubo
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10. LPIDOS
ste es un conjunto heterogneo de molculas orgnicas cuyas propiedades comunes son su insolubilidad en agua y solubilidad en solventes no polares como el benceno, cloroformo, ter, etc. Por lo que este grupo incluye sustancias de muy diversa estructura. Suelen ser molculas de nmero relativamente alto de tomos de carbono e hidrgeno y bajo en tomos de oxgeno; ciertos lpidos tambin poseen tomos de fsforo, nitrgeno y azufre en su molcula. Cualquier clasificacin presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede producir falsas interpretaciones ya que idntica terminologa ha sido empleada por diferentes autores para denominar a distintos grupos de lpidos. Los lpidos ms recientemente estudiados, (prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc.), que hasta hace poco se consideraban de poco inters han demostrado tener propiedades especiales como actuar a dosis muy bajas, intervenir en procesos como la coagulacin, inflamacin tisular, vasodilatacion, dolor, etc. Las funciones de los lpidos son muy variadas y las ms aceptadas actualmente son las siguientes: 1. Funcin estructural, principalmente en las membranas celulares. 2. Actan como material energtico y de reserva. 3. Intervienen en el transporte de compuestos energticamente activos. 4. Componentes protectores de la pared celular de ciertas bacterias, plantas, insectos y vertebrados. 5. Sustancias de gran actividad biolgica como vitaminas y hormonas. Las cuales se consideran como verdaderos reguladores metablicos. 6. Actan como aislante trmico y proteccin alrededor de determinados rganos. Para estudiar los lpidos se llevan a cabo diferentes reacciones como: REACCIN DE HANUS El grado de insaturacin de los cidos grasos que forman parte de un lpido es uno de los factores determinantes de sus propiedades fsicas, qumicas y fisiolgicas. Se ha observado que aparecen ms dobles enlaces en los triacilgliceroles de almacenamiento y en los lpidos estructurales cuando la temperatura ambiente disminuye. Los dobles enlaces disminuyen el punto de fusin por lo que se cree que sea un mecanismo del organismo para impedir la cristalizacin de los lpidos en los tejidos. El reactivo de Hanus es una solucin de yodo y bromo que nos permite determinar el grado de insaturacin de un lpido midiendo la capacidad que tiene para fijar halgenos en su molcula. EXPERIMENTO 1 Coloque en tubos de ensayo limpios y secos 6 mL de soluciones clorofrmicas al 10% de aceite de algodn, aceite de crtamo y monoestearilglicerol. Aada a cada tubo 5 gotas del reactivo de Hanus y agite vigorosamente.
Anote cada 30 minutos el grado de decoloracin de cada tubo protegindolo de la luz. Anote sus resultados (por medio de cruces de XXX a X o cero) en la tabla: Lpido
Aceite de algodn Aceite de Crtamo Monoestearilglicerol Aceite de ricino
Tiempo minutos 30 60 90 120
EXTRACCIN DE LPIDOS DE CEREBRO EXPERIMENTO 2 Pese 5 g de cerebro y tritrelos perfectamente en un mortero con 20 mL de una mezcla 200:100:1 de cloroformo - metanol cido clorhdrico por 10 minutos. Una vez obtenido el homogeneizado agregue 2 mL de HCl 1N, mezcle y centrifugue a 2000 rpm por 10 minutos. Separe el paquete celular, la fase clorofrmica y la metanlica. Deseche el sedimento. Se obtienen dos fases: Metanlica, situada en la parte superior del centrifugado, de color transparente, que servir para la identificacin de cerebrsidos. Clorofrmica, ubicada en la parte inferior, de color pardo rojizo que se usar para la identificacin del colesterol, la separacin cromatogrfica de fosfolpidos y la formacin de membranas. PM del metanol (CH3OH) = 32, del cloroformo (CHCl3)=119.4 IDENTIFICACIN DE FOSFOLPIDOS DE CEREBRO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Como una aplicacin del fenmeno de adsorcin, se desarrollar la tcnica de cromatografa en placa fina para separar los diferentes fosfolpidos extrados del cerebro. EXPERIMENTO 3 Diluya 1:1 con cloroformo (CHCl3), un volumen pequeo (0.5 o 1 ml) del extracto clorofrmico obtenido en el experimento no. 2. Utilizando una pipeta Pasteur aplique una gota de esta dilucin en tres puntos equidistantes en una cromatoplaca previamente preparada, aproximadamente a 2 cm de altura de la base. Permita que el cloroformo se evapore y entonces introduzca la placa en una cubeta de vidrio que contenga como solvente de elucin, una mezcla de cloroformo metanol cido actico agua (65:25:8:4).
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Deje desarrollar el cromatograma hasta el frente del solvente ya marcado; saque la placa de la cubeta y djela secar.
En esta forma se tendrn 3 cromatogramas idnticos en la misma placa, los cuales se van a revelar con diferentes reactivos. Esto se puede hacer cubriendo con una placa de vidrio los cromatogramas que no se deseen revelar. El cromatograma se revelar por separado con Yodo y con ninhidrina que pondr de manifiesto a los fosfo aminolpidos. Esta reacccion se lleva a cabo al calentarse a 100C por 10 minutos. REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE LPIDOS IDENTIFICACIN DE CEREBRSIDOS EXPERIMENTO 4 Utilizando 1 mL del extracto metanlico obtenido en la extraccin de lpidos de cerebro, trate de demostrar la presencia de cerebrsidos utilizando la reaccin de MolischUdransky cuya tcnica y fundamento ya han sido descritos anteriormente. REACCIN DE LA ACROLENA Una de las reacciones ms usadas para la identificacin de acilglicridos es la formacin de acrolena o aldehdo acrlico, el cual se puede obtener por deshidratacin del glicerol o de cualquier glicrido y se reconoce fcilmente por su fuerte olor acre caracterstico. EXPERIMENTO 5 Coloque en dos tubos de ensayo secos, un poco de bisulfato de potasio (KHSO4) y aada de 3 a 5 gotas de glicerina en uno de los tubos y en el otro 5 gotas de aceite de algodn, crtamo o girasol. Caliente cuidadosamente y huela los vapores indirectamente. PRECAUCIN! 1) Se puede considerar esta reaccin general para cualquier lpido? Por qu? 2) Escriba la reaccin que se ha efectuado. REACCIN DE LIEBERMANN BURCHARDS El anhdrido actico se puede condensar con los grupos OH en posicin 3 de los esteroles como en el colesterol y dar los correspondientes steres. Si el esterol tiene un doble enlace en posicin 5, se produce adems una epimerizacin y una deshidratacin en presencia de cido sulfrico (H2SO4) concentrado, dando como resultado una serie de compuestos de estructura desconocida que se caracterizan por tener colores que van del rojo al azul y del azul al verde. Esta reaccin es por lo tanto especfica para todos los esteroles que contengan un OH en posicin 3 y un doble enlace en posicin 5.
EXPERIMENTO 6 Prepare 2 tubos de ensayo. En el tubo no. 1 coloque 3 mL de solucin clorofrmica de colesterol puro y en el tubo no. 2, coloque 3 mL de solucin clorofrmica de colesterol obtenido en la extraccin de lpidos de cerebro en el experimento 2. Aada a los 2 tubos, 1 mL de anhdrido actico y mezcle bien, finalmente aada lentamente, resbalndolo por las paredes del tubo, 1 mL de cido sulfrico (H2SO4) concentrado. 1) Observe y describa los cambios de coloracin que se producen. PERMEABILIDAD DE LA BICAPA LIPDICA En este captulo de lpidos no podemos dejar de mencionar a las membranas ya que hacen posible la existencia de organismos complejos porque separan las clulas en el interior de los tejidos y los organelos celulares dentro de las clulas, formando compartimientos con propiedades fisicoqumicas diferentes, lo que permite una diferente organizacin; y cada compartimiento se vuelve una parte individual de un conjunto ms complejo. Se ha comprobado que las membranas son complejos lipoproticos que contienen de 60% a 75% de protena y de 25% a 40% de lpidos. En este experimento usaremos monocapas lipdicas como modelos de membrana. Al estratificar butanol sobre agua y agregar un lpido, ste se situar en la interfase, orientandose la parte polar lipdica a la fase acuosa, y la parte hidrofbica a la fase orgnica. Si ahora se coloca un colorante se puede observar la difusin pasiva a travs de la membrana. EXPERIMENTO 7 Preparar 4 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla colocando las soluciones con mucho cuidado resbalando por las paredes del tubo para estratificar.
TUBO 2 3 4 Agua destilada ml 5 5 5 Azul de metileno mas monoestearato de glicerilo en butanol ml -- -- -Azul de metileno mas fosfolpidos en butanol * ml -2 -- -Azul de metileno mas colesterol en butanol ml -- -2 -Azul de metileno en butanol ml -- -- -2 * 2 mL del extracto clorofrmico obtenido en el experimento 2 se evaporan a sequedad (cuidando que no se queme), al residuo se le re disuelve con 2 mL de azul de metileno en butanol y se agrega este contenido al tubo no. 2 de la serie. 1 5 2
Reactivo
Deje los tubos en reposo procurando moverlos lo menos posible y haga observaciones a las 2, 4, y 24 horas. 1) Observ el paso del colorante en todos los tubos?
2) Explique a qu se debe esa diferencia.
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11. CIDOS NUCLICOS
l control estricto y coordinado de todos los procesos vitales depende de protenas especficas, fundamentalmente enzimas. Estas dirigen la bioenergtica, el transporte a travs de membranas, la formacin de nuevas clulas, la diferenciacin celular y la creacin de nuevos seres. Sin embargo, las molculas que poseen la informacin necesaria para la biosntesis de protenas son los cidos nuclicos: ribonuclico (RNA) y desoxirribonuclico (DNA) Adems, algunos RNA pueden funcionar como catalizadores. En 1871 Friedrich Miescher logr aislar del ncleo celular una sustancia que llam nuclena, la cual debido a su carcter cido se denomin posteriormente cido nuclico. El DNA se encuentra en el ncleo y sin abandonarlo, puede transmitir su informacin por medio del cido ribonuclico mensajero (RNAm) hasta el ribosoma, constituido por el cido ribonuclico ribosomal (RNAr), al cual es transportado el material para la sntesis de protenas por medio del cido ribonuclico de transferencia (RNAt). RNAm tiene un peso molecular de 300,000. El RNAr constituye el ribosoma y su peso molecular es de 2,000,000. El RNAt tiene un peso molecular de 25,000 a 30,000, mientras que el DNA es una de las biomolculas ms grandes que se conocen hasta ahora y su peso molecular va de 1,000,000 a 1,000,000,000 (uno a mil millones). Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con protenas fuertemente bsicas (histonas o protaminas) formando las llamadas nucleoprotenas. Los cidos nuclicos estn constituidos por bases pricas, bases pirimdicas, pentosa y cido fosfrico. El DNA tiene como bases pricas adenina y guanina, como bases pirimdicas, citosina y timina, como pentosa la 2-desoxirribosa y cido fosfrico H3PO4. Los cidos ribonuclicos tienen como bases pricas: adenina y guanina y como bases pirimdicas: citosina y uracilo, como pentosa la D ribosa y H3PO4.
Los cidos nuclicos son macromolculas formadas por la unin de varios nucletidos. Un nucletido se puede considerar como un ster fosfrico de un nuclesido, que es la unin de una base prica o pirimdica con una pentosa. Los mononucletidos se unen entre s por medio de un enlace fosfodiester 3- 5, formando los polinucletidos. OBTENCIN DEL DNA DE BAZO Cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las clulas o tejidos que se van a utilizar como materia prima. En el caso del DNA esta seleccin es en especial importante porque el contenido de DNA es pequeo en la mayor parte de las clulas. La clula ideal ser aquella que tenga una relacin ncleo/citoplasma
alta, como en los linfocitos y clulas del tumor asctico de Ehrlich. Sin embargo, no es fcil obtener este tipo de clulas por lo que frecuentemente se usan rganos tpicamente linfoides como el timo y el bazo. El primer paso en la extraccin del DNA es la homogeneizacin del tejido. Este paso puede degradar en parte la molcula del DNA si no se toman las precauciones necesarias, la solucin reguladora es de citrato 0.01M y NaCl 0.14M, a pH de 7.2 a 7.4; la fuerza inica de esta solucin hace insoluble a la desoxirribonucleoprotena. Si se centrifuga este homogeneizado, en el residuo quedarn los restos celulares y las desoxirribonucleoprotenas insolubles. En el sobrenadante se encuentran compuestos solubles como la mayor parte de los cidos ribonuclicos. Al homogeneizar el tejido se liberan las enzimas de los lisosomas, entre ellas la DNAasa, la cual hidroliza el DNA. Se sabe que el Mg++ es indispensable para la actividad de esta enzima; si en la solucin existe citrato, ste se une al Mg++ e impide la accin de la DNAasa. Otra forma de evitar la accin hidroltica de la enzima es trabajar a temperaturas bajas (0C a 2C). El siguiente paso en la purificacin est basado en que las desoxirribonucleoprotenas y el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, mientras que la mayor parte de las protenas precipitan en estas condiciones. Si el residuo se suspende en solucin de NaCl 2.6M y se centrifuga, el residuo insoluble estar formado fundamentalmente por protenas, mientras que el DNA permanecer en solucin. Este DNA se puede precipitar selectivamente por la adicin selectiva de 2 volmenes de alcohol etlico al 95% formndose un precipitado blanco fibroso, el cual se puede recoger por rotacin de un agitador de vidrio con pequeos salientes. EXPERIMENTO 1 La muestra de bazo se coloca en un mortero, previamente enfriado y se secciona lo ms finamente posible con una tijera. Se colocan 450 mL de la solucin reguladora de citrato 0.01M NaCl 0.14M, a pH de 7.2 fra, en una licuadora cuyo vaso haya sido previamente enfriado. Se hace funcionar la licuadora a baja velocidad y se van aadiendo los trozos de bazo de todos los equipos, esperando a que se homogeneice completamente el primero antes de aadir el segundo y as sucesivamente. Una vez terminada la adicin, contine homogeneizando por 30 60 segundos ms. Utilizando la centrifuga automtica refrigerada, se coloca el homogeneizado en tubos de centrfuga apropiados teniendo cuidado de tarar perfectamente los tubos opuestos. PRECAUCIN! (CONSULTE A SU MAESTRO). Se centrifuga por 15 minutos a 5 000 rpm. El sobrenadante se desecha. El residuo insoluble se lava en el mismo tubo con 15 mL de citrato 0.01M NaCl 0.14M, pH 7.2, agitando hasta volver a resuspender con ayuda de una varilla de vidrio, si es necesario.
Se vuelve a centrifugar a 5 000 rpm por 5 minutos y el sobrenadante se desecha. Al residuo insoluble que contiene el DNA y residuos celulares se le aaden 15 mL de NaCl 2.6M fro y se homogeneiza por agitacin. El cido desoxirribonuclico es soluble en esta solucin mientras que la mayor parte de las protenas son insolubles. Centrifugue a 8 000 rpm por 30 minutos. El lquido sobrenadante contiene el DNA en solucin y el sedimento, que contiene restos celulares y protenas insolubles, se desecha. La solucin salina sobrenadante se coloca en un vaso de precipitados y se aaden lentamente dos volmenes de alcohol etlico al 95%, procurando que la fase alcohlica quede en la parte superior. Se deber observar la formacin de un precipitado blanco, denso, en la interfase. Utilizando un agitador con pequeos salientes, agite esta mezcla lentamente procurando enrollar sobre el agitador las fibras del DNA precipitadas. 1) Explique por qu se utiliz bazo como materia prima y no otro rgano cualquiera. 2) Sera conveniente utilizar solucin reguladora de fosfatos para la extraccin del DNA? Por qu? 3) Por qu es conveniente trabajar durante toda la extraccin a baja temperatura? CARACTERIZACIN Y ANLISIS CUANTITATIVO DEL DNA
Existen varios mtodos para identificar y cuantificar a los cidos nuclicos. El mtodo ms utilizado es el espectrofotomtrico, el cual est basado en que tanto el DNA como el RNA absorben a 260 nm. La absorbancia es proporcional a la concentracin del cido, por lo tanto, el medir la absorbancia es un mtodo cuantitativo muy sensible y sencillo, pero no distingue entre DNA y RNA. Es de gran utilidad cuando las muestras estn puras. Una reaccin muy utilizada para identificar y cuantificar DNA es la llamada reaccin de Dische, la cual est basada en que el reactivo de difenilamina reacciona especficamente con el DNA dando una coloracin azul cuya intensidad es proporcional a la concentracin de DNA. En realidad, la especificidad de esta reaccin no es absoluta, ya que la difenilamina es un reactivo especfico para las 2desoxipentosas en general, pero en condiciones normales la cantidad de azcares capaces de interferir es despreciable. EXPERIMENTO 2 Prepare una serie de 6 tubos de ensayo y numrelos del 1 al 6. Mida con una pipeta cuidadosamente 2 mL de solucin patrn. Esta solucin tiene una concentracin de DNA de 1 mg/mL. Colquela en el tubo no.1. Aada a los tubos 2, 3, 4 y 5, 2 mL de agua destilada. Agregue al tubo no.2, 2 mL de la solucin patrn; mezcle perfectamente,
transfiera 2 mL de esta mezcla al tubo no. 3; se mezcla el contenido y se transfieren 2 mL al tubo no. 4. De este tubo se toman 2 mL y se descartan. El tubo no. 5 ser el blanco y en el tubo 6 se colocan 2 mL de la solucin de DNA problema. Aada a todos los tubos 4 mL de reactivo de Dische y agite vigorosamente coloque los tubos en bao mara a ebullicin por 10 minutos. Inmediatamente despus coloque los tubos en bao mara de hielo agua durante 5 minutos con objeto de enfriar su contenido rpidamente.
Los tubos con DNA desarrollan una coloracin azul caracterstica con un mximo de absorcin a 600 nm. La intensidad de la coloracin se puede determinar cuantitativamente en el espectrofotmetro. Determine la densidad ptica a 600 nm de todos los tubos utilizando el tubo no. 5 como blanco. Resuma sus resultados en la siguiente tabla:
Tubo 1 2 3 4 5 6 [DNA] mg/mL 1 0.5 0.25 0.125 0 Problema Densidad ptica
1) Con los datos de la tabla construya la curva tipo (absorbancia contra mg de DNA) 2) Interpolando la absorbancia del tubo no. 6 encuentre la concentracin de DNA (mg/mL) y calcule la cantidad total de DNA en su problema. CARACTERIZACIN Y ANLISIS CUANTITATIVO DEL RNA El RNA puede ser cuantificado por espectrofotometra, como ya se explic. Sin embargo, la reaccin ms utilizada para identificar y cuantificar el RNA es la reaccin del orcinol, (5-metilbenceno-1,2 diol), la cual se caracteriza por dar una coloracin verde en presencia de cualquier RNA. La reaccin del orcinol es una modificacin de la reaccin de Bial para pentosas y es, por tanto, poco especfica. Sin embargo, cuando se trata de muestras razonablemente puras, esta reaccin puede ser utilizada incluso para anlisis cuantitativos. EXPERIMENTO 3 Prepare una serie de seis tubos y numrelos del 1 al 6. Aada a los tubos 2, 3, 4 y 5, 3 mL de agua destilada, al tubo no.1, 3 mL de la solucin patrn de RNA que contendr 0.300 mg/mL. Aada 3 mL de la misma solucin patrn al tubo no. 2, mezcle bien el contenido transfiera 3 mL de esta solucin al tubo no. 3, mezcle el contenido
y aada 3 mL de esta solucin al tubo no. 4, mezcle bien el contenido y tome 3 mL de esta solucin y deschelos. El tubo no. 5 ser considerado como blanco y al tubo no. 6 se le aaden 3 mL de solucin problema. Aada a todos los tubos 6 mL del reactivo de orcinol cido y 0.4 mL del reactivo de orcinol alcohol. Se mezcla el contenido y se colocan en bao mara a ebullicin por 20 minutos. Una vez fros se lee la densidad ptica de cada tubo a 660 nm. Anote sus resultados en la siguiente tabla:
Tubo 1 2 3 4 5 6 [RNA] mg/mL 0.3 0.15 0.075 0.0375 0 Problema Densidad ptica
1) Con los datos de la tabla anterior trace la curva tipo, absorbancia contra mg de RNA. 2) Interpole los valores de absorbancia de su problema y determine la concentracin real en mg/mL. DETERMINACIN DEL FOSFATO TOTAL EXPERIMENTO 4 Para efectuar la determinacin colorimtrica con el molibdato de amonio se emplear una muestra que ha sido previamente digerida.Prepare una serie de seis tubos como se indica en la siguiente tabla: Tubo Reactivo 1 2 3 4 5 6
Buffer de acetato 0.1M pH 4.0 mL 7 7 7 7 Reactivo molibdato al 2.5% mL 0.5 0.5 0.5 0.5 Solucin de vitamina C al 1% reciente mL 0.5 0.5 0.5 0.5 Agua destilada mL 2 Solucin tipo 1 M/mL 2 Solucin tipo 2.5 M/mL 2 Solucin tipo 5 M/mL 2 Problema DNA Problema 7 0.5 0.5 7 0.5 0.5
2 RNA
Deje los tubos en reposo a temperatura ambiente por 30 minutos y lea la absorbancia a 660 nm tomando como blanco el tubo no. 1. 1) Con los datos obtenidos con las soluciones tipo, construya la curva tipo para fosfato. (Densidad ptica contra concentracin en mol/mL) 2) Cmo afecta el medio cido al enlace 3-5dister fosfato? Cmo afecta el medio alcalino al enlace 3-5dister fosfato?

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1) Grafique tiempo en las abscisas (eje x) ordenadas (eje y).

y altura en milmetros en las

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I = --------La fuerza inica (I) es la semisuma del producto de la concentracin

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Agregar HCl 0.1N Glicina 0.1N 30 ml Acumulativo ml pH 0 0 2 2 3 5 4 9 5 14 5 19 5 24 1 25 1 26 1 27 1 28 0.5 28.5 0.5 29

Agregar NaOH 0.1N ml 0 2 3 4 5 5 5 1 1 1 1 0.5 0.5

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Precipitado: Serie Serie P G

Con exceso: Serie Serie P G

FeCl3 AgNO3 HgCl2 Pb(CH3COO) 2

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