Sistemtica microbiana: cronmetro molecular

Antonio Luque Lara y Juan Jos Borrego

Los registros fsiles moleculares abarcan un buen nmero de constituyentes celulares: casi todos los marcadores quimiotaxonmicos pueden ser utilizados en este sentido. La qumica de la membrana o pared celular, y la composicin de los sistemas de transporte electrnico son slo los ejemplos ms sobresalientes. Sin embargo, la evaluacin cronolgica de las relaciones filogenticas requiere la utilizacin de molculas con contenido informativo codificado, un cronmetro molecular ha de ser necesariamente un cido nucleico o una protena.

La hiptesis del cronmetro molecular asume que el nmero de cambios en las secuencias de estas molculas es, a grosso modo, equivalente al tiempo transcurrido desde la divergencia de dos lneas evolutivas que comparten la molcula. Tanto protenas como cidos nucleicos han sido ampliamente utilizados como cronmetros moleculares en la resolucin de filogenias de muy distintos grupos de seres vivos, pero son los cidos nucleicos los que han tenido una especial incidencia en la elaboracin del rbol evolutivo de los procariotas. Adems, presentan la ventaja de que los cambios mutacionales quedan en su totalidad reflejados en la secuencia, evento que no ocurre en las protenas, debido al carcter degenerado del cdigo gentico. Un cronmetro molecular que permita detectar las relaciones evolutivas ms amplias ha de cumplir las siguientes condiciones: Debe tener una distribucin universal. No debe estar sujeto a transmisin horizontal. Ha de poseer una constancia funcional, de modo que la presin selectiva que acte sobre la molcula sea mnima. La longitud de la secuencia debe ser suficiente para que las estimaciones de semejanza tengan validez estadstica. La tasa de cambio, al menos en una parte de la molcula, debe ser lo suficientemente baja como para permitir la deteccin de las relaciones evolutivas lejanas. Desde el punto de vista metodolgico interesa que no sea excesivamente larga para poder aplicar tcnicas de secuenciacin.

Aunque la secuenciacin de cidos nucleicos es, comparativamente hablando, un mtodo nuevo dentro de los estudios de sistemtica, ha demostrado ser uno de los mtodos ms tiles para inferir la historia filogentica de los organismos. El mayor atractivo de esta tcnica se basa en que los caracteres analizados (nucletidos) son las unidades bsicas de informacin, y que el banco de datos que se puede obtener en estos anlisis es inmenso. Para utilizar las secuencias nucleotdicas en estudios filogenticos stas deben ser alineadas. El nmero y tamao de las secuencias que deben ser alineadas depende del nivel de comparacin elegido.

Las secuencias nucleotdicas analizadas por los distintos laboratorios son recopiladas regularmente en los bancos de datos informticos, siendo el GenBank (contratado por el U.S. National Institute of Health) y el European Molecular Biology Laboratory (EMBL) los ms conocidos e importantes. Todos estos datos estn disponibles para que los autores puedan realizar estudios de sistemtica.

La estrategia seguida en los estudios de sistemtica mediante secuenciaciones, bsicamente es la misma para las diferentes tcnicas. Primero se identifica una secuencia diana que contenga una determinada cantidad de variaciones entre las distintas especies. Posteriormente, se aisla un gran nmero de copias de la secuencia diana de cada individuo que va a ser analizado. Estas copias se purifican y secuencian, finalmente, las secuencias homlogas deben ser alineadas y comparadas. Una vez comparadas, el grado de semejanza se estima con un coeficiente de similaridad y tras ello se agrupan los valores por mtodos estndares. En teora, debido a la cantidad y calidad de informacin contenida, el cronmetro molecular por excelencia debera ser el DNA; sin embargo, su tasa de cambio es demasiado rpida como para que pueda utilizarse como indicador de procesos de especiacin. Por ello, son los RNA ribosmicos los que se han constituido como principales cronmetros moleculares. Los RNA ribosmicos forman parte integral de la maquinaria de sntesis proteica bsica de toda clula viva, sus tipos estn universalmente distribuidos en todos los seres vivos, con alguna diferencia menor entre los reinos, su funcin es constante en toda la escala biolgica y los tipos existentes presentan una variacin en la longitud de la molcula adecuada para medir cualquier distancia filogentica. Los cidos ribonucleicos ribosmicos, al ser componentes esenciales de la vida poseen estructuras que se han conservado durante el transcurso de la evolucin. Sin embargo, estas estructuras primarias estn compuestas por regiones alternadas de alta y baja variabilidad. Las regiones con secuencias variables contienen informacin de bajo nivel filogentico, mientras que las regiones con secuencias preservadas contienen informacin de los eventos evolutivos ms tempranos. As mismo, existe una gran cantidad de copias de RNA ribosmico en una bacteria que est en fase de crecimiento. De esta forma, el RNA ribosmico es un excelente marcador molecular para la reconstruccin de la mayora de las relaciones filogenticas. Los mtodos de estudios ms empleados son la secuenciacin del RNA ribosmico 5S, 16S y 23S, y la hibridacin DNA-RNA ribosmico [Fox y Stackebrandt, Methods in Microbiology, 19: 405-459 (1987); Goodfellow y O'Donell, Handbook of Bacterial Systematics. Ac. Press Ed. 3-56 (1993)]. Con la hibridacin DNA-RNA ribosmico se pueden comparar secuencias nucleotdicas pertenecientes a distintos taxones debido a que los genes que las forman son ms conservativos que los genes del genoma (Doi e Igarashi, J. Bacteriol. 90: 384-390 (1965); Dubnau et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 54:491-498 (1965); Moore y McCarthy, J. Bacteriol. 94:1066-1074 (1967); Nomura et al., Nature 219: 793-799 (1968)]. Inicialmente se comenzaron a realizar estudios de secuenciacin del RNA ribosmico 16S [Fox et al., Int. J. System. Bacteriol. 27:44-57 (1977)]. Posteriormente, los estudios se extendieron al RNA ribosmico 23S. Las secuencias nucleotdicas constantes del RNA ribosmico 16S presentan la ventaja de proporcionar un sitio de iniciacin adecuado para la elongacin de los cebadores y as aplicar de forma ms fcil la tcnica de secuenciacin. La secuenciacin completa del RNA 5S, debido a su pequeo tamao, es ms rpida y econmica que las anteriores, e incluso la secuenciacin de determinados fragmentos del RNAr 5S puede proporcionar una informacin adecuada. Dos miembros pertenecientes a un mismo gnero pueden poseer entre 114-116 pb comunes de 118-120 [Stackebrandt y Liesack, Handbook of Bacterial Systematic. Ac. Press. Ed. 152-194 (1993)]. Actualmente existe un debate sobre cul es el anlisis ms adecuado para establecer relaciones filogenticas. El anlisis del RNA 16S parece ser el ms adecuado con seres procariotas, ya que contiene aproximadamente 1550 pb frente a los 75-120 del RNAr 5S, por lo que pequeas diferencias en los nucletidos del RNAr 5S afectan mucho ms al resultado final que en el caso del RNAr 16S. Adems de su utilidad en los estudios taxonmicos, la secuenciacin del RNAr se ha aplicado en identificacin bacteriana. Mediante el anlisis de las secuencias parciales del RNA ribosmico 16S es posible encontrar patrones de secuencias especficos para grupos, especies o incluso serotipos bacterianos. Para la

identificacin de los microorganismos a ese nivel, se han desarrollado pequeas sondas especficas de la regin variable del RNAr 16S [Festl et al., Appl. Environ. Microbiol. (1986); Romaniuk y Trust, FEMS Microbiol. Lett. 43: 331-335 (1987)]. Las diferencias en las regiones conservativas proporcionan as mismo secuencias para el diagnstico de grupos de organismos relacionados y pueden ser usadas como dianas para sondas especficas de oligonucletidos. Sondas especficas de RNAr 16S y 23S han sido aplicadas para establecer diferentes grupos y especies as como en la identificacin de bacterias (Amann et al., Appl. Envirom. Microbiol. 58: 3007-3011 (1992)]. La hibridacin con sondas especficas permite la identificacin rpida de un gran nmero de aislados, al mismo tiempo que posibilitan la deteccin directa de microorganismos concretos en las muestras, usando un extracto de cidos nucleicos como diana [Hertel et al., System. Appl. Microbiol. 15: 447-452 (1991); Ehrmann et al., System. Appl. Microbiol. 15: 453-455 (1992)]. La sensibilidad de las pruebas puede ser aumentada in vitro aplicando la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) [Kleppe et al., J. Mol. Biol. 56: 341-361 (1971) ; Mullis y Faloona, Methods Enzymol. 155: 335-350 (1987); Ochman et al., Genetics 120: 621-623 (1988); Saiki et al., Sci. 239: 487-491 (1988); Innis et al., PCR Protocols. Ac. Press, Ed. (1990)]. A partir de un pequeo fragmento de DNA, es posible amplificar una secuencia diana hasta unos cuantos microgramos, los cuales pueden ser secuenciados directamente o pueden ser utilizados como diana de una sonda especfica. El uso combinado de sondas universales y especficas permite tambin estimar la fraccin de determinados microorganismos dentro de un conjunto [Stahl et al., Appl. Envirom. Microbiol. 54: 1079-1084 (1988)]. Por ltimo, se pueden realizar estimaciones de unidades formadoras de colonias utilizando mtodos de hidribacin de colonias in situ [Hertel et al., System. Appl. Microbiol. 15: 447-452 (1992)].